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Wie viele mutierte Gene aus einem Komplementationstest?

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Da 1, 3 und 5 zusammen defekt sind, bedeutet dies, dass sie auf demselben Gen liegen. 3 und 5 sind auch zusammen defekt, was bedeutet, dass sie auf demselben Gen wie 1 liegen. Warum steht auf dieser Folie, dass es 3 mutierte Gene gibt? Ich muss etwas übersehen, ich glaube, ich verstehe etwas nicht.


In diesem Komplementationstest werden 5 Mutationen getestet.

Das erste Gen trägt die Mutationsnummer 2. Mit anderen Worten, Mutation Nummer 2 komplementiert die Mutationen 1, 3, 4 und 5 und kann sich nicht selbst komplementieren.

Das zweite Gen trägt die Mutationsnummer 4. Mit anderen Worten, die Mutationsnummer 4 komplementiert die Mutationen 1, 2, 3 und 5 und kann sich nicht selbst komplementieren.

Das dritte der drei Gene trägt die Mutation 1 in einem Stamm, Mutation 3 in einem zweiten Stamm und Mutation 5 in einem dritten Stamm. Mit anderen Worten, die Mutationen 1, 3 und 5 ergänzen sich alle nicht, aber alle drei komplementieren die Mutationen 2 und 4.

Es gibt 5 verschiedene Stämme in diesem Experiment und es gibt fünf verschiedene Mutationen (eine in jedem Stamm), aber die fünf Mutationen betreffen nur drei verschiedene Gene.


BSCI410

Wildtyp-Allel (Wildtyp): Allelhäufigkeit größer als 1%.
Monomorphes Gen - nur ein Wildtyp-Allel.
Polymorphes Gen - mehrere Wildtyp-Allele (z. B. ABO-Blutgruppen.

Wie wirken sich Veränderungen in der DNA auf den Phänotyp aus?

Veränderung der Menge an normal produziertem Protein
Änderungen der Aminosäuresequenz.

Die meisten Mutationen sind neutral, insbesondere bei den Eukaryoten, da ein großer Teil der DNA nicht in den Genen enthalten ist und somit den Phänotyp des Organismus nicht beeinflusst.

Keimmutation - tritt in Gameten (Ei & Spermien) auf und wird an die Nachkommen weitergegeben

Chromosomenmutation - tritt auf Chromosomenebene auf (betrifft mehrere Gene)

Genmutation - tritt auf Genebene auf (betrifft ein Gen)

Vorwärtsmutation - ändert den Wildtyp in ein anderes Allel
Reverse Mutation - bewirkt, dass die neue Mutation wieder zum Wildtyp zurückkehrt (Reversion-seltener)

-Down-Syndrom - Trisomie 21

-Turner-Syndrom - einzelnes X-Chromosom

1. "Übergänge", bei denen ein Purin in ein anderes Purin umgewandelt wird (A <-> G) oder ein Pyrimidin in ein anderes Pyrimidin umgewandelt wird (T <-> C).

- Größere Mutationen beinhalten das Einfügen ganz neuer Sequenzen, oft aufgrund von Bewegungen transponierbarer Elemente in der DNA oder Chromosomenänderungen wie Inversionen oder Translokationen.

-Verursacht durch DNA-Replikationsschlupf von Trinukleotid-Wiederholungen. Während der Replikation kann die DNA-Polymerase "stottern", wenn sie mehrere Tandemkopien einer kurzen Sequenz repliziert.

Ex: . Zum Beispiel wird CAGCAGCAGCAG, 4 Kopien von CAG, gelegentlich durch DNA-Polymerase-Stuttern in 3 Kopien oder 5 Kopien umgewandelt.

Außerhalb von Genen erzeugt dieser Effekt nützliche genetische Marker, die SSR (Simple Sequence Repeats) genannt werden.

-FMR-1-Gene bei nicht betroffenen Personen haben weniger als 50 CGG-Wiederholungen.

-Instabile Prämutationsallele haben zwischen 50 und 200 Wiederholungen.

-Die Änderungsrate der Kopienzahl ist bei Huntington-Menschen viel höher - zu viele Kopien machen die wiederholte Sequenz anfälliger für das Stottern der DNA-Polymerase während der Meiose


Mutantenanalyse

Mutierte Organismen bieten leistungsstarke Werkzeuge, um biochemische Wege in lebenden Zellen zu untersuchen. In diesem Semester arbeiten wir mit Hefestämmen, die weder Methionin (Met) noch Cystein (Cys) synthetisieren können, weil eines der am Biosyntheseweg beteiligten Gene inaktiviert wurde. Met und Cys sind essentielle Aminosäuren für alle Organismen. Die Schwefelatome in ihren Seitenketten verleihen Met und Cys eine charakteristische Chemie, was wichtige Auswirkungen hat
für die Proteinfunktion. Im Gegensatz zu uns ist Wildtyphefe in der Lage, sowohl Met als auch Cys zu synthetisieren, wobei nur anorganisches Sulfat als Schwefelquelle verwendet wird. Jedem der Met-Mutantenstämme, die wir dieses Semester verwenden, fehlt ein einzelner GETROFFEN Gen, und diese Deletion verhindert, dass der Stamm auf Medien wächst, die nur Sulfat als Schwefelquelle enthalten. Das gelöschte GETROFFEN Gene in den Stämmen wurden durch homologe Rekombination durch ein bakterielles Kanamycinresistenzgen (KAN R ) ersetzt (Winzeler et al., 1999). Je nach genauer getroffen Mutation können die Stämme Met und Cys aus anderen Schwefelquellen synthetisieren, die sie in die Zelle transportieren und umwandeln
zu Met oder Cys. In diesem Lab verwenden Sie selektive Medien mit verschiedenen Schwefelquellen und Differenzmedien, um zwischen drei Met-Mutanten zu unterscheiden. Im nächsten Labor werden Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwenden, um die mutierten Met-Stämme schlüssiger zu identifizieren.

Genetische Nomenklatur

Bei der Bezugnahme auf Gene und Stämme ist es wichtig, die korrekte genetische Nomenklatur zu verwenden. Achten Sie bei der Erstellung Ihrer Berichte besonders auf Kursiv- und Großbuchstaben. Gennamen werden kursiv gesetzt, während Proteine ​​und Phänotypen in normaler Schrift bezeichnet werden. Gennamen, die mit Großbuchstaben beginnen, beziehen sich auf dominante Allele, während sich Gennamen, die mit Kleinbuchstaben beginnen, auf rezessive Allele beziehen. (Eine Kuriosität über angehende Hefe: S. cerevisiae Gennamen sind insofern einzigartig, als dominante Allele mit drei Großbuchstaben beschrieben werden. Bei den meisten anderen eukaryotischen Arten werden dominante Allele als bezeichnet Met6 nur der erste Buchstabe groß geschrieben.) S. cerevisiae Gennamen bestehen aus drei Buchstaben, gefolgt von einer Zahl. Es kann viele verschiedene Gennamen geben, die mit den gleichen drei Buchstaben beginnen, z.B. es gibt über 20 verschiedene GETROFFEN Gene, aber die Zahl am Ende des Gennamens ist spezifisch für ein bestimmtes Gen. Wenn einige molekulare Details für ein bestimmtes mutiertes Allel verfügbar sind, kann der Nummer ein Bindestrich und zusätzliche Informationen über das Allel folgen.

Betrachten wir als Beispiel die Nomenklatur, die für die MET6 Gen von S. cerevisiae. Das Met-Präfix wird verwendet, um Funktionsverlust-Allele zu beschreiben, die in mutierten Stämmen gefunden wurden, von denen die meisten aufgrund ihrer Unfähigkeit, in Abwesenheit von Met zu leben, in genetischen Screens isoliert wurden. Die mit Genen assoziierten Zahlen sind normalerweise willkürlich. Die MET6 Gen erhielt seinen Namen, bevor sein Genprodukt als Homocystein-Methyltransferase, dem letzten Schritt der Methionin-Synthese, identifiziert wurde. Die folgende Liste beschreibt die Namenskonventionen für Gene, Proteine ​​und Stämme im Zusammenhang mit S. cerevisiae MET6. Dieselben Regeln gelten für andere Gene in S. cerevisiae.

  • MET6 — Dominantes Allel der MET6 Gen oder der chromosomale Locus
  • met6 — Rezessives Allel der MET6 Gen (Allel in einer Met6-Mutante gefunden)
  • met6-12 — Rezessives Allel – Nummer nach den Klammern bezieht sich auf eine bestimmte Mutation
  • met6-∆1 — Rezessives Allel – met6 Allel hat eine spezifische Deletion (∆ zeigt eine Deletion an)
  • met6::LEU2 — Rezessives Allel – die Insertion eines dominanten LEU2-Gens in den MET6-Locus auf dem Chromosom hat das MET6-Gen des Wirts inaktiviert
  • Met6p — Protein, das vom MET6-Gen kodiert wird, d. h. Homocystein-Methyltransferase

In diesem Kurs werden wir mit haploiden Hefestämmen arbeiten. Um den Genotyp eines bestimmten Stamms zu schreiben, beginnen Sie mit dem Paarungstyp und folgen Sie ihm mit den mutierten Allelen in dem Stamm. Zum Beispiel verwenden wir Met-Stämme, die durch Einfügen einer bakteriellen Kanamycin-Resistenz (KANR)-Gen in den Hefestamm BY4742, der den α-Paarungstyp aufweist und Mutationen in Genen trägt, die an der Synthese von Histidin, Leucin, Lysin und Uracil beteiligt sind. BY4742 stammt vom Stamm S288C ab, der für das Genomprojekt verwendet wurde (Brachmann et al., 1998). Somit ist der Genotyp unseres met6 mutant würde die BY4742-Mutationen enthalten und geschrieben werden:

MATa his3-∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 met6::KANR

Auxotrophe und selektive Medien

Die getroffen Mutanten sind Met-Auxotrophe, was bedeutet, dass sie nicht in Medien wachsen können, die kein Met enthalten. Auxotrophe sind Mikroorganismen, die aufgrund einer Genmutation nicht in der Lage sind, einen essentiellen Nährstoff zu synthetisieren. Viele Laborstämme tragen mehrere Mutationen, die die Synthese essentieller Nährstoffe stören. Zum Beispiel, weil der Stamm BY4742 Mutationen in der HIS3, LEU2, LYS2 und URA3 Gene, wird der Stamm nur in Medien wachsen, die Histidin, Leucin, Lysin und Uracil enthalten. Auxotrophe Stämme haben viele Verwendungsmöglichkeiten in der Genetik. Forscher verwenden häufig auxotrophe Stämme als Wirte für die Plasmidtransformation (Kapitel 12). Die für die Transformation verwendeten Plasmide tragen funktionelle Allele eines Gens, das im Wirtsstamm defekt ist, was es ermöglicht, Transformanten nach ihrer Fähigkeit zu selektieren, auf Medien zu wachsen, denen der essentielle Nährstoff fehlt.

*YNB ist eine komplexe Mischung aus Vitaminen, Mineralstoffen und Salzen. Endkonzentrationen in YC: Vitamine (μg/Liter): Biotin (2), Calciumpantothenat (400), Folsäure (2), Inosit (2000), Niacin (400), p-Aminobenzoesäure (200), Pyridoxinhydrochlorid (400), Riboflavin (200 .) ), Thiaminhydrochlorid (400). Mineralien (μg/Liter): Borsäure (500), Kupfersulfat (40), Kaliumjodid (100), Eisenchlorid (200), Mangansulfat (400), Natriummolybdat (200), Zinksulfat (400). Salze (mg/Liter): Kaliumphosphat monobasisch (1000), Magnesiumsulfat (500), Natriumchlorid (100), Calciumchlorid (100). Quelle: Labor Gottschling

Synthetische Medien sind ein wesentliches Werkzeug für die Kultivierung und Untersuchung von Auxotrophen, da alle Komponenten definiert sind. Hefeforscher haben eine Vielzahl unterschiedlicher Formulierungen für synthetische Medien entwickelt. Alle synthetischen Medien enthalten eine Kohlenstoffquelle (normalerweise D-Glucose), eine Stickstoffquelle und essentielle Vitamine und Mineralstoffe. Die Vitamine und Mineralstoffe werden in der Regel gekauft
in einer Formulierung, die als Hefe-Stickstoff-Base (YNB) bekannt ist. Die den synthetischen Medien zugesetzten Ergänzungen können maßgeschneidert werden, um das Wachstum bestimmter Genotypen zu unterstützen oder gegen dieses zu selektieren. In diesem Kurs verwenden wir Yeast Complete (YC)-Medium, das das Wachstum der meisten . unterstützt S. cerevisiae Stämme. Die Wachstumsrate von Wildtyp-Stämmen in YC ist etwas langsamer als in reichen Medien wie YPD, aber die Stämme sind über lange Zeiträume lebensfähig. Die folgende Tabelle zeigt die Zusammensetzung von YC, die ein reichhaltiges Angebot an Aminosäuren und Nukleotidbasen umfasst. Neben dem kompletten YC-Medium werden wir auch selektive Medien verwenden, bei denen einige Komponenten weggelassen wurden. In diesem Lab verwenden wir beispielsweise YC-Met-"Drop-out"-Medien, die alle YC-Komponenten in der folgenden Tabelle außer Methionin enthalten.

Genetische Analysen der Methionin-Biosynthese

Wenn Sie sich später in diesem Kapitel den Weg der Met-Biosynthese ansehen, fragen Sie sich vielleicht, wie die Gennummern mit bestimmten Genen in Verbindung gebracht wurden, da die Nummern nicht den Positionen der Reaktionen entsprechen, die durch die GETROFFEN Genprodukte im Weg. Das Nummerierungssystem spiegelt den Entdeckungsprozess für die MET-Gene wider. Die ersten Studien zur Met-Biosynthese in Hefe wurden von Genetikern durchgeführt, die klassische genetische Screens verwendeten, um getroffen Mutanten. Genetische Screens sind wichtige Werkzeuge zur Identifizierung neuer Gene, da sie nicht von Vorkenntnissen des Signalwegs beeinflusst werden. Darüber hinaus ist Mutation ein zufälliger Prozess, der alle Gene betreffen sollte, die an der Erzeugung des untersuchten Phänotyps beteiligt sind. Der Genetiker beginnt mit der Behandlung eines Elternstamms mit einer Chemikalie oder Strahlung, um Mutationen in der DNA zu induzieren. Die spontane Mutationsrate in Hefe beträgt

10 -8 /Base/Generation, was für ein praktisches genetisches Screening viel zu niedrig ist. Die Ermittler verwenden daher Mutagendosen, die bis zu

50% der Zellen. Zellen, die die Mutagenese überleben, tragen typischerweise eine große Anzahl von Mutationen, von denen viele keinen Einfluss auf den gescreenten Phänotyp haben. Folglich ist eine große Anzahl von Zellen erforderlich, um alle am Phänotyp beteiligten Gene aufzudecken. Zum Beispiel enthält das Hefegenom

6000 Gene, so dass ein nützliches genetisches Screening 20.000 oder mehr Zellen umfassen könnte.

Selektive Medien stellen wichtige Werkzeuge zur Identifizierung mutierter Phänotypen in genetischen Screens bereit. Abhängig vom untersuchten Phänotyp können die Forscher nach Mutanten entweder nach einem positiven oder negativen Selektionsschema selektieren, wie auf der gegenüberliegenden Seite gezeigt. Die einfachsten Arten von Screens verwenden positive Selektion, da nur mutierte Zellen auf selektiven Medien wachsen. Wenn Forscher Wege analysieren, die für das Zellwachstum wichtig sind, wie die Met-Synthese, würden sie wahrscheinlich ein negatives Selektionsschema verwenden. In einem negativen Schema werden Zellen zuerst auf Medien wie YPD oder YC kultiviert, die allen Zellen das Wachstum ermöglichen. Repliken dieser Masterplatten werden dann auf definierten Medien ohne Met hergestellt. Da nur Wildtyp-Zellen auf den selektiven Medien ohne Met wachsen, suchen die Forscher nach Kolonien auf den reichen Medien, deren Gegenstücke auf den selektiven Medien fehlen.

Selektionsstrategien zur Isolierung von Hefemutanten. Nach der anfänglichen Mutagenese wird die Hefe auf einer Platte gezüchtet, die reiches (oder vollständig synthetisches) Medium enthält. In dieser Figur hat die Mutagenese drei verschiedene Mutanten im interessierenden Gen erzeugt. Die mutierten Kolonien sind von einem leeren Kreis umgeben. Repliken der Masterplatte werden auf ausgewählte Medien kopiert. In einem negativen Selektionsschema fehlt der selektiven Platte eine Komponente, die normalerweise in reichen Medien vorhanden ist. Bei einem positiven Selektionsschema enthält das Medium ein selektives Agens, das für normale Zellen toxisch ist, aber von mutierten Zellen toleriert wird. Das selektive Mittel ist manchmal ein toxisches Analogon eines normalen zellulären Metaboliten.

Die Anzahl und das Spektrum der bei einem genetischen Screening erhaltenen Mutanten sind aufgrund der zufälligen Natur der Mutation unvorhersehbar. Wie Sie vielleicht erwarten, kann ein Screening mehrere Mutanten in einem Gen produzieren und keine Mutationen in anderen Genen, die am Phänotyp beteiligt sind.
Nach Abschluss eines Screenings müssen die Ermittler als nächstes feststellen, ob die Mutationen in denselben oder unterschiedlichen Genen liegen. Dafür verlassen sich Genetiker auf genetische Kartierung und/oder Komplementation. Die Komplementierung ist ein funktioneller Test der Genaktivität. In einem Komplementierungsexperiment rettet die Einführung eines funktionellen Gens aus einer anderen Quelle einen mutierten Phänotyp, der durch das defekte Gen verursacht wird. Die klassische genetische Komplementation in Hefe nutzt die beiden Hefepaarungstypen und die Fähigkeit der Hefe, sowohl als haploide als auch als diploide Stämme zu überleben. In einem Komplementierungsexperiment mit Met-Mutanten paaren die Forscher eine haploide Met-Mutante entweder im α- oder im .-Format ein Paarungsart (MATα oder MATTEein) mit einem haploiden getroffen Mutante des entgegengesetzten Paarungstyps. Wenn das Diploid in Abwesenheit von Met wachsen kann, ist eine Komplementation aufgetreten, und die getroffen Mutationen in den beiden haploiden Stämmen müssen in unterschiedlichen Genen liegen. Wenn das Diploid auf der Selektionsplatte nicht überleben kann, tragen die beiden haploiden Stämme Mutationen im gleichen Gen (obwohl es sich mit ziemlicher Sicherheit um unterschiedliche mutierte Allele handelt). Ein genetischer Screen kann mehrere mutierte Allele desselben Gens ergeben, die zusammen eine Komplementierungsgruppe bilden.

Bis 1975 hatten Hefelabore isolierte Sammlungen von getroffen Mutanten und kartierte neun der getroffen Mutationen an Chromosomen. In einer wegweisenden Studie sammelten Masselot und DeRobichon-Szulmajster (1975) 100 getroffen Stämme aus Labors auf der ganzen Welt und führte systematische Komplementierungsexperimente mit allen Mutanten durch. Einundzwanzig Komplementationsgruppen, die potentielle Gene repräsentieren, wurden identifiziert und den Genen wurden Namen zugewiesen MET1 durch MET25. Viele der GETROFFEN Gene codieren Enzyme im Met-Biosyntheseweg, der auf der gegenüberliegenden Seite beschrieben wird. Einige Genprodukte sind an der Synthese von Cofaktoren und Methyldonoren beteiligt, die im Stoffwechselweg verwendet werden, während andere GETROFFEN Genprodukte (nicht gezeigt) sind an der Regulation des Stoffwechselweges beteiligt (Übersicht in Thomas &. Surdin-Kerjan, 1992). Die in der Studie von 1975 vergebenen Namen werden größtenteils noch heute verwendet. Für einige wenige Gene, die in der Studie von 1975 identifiziert wurden, wurde später gezeigt, dass sie nicht an der Met-Biosynthese beteiligt sind, und andere (z. MET15, MET17 und MET25) wurde später gezeigt, dass sie verschiedene Allele desselben Gens repräsentieren (D’Andrea et al., 1987).

Zum Zeitpunkt der Studie von 1975 waren die biochemischen Reaktionen des Stoffwechselwegs weitgehend bekannt, und die Wissenschaftler standen vor der Herausforderung, Gene mit enzymatischen Aktivitäten in Verbindung zu bringen. Sie können am Signalweg erkennen, dass Mutationen in 11 verschiedenen GETROFFEN Gene würden einen Phänotyp erzeugen, bei dem Stämme in Gegenwart von Methionin wachsen würden, aber nicht in seiner Abwesenheit. Die Wissenschaftler grenzten mögliche Gen-Enzym-Beziehungen ein, indem sie die Fähigkeit von Met-Stämmen analysierten, alternative Schwefelquellen anstelle von Methionin zu verwenden (Masselot & DeRobichon-Szulmajster, 1975). Hefen sind sehr vielseitig in ihrer Verwendung sowohl von anorganischen als auch organischen Schwefelquellen. Sulfat wird durch die Sul1p- und Sul2p-Transporter in der Membran effizient in die Zellen transportiert. Auch Sulfit und Sulfid werden mit verminderter Effizienz in die Zellen transportiert. Hefen können auch Met, Cys, Homocystein und S-Adenosylmethionin (AdoMet oder SAM) als Schwefelquellen transportieren und verwenden (Übersicht in Thomas und Surdin-Kerjan, 1992). In diesem Lab verwenden Sie selektive Medien, in denen Sulfit oder Cystein Methionin ersetzt, um zwischen 3 . zu unterscheiden getroffen Mutanten. Sie verwenden auch ein Differenzierungsmedium, BiGGY-Agar, das Hefestämme durch ihre Produktion von Schwefelwasserstoff unterscheidet. Differentielle Medien erlauben allen Mutanten zu wachsen, aber die Mutanten produzieren Kolonien, die durch ihre Farbe oder Morphologie voneinander unterschieden werden können.

HINWEIS: Die getroffen Mutanten, die in diesem Kurs verwendet wurden, wurden NICHT durch traditionelle Mutagenese erzeugt. Stattdessen wurden die Mutanten durch einen neueren molekularen Ansatz konstruiert, der detaillierte Kenntnisse der Hefegenomsequenz erfordert. Nach Abschluss des Hefegenomprojekts waren die Forscher daran interessiert, eine genomweite Sammlung von Deletionsstämmen zu erhalten, von denen sich jeder an einem einzigen Genort vom Elternstamm BY4742 unterschied. Ihr Ansatz, der
wird in Kapitel 7 genauer besprochen, nutzt die hohe Frequenz, mit der S. cerevisiae erfährt eine homologe Rekombination. Jeder ORF im S. cerevisiae Genom wurde systematisch durch ein bakterielles ersetzt KAN R Gen (Winzeler et al., 1999). Ein großer Vorteil dieser Strategie, die manchmal als „reverse Genetik“ bezeichnet wird, gegenüber dem traditionellen genetischen Ansatz besteht darin, dass positive Selektion verwendet werden kann, um Mutanten zu isolieren. Nur Stämme mit gestörtem GETROFFEN Gene können auf Medien wachsen, die Analoga von Kanamycin enthalten. Stämme mit KAN R -gestörte Gene haben andere Vorteile gegenüber mutierten Stämmen, die mit chemischen Mutagenen oder Strahlenbehandlung erzeugt wurden. Die Stämme tragen keine durch die Mutagenbehandlung induzierten sekundären Mutationen und eine spontane Reversion zu einem Wildtyp-Phänotyp ist nicht möglich.

Methioninbiosynthese in Hefe. Die Proteine, die die einzelnen Schritte der Met- und Cys-Biosynthese katalysieren, sind neben jedem Schritt im Stoffwechselweg aufgeführt. Die Namen der Gene, die die Aktivitäten kodieren, sind in kursiver Großbuchstaben dargestellt, gemäß den Konventionen von S. cerevisiae. Die MET1- und MET8-Gene kodieren für Proteine, die an der Synthese von Sirohäm, einem essentiellen Cofaktor für die Sulfitreduktase, beteiligt sind. Die MET7- und MET13-Genprodukte katalysieren die letzten beiden Schritte in der Synthese des von Met6p verwendeten Methyldonors, der Homocystein-Methyltransferase, um Methionin zu synthetisieren. (Angepasst von Thomas et al., 1992)

Biochemie der schwefelhaltigen Aminosäuren

S. cerevisiae benötigt zum Leben drei schwefelhaltige Aminosäuren. Neben Met und Cys, die in zelluläre Proteine ​​eingebaut werden, benötigen Zellen auch S-Adenosylmethionin (AdoMet), das für viele Methylierungsreaktionen aktivierte Methylgruppen liefert. Die Konsensansicht der Synthese dieser drei Aminosäuren auf der vorherigen Seite wird jetzt durch biochemische und genetische Beweise aus vielen Laboratorien gut gestützt (überprüft in Thomas
& Surdin-Kerjan, 1992). Die Gen-Enzym-Beziehungen konnten erst mit der Entwicklung molekularer Klonierungs- und DNA-Sequenzierungstechniken endgültig festgestellt werden, die es den Forschern ermöglichten, die Plasmidkomplementation zum direkten Testen der Genfunktion zu verwenden. In diesen Experimenten konstruierten die Forscher Plasmide mit Wildtyp MET, CYS oder SAM Gene, die in mutierte Stämme umgewandelt wurden. Transformierte Stämme konnten nur überleben, wenn das Plasmid das Wildtyp-Allel des inaktivierten Gens in der Mutante enthielt. (In dieser Klasse verwenden Sie die Plasmidkomplementation, um die Identifizierung Ihrer Stämme und Plasmide zu bestätigen.)

Die meisten Gene, mit denen wir in diesem Semester arbeiten werden, kodieren für Enzyme, die eine Umwandlung eines schwefelhaltigen Moleküls in ein zweites schwefelhaltiges Molekül katalysieren. Sonstiges GETROFFEN Gene kodieren für Enzyme, die nicht direkt an der Synthese von Schwefelaminosäuren beteiligt sind, aber die Synthese eines Cofaktors oder eines Methyldonors katalysieren, der für die Synthese von Schwefelaminosäuren benötigt wird. In der folgenden kurzen Beschreibung verfolgen wir den Fortschritt eines Schwefelatoms von anorganischem Sulfat bis zu seiner Umwandlung in Met, Cys oder AdoMet.

Die Sulfatassimilation beinhaltet die Schwefelaktivierung und die Reduktion zu Sulfid

Die frühen Schritte des Weges, der die Reaktionen umfasst, die an der Umwandlung von Sulfat in Sulfid beteiligt sind, umfassen den Sulfatassimilationsweg. Sulfationen sind die Quelle des meisten Schwefels in biologischen Molekülen, aber es wird beträchtliche Stoffwechselenergie benötigt, um Sulfat aus seiner Oxidationsstufe +6 zu aktivieren und es in Sulfid umzuwandeln, das eine Oxidationsstufe von -2 hat. Die für die Sulfatassimilation verantwortlichen Enzyme sind in Mikroorganismen und Pflanzen weit verbreitet. In S. cerevisiae, Sulfat wird zuerst durch ATP Sulfurylase oder Met3p aktiviert, um 5’-Adenylylsulfat (APS) zu bilden. APS wird dann von Met14p oder APS-Kinase phosphoryliert, wodurch 3’-Phospho-5’-Adenylylsulfat (PAPS) gebildet wird. PAPS ist ein interessantes Molekül, da es ein aktiviertes Schwefelatom enthält, das für eine Vielzahl von Schwefelübertragungsreaktionen verwendet werden kann. Bei Säugetieren wird PAPS für eine Vielzahl von Sulfatierungsreaktionen im Golgi verwendet, wobei die Akzeptoren Lipide, Proteine ​​und eine Vielzahl kleiner Moleküle umfassen. (Interessanterweise ist die APS-Kinase das einzige Hefeenzym, das an der Sulfatassimilation mit Homologen bei Säugetieren beteiligt ist.)

Die letzten beiden Schritte der Sulfatassimilation sind NADPH-abhängige Reduktionsreaktionen. Die PAPS-Reduktase oder Met16p katalysiert die erste Reaktion, bei der dem Schwefelatom zwei Elektronen hinzugefügt werden. Die abschließende 6-Elektronen-Reduktion wird durch Sulfitreduktase katalysiert. Sulfitreduktase ist ein komplexes Metalloenzym mit zwei Met5p- und zwei Met10p-Untereinheiten sowie mehreren prothetischen Gruppen, einschließlich Sirohäm, die am Elektronentransfer beteiligt sind. (Eine prothetische Gruppe ist ein Metallion oder ein organisches Molekül, das kovalent an ein Enzym gebunden und für seine Aktivität essentiell ist.) In Hefe wird Sirohäm in einer Reihe von Reaktionen synthetisiert, die durch Met1p und Met8p katalysiert werden.

Die Sirohem-Synthese wird formal nicht als Teil des Sulfatassimilationsweges angesehen, aber ihre Funktion ist entscheidend für den Aufbau der funktionellen Sulfitreduktase.

Homocysteinsynthese und Transsulfuration

Im nächsten Schritt der Met- und Cys-Biosynthese wird Sulfid in die Aminosäure Homocystein (Hcy) eingebaut. Hcy sitzt am Verzweigungspunkt zwischen mehreren Pfaden in Hefe. Das Aminosäure-Rückgrat von Hcy leitet sich letztendlich von Asparaginsäure ab, die in einer Reihe von Schritten zu Homoserin umgewandelt wurde. (Hinweis: „Homo“-Aminosäuren haben im Vergleich zu den Namensgebern ohne Präfix ein zusätzliches Kohlenstoffatom in ihren Seitenketten.) Met2p aktiviert das Homoserin in einer Acetylierungsreaktion, die Acetyl-CoA verwendet. Met17p, auch bekannt als entweder Homocystein-Synthase oder O-Acetyl-Homoserin-Sulfhydryase, katalysiert dann die Reaktion von O-Acetylhomoserin mit Sulfid, um Hcy zu bilden.

In Hefe dient Hcy als Vorläufer für entweder Cys oder Met. Der Weg, der Hcy und Cys verbindet, wird als Transsulfurierungsweg bezeichnet. Transsulfuration bietet S. cerevisiae mit ungewöhnlicher Flexibilität in Bezug auf Schwefelquellen. Vier verschiedene Genprodukte sind an der Umwandlung von Hcy in Cys und umgekehrt beteiligt, wobei Cystathionin (unten) als gemeinsames Zwischenprodukt verwendet wird. Str2p katalysiert die Cystathioninsynthese aus Cys und O-Acetylhomoserin, dem Produkt der durch Met2p katalysierten Reaktion. Auf dem entgegengesetzten Weg katalysiert Cys4p (auch bekannt als Str4p) die Cystatinsynthese aus Hcy und Ser. Die vier Gene im Schwefeltransferweg zeigen unterschiedliche Muster der evolutionären Konservierung. Zum Beispiel, E coli ist nicht in der Lage, Cys aus Met zu synthetisieren, während Säugetiere Met nicht aus Cys synthetisieren können.

Methionin und AdoMet werden während des Methylzyklus gebildet

Hcy ist auch der Ausgangspunkt eines Zyklus, der Met und AdoMet produziert. Der Zyklus beginnt, wenn Met6p die Umwandlung von Hcy zu Met katalysiert, unter Verwendung eines ungewöhnlichen Methyldonors, Polyglutamyl-5-methyl-tetrahydrofolat (THF). Die MET13 und MET7 Gene codieren die Enzyme, die die letzten beiden Schritte der Synthese von Polyglutamyl-5-methyl-THF katalysieren, was die Unfähigkeit der Met7- und Met13-Zellen erklärt, Methionin zu synthetisieren.

Wie zu erwarten, wird das meiste Methionin für die Proteinsynthese in Zellen verwendet, aber eine beträchtliche Menge wird von zwei nahezu identischen AdoMet-Synthasen, Sam1p und Sam2p, in den hochenergetischen Methyldonor AdoMet umgewandelt. S. cerevisiae ist in der Lage, große Mengen von AdoMet zu synthetisieren, das entweder für Transmethylierungsreaktionen verwendet oder in seiner Vakuole gespeichert wird. (Tatsächlich ist Hefe die Quelle für das meiste kommerziell hergestellte AdoMet.) Mehrere Hefe-Methyltranferasen katalysieren die Übertragung von Methylgruppen von AdoMet auf Hunderte verschiedener Substrate, darunter Nukleotidbasen und Zucker in DNA und RNA, verschiedene Aminosäureseitenketten in Proteine, Lipide, kleine Moleküle und mehr. Jede Transmethylierungsreaktion erzeugt ein Molekül S-Adenosylhomocystein (AdoHcy), das von Sah1p zu Adenosin und Hcy hydrolysiert wird, wodurch der Methylzyklus abgeschlossen wird.

Wir werden in dieser Klasse nicht die Enzyme untersuchen, die am Methylzyklus beteiligt sind, aber es ist wichtig, ihre Bedeutung für das Überleben der Zellen zu erkennen. Die Aminosäuresequenzen von Sam1p und Sam2p sind zu 93% identisch, was weit höher ist als bei anderen Proteinen, die durch Genduplikation entstanden sind S. cerevisiae. Diese Redundanz stellt einen Puffer gegen den Verlust einer der beiden Funktionen bereit. Zellen mit einer Mutation in einem der SAM1 oder SAM2 Gen können überleben, aber Zellen mit Mutationen in beiden Genen können nicht überleben. Ebenso die SAH1 Gen ist eines der wenigen essentiellen Gene in S. cerevisiae, wahrscheinlich weil der Aufbau von AdoHcy viele Methyltransferase-Reaktionen hemmen würde.

Mutationen stören biochemische Wege

Die getroffen Mutanten, die Sie analysieren, können eine der Reaktionen, die für die Synthese von Schwefelaminosäuren erforderlich sind, nicht katalysieren. In diesem Labor verwenden Sie selektive und differentielle Medien, um festzustellen, welche Gene in Ihren Stämmen inaktiviert wurden. Stellen Sie sich jede Mutation als das Löschen eines der Pfeile vor, die im Schwefelaminosäureweg gezeigt werden. Unsere selektiven Medien enthalten eine Vielzahl von Schwefelquellen. Abhängig von der Position der Met-Mutation relativ zur Schwefelquelle kann der Stamm die Schwefelaminosäuren synthetisieren oder nicht.

Sie werden auch das Differenzierungsmedium BiGGY-Agar verwenden, um Hefestämme anhand der von ihnen produzierten Menge an Schwefelwasserstoff zu unterscheiden. Dies liegt daran, dass BiGGY Wismut enthält, das mit Sulfid reagiert, um einen bräunlichen bis schwarzen Niederschlag zu bilden. Es wird erwartet, dass alle Stämme auf BiGGY wachsen, da es Hefeextrakt enthält, der eine Methioninquelle ist. BiGGY enthält auch Sulfit anstelle von Sulfat als primäre Schwefelquelle. Lokalisieren Sie die Positionen Ihrer mutierten Gene im Signalweg relativ zu Sulfid und Sulfit. Mutationen in Genen stromaufwärts von Sulfid sollten hellere Kolonien erzeugen, da weniger Sulfid produziert wird. Von diesen sollten Mutationen, die eine Sulfitreduktion verhindern, die leichtesten Kolonien erzeugen. Mutationen in Genen stromabwärts von Sulfid sollten dunklere Kolonien erzeugen, da die Stämme Sulfid nicht metabolisieren können.

Wenn Sie Ihre Vorhersagen für dieses Experiment treffen, können Sie diese Analogie nützlich finden: Ein Stoffwechselweg ist nicht unähnlich einer Einbahnstraße (aus energetischen Überlegungen sind die meisten Stoffwechselwege unidirektional) mit einer Reihe von Brücken, die Inseln verbinden. (Die Inseln haben unterschiedliche Energieniveaus.) Die Autos, die die Autobahn entlangfahren, sind die Moleküle, die von einer Form in eine andere umgewandelt werden. Wenn ein Auto die nächste Insel auf dem Weg erreicht, ändert sich seine Farbe, weil es in ein anderes Molekül umgewandelt wurde. Die Brücken sind die Enzyme im Stoffwechselweg. Sie erleichtern die Durchfahrt der Autos, weil sie die Reaktionen katalysieren, die ein Molekül in das nächste umwandeln. Tritt eine Mutation in einem Gen auf, das für ein bestimmtes Enzym kodiert, fällt diese bestimmte Brücke ab. Autos stapeln sich vor der kaputten Brücke, und auf Inseln hinter der kaputten Brücke würden nur sehr wenige Autos gefunden. In einigen Fällen kann es einen alternativen Weg oder einen Rettungsweg geben, aber dieser Weg ist normalerweise weniger effizient.


1. EINLEITUNG

Der phytopathogene Oomycet Phytophthora soja ist der Erreger der Sojabohnen-Wurzelfäule weltweit. Merkmale der erkrankten Pflanzen sind wasserdurchtränkte Fäulnis und Abdämpfung von Sojabohnensetzlingen, was zu einer Reduzierung des Pflanzenbestands und Ertragsverlusten von 1 bis 2 Milliarden US-Dollar pro Jahr führt (Kamoun et al., 2015 Tyler, 2007). Die wirtschaftlichen Auswirkungen von P. soja, zusammen mit einer Fülle verfügbarer Genom- und Transkriptomdaten, macht sie zu einer geeigneten Modellart für die Untersuchung von Oomyceten-Pflanzenpathogenen (Tyler, 2007 Ye et al., 2011 ).

Bei Oomyceten wurde die Gen-Targeting-Transgenese typischerweise durch Regulation auf Transkriptionsebene über internukleäre Gen-Silencing durchgeführt (van West et al., 1999, 2008). Die Manipulation auf der Grundlage von Gen-Silencing ist jedoch instabil und ineffizient. Die homologe Rekombination wurde weithin für den Genersatz bei Arten in allen Königreichen verwendet, aber dieser Ansatz funktionierte vor der Etablierung des CRISPR/Cas9-Systems nicht gut. Kürzlich wurde bei einigen Oomyceten eine Genommodifikation unter Beteiligung von CRISPR/Cas9 implementiert (Fang & Tyler, 2016 Fang et al., 2017), was eine erhebliche technische Machbarkeit für die Oomyceten-Forschung ermöglicht. Das CRISPR/Cas9-System hat sich als angeborener Bestandteil der adaptiven Immunantwort in bakteriellen und archaealen Systemen entwickelt und wird heute als vielseitiges molekulares Werkzeug verwendet, das eine spezifische und gezielte Genommodifikation in einer Vielzahl von Eukaryoten gewährleistet. Zu den Anwendungen dieses Genom-Editing-Toolkits gehören gezielte Genmutationen und Genersatz, die das inhärente Potenzial funktioneller Genomikstudien beispielsweise bei Oomyceten stimulieren P. soja (Ma et al., 2017 Yang et al., 2017), Phytophthora capsici (Miao et al., 2018 Wang et al., 2018), Phytophthora palmivora (Gumtow et al., 2018) und Aphanomyces invadans (Majeed et al., 2018). Dennoch gibt es bei der umfassenden Nutzung dieser präzisions-gezielten Genom-Editing-Plattformen noch einige verbleibende Probleme für den effektiven Einsatz von Editiertechnologien bei Oomyceten.

Um zu verifizieren, dass ein mutierter Phänotyp wirklich auf das Fehlen eines bestimmten Gens zurückzuführen ist, ist die Wiedereinführung des nativen Gens in die Mutante, der das Gen fehlt, erforderlich. Dies kann durch die Wiedereinführung einer Kopie des Gens, auf einem Plasmid oder an einer anderen Stelle im Genom (Choudhary et al., 2015 Zhou et al., 2016 ) erfolgen, ein Ansatz, der sich bei Oomyceten als anwendbar erwiesen hat (Qiu et al., 2020). Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass nur ein Plasmid benötigt wird und es relativ einfach ist, ein an einer zufälligen Stelle wieder eingefügtes Gen zu exprimieren. Ein Nachteil besteht darin, dass die Transkription nicht verwandter Teile des Chromosoms an der Insertionsstelle beeinträchtigt sein kann (van Dam & Bos, 2012). Daher ist die Fähigkeit, das mutierte Gen genau zu ersetzen, um die Wiederherstellung des Phänotyps zu testen, sehr wünschenswert, um eine funktionelle Genomforschung zu erreichen.

In dieser Studie haben wir eine In-situ-Komplementierungsmethode in P. soja unter Verwendung eines Gens, das eine regulatorische B-Untereinheit von Proteinphosphatase 2A codiert. Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist eine Untergruppe weit konservierter Serin/Threonin-Phosphatasen und spielt verschiedene Rollen bei Transkription, Translation, Differenzierung, Zellzyklus und Signaltransduktion (Mumby & Walter, 1993). Wir identifizierten eine regulatorische B-Untereinheit von PP2A Holoenzym in P. soja, genannt PsPP2Ab1, das Ähnlichkeit mit CDC55 in . zeigt Saccharomyces cerevisiae (Healy et al., 1991). Ein CRISPR/Cas9-vermittelter Gen-Knockout und eine anschließende In-situ-Genkomplementierung wurden angewendet, um seine Funktion beim Myzelwachstum, der Sporangiumbildung und der Virulenz bei zu untersuchen P. soja. Unsere Ergebnisse demonstrieren eine erfolgreiche In-situ-Komplementierung und bekräftigen den Mehrwert der Genom-Editierung für die Entschlüsselung der Genfunktion in Phytophthora.


Update: Mutationen bei menschlichen Krebserkrankungen durch die Linse von KRAS

Korrektur der Autoren: Ein aufmerksamer Leser informierte uns, dass die Daten im Genome Data Analysis Center des Broad Institute zeigen, dass EGFR-Gene in Lungenadenokarzinomen tatsächlich nur dann stark mutiert sind, wenn KRAS vom Wildtyp (0/66, Mutant/Wildtyp) ist. Unser Skript konnte diese Voreingenommenheit aufgrund eines #DIV/0 nicht zurückgeben! Error. Der Text unten, Abbildung 2A und die Tabelle wurden jetzt korrigiert.

Im Jahr 2015 haben wir einen RAS-Dialog veröffentlicht, der TCGA-Daten (The Cancer Genome Atlas) verwendet, um die Arten von KRAS-Mutationen zu analysieren, die bei Krebserkrankungen gefunden werden, und die Gene, die häufig co-mutiert (zusammen mit KRAS mutiert), häufig kontra-mutiert (mutiert .) wenn KRAS Wildtyp war) oder häufig unabhängig vom KRAS-Status mutiert. Unsere Daten wurden vom GDAC (Genome Data Analysis Center) des Broad Institute heruntergeladen und umfassten 122 Pankreas (PAAD, duktales Pankreas-Adenokarzinom), 226 Lunge (LUAD, Lungenadenokarzinom), 149 Kolon (COAD, Kolon-Adenokarzinom) und 217 rektale ( READ, Rektumadenokarzinom) Proben, insgesamt 714 Patienten Tumoren.

Wir haben unsere Analyse jetzt wiederholt und die größere Anzahl von Tumorproben genutzt, die jetzt am GDAC-Standort von Broad sowie am Memorial Sloan Kettering (cBioPortal) und über das Genie-Projekt der AACR analysiert wurden. Darüber hinaus enthalten die cBioPortal- und Genie-Daten eine kombinierte Kategorie für Kolon- und Rektalproben (COADREAD). (Dies ist ein eindeutiger Satz von Proben, keine Kombination aus Dickdarm und Rektum.) Die Analysen dieser neueren Daten werden hier in grafischer Form (Download Figures) und auch in numerischer Form hier (Download Spreadsheet) präsentiert.

Legende zu den Zahlen

  1. Wie schon 2015 haben wir die signifikanten Gene im Tumor jedes Patienten farbkodiert dargestellt. Jede Spalte repräsentiert den Tumor eines einzelnen Patienten.
  2. Jede Reihe repräsentiert ein Gen, das signifikant mutiert ist (siehe Methoden unten).
  3. Gennamen sind nach folgendem Schema eingefärbt:
    1. Blaue Gennamen stehen für Gene, die mindestens viermal häufiger mutiert sind, wenn KRAS mutiert ist.
    2. Rote Gennamen stehen für Gene, die mindestens viermal häufiger mutiert sind, wenn KRAS ein Wildtyp ist.
    3. Schwarze Gennamen stehen für Gene, die in mindestens 20 % der Patientenproben mutiert sind, unabhängig vom KRAS-Status.

    Ergebnisse

    Die Zahl der zur Analyse zur Verfügung stehenden Patientenproben ist heute mit 20.503 Tumorproben deutlich größer als im Jahr 2015. Die Daten aus den drei Quellen wurden auf Gene analysiert, die in Patiententumorproben mutiert waren, wenn KRAS-Gene mutiert oder Wildtyp-Gene waren, und auf Gene, die unabhängig vom KRAS-Mutationsstatus stark mutiert waren. Die Ergebnisse für Bauchspeicheldrüsen-, Lungen-, Dickdarm-, Rektum- und Dickdarmkrebs werden als ein Raster aus Rechtecken angezeigt, die gefärbt sind, um die Aminosäureveränderungen in jeder Tumorprobe darzustellen, und auch in der Tabelle zusammengefasst. Die Anteile an mutiertem KRAS in jedem Datensatz sind in Tabelle 1 dargestellt.

    Tabelle 1. Die Anzahl der Tumorproben jedes Typs und die Anteile der mutierten KRAS-Gene in diesen Proben.
    Beispielstyp Breiter GDAC MSK cBioPortal AACR Genie
    Anzahl der Proben (% mutantes KRAS)
    Bauchspeicheldrüse (PAAD) 184 (76%) 766 (89%) 1973 (90%)
    Lunge (LUAD) 523 (31%) 890 (32%) 7429 (36%)
    Doppelpunkt (COAD) 347 (45%) 132 (38%) 3679 (44%)
    Rektal (LESEN) 121 (51%) 327 (45%) 1021 (44%)
    Kolorektal (COADREAD) --- 1378 (39%) 1733 (51%)

    Allgemeine Bemerkungen zur Methode

    • Das farbige Rasterformat für die Anzeige von Daten einzelner Patienten ist mit zunehmender Patientenzahl weniger sinnvoll, da die Rasterquadrate so klein werden, dass die Farben undeutlich werden. Vergleichen Sie die Broad GDAC-Daten zum rektalen Adenokarzinom (READ, N=121) mit den AACR Genie-Daten zum Lungenadenokarzinom (LUAD, N=7429).
    • Mit zunehmender Anzahl von Patienten-Tumorproben nimmt die Anzahl der Gene ab, die unsere Signifikanzfilter passieren. Zum Beispiel die Broad-GDAC-Daten für Pankreasadenokarzinom (PAAD, N=184) ergeben 14 Gene, die eher mutiert sind, wenn KRAS mutiert ist, 24 Gene, die eher mutiert sind, wenn KRAS Wildtyp ist, und 40 Gene, die stark mutiert sind, unabhängig davon, ob KRAS mutiert oder Wildtyp ist. Im Gegensatz dazu basieren die Daten von MSK cBioPortal und AACR Genie für PAAD auf 766 und 1973 Proben, und nach dem Filtern dieser Daten blieb kein co-mutiertes und nur ein kontra-mutiertes Gen übrig.
    • Der Einfachheit halber sind alle verschiedenen KRAS-Mutanten zusammen mit ihrer Anzahl und ihrem prozentualen Beitrag zu jedem Krebs auf den „KRAS-Mutanten“-Seiten von Spreadsheet aufgelistet.

    Adenokarzinome der Bauchspeicheldrüse

    • Mutantes KRAS bleibt der dominante Treiber bei PAAD (Tabelle 1 oben).
    • Als die Anzahl der analysierten Proben anstieg (184 -> 766 -> 1983), nahm die Anzahl der Gene, die unsere Tests bestanden, dramatisch ab (78 -> 3 -> 2). Siehe „Daten“-Seiten der Tabellenkalkulation.
    • TP53 ist in 60 – 70 % der KRAS-mutierten PAAD-Tumoren mutiert, und etwa halb so häufig, wenn KRAS Wildtyp ist.
    • Die häufigsten KRAS-Mutanten in den drei Sätzen von PDAC-Daten sind die gleichen, G12D > G12V > G12R >Q61H. Siehe PAAD KRAS-Mutanten-Seite der Kalkulationstabelle.
    • Siehe Abbildungen 1A-1C in Abbildungen.

    Lungenadenokarzinome

    • Als die Anzahl der Patientenproben dramatisch anstieg (523 – > 890 – > 7429), blieb der Anteil der Proben, die mutantes KRAS enthielten, bei etwa einem Drittel (Tabelle 1).
    • G12C-Mutationen machen etwa 40 % der in LUAD gefundenen KRAS-Mutanten und damit etwa 12 % aller LUAD-Tumoren aus.
    • EGFR-Mutationen sind in Lungenproben viel häufiger, jedoch nicht in anderen Geweben, wenn KRAS vom Wildtyp ist (siehe Varmus, et al., 2018).
    • Im Gegensatz zu Bauchspeicheldrüsentumoren enthalten Lungentumore eher mutierte TP53-Gene, wenn KRAS nicht mutiert ist.
    • Laut unseren Tests ergeben sowohl die Broad GDAC- als auch die MSK-cBioPortal-Daten sehr ähnliche Sätze von Genen, die in LUAD unabhängig vom KRAS-Status stark mutiert sind: alle 8 der stark mutierten Gene in den cBioPortal-Daten (CSMD3, LRP1B, MUC16, RYR2, TP53 , TTN, USH2A, ZFHX4) finden sich auch in den 11 Treffern der Broad-Daten. Im viel größeren AACR Genie-Datensatz passiert jedoch nur TP53 unsere Filter.
    • Siehe Abbildungen 2A-2C in den Abbildungen.

    Doppelpunkt (COAD), rektal (Lesen und kolorektal (COADREAD) Andenokarzinome

    • Die COADREAD-Tumordaten in den Datensätzen von MSK cBioPortal und AACR Genie stellen separate und unterschiedliche Tumoren dar, nicht die Summe von COAD und READ.
    • KRAS-Gene sind mutiert in

    Diskussion

    Die Zahl der Patientenproben, die auf Missense-Mutationen analysiert wurden, hat sich seit unserer Analyse der TCGA-Daten im Jahr 2015 um das 28-Fache erhöht. Unsere Filter zum Nachweis von Genen, die mit mutierten KRAS-Genen ko- oder kontra-mutiert waren, fanden 2015 viele Treffer, die wurden mit zunehmender Probenanzahl nicht repliziert und übersehen andere Gene, deren Bedeutung jetzt schwer zu übersehen ist (z. B. EGFR-Mutanten bei Lungenkrebs).

    Bei Pankreas-Adenokarzinomen liegt die Inzidenz von mutiertem KRAS bei etwa 90 %, was bedeutet, dass es schwierig ist, Gene herauszukitzeln, die in der viel geringeren Anzahl von Proben, in denen KRAS Wildtyp ist, signifikant mutiert sind. Zum Beispiel ist selbst bei zehnmal mehr Proben (AACR Genie-Daten) die Bedeutung von mutiertem BRAF schwer zu beurteilen: 28 Fälle, in denen KRAS Wildtyp war (N = 193), 9 Fälle, wenn KRAS mutiert war (N = 1780) . Missense-Mutationen in TP53 sind bei Bauchspeicheldrüsen- (und Lungen- und Dickdarmkrebs) häufig, unabhängig davon, ob es sich bei KRAS um eine Mutante oder einen Wildtyp handelt.

    Das Signal dafür, dass EGFR nur mutiert ist, wenn KRAS ein Wildtyp ist, ist in allen drei Datenbanken sehr stark. Jetzt, da sich KRAS G12C-Inhibitoren in klinischen Phase-3-Studien befinden, werden jedes Jahr Zehntausende von Patienten mit G12C- oder EGFR-Mutationen (14 % bzw. 27 % der 7429 AACR Genie LUAD-Proben) davon profitieren.

    Wir sind keine Pathologen und würden uns über Kommentare zur Definition der Tumorkategorie COADREAD freuen. G13D-Mutanten sind in dieser Gruppe relativ häufig und umfassen

    15 % aller KRAS-Mutationen (im Vergleich zu 3 % bei LUAD und 1 % bei PAAD), ebenso wie A146Ts (

    6% in der kolorektalen Gruppe, aber <1% in PAAD und LUAD). Sowohl die G13D- als auch die A146T-Form von KRAS tauschen GDP gegen GTP in Abwesenheit der GEFs (Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren) viel stärker aus als andere Mutanten, aber warum dies in kolorektalen Geweben höher selektiert werden könnte, ist nicht klar.

    Methoden

    Die Daten wurden von jeder Site heruntergeladen und so formatiert, dass sie mit Sequence Query Language (SQL) analysiert werden konnten. Wir haben ein R-Skript geschrieben, das Folgendes tut:

    Test 1: Einige der Proben enthalten eine große Anzahl (Tausende) mutierter Gene. Wir kamen zu dem Schluss, dass die meisten Mutationen in solchen Proben wahrscheinlich Passagiere und nicht Treiber von Krebsphänotypen waren. Daher wurde die mittlere Anzahl mutierter Gene in Proben von jedem Tumortyp bestimmt, und Proben mit einer Anzahl mutierter Gene größer als zwei Standardabweichungen über dem Mittelwert wurden von weiteren Tests ausgeschlossen.

    Test 2: Wir wählten KRAS als Indexgen für die Komutationsanalyse. Das Skript wählte nur Missense-Mutationen in Exons aus.

    Test 3: Co-mutierte oder kontra-mutierte Gene wurden gefunden, indem die Kandidatengene zwei Tests bestehen mussten. Test 3a: Gene müssen in mindestens 10 % der Proben mutiert sein, bei denen entweder KRAS mutiert oder KRAS ein Wildtyp ist. Test 3b: Benennen Sie Gene, die mit KRAS komutiert sind, wenn sie mehr als 4-mal so oft (nach Häufigkeit) mutiert sind, wenn KRAS mutiert ist. Nennen Sie Gene mit KRAS kontra-mutiert, wenn sie 4-mal so oft mutiert sind, wie KRAS vom Wildtyp ist.

    Test 4: Gene, die unabhängig vom KRAS-Status stark mutiert waren (>20%), wurden ebenfalls eingeschlossen.

    Test 5: Single-Missense-Mutationen, die entweder Test 3 oder Test 4 erfüllen, werden in separaten Zeilen angezeigt.

    Die Ergebnisse der obigen Tests sind als Rechteckgitter aufgetragen, wobei jedes Rechteck ein Gen in einer Tumorprobe eines Patienten darstellt. Wenn ein Gen in einer bestimmten Probe mutiert ist, wird dieses Rechteck für diese bestimmte Missense-Mutation gefärbt. Weiße Rechtecke in den Diagrammen zeigen, dass das Gen in dieser Tumorprobe ein Wildtyp war. Schwarze Rechtecke erscheinen nur in Zeilen, in denen eine bestimmte Aminosäureänderung die obigen Tests bestanden hat, und repräsentieren andere Mutationen in diesem Gen als die angegebene Mutation. Bei Lungenadenokarzinomen hat beispielsweise die G12C-Mutation von KRAS die obigen Tests bestanden, und solche Proben erscheinen als grüne Rechtecke in der KRASG12C-Reihe. Patientenproben mit anderen KRAS-Mutationen wie G12V, G13D usw. werden in dieser Zeile als schwarze Rechtecke dargestellt.

    Für weitere Informationen kontaktieren Sie Dr. Ming Yi unter [email protected]

    Neue Klarheit über den Warburg-Effekt

    RAS-bindende Verbindungen: Annäherung an das Nicht-Drugable aus einer anderen Perspektive

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    Die meisten temperaturempfindlichen Mutationen beeinflussen Proteine ​​und verursachen einen Verlust der Proteinfunktion bei der nicht-permissiven Temperatur. Die zulässige Temperatur ist eine Temperatur, bei der sich das Protein typischerweise richtig falten kann oder richtig gefaltet bleiben kann. Bei höheren Temperaturen ist das Protein instabil und funktioniert nicht mehr richtig. Diese Mutationen sind bei diploiden Organismen normalerweise rezessiv. Temperaturempfindliche Mutanten arrangieren einen reversiblen Mechanismus [1] und sind in der Lage, bestimmte Genprodukte in unterschiedlichen Wachstumsstadien zu reduzieren, und zwar leicht durch Änderung der Wachstumstemperatur.

    Die permissive Temperatur ist die Temperatur, bei der ein temperaturempfindliches mutiertes Genprodukt einen normalen, funktionellen Phänotyp annimmt. [2] Wenn eine temperaturempfindliche Mutante unter permissiven Bedingungen gezüchtet wird, verhält sich das mutierte Genprodukt normal (was bedeutet, dass der Phänotyp nicht beobachtet wird), selbst wenn ein mutiertes Allel vorhanden ist. Dies führt zum Überleben der Zelle oder des Organismus, als ob es ein Wildtyp-Stamm wäre. Im Gegensatz dazu ist die nicht-permissive Temperatur oder restriktive Temperatur die Temperatur, bei der der mutierte Phänotyp beobachtet wird.

    Temperatursensitive Mutationen sind normalerweise Missense-Mutationen, die dann die Funktion eines spezifizierten notwendigen Gens bei der standardmäßigen, zulässigen, niedrigen Temperatur beinhalten. Alternativ fehlt ihm die Funktion bei einer ziemlich hohen, nicht-permissiven Temperatur und zeigt eine hypomorphe (teilweiser Verlust der Genfunktion) und eine mittlere, semi-permissive Temperatur. [3]

    Temperaturempfindliche Mutanten sind in der biologischen Forschung nützlich. Sie ermöglichen die Untersuchung wesentlicher Prozesse, die für das Überleben der Zelle oder des Organismus erforderlich sind. Mutationen an essentiellen Genen sind im Allgemeinen tödlich und daher ermöglichen temperaturempfindliche Mutanten den Forschern, den Phänotyp bei den restriktiven Temperaturen zu induzieren und die Auswirkungen zu untersuchen. Der temperaturempfindliche Phänotyp könnte während eines bestimmten Entwicklungsstadiums ausgedrückt werden, um die Auswirkungen zu untersuchen.

    Beispiele Bearbeiten

    In den späten 1970er Jahren wurde der sekretorische Pfad der knospenden Hefe, der für die Lebensfähigkeit der Zelle und für das Wachstum neuer Knospen essentiell ist, unter Verwendung temperaturempfindlicher Mutanten seziert, was zur Identifizierung von dreiundzwanzig essentiellen Genen führte. [4]

    In den 1970er Jahren wurden mehrere temperaturempfindliche mutierte Gene in der Fruchtfliege identifiziert, wie z shibire ts , die zur ersten genetischen Dissektion der synaptischen Funktion führte. [5] In den 1990er Jahren wurde der Hitzeschockpromotor hsp70 zur temperaturmodulierten Genexpression in der Fruchtfliege verwendet. [6]

    Bakteriophage Bearbeiten

    Eine Infektion von an E coli Wirtszelle durch einen Bakteriophagen (Phagen) T4 temperaturempfindlich (ts) konditionell letale Mutante bei einer hohen restriktiven Temperatur führt im Allgemeinen zu keinem Phagenwachstum. Eine Koinfektion unter restriktiven Bedingungen mit zwei ts Mutanten, die in verschiedenen Genen defekt sind, führen aufgrund der intergenen Komplementation im Allgemeinen zu einem robusten Wachstum. Die Entdeckung von ts Mutanten des Phagen T4 und die Verwendung solcher Mutanten in Komplementationstests trugen zur Identifizierung vieler Gene in diesem Organismus bei. [7] Da mehrere Kopien eines durch ein Gen spezifizierten Polypeptids häufig Multimere bilden, können Mischinfektionen mit zwei verschiedenen ts Mutanten, die im gleichen Gen defekt sind, führen oft zu gemischten Multimeren und teilweiser Wiederherstellung der Funktion, ein Phänomen, das als intragene Komplementation bezeichnet wird. Intragene Komplementierung von ts Mutanten, die im gleichen Gen defekt sind, können Informationen über die strukturelle Organisation des Multimers liefern. [8]

    Wachstum von Phagen ts Mutanten unter teilweise restriktiven Bedingungen wurden verwendet, um die Funktionen von Genen zu identifizieren. So wurden Gene identifiziert, die bei der Reparatur von DNA-Schäden eingesetzt werden, [9] [10] sowie Gene, die die genetische Rekombination beeinflussen. [11] [12] Zum Beispiel wächst a ts Die DNA-Reparaturmutante bei einer Zwischentemperatur ermöglicht die Produktion einiger Phagennachkommen. Wenn das jedoch ts Mutante mit UV-Licht bestrahlt wird, ist ihr Überleben stärker reduziert als die Überlebensreduzierung des bestrahlten Wildtyp-Phagen T4.

    Bedingte letale Mutanten, die bei hohen Temperaturen wachsen, aber bei niedrigen Temperaturen nicht wachsen können, wurden ebenfalls in Phagen T4 isoliert. [13] Diese kälteempfindlichen Mutanten definierten einen diskreten Satz von Genen, von denen einige zuvor durch andere Arten von konditional letalen Mutanten identifiziert worden waren.


    UNIVERSITY PARK, Pennsylvania — Ein neuer Ansatz zur Gen-Editierung mit dem CRISPR/Cas9-System umgeht krankheitsverursachende Mutationen in einem Gen und ermöglicht die Behandlung von genetischen Krankheiten, die mit einem einzelnen Gen verbunden sind, wie Mukoviszidose, bestimmte Arten von Sichelzellenanämie, und andere seltene Krankheiten. Die Methode, die von Forschern der Penn State an Mäusen und menschlichen Gewebekulturen entwickelt und getestet wurde, beinhaltet das Einfügen einer neuen, voll funktionsfähigen Kopie des Gens, das das mutierte Gen verdrängt.

    Ein Proof-of-Concept für diesen Ansatz, der von Forschern der Penn State entwickelt wurde, wird in einem Artikel beschrieben, der am 20. April in der Zeitschrift Molecular Therapy erscheint.

    Das CRISPR/Cas9-System hat vielversprechende neue Gentherapien ermöglicht, mit denen krankheitsverursachende Mutationen in einem Gen gezielt und korrigiert werden können. Bei diesem Prozess schneidet Cas9 – ein bakterielles Protein – DNA an einer bestimmten Stelle, wo die genetische Sequenz dann bearbeitet, getrimmt oder eine neue Sequenz eingefügt werden kann, bevor die DNA repariert wird. Es gibt jedoch zwei Haupteinschränkungen der gegenwärtigen Reparaturstrategien. Erstens erfordert die gängige Reparaturstrategie, die als „homologiegerichtete Reparatur“ bezeichnet wird, die Verwendung spezifischer Proteine ​​in der Zelle, die nur während der Zellteilung vorhanden sind, was bedeutet, dass der Genreparaturprozess in den meisten erwachsenen Geweben, in denen eine Zellteilung selten stattfindet, nicht angewendet werden kann.

    „Die zweite Herausforderung ergibt sich aus der Tatsache, dass selbst wenn eine Krankheit durch ein einzelnes Gen verursacht wird, sie aus einer Vielzahl unterschiedlicher Mutationen innerhalb dieses Gens resultieren kann“, sagte Douglas Cavener, Professor für Biologie an der Penn State und leitender Autor der Studie . „Bei der homologiegesteuerten Reparatur müssten wir die Strategie für jede einzelne dieser Mutationen entwickeln und testen, was teuer und zeitintensiv sein kann. In dieser Studie haben wir einen Ansatz namens Co-opting Regulation Bypass Repair (CRBR) entwickelt, der sowohl bei sich teilenden als auch sich nicht teilenden Zellen/Geweben und für ein Spektrum von Mutationen innerhalb eines Gens verwendet werden kann. Dieser Ansatz ist besonders vielversprechend für seltene genetische Erkrankungen, die durch ein einzelnes Gen verursacht werden, bei denen begrenzte Zeit und Ressourcen in der Regel ein Design und Testen auf die vielen möglichen krankheitsverursachenden Mutationen ausschließen.“

    CRBR nutzt das CRISPR/Cas9-System und einen zellulären Reparaturweg, der als „nicht homologe Endverknüpfung“ bezeichnet wird, um eine genetische Sequenz zwischen der Promotorregion eines mutierten Gens – der genetischen Sequenz, die kontrolliert, wann und wo das Gen funktionsfähig ist – und dem mutierten . einzufügen Teil des Gens. Die neu eingefügte Sequenz enthält eine kondensierte Version des normalen Gens, die anstelle der mutierten Version verwendet wird. Eine Terminatorsequenz am Ende der inserierten Sequenz verhindert, dass das verbleibende stromabwärts mutierte Gen verwendet wird. Da CRBR nicht auf die Proteine ​​angewiesen ist, die für die homologiegerichtete Reparatur benötigt werden, kann es in allen Arten von adulten Geweben verwendet werden.

    „Unser Ansatz nutzt den nativen Promotor für ein Gen“, sagte Jingjie Hu, Doktorandin an der Penn State und Erstautorin des Papiers. „Das bedeutet, dass das neu eingefügte Gen zu den gleichen Zeiten und in angemessener Menge innerhalb der Zelle exprimiert wird wie das Gen, das es ersetzt. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Arten von Gentherapien, die auf einen externen Promotor angewiesen sind, um eine hohe Expression des Gens zu erreichen, was zu negativen Auswirkungen führen könnte, wenn zu viel produziert wird oder wenn unter bestimmten physiologischen Bedingungen eine wesentliche Regulationsreaktion fehlt.“

    Das Forschungsteam führte eine Reihe von Proof-of-Concept-Experimenten durch, um den Nutzen dieser Methode zu demonstrieren. Sie konzentrierten sich zunächst auf das PERK-Gen, dessen Mutationen zu einer seltenen Krankheit namens Wolcott-Rallison-Syndrom führen können. Das Syndrom entsteht, wenn Kopien des von beiden Elternteilen geerbten Gens Mutationen aufweisen – es handelt sich um eine „rezessive“ Krankheit – und kann Neugeborenen-Diabetes, Skelettprobleme, Wachstumsverzögerung und andere Symptome verursachen.

    Die Forscher fügten das PERK-Gen mit CRBR in gesunde Mäuse ein und kreuzten sie mit Mäusen, die eine Mutation im Gen aufwiesen. Die resultierenden Mäuse, die ein CRBR-editiertes PERK-Gen und ein mutiertes PERK-Gen enthielten, wiesen nicht die typischen Anomalien im Zusammenhang mit dem Syndrom auf, was darauf hindeutet, dass das CRBR-editierte Gen die PERK-Genfunktion in einem Mausmodell der Wolcott-Rallison® retten kann Syndrom.

    Als nächstes testeten die Forscher die CRBR-Methode in menschlichem Gewebe, in diesem Fall konzentrierten sie sich auf das Insulin-Gen. Sie fügten eine grün fluoreszierende Proteinmarker-Gensequenz zwischen dem Insulin-Gen-Promotor und der für Insulin kodierenden Sequenz in menschliche Kadaverzellen ein. Dieses Experiment führte zur Expression des fluoreszierenden Proteins in den insulinsekretierenden Zellen, jedoch nicht in anderen Zelltypen, was darauf hindeutet, dass die neue Sequenz unter der Kontrolle des Insulinpromotors streng reguliert wurde.

    „Unsere Ergebnisse zeigten, dass die CRBR-Genreparatur die PERK-Genfunktion bei Mäusen wiederherstellen kann und zeigten den potenziellen Nutzen von CRBR für die Genreparatur in menschlichem Gewebe“, sagte Hu.

    Die Forscher stellen fest, dass die Genbearbeitung mit CRISPR/Cas9 fehleranfällig sein kann. Beispielsweise könnten homologiegerichtete reparaturbasierte Strategien potenziell schädliche Mutationen in der kodierenden Sequenz erzeugen, wenn die Reparatur nicht richtig abläuft. Mit CRBR zielen die Forscher auf die Insertion innerhalb einer Region des Gens ab, die nicht für Protein kodiert, was gegenüber diesen Fehlern toleranter sein sollte.

    „Gentherapien wie CRBR, die CRISPR/Cas9 nutzen, stehen weiterhin vor der Herausforderung, Reparaturmaschinen in die interessierenden Zellen einzubringen“, sagte Cavener. „Eine vielversprechende Entwicklung besteht darin, Zellen oder Gewebe des betroffenen Patienten zu isolieren, ein mutiertes Gen im Labor zu reparieren und dann die reparierten Zellen oder Gewebe wieder in den Patienten zu transplantieren. Wir hoffen, dass CRBR bei der weiteren Verbesserung der Verabreichungsmethoden zur Behandlung des Wolcott-Rallison-Syndroms sowie anderer humangenetischer Erkrankungen eingesetzt werden kann.“

    Neben Cavener und Hu gehören zum Forschungsteam von Penn State die wissenschaftliche Mitarbeiterin Rebecca Bourne Associate Research Professor für Biologie Barbara McGrath-Studentin Alice Lin und der Assistant Research Professor für Biologie Zifei Pei. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health und dem Penn State Eberly College of Science unterstützt.


    Die Labormaus ist das am häufigsten verwendete Tiermodell zur Untersuchung der Genetik und Biologie der Entwicklung und Fortpflanzung von Säugetieren. Die Gen-Targeting-Technologie für embryonale Stammzellen (ESC) und die hochentwickelten genomischen Manipulationen, die sie ermöglichte, waren für diesen Organismus lange Zeit einzigartig. Dies war ein wichtiger Faktor für den Aufstieg der Maus als Modellsystem in den letzten drei Jahren Jahrzehnte oder so. Das jüngste Aufkommen der CRISPR/Cas9-Technologie hat die Anwendung der Genom-Editierung auf praktisch alle Organismen demokratisiert. Dennoch macht die wissenschaftliche Infrastruktur der Maus sie immer noch zum Organismus der Wahl, um molekulare Mechanismen der Säugetierentwicklung zu untersuchen und die menschliche Entwicklung und Krankheit zu modellieren.

    Die internationale Gemeinschaft ist auf dem besten Weg, Knockouts für jedes Mausgen zu generieren und die phänotypischen Konsequenzen zu bestimmen. Mehr als die Hälfte aller Gene sind bei Mäusen mutiert, und mehrere Hundert haben gefunden, dass sie die Fertilität oder Gametogenese stören [1]. Ein Haupthindernis für die Reproduktionsgenetik – und andere Bereiche der Erforschung der Physiologie des Erwachsenen – ist jedoch dies

    1/4 aller Mausgene werden für die Lebensfähigkeit benötigt [2]. Daher können ganze Tier-Knockouts nicht verwendet werden, um die Anforderungen an diese Gene in bestimmten Geweben wie denen des Fortpflanzungssystems zu untersuchen.Dieses seit langem bestehende Problem hat die Entwicklung von konditionalen Mutagenese-Technologien vorangetrieben, vor allem das ortsspezifische Cre/loxP-Rekombinase-System, das häufig bei Mäusen verwendet wird [3]. Im Prinzip löst diese Technologie viele der Probleme bei der Untersuchung der gewebespezifischen Funktionen embryonaler letaler Gene. Warum ist also ein anderer Ansatz wünschenswert, wie er in dieser Ausgabe von Miura und Kollegen vorgestellt wird [ 4]?

    Es gibt zwei wichtige Punkte, die die Effizienz der konditionalen Standardmutagenese einschränken: 1) die Entwicklung effizienter und effektiver Cre-Treiber und 2) der haltungsintensive Aspekt dieser Strategie. Im Allgemeinen ist ein Forscher auf Cre-Linien angewiesen, die zuvor charakterisiert wurden, und erhält die relevanten Treibermäuse (relevant für diese Geschichte, ein Cre, das während eines bestimmten Stadiums der Gametogenese wirkt, wie Vasa-Cre), die mit einem floxed-Allel gekreuzt werden des embryonalen letalen interessierenden Gens (GOI), dann werden für das floxed-Allel heterozygote Geschwister (von denen mindestens eines ein Cre-Transgen enthält) gekreuzt, um Cre-transgenhaltige Nachkommen zu erhalten, die für das floxed-Allel homozygot sind. Die Keimbahn dieser Mäuse kann dann untersucht werden. Wie in Abbildung 1 dargestellt, werden mindestens drei Generationen benötigt, um die Versuchstiere zu erhalten. Daher ist dies nicht nur zeitaufwendig, sondern auch teuer und erfordert eine beträchtliche Anzahl von Tieren.

    Vergleich der traditionellen bedingten Mutagenese mit der Embryokomplementierungsmethode von Miura et al. GOI, interessierendes Gen Flox, Gen, das loxP-Stellen enthält, die die kritische Region flankieren.

    Vergleich der traditionellen bedingten Mutagenese mit der Embryokomplementierungsmethode von Miura et al. GOI, interessierendes Gen Flox, Gen, das loxP-Stellen enthält, die die kritische Region flankieren.

    Miura und Kollegen demonstrierten die Machbarkeit eines alternativen Ansatzes für eine einzige Generation, um die oben genannten Probleme zu mildern. Das Grundkonzept ist die Embryokomplementation, bei der chimäre Mäuse erzeugt werden, die Zellen aus zwei verschiedenen Genomen mit unterschiedlichen Mutationen enthalten. Diese Mäuse werden durch die Einführung von ESCs erzeugt, denen eine GOI fehlt (in diesem Fall Dnmt3b) in Wirtsblastozysten, denen die Nanos3 Gen, das für die Keimzellentwicklung benötigt wird. Nanos3-defiziente Mäuse haben einen ausgelöschten primordialen Keimzellpool und sind daher steril. Mangel an Dnmt3b verursacht den embryonalen Tod

    ¾ durch die Schwangerschaft. Daher könnten chimäre Mäuse nur lebensfähig sein, wenn Schlüsselzelllinien von den Wirtsembryonen abgeleitet werden und könnten nur fruchtbar sein, wenn ESCs die Keimbahn kolonisieren und Dnmt3b ist für die Fruchtbarkeit unwesentlich. Genau das fanden die Autoren heraus.

    Obwohl die zur Herstellung dieser Mäuse verwendeten allgemeinen Technologien Routine sind, erfordert die Methode zwei nicht triviale Schritte. Eine besteht darin, eine Sammlung von keimzelldefizienten (Nanos3 −/− ) Embryoempfänger. Sie erreichten dies über de novo CRISPR/Cas9-Mutagenese durch Mikroinjektion von befruchteten Eizellen mit Cas9-mRNA und 3 hocheffizienten sgRNAs-Targeting Nanos3. Folge in vitro Kultur bis zum Blastozystenstadium, die Embryonen werden dann mit mikroinjiziert Dnmt3b −/− ESCs. In diesem Papier waren die ESCs bereits aus einem Repository verfügbar, aber ansonsten müsste man eine homozygote mutierte ESC-Linie ableiten. Typischerweise würde dies durch traditionelles Gen-Targeting in ESCs, CRISPR-Mutagenese von ESCs oder durch Ableitung einer neuen ESC-Linie aus Blastozysten erfolgen, die durch Kreuzung heterozygoter Tiere produziert wurden.

    Die eigentliche Stärke dieses Ansatzes besteht darin, dass Gründertiere direkt ausgewertet werden können. Unter der Annahme, dass qualitativ hochwertige ESCs verwendet werden, die die interessierende Mutation enthalten, können nur dann Nachkommen erzeugt werden, die von den ESCs abgeleitet werden (geeignete Unterschiede in der Fellfarbengenetik zwischen dem Wirtsembryo und den ESCs können verwendet werden), wenn die GOI NICHT für die Fruchtbarkeit erforderlich. Das Versäumnis, fruchtbare Chimären abzuleiten, würde darauf hinweisen, dass der GOI tatsächlich für die Fruchtbarkeit erforderlich ist. Die adulten Chimären könnten dann einer phänotypischen Analyse unterzogen werden. Besteht der Verdacht, dass die Mutation früh in der Keimzellentwicklung wirkt (zum Beispiel wenn Erwachsenen keine Keimzellen fehlen), könnten chimäre Embryonen zu geeigneten Zeitpunkten untersucht werden.

    Der Ansatz hat nur ein paar Nachteile. Einer ist die Voraussetzung für homozygote mutierte ESCs. Wie oben erwähnt, gibt es einige Möglichkeiten, diese abzuleiten, aber es gibt ein kleines Rätsel: Der Goldstandard für die Bestimmung der Qualität einer ESC-Linie ist, dass sie „keimbahn“ kann, d. h., sie behält das Potenzial, zu allen Geweben einer erwachsenen Maus beitragen, einschließlich der Keimzellen. Wenn der GOI jedoch für die embryonale Lebensfähigkeit erforderlich ist, kann eine solche Linie nicht vorgetestet werden. Daher wäre es ratsam, mehrere Zeilen zu erhalten. Tatsächlich war die Effizienz der Erzeugung „geretteter“ Chimären im Miura . gering et al. Papier, wahrscheinlich ein Ergebnis von minderwertigen ESCs. Wenn man die Gametogenese über das Stadium der Geschlechtsbestimmung hinaus untersuchen wollte, wären außerdem sowohl männliche als auch weibliche mutierte ESCs erforderlich. Der zweite Nachteil hat damit zu tun, wann das tödliche Gen zum ersten Mal in der Keimbahn benötigt wird und wie dies mit dem interessierenden Stadium des Forschers zusammenhängt. Wenn man zum Beispiel an der Rolle eines Gens bei der Meiose interessiert wäre, das Gen aber für das Überleben der PGC benötigt wird, wäre man behindert.

    Trotz der technischen Probleme ist die Embryo-Komplementierungsmethode sehr clever und sollte als First-Line-Ansatz betrachtet werden, um die Rolle eines ansonsten tödlichen Gens in der Keimbahn anzugehen. Es gibt technische Möglichkeiten, den Prozess zu rationalisieren, wie z. B. die Elektroporation anstelle der Mikroinjektion für die CRISPR-Mutation Nanos3 in Zygoten [ 5], und auf ähnliche Weise ESCs mit einem CRISPR/Cas9/sgRNA-Vektor transfizieren. Schließlich ist diese Option, Gründertiere zu verwenden, sehr attraktiv, da jemand, der eine himmelhohe monatliche Rechnung für Maustagegelder zahlt und daher Angst davor hat, sich auf ein bedingtes Mutagenese-Projekt einzulassen, dessen Antwort viele Monate dauern würde.


    Datenbank für seltene Krankheiten

    NORD dankt David Brouch, NORD Intern von der University of Notre Dame, Jakub Tolar, MD, PhD, Executive Vice Dean, Medical School, Distinguished McKnight University Professor, Department of Pediatrics, Division of Blood and Marrow Transplantation, Director, Stem Cell Institute , Edmund Wallace Tulloch und Anna Marie Tulloch Chair in Stem Cell Biology, Genetics and Genomics, und Blanche P Alter, MD, MPH, FAAP, Clinical Genetics Branch, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, für die Unterstützung bei der Vorbereitung von dieser Bericht.

    Synonyme von Fanconi-Anämie

    Allgemeine Diskussion

    Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene genetische Erkrankung, die in die Kategorie der erblichen Knochenmarksversagenssyndrome fällt. Die Hälfte der Patienten wird vor dem 10. Lebensjahr diagnostiziert, während etwa 10 % als Erwachsene diagnostiziert werden. Frühe Diagnosen werden bei Patienten mit Geburtsfehlern wie geringer Größe, abnormalen Daumen- und/oder Radiusknochen, Hautpigmentierung, kleinen Köpfen, kleinen Augen, abnormalen Nierenstrukturen sowie Herz- und Skelettanomalien erleichtert. Die Erkrankung ist oft mit einem fortschreitenden Mangel der gesamten Knochenmarkproduktion von Blutkörperchen, roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen verbunden. Betroffene Personen haben ein erhöhtes Risiko, einen Krebs der blutbildenden Zellen im Knochenmark zu entwickeln, der als akute myeloische Leukämie (AML) bezeichnet wird, oder an Tumoren des Kopfes, Halses, der Haut, des Magen-Darm-Systems oder des Genitaltrakts. FA kommt bei Männern und Frauen gleichermaßen vor und kommt in allen ethnischen Gruppen vor. Sie wird in der Regel als autosomal-rezessive Erbkrankheit vererbt, aber auch über X-chromosomale Vererbung wurde berichtet.

    Einführung

    Es gibt mehrere Subtypen von FA, die aus der Vererbung von zwei Genmutationen in jedem von mindestens 18 verschiedenen Genen resultieren. Die meisten Subtypen teilen die charakteristischen Symptome und Befunde. Die Fanconi-Anämie ist nicht dasselbe wie das Fanconi-Syndrom, eine seltene Nierenfunktionsstörung.

    Anzeichen und Symptome

    Die Symptome von FA variieren von Person zu Person. Zu den identifizierten Symptomen gehören eine Vielzahl von körperlichen Anomalien, Knochenmarkversagen und ein erhöhtes Malignitätsrisiko. Körperliche Auffälligkeiten zeigen sich normalerweise in der frühen Kindheit, aber in seltenen Fällen werden die Diagnosen im Erwachsenenalter gestellt. Probleme mit der Blutproduktion treten häufig im Alter zwischen 6 und 8 Jahren auf. Knochenmarkversagen tritt schließlich bei der Mehrheit der betroffenen Personen auf, obwohl das Fortschreiten und das Alter des Beginns variieren. Patienten, die das Erwachsenenalter erreichen, entwickeln wahrscheinlich viel früher als die allgemeine Bevölkerung Kopf-Hals-, gynäkologische und/oder Magen-Darm-Krebs, unabhängig davon, ob sie frühere Blutprobleme hatten oder nicht.

    Körperliche Anomalien
    Mindestens 60 % der von FA betroffenen Personen werden mit mindestens einer körperlichen Anomalie geboren. Dies kann Folgendes umfassen:

    -Kleinwuchs
    -Daumen- und Armanomalien: ein zusätzlicher oder falsch geformter oder fehlender Daumen und Finger oder ein unvollständig entwickelter oder fehlender Radius (einer der Unterarmknochen)
    -Skelettanomalien der Hüften, Wirbelsäule oder Rippen
    - Nierenstrukturprobleme
    - Hautpigmentierung (sogenannte Café-au-lait-Flecken)
    -kleiner Kopf
    -kleine, gekreuzte oder weit auseinanderstehende Augen
    -niedriges Geburtsgewicht
    - Magen-Darm-Beschwerden
    -kleine Fortpflanzungsorgane bei Männern
    -Defekte in Geweben, die die Herzkammern trennen

    Personen mit Anämie können Müdigkeit, erhöhtes Schlafbedürfnis, Schwäche, Benommenheit, Schwindel, Reizbarkeit, Kopfschmerzen, blasse Hautfarbe, Atembeschwerden und Herzsymptome erfahren.

    Nach minimalen Verletzungen kann es zu übermäßigen Blutergüssen und spontanen Blutungen aus den Schleimhäuten, insbesondere von Zahnfleisch und Nase, kommen.

    Knochenmarkversagen
    Knochenmark ist die schwammartige Substanz, die sich in der Mitte der langen Knochen des Körpers befindet. Das Knochenmark produziert spezialisierte Zellen (hämatopoetische Stammzellen), die wachsen und sich schließlich zu roten Blutkörperchen (Erythrozyten), weißen Blutkörperchen (Leukozyten) und Blutplättchen entwickeln. Die Zellen werden in den Blutkreislauf freigesetzt, um durch den Körper zu reisen und ihre spezifischen Funktionen zu erfüllen. Rote Blutkörperchen versorgen den Körper mit Sauerstoff, weiße Blutkörperchen helfen bei der Abwehr von Infektionen und Blutplättchen ermöglichen dem Körper, Blutgerinnsel zu bilden, um Blutungen zu stoppen.

    Progressives Knochenmarkversagen tritt typischerweise im Alter von 10 Jahren auf und wird normalerweise von niedrigen Thrombozytenwerten oder niedrigen weißen Blutkörperchen begleitet. Im Alter von 40 bis 50 Jahren liegt die geschätzte Inzidenz eines Knochenmarkversagens als erstes schwerwiegendes Ereignis bei über 50 %.

    Betroffene Personen entwickeln niedrige Spiegel aller zellulären Elemente des Knochenmarks – rote und weiße Blutkörperchen und Blutplättchen – was zu Folgendem führen kann:
    -niedrige Anzahl zirkulierender roter Blutkörperchen – Anämie
    -niedrige Anzahl weißer Blutkörperchen – Leukopenie
    -niedrige Konzentration an Neutrophilen (eine Art von weißen Blutkörperchen) – Neutropenie
    -niedriger Blutplättchenspiegel – Thrombozytopenie

    Erhöhtes Malignitätsrisiko
    Personen mit FA haben ein höheres Risiko als die allgemeine Bevölkerung, bestimmte Krebsarten zu entwickeln, einschließlich akuter myeloischer Leukämie und spezifischer solider Tumoren. Betroffene Personen können ein extrem hohes Risiko haben, an Krebs zu erkranken, der den Kopf-Hals-Bereich, den Magen-Darm-Trakt, die Speiseröhre oder gynäkologische Bereiche betrifft. Bei den meisten handelt es sich um eine spezielle Form von Krebs, das sogenannte Plattenepithelkarzinom. FA-Patienten, deren Knochenmarkversagen mit männlichen Hormonen (sogenannten „Androgenen“) behandelt wird, haben ein erhöhtes Risiko für Lebertumore.

    In etwa 30 Prozent der mit Krebs assoziierten Fälle geht die Entwicklung einer Malignität der Diagnose von FA voraus.

    Ursachen

    Die Chromosomen in den Zellen von Personen mit FA sind nicht in der Lage, Schäden durch Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu reparieren und können daher leicht brechen und sich neu anordnen (Chromosomeninstabilität). DNA ist der Träger des genetischen Codes und DNA-Schäden sind ein alltägliches Ereignis. Bei den meisten Menschen werden DNA-Schäden repariert. Bei Personen mit FA treten jedoch häufiger Brüche und Umlagerungen auf und ihre Körper sind langsam oder reparieren den Schaden nicht.

    Mutationen in mindestens 18 Genen können FA verursachen. Die von diesen Genen kodierten Proteine ​​arbeiten in einem gemeinsamen Weg zusammen, der als FA-Weg bezeichnet wird und bei DNA-Schäden in Betrieb geht. Der FA-Weg schickt bestimmte Proteine ​​in den beschädigten Bereich, damit DNA repariert und DNA weiter kopiert (repliziert) werden kann. Acht Proteine ​​bilden einen Komplex, der als FA-Kernkomplex bekannt ist und zwei Gene aktiviert, um Proteine ​​herzustellen, die FANCD2 und FANCI genannt werden. Die Aktivierung dieser beiden Proteine ​​bringt DNA-Reparaturproteine ​​in den Bereich der DNA-Schäden.

    80 bis 90 Prozent der FA-Fälle sind auf Mutationen in einem von drei Genen zurückzuführen. FANCA, FANCC, und FANCG. Diese Gene liefern Anweisungen zur Herstellung von Komponenten des FA-Kernkomplexes. Mutationen in einem der vielen Gene, die mit dem FA-Kernkomplex verbunden sind, führen dazu, dass der Komplex nicht funktionsfähig ist und den gesamten FA-Weg unterbrechen. Eine Unterbrechung dieses Signalwegs führt zu einer Ansammlung von DNA-Schäden, die zu abnormalem Zelltod oder abnormalem Zellwachstum führen können. Das Absterben von Zellen führt zu einer Abnahme der Blutzellen und zu körperlichen Anomalien, die mit FA verbunden sind. Unkontrolliertes Zellwachstum kann zur Entwicklung einer akuten myeloischen Leukämie oder anderer Krebsarten führen.

    Die meisten Fälle von FA werden autosomal-rezessiv vererbt. Rezessive genetische Störungen treten auf, wenn ein Individuum zwei Kopien eines abnormalen Gens für das gleiche Merkmal erbt, eine von jedem Elternteil. Wenn eine Person ein normales Gen und ein Gen für die Krankheit erbt, ist die Person Träger der Krankheit, zeigt jedoch normalerweise keine Symptome. Das Risiko für zwei Trägereltern, das veränderte Gen zu übertragen und ein betroffenes Kind zu bekommen, beträgt bei jeder Schwangerschaft 25 %. Das Risiko, ein Kind zu bekommen, das wie die Eltern Träger ist, beträgt bei jeder Schwangerschaft 50 %. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kind von beiden Elternteilen normale Gene erhält, beträgt 25 %. Das Risiko ist bei Männern und Frauen gleich.

    Eltern, die nahe Verwandte (blutsverwandt) sind, haben eine höhere Wahrscheinlichkeit als nicht verwandte Eltern, dass beide das gleiche abnormale Gen tragen, was das Risiko erhöht, Kinder mit einer rezessiven genetischen Störung zu bekommen.

    Mutationen in folgenden Genen verursachen ebenfalls FA und werden autosomal-rezessiv vererbt: BRCA2, BRIP1, FANCB, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCI, ERCC4, FANCL, FANCM, PALB2, RAD51C, SLX4, und UBE2T.

    Die FANCB Gen befindet sich auf dem X-Chromosom und verursacht weniger als 1 Prozent aller Fälle von FA. Dieses FA-Gen wird als X-chromosomal-rezessives Merkmal vererbt.

    X-chromosomale genetische Störungen sind Erkrankungen, die durch ein abnormales Gen auf dem X-Chromosom verursacht werden und sich hauptsächlich bei Männern manifestieren. Frauen, die ein verändertes Gen auf einem ihrer X-Chromosomen aufweisen, sind Träger dieser Störung. Trägerinnen zeigen normalerweise keine Symptome, da Frauen zwei X-Chromosomen haben und nur eines das veränderte Gen trägt. Männer haben ein X-Chromosom, das von ihrer Mutter geerbt wird, und wenn ein Mann ein X-Chromosom erbt, das ein verändertes Gen enthält, wird er die Krankheit entwickeln. Weibliche Trägerinnen einer X-chromosomalen Störung haben bei jeder Schwangerschaft eine Chance von 25 %, eine Trägertochter wie sie selbst zu bekommen, eine 25-prozentige Chance, eine Tochter ohne Trägerin zu bekommen, eine 25-prozentige Chance, einen von der Krankheit betroffenen Sohn zu bekommen, und a 25% Chance, einen nicht betroffenen Sohn zu bekommen. Wenn ein Mann mit einer X-chromosomalen Störung in der Lage ist, sich zu reproduzieren, wird er das veränderte Gen an alle seine Töchter weitergeben, die Trägerinnen sein werden. Ein Männchen kann seinen Söhnen kein X-chromosomales Gen vererben, da Männchen immer ihr Y-Chromosom anstelle ihres X-Chromosoms an männliche Nachkommen weitergeben.

    Mutationen im RAD51 Gen verursachen autosomal-dominante FA. Dominante genetische Störungen treten auf, wenn nur eine einzige Kopie eines abnormalen Gens notwendig ist, um eine bestimmte Krankheit zu verursachen. Das abnormale Gen kann von einem der Elternteile geerbt werden oder das Ergebnis einer neuen Mutation (Genveränderung) bei dem betroffenen Individuum sein. Das Risiko, das abnormale Gen von einem betroffenen Elternteil an ein Nachkommen zu vererben, beträgt 50 % für jede Schwangerschaft. Das Risiko ist bei Männern und Frauen gleich. Bis heute sind alle betroffenen Personen mit FA aufgrund von a RAD51 Genmutation haben eine spontane (de novo) genetische Mutation, die in der Ei- oder Samenzelle auftritt. In solchen Situationen wird die Störung nicht von den Eltern vererbt.

    Betroffene Populationen

    Die Inzidenzrate von FA wird auf etwa 1 von 136.000 Geburten geschätzt. Dieser Zustand tritt häufiger bei Menschen aschkenasischer jüdischer Abstammung, der Roma-Bevölkerung Spaniens und schwarzen Südafrikanern auf.

    Verwandte Erkrankungen

    Die Symptome der folgenden Erkrankungen können denen von FA ähneln. Vergleiche können für eine Differenzialdiagnose hilfreich sein.

    Chromosomeninstabilitätssyndrome: autosomal-rezessiv vererbte Erkrankungen, die mit erhöhtem Chromosomenbruch und genetischer Instabilität einhergehen. Aufgrund dieser Chromosomenanomalien besteht für die betroffenen Personen ein überdurchschnittlich hohes Risiko, bestimmte Krebsarten, insbesondere Leukämie, zu entwickeln. Bei den meisten Betroffenen sind zusätzliche Anomalien vorhanden. Chromosomale Instabilitätssyndrome umfassen Bloom-Syndrom, Ataxia Teleangiektasie, Nijmegen-Bruchsyndrom und Xeroderma pigmentosum. (Für weitere Informationen zu diesen Erkrankungen wählen Sie den spezifischen Namen der Erkrankung als Suchbegriffe in der Datenbank für seltene Krankheiten.)

    Erworbene aplastische Anämie: eine seltene Erkrankung, die durch tiefgreifendes, fast vollständiges Knochenmarkversagen verursacht wird. Knochenmark ist die schwammartige Substanz, die sich in der Mitte der langen Knochen des Körpers befindet. Das Knochenmark produziert spezialisierte Zellen (hämatopoetische Stammzellen), die wachsen und sich schließlich zu roten Blutkörperchen (Erythrozyten), weißen Blutkörperchen (Leukozyten) und Blutplättchen entwickeln. Bei erworbener aplastischer Anämie führt ein fast vollständiges Fehlen hämatopoetischer Stammzellen schließlich zu einem niedrigen Spiegel an roten und weißen Blutkörperchen und Blutplättchen (Panzytopenie). Spezifische Symptome im Zusammenhang mit erworbener aplastischer Anämie können variieren, umfassen jedoch Müdigkeit, chronische Infektionen, Schwindel, Schwäche, Kopfschmerzen und Episoden übermäßiger Blutungen. Obwohl einige Fälle von erworbener aplastischer Anämie sekundär zu anderen Erkrankungen auftreten, gehen Forscher heute davon aus, dass viele Fälle auf eine Störung des Immunsystems des Patienten zurückzuführen sind, bei der das Immunsystem fälschlicherweise auf das Knochenmark abzielt (Autoimmunität). Dies basiert auf dem Ansprechen von etwa der Hälfte der Patienten auf eine Immuntherapie, sei es ATG, Ciclosporin, hochdosierte Steroide oder Cyclophosphamid. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie „aplastische Anämie“ als Suchbegriff in der Datenbank für seltene Krankheiten.)

    Thrombozytopenie-Absent-Radius-(TAR)-Syndrom: eine seltene genetische Störung, die bei der Geburt sichtbar wird (angeborene). Die Erkrankung ist durch einen niedrigen Blutplättchenspiegel (Thrombozytopenie) gekennzeichnet, der vor allem im Säuglingsalter zu möglicherweise schweren Blutungen (Blutungen) führt. Weitere charakteristische Befunde sind das Fehlen (Aplasie) des Knochens auf der Daumenseite der Unterarme (Radien) und manchmal eine Unterentwicklung (Hypoplasie) oder das Fehlen des Knochens auf der „kleinen“ Seite der Unterarme (Ulnae). Andere Anomalien können ebenfalls vorhanden sein, wie strukturelle Fehlbildungen des Herzens (angeborene Herzfehler), Nieren-(Nieren-)Defekte und/oder geistige Behinderung, die sekundär zu Blutungsepisoden im Säuglingsalter (intrakranielle Blutungen) sein können. Das TAR-Syndrom wird autosomal-rezessiv vererbt. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie in der Rare Disease Database als Suchbegriff „thrombozytopenie-absent radius“.)

    Dyskeratosis congenita, auch bekannt als Zinsser-Cole-Engman-Syndrom: eine seltene genetische Störung, die durch Verdunkelung und/oder ungewöhnliches Fehlen der Hautfarbe (Hyper-/Hypopigmentierung), abnorme Nagelveränderungen (Dystrophie) und fortschreitende degenerative Veränderungen der Schleimhaut gekennzeichnet ist Schleimhäute (Leukoplakie) im Mund und selten den Anus oder die Harnröhre. Viele Patienten haben Augenprobleme, einschließlich Tränen aufgrund der Verengung der Kanäle, die Tränen abfließen lassen. Zusätzliche Symptome können eine Verringerung der roten und weißen Blutkörperchen und Blutplättchen im Blut (Panzytopenie) sein, was zu einem Knochenmarkversagen führt. Betroffene Personen können auch eine Verdickung der Haut an den Handflächen und Fußsohlen, übermäßiges Schwitzen der Handflächen und Fußsohlen, spärliches oder fehlendes Haar, brüchige Knochen, unterentwickelte Hoden und Zahnanomalien haben. Diese Störung kann vererbt werden oder sporadisch auftreten. X-chromosomal-rezessiv ist das häufigste Vererbungsmuster, aber autosomal-dominant (ein Elternteil mit einem mutierten Gen vererbt es an sein Kind) kommt häufig vor, und autosomal-rezessiv ist selten. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie „Dyskeratosis congenita“ als Suchbegriff in der Datenbank für seltene Krankheiten.)

    VACTERL-Assoziation: eine nicht zufällige Assoziation von Geburtsfehlern, die mehrere Organsysteme betrifft. Der Begriff VACTERL ist ein Akronym, wobei jeder Buchstabe den ersten Buchstaben eines der häufigeren Befunde bei betroffenen Kindern darstellt: (V) = Wirbelanomalien (A) = Analatresie (C) = Herzfehler (T) = tracheoösophageale Fistel (E) = Ösophagusatresie (R) = Nieren- (Nieren-) Anomalien (L) = Gliedmaßenanomalien (einschließlich Daumen und Radien). Zusätzlich zu den oben genannten Merkmalen können betroffene Kinder auch weniger häufige Anomalien aufweisen, einschließlich Wachstumsstörungen und Versagen, an Gewicht zuzunehmen und mit der erwarteten Geschwindigkeit zu wachsen (Gedeihstörung). In einigen Fällen wird die Abkürzung VATER Association verwendet. Geistiges Funktionieren und Intelligenz sind in der Regel nicht betroffen. Die meisten Fälle treten zufällig ohne ersichtlichen Grund auf (sporadisch). Allerdings weisen mindestens 5 % der FA-Patienten diese Assoziation auf. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie „VACTERL“ als Suchbegriff in der Datenbank für seltene Krankheiten.)

    Die folgenden Erkrankungen können als sekundäre Komplikationen mit FA einhergehen. Sie sind für eine Differentialdiagnose nicht erforderlich.

    Myelodysplastische Syndrome (MDS): eine seltene Gruppe von Blutkrankheiten, die als Folge einer falschen Entwicklung von Blutzellen im Knochenmark auftreten. Betroffen sind die drei Haupttypen von Blutkörperchen (d. h. rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen). Rote Blutkörperchen versorgen den Körper mit Sauerstoff, weiße Blutkörperchen helfen bei der Bekämpfung von Infektionen und Blutplättchen helfen bei der Gerinnung, um den Blutverlust zu stoppen. Diese falsch entwickelten Blutzellen entwickeln sich nicht normal und gelangen in den Blutkreislauf. Infolgedessen haben Personen mit MDS ungewöhnlich niedrige Blutzellenwerte (niedrige Blutwerte). Allgemeine Symptome im Zusammenhang mit MDS sind Müdigkeit, Schwindel, Schwäche, blaue Flecken und Blutungen, häufige Infektionen und Kopfschmerzen. In einigen Fällen kann das MDS zu einem lebensbedrohlichen Versagen des Knochenmarks fortschreiten oder sich zu einer akuten Leukämie entwickeln. Die genaue Ursache von MDS ist unbekannt. Es gibt keine bestimmten Umweltrisikofaktoren. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie „Myelodysplastisches Syndrom“ als Suchbegriff in der Datenbank für seltene Krankheiten.)

    Akute myeloische Leukämie (AML): eine seltene Form von Blutkrebs, die in Zellen beginnt, die sich normalerweise zu bestimmten Arten von weißen Blutkörperchen entwickeln. Der Übergang zur Leukämie wird von einer Verschlechterung der Knochenmarkfunktion und der Anhäufung zunächst im Knochenmark und später im Blut von unentwickelten „unreifen“ Zellen, sogenannten Blasten, begleitet, die die verbleibende Knochenmarkzellproduktion unterdrücken. Als Folge davon werden die Komplikationen durch Anämie, Blutungen und Infektionen lebensbedrohlich. Die abnormen (leukämischen) Zellen können sich schließlich über den Blutkreislauf auf andere Organsysteme des Körpers ausbreiten. (Für weitere Informationen zu dieser Erkrankung wählen Sie in der Datenbank für seltene Krankheiten als Suchbegriff „akute myeloische Leukämie“.)

    Diagnose

    Eine Diagnose von FA wird auf der Grundlage einer gründlichen klinischen Bewertung, einer detaillierten Anamnese, der Identifizierung charakteristischer Befunde und einer Vielzahl von spezialisierten Tests gestellt.

    Der definitive Test für FA ist derzeit ein Chromosomenbruchtest: Einige der Blutzellen des Patienten werden in einem Reagenzglas mit einer Chemikalie behandelt, die die DNA vernetzt. Normale Zellen sind in der Lage, die meisten Schäden zu korrigieren und sind nicht stark betroffen, während FA-Zellen deutliche Chromosomenbrüche aufweisen. Für diesen Test werden häufig zwei Chemikalien verwendet: DEB (Diepoxybutan) und MMC (Mitomycin C). Diese Tests können pränatal an Zellen aus Chorionzotten oder aus dem Fruchtwasser durchgeführt werden.

    Bluttests können durchgeführt werden, um die Konzentrationen von roten und weißen Blutkörperchen und Blutplättchen zu bestimmen. Röntgenuntersuchungen können das Vorhandensein und das Ausmaß von Skelettfehlbildungen und inneren strukturellen Anomalien aufdecken.

    Viele Fälle von FA werden überhaupt nicht oder nicht rechtzeitig diagnostiziert. Bei jedem Säugling, der mit den oben beschriebenen Daumen- und Armanomalien geboren wurde, sollte FA vermutet und getestet werden. Jeder, der in jedem Alter eine aplastische Anämie entwickelt, sollte auf FA getestet werden, auch wenn keine anderen Defekte vorliegen. Jeder Patient, der in einem frühen Alter ein Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-, Magen-Darm- oder gynäkologischen Systems mit oder ohne Tabak- oder Alkoholkonsum in der Vorgeschichte entwickelt, sollte auf FA getestet werden. Viele FA-Patienten zeigen keine anderen Auffälligkeiten. Es ist wichtig, auf FA zu testen, bevor eine Stammzelltransplantation für aplastische Anämie oder eine Krebsbehandlung in Betracht gezogen wird, da sich Standard-Chemotherapie- und Bestrahlungsprotokolle für FA-Patienten als toxisch erweisen können.

    Molekulargenetische Tests sind für alle 18 mit FA assoziierten Gene verfügbar. Komplementärtests werden normalerweise zuerst durchgeführt, um zu identifizieren, welches FA-Gen mutiert ist. Anschließend kann eine Sequenzanalyse des geeigneten Gens durchgeführt werden, um die spezifische Mutation in diesem Gen zu bestimmen. Wenn keine Mutation identifiziert wird, ist eine Deletions-/Duplikationsanalyse für die mit FA assoziierten Gene klinisch verfügbar.

    Gezielte Mutationsanalysen sind für die gemeinen aschkenasischen Juden verfügbar FANCC Mutation.

    Klinische Tests/Aufarbeitung
    Um das Ausmaß der Erkrankung bei einer mit FA diagnostizierten Person festzustellen, werden bei Bedarf die folgenden Bewertungen empfohlen:

    -Ultraschalluntersuchung der Nieren und Harnwege
    -Formeller Hörtest
    -Entwicklungsdiagnostik (besonders wichtig für Kleinkinder und Schulkinder)
    -Überweisung an einen Augenarzt, HNO-Arzt, Endokrinologen, Handchirurgen, Gynäkologen (für Frauen wie angegeben), Gastroenterologen, Urologen, Dermatologen, HNO-Chirurgen, genetische Berater
    -Beurteilung durch einen Hämatologen, um ein komplettes Blutbild, fetales Hämoglobin und Knochenmarkaspirat für die Zellmorphologie und Chromosomenuntersuchung (Zytogenetik) sowie eine Biopsie für die Zellularität einzuschließen
    -HLA-Typisierung der betroffenen Person, Geschwister und Eltern zur Berücksichtigung einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation
    -Vollblutgruppenbestimmung
    -Blutchemie (Beurteilung von Leber, Niere, Schilddrüse, Lipiden und Eisenstatus)

    Standardtherapien

    Die Behandlung von FA richtet sich nach den spezifischen Symptomen, die bei jedem Einzelnen auftreten. Die Behandlung kann die koordinierten Bemühungen eines Spezialistenteams erfordern. Kinderärzte, Chirurgen, Kardiologen, Nierenspezialisten (Nephrologen), Urologen, Gastroenterologen, Spezialisten für die Beurteilung und Behandlung von Hörproblemen (Audiologen und HNO-Ärzte), Augenspezialisten und andere Angehörige der Gesundheitsberufe müssen möglicherweise die Behandlung einer betroffenen Person systematisch und umfassend planen.

    Auf einer Konsensuskonferenz 2014 wurden Behandlungsempfehlungen vereinbart.

    -Verabreichung von Androgenen (männlichen Hormonen): Androgene verbessern das Blutbild bei etwa 50 % der Personen mit FA. Die früheste Reaktion wird bei den roten Blutkörperchen beobachtet, wobei ein Anstieg des Hämoglobins im Allgemeinen innerhalb der ersten ein oder zwei Monate der Behandlung auftritt. Die Reaktionen bei der Anzahl der weißen Blutkörperchen und der Thrombozytenzahl sind variabel. Die Thrombozytenreaktionen sind im Allgemeinen unvollständig und werden möglicherweise erst nach mehreren Monaten der Therapie beobachtet. Die Verbesserung ist im Allgemeinen für die Anzahl der roten Blutkörperchen am größten. Im Laufe der Zeit kann sich eine Therapieresistenz entwickeln.

    - Hämatopoetische Wachstumsfaktoren: Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) kann bei einigen Personen die Neutrophilenzahl verbessern. Es wird in der Regel nur zur Unterstützung bei interkurrenten Erkrankungen eingesetzt.

    -Hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT): die einzige kurative Therapie für die hämatologischen Manifestationen von FA. Spenderstammzellen können aus Knochenmark, peripherem Blut oder Nabelschnurblut gewonnen werden.

    -Krebsbehandlung: Die Behandlung von Malignomen ist aufgrund der erhöhten Toxizität im Zusammenhang mit Chemotherapie und Bestrahlung bei FA eine Herausforderung. Die Behandlung sollte von Zentren mit Erfahrung in der Behandlung von FA-Patienten in Anspruch genommen werden.

    Eine Operation kann erforderlich sein, um Skelettfehlbildungen wie solche, die die Daumen- und Unterarmknochen betreffen, Herzfehler und gastrointestinale Anomalien wie tracheoösophageale Fistel oder Ösophagusatresie sowie Analatresie zu korrigieren.

    Bestimmte Chemikalien können das Risiko eines Chromosomenbruchs bei Personen mit FA erhöhen und sollten nach Möglichkeit vermieden werden. Zu diesen Chemikalien gehören Tabakrauch, Formaldehyd, Herbizide und organische Lösungsmittel wie Benzin oder Farbverdünner.

    Betroffenen und ihren Familien wird eine genetische Beratung empfohlen.

    Prüftherapien

    Informationen zu aktuellen klinischen Studien finden Sie im Internet unter www.clinicaltrials.gov. Alle Studien, die von der US-Regierung finanziert und einige von der Privatwirtschaft unterstützt werden, werden auf dieser Website der Regierung veröffentlicht.

    Für Informationen zu klinischen Studien, die im NIH Clinical Center in Bethesda, MD, durchgeführt werden, wenden Sie sich an das NIH Patient Recruitment Office:

    Gebührenfrei: (800) 411-1222
    TTY: (866) 411-1010
    E-Mail: [E-Mail geschützt]

    Für Informationen zu klinischen Studien, die von privaten Quellen gesponsert werden, wenden Sie sich an: www.centerwatch.com

    Für Informationen zu in Europa durchgeführten klinischen Studien wenden Sie sich bitte an:
    https://www.clinicaltrialsregister.eu/

    Für Forscher stehen folgende Ressourcen zur Verfügung:

    Studie zum vererbten Knochenmarkversagenssyndrom (IBMFSS)
    Nationales Krebs Institut
    Telefon: 800-518-8474
    E-Mail: [E-Mail geschützt]
    www.marrowfailure.cancer.gov

    FA-Zell-Repository und das FA-Antikörper-Projekt
    Fanconi Anämie Research Fund, Inc.
    Oregon Health & Science University
    Medizinische Fakultät/Initiative Humangenetik
    http://www.ohsu.edu/research/fanconi-anemia/

    NORD Mitgliedsorganisationen

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