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Proteasen im Blut

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Ich lese über Hormone und das Buch spricht darüber, wie Peptid- oder Aminhormone leicht durch im Blutplasma vorhandene Proteasen abgebaut werden. Dies hat mich dazu veranlasst, die Wechselwirkungen zwischen diesen Proteasen und den Blutproteinen des Blutes (wie Albuminen und Globulinen) in Frage zu stellen. Bedeutet Proteasen im Blut, dass die Blutproteine ​​ständig abgebaut werden? Wie machen die Blutproteine ​​dann etwas? Und was nützen Bindungsproteine ​​beim Schutz von Hormonen während der Gefäßpassage, wenn die Bindungsproteine ​​auch für Blutproteasen anfällig sind?

Bearbeiten: Ich wurde gebeten, einige Zitate und Referenzen bereitzustellen.

Da sich wasserlösliche Hormone im Blut auflösen können, zirkulieren viele als freie Hormone, was bedeutet, dass sich die meisten von ihnen direkt im Blut auflösen und ohne Bindung an ein Bindungsprotein an ihr Zielgewebe abgegeben werden.

Weiter heißt es im Buch

Wasserlösliche Hormone wie Proteine, Peptide und Aminosäurederivate haben relativ kurze Halbwertszeiten, da sie durch Enzyme, die als Proteasen bezeichnet werden, im Blutkreislauf schnell abgebaut werden. Die Nieren entfernen dann die Hormonabbauprodukte aus dem Blut.

Diese Zitate stammen von Seeleys Anatomie und Physiologie, 10. Auflage.


Thrombozyten und Proteasen

Zirkulierende Blutplättchen sind essentiell für die Bildung von Blutgerinnseln. Studien an Mäusen zeigen mehr über die Proteine, die an der Aktivierung von Blutplättchen beteiligt sind, was Auswirkungen auf das Verständnis von Schlaganfällen und Herzinfarkten hat.

Wie stoppen Tiere nach einer Verletzung die Blutung? Zu der Zeit, als sich der Mensch entwickelte, bestand eine gängige Lösung darin, schnell ein komplexes Gerinnsel zu bilden, das aus aus dem Blut stammenden Proteinen (Fibrin) und Zellen (Blutplättchen) besteht. Fibrin und Blutplättchen bilden zusammen einen Pfropfen, der Blutungen so lange verhindert, bis eine Heilung eintritt. Der Nachteil ist, dass sich Gerinnsel auch in Blutgefäßen bilden können, die durch cholesterinhaltige Plaques (Atherosklerose) vernarbt sind, die den Blutfluss unterbrechen und zu Schlaganfällen und Herzinfarkten führen.

Auf Seite 74 dieser Ausgabe untersuchen Sambrano und Kollegen 1 eine der wichtigsten unbeantworteten Fragen zur Gerinnung: Welche Rolle spielt bei Mäusen ein Protein namens Protease-aktivierter Rezeptor-4 (PAR4)? Ihre Ergebnisse bestätigen die Notwendigkeit dieses Proteins bei der Gerinnung, aber die Auswirkungen gehen darüber hinaus und berühren die Feinabstimmung der Thrombozytenaktivierung und faszinierende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen. Dies kann auch Auswirkungen auf die Entwicklung von Medikamenten zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Problemen haben.

Einer der frühesten Schritte bei der Bildung eines Blutgerinnsels ist die lokalisierte Erzeugung des aktiven Enzyms Thrombin aus seinem zirkulierenden inaktiven Vorläufer, Prothrombin. Thrombin spaltet Fibrinogen im Blutplasma und erzeugt Fibrinmonomere, die dann zu einem Netz über einer Wunde in einer Blutgefäßwand polymerisieren. Thrombin aktiviert auch Blutplättchen 2 . Eine vor einem Jahrzehnt veröffentlichte Studie 3 stellte fest, dass menschliche Blutplättchen auf ihrer Oberfläche den Protease-aktivierten Rezeptor-1 (PAR1) exprimieren, ein Signalprotein, das ein Substrat für Thrombin ist. Durch die Spaltung von PAR1 initiiert Thrombin die Signalübertragung innerhalb der Blutplättchen, wodurch diese aneinander kleben. Die Grundstruktur von PAR1 platziert es innerhalb einer großen Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die durch intrazelluläre Schalter, die G-Proteine ​​genannt werden, funktionieren.

Mit der Identifizierung von PAR1 schien das Rätsel, wie eine Plasmaprotease Blutplättchen aktivieren kann, gelöst zu sein. Doch schon bald häuften sich Fragen. Wenn PAR1 tatsächlich der universelle Thrombinrezeptor ist, warum hatte dann die Deletion seines Gens bei Mäusen keinen Einfluss auf die Thrombozytenaktivierung durch Thrombin? Wie kann die Spaltung eines einzigen Rezeptortyps mehr als einen Signalweg innerhalb von Blutplättchen aktivieren, und wie könnten diese Reaktionen im Laufe der Zeit und über den weiten Bereich von Thrombinkonzentrationen, denen die Blutplättchen wahrscheinlich begegnen, moduliert werden? Welche Rolle spielen, wenn überhaupt, andere Thrombin-bindende Proteine ​​auf der Thrombozytenoberfläche?

Antworten auf zumindest einige dieser Fragen sind mittlerweile bekannt. Wie sich herausstellt, gibt es noch drei weitere Mitglieder der PAR-Familie 4 : PAR2, PAR3 und PAR4. Wie PAR1 werden zwei dieser Rezeptoren – PAR3 und PAR4 – durch Thrombin aktiviert, PAR2 ist es nicht. Menschliche Blutplättchen exprimieren PAR1 und PAR4, wohingegen Mausblutplättchen PAR3 und PAR4 exprimieren, aber nicht PAR1. Dies erklärt natürlich, warum der Verlust von PAR1 bei Mäusen keinen Einfluss auf die Blutplättchenfunktion hatte.

Thrombin erzeugt eine Vielzahl von Reaktionen in Blutplättchen, da die PAR-Rezeptoren an mehr als eine Art von G-Protein gekoppelt sind. Abgestufte Reaktionen auf eine Reihe von Thrombinkonzentrationen können teilweise durch eine Beziehung zwischen der vorhandenen Thrombinmenge und der Anzahl der pro Sekunde gespaltenen PAR-Proteine ​​und teilweise durch Unterschiede zwischen den Mitgliedern der PAR-Familie in der für die Spaltung erforderlichen Thrombinkonzentration erklärt werden. So ist beispielsweise PAR1 ein besseres Substrat für Thrombin als PAR4. Wenn beide vorhanden sind, geht die Spaltung von PAR1 vermutlich der Spaltung von PAR4 voraus, da sich Thrombin ansammelt (Fig. 1a) 5,6. Andererseits, sobald PAR4 gespalten ist, scheint es länger zu signalisieren 7 .

Die Kommunikation zwischen dem proteinspaltenden Enzym Thrombin (Schere) und Mitgliedern der PAR-Proteinfamilie setzt Signalwege in Gang, die die Blutzellen aktivieren. ein, Beim Menschen exprimieren Blutplättchen PAR1 und PAR4. Diese sind über molekulare Schalter vom G . an intrazelluläre Signalwege gekoppeltQ, G12 und Gich Proteinfamilien. Wenn Thrombin die Aminotermini von PAR1 und PAR4 entfernt, werden mehrere Signalwege (farbige Pfeile) aktiviert, unter anderem die Sekretion von ADP. Durch Bindung an seinen Rezeptor kann P2Y12, ADP aktiviert zusätzliches Gich-vermittelte Wege. Ohne Verwundung wird der Thrombozytenaktivierung durch das Signal von Prostaglandin I . entgegengewirkt2. Die Spaltung von PAR1 durch Thrombin scheint durch die Thrombinbindung an das Glykoprotein Ibα ermöglicht zu werden. B, Mausplättchen exprimieren PAR3 und PAR4. PAR4 scheint allein für die Signalübertragung verantwortlich zu sein 1 , während PAR3 die Spaltung von PAR4 ermöglicht, wodurch es auf niedrigere Thrombinkonzentrationen reagieren kann.

Die Tatsache, dass menschliche Blutplättchen PAR1 und PAR4 exprimieren, während Mausblutplättchen PAR3 und PAR4 exprimieren, scheint ein Beispiel für unterschiedliche Lösungen für ein häufiges Problem zu sein – wie man eine Vielzahl von Reaktionen auf Thrombin induziert. Obwohl Maus-PAR3 ein gutes Substrat für Thrombin ist, signalisiert es schlecht, wenn überhaupt. Mit anderen Worten, es hat aus irgendeinem Grund die Fähigkeit verloren, G-Proteine ​​zu aktivieren, während es die Fähigkeit behält, durch Thrombin gespalten zu werden. Wenn das PAR3-kodierende Gen aus Mäusen deletiert wurde, reagierten die Blutplättchen jedoch erheblich weniger gut auf Thrombin 5 . Daher wurde vorgeschlagen, dass PAR4 der Hauptmediator der Mausreaktionen auf Thrombin ist und dass PAR3 eine unterstützende Rolle spielt, die die Spaltung von PAR4 bei niedrigen Thrombinkonzentrationen ermöglicht. Wenn dies der Fall ist, würde man vorhersagen, dass die Deletion von PAR4 die Thrombin-Signalgebung in Maus-Blutplättchen aufheben würde.

Sambrano et al. 1 haben nun das PAR4-Gen bei Mäusen deletiert und festgestellt, dass Thrombozyten tatsächlich nicht mehr durch Thrombin aktiviert werden. Die Ergebnisse zeigen den Bedarf an PAR4 und unterstützen die vorhergesagte Helferrolle für PAR3 (Abb. 1b). Damit diese unangenehme Anordnung zustande kam, musste Maus-PAR3 nicht nur seine intrinsische Signalfähigkeit verlieren, wenn es gespalten wurde, sondern auch die Fähigkeit, die PAR4-Aktivierung zu unterstützen, „erlangen“. Man könnte spekulieren, dass diese Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen Blutplättchen kein Zufall sind, sondern aus anderen Gründen angebracht sind. Das wird sich noch zeigen.

Wie die Autoren zeigen, wurden die Thrombozytenreaktionen auf Thrombin bei Mäusen, denen beide Kopien des PAR4-Gens fehlten, vollständig aufgehoben. Mäuse mit einer Kopie des Gens zeigten eine mäßige Beeinträchtigung der Gerinnselbildung. Obwohl diese Beeinträchtigung keine statistische Signifikanz erreichte, scheint es hier einen Trend zu geben: Maus-Thrombozyten können erfordern, dass die meisten, wenn nicht alle ihrer Thrombinrezeptoren voll funktionsfähig sind. Wenn dies auch auf menschliche Blutplättchen zutrifft, könnten ererbte Variationen in der Struktur von PAR-Familienmitgliedern, die zu einer Verringerung der Signalübertragung führen, zu Unterschieden zwischen den Menschen in ihrem Risiko für Schlaganfälle und Herzinfarkte führen. Bisher wurden keine funktionsverändernden Variationen bei PAR1 und PAR4 berichtet, jedoch wurde eine für PAR2 beschrieben8.

Reichen die PAR-Proteine ​​aus, um alle Reaktionen der Blutplättchen auf Thrombin zu erklären? Angesichts der neuen Ergebnisse 1 und der Tatsache, dass die gleichzeitige Blockade von PAR1 und PAR4 die Fähigkeit menschlicher Blutplättchen aufhebt, auf Thrombin zu reagieren 9 , scheint die Antwort „ja“ zu sein. Jüngste Studien 10,11 haben jedoch eine Debatte über die Rolle des Glykoprotein-Ib/IX/V-Multiproteinkomplexes als Bindungsstelle und Substrat für Thrombin neu belebt. Es ist noch zu früh, um den Ausgang dieser Debatte vorherzusagen. Dennoch sind die Ergebnisse von Sambrano et al. liefern einen schlüssigen Beweis für die wesentliche Rolle von PAR4 bei der Aktivierung von Blutplättchen durch Thrombin und darüber hinaus für die Notwendigkeit von Thrombin selbst. Ihre Arbeit unterstreicht auch erneut die Möglichkeit, dass Medikamente, die PAR1, PAR4 oder beide blockieren, bei der Behandlung einer Vielzahl von Gerinnungsstörungen beim Menschen nützlich sein könnten.


Was ist Protease? (Mit Bildern)

Eine Protease ist ein Mitglied einer sehr großen Gruppe von Enzymen, die im Körper eine Vielzahl von Funktionen haben. Ein primäres Enzym ist ein Verdauungsenzym zur Verarbeitung von Proteinen. Ohne Protease wäre der Körper nicht in der Lage, das Protein in der Nahrung zu verdauen. Andere Arten von Proteasen sind an der Regulierung von zellulären Ereignissen, wie der Blutgerinnung, beteiligt. Diese werden auch genannt proteolytische Enzyme oder Proteinasen.

Proteine ​​sind lange Ketten von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen zusammengehalten werden. Kleine Proteinfragmente sind bekannt als Peptide, und größere Fragmente werden als . bezeichnet Polypeptide. Enzyme, die Peptide abbauen, nennt man Peptidasen.

Proteasen sind Arten von Proteinen, die den Abbau anderer beschleunigen. Sie unterscheiden sich in der Art und Weise, in der sie diese Tätigkeit ausüben. Exopeptidasen spalten terminale Aminosäuren ab und knabbern an Proteinen. Sie bauen Peptidbindungen ab, um Aminosäuren freizusetzen. Im Gegensatz, Endopeptidasen wirken innerhalb des Proteins und spalten auch Peptidbindungen, wodurch als Ergebnis ihrer Aktivitäten Polypeptide produziert werden.

Es gibt mehrere Klassen von Proteasen, abhängig von der Art der Aminosäure an der Stelle, an der die Reaktion stattfindet, und jedem zusätzlichen Molekül, das für die Aktivität benötigt wird. Viele Proteine ​​benötigen beispielsweise ein Metallatom, um aktiv zu sein. Sie sind bekannt als Metalloproteinasen. Andere Proteasen haben an ihrem aktiven Zentrum eine Aminosäure namens Serin und werden als Serinproteasen.

Die ersten Studien von Proteasen in der Humanphysiologie wurden durchgeführt, um ihre Rolle bei der Verdauung im Magen-Darm-System zu erkennen. Das Ziel der enzymatischen Verdauung besteht darin, größere Moleküle in kleinere aufzuspalten. Mehrere Proteasen arbeiten mit Peptidasen zusammen, um die Proteine ​​in Lebensmitteln zu kleinen Peptiden und Aminosäuren abzubauen. Solche kleinen Moleküle können von den Darmzellen aufgenommen und als Brennstoff oder zum Aufbau neuer Proteinmoleküle verwendet werden.

Allen diesen Verdauungsproteasen ist gemeinsam, dass sie in größeren, inaktiven Formen synthetisiert werden, um das Gewebe, das sie enthält, vor enzymatischer Schädigung zu schützen. Solche Vorläufer sind bekannt als Zymogene. Ein weiteres gemeinsames Merkmal ist, dass sie alle Endopeptidasen sind, obwohl sie sich in ihrer Präferenz für den Teil der Proteine ​​unterscheiden, den sie spalten. Diese Substratspezifität basiert auf der Lage spezifischer Aminosäuren in den Zielproteinen.

Der Magen enthält die Verdauungsprotease Pepsin, die durch die Salzsäure des Magens stimuliert wird. Pepsin zerlegt die Proteine ​​in Polypeptide, die in den Darm wandern. An dieser Stelle werden sie durch die zusätzlichen Verdauungsproteasen Trypsin und Chymotrypsin in noch kleinere Stücke zerlegt. Alle diese Enzyme sind Serinproteasen.

Andere Arten von Proteasen regulieren die Aktivität anderer Proteine. Indem sie eine bestimmte Stelle eines Proteins spalten, können sie diese entweder ein- oder ausschalten. Dies kann Teil eines Mechanismus sein, der eine physiologische Veränderung signalisiert. Eine weitere Funktion von Proteasen besteht darin, bei der Verarbeitung von Proteinen zu helfen, die in größeren Formen produziert werden, wie zum Beispiel das Amyloid-Vorläuferprotein. Andere Proteasen bauen Proteine ​​ab, die für die Zellfunktion nicht mehr benötigt werden.


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ADAMTS-Proteasen in der kardiovaskulären Physiologie und Krankheit

Die Familie der Disintegrin-ähnlichen und Metalloproteinasen mit Thrombospondin-Motiv (ADAMTS) umfasst 19 Proteasen, die die Struktur und Funktion von extrazellulären Proteinen in der extrazellulären Matrix und im Blut regulieren. Die am besten charakterisierte kardiovaskuläre Rolle ist die von ADAMTS-13 im Blut. Mäßig niedrige ADAMTS-13-Spiegel erhöhen das Risiko eines ischämischen Schlaganfalls und sehr niedrige Spiegel (weniger als 10 %) können eine thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) verursachen. Rekombinantes ADAMTS-13 befindet sich derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von TTP. Kürzlich wurden neue kardiovaskuläre Rollen für ADAMTS-Proteasen entdeckt. Mehrere Mitglieder der ADAMTS-Familie sind wichtig für die Entwicklung der Blutgefäße und des Herzens, insbesondere der Klappen. Eine Reihe von Studien hat auch die potenzielle Rolle von ADAMTS-1, -4 und -5 bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht. Sie spalten Proteoglykane wie Versican, die wichtige strukturelle Komponenten der Arterien darstellen. ADAMTS-7 und -8 ziehen aufgrund ihrer Beteiligung an Arteriosklerose bzw. pulmonaler arterieller Hypertonie großes Interesse auf sich. Mutationen im ADAMTS19 Gen verursachen progressive Herzklappenerkrankungen und Missense-Varianten in ADAMTS6 sind mit der Reizleitung des Herzens verbunden. In diesem Review diskutieren wir im Detail die Evidenz für diese und andere kardiovaskuläre Rollen von Mitgliedern der ADAMTS-Familie, ihre proteolytischen Substrate und die möglichen beteiligten molekularen Mechanismen.

1. Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) steuert die Bildung von kardiovaskulärem Gewebe während der Embryogenese und unterstützt sie während des gesamten Erwachsenenalters durch strukturelle Unterstützung, Steuerung des Zellverhaltens und Sequestrierung von Wachstumsfaktoren. In großen Arterien und Blutgefäßen bieten kollagene und elastische Fasern eine wesentliche strukturelle Unterstützung, um eine Ruptur zu verhindern. Eine gesunde Arterie besteht aus drei Schichten (Tunicae): Tunica Adventitia, Media und Intima (Abbildung 1). Die Intima steht in Kontakt mit dem Gefäßlumen und besteht aus Endothelzellen (ECs), die an einer Basalmembran befestigt sind, die reich an Kollagen IV, Laminin, Nidogen und Heparansulfat (HS) Proteoglykanen (PGs) (Syndecan, Perlecan) ist. Die Tunica media besteht aus vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC), die Chondroitinsulfat (CS)/Dermatansulfat (DS)-PGs (CSPGs) (wie Versican und Aggrecan) und Elastin exprimieren. Es gibt gefensterte Elastinblätter, sogenannte Lamellen, zwischen denen sich Kollagenfasern, dünne Schichten PG-reicher ECM und VSMCs befinden. Elastin, das dehnbar ist und eine geringe Zugfestigkeit besitzt, fungiert als elastisches Reservoir und verteilt Spannungen gleichmäßig in der Wand und auf Kollagenfasern [1]. Die Adventitia ist die äußerste Schicht eines Blutgefäßes und besteht aus einer kollagenreichen ECM, die von Fibroblasten sezerniert wird und bei sehr hohem Druck eine Gefäßruptur verhindert. Die Adventitia ist auch ein Reservoir von Stammzellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Funktionen von Zellpopulationen in der Tunica intima und media [2]. In den verschiedenen Schichten sind verschiedene PGs vorhanden. In der Tunica media tragen sie zu den viskoelastischen Eigenschaften der Gefäßwand bei. Diese Funktion von PGs wird durch ihre Glykosaminoglykan (GAG)-Ketten vermittelt. Aufgrund ihrer hohen negativen Ladung ziehen diese GAGs Gegenionen und Wasser in das Gewebe an [3,4]. Darüber hinaus sind CSPGs wie Versican und Aggrecan wesentliche Bestandteile der Herzklappensegel und insbesondere der mittleren ECM-Schicht, der Spongiosa, während Elastin und Kollagene in den Ventricularis/Atrialis- bzw. Fibrosaschichten vorherrschen [5,6] (Abbildung 2). Die Verhältnisse von PGs und den eingestreuten Kollagenen/elastischen Fasern bieten ein Mittel zum Ausgleich zwischen Steifigkeit und Flexibilität des kardiovaskulären Gewebes [7]. Aus diesem Grund ist die Remodellierung der vaskulären ECM durch Proteasen, die sowohl von ECs als auch VSMCs sezerniert werden, entscheidend, um die mechanischen Eigenschaften dieser Gewebe zu bestimmen. Darüber hinaus ist der Abbau von ECM für die Migration und Proliferation von VSMCs sowie die Infiltration von Entzündungszellen unter pathologischen Bedingungen erforderlich. Unter den Proteasen, die an dieser dynamischen Wirkung beteiligt sind, wurden Mitglieder der Familie der Matrixmetalloproteinasen (MMP) aufgrund ihrer Fähigkeit, die elastischen ECM-Komponenten wie Kollagene (MMP-1, -8, -13, -14) und zu spalten, eingehend untersucht Elastin (MMP-12). Darüber hinaus spielen Proteasen der verwandten Familie der Disintegrin- und Metalloproteinasen (ADAMs) aufgrund ihrer Fähigkeit, die Ektodomäne von Membranproteinen selektiv zu spalten (Shedding), eine grundlegende Rolle in der vaskulären ECM. Die Rolle dieser Metalloproteinase-Familien bei kardiovaskulären Erkrankungen wurde an anderer Stelle ausführlich untersucht [8,9].

Abbildung 1. Beteiligung von ADAMTS-Proteasen an der kardiovaskulären Physiologie und Krankheit. Arteriosklerose und Hämostase: verminderte Proteoglykanase-Aktivität (ein1) ist mit einer Akkumulation von Proteoglykanen, einer erhöhten Internalisierung von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) verbunden (ein2) und Schaumzellbildung (ein3), was schließlich zur Bildung eines atherosklerotischen Plaques führt. Ein Thrombus kann sich auf einer Plaque bilden, wenn Kollagen dem Blut ausgesetzt ist. ADAMTS-13 reguliert die Fähigkeit des von-Willebrand-Faktors (VWF), Thrombozyten an die Stelle der Kollagenexposition zu rekrutieren und die Thrombusbildung zu initiieren. In der Aorta reduzierte Proteoglykanase-Aktivität (ein1) verursacht eine Akkumulation von Proteoglykanen, einen erhöhten osmotischen Druck, eine verminderte Lebensfähigkeit der glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) und eine Störung der Mechanosensierung (B). BM, Basalmembran-EC, Endothelzellen-VWF, von Willebrand-Faktor.

Abbildung 2. Organisation der extrazellulären Matrix (ECM) in Herzklappen. (ein) Dargestellt ist die ECM-Zusammensetzung in einer ausgereiften Klappe. Die Bildung der Ventricularis und der Fibrosa während der Entwicklung ist ein komplexer und streng regulierter molekularer Prozess, bei dem ADAMTS-Proteasen eine wesentliche Rolle spielen. (B) Dysfunktionale ADAMTS-Aktivität kann zu einem gewissen Grad an desorganisierter ECM, veränderter Klappenform und Undichtigkeit der Klappe führen. Eine desorganisierte ECM kann sich in Form einer Fülle von Proteoglykanen präsentieren, was an einer unzureichenden Proteoglykanaseaktivität oder möglicherweise an einer falschen Anordnung der ECM im Ventricularis (z. B. Fibrillin-1-Mikrofibrillen/Elastin) liegen kann. ADAMTS-1, -5 und -9 wurden durch Mausstudien mit der Herzklappenentwicklung in Verbindung gebracht und ADAMTS-19 durch eine humangenetische Erkrankung.

Dieser Aufsatz konzentriert sich auf eine eng verwandte Metalloprotease-Familie, die eine Disintegrin-ähnliche und Metalloproteinase mit Thrombospondin-Motiv (ADAMTS) und ihre (patho)physiologische Rolle in Herz und Blutgefäßen. Beim Menschen umfasst die ADAMTS-Familie 19 sekretierte Metalloproteinasen sowie 7 ADAMTS-ähnliche Proteine ​​ohne katalytische Aktivität [10]. Sie teilen eine gemeinsame Domänenzusammensetzung bestehend aus einem Signalpeptid, einer Prodomäne, einer katalytischen Metalloproteinase-Domäne (Mp, fehlt in den ADAMTS-ähnlichen Proteinen), gefolgt von nicht-katalytischen Hilfsdomänen wie einer Disintegrin-ähnlichen (Dis) Domäne, a zentrales Thrombospondin-Typ-I-Motiv (TSR), eine Cystein-reiche (CR) Domäne, eine Spacer (Sp) Domäne und mit Ausnahme von ADAMTS-4 eine unterschiedliche Anzahl von TSRs am C-Terminus (Tabelle 1) . Einige Mitglieder haben zusätzliche C-terminale Domänen, wie eine Mucindomäne (in ADAMTS-7 und ADAMTS-12 vorhanden), eine Gon-1-ähnliche Domäne (in ADAMTS-20 und ADAMTS-9) und eine PLAC (Protease und Lacunin). Domäne (in ADAMTS-2, -3, -6, -10, -12, 14, -16, -17, -18 und -19). Darüber hinaus ist ADAMTS-13 einzigartig unter den ADAMTS-Proteasen, da es zwei CUB-Domänen [Komplement-Subkomponente C1r/C1s/embryonales Seeigelprotein Uegf (Seeigel-Epidermal-Wachstumsfaktor)/knochenmorphogenes Protein 1]-Domänen aufweist [11,12]. Ein gemeinsames Merkmal der Familie ist das Vorhandensein eines Zink-bindenden Motivs in der Mp-Domäne, das die Konsensussequenz H EXX H XXGXX H enthält, in der die drei unterstrichenen Histidinreste ein Zinkatom koordinieren, das zusammen mit einem Glutamatrest eine katalytische Rolle. Auf dieses Motiv folgt C-terminal ein Methioninrest, der einen strukturellen Turn (Met-Turn) darstellt, der innerhalb der Metzincin-Familie der Metallopeptidasen (umfassend MMPs, ADAMs, ADAMTSs und Astacine) konserviert ist [13].

Tabelle 1. Zusammenfassung der kardiovaskulären Rollen, proteolytischen Funktionen und Domänenorganisation der ADAMTS-Familie. Für die kardiovaskulären Rollen und Krankheiten geben die Zahlen in Klammern spezifische ADAMTS-Familienmitglieder an. KHK, koronare Herzkrankheit PAH, pulmonale arterielle Hypertonie TAAD, thorakale Aortenaneurysmen und Dissektionen TTP, thrombotische thrombozytopenische Purpura VSMC, vaskuläre glatte Muskelzellen VWF, von Willebrand-Faktor WMS, Weill-Marchesani-Syndrom. Die ADAMTS-Proteindomänen werden wie folgt abgekürzt: S, Signalpeptid Pro, Prodomäne Mp, Metalloproteinase-Domäne Dis, Disintegrin-ähnliche Domäne CR, Cystein-reiche Domäne Sp, Spacer-Domäne Muc, Mucin-ähnliche Domäne CUB, Komplement-Subkomponente C1r/C1s/ embryonales Seeigelprotein Uegf (Seeigel epidermaler Wachstumsfaktor)/knochenmorphogenes Protein 1 PL, Protease- und Lacunindomäne GON, gon-1-ähnliche Domäne.

ADAMTS-Proteasen werden im Allgemeinen nach proteolytischer Entfernung der N-terminalen Prodomäne durch Proproteinkonvertasen vom Subtilisin-Typ (z. B. Furin, PCSK6) aktiviert [14]. Mit Ausnahme von ADAMTS-13, das im Blut zirkuliert, scheinen die anderen Mitglieder der ADAMTS-Familie in der ECM zu funktionieren. Die sekretierten aktivierten Enzyme werden hauptsächlich durch Hemmung durch Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMPs) [15] und Endozytose [16] reguliert.

Auf der Grundlage der Sequenzhomologie können verschiedene ADAMTS-Unterfamilien definiert werden (Tabelle 1). Sie haben sich wahrscheinlich durch einen Prozess der Genduplikation entwickelt, der entweder zu einer Neofunktionalisierung oder einer Subfunktionalisierung führt [17] und einige teilen immer noch ein gemeinsames Substratrepertoire.

ADAMTS-1, -4, -5, -8 und -15 zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur Spaltung von PGs aus und werden daher zusammenfassend als „Proteoglykanasen“ bezeichnet. Obwohl sie weiter entfernt verwandt sind, zeigen ADAMTS-9 und -20 auch diese ausgeprägte proteolytische Aktivität.

ADAMTS-2 ist eine gut charakterisierte Prokollagen-N-Propeptidase, die die N-terminalen Propeptide von Kollagen Typ I, II und III spaltet [18]. ADAMTS-3 und ADAMTS-14 zeigen eine hohe Homologie zu ADAMTS-2 und können Pro-Kollagen spalten in vitro. ADAMTS-3 ist essentiell für die Lymphangiogenese durch die Aktivierung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)-C [19,20].

Die verwandten Paare ADAMTS7/12, ADAMTS6/10, ADAMTS16/18 und ADAMTS17/19 sind nicht gut charakterisiert [21]. ADAMTS10 und ADAMTS17 Mutationen führen zu einem Weill-Marchesani-Syndrom (WMS)-ähnlichen Spektrum und wurden funktionell mit dem Aufbau von Fibrillin-Mikrofibrillen in Verbindung gebracht [21]. Es wurde auch gezeigt, dass ADAMTS-6 die Bildung von Fibrillin-1-Mikrofibrillen fördert [22].

ADAMTS-13, das mit Abstand am besten charakterisierte Familienmitglied, reguliert die Funktion des von-Willebrand-Faktors (VWF) bei der primären Hämostase [23,24].

Während die nicht-kardiovaskulären Rollen der verschiedenen Mitglieder der ADAMTS-Familie in kürzlich erschienenen hervorragenden Übersichtsartikeln [10,14] diskutiert wurden, werden wir hier die Beteiligung von ADAMTS-Proteasen an der kardiovaskulären Biologie und bei Erkrankungen im Detail diskutieren.

2. Proteoglykane und Proteoglykanasen in der kardiovaskulären Physiologie und Krankheit

2.1. Proteoglykane

Mehrere Mitglieder der ADAMTS-Familie spalten spezifisch PGs. Da „Die Biologie einer Protease in Wirklichkeit die Biologie ihrer Substrate ist“ [14], werden wir kurz die Rolle von PGs im kardiovaskulären System diskutieren. In Blutgefäßen werden PGs hauptsächlich durch ECs und VSMCs in der Tunica Intima bzw. Media exprimiert, wo sie die biophysikalischen Eigenschaften der ECM regulieren [3,19]. Darüber hinaus regulieren PGs durch ihre Interaktionen mit ECM-Proteinen, Wachstumsfaktoren und Chemokinen eine Vielzahl von Prozessen wie Zellsignalisierung, Proliferation, Migration und Apoptose [25]. Eine erhöhte Akkumulation von PGs ist ein Merkmal von Atherosklerose [26,27] und Aneurysmen [28] sowie erblichen Erkrankungen wie der pädiatrischen Aortenklappenerkrankung und der erwachsenen myxomatösen Mitralklappe [29].

PGs werden nach dem vorherrschenden GAG klassifiziert, das kovalent an Serinreste in ihrem Proteinkern gebunden ist, Heparin/Heparansulfat (HS) PGs und Chondroitinsulfat/Dermatansulfat (CS/DS) PGs. CS-GAGs enthalten D-Glucuronsäure und n-Acetyl-D-Galactosamin, während in DS-GAGs die D-Glucuronsäure wird epimerisiert in L-Iduronsäure. HS-GAGs enthalten D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure im Wechsel mit n-Acetyl-D-Glucosamin. GAGs sind nicht nur wichtig, um aufgrund ihrer negativen Ladungen einen Donnan-osmotischen Druck im Gefäßgewebe zu erzeugen [4], sondern auch, um die Lipoproteinaufnahme aus dem Kreislauf zu vermitteln.

Die subintimale Ansammlung von lipidreichen und entzündlichen Ablagerungen (Plaques) in mittleren und großen Arterien ist ein Kennzeichen der Arteriosklerose (Abbildung 1 .).ein). Die Vergrößerung von Plaques behindert den normalen Blutfluss, was zu Organischämie und Gewebenekrose führt. Eine Plaqueruptur mit nachfolgender Thrombusbildung kann einen Gefäßverschluss verursachen, der zu potenziell tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie Myokardinfarkt und Schlaganfall führt. PGs wie Versican und Aggrecan neigen auch dazu, sich in thorakalen Aortenaneurysmen und Dissektionen (TAAD) [28,30,31] und während der normalen Alterung der Aorta [32] zu akkumulieren, was zu einem erhöhten osmotischen Druck führt, der die ECM stört ( Abbildung 1B). Darüber hinaus kann eine PG-Akkumulation die Mechanosensing durch VSMCs stören und Stresserhöhen in der Aortenwand erzeugen, die eine Dissektion prädisponieren oder propagieren können [33].

HSPGs wie Perlecan und die vier Transmembran-Sydecane werden hauptsächlich von ECs in der Intima synthetisiert und hemmen proatherogene Prozesse wie Lipoproteinretention, Infiltration von Entzündungszellen, Proliferation von VSMCs und Thrombose [34,35]. Da HSPGs keine wichtigen ADAMTS-Substrate sind, werden sie hier nicht im Detail diskutiert. Wir werden uns stattdessen auf CSPGs konzentrieren.

CSPGs werden hauptsächlich von VSMCs in Tunica media exprimiert [25]. Im Gegensatz zu HSPGs können CSPGs atherosklerotische Prozesse in Gang setzen, indem sie sowohl die Ablagerung als auch die Internalisierung von Low-Density-Lipoprotein(LDL)-Partikeln verstärken, die nach Transzytose oder endothelialer Dysfunktion in die Arterienwand eingedrungen sind [27,36] (Abbildung 1 .).ein). CSPGs können mit LDL-Partikeln hochaffine Komplexe bilden, die dann von VSMCs und infiltrierten Makrophagen effizienter internalisiert werden als native LDLs [37,38]. Sobald sie internalisiert sind, verstärken LDLs die intrazelluläre Cholesterinestersynthese und die anschließende Schaumbildung [39]. Die Interaktion zwischen Lipoproteinen und CSPGs beinhaltet eine ionische Bindung zwischen basischen Aminosäuren in Apoprotein B (apoB) und negativ geladenen Sulfatgruppen an den GAGs [40]. Darüber hinaus ist die Affinität für LDL umso höher, je länger die CS-Ketten sind [41]. Um die Annahme zu untermauern, dass die direkte Bindung von LDL-Partikeln an CSPGs ein Schlüsselschritt in der Atherogenese ist, zeigten transgene Mäuse, die LDL-Partikel exprimieren, bei denen positiv geladene Aminosäuren in apoB durch neutrale ersetzt wurden, signifikant weniger atherosklerotische Läsionen als Mäuse, die Wildtyp-apoB . exprimieren [42]. CSPGs umfassen große aggregierende PGs wie Versican und Aggrecan und kleine leucinreiche PGs (SLRPs) wie Biglycan und Decorin. Aufgrund ihrer Fähigkeit, sowohl Hyaluronan, das einzige nicht sulfatierte GAG, als auch Lektine zu binden, werden große aggregierende PGs auch als Hyalektane bezeichnet [43]. Hyalectane haben eine ähnliche Struktur und umfassen zwei globuläre Domänen am N- und C-Terminus, die als G1 bzw. G3 bezeichnet werden, und eine zentrale GAG-Domäne, die Bindungsstellen für GAG-Ketten enthält. Die G1-Domäne bindet an Hyaluronan, während die G3-Domäne die Lektin-bindende Region enthält (Abbildung 1ein).

Versican ist das wichtigste Hyalectan im Gefäßsystem, wo es bei Entwicklungs- und Reparaturprozessen wie Zelladhäsion, Proliferation und Migration, ECM-Zusammenbau und Entzündung eine Rolle spielt [25,26,44]. Es liegt in 5 Isoformen (V0-V4) vor, die durch alternatives Spleißen innerhalb der zentralen GAG-reichen Region erzeugt werden. Die Expression von Versican ist für die normale Entwicklung von Herz und Blutgefäßen essentiell [45,46].Versican ist an verschiedenen Aspekten der Entwicklung von Gefäßläsionen beteiligt und kommt in atherosklerotischen Plaques, restenotischen Läsionen, während der Transplantatreparatur entstehenden Läsionen und aneurysmatischen Läsionen vor [27] .Versican-Spiegel steigen bei Atherosklerose dramatisch an [27,47], was darauf hindeutet, dass seine Akkumulation teilweise für eine erhöhte LDL-Ablagerung/Internalisierung in der Gefäßwand verantwortlich sein könnte (Abbildung 1ein).

Aggrecan, ein wichtiges CSPG im Knorpel, wurde kürzlich in menschlichen Aorten identifiziert [28,30,31,48–53] und zusammen mit Versican wurde gezeigt, dass es sich in den Aorten von Patienten mit TAAD anreichert, was zu einer erhöhten osmotischer Druck, der die ECM stört [30] (Abbildung 1B). Hier ist es wichtig zu beachten, dass Aggrecan eine Größenordnung mehr CS als Versican hat [54] und daher mehr Potenzial, osmotischen Druck auszuüben. Aggrecan enthält neben CS auch Keratansulfat (KS) GAGs (wo die D-Galactose ersetzt Hexuronsäure) gruppiert in eine KS-reiche Region [54].

Der Proteinkern von SLRPs wie Biglycan ist klein (40–60 kDa) und durch das Vorhandensein von 11–12 leucinreichen Tandem-Repeats und die Anlagerung von 1–2 CS/DS-GAG-Ketten gekennzeichnet [55]. Die leucinreichen Tandem-Repeats binden an Kollagene und regulieren so die Kollagenfibrillenbildung [56–58].

Biglycan ist eines der wichtigsten PGs, das in humanen atherosklerotischen Läsionen gefunden wird [59–62]. Biglycan bindet wie Aggrecan und Versican an LDL-Partikel, allerdings mit reduzierter Affinität aufgrund der geringeren Anzahl an GAG-Ketten [63]. Bgn Knockout-Mäuse zeigten keine reduzierte LDL-Retention in der Arterienwand, höchstwahrscheinlich aufgrund einer Kompensation durch andere CSPGs [64].Die Überexpression von Biglycan bei Mäusen erhöhte jedoch die arterielle Retention von apoB-Lipoproteinen und förderte Atherosklerose [62,65]. Biglycan kann auch eine anti-atherosklerotische Funktion ausüben. Bei Mäusen, die genetisch anfällig für die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen sind (die bereits eine Deletion von Apolipoprotein-E, ApoE, oder LDL-Rezeptor, LDLR), die Abschaffung der Biglycan-Expression erhöhte die Makrophagen-vermittelte Plaque-Entzündung [64]. Biglycan gilt auch als früher Initiator von Aortenstenose-Läsionen und trägt zur Wandverdickung bei [66]. Darüber hinaus ist Biglycan an der Bildung von TAAD beteiligt, da Bgn/LDLR Doppel-Knockout-Mäuse zeigten eine erhöhte Inzidenz von TAAD [67] und Verlust von Funktionsmutationen in Bgn führt beim Menschen zu syndromalem früh einsetzendem TAAD [68]. Bgn Knockout-Mäuse zeigten auch spontane abdominale Aortenaneurysmen (AAA) [69]. Da Biglycan-Mangel die Bildung von Kollagenfasern in der Aortenwand beeinträchtigt und zum Abbau elastischer Fasern beiträgt [67,70], beeinflusst dies die Fähigkeit des Gefäßes, Zugkräfte auszuhalten.

2.2. Proteoglykanasen

Physiologische PG-Spiegel werden durch die Proteoglykanase-Aktivität mehrerer Mitglieder der ADAMTS-Familie reguliert. ADAMTS-1, -4, -5, -8, -9, -15 und -20 spalten, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, sowohl Versican [71–75] als auch Aggrecan [76]. Die einzige bisher beschriebene ADAMTS-Spaltung der Versican-V1-Isoform erfolgt an der Glu441↓442Ala-Bindung innerhalb der βGAG-Domäne [71–75]. Die äquivalenten Spaltstellen im αDie GAG-Region in den V0- und V2-Isoformen wurde als Glu1428↓1429Ala [71] bzw. Glu405↓406Gln [77] identifiziert. Aggrecan wird von ADAMTS-Proteasen an mehreren Stellen gespalten [78], obwohl das Spaltungsereignis, das für seine Funktion am schädlichsten ist, an der Glu392↓Ala393-Bindung (Uniprot P16112-Nummerierung) in der Region zwischen den G1- und G2-Domänen auftritt [79]. Wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass die ADAMTS-vermittelte Spaltung von Aggrecan und Versican bioaktive Fragmente freisetzt. Das Versican V1-Spaltfragment G1-DPEAAE 441, Versikine genannt, ist an einer Vielzahl von biologischen Prozessen beteiligt, wie z. Bindungsprotein, das zuvor im menschlichen Gehirn identifiziert wurde [77]. Es wurde gezeigt, dass ein 32 Aminosäuren langes Aggrecan-Fragment, das durch MMP-vermittelte Spaltung an Asn360↓Phe361 und ADAMTS-vermittelte Spaltung an Glu392↓Ala393 erzeugt wurde, mit dem Toll-like-Rezeptor-2 interagiert und nozizeptive Neuronen in Chondrozyten anregt [82,83] . Nach ADAMTS-Spaltung an Glu392↓Ala393 kann das 393 ARGS Neopeptid aus der ECM in Plasma, Urin und Synovialflüssigkeit diffundieren [84,85]. Unter den oben genannten ADAMTS-Proteasen zeigen ADAMTS-4 und -5 die stärkste proteolytische Aktivität sowohl gegen Aggrecan [86,87] als auch Versican [88] darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass sie das SLRP Biglycan an Asn186↓187Cys spalten [86,89 ]. Diese Proteoglykanase-Aktivität übt wichtige Funktionen in der Gefäßbiologie aus und kann zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Arteriosklerose und Aneurysmen beitragen, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.

2.2.1. ADAMTS-1: Freund (bei TAAD) oder Feind (bei Arteriosklerose)?

ADAMTS-1 wurde als erstes Familienmitglied beschrieben [90]. Frühe murine Knockout-Modelle zeigten die Beteiligung dieses Enzyms an der Befruchtung und der Entwicklung des Urogenitalsystems [91–94], aber es wurde bald erkannt, dass ADAMTS-1 eine wichtige kardiovaskuläre Rolle spielt. Das Substratrepertoire von ADAMTS-1 scheint über die CSPGs Aggrecan [95] und Versican [88] hinauszugehen. Gemeldet in vitro Substrate umfassen Nidogen-1 und -2 [96,97], Semaphorin 3C [98], Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)-2 [99], Insulin Growth Factor Binding Protein (IGFBP)-2 [100], Syndecan-4 [101] und Thrombospondine 1 und 2 [98,102]. ADAMTS-1-Versicanase-Aktivität in vitro ist erheblich schwächer als die von ADAMTS-4 oder ADAMTS-5 [88], scheint aber bei bestimmten Entwicklungsprozessen wie der Follikulogenese biologisch wichtig zu sein [94]. Mausstudien legen nahe, dass die ADAMTS-1-Versicanase-Aktivität innerhalb des endokardialen Kissens zur Klappenreifung und myokardialen Trabekulation beiträgt [103,104]. Jedoch können die ADAMTS-1-Proteolyse von Nicht-PG-Substraten oder nicht-proteolytische Aktivitäten teilweise für diese Phänotypen verantwortlich sein.

In den Blutgefäßen wird ADAMTS-1 wie ADAMTS-4 und -5 von ECs, VSMCs und eindringenden Makrophagen exprimiert [105–108]. Die ADAMTS-1-Expression wurde in humanen atherosklerotischen Läsionen hochreguliert [105] und seine Versicanase-Aktivität kann zur Plaque-Instabilität beitragen [71,105]. Transgene Mäuse überexprimieren Adamts1 auf ein ApoE −/− Hintergründe wurden von Jönsson-Rylander untersucht et al. [107], aber Messungen der atherosklerotischen Läsionsbildung wurden nicht berichtet. Die Ligation der Halsschlagader bei diesen Mäusen zeigte jedoch eine signifikante Zunahme der Neointima-Bildung, was auf eine Wirkung von ADAMTS-1 auf die VSMC-Migration/Proliferation hindeutet (Tabelle 2). Um dies zu untermauern, zielen zwei miRNAs auf ADAMTS1, miR-265b-3p und miR-362-3p, schienen die VSMC-Proliferation und -Migration zu hemmen [123,124].

Tabelle 2. Adamts Knockout-Mäuse und Überexpression in vivo. AB, Aortenbanding-induzierte Herzhypertrophie BAV, bikuspide Aortenklappe AngII, Angiotensin II PAH, pulmonale arterielle Hypertonie PPS, Pentosanpolysulfat TAAD, thorakale Aortenaneurysmen und Dissektionen. Genmanipulation findet bei Mäusen statt, sofern nicht anders angegeben.

Es wurde auch berichtet, dass Angiotensin II (Ang II) und andere Stimuli, die mit dem Gefäßumbau verbunden sind, die Expression von ADAMTS-1 in der Aorta induzieren [125]. Schon seit Adamts1 Knockout-Mäuse haben eine erhöhte perinatale Mortalität [92], heterozygote Adamts1 +/–-Mäuse wurden in einem TAAD-Modell getestet [109]. Die Adamts1 +/− Genotyp-exazerbierte Aortenaneurismen und tödliche Aortendissektionen, die durch Behandlung mit dem hypertensiven Faktor Ang II induziert wurden. Die Verabreichung von Ang II induzierte TAAD in fast 80 % der Fälle Adamts1 +/− -Mäuse und tödliche Aortendissektionen bei fast 50 % dieser Mäuse, verglichen mit fast 10 und 8 % bei Wildtyp-Mäusen [109]. Dieser Phänotyp ähnelt dem von Fbn1 C1039G/+ , einem Mausmodell des Marfan-Syndroms (MFS), das im Vergleich zu anderen MFS-Mausmodellen durch eine geringe Inzidenz von Aortendissektionen und -rupturen gekennzeichnet ist [126]. In diesen „Marfan-Mäusen“ sind die eingeführten Fbn1 Mutation C1039G stört das Mikrofibrillengerüst, das aufgrund der vielen mechanistischen Komplexitäten der Fibrillen-Mikrofibrillennische und ihrer Rolle bei der Bildung elastischer Fasern, der Wachstumsfaktor-Signalgebung und der VSMC-Biologie komplexe Folgewirkungen (einschließlich verringerter ADAMTS-1-Proteinspiegel) hat [127,128 ]. Bei menschlichen Aortenaneurysmen sind die ADAMTS-1-Spiegel jedoch entweder unverändert oder erhöht [30,129,130].

Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass ADAMTS-1 eine schädliche Rolle bei der Ätiologie der Atherosklerose spielen kann, während weitere Studien erforderlich sind, um seine Beteiligung an der Entwicklung von Aortopathien zu belegen.

2.2.2. ADAMTS-4, ein potenzielles therapeutisches Ziel bei Arteriosklerose und TAAD

ADAMTS-4 spaltet CSPGs wie Versican und Aggrecan [87,88], Brevican [131] und SLRPs wie Fibromodulin [86,87] und Biglycan [86,89] sowie Nicht-PG-Substrate wie knorpeliges oligomeres Matrixprotein (KOMP) [132].

Obwohl ADAMTS-4, wie alle anderen Mitglieder der ADAMTS-Familie, mit Ausnahme von ADAMTS-13, überwiegend an die ECM gebunden ist [86,87], kann es nach kardiovaskulärer Schädigung ins Plasma diffundieren. Erhöhte Plasmaspiegel von ADAMTS-4 wurden durchweg bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit (CAD) [129,133-135], Atherosklerose [106,136–138] und TAAD [112,129] gefunden. Einige dieser Studien assoziierten erhöhte ADAMTS-4-Plasmaspiegel mit einem erhöhten Schweregrad der CAD [134,136] und einer Plaque-Destabilisierung [137,138]. Erhöhte ADAMTS-4-Spiegel wurden auch in makrophagenreichen Bereichen menschlicher atherosklerotischer Plaques und instabiler Koronarplaques gefunden [106,138]. Wichtig ist, dass diese Befunde beim Menschen mit denen aus verschiedenen Mausmodellen übereinstimmen (Tabelle 2). Es wurde gezeigt, dass die ADAMTS-4-Spiegel in den atherosklerotischen Plaques und im Plasma von ApoE Knockout [111,138] und LDLR −/− ApoB 100/100 [99] Doppel-Knockout-Mäuse mit fortschreitender Atherosklerose. Darüber hinaus ist die genetische Deletion von Adamts4 in einem (n ApoE Der Knockout-Hintergrund führte zu einem milderen atherosklerotischen Phänotyp mit erhöhter Plaquestabilität im Vergleich zu ihren Wurfgeschwistern [111]. ApoE/Adamts4 Doppel-Knockout-Mäuse zeigten auch eine reduzierte Spaltung von sowohl Versican als auch Aggrecan in den Arterien, ohne dass eine Kompensation durch andere Proteoglykanasen wie ADAMTS-1 und –5 gezeigt wurde. Dies war mit einer verringerten Lipidablagerung und Makrophageninfiltration, aber einer erhöhten VSMC-Proliferation verbunden [111]. Darüber hinaus wurden in Abwesenheit von ADAMTS-4 eine erhöhte Makrophagen-Apoptose und erniedrigte Spiegel proinflammatorischer Zytokine beobachtet [111]. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivität von ADAMTS-4 mit instabileren atherosklerotischen Plaques verbunden ist. Daher kann eine therapeutische Hemmung von ADAMTS-4 in späten Stadien der atherosklerotischen Entwicklung von Vorteil sein.

Löschung von Adamts4 konnte in einem Mausmodell von sporadischem TAAD, das durch eine fettreiche Ernährung und AgII-Infusion induziert wurde, eine signifikante Reduzierung des Aortendurchmessers, der Bildung von Aneurysmen, der Dissektion und der Aortenruptur zeigen [112]. Diese Phänotypen waren mit einer verminderten Makrophageninfiltration, VSMC-Apoptose und Versican-Abbau assoziiert [112]. Ausdruck von Adamts4 wird nach Ang II-Behandlung und Injektion von miR-126a-5p, einem miRNA-Targeting, erhöht Adamts4, wurde kürzlich gezeigt, dass es die Aortendilatation und den Versican-Abbau reduziert sowie das Überleben bei diesen Mäusen erhöht [139]. Eine starke Herunterregulation dieser miRNA könnte einer der Mechanismen sein, die für die beobachtete Hochregulation von Adamts4 Expression im Ang II-Modell [139].

In vitro, ADAMTS4 Knockdown reduziert nachweislich die Makrophageninfiltration [129] und die VSMC-Apoptose [112], zwei Prozesse, die für die Entwicklung von Aortenaneurysmen entscheidend sind [140], und Plaque-Rapture [141]. In beiden Fällen kann die Versicanase-Aktivität von ADAMTS-4 eine Rolle spielen. Versican in voller Länge ist mit adhäsiven Eigenschaften ausgestattet und seine Spaltung durch ADAMTS-Proteoglykanasen erleichtert die Migration von Immunzellen [80,142]. Darüber hinaus kann Versikin, das von ADAMTS erzeugte Versican-Spaltfragment, die Apoptose fördern [81] und somit der anti-apoptotischen Wirkung von Volllängen-Versican entgegenwirken [143,144]. ADAMTS-4 kann auch direkt an der Apoptose von VSMCs nach der Translokation in den Zellkern und der Spaltung von Poly-ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1) beteiligt sein, einem Schlüsselmolekül für die DNA-Reparatur und das Zellüberleben [112]. PARP-1 in voller Länge fördert das Überleben der Zellen, während gespaltenes PARP-1 Apoptose induzieren kann [145]. Schließlich wurde gezeigt, dass ADAMTS-4 unabhängig von seiner katalytischen Aktivität pro-apoptotische Wirkungen ausübt [146], was darauf hindeutet, dass ADAMTS-4 durch verschiedene Mechanismen Apoptose induzieren kann.

Interessanterweise war die ADAMTS-4-Expression im Myokard von Ratten mit Bluthochdruck erhöht und die Zugabe von Pentosanpolysulfat hemmte beides Adamts4 Expression und Versican-Spaltung und verbesserte Myokardfunktion [147].

Diese klinischen Beobachtungen und in vivo Daten aus Mausmodellen der Krankheit weisen auf mehrere Rollen von ADAMTS-4 in erkrankten kardiovaskulären Geweben hin. Ob die therapeutische Hemmung von ADAMTS-4 insbesondere das Fortschreiten von Gefäßerkrankungen verlangsamen könnte, bedarf weiterer Untersuchungen.

2.2.3. ADAMTS-5 reguliert den kardiovaskulären Proteoglykanspiegel

ADAMTS-5 wurde im Zusammenhang mit dem Abbau von Aggrecan im Knorpel umfassend untersucht und ist ein validiertes Ziel für die Behandlung von Osteoarthritis [148]. In jüngerer Zeit hat sich für ADAMTS-5 eine kardiovaskuläre Rolle herauskristallisiert, die kürzlich überprüft wurde [148] und hier kurz zusammengefasst werden soll.

In vitro, ADAMTS-5 ist eine stärkere Proteoglycanase als ADAMTS-1 und -4 [87,88] und das Fehlen von ADAMTS-5 in vivo verursacht eine Akkumulation von kardiovaskulären PGs (Tabelle 2). Zum Beispiel, Adamts5 Knockout-Mäuse zeigten schwere Anomalien in den Pulmonalklappensegeln aufgrund einer verminderten Versican-Spaltung und anschließender Versican- und Aggrecan-Akkumulation [53,113,114]. Es wäre interessant, diesen Phänotyp mit dem von Knock-in-Mäusen zu vergleichen, die ADAMTS-spaltungsresistentes Versican exprimieren (d. h. an der Glu1428↓1429Ala-Stelle mutiert), V1R-Mäuse genannt, aber ihr kardiovaskulärer Phänotyp wurde leider nicht beschrieben [149]. Während die Mehrheit der V1R-Mäuse lebensfähig und fruchtbar war, sterben einige von ihnen nach Rückkreuzung an Organblutungen [149].

ADAMTS-5 wurde in Aorten von . deutlich reduziert ApoE Knockout-Mäuse, die spontan atherosklerotische Läsionen entwickelten, was zu einer Akkumulation von Versican und Biglycan führte [150]. Rekombinantes ADAMTS-5 reduzierte die LDL-Bindungsfähigkeit von Biglycan und setzte LDL-Partikel aus humanen Aortenläsionen frei [150], was auf eine Rolle dieses Enzyms bei der Regulierung der PG-vermittelten Lipoproteinretention hindeutet (Abbildung 1ein). ADAMTS-5 wird sowohl in VSMCs [151,152] als auch in Makrophagen [106] exprimiert, zwei Zelltypen, die auch Versican exprimieren [151,153–155] und TIMP-3 [156–158], dem Hauptinhibitor von ADAMTS-4 und -5 [ fünfzehn]. Sobald sich ein Plaque gebildet hat, ist seine Stabilität mit hohen Expressionsspiegeln von TIMP-3 [158,159] und Versican [160] verbunden. Daher wird die atherosklerotische Plaqueentwicklung durch ein Ungleichgewicht zwischen der Expression von Proteoglykanasen, Proteoglykanase-Inhibitoren und PGs beeinflusst, wobei jedes Protein in verschiedenen Phasen des Prozesses eine vorteilhafte/schädliche Rolle spielen kann.

In Studien zu TAAD wurde festgestellt, dass die mRNA-Spiegel von ADAMTS-5 erniedrigt sind [30,161] und dies wurde kürzlich auf Proteinebene sowohl in Plasma als auch in Aortenbiopsien bestätigt [152]. Mausmodelle von TAAD können helfen, die Rolle von ADAMTS-5 bei dieser Krankheit zu klären. Im Ang II-Modell ist Adamts5 Knockout-Mäuse zeigten eine erhöhte Aortendilatation, was darauf hindeutet, dass ADAMTS-5 eine nicht redundante Rolle bei der Aufrechterhaltung der viskoelastischen Eigenschaften der Aorten-ECM spielt [51]. Der Verlust von ADAMTS-5 war mit erhöhten Proteinspiegeln von Versican und TGF-β verbunden [50], einem entscheidenden Faktor bei der Entwicklung von TAAD [160]. Gleichzeitig wurde die Expression von Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandtem Protein-1 (LRP-1) herunterreguliert [50], ein Phänomen, das seinerseits nachweislich die Aortendilatation verschlimmert [162]. Bemerkenswerterweise kompensierte in diesem Modell ein Anstieg der ADAMTS-1-Proteinspiegel das Fehlen von ADAMTS-5 nicht, da die Versican-Spaltung stark vermindert war [50]. Dies kann durch die höhere intrinsische Versicanase-Aktivität von ADAMTS-5 erklärt werden [88].

Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die proteolytische Aktivität von ADAMTS-5 für die Regulierung der Spiegel von kardiovaskulären PGs essentiell ist und dass Störungen den Krankheitsprozess bei Atherosklerose und TAAD beeinflussen könnten. Folglich sollte jede Arthrosebehandlung darauf abzielen, die ADAMTS-5-Aktivität in den Blutgefäßen zu schonen, um ein Ungleichgewicht der PG-Spiegel zu vermeiden [148].

2.2.4. ADAMTS-8, ein Beitrag zur pulmonalen arteriellen Hypertonie

Die enzymatischen Eigenschaften von ADAMTS-8, einschließlich seines Substratrepertoires, wurden nicht umfassend untersucht. Das einzige berichtete Substrat ist Aggrecan, das gespalten wurde in vitro, jedoch bei einem extrem hohen Enzym/Substrat-Verhältnis [163]. Ungeachtet der Homologie von ADAMTS-8 mit ADAMTS-1, -4 und -5 werfen diese Daten Zweifel an der Aufnahme von ADAMTS-8 in die Proteoglykanase-Unterfamilie auf. ADAMTS8 wurde als Tumorsuppressorgen bei mehreren Krebsarten [164] und bei Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in der ADAMTS8 Locus wurden in einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) mit Hypertonie in Verbindung gebracht [165]. Auf Proteinebene wird ADAMTS-8 in Lunge und Herz stark exprimiert [119,166] und wurde zusammen mit ADAMTS-1, -4 und -5 in humanen Karotisläsionen und fortgeschrittenen koronaren atherosklerotischen Plaques nachgewiesen [106,107]. Die Expression von ADAMTS-8 war in der Lunge von Patienten mit pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) und in Maus/Ratten-Modellen von PAH erhöht [119]. In einem Modell von Hypoxie-induzierter PAH zeigten Mäuse mit einer gezielten Deletion von Adamts8 in pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (Adamts8 SM22α ) zeigte im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen verringerten rechtsventrikulären systolischen Druck und eine rechtsventrikuläre Hypertrophie, was auf eine entscheidende Rolle von ADAMTS-8 bei der Entwicklung von PAH hindeutet [119]. Die Zugabe von rekombinantem ADAMTS-8 zu Lungenarterien-ECs schien eine proinflammatorische und pro-apoptotische Rolle zu spielen [119], ähnlich wie seine Wirkung auf Nasopharynxkarzinom-Zelllinien [167]. Diese Daten deuten auf mögliche Ähnlichkeiten zwischen der Funktion von ADAMTS-8 bei PAH und bei Krebs hin. Da ADAMTS-8 auch im Herzen exprimiert wird, ist ein konditionales Knockout-Modell mit kardiomyozytenspezifischer Deletion von Adamts8 (Adamts8 αMHC ) wurde generiert [119]. Diese Mäuse zeigten eine verminderte Herzhypertrophie, Fibrose und rechtsventrikuläre Dysfunktion als Reaktion auf Hypoxie.

Zusammengenommen implizieren diese Ergebnisse ADAMTS-8 bei der Entwicklung von PAH und möglicherweise anderen kardiovaskulären Phänotypen, aber weitere Studien sind notwendig, um das Substratrepertoire, den Wirkmechanismus und die Regulation von ADAMTS-8 zu charakterisieren.

2.2.5. ADAMTS-9 in der Herzentwicklung

Evolutionär gesehen scheint ADAMTS-9 das älteste Familienmitglied zu sein, basierend auf seiner hohen Homologie zu Nematoden- und Fruchtfliegen-Proteasen namens Gon-1 bzw. Adamts-A [72,168–170]. Es ist auch das größte Mitglied der ADAMTS-Familie und umfasst 14 TSR-Wiederholungen und eine Gon-1-ähnliche Domäne am C-Terminus (Tabelle 1).

Adamts9 Knockout-Mäuse überlebten aus unbekannten Gründen nicht die 7,5-Tage der Trächtigkeit, aber möglicherweise aufgrund einer wichtigen Rolle von ADAMTS-9 bei der Bildung und Funktion von primären Zilien [171,172]. Heterozygote Knockout-Mäuse zeigten eine variable Penetranz von Herzanomalien des Myokards, der Mitralklappen, der Aortenklappen und der proximalen Aorta, verbunden mit einem Überschuss an Versican [120], was darauf hindeutet, dass dieses Enzym an der Entwicklung des Herzens beteiligt ist (Tabelle 2).

In einer Studie zur Genexpression im Zusammenhang mit einer AAA-Ruptur wurde Aortengewebe aus einer Notfallreparatur eines rupturierten AAA mit Gewebe aus einer elektiven Operation verglichen. Dies identifizierte einen Satz von 5 Fibroblasten-exprimierten Genen, die ausschließlich in AAA hochreguliert waren, einschließlich ADAMTS9 [173].

3. ADAMTS-7 bei koronarer Herzkrankheit

ADAMTS-7 ist ein potenzielles therapeutisches Ziel bei Arteriosklerose und damit verbundenen Erkrankungen wie CAD.Die Beweise für eine nachteilige Rolle haben sich in den letzten zehn Jahren angesammelt und umfassen 1) reduzierte Arteriosklerose nach Ablation des Adamts7 Gen in Mäusen (Tabelle 2) 2) GWAS, die eine Assoziation von ADAMTS7 SNPs mit CAD und 3) immunhistochemischer Nachweis von ADAMTS-7 in humanen atherosklerotischen Plaques.

Knockout von Adamts7 vor atherosklerotischem Hintergrund reduzierte atherosklerotische Gesamtläsionsfläche in der Aorta von Adamts7 −/− /ApoE −/− Mäuse um 62 % (männlich) und 54 % (weiblich) im Vergleich zu den Kontrollen der Wurfgeschwister. In Adamts7 −/− /Ldlr −/− Mäusen betrug die Reduktion 37 % bzw. 52 % [116]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die pharmakologische Hemmung der ADAMTS-7-Aktivität das Fortschreiten der Arteriosklerose verlangsamen könnte. Adamts7 −/−-Mäuse zeigten auch eine veränderte Reaktion von VSMCs auf arterielle Drahtverletzungen [116,117]. Sie zeigten eine stark reduzierte Neointima-Bildung bei Gefäßverletzungen, die zuvor bei Ratten nach Adamts7 Knockdown mit siRNA in einem Ballonverletzungsmodell [118]. Bei Verwendung des gleichen Modells wurde der gegenteilige Effekt beobachtet, wenn ADAMTS-7 überexprimiert wurde [118]. Diese Effekte von ADAMTS-7 auf VSMC in vivo stimme mit den Ergebnissen überein in vitro [116–118,174].

GWAS haben gezeigt, dass SNPs im ADAMTS7 Locus sind mit CAD assoziiert [174]. Der SNP, von dem angenommen wird, dass er die Assoziation verursacht, ist rs3825807, von denen das G-Allel mit einem reduzierten KHK-Risiko verbunden ist. Es bewirkt eine Serin-zu-Prolin-Substitution in Position 214 der Prodomäne von ADAMTS-7. Das Prolin befindet sich in der Nähe von Erkennungsmotiven von Subtilisin-ähnlichen Proproteinkonvertasen wie Furin und PCSK6, die ADAMTS-7 durch proteolytische Entfernung der inhibitorischen Prodomäne aktivieren. Es wurde gezeigt, dass Prolin die Entfernung der Prodomäne behindert, was folglich die Aktivierung von ADAMTS-7 reduziert [174] und möglicherweise das reduzierte KHK-Risiko im Zusammenhang mit dem G-Allel vermittelt. VSMCs des G/G-Genotyps für rs3825807 auch weniger abgewandert in vitro im Vergleich zum A/A-Genotyp.

Immunhistochemie menschlicher atherosklerotischer Plaques identifizierte das ADAMTS-7-Protein [174,175]. In Carotis-Plaques waren die ADAMTS-7-Spiegel bei Patienten mit zerebrovaskulären Symptomen im Vergleich zu Patienten ohne diese Symptome erhöht und hohe Spiegel korrelierten auch mit einem erhöhten Risiko für postoperative kardiovaskuläre Ereignisse [175].

Mehrere in vitro Substrate von ADAMTS-7 wurden in der Literatur beschrieben, aber klare Verbindungen mit Atherosklerose und VSMC-Verhalten wurden nicht festgestellt [117,176,177]. Die auf Massenspektrometrie basierende Methode terminal amin isotopic labeling of substates (TAILS) wurde verwendet, um potenzielle ECM-Substrate zu identifizieren, die das latente TGF-β-bindende Protein 4 (LTBP4) als Substrat identifizierten [178]. LTBP4 ist ein Bestandteil von Mikrofibrillen/elastischen Fasern in der Lunge und großen Blutgefäßen und wird auch im Herzen mit ADAMTS-7 koexprimiert [179,180]. Es bindet an mehrere ECM-Proteine, darunter Fibulin-1, Fibulin-4 und Fibulin-5, die für die Bildung elastischer Fasern in großen Blutgefäßen essentiell sind [179,181,182]. Die Proteolyse von LTBP4 durch ADAMTS-7 beeinflusst wahrscheinlich diesen Prozess, aber dies muss noch untersucht werden in vivo. Auch die Bedeutung der LTBP4-Proteolyse durch ADAMTS-7 für die Arteriosklerose ist derzeit unklar. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte jedoch, dass die LTBP4 Gen wurde zwischen Plaques von symptomatischen und asymptomatischen Patienten unterschiedlich exprimiert [183], was darauf hindeutet, dass LTBP4 die Zusammensetzung atherosklerotischer Plaques beeinflussen könnte.

Während mehrere andere Mitglieder der ADAMTS-Familie durch den endogenen Metalloprotease-Inhibitor TIMP-3 reguliert werden, ist ADAMTS-7 anfälliger für die Hemmung durch TIMP-4, das ADAMTS-7 bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen effizient hemmt [178]. Sowohl TIMP-4 als auch ADAMTS-7 haben eine eingeschränkte Gewebeverteilung mit besonders starker Expression in adulten kardiovaskulären Geweben [116,184].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ADAMTS-7 ein potenzielles therapeutisches Ziel bei KHK und verwandten Erkrankungen aufgrund von Atherosklerose ist, aber weitere Forschung ist erforderlich, um es als Ziel zu validieren und ein besseres Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu ermöglichen.

4. ADAMTS-13, thrombotische thrombozytopenische Purpura und Schlaganfall

ADAMTS-13 zirkuliert im Blut mit einer Konzentration von ungefähr 6 nM, wo es neu sekretierte VWF-Multimere trimmt, die ansonsten zu thrombogen wären [185] (Abbildung 1ein). Eine sehr geringe (weniger als 10%) ADAMTS-13-Aktivität verursacht die Krankheit TTP und eine mäßig niedrige ADAMTS-13-Aktivität ist mit einem ischämischen Schlaganfall verbunden, der ebenfalls ein Merkmal von TTP ist. Bei TTP aggregieren die VWF-Multimere, die zu lang sind, spontan Thrombozyten ohne Endothelschädigung [186]. TTP ist eine seltene, lebensbedrohliche Erkrankung, die am häufigsten bei zuvor gesunden jungen bis mittleren Erwachsenen auftritt, mit einer jährlichen Inzidenz von 6 pro Million in Großbritannien [187,188]. Sie zeigen eine schwere mikroangiopathische hämolytische Anämie (MAHA), schwere Thrombozytopenie und Endorganschäden. Die am häufigsten betroffenen Organe sind Herz, Gehirn, Niere und Magen-Darm-Trakt [189]. Der MAHA ist das Ergebnis der Mikrothromben, die die kleinen Gefäße verschließen und die roten Blutkörperchen schädigen, während die schwere Thrombozytopenie durch den Verzehr der in den Mikrothromben gefangenen Blutplättchen verursacht wird. Der Endorganschaden resultiert aus dem Verschluss der kleinen Gefäße, die die Organe mit Sauerstoff versorgen [188]. Bei einer kleinen Minderheit von TTP-Patienten ist die ADAMTS-13-Aktivität aufgrund von vererbten Mutationen in der kodierenden Region des gering ADAMTS13 Gen [189]. Die häufigste Form von TTP ist die immunvermittelte TTP (iTTP), an der Autoantikörper gegen ADAMTS-13 beteiligt sind, die das Enzym schnell aus dem Kreislauf entfernen und seine Aktivität hemmen, indem sie die Bindung an sein Substrat VWF verhindern [190]. Autoantikörper, die auf die N-terminalen Domänen bis hin zur Sp-Domäne abzielen, können inhibitorisch sein, im Einklang mit der Entdeckung mehrerer Exositen in diesen Domänen [190–195]. Die Behandlung von iTTP besteht derzeit aus Plasmaaustausch (PEX), um pathogene Autoantikörper zu entfernen und ADAMTS-13 in Verbindung mit Rituximab zur Unterdrückung der Autoantikörperproduktion bereitzustellen [186,196]. PEX ist entscheidend und lebensrettend, wenn sich Patienten im Notfall im Krankenhaus aufhalten. In jüngerer Zeit wird PEX auch mit Caplacizumab ergänzt, einem Konstrukt, das aus zwei fusionierten Einzeldomänen-Antikörpern besteht, die beide auf dasselbe Epitop in der VWF A1-Domäne abzielen und die Thrombozytenaggregation reduzieren [197]. Rekombinantes ADAMTS-13 befindet sich derzeit in einer klinischen Phase-2-Studie, in der es zur Ergänzung von PEX bei iTTP-Patienten eingesetzt wird, um die Genesung zu beschleunigen und den Einsatz von PEX zu reduzieren (ClinicalTrials.gov: NCT03922308). Während die meisten antithrombotischen Mittel ein Blutungsrisiko bergen, ist dies für rekombinantes ADAMTS-13 aufgrund des einzigartigen Mechanismus, durch den seine Aktivität reguliert wird, unwahrscheinlich. Es wird nicht durch einen physiologischen Inhibitor (z. B. TIMPs, [198]), sondern durch die begrenzte und bedingte Verfügbarkeit von VWF-Exositen und spaltbaren Bindungen reguliert. Diese sind normalerweise innerhalb der globulären VWF-A2-Domäne vergraben und werden erst freigelegt, wenn sich die A2-Domäne bei erhöhter Schubspannung im Kreislauf entfaltet [199–201]. Ultralanges VWF unterliegt beim Austritt aus dem Endothel und Eintritt in den Kreislauf einer erhöhten Scherspannung, was eine Proteolyse durch ADAMTS-13 verursacht, die die Größe des Multimers verringert und dadurch die auf das Molekül ausgeübte Zugkraft reduziert, wodurch eine weitere Entfaltung und Spaltung von VWF verhindert wird A2 Domänen [199, 202]. VWF ist das einzige berichtete Substrat von ADAMTS-13. Die Spezifität der Protease wird durch Exositen in mehreren ADAMTS-13-Domänen verliehen, die komplementäre Exositen in der VWF-A2-Domäne C-terminal an die spaltbare Bindung binden [193,194,203–205]. Darüber hinaus beherbergen Subsites in der Mp-Domäne VWF-Seitenketten auf beiden Seiten der spaltbaren Bindung und tragen zur Gesamtspezifität des Enzyms bei [204,206,207].

Während ADAMTS-13-Aktivitäten von weniger als 10 % TTP verursachen können, sind niedrige Werte, die in den normalen Bereich (unterstes Quartil) fallen, mit einem erhöhten Risiko verbunden, einen ischämischen Schlaganfall zu entwickeln [208–210]. Bei Patienten mit akuter ischämischer Hirnschädigung sagt das Verhältnis der VWF-Antigenspiegel zur ADAMTS-13-Aktivität (VWF:Ag/ADAMTS-13Ac) die Sterblichkeit voraus und ist mit einer Auswirkung auf die Gehirnfunktion bei Überlebenden verbunden [211]. Auch bei TTP-Patienten, die sich erholt haben und sich in Remission befinden, sind niedrigere ADAMTS13-Aktivitäten nach der Genesung mit einem Schlaganfall verbunden [212]. In Tiermodellen des ischämischen Schlaganfalls scheint die Gabe von rekombinantem ADAMTS-13 nach einem Schlaganfall vorteilhaft zu sein [213,214].

5. Andere Mitglieder der ADAMTS-Familie

5.1. Die Prokollagenase ADAMTS-2 bei der Myokardreparatur

ADAMTS-2 ist das Hauptenzym, das das N-Propeptid von Typ-I-Prokollagen spaltet und so den Zusammenbau von Kollagentrimeren zu Fibrillen/Fasern ermöglicht [215]. Obwohl dies hauptsächlich an der Haut untersucht wurde, kann es auch in anderen Geweben vorkommen. Beispielsweise zeigte die Analyse von Herzen von kardiomyopathischen Patienten eine Hochregulation von ADAMTS2, was die wichtige Rolle von Kollagen bei der Myokardreparatur und bei der Narbenbildung widerspiegeln könnte. Das Kollagen, das zur „Reparatur“ von Myokardschäden abgelagert wird, erfordert die Entfernung der Prodomäne durch ADAMTS-2, damit sich Kollagenfasern bilden können. Eine erhöhte Kollagenexpression erfordert wahrscheinlich eine erhöhte ADAMTS-2-Expression. Dies kann auch die veränderte Adamts2 Expression bei mit Isoproterenol behandelten Mäusen, die kardiale Myopathie und Hypertrophie induzieren [216] (Tabelle 2). In einemdamts2 Null-Mäuse wurden die schädlichen Auswirkungen einer Drucküberlastung auf das Herz verstärkt [110], möglicherweise aufgrund von gestörten Reparaturmechanismen von Kollagen.

5.2. ADAMTS-6 in der Herzentwicklung und QRS-Dauer

ADAMTS6 mRNA wurde im Mausherzen nachgewiesen, insbesondere im Ausflusstrakt, in den Klappen, Vorhöfen und im ventrikulären Myokard [115]. Die physiologische Funktion von ADAMTS-6 ist nicht bekannt, aber in vitro Studien legen nahe, dass es mit dem von Fibrillin-1-Mikrofibrillen und fokalen Adhäsionen in Verbindung stehen könnte [22]. Wichtig ist, dass ADAMTS-6 durch ein GWAS mit der Herzbiologie in Verbindung gebracht wurde, das herausfand, dass zwei ADAMTS6 Missense-Varianten (S90 L und R603 W) wurden mit der Dauer des QRS-Intervalls des Elektrokardiogramms in Verbindung gebracht [115], was eine kardiale ventrikuläre Depolarisation widerspiegelt. Ein verlängertes QRS ist ein Prädiktor für die Mortalität sowohl in der Allgemeinbevölkerung als auch bei Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen [217–219]. Die Missense-Varianten S90 L in der Prodomäne und R603 W in der ersten TSP-1-ähnlichen Domäne beeinträchtigen beide die Proteinsekretion stark [115]. Verblüffenderweise war S90 L mit einem längeren QRS und R603 W mit einer kürzeren QRS-Dauer verbunden. Bei Menschen europäischer Abstammung ist etwa 1/500 für die S90 L-Variante heterozygot, während R603 W bei Personen europäischer Abstammung selten, bei Menschen afrikanischer Abstammung jedoch häufig vorkommt, wo etwa 1/70 heterozygot ist (https://gnomad .broadinstitute.org/). Beide Varianten können jedoch homozygot pathogen sein und/oder in heterozygoter Form als Risikofaktoren für Herzerkrankungen fungieren. Eine kardiale Rolle von ADAMTS-6 steht auch im Einklang mit den tödlichen angeborenen Herzfehlern von Mäusen, die für eine Nullmutation in homozygot sind Adamts6, die prä-/perinatal sterben [115]. Ihre embryonalen Herzfehler umfassen den rechten Doppelausgangsventrikel, einen atrioventrikulären Septumdefekt und eine ventrikuläre Hypertrophie. Interessanterweise sind Mäuse, die für die Nullmutation hemizygot sind, lebensfähig und zeigen keine strukturellen Herzfehler, aber ihre Ventrikel exprimieren geringe Mengen an Connexin-43-Protein, dem wichtigsten Myokard-Gap-Junction-Protein in Mäusen und menschlichen Herzen. Die reduzierten Connexin-43-Spiegel scheinen eine posttranskriptionelle Ursache zu haben, da die mRNA-Spiegel des entsprechenden Gens (Gja1) waren nicht betroffen [115]. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass ADAMTS-6 eine Rolle bei der Entwicklung des Herzens und bei der Regulierung der Gap Junction-vermittelten ventrikulären Depolarisation spielen könnte.

5.3. ADAMTS-10 und kardiovaskuläre Manifestationen von WMS

Mutationen in ADAMTS10 eine autosomal-rezessive Form des WMS verursachen [220–222]. WMS ist eine seltene erbliche Erkrankung des Bindegewebes, die durch Kleinwuchs, Brachydaktylie, Gelenksteife, breiter Schädel, Herzfehler und eine Vielzahl von Augenanomalien gekennzeichnet ist [222,223]. Drei verschiedene ADAMTS10 Mutationen wurden in zwei blutsverwandten Familien und in einem sporadischen WMS-Fall identifiziert, darunter eine Nonsense-Mutation und zwei Spleißmutationen [220]. Zu den klinischen Merkmalen von WMS-Patienten mit ADAMTS10 Mutationen waren Aorten- und Lungenstenose mit dysplastischen Klappen und hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie [220]. Das Weil-Marchesani-Syndrom wird auch durch Mutationen in Fibrillin-1 verursacht (FBN1) und LTBP2, was ADAMTS-10 in der Fibrillin-1-Mikrofibrillenbiologie impliziert [21]. Fibrillin-1-Mikrofibrillen sind ECM-Einheiten, die für die Bildung der elastischen Fasern in Blutgefäßen, Lunge, Haut, Bändern und anderen elastischen Geweben unerlässlich sind. Sie regulieren auch die Bioverfügbarkeit von Wachstumsfaktoren der TGF-β- und Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Superfamilie [224]. Anschließend wurde bestätigt, dass ADAMTS-10 die Fibrillin-Mikrofibrillenfunktion reguliert und Fibrillin-1 an zwei Stellen bindet, die mit den Fibrillin-1-Mutationen in WMS übereinstimmen [225]. Es kolokalisiert auch mit Fibrillin-1 in Geweben und beschleunigt den Aufbau von Mikrofibrillen in Fibroblastenkulturen [226]. Augenmerkmale in WMS verursacht durch ADAMTS10 Mutationen können auf eine reduzierte Fibrillin-2-Spaltung zurückzuführen sein [227]. Mutationen in anderen Genen, die an der Fibrilin-Mikrofibrillenbiologie beteiligt sind, verursachen die verwandten Erkrankungen WMS-ähnliches Syndrom (ADAMTS17) und geleophysische Dysplasie (LTBP3, ADAMTSL2, Fibrillin 1) [228].

5.4. ADAMTS-16, ein potenzieller Blutdruckregulator

Die Funktion von ADAMTS-16 ist derzeit unbekannt, mit widersprüchlichen Berichten über seine mögliche Beteiligung an der männlichen Fertilität und Geschlechtsbestimmung [229,230]. Das einzige bisher beschriebene Substrat ist Fibronektin [231]. ADAMTS-16 wurde als quantitatives Merkmalsgen (QTG) für den Blutdruck bei Menschen [232,233] und Ratten [234] identifiziert. Um die kardiovaskuläre Funktion von ADAMTS-16 zu untersuchen, Adamts16 Knockout-Ratten wurden generiert [121] (Tabelle 2). Diese Ratten zeigen im Vergleich zu Wildtyp-Ratten einen niedrigeren systolischen Blutdruck, eine verringerte arterielle Steifigkeit und Dicke der Tunica media, was auf eine Beteiligung von ADAMTS-16 an der Regulierung der Hämodynamik schließen lässt [121]. Außerdem, Adamts16 Knockout-Ratten überlebten länger, obwohl sie Nierenanomalien aufwiesen [121]. Weitere Daten werden benötigt, um eine mögliche Rolle von ADAMTS-16 bei der Blutdruckregulation zu ermitteln.

5.5. ADAMTS-19 bei progressiver Herzklappenerkrankung

Eine kürzlich durchgeführte Studie über früh einsetzende Herzklappenerkrankungen identifizierte Mutationen in ADAMTS19 durch Whole-Exom-Sequenzierung. Vier Patienten in zwei blutsverwandten Familien trugen homozygote Mutationen in ADAMTS19 Dies verursacht eine große Multi-Exon-Deletion in einer Familie und ein verkürztes ADAMTS-19-Protein in der anderen Familie [122]. Um die Kausalität zu bestätigen, Adamts19 Knockout-Mäuse wurden erzeugt (Tabelle 2). Von den Homozygoten Adamts19 Knockout-Mäuse zeigten 38 % im Alter von drei Monaten eine Aortenklappeninsuffizienz und/oder Aortenstenose, was eine wichtige Rolle von ADAMTS-19 in der Aortenklappenphysiologie bestätigt. Ausdrucksanalyse von lacZ in Adamts19 Knockout-Mäuse zeigten eine starke lokalisierte Expression von lacZ durch interstitielle Klappenzellen in allen vier Klappen um E14.5 und Expression durch diese Zellen bis zum Erwachsenenalter. Die ultrastrukturelle Analyse der ECM deutete auf Veränderungen in der ECM-Organisation hin, einschließlich PG-Akkumulation. Die Beobachtung der PG-Akkumulation wirft die Frage auf, ob dies sekundär auf eine gestörte Klappenphysiologie/Zellfunktion oder einen reduzierten PG-Umsatz durch ADAMTS-19 zurückzuführen ist.

6. ADAMTS therapeutisch gezielt einsetzen

ADAMTS-Inhibitoren könnten potenziell therapeutisch eingesetzt werden, um die Enzymaktivität zu reduzieren, die zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen beiträgt oder diese verschlimmert (z. B. für ADAMTS-7). Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, therapeutische Metalloprotease-Inhibitoren mit ausreichender Selektivität zu entwickeln, um Nebenwirkungen durch Kreuzhemmung verwandter Metalloproteinasen zu verhindern [235]. Selektive Inhibitoren können entweder monoklonale Antikörper [235] oder kleine Moleküle sein, wobei letztere den entscheidenden Vorteil haben, dass sie oral verabreicht werden können. Selektive niedermolekulare Inhibitoren können auf der Grundlage der verfügbaren dreidimensionalen Struktur des Zielenzyms entworfen oder durch Hochdurchsatz-Screening (HTS) großer Substanzbibliotheken identifiziert werden. Um Bibliotheken mit kleinen Molekülen auf ihr inhibitorisches Potenzial zu screenen, werden gereinigte Enzyme und ein Hochdurchsatz-Aktivitätsassay benötigt. Typischerweise beinhalten Hochdurchsatz-Aktivitätsassays für Proteasen die Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Technologie, bei der die Proteolyse eines kleinen Peptids ein Fluoreszenzsignal erzeugt [236]. Für ADAMTS-7 haben wir einen solchen Aktivitätsassay mit einem kleinen LTBP4-Peptid als effizientem Substrat entwickelt und konvertieren diesen derzeit für HTS von Bibliotheken kleiner Moleküle (Manuskript in Vorbereitung)

Andererseits, wo sich die Aktivität eines Mitglieds der ADAMTS-Familie in einem bestimmten pathologischen Kontext als vorteilhaft erwiesen hat, können sogenannte Enhancer oder Aktivatoren in Betracht gezogen werden. Beispielsweise wurde über monoklonale Antikörper berichtet, die die katalytische Aktivität von ADAMTS-13 erhöhen können [237]. Ein weiterer innovativer Ansatz zur Steigerung der ADAMTS-Aktivität kann die Störung der LRP-1-vermittelten Endozytose beinhalten. Wir haben kürzlich über einen monoklonalen Antikörper berichtet, der in der Lage ist, an ADAMTS-5 zu binden und seine Bindung an LRP-1 zu blockieren, ohne seine Proteoglykanase-Aktivität zu beeinträchtigen [238], was zu einer Akkumulation von aktivem ADAMTS-5 im extrazellulären Milieu führt. Ein solcher Antikörper kann verwendet werden, um die ADAMTS-5-Proteoglykanase-Aktivität in Mausmodellen von Atherosklerose und TAAD zu retten (Tabelle 2).

7. Fazit

Mitglieder der ADAMTS-Familie erfüllen mehrere unterschiedliche Rollen in kardiovaskulären Geweben (Tabelle 1). Einige von ihnen sind wichtig für die Embryogenese und Homöostase der Herzklappen (Abbildung 2), aber im Allgemeinen spiegelt die Vielzahl der von ADAMTS-Proteasen beeinflussten physiologischen Prozesse die vielen Funktionen der ECM wider, wie z Faktoren. Aus Tierversuchen wurde viel über ADAMTS-Proteasen gelernt, jedoch ist bei der Extrapolation von Mausdaten auf menschliche Erkrankungen in Ermangelung klinischer Studien Vorsicht geboten. In dieser Hinsicht sollte eine Schlussfolgerung durch qualitativ hochwertige gesammelte Daten gestützt werden in vitro, in vivo und Ex-vivo aber dieses Ziel wurde bisher nur von wenigen Familienmitgliedern erreicht. Dennoch werden jedes Jahr spannende neue Erkenntnisse veröffentlicht, die die physiologischen Funktionen dieser faszinierenden Proteasenfamilie schrittweise aufklären.


Methoden

Die Protease-Daten

Die Proteasen in P. falciparum wurden mithilfe eines vergleichenden Genomik-Ansatzes und eines auf Support-Vektor-Maschinen (SVM) basierenden, überwachten maschinellen Lernansatzes vorhergesagt [1-3]. Die Klassifizierung und Annotation erfolgte nach der MEROPS-Protease-Nomenklatur, die auf intrinsischen evolutionären und strukturellen Beziehungen beruht [110].

Netzwerkdaten und -analyse

Der komplette Satz von Protein-Protein-Assoziationen für P. falciparum wurde aus der heruntergeladenen STRING-Datenbank extrahiert [4] jede Assoziation zwischen einem Proteinpaar hat einen Konfidenzwert (S) im Bereich von 0,15 bis 0,999, der aus den Beweisen abgeleitet wurde, die zum Nachweis der Assoziation verwendet wurden, wie Homologietransfer, KEGG-Wegzuordnungen, konservierte Chromosomensyntenie, phylogenetische Ko-Vorkommen und Literatur-Ko-Vorkommen [111]. Dieser Satz von Assoziationen wurde in Cytoscape [112] visualisiert und in einen ungerichteten gewichteten Graphen umgewandelt, bei dem es eine einzelne Kante zwischen jedem Proteinpaar gibt und der S-Wert als Gewicht verwendet wird. Das Netzwerk wurde mit NetworkAnalyzer [113] charakterisiert und signifikante Module wurden mit MINE [114] und MCODE [115] erkannt. Für alle drei Plugins wurden die Standardwerte verwendet. Der Satz von Proteinen, der direkt mit den 77 Proteasen im Assoziationssatz assoziiert ist, wurde mit BiNGO [116] gescreent, um zu bestimmen, ob irgendwelche Kategorien von Proteinen, wie sie durch ihre Gene Ontology-Begriffe identifiziert wurden, überrepräsentiert waren. Der hypergeometrische Test wurde mit der Korrektur des falschen Entdeckungsdatums von Benjamini und Hochberg verwendet. Es wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt.

Das Omics-Data-Mining

Wir haben die heruntergeladen P. falciparum Genomsequenz- und Annotationsdaten [18], transkriptomische Microarray-Daten [6-8], Massenspektrometrie-Proteomikdaten [9-12] und Protein-Protein-Interaktomdaten [5] für netzwerkassoziierte Proteine ​​von PlasmoDB, dem Plasmodium Genome Resource Center (http://www.plasmodb.org) [117]. Konservierte Domänen/Motive in P. falciparum Sequenzen wurden durch Durchsuchen von InterPro identifiziert [118]. Mehrere Alignments wurden mit dem ClustalX-Programm [119] und T-Coffee [120] erhalten, gefolgt von einer manuellen Inspektion und Bearbeitung. Phylogenetische Bäume wurden durch die Methoden Neighbor-Joining, Maximum-Parsimony und Maximum-Likelihood unter Verwendung von MEGA5 abgeleitet [121].


Inhalt

Proteasen werden derzeit in sechs Gruppen eingeteilt:

  • Serinproteasen
  • Threonin-Proteasen
  • Cystein-Proteasen
  • Asparaginsäure-Proteasen
  • Metalloproteasen
  • Glutaminsäure-Proteasen

Die Threonin- und Glutaminsäure-Proteasen wurden erst 1995 bzw. 2004 beschrieben. Der Mechanismus zur Spaltung einer Peptidbindung besteht darin, einen Aminosäurerest mit Cystein und Threonin (Peptidasen) oder ein Wassermolekül (Asparaginsäure-, Metallo- und Glutaminsäure-Peptidasen) nukleophil zu machen, damit er die Peptid-Carbonylgruppe angreifen kann. Eine Möglichkeit, ein Nukleophil herzustellen, ist eine katalytische Triade, bei der ein Histidinrest verwendet wird, um Serin, Cystein oder Threonin als Nukleophil zu aktivieren.


Proteasen im Blut - Biologie

In seinem 1996 erschienenen Buch Darwin's Black Box argumentierte Michael Behe, dass die Blutgerinnungskaskade bei Wirbeltieren „irreduzibel komplex“ sei. Prof. Behe ​​meint damit, dass jedes einzelne Element der komplexen Kaskade von Enzymen und Cofaktoren für Blut vorhanden sein muss Gerinnung zur Arbeit. Da nach Behe ​​ein irreduzibel komplexes System nicht durch die Darwinsche natürliche Auslese erzeugt werden kann, muss es von etwas anderem erzeugt worden sein. Es muss entworfen worden sein.

Nach der Veröffentlichung von Behes Buch wiesen eine Reihe von Wissenschaftlern schnell darauf hin, dass Behe ​​sich in vielen seiner Behauptungen über die Blutgerinnungskaskade geirrt hatte. Die Arbeit von Russell Doolittle und vielen anderen Wissenschaftlern hat ganz klar gezeigt, dass sich das System durch einen Prozess von Genduplikationen aus Serinproteasen entwickelt hat, die einst Verdauungsenzyme waren. Es überrascht nicht, dass Behe ​​behauptet, dass die vielen Kritiken an seiner Arbeit falsch sind. Im August 2000 veröffentlichte er einen Aufsatz im Internet:

Zur Verteidigung der irreduziblen Komplexität der Blutgerinnungskaskade.
Eine Antwort auf Russell Doolittle, Ken Miller und Keith Robison.

Eine Antwort auf Behes Verteidigungsversuch

Wie ich in meinem 1999 erschienenen Buch Finding Darwin's God schrieb, hat Russell Doolittles bahnbrechende Arbeit zur Proteinevolution tatsächlich gezeigt, dass die Blutgerinnungskaskade durch die darwinistische Evolution hervorgebracht werden könnte und tatsächlich wurde. Dr. Behes Verteidigung seiner gegenteiligen Position erfordert von ihm zu erklären, warum meine Beschreibung der Entwicklung des Systems (S. 152-161) nicht gültig ist. In seiner im Internet veröffentlichten Verteidigung schreibt er, dass meine Beschreibung "eine gerechte Geschichte ist, die sich nicht mit den Schwierigkeiten befasst, mit denen die Entwicklung eines so komplizierten Systems konfrontiert wäre."

Seltsamerweise ignoriert Behe ​​meine Beschreibung der Entwicklung der Blutgerinnung im Hummer fast und liefert keine Widerlegung meines Szenarios für seine Entwicklung (natürlich basierend auf Doolittles Forschungsarbeit). Ich habe das Hummersystem in meinem Buch aus zwei Gründen beschrieben: (1) Es ist wie das Wirbeltiersystem (nach Behes Maßstäben) irreduzibel komplex und (2) es ist ein einfacheres System, dessen schrittweise Evolution relativ einfach zu Rechnung tragen.

Behe merkt ganz richtig an, dass meine eigene Beschreibung der Evolution des Gerinnungssystems von Wirbeltieren ziemlich kurz ist. leider eine Entscheidung meines Herausgebers bei Harper-Collins (dem Herausgeber des Buches). Nichtsdestotrotz habe ich immer noch meinen ursprünglichen Entwurf dieses herausgeschnittenen Abschnitts, den der Leser vielleicht einsehen möchte. (Klicken Sie hier für meine Ideen zur Evolution des Gerinnungssystems von Wirbeltieren). Doch welche Elemente meiner Beschreibung, abgesehen von der Skizzenhaftigkeit, bemängelt er?

Behe behauptet, dass das Targeting einer Protease, eines Verdauungsenzyms, in den Blutkreislauf eine "potenziell tödliche Situation" ist und sagt den Lesern seines Webdokuments, dass wir anhand von Situationen, in denen regulatorische Proteine ​​fehlen, erkennen können, wie tödlich dies sein könnte moderne Organismen." Mit anderen Worten, Behe ​​möchte, dass wir uns ansehen, was passiert, wenn den hochregulierten aktuellen Versionen von Gerinnungsproteasen ihre regulatorischen Faktoren fehlen. Trotz dieses Getöses hat Behe ​​jedoch keine Beweise dafür, dass die Fehlsteuerung einer inaktiven Protease in den Blutkreislauf Schaden anrichten würde. Tatsächlich entstand die jüngste Entdeckung, dass Frostschutzprotein-Gene in Fischen aus genau einem solchen Fehlziel von Proteasen in den Blutkreislauf stammen (Chen, L., DeVries, AL &. Cheng, C.-HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3811­3816 ( 1997) und Chen, L., DeVries, AL & Cheng, C.-HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3817­3822 (1997)) legen nahe, dass genau das Gegenteil der Fall ist.

Nachdem er unbegründete Behauptungen über die "Gefahr" einer solchen Mutation aufgestellt hat, sagt Behe, dass es schwierig wäre, zu sehen, welchen "Vorteil" dies für den Organismus bieten würde. Die Antwort ist natürlich, dass es die Blutgerinnungsfähigkeit des Organismus leicht verbessern würde - und das ist der Punkt. Das Gerinnungssystem muss nicht sofort auf Hochtouren laufen. Bei einem primitiven Wirbeltier mit einem Kreislaufsystem mit niedrigem Druck wäre eine sehr geringe Verbesserung der Gerinnung vorteilhaft und würde durch die natürliche Selektion begünstigt.

Behe fragt sich dann, wie die zirkulierende Protease an der Stelle eines Gerinnsels lokalisiert werden könnte, als ob dies eine unüberwindbare Schwierigkeit wäre. Es ist nicht. Wie ich in meinem ursprünglichen Entwurf zur Evolution der Gerinnung vorgeschlagen habe, hätte ein gut verstandener Prozess namens Exon-Shuffling eine "EGF-Domäne" auf die Proteasesequenz legen können, und das "Problem", über das Behe ​​rätselt, ist blitzschnell gelöst.

Schließlich betont Behe, dass das eigentliche Problem nicht darin besteht, ein Gerinnsel zu erzeugen - es besteht darin, dieses Gerinnsel mit Hilfe eines Inhibitors der Protease zu "regulieren", damit es nicht destruktiv wird. Aber auch das ist kein Problem für die Evolution. Behe stellt sich wie üblich eine Gerinnungsprotease vor, die genauso leistungsfähig ist wie die voll entwickelten Proteasen in modernen Wirbeltieren. Denken Sie jedoch daran, dass dies derselbe Typ ist, der sich vor ein oder zwei Momenten Sorgen machte, dass die Protease nicht stark genug wäre, um effektiv zu gerinnen. Er will beides haben. Die Antwort auf seinen Einwand ist genau das, was ich im Entwurf geschrieben habe:

". Ein primitives Gerinnungssystem, das für ein Tier mit niedrigem Blutdruck und minimalem Blutfluss geeignet ist, hat nicht die Gerinnungskapazität, um diese Art von Bedrohung darzustellen. Aber sobald ein gelegentliches Gerinnsel groß genug wird, um ein Gesundheitsrisiko darzustellen, würde die natürliche Selektion die Entwicklung von Systemen begünstigen, die die Gerinnselbildung in Schach halten. Und woher sollen diese Systeme kommen? Aus bereits vorhandenen Proteinen natürlich dupliziert und modifiziert. Die Gewebe des Körpers produzieren ein Protein namens Alpha-1-Antitrypsin, das an das aktive Zentrum von Serinproteasen im Gewebe bindet und diese in Schach hält. Sobald die Gerinnungssysteme stark genug geworden waren, hätte die Genduplikation eine natürliche Selektion mit einem funktionierenden Protease-Inhibitor präsentiert, der sich dann zu Antithrombin entwickeln könnte, einem ähnlichen Inhibitor, der heute die Wirkung der primären Fibrinogen-spaltenden Protease Thrombin blockiert."

Kurz gesagt, keiner der von Behe ​​angesprochenen Punkte ist ausreichend, um zu erklären, warum sich das Gerinnungssystem der Wirbeltiere nicht entwickelt haben könnte. Darüber hinaus macht, wie Doolittles Arbeit deutlich gezeigt hat, die Evolutionshypothese überprüfbare Vorhersagen in Bezug auf die DNA-Sequenzen von Gerinnungsproteinen, und diese Vorhersagen haben sich immer wieder als richtig herausgestellt.

Warum stößt Behes "Biochemical Challenge to Evolution" in der wissenschaftlichen Gemeinschaft auf so wenig Unterstützung? Ich würde vorschlagen, dass der Grund einfach ist. Seine Hypothese ist falsch. Die komplexen biochemischen Systeme lebender Organismen, einschließlich der Gerinnungskaskade von Wirbeltieren, sind im Hinblick auf die darwinistische Evolution vollständig verständlich.

Kenneth R. Miller
Professor für Biologie
Universität Brown
Vorsehung, RI 02912


PARs und Proteasen – Zusammenarbeit bei der Krebsprogression

Gewebefaktor

TF ist ein Membranglykoprotein, das auf subendothelialen Zellen vorhanden ist und die Blutgerinnung initiiert. Die Zerstörung des Endothels setzt TF Gerinnungsfaktoren aus, die im Blutkreislauf vorhanden sind. TF bindet an FVII und bewirkt dessen Aktivierung (FVIIa). Der TF/FVIIa-Komplex kann weiterhin FX (FXa) aktivieren, der zusammen mit seinem Cofaktor FVa aus Prothrombin durch proteolytische Umwandlung Thrombin (FIIa) erzeugt. Thrombin initiiert die Gerinnung durch Thrombozytenaktivierung und Fibrinumwandlung aus Fibrinogen, was zu einer effektiven Blutgerinnung führt [83].

TF ist auch das prominenteste Prokoagulans von Krebszellen und eine Determinante für die Tumorprogression [97]. TF wurde auf der Oberfläche verschiedener bösartiger Zellen, Tumorgefäße und Tumormikroumgebung entdeckt: Stammzellen, Makrophagen, ECs und Myofibroblasten [9, 10, 40, Übersicht in 98, 99]. Es ist auch allgemein anerkannt, dass die TF-Expression mit einer größeren Invasivität und einem höheren klinischen Stadium der malignen Erkrankung korreliert und mit einer schlechten Gesamtprognose verbunden ist [Übersicht in 40, 97]. Tumorzellen exprimieren TF endogen konstitutiv oder induzieren die Produktion von TF in ihrer Umgebung, indem sie lösliche Substanzen produzieren, die Monozyten und ECs zur Expression anregen können [98]. Die TF-Expression wird mit karzinogenen Ereignissen während der onkogenen Transformation in Verbindung gebracht, da es immer mehr Hinweise darauf gibt, dass Mutationen von Proto-Onkogenen und Tumorsuppressorgenen ihre Expression beeinflussen [40]. Bei Darmkrebs ist die K-ras und p53 Mutationen, die die MAPK- und PI3-vermittelten Signalwege auslösen, führen zu einer verstärkten Expression von TF [100]. Bei Lungenkrebs wurden ähnliche Beobachtungen für PTEN und gemacht p53 Mutationen [101]. Es wurde auch gezeigt, dass die TF-Expression bei anderen Krebsarten durch konstitutiv aktive mutierte Formen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFRvIII) in Gliom- und Vulvazellen sowie Kinasen der Src-Familie, TGF-β-Produktion und Hypoxie moduliert wird [40].

Es gibt zahlreiche Mechanismen, durch die TF die Krebsbiologie beeinflusst. Erstens fördert TF nach Aktivierung durch die Faktoren VII und X und Bildung von Komplexen mit ihnen (TF/VIIa, TF/Xa, TF/VIIa/Xa) die PAR-1- und PAR-2-vermittelte Signalübertragung, die für die proliferative Reaktion von Krebs verantwortlich ist Zellen [38, 97, 102]. Darüber hinaus kann TF über seinen zytoplasmatischen Schwanz durch Rac1 und p38 und das zytoskelettale Remodeling direkt signalisieren [103]. Darüber hinaus beeinflusst eine alternativ gespleißte Isoform von TF (asTF) auch das Tumorwachstum unabhängig von der Spaltung von VIIa und PARs durch die Aktivierung von Integrinen α6β1 und αVβ3 auf ECs zur Förderung der Angiogenese [97, 104]. Humanes asTF förderte das Tumorwachstum und die Angiogenese bei Bauchspeicheldrüsenkrebs [105], war jedoch beim koagulansabhängigen Mechanismus der Metastasierung in einem Brustkrebsmodell inaktiv [106].

In experimentellen und klinischen Modellen hatten Krebszellen, die TF exprimierten, eine größere Tendenz zur Metastasierung im Vergleich zu TF-defizienten Zellen [106]. TF-Effekte auf die Metastasierung können über Mechanismen vermittelt werden, die entweder abhängig oder unabhängig von der Gerinnungsaktivierung sind, d. h. durch die TF-Signalfunktion. Der Gewebefaktor fördert wahrscheinlich eher das proliferative und infiltrative Potenzial als die adhäsiven Eigenschaften metastatischer Zellen [30, 68, 107]. Es gibt auch Hinweise darauf, dass TF eine Rolle bei der Intravasation von Tumorzellen spielt, die der erste Schritt bei der Verbreitung von malignen Zellen ist [108].

Obwohl TF sowohl die PAR-1- als auch die PAR-2-Aktivierung fördern kann, scheint es, dass TF oder der TF/FVIIa-Komplex typischerweise die PAR-2-, aber nicht die PAR-1-Signalgebung in Krebszellen auslöst [38, 67–69, 99, 102, 109, 110]. In experimentellen Brustkrebsmodellen wurde eine Hemmung des Tumorwachstums und der Angiogenese nach Blockierung der Signalfunktion von TF, jedoch nicht seiner Gerinnungsaktivität, und nach Hemmung der PAR-2-, aber nicht der PAR-1-Aktivität beobachtet [109, 110]. Ein ähnlicher Phänotyp wurde beim Glioblastom (GBM) beobachtet, dem aggressivsten primären Hirntumor, der durch intensive Neovaskularisation, EC-Hyperplasie und Hyperkoagulation gekennzeichnet ist [73]. Experimente mit GBM-Zelllinien ergaben, dass sowohl in diesen Zellen als auch in Gefäßwänden im invasiven Bereich von Hirntumoren PAR-1 und PAR-2 ​​exprimiert wurden [31, 72, 73]. Jedoch führte nur die Stimulation des PAR-2-Wegs zu einer erhöhten Sekretion von VEGF und IL-8, was darauf hindeutet, dass PAR-2/MAPK/ERK1/2, aber nicht PAR-1/PI3K/Akt, die Angiogenese bei GBM reguliert. Bemerkenswert ist, dass in GBM-Zellen eine Korrelation zwischen der TF- und der PAR-2-Expression besteht [72]. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Hypoxie die PAR-2-Expression in Hirntumoren hochreguliert. Es gibt eine etwa 2,5-fache Zunahme der PAR-2-Expression in hypoxischen vs. normoxischen mikrovaskulären ECs von GBM, was zu einer HB-EGF-Hochregulierung und einem proangiogenen Phänotyp führt [111]. Poole et al. haben kürzlich gezeigt, dass PAR-2, das ein zentraler Faktor bei neurogenen Entzündungen und Schmerzen ist, die Entzündung durch einen neuartigen TRP-Kanal-Kopplungsmechanismus aufrechterhält. Durch die Erzeugung bioaktiver Lipide wie 5′,6′-EET und 12(S)-HETE wird die proinflammatorische Wirkung von PAR-2 ​​durch TRPV4-abhängige Ca 2+ -Signale aufrechterhalten [112]. Dies kann sich in diesem Zusammenhang als äußerst relevant erweisen, da gezeigt wurde, dass TRPV4 die Angiogenese auf mehreren Ebenen beeinflusst [113, 114]. Schließlich stimuliert die EGFR-induzierte Signalübertragung in Gliomzellen die Expression von TF, FVII und PAR-2, wodurch die TF/VIIa-vermittelte PAR-2-Aktivierung in Krebszellen erhöht wird [115], und Krebszellen können aFVII sezernieren, das allein auf aktivieren Sie PAR-2 ​​[116].

Die TF/VIIa-vermittelte PAR-2-Aktivierung führt zu einem vorübergehenden Anstieg des Ca 2+ -Spiegels und löst eine intrazelluläre Signalübertragung aus, die von der MAPK-Familie (p44/42, p38, JNK), PI3, Src-ähnliche Kinasen, Jak/STAT . abhängig ist , Rho GTPasen, Rac1- und Cdc42-Wege [40, 80, 102]. Darüber hinaus wurden erhöhte Spiegel von proangiogenen Proteinen wie VEGF, Cyr61, VEGF-C, CTGF, CXCL1, IL8 und Immunmodulatoren wie GM-CSF (oder CSF2) und M-CSF (oder CSF1) beobachtet [38, 68, 73, 97]. Die Wirksamkeit der TF/VIIa/PAR-2-vermittelten Aktivierung von angiogenen Mediatoren ist größer als die durch die PAR-1-Signalgebung induzierte [38]. Die TF-getriggerte PAR-2-Signalgebung führt auch zu einer erhöhten MMP-9-Expression, die positiv mit der Invasivität von MCF-7-Brusttumorzellen korreliert [70] und mit der MMP-9-Antwort auf den Arachidonsäure-Stoffwechsel in Verbindung gebracht werden kann [117]. Es wurde berichtet, dass TF/FVIIa/PAR-2-Wechselwirkungen für die Migration und Invasion von MDA-MB-231-Brustkrebszellen in Richtung NIH-3T3-Fibroblasten-konditioniertes Medium entscheidend sind [68]. Daher erleichtert die TF/VIIa-induzierte PAR-2-Aktivierung die Proliferation und das Überleben sowie das metastatische Potenzial von Krebszellen [50, 68, 70].

In Brustkrebszellen kann die PAR-2-Aktivierung auch durch FXa sowie durch TF/FXa- oder TF/FVIIa/FXa-Komplexe induziert werden. Die anschließende MAPK-Phosphorylierung oder Erk1/2-Aktivierung stimuliert dann die Migration und Invasion von Krebszellen [67, 68].

Bei Tumoren mit hohen TF-Spiegeln (prothrombotischer Zustand) resultiert der vorherrschende Metastasierungsmechanismus aus der Gerinnungsaktivität von TF anstelle seiner inhärenten Signalfähigkeit [109]. Die prokoagulatorische Aktivität von TF führt zu Thrombinbildung, Thrombozytenaktivierung und thrombozytenabhängigem Schutz vor natürlichen Killerzellen sowie zur Fibrinbildung und Monozyten-/Makrophagenrekrutierung, die alle die angiogenetischen und metastatischen Eigenschaften des Tumors beeinflussen [6, 97, 106 , 118]. Studien zu Yokota et al. [106] lieferten neue Einblicke in die Thrombin-vermittelte TF-abhängige Metastasierung basierend auf einem hyperthrombotischen Mausmodell mit Thrombomodulin-Mangel (TM Pro-Mäuse). TF-abhängige, aber kontaktweg-unabhängige Brustkrebsmetastasen waren mit einer Hyperaktivität der Thrombozyten und der Bildung von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten verbunden. Die genetische Deletion des Thrombozyten-Glykoproteins Ibα (GPIbα) und des Leukozyten-CD11b schloss diese Rezeptoren von thrombozytenabhängigen Metastasen aus. Darüber hinaus verringerte die Blockade von sowohl Wirts- als auch Tumor-PAR-1 signifikant das Metastasierungspotential von Tumorzellen. Ähnliche Ergebnisse wurden in Melanommodellen erhalten, wodurch der Beitrag von PAR-1 zu Melanomen und Brustmetastasen bestätigt wurde [97].

Thrombin

Die Bildung von Thrombin (IIa) ist der zentrale Schritt der Blutgerinnung. Wie oben erwähnt, spaltet Thrombin Fibrinogen, um Fibrin zu ergeben, und aktiviert Blutplättchen, was zur Bildung eines wirksamen Blutpfropfens nach einer Gefäßverletzung führt. Allerdings wird enzymatisch aktives Thrombin auch in verschiedenen Arten von chirurgisch entfernten malignen Tumoren (z. B. kleinzelligem Lungenkrebs, Nieren-, Eierstock-, Kehlkopf-, Bauchspeicheldrüsen- und Magenkrebs sowie Melanomen) nachgewiesen [11, 98, 119, 120] .

Das Vorhandensein von TF auf Tumorzellen trägt unabhängig von der Blutgerinnung zur Thrombinbildung in der Tumormikroumgebung bei.Mehrere Thrombin-Targets (z. B. Blutplättchen- und EC-Aktivierung, Fibrinbildung) tragen zur Krebsprogression bei, indem sie eine Matrix für neue Gefäße und metastatische Tumorzellkolonien bereitstellen [118, 121, 122]. Die ersten Berichte über eine neuartige Rolle von Thrombin bei Tumorzellmetastasen wurden Anfang der 1990er Jahre veröffentlicht [123–128]. Bei Inkubation mit W256-Karzinomzellen bewirkte α-Thrombin eine um 50–300 % gesteigerte Adhäsion an Ratten-Aorten-Endothelzellen und Fibronektin [123–127]. Thrombin-Vorläufer und -Analoga einschließlich Prothrombin, Prothrombin-1, Mesyl-Thrombin, Exo-Site-Thrombin, DFP-Thrombin und Nitro-Thrombin imitierten die Wirkung von α-Thrombin [123–127]. Interessanterweise war α-Thrombin in Verbindung mit seinen Inhibitoren, nämlich Hirudin oder dem Antithrombin III-Heparin-Komplex, bei der Verbesserung der Tumorzelladhäsion nicht so effektiv wie die native Form des Enzyms [123–127]. Die Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der Thrombininteraktion bei der Tumorzellmetastase hin, der nicht proteolytisch ist. Darüber hinaus zeigten Mäuse, denen menschliche Eierstockkrebszellen (SKOV3) transplantiert wurden, eine erhöhte Tumorgröße und eine verringerte Überlebensrate, wenn sie mit Thrombin behandelt wurden [122]. Ob die Thrombin-Signalisierung synergistisch mit den Arachidonat-Metabolisierungswegen funktioniert, die das Wachstum von Eierstockkrebs stimulieren, muss noch geklärt werden [129]. Neben seiner zentralen Rolle im Gerinnungsweg gilt Thrombin als Hauptaktivator von PAR-1 und PAR-4. Daher sind viele zelluläre Reaktionen, einschließlich derjenigen, die in Krebszellen beobachtet werden, wie die Umlagerung des Zytoskeletts [130], thrombinabhängig. Der Beweis für eine entscheidende Rolle der TF-abhängigen Thrombinbildung und der Thrombin-vermittelten Thrombozyten-PAR-4-Aktivierung bei der Krebsprogression und Metastasierung stammt aus Studien, die an genetisch veränderten Mäusen durchgeführt wurden. Stroma- und Tumorzellen sind an mehreren Schritten der Tumorentstehung beteiligt, einschließlich Proliferation, Angiogenese, Invasion und Überleben. Diejenigen Tiere, die an Thrombozyten, PAR-4 oder Fibrinogen verarmt waren, waren vor Metastasen geschützt [118, 121, 122]. Die Behandlung von Melanom-B16a-Zellen mit α-Thrombin führte zu einer signifikant erhöhten Anzahl von metastasierten Lungenkolonien [123–127]. Prothrombin, ɣ-Thrombin und Maus-Thrombin, aber nicht Nitro-Thrombin, konnten den α-Thrombin-Effekt nachahmen, der das Lungenkolonisierungspotential von Tumorzellen erhöht [123–127]. Die intravenöse Verabreichung von Thrombin an Dickdarmkrebszellen (CT26) und Melanomzellen (B16a) erhöhte die Lungenmetastasen der Maus um das 4- bis 413-fache [131]. Das Metastasierungspotential wurde durch Hirudin, einen spezifischen Thrombininhibitor, vermindert [4, 122, 132].

Thrombin/PAR-1 in Fibroblasten

Während des Gerinnungsprozesses führt die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin und seine anschließende Aktivität zur Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin. Fibrinablagerungen in der Tumormikroumgebung sind der Vorrat an Thrombin, der beim Abbau von Fibrin durch Plasmin freigesetzt wird [133]. Die in vitro Experimente lieferten den Beweis, dass Stromazellen von malignen Tumoren, wie Fibroblasten, im Vergleich zu gutartigen Läsionen oder normalen Geweben, in denen eine solche Expression nicht beobachtet wird, erhöhte PAR-1 und PAR-2 ​​exprimieren [74]. Chronische PAR-1-vermittelte Signalübertragung in NIH-3T3-Fibroblasten kann eine Wachstumstransformation verursachen [85]. Berichten zufolge fördert die PAR-1-Expression in der Mikroumgebung das Fortschreiten und induziert die Chemoresistenz von Bauchspeicheldrüsenkrebs [134], indem sie die Monozytenmigration und die fibroblastenabhängige Chemokinproduktion reguliert.

Thrombin/PAR-1 in Endothelzellen

Endothelzellen sind ein weiteres Ziel von Thrombin/PARs-Wechselwirkungen. Die Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivierung reguliert Entzündungswege, die auch an der Krebsprogression beteiligt sind. Erhöhte Lipidproduktion und Expression von PAF, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α und adhäsiven Molekülen (E-Selectin, P-Selectin, intrazelluläres Adhäsionsmolekül-1 und vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1, Integrine) fördert die EC-Proliferation, die Thrombozytenrekrutierung und die Anheftung von malignen Zellen [4, 5, 128, 135–138]. Die Hemmung der PAR-1-Aktivität hemmt das EC-Wachstum durch Erhöhung der Sub-G0/G1-Fraktion, wodurch der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase verringert wird [139]. Darüber hinaus reguliert die Thrombin/PAR-1-Aktivierung die Barrierefunktion zwischen den ECs, indem sie die Adhärens Junctions (AJ) moduliert [140]. Die Erhöhung der Permeabilität der Endothelbarriere als Reaktion auf Thrombin/PAR-assoziierte Wirkungen resultiert aus der Modifikation von VE-Cadherin, p120 und β-Catenin über Proteinkinase-C-abhängige Signalübertragung [138, 140]. Die Dysfunktion der Endothelbarriere erzeugt eine temporäre proangiogene Matrix, die die Grundlage für die Aktivierung der Thrombin/PAR/IP3/Ca 2+ /MAPK-Kaskade und nachfolgende zelluläre Reaktionen ist [98]. Die Hochregulierung von angiogenetischen Faktoren wie VEGF, VEGFR2 und Angiopoietin-2 über den Thrombin/PAR-abhängigen Weg führt zusammen mit einer erhöhten Barrierepermeabilität von ECs zur Induktion von Angiogenese und Krebsausbreitung [4, 141].

Das Integrin αvβ3 kommt hauptsächlich auf Blutgefäßzellen vor und spielt eine wesentliche Rolle bei der Angiogenese. Lokalisierung von αvβ3 wird als Reaktion auf proinflammatorische Eicosanoid-Metaboliten wie 12(S)-HETE verändert, was zu einer EC-Retraktion und einer Störung der Barrierefunktion führt [142–144]. Die Expression von Integrin αvβ3 wird durch Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivität reguliert. Die Thrombinaktivierung von PARs führt auch zu einer erhöhten Expression von Gelatinasen, die Kollagen IV abbauen und die Gefäßpermeabilität erhöhen, um die Migration und Invasion von Endothel- und Krebszellen zu fördern [120].

In ECs kann Thrombin PAR-1 direkt spalten, von dem angenommen wird, dass es zu einem proinflammatorischen Phänotyp führt, oder es kann dies indirekt tun, nachdem es eine intermediäre Protease namens Protein C (aktiviertes Protein C (APC)) aktiviert, die dann auf PAR einwirkt. 1. Wenn jedoch die GLA-Domäne von APC im Komplex mit ihrem verwandten Rezeptor EPCR und Thrombomodulin (TM) ist, wird die Signalspezifität von PAR-1 zu einem entzündungshemmenden oder schützenden Phänotyp verändert. Somit hängt in ECs die Modulation der Koagulationsprotease-Signalisierungsspezifität durch PAR-1 davon ab, ob Thrombin direkt auf PAR-1 oder indirekt über APC wirkt und ob APC an EPCR gebunden ist [145]. In ECs kann PAR-1 sowohl durch Thrombin als auch durch aktiviertes Protein C (APC) beeinflusst werden, um entgegengesetzte Ergebnisse zu bewirken, aber dies hängt vermutlich davon ab, ob die letztere Protease mit EPCR komplexiert ist.

Der APC/EPCR/PAR-1-Weg induziert Motilität, Proliferation von ECs und Angiogenese über gefäßschützende Signalgebung und Röhrenbildung, um die Verbreitung von Krebszellen zu fördern [146, 147]. Darüber hinaus beeinflusst der EC-assoziierte Modulator der Hämostase, TM, auch das mit der Thrombin-Prokoagulationsfunktion verbundene Metastasierungspotenzial stark [148].

Jüngste Berichte haben die PAR-2- und TRPV4-Aktivierung in Verbindung gebracht, wobei bekannt ist, dass TRPV4 die EC-Proliferation und die Arachidonsäure-vermittelte Tumor-EC-Migration verstärkt [112, 113].

Thrombin/PARs in Thrombozyten

Menschliche Blutplättchen exprimieren zwei Arten von Thrombin-getriggerten PARs, nämlich das hochaffine PAR-1 und das niedrigaffine PAR-4. Beide Rezeptoren aktivieren pleiotrope zelluläre Effekte über die Kopplung an das Protein GαQ und Gα13, was zur Aktivierung von Phospholipase Cβ, Hydrolyse von Phosphoinositiden und einer erhöhten zytoplasmatischen Calciumkonzentration führt, was zur Aktivierung von Integrin α . führtIIbβ3und Thrombozytenaggregation [5, 6, 91, 149]. Erste Berichte, die das duale PARs-System in menschlichen Blutplättchen beschreiben, erklärten dieses Phänomen durch die Tatsache, dass PAR-1 und PAR-4 mit unterschiedlichen Konzentrationen des Aktivators interagieren und somit effizienter auf die Thrombin-Signalgebung abstimmen können [30]. Weitere Studien zeigten, dass PAR-4 anders funktioniert als PAR-1, da die Thrombin-induzierte Spaltung von PAR-4 zu einer viel längeren Aktivierung von Gα . führtQ. Dies führt zu einer anhaltenden Ca 2+ -Antwort, die die sekundäre Signalübertragung im Vergleich zu PAR-1 verlängert, das für die späte Phase der Thrombozytenaggregation entscheidend ist [150]. Bei niedrigen Thrombinkonzentrationen kann PAR-1 als Cofaktor von PAR-4 wirken. Es gibt auch eine Thrombin-vermittelte mitogene PAR-Aktivität, die aus Blutplättchen sowie für ECs und Myozyten von Gefäßen stammt [97, 120]. Mit Thrombin beschichtete Blutplättchen überleben länger, was den Krebszellen die Möglichkeit gibt, sich anzuheften und weiter einzudringen [4, 120, 151]. Darüber hinaus sind mit Blutplättchen beschichtete Tumorzellen vor der durch natürliche Killerzellen vermittelten Elimination geschützt [152].

Die Aggregation von Thrombozyten und die daraus resultierende Fibrinbildung wird von einer erhöhten Expression von adhäsiven Proteinen (Glykoprotein GPIIb/IIIa, von Willebrand-Faktor, P-Selectin, Fibronectin) in Thrombin-stimulierten Thrombozyten begleitet [4]. Diese adhäsiven Proteine ​​ermöglichen es malignen Zellen, Komplexe mit Fibrinthrombus und Blutplättchen in Gefäßräumen bei Melanomen und Epithelkarzinomen zu bilden [Übersicht in 4]. Diese Komplexe verbessern das Überleben von Krebszellen und das metastatische Potenzial. Die Thrombinbehandlung von Thrombozyten förderte die Adhäsion von Melanomzellen an Thrombozyten, was die Lungenmetastasierung erhöhte [129].

Zusätzlich zur Thrombozytenaggregation induziert die Thrombin-vermittelte PAR-1- und PAR-4-Spaltung die selektive Freisetzung von proangiogenen und mitogenen Thrombozytenregulatoren (PDGF, VEGF und Angiopoietin-1), die die Migration endothelialer Vorläuferzellen und die Bildung neuer Kapillarnetze erleichtern ist ein entscheidender Schritt zu Metastasen [153]. Im Vergleich zu gesunden Probanden produzieren Thrombozyten von Brustkrebspatientinnen als Reaktion auf die Thrombinstimulation viel höhere VEGF-Spiegel [151]. Thrombin induzierte diesen Effekt durch die PAR-1-Aktivierung, während die PAR-4-Stimulation zur Sekretion von Endostatin, einem antiangiogenen Faktor, führte [151].

Thrombin/PAR-1 in Krebszellen

Thrombin kann durch direkte Interaktion mit PAR-1, das auf Tumorzellen vorhanden ist, eine Signalantwort auslösen [4, 14, 41, 48]. In vitro Studien mit verschiedenen Krebszelllinien zeigten eine Korrelation zwischen der Überexpression von PAR-1 in Krebszellen und einer größeren Invasivität und Entwicklung von Fernmetastasen [14, 17, 18, 41–44, 52, 94, 154]. Darüber hinaus war die PAR-1-Expression bei Patienten mit Lungen-, Magen- oder Brustkrebs ein unabhängiger, ungünstiger Prognosefaktor im Hinblick auf das Gesamtüberleben, während sie sich bei Patienten mit Prostatakrebs als prognostischer Faktor für ein Lokalrezidiv herausstellte [17, 18, überprüft im Jahr 155]. Eine verminderte Expression von PAR-1 war mit einer verringerten Invasivität von Krebszellen verbunden [68].

Die PAR-1-Expression wurde bei Melanom-, Brust-, Lungen-, Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber-, Eierstock-, Endometrium- und Kopf-Hals-Karzinomen bestätigt (Tabelle 1) [17, 38, 43–45, 78, 79, besprochen in 155–157]. Obwohl PAR-1 in normalen hämatopoetischen Stammzellen exprimiert wird, ist seine Expression interessanterweise bei akuter myeloischer Leukämie deutlich vermindert [158]. Die durch PAR-1 induzierte zelluläre Wirkung hängt von der Konzentration des Agonisten ab, so dass eine niedrige Thrombinkonzentration (weniger als 3 nM) die Proliferation von Krebszellen und das Tumorwachstum stimuliert, während hohe Thrombinspiegel zur Apoptose führen [159]. Die meisten zellulären Effekte werden über eine lang anhaltende Aktivierung des zweiten Botenstoffes ERK1/2 ausgelöst. Allerdings können mehrere intrazelluläre Signalwege an der Thrombin/PAR-1-Aktivierung beteiligt sein (unten beschrieben) [118, 160].

Apoptose, Proliferation, Migration und Invasion

In Mäusemodellen von gutartigen Tumoren führt die PAR-1-Aktivierung zu Tumorwachstum und -invasion, indem proapoptotische Gene zum Schweigen gebracht werden [154]. Bei epithelialen Karzinomen und Melanomzellen löst die Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivierung jedoch Prosurvival-Signalwege aus [5, 50, 75, 77, 154, 161]. Die Überexpression und Aktivierung von PAR-1 in nicht metastasierten Melanomzelllinien stimuliert den Akt/PKB-Signalweg, was zu einer Abnahme der Bim- und Bax-Expression sowie der gespaltenen Caspase-3- und Caspase-9-Spiegel führt. Die Hemmung der PAR-1-Aktivität verringerte das Tumorwachstum während in vivo Experimente, die Apoptose-bezogene Effekte bestätigen, die von diesem Rezeptor ausgelöst werden [5].

Bei zahlreichen Krebsarten erhöht die Reaktion auf die Thrombin-induzierte PAR-1-Aktivierung die Zellproliferation sowie die Motilität und Migration in Matrigel-Barriereassays [45, 46, 50, 77]. In Hep3B-Leberkarzinomzellen aktivieren PAR-1 und PAR-4 über die Aktivierung der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen Met, PDGFR und ROS-Kinase sowie die Inaktivierung der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTP1B gemeinsame promigratorische Signalwege [162]. Beim Nasopharynxkarzinom führt die Thrombin-induzierte PAR-1-Aktivierung zu einer erhöhten Expression von MMP-2 und MMP-9, die eng mit Tumormetastasen assoziiert sind, da sie die extrazelluläre Matrix abbauen und die Basalmembran zerstören können [43, 60].

Erhöhte Expression von Integrinen

Integrine sind Transmembranproteine, die die für eine erfolgreiche Angiogenese entscheidenden Wechselwirkungen zwischen ECs und extrazellulärer Matrix vermitteln [41, 42, 120]. Es gibt substanzielle Hinweise darauf, dass eine verstärkte Expression von Adhäsionsproteinen aufgrund der Thrombin-vermittelten PAR-Aktivität zu einem erhöhten metastatischen Potenzial von Krebszellen führt [4, 41–43]. PAR-1 erhöht die invasiven Eigenschaften von Tumorzellen hauptsächlich durch die Förderung der Adhäsion an extrazelluläre Matrixkomponenten. Mehrere Krebszelllinien (z. B. Lunge und Melanom) zeigen nach Thrombin/PAR-1-Stimulation eine erhöhte Adhäsion an Thrombozyten sowie an Aorten- und Kapillar-ECs [4, 14, 41, 42, 130]. Die PAR-1-getriebene Adhäsion an extrazelluläre Matrixkomponenten erfolgt über drei Mechanismen: (1) Phosphorylierung von fokaler Adhäsionskinase und Paxillin und Induktion von fokalen Kontaktkomplexen, (2) Mobilisierung von Integrinen auf der Zelloberfläche, ohne ihr Expressionsniveau zu verändern, und (3) spezifische Rekrutierung von Integrin αvβ5 zu fokalen Kontaktstellen [163]. Interaktion von Krebszellen mit Integrin αvβ5 und die Reorganisation des Zytoskeletts erleichtert die Zellmigration, -invasion und die metastatische Entwicklung bei Lungenkrebs und Melanomen [43, 163, 164]. Darüber hinaus ist die Anwendung von Anti-αvβ5 Antikörper schwächen diese PAR-1-induzierte Invasion spezifisch ab [163]. Expression von Integrin αIIbβ3 und P-Selectin als Reaktion auf PAR-1 können zur Anlagerung von Melanomzellen an ECs und Thrombozyten führen und auf diese Weise auch das metastatische Potenzial von Krebszellen erhöhen [14, 41, 42, 120]. Erhöhte Expression von αIIbβ3 Protein wurde bei mehreren malignen Tumoren berichtet [4, 14, 41, 42, 165, 166].

Angiogenese

Die Entwicklung neuer Blutgefäße, Angiogenese (angio-Schiff, Genesis-Kreation) ist der zentrale Prozess für das Tumorwachstum und die Tumorprogression [167, 168]. Kleine Blutgefäße versorgen Krebszellen mit Sauerstoff und Nährstoffen und entfernen Stoffwechselendprodukte. Es wird davon ausgegangen, dass bösartige Tumoren ohne Gefäßversorgung nicht über 2–3 mm 3 wachsen können [168]. Mausembryogenese- und Krebsstudien zeigten, dass die PAR-1-Expression für die Angiogenese notwendig ist, da die Hälfte der tierischen Embryonen, denen PAR-1 entzogen wurde, aufgrund unzureichender Gefäßentwicklung starben, während die Aktivierung des PAR-1-Signalwegs den Krebszelltod verhinderte [169]. In Melanom- und Brustkrebszellen korreliert die PAR-1-Expression mit erhöhten VEGF-Spiegeln und einer Stimulation der Angiogenese und des Tumorwachstums [161]. Es gibt auch eine Korrelation zwischen Thrombin und VEGF-Expression in Gliomzellen, was auf einen möglichen autokrinen Mechanismus der Regulation der Angiogenese in Hirntumoren hindeutet.

Die Thrombin-vermittelte Spaltung von PARs in Krebs-, Blut- und Gefäßwandzellen führt zur Aktivierung der Transkription vieler proangiogener Gene wie VEGF und sein Rezeptor (VEGFR), TF, MMP-2, Angiopoetin-2 (Ang-2), basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), MAP und PI3-Kinasen [120, 142, 170–173]. Beyogen auf in vitro Studien können VEGF aus Blutplättchen und Krebszellen innerhalb von Minuten nach der Aktivierung sezerniert werden [170]. Darüber hinaus induziert die Thrombin-vermittelte PAR-Aktivierung die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) über eine erhöhte Expression von Hypoxie-induziertem Faktor-1 (HIF-1) [116]. HIF-1 aktiviert die VEGF-Gentranskription, und seine Expression reagiert auf Arachidonsäure-Metaboliten [174].

PAR-1- und PAR-4-Signalgebung nach Thrombozytenaktivierung führt zur Synthese und Freisetzung von Thromboxan (TXA2) und 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12(S)-HETE) [6, 142, 143, 175–181]. Dies sind metabolische Endprodukte der Cyclooxygenase (COX-1) und Lipoxygenase (12-LOX) Aktivität auf Arachidonsäure und sind wichtige Mediatoren der Thrombusbildung, des Gefäßtonus und der Angiogenese durch ihre Wirkung auf spezifische Rezeptoren (TPα, GPR31) und Transkriptionsregulation von Faktoren wie VEGF und HIF1α [144, 174–186]. Arachidonsäure wird als Substrat für diese Enzyme von der Zellmembran durch die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2a) freigesetzt, die unterschiedlich auf Signale von PAR-1 und PAR-4 reagiert, je nachdem, ob sie an den COX-1-Weg oder den 12- LOX-Weg [187]. Die Thrombinaktivierung von PAR-1 und PAR-4 führt auch zur Bildung von veresterten Eicosanoiden im gleichen Tempo wie die Freisetzung von freien Säuren. Allerdings wird HETE, das nach dieser Reaktion zu Phosphatidylethanolamin verestert ist, dem Zelläußeren präsentiert, anstatt im inneren Substratpool recycelt zu werden, und hat in diesem Zusammenhang einzigartige Funktionen [188].

Epithelial-mesenchymaler Übergang

Ein weiteres potenziell wichtiges Phänomen bei der Krebsmetastasierung, zumindest teilweise durch Thrombin reguliert, ist die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) [44]. Der Mechanismus mit seinem umgekehrten Prozess, einem mesenchymal-epithelialen Übergang (MET), verbessert die Fähigkeit solider Krebsarten, sich weiter zu verbreiten und entfernte Stellen zu besiedeln [189]. Maligne Tumoren, die aus mäßig differenzierten Zellen bestehen, können auch Regionen mit geringer Differenzierung enthalten. Diese Zellen können sich von der Tumormasse lösen und nach einem EMT-ähnlichen Ereignis in das benachbarte Stroma eindringen. Sie verlieren die Expression von epithelialen Differenzierungsmarkern und gewinnen die Fähigkeit, mesenchymale und „Stamm“-Marker zu exprimieren. Diese Zellen tragen auch zur Migration von zirkulierenden Stammzellen (CSCs) bei, die sich ausbreiten und Metastasen bilden. Während der EMT werden einige Merkmale des differenzierten Epithels (z. B. apikobasale Polarität und Zell-Zell-Adhäsionen) durch mesenchymale Merkmale ersetzt – Polarität von hinten nach vorne, Fähigkeit zur individuellen Zellmigration und Invasion von Basallamina und Blutgefäßen [189] . Um neue Standorte effektiv zu besiedeln, müssen solche Zellen auch in der Lage sein, den umgekehrten MET-Prozess zu durchlaufen, um die Zellorganisation neu zu differenzieren und wiederherzustellen [189].

Experimentelle Studien an Magenkrebszelllinien zeigten, dass die Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivierung zu einer Neuprogrammierung der Genexpression durch Stimulation von Transkriptionsfaktoren wie SNAIL1 führt, die bekanntermaßen EMT im Embryo antreiben [44].Darüber hinaus führt der Thrombin/PAR-1-Komplex bei epithelialen Krebsarten (z. B. Magen- und Brustkrebs) zu einer Veränderung der Basalmembrankomponenten (erhöhte Expression von Fibronektin, Wnt und β-Catenin, verminderte Expression von E-Cadherin) sowie des Zytoskeletts Proteine ​​(Myosin IIA und Filamin B), die kollektiv EMT regulieren, die an der malignen Tumorprogression beteiligt sind [45, 46, 75, 77, 94, 189].

MMPs sind zinkabhängige Proteasen, die sowohl von Tumor- als auch von Wirtszellen sezerniert werden. Es ist allgemein anerkannt, dass MMPs an der Krebsprogression und Metastasierung beteiligt sind, indem sie die Invasion von Tumorzellen durch die Basalmembran und das Stromagewebe erleichtern [39, 157, 190]. Die Koexpression von MMPs und PARs ist mit hoher Invasivität (tiefere Tumorinfiltration, lymphovaskuläre Invasion, häufigeres Auftreten von Lymphknotenmetastasen, fortgeschritteneres klinisches Stadium der Krankheit) und schlechtem Überleben bei mehreren bösartigen Tumoren, z. B. Brust, Magen, Speiseröhre, verbunden , Gallenblasen-, Leberzell-, Lungen- und Eierstockkrebs [18, überprüft in 39, 157, 189].

Darüber hinaus haben Studien mit Brust-, Gallenblasen- und Eierstockkrebszelllinien gezeigt, dass MMPs (MMP-1, MMP-9, MMP-13, MMP-14) die PAR-Signalgebung aktivieren können, insbesondere durch die Spaltung von PAR-1 (die Mehrheit der Tumoren ) oder PAR-2 ​​(Lungenkrebs) [15, 39, 52, 71]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass seneszente Fibroblasten durch MMP-1-vermittelte PAR-1-Aktivierung frühe kanzerogene Ereignisse der Haut verstärken [191]. Von den getesteten MMPs weist MMP-1 die stärkste positive Korrelation mit Zellmigration und Invasivität auf. Die Blockade der MMP-1-vermittelten PAR-1-Aktivität in Xenograft-Modellen des fortgeschrittenen peritonealen Ovarialkarzinoms führt zur Hemmung der Angiogenese und Metastasierung [39].

Die Aktivierung von Thrombozyten-PAR-1 durch MMP-1 kann auch zu Rho-GTP- sowie MAPK-Signalaktivierung führen, wodurch die Thrombozytenaggregation sowie die Thrombozytenmotilität und Zellproliferation gefördert werden [87]. Das ProMMP-1-Zymogen wird auf der Thrombozytenoberfläche nach Kontakt mit Kollagenfibrillen in MMP-1 umgewandelt. Die Blockade des MMP-1/PAR-1-Signalwegs hemmt die Thrombose bei Tieren stark, was zeigt, dass der Kollagen/MMP-1/PAR-1-Weg ein Thrombin-unabhängiger Aktivator von Thrombozyten-Signalgebungsereignissen ist. Da PARs die Expression und Freisetzung von 12(S)-HETE stimulieren, das MMP9 hochreguliert [117], scheint es einen Präzedenzfall für die bidirektionale Regulation der MMPs- und PARs-Signalgebung zu geben.

Trypsin

Trypsin ist eine weitere Serinprotease, die PAR-2 ​​in Krebszellen aktiviert. Bei Patienten mit Magen-, Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen- und Eierstockkrebs ist die Trypsinkonzentration erhöht [54, 155, 192]. Eine erhöhte Expression von PAR-2 ​​und sein Einfluss auf die Krebszellproliferation wurden bei Magen-, Speiseröhren-, Kolorektal-, Pankreas-, Plattenepithelkarzinom-, Leber-, Cholangiokarzinom-, Lungen-, Brust- und Eierstockkrebs sowie bei Melanomen und Hirntumoren definiert (Tabelle 3 ) [53, 54, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 71, 155, 193–195]. PAR-2 ​​kann auch in stromareichen Tumorregionen stark exprimiert werden. Studien von Shi et al. haben eine faszinierende Doppelrolle für stromales PAR-2 ​​bei der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt, nämlich dass PAR-2 ​​das Primärtumorwachstum potenziert, aber die Lymphangiogenese und die nachfolgende Lymphknotenmetastasierung verringert [194]. Die Ergebnisse definierten PAR-2 ​​als negativen Regulator der Lymphangiogenese bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Im Gegensatz dazu korrelierte die Expression von PAR-2 ​​mit der Tiefe der Wandinvasion, der Lebermetastasierung sowie der lymphatischen und venösen Infiltration bei Patienten mit Magenkrebs [193]. Patienten mit PAR-2-positiven Tumoren hatten eine signifikant schlechtere Prognose als Patienten mit Expressions-negativen Tumoren.

In vitro Studien mit Epithelkarzinomen haben gezeigt, dass PAR-2 ​​wie PAR-1 eine mitogene Aktivität ausübt [46, 53, 54, 56–61, 64, 71, 155, 193–195]. Trypsin und das PAR-2-aktivierende Peptid SLIGKV erhöhten signifikant die gelatinolytische Aktivität von MMP-2 sowie die ERK/AP-1-, MEK1/2- und MAPK-Signalgebung, um die Proliferation, Migration und Metastasierung von Krebszellen zu fördern [53, 57, 58, 60–62, 195]. Die erhöhte Aktivität von MMP-2 legt nahe, dass PAR-2 ​​an der Krebsinvasion durch den MMP/EGFR/MAPK/ERK1/2-Weg beteiligt sein könnte [60]. PAR-2 ​​kann auch Ca 2+ -Kanäle aktivieren, um die Freisetzung von Prostaglandin E2 zu fördern, was zu einer EGFR-stimulierten Zellproliferation führt [53]. Mit einem Migrationsassay durch die Matrigel-Barriere wurde festgestellt, dass die Transaktivierung der Met-Rezeptor-Tyrosinkinase durch PAR-2 ​​an der Invasion von Leberzell- und Cholangiokarzinomzellen beteiligt ist [58].

Der Einfluss von Entzündungen bei Krebs ist unbestreitbar. Es gibt interessante Zusammenhänge zwischen dem Nervensystem und der Entzündungsregulation, wobei der Vagusnerv an einer systemischen Rückkopplungsschleife teilnimmt, an der auch PARs beteiligt sind [Übersicht 196]. Neuere Studien haben ergeben, dass die PAR-1-Isoform auf vagalen C-Fasern in Mauslungen ein Aktionspotential als Reaktion auf Thrombin, Trypsin oder das PAR-1-aktivierende Peptid TFLLR-NH(2) hervorrufen könnte [197]. Die schmerz- und entzündungsauslösenden TRPV-Kanäle werden auch von den PARs und ihren nachgeschalteten proinflammatorischen bioaktiven Lipidmediatoren wie 12(S)-HETE [198–204] reguliert. Während wir neurogene Entzündungen meist mit Nozizeption assoziieren, sollte beachtet werden, dass Tumorzellen über einen perineuralen Weg wandern können, was auf die proinflammatorischen PARs-bioaktiven Lipidgradienten entlang der als Metastasen-Beacons dienenden Nerven sprechen könnte [205–207]. In ähnlicher Weise wurden neurogene Mechanismen beschrieben, die die Aktivierung von PARs mit der Extravasation von Plasma in Verbindung bringen und die von bioaktiven Lipidmediatoren abhängen [112, 208]. Biopsien um die Bartholin-Drüse von Frauen mit Vestibulodynie zeigen mehr intraepitheliale Nervenendigungen als gesunde Personen und eine erhöhte Freisetzung von Entzündungsmediatoren, die zu einer Sensibilisierung der C-Nervenfasern und einer erhöhten Proliferation führen [209]. Aufgrund dieser neurogenen Entzündung treten bei diesen Patienten typischerweise widerspenstige Hefeinfektionen auf, die zu epithelialer Hyperplasie und Krebs führen können [210].

Mikrobiom, PARs, Krebs

PARs sind an vielen Wirt-Mikroben-Interaktionen beteiligt, die sich im Laufe der Zeit für die Entschlüsselung der Rolle des Mikrobioms bei der Entstehung und Progression von Krebs sowie bei anderen Krankheiten mit Wurzeln in infektiösen Entzündungsprozessen als relevant erweisen können [211–217]. Mikrobielle Beleidigung durch Streptococcus pneumoniae ist dafür bekannt, vom Wirt stammende Proteasen zu stimulieren, um PARs zu aktivieren [218]. Porphyromonas gingivalis kann PARs auf oralen Epithelzellen aktivieren, um IL-6 hochzuregulieren [219], und es wurde kürzlich gezeigt, dass das Bakterium PAR-2 ​​stimuliert, was zur MMP9-Expression und zur Förderung des oralen Plattenepithelkarzinoms führt [220]. Beide Streptococcus pyogenes und Staphylococcus aureus auf der Haut produzieren Proteasen, die die Aktivierung von PARs auf Keratinozyten fördern, was zu Entzündungen führt [221]. Mikroben selbst produzieren zahlreiche Proteasen, die bei der mikrobiellen Verbreitung helfen, indem sie einige der gleichen logistischen Prozesse überwinden, die metastasierende Krebszellen umgehen müssen, um sich auszubreiten [222–225]. Das Zusammenspiel zwischen Mikrobiom und Wirt, um Veränderungen im Gewebe und in der hämatologischen Mikroumgebung zu beeinflussen, wird aktiv untersucht [226, 227]. Bakterielle Proteasen können PARs spalten, um Entzündungen zu modulieren, und wurden auf ihr Potenzial untersucht, die Barrierefunktion des Wirts zu beeinträchtigen [228]. Dabei ist es denkbar, dass zirkulierende oder metastasierende Zellen aus Tumoren oder Stammnischen von solchen Veränderungen profitieren. Kürzlich gibt es auch Hinweise auf eine mikrobielle Protease-Aktivierung eines neuen TLR in einem der PAR-Aktivierung ähnlichen Mechanismus [229].

Als Denkanstoß hat das Darmmikrobiom viel Aufmerksamkeit in Bezug auf Krankheit und Wohlbefinden erhalten [230–233]. Daher ist es im Klima gentechnisch veränderter Lebensmittel, die entweder gezüchtet oder manipuliert werden, bemerkenswert, dass reiche Erträge bestimmter Körner in der Pflanzenindustrie auf der Serpin-Expression beruhen [233, 234], was Auswirkungen auf die PAR-Regulation im Darm haben kann [235 –239].

Klinische Implikationen

Die oben präsentierten Ergebnisse der theoretischen Studien legen nahe, dass PARs und PARs-assoziierte Signalgebung als mögliches therapeutisches Ziel verwendet werden können, entweder allein oder in Kombination mit anderen Modalitäten, wie Chemotherapie, antiangiogenen Mitteln und proapoptotischen Arzneimitteln. Ein PAR-gerichteter Ansatz ist attraktiv, da er sowohl auf den Tumor als auch auf seine Mikroumgebung abzielt. In vitro und in vivo Studien belegen, dass die Hemmung der PAR-assoziierten Signalübertragung zu reduziertem Tumorwachstum, Invasivität und Metastasierung führt [5, 41, 42, 240]. Es gibt funktionelle (Inhibitoren von Proteasen) und pharmakologische (Inhibitoren des gebundenen Liganden oder der Spaltungsstelle von PAR) PAR-assoziierte Signalantagonisten [19, 20]. Klinischer Nutzen kann durch direkte Blockade von PAR-1 oder PAR-2 ​​auf Tumorzellen, Hemmung von PAR-1 auf Thrombozyten, Fibroblasten und ECs (ATAP2, WEDE15, SCH530348, SCH79797, Vorapaxar) sowie die Verabreichung von Inhibitoren von Thrombin (Hirudin, Argatroban), TF (TFPI, mAb-10H10), MMPs und andere Serinprotease-Inhibitoren (Serpine) [4, 5, 16, 22, 24, 87, 95, 96, 241, 242]. Obwohl eine experimentelle Trypsin-Hemmung möglich ist, scheint es, dass Trypsin als Ziel für die klinische Therapie aufgrund seiner universellen Verbreitung unwahrscheinlich ist [60]. Die Blockade von Proteinen, die als Reaktion auf PAR-ausgelöste Signale exprimiert werden, z. B. Anti-αvβ5 Auch Antikörper, EGFR, Erb, Erk, MEK-Inhibitoren sowie PAR-RNA-interferierende Wirkstoffe (Short-Hairpin-RNA (shRNA)) haben therapeutisches Potenzial [24, 61].

Die Hemmung verwandter Aktivitäten, die nicht direkt mit krebsfördernden Wirkungen von PARs verbunden sind, kann auch Krebspatienten zugute kommen. Es gibt faszinierende Erkenntnisse aus einem Tiermodell, dass die Thrombin-vermittelte PAR-1- und PAR-2-Aktivierung eine Rolle bei der Pathogenese akuter Nebenwirkungen der Strahlentherapie spielt, z. B. Enteritis, bei der PAR-vermittelte Signalübertragung entzündliche, mitogene und proliferative Prozesse aktiviert in Darmzellen nach Strahlentherapie. PAR-1-Hemmer verringerten die Intensität akuter, unmittelbar früher Nebenwirkungen (Enteritis), beeinflussten jedoch nicht die spät einsetzenden Nebenwirkungen [243–245]. Die Pathogenese von Spätnebenwirkungen wird als PAR-unabhängig angenommen. Darüber hinaus verstärken PAR-2-Antagonisten die analgetischen Wirkungen von systemischem Morphin in einem Rattenmodell für Knochenkrebsschmerzen [246].

Obwohl die Ergebnisse experimenteller Modelle vielversprechend sind, kann die Hemmung der PAR-Aktivität sowohl bei normalen als auch bei Tumorzellen Nebenwirkungen wie Blutungen verursachen, so dass die PAR-maßgeschneiderte Wirkstoffforschung eine große Herausforderung darstellt. Klinische Studien sind noch begrenzt und richten sich bisher an Patienten mit anderen Krankheiten als Krebs. PAR-1-Antagonisten wie Vorapaxar und Atopaxar wurden in klinischen Studien bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, Hirninfarkt und Arteriosklerose untersucht [24, 247].

Einblicke in die molekularen Grundlagen von Brustkrebs und Melanomen bieten jedoch neue potenzielle Angriffspunkte für die Entdeckung von Krebsmedikamenten, die auf die PAR-abhängige Signalübertragung zugeschnitten sind.

Brustkrebs

Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass PARs, hauptsächlich PAR-1 und PAR-2, starke Mediatoren der Zellinvasion bei Epithelkarzinomen sind [68, 77]. Brustkrebszellen können sowohl PAR-1 als auch PAR-2 ​​exprimieren [66, 68, 77], und ihre Rolle beim Mammakarzinom ist am umfassendsten untersucht. PAR-1 wird in normalem Brustepithel, Dysplasie oder Adenom nicht exprimiert, ist jedoch bei Karzinomen hochreguliert vor Ort (geringe Expression) und wird in invasiven Mammakarzinomzelllinien stark exprimiert [47, 77, 154]. Experimentelle Studien zu Brustkrebs haben gezeigt, dass PAR-1 durch Thrombin, MMPs und TF aktiviert wird, während PAR-2 ​​durch die Gerinnungsfaktoren VIIa, Xa oder deren Komplexe mit TF aktiviert wird [16, 52, 66, 68, 77]. Es gibt auch Beobachtungen, dass PAR-1 und PAR-2 ​​bei diesem Tumortyp als funktionelle Einheit fungieren [248]. Das Stummschalten von PAR-2 ​​durch shRNA schwächt die Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivierung ab, was zu einer verringerten Koloniebildung und einer verringerten Zellinvasion führt [248].

Die PAR-Aktivität vermittelt die Migration von Brustkrebszellen durch Matrigel (eine rekonstituierte Basalmembran), erleichtert die Zellchemokinese über den Gαi/c-Src/JNK/Paxillin-Signalweg, aktiviert Akt-abhängige Überlebenswege und korreliert mit dem Grad der Invasivität und dem Metastasierungspotenzial zahlreicher Krebszelllinien [66, 77, 154, 163]. PARs regulieren auch EMT-Prozesse in Brustkrebstumoren, was die Zellproliferation erleichtert (vor Ort Karzinom), Eindringen in die Basalmembran, Matrixabbau und lokale Infiltration (invasiver Krebs). Darüber hinaus ermöglichen PAR-Wechselwirkungen mit Integrinen, die Bildung von fokalen Kontaktkomplexen und die Reorganisation des Zytoskeletts eine Fernverbreitung über Intravasation und Extravasation (über Lymph- oder Blutgefäße). Schließlich erleichtert der MET-Prozess und die Interaktionen mit Blut und ECs die Metastasenbildung (disseminierter Krebs) [77]. Die Hemmung der PAR-Aktivierung in stark metastasierten MDA-435-Brustkrebszellen reduzierte die Zellinvasion [77]. Die Gabe eines MMP-1-Inhibitors und P1pal-7 (Inhibitor der durch Akt-Signalgebung vermittelten Zellviabilität) schwächt die Akt-Aktivität ab, fördert signifikant die Apoptose in Brusttumor-Xenotransplantaten und hemmt die Metastasierung in die Lunge um bis zu 88 % [16].

Es gibt Beweise von in vivo Studien zur PAR-vermittelten Brustkrebsprogression [32]. Die PAR-1-Expression war für das Tumorwachstum und die Invasion in Brust-Xenotransplantaten über die Thrombin-vermittelte Interaktion mit EGFR- und ErbB oder über den von Fibroblasten abgeleiteten MMP-1-vermittelten Ca 2+ -Weg essentiell [32, 52]. Eine anhaltende Transaktivierung von EGFR und ErbB2/Her2 über den Thrombin-gespaltenen PAR-1-Weg wurde in invasiven Mammakarzinomen, jedoch nicht in normalen Brustepithelzellen nachgewiesen [32, 94]. Es gibt Hinweise darauf, dass Gαi/o, Metalloproteaseaktivität und Freisetzung von HB-EGF (Heparin-bindendes EGF)-Liganden sind für die Transaktivierung von EGFR kritisch. Schließlich führt die durch PARs ausgelöste EGFR- und ErbB2/Her2-Signalgebung zu einer verlängerten Erk-1/2-Aktivierung, die zur Invasion von Brustkrebszellen führt. Diese Ergebnisse weisen auf einen möglichen therapeutischen Nutzen von Inhibitoren von Thrombin, EGFR, ErbB und Erk-Kinasen bei Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs hin.

Melanom

Bei epithelialen Karzinomen ist die EMT der vorherrschende Mechanismus, der zur Metastasierung führt. Beim Melanom ist der Übergang einer Läsion von der nichtinvasiven radialen Wachstumsphase (RGP) in die invasive und metastasenkompetente vertikale Wachstumsphase (VGP) ein wichtiger Schritt in der Tumorprogression, und die PAR-Expression ist am RGP-VGP-Übergangsprozess beteiligt [249]. Melanomzellen exprimieren sowohl PAR-1 als auch PAR-2 ​​[50, 250]. Die Rolle von PAR-2 ​​bei Melanommetastasen wurde bisher nicht gewürdigt, aber die neuesten Erkenntnisse haben seine doppelte Rolle beim Melanom gezeigt [187, 194]. In einem Mausmodell des spontanen metastasierten B16-Melanoms trug PAR-2 ​​zur Begrenzung der lokalen Krebsprogression in einem Bereich bei, während es die Ausbreitung von Fernmetastasen verstärkte. Zahlreiche Berichte dokumentieren die Rolle des PAR-1-Signalwegs im prometastatischen Phänotyp von Melanomzellen [4, 5, 21]. Experimentelle Studien an Melanomzelllinien zeigten, dass die PAR-1-ausgelöste Signalgebung adhäsive, invasive, antiapoptotische und angiogene Faktoren aktiviert, um Melanommetastasen zu fördern [4, 5, 21, 251]. Ein weiterer Beweis für die Rolle von PAR-1 bei der Melanomdissemination ist die Tatsache, dass es sowohl in metastasierten Melanomzelllinien als auch in metastasierten Läsionen im Vergleich zu primären Nävi und normaler Haut stark exprimiert wird [21, 250]. Darüber hinaus wiesen Melanomzellen, die aus Läsionen isoliert wurden, die bei Patienten zu Metastasen führten, eine höhere PAR-1-mRNA- und Proteinexpression auf als solche, die aus Läsionen erhalten wurden, die keine metastasierende Erkrankung entwickelten [252]. Motilität und Migration von Melanomzellen wird auch durch die Thrombin-vermittelte PAR-1-Aktivierung reguliert [50, 252]. Thrombin, dessen Bildung TF-abhängig ist (in Melanomzellen exprimiertes Prokoagulans), ist der vorherrschende PAR-1-Aktivator [21, 107]. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass MMP-1-vermittelte PARs-Aktivierung in Melanomzellen existiert [5, 249]. Sowohl MMP-1 als auch PAR-1 werden von VGP-Melanomen stark exprimiert. Es wird angenommen, dass MMP-1 die Melanom-Invasion durch Abbau von Typ-I-Kollagen in der Haut erleichtert, während die PAR-1-Aktivierung zu einer erhöhten Aktivierung von Wachstumsfaktoren führt: FGFR-2 und IGF-1 [5, 249].

Experimente mit dem B16F10-Mausmetastasenmodell des Melanoms zeigten, dass mit PAR-1 transfizierte Zellen ein wesentlich höheres Lungenmetastasierungspotenzial aufwiesen als solche ohne PAR-1-Signalübertragung [4, 48]. PAR-1 förderte das metastasierende Melanom, indem es den Tumorsuppressor Maspin und das Gap Junction Protein Connexin 43 regulierte. Villares et al. [253] stellten fest, dass Connexin 43 die Interaktion zwischen malignen Zellen und ECs erleichtert und die Maspin-Expression in metastasierenden Melanomzellen verringert ist, wo eine inverse Korrelation zwischen PAR-1 und Maspin-Expression besteht [254]. PAR-1 fördert auch die Expression des Melanomzelladhäsionsmoleküls MCAM/MUC18 (MUC18), das ein Schlüsselmarker für Melanommetastasen ist. Es ist von Interesse, dass die PAR-1-Aktivität die Expression des Thrombozyten-aktivierenden Faktor-Rezeptors (PAFR) und seines Liganden erhöht und somit nicht nur die Thrombozytenaggregation fördert, sondern auch die MUC18-Spiegel erhöht. Dies ist äußerst relevant für den Metastasierungsprozess, da gezeigt wurde, dass der PAR1/PAFR/MUC18-Weg die Adhäsion von Melanomzellen an mikrovaskuläre ECs, die transendotheliale Migration und die metastatische Retention in der Lunge vermittelt [251].

PAR-1-Silencing und Thrombin-Hemmung beeinflussen die Fähigkeit von metastasierenden Melanomzelllinien, sich zu verbreiten [21, 22, 251]. Die Hemmung der PAR-Aktivität um 80 % durch die Verwendung lentiviraler shRNA verringert das Lungenmetastasierungspotential von PAR-1-überexprimierenden Melanomzelllinien [21]. PAR-1-Silencing hemmt auch die Expression des Adhäsionsproteins MUC18, das den metastatischen Phänotyp von Melanomzellen abschwächt [251].

Um die toxischen Immunantworten einer Virustherapie zu reduzieren, wurde in neutralen Liposomen (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin, DOPC) eingebaute PAR-1 small interfering RNA (siRNA) in Experimenten an Melanommodellen verwendet. Bei Mäusen, die mit PAR-1 siRNA-DOPC behandelt wurden, kam es zu einem signifikanten Rückgang des Tumorwachstums, des Tumorgewichts und der Bildung von metastatischen Lungenkolonien [21]. Die siRNA-Lieferung führte auch zu einem Rückgang der VEGF-, IL-8- und MMP-2-Expressionsspiegel und einer verringerten Blutgefäßdichte. In einer anderen Studie verringerte die Reduktion der PAR-1-Expression durch siRNA und die Hemmung der PAR-1-Funktion durch den spezifischen Antagonisten SCH79797 die Motilität und Invasivität der Melanomzellen signifikant bis zu dem Ausmaß der nicht metastasierten und schwach PAR-1-exprimierenden Zellen [252 ]. Ein spezifischer Thrombinhemmer, Argatroban, verringert auch die Migration und das Knochenmetastasierungspotenzial von B16BL6-Melanomzellen [22].

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die PAR-1-abhängige Stimulation von Tumorwachstum und Metastasierung durch invasive, adhäsive und proangiogene Faktoren reguliert wird und dass PAR-1 ein potenzielles therapeutisches Ziel für Patienten mit metastasiertem Melanom sein könnte.

Zusammenfassung

Die Invasion und Metastasierung von Tumorzellen beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen mesenchymalen Zellen und extrazellulärer Matrix sowie Blutkomponenten und ECs. Die Gerinnungsproteasen, Matrixmetalloproteasen und Serinproteasen interagieren mit PARs und fördern so mehrere Aktivitäten, die zur Krebsprogression führen. Weitere Studien sind notwendig, um theoretisches Wissen in praktischen Wert zu verwandeln.


Wie Serpins funktionieren

Die Serpine hemmen die Wirkung ihrer jeweiligen Serinprotease, indem sie die dreidimensionale Struktur des normalen Substrats der Protease nachahmen.

  • Die Serinprotease bindet das Serpin anstelle seines normalen Substrats. Dies allein würde jede weitere Aktivität der Protease blockieren. Aber der Serpin hat noch einen anderen Trick zu spielen.
  • Die Protease macht einen Schnitt im Serpin, der zu
    • die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den beiden Molekülen
    • eine massive allosterische Veränderung der Tertiärstruktur der Serpine
    • wodurch die angelagerte Protease an eine Stelle bewegt wird, an der sie zerstört werden kann.

    Borrelien burgdorferi, vom Wirt abgeleitete Proteasen und die Blut-Hirn-Schranke

    FEIGE. 1. Humane BMEC exprimieren in vitro P-Glykoprotein und Tight-Junctional-Proteine. (A) Konfluente und subkonfluente humane BMEC-Monolayer wurden mit EDTA angehoben. Die Zellen wurden mit 2% Paraformaldehyd in PBS 30 min fixiert, mit PBS, das 0,01% Triton X-100 enthielt, permeabilisiert und mit 10 mM Glycin-PBS gequencht. Nach dem Blockieren mit 10 % normalem Ziegenserum wurden die Zellen mit Fluoresceinisothiocyanat-markiertem monoklonalem Maus-Anti-P-Glycoprotein-Antikörper und Kaninchen-Anti-Faktor VIII-Rag-polyklonalem Antikörper inkubiert, gefolgt von sekundärem Antikörper, der an Phycoerythrin gekoppelt war. Die Analyse wurde unter Verwendung eines FACScan und der CellQuest-Software (Becton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt. Die Prozentsätze von Gated Human BMEC, die sowohl für Faktor VIII-Rag als auch für P-Glycoprotein positiv sind, sind gezeigt. (B) Menschliche BMEC-Monoschichten wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5% Triton X-100 permeabilisiert und mit monoklonalem Anti-Human-ZO-1-Antikörper gefärbt. Die Anwesenheit von ZO-1 wurde mit Alexa 488-konjugiertem Sekundärantikörper sichtbar gemacht. Differenzialinterferenzkontrast- (linke Tafel) und Fluoreszenz- (rechte Tafel) Bilder von humanem BMEC zeigten, dass ZO-1 an den Zellverbindungen exprimiert wird. Vergrößerung, ×400. FEIGE. 2. In-vitro-Modell für B. burgdodrferi 297 überquert die menschliche BBB. Insgesamt 10 7 B. burgdodrferi 297 (Bb)-Zellen wurden über Nacht mit humanem BMEC inkubiert, das in Transwell-Inserts bis zur Konfluenz gezüchtet wurde. (A) Dunkelfeldmikroskopie wurde verwendet, um die Anzahl der Spirochäten zu bestimmen, die die Monoschichten durchquerten. Die Daten aus zwei unabhängigen Experimenten mit Dreifachbestimmungen werden als Prozentsätze von ausgedrückt B. burgdorferi (Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts), die sich relativ zur Gesamtzahl der Spirochäten in den Kontrollvertiefungen ohne Einsätze gekreuzt haben. (Einschub) Vergleich von B. burgdorferi Kreuzung mit Human-BMEC (Balken +) oder ohne Human-BMEC (Balken –). (B) TEER, ausgedrückt als Mittelwert ± Standardfehler der Mittelwerte für die in Feld A gezeigten Experimente. Forts., Kontrolle. FEIGE. 3 . B. burgdorferi kreuzt differenziell humane BMEC- und HUVEC (EA.hy926)-Monoschichten. Insgesamt 10 6 B. burgdodrferi 297 (Bb)-Zellen wurden über Nacht mit menschlichem BMEC oder HUVEC (EAhy.926) inkubiert, das in Transwell-Inserts bis zur Konfluenz gezüchtet wurde. (A) Dunkelfeldmikroskopie wurde verwendet, um die Anzahl der Spirochäten zu bestimmen, die menschliche BMEC- oder HUVEC-Monoschichten kreuzten. (B) Echtzeit-PCR basierend auf der Einzelkopie B. burgdorferi Sinn streng fla Gen (50) wurde verwendet, um die Anzahl der Spirochäten zu bestimmen, die menschliche BMEC- oder HUVEC-Monoschichten in den Experimenten kreuzten, deren Ergebnisse in Feld A gezeigt sind. Die Daten aus Dreifachbestimmungen werden als Prozentsätze von . ausgedrückt B. burgdorferi (Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts), die sich relativ zur Gesamtzahl der Spirochäten in den Kontrollvertiefungen ohne Einsätze gekreuzt haben. (C) TEER, gemessen als mittlerer Widerstand (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts) für die Experimente, deren Ergebnisse in den Feldern A und B gezeigt sind, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die P Werte (wie von einem gepaarten Schüler- T Test) für die TEER-Änderungen in den 5- und 18-h-HUVEC-Proben betrugen 0,019 bzw. 0,017 (durch Sternchen gekennzeichnet). Fortsetzung, Kontrolle. FEIGE. 4. Plasminogenaktivierung durch Kokulturen von B. burgdorferi und menschliches BMEC. Humane BMEC wurden auf 96-Well-Platten gezüchtet, bis sie Konfluenz erreichten (ungefähr 10 5 Zellen). Das Medium wurde gegen DMEM-F-12-Medium ausgetauscht und am nächsten Tag steigende Mengen an B. burgdorferi N40 (0, 10 3 , 10 4 , 10 5 Zellen) wurden zugegeben. (A) Plasminogenaktivierung durch humanes BMEC als Reaktion auf die Zugabe von Spirochäten. 24 Stunden nach der Spirochätenzugabe wurden die Überstände der Kulturen gesammelt und mit 1 &mgr;g humanem Plasminogen pro ml und 5 mM Spectrozyme PL inkubiert. Die Zunahme der Extinktion bei 405 nm war direkt proportional zur Plasminmenge in einer gegebenen Probe. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen basierend auf sechs Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden. (B) Bindung von exogenem Plasminogen-Aktivator vom Urokinase-Typ an menschliches BMEC nach Zugabe von Spirochäten. Die Kulturen wurden dreimal mit PBS gewaschen, bevor 125 U humanen rekombinanten uPA pro ml zugegeben wurden. Nach einer 60-minütigen Inkubation wurden die Kulturen erneut dreimal mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden 200 µl PBS mit 1 µg Plasminogen pro ml zusammen mit 5 mM Spectrozyme PL zugegeben. Der Anstieg der Extinktion bei 405 nm wurde nach 3 h bestimmt. Beachten Sie die erhöhte Fähigkeit von B. burgdorferi N40 zur Stimulierung der humanen BMEC-Bindung an uPA und Aktivierung von Plasminogen im Vergleich zu Kontrollkulturen, die mit Spirochäten inkubiert wurden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen basierend auf drei Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden. FEIGE. 5. Rolle von Proteasen in B. burgdorferi (Bb) Transmigration durch menschliche BMEC. Serumreduzierte Bedingungen wurden verwendet, um die Rolle von Wirtsproteasen bei der Spirochätentransmigration durch humane BMEC zu untersuchen, wie in Materialien und Methoden und der Legende zu 4 beschrieben B. burgdorferi N40 wurde in Gegenwart von 1 µg Plasminogen pro ml untersucht. Die Durchquerung des menschlichen BMEC durch B. burgdorferi N40 mit 50 nM BB-94 allein, mit 200 μM EACA allein, mit BB-94 und EACA oder mit 40 μg α2-Antiplasmin pro ml wird angezeigt. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte von zwei Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen an. FEIGE. 6. MMP-1-Expression als Reaktion auf B. burgdorferi. Insgesamt wurden 10 5 humane BMEC mit steigenden Mengen an geimpft B. burgdorferi N40. Nach 24 h wurden Zellkulturüberstände geerntet und durch Immunoblot-Analyse mit dem gegen MMP-1 erzeugten Antikörper getestet. Beachten Sie die erhöhten MMP-1-Spiegel mit der erhöhten Anzahl von B. burgdorferi Zellen.



Bemerkungen:

  1. Laureano

    Für Hinweise bin ich Ihnen sehr dankbar. Ich habe dies verwendet.

  2. Jaycee

    Du hast einen wunderschönen Gedanken

  3. Dewitt

    Es ist Zeit, vernünftig zu werden. Es ist Zeit, an sich selbst zu kommen.

  4. Chu'a

    Du hast nicht recht. Ich bin sicher. Maile mir per PN.

  5. Joseph Harlin

    der sehr lustige Satz



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