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Wo würde Saccharomyces cerevisiae in den höchsten Konzentrationen in der Umwelt vorkommen?

Wo würde Saccharomyces cerevisiae in den höchsten Konzentrationen in der Umwelt vorkommen?


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Ich habe Bäckerasthma speziell gegen 'Sc'-Hefe und weiß, dass ich Bäckereien, Brauereien usw.

Ich habe herausgefunden, dass verrottende Blatthaufen und fermentierender Rindenmulch nicht gestört werden. Wo sonst?

Um wie viel Prozent höher sind die Konzentrationen beispielsweise in Florida, im Gegensatz zum Bundesstaat New York?


Hier ist ein Link zu einem interessanten Artikel, der eine Übersicht über wilde Isolate von berichtet Saccharomyces cerevisiae in China.

Wang, Qi-Ming et al. (2012)Überraschend divergierende Populationen von Saccharomyces cerevisiae in natürlichen Umgebungen, die von menschlichen Aktivitäten entfernt sind. Mol Ecol 21: 5404-5417

Ein relevantes Zitat aus dem Artikel:

Neben Trauben und Eichenrinde (Quercus spp.) wurde S. cerevisiae erfolgreich aus einer Vielzahl von beschädigten Früchten isoliert, die in Obstgärten oder Märkten in verschiedenen Provinzen Chinas gesammelt wurden; aus der Rinde verschiedener Laubbäume; Waldboden und morsches Holz aus urzeitlichen, ursprünglichen Sekundär- und Pflanzwäldern in verschiedenen Regionen der gemäßigten, subtropischen und tropischen Klimazonen von Nord- bis Südchina. Unerwarteterweise war die Erfolgsrate der Isolierung von S. cerevisiae aus Fruchtproben (6,5 %) geringer als die aus Baumrinden- (16,5 %), Erde (10,8%) und faulen Holzproben (9,2 %). S. cerevisiae wurde häufiger aus Waldbodenproben (Erfolgsrate 13,7%) als aus Obstplantagen-Bodenproben (Erfolgsrate 9,1%) isoliert. Unter den Früchten, die eine positive Isolierung von S. cerevisiae ergaben, zeigten Traubenproben die niedrigste Erfolgsrate.

Tabelle S2 in den Zusatzinformationssätzen isoliert wie folgt:

Klimazone Standorte Isolate __________________________________ tropisch 5 20 subtropisch 2 14 gemäßigt 13 51

Oberflächlich betrachtet sieht es so aus, als gäbe es wohl kaum einen Unterschied zwischen New York State (feucht, kontinental) und Florida (feucht, subtropisch).


Alles über die kleinen Mikroben

Hefen sind eukaryontische Mikroorganismen, die in das Königreich Pilze eingeordnet werden, mit derzeit etwa 1.500 beschriebenen Arten dominieren sie die Pilzvielfalt in den Ozeanen. Die Hefeart Saccharomyces cerevisiae wird seit Jahrtausenden zum Backen und Fermentieren alkoholischer Getränke verwendet. Auch als Modellorganismus in der modernen zellbiologischen Forschung ist er von großer Bedeutung und zählt zu den am besten erforschten eukaryontischen Mikroorganismen

Hefen sind in der Umwelt sehr verbreitet,

1) Hauptsächlich aus zuckerreichem Material isoliert. Beispiele sind natürlich vorkommende Hefen auf den Schalen von Früchten und Beeren (wie Trauben, Äpfel oder Pfirsiche) und Exsudate von Pflanzen (wie Pflanzensäfte oder Kakteen). Einige Hefen werden in Verbindung mit Erde und Insekten gefunden.

2) Die ökologische Funktion und Biodiversität von Hefe ist im Vergleich zu anderen Mikroorganismen relativ unbekannt.

3) Hefen wie Candida albicans, Rhodotorula rubra, Torulopsis und Trichosporon cutaneum wurden als Teil ihrer Hautflora zwischen den Zehen der Menschen gefunden.

3) Hefen kommen auch in der Darmflora von Säugetieren und einigen Insekten vor.

4) Bioremediation von Kohlenwasserstoffen. Einige Hefen finden Anwendung auf dem Gebiet der biologischen Sanierung. Von einer solchen Hefe, Yarrowia lipolytica, ist bekannt, dass sie Palmölmühlenabwässer, TNT (ein explosives Material) und andere Kohlenwasserstoffe wie Alkane, Fettsäuren, Fette und Öle abbaut. Es verträgt auch hohe Salz- und Schwermetallkonzentrationen und wird auf sein Potenzial als Schwermetall-Biosorbens untersucht.

Rohöl ist ein Gemisch aus Kohlenwasserstoffen unterschiedlicher Größe. Verschiedene Mikroorganismen bauen Kohlenwasserstoffe unterschiedlicher Größe ab.

Verwendung in Gewässern

Hefe wird häufig von Aquarianern verwendet, um Kohlendioxid (CO2) zu erzeugen, um Pflanzen in bepflanzten Aquarien zu düngen. In einem selbstgebauten Setup wird es häufig als billige und einfache Alternative zu CO2-Drucksystemen verwendet. Das CO2 wird von Pflanzen im Photosyntheseprozess verwendet und ist für das Pflanzenwachstum sehr wichtig. Es ist absolut sicher für Fische und andere Wassertiere.

Menschlicher Verzehr:

Natürliche Nahrungsergänzungsmittel und Probiotika für den menschlichen Verzehr Hefe wird in Nahrungsergänzungsmitteln verwendet, die bei Veganern und Gesundheitsbewussten beliebt sind, wo sie oft als „Nährhefe“ bezeichnet wird. Meist handelt es sich um Saccharomyces cerevisiae.

Es ist eine ausgezeichnete Quelle für Proteine ​​und Vitamine, insbesondere die Vitamine des B-Komplexes, deren Funktionen mit dem Stoffwechsel sowie anderen für das Wachstum erforderlichen Mineralien und Cofaktoren zusammenhängen.

Einige probiotische Nahrungsergänzungsmittel verwenden die Hefe Saccharomyces boulardii zur Erhaltung und Wiederherstellung der natürlichen Flora im großen und kleinen Magen-Darm-Trakt. Es wurde gezeigt, dass S. boulardii die Symptome von akutem Durchfall bei Kindern reduziert, eine erneute Infektion von Clostridium difficile verhindert, den Stuhlgang bei RDS-Patienten mit vorherrschendem Durchfall reduziert und die Inzidenz von Antibiotika, Reisekrankheiten und HIV/AIDS-assoziierten Durchfällen verringert.


Einführung

Saccharomyces cerevisiae ist neben dem Menschen wohl der am intensivsten untersuchte eukaryotische Organismus. Seine genetische Beherrschbarkeit hat ihn zu einem wertvollen Modellorganismus für Genetik, Genomik, Zellbiologie und Biochemie gemacht (z.B. Goffeau et al., 1996 Spellman et al., 1998 Hartwell et al., 1974). Aber seine lange Geschichte der menschlichen Domestikation macht es für die Ökologie- und Evolutionsforschung weniger als ideal. Evolutionsbiologen und Ökologen ziehen es oft vor, andere Arten der Gattung zu studieren Saccharomyces, das sieben bekannte Arten und viele Hybriden umfasst (Abbildung 1). Alle sind so lenkbar wie S. cerevisiae im Labor. Mehrere, darunter S. cerevisiaeder nächste Verwandte, S. paradoxus, werden nur in freier Wildbahn und nicht in menschlichen Fermentationen gefunden. Alle Saccharomyces Arten haben ähnliche Morphologien und biochemische Phänotypen (Vaughan-Martini und Martini, 2011), obwohl es einige ökologisch bedeutsame Merkmale gibt, die sich zwischen den Arten unterscheiden, z. Temperaturtoleranz (Sampaio und Gonçalves, 2008). Information über Saccharomyces Hefen können setzen S. cerevisiae Molekularbiologie in ökologischen und evolutionären Kontext. Diese Klade hat uns auch Lektionen über Nischenökologie, Hybridisierung, Domestikation, Populationsgenetik und Biogeographie gelehrt, die über Vergleiche mit hinausgehen S. cerevisiae.

Hier werden wir die Verwendung von überprüfen S. paradoxus und ihre Verwandten, um die Naturgeschichte, Ökologie und Evolution der Hefe zu verstehen. Wir konzentrieren uns auf S. paradoxus weil es am besten untersucht ist Saccharomyces Hefe außerdem S. cerevisiae. Die Literatur zu Saccharomyces Arten, die es nicht sind S. paradoxus oder S. cerevisiae wächst schnell, und wir fügen Informationen zu anderen hinzu Saccharomyces Spezies (S. eubayanus, S. uvarum, S. kudriavzevii, S. arboricola und S. mikatae) wenn verfügbar. Wir empfehlen zusätzliche aktuelle Saccharomyces Rezensionen, die sich auf Vergleiche mit konzentrieren S. cerevisiae (Replansky et al., 2008 ), Speziation (Greig, 2009 ) und evolutionäre Genomik (Hittinger, 2013 ) für interessierte Leser.


Ergebnisse

Aus dem Traubensaft und dem daraus resultierenden Ferment wurden neun verschiedene Hefearten gewonnen. Es scheint, dass zwei unterschiedliche Perioden der mikrobiellen Expansion stattgefunden haben: eine frühere, die die nicht-Saccharomyces und eine spätere, die nur S. cerevisiae umfasst. S. cerevisiae konnte am ersten Fermentationstag noch nicht nachgewiesen werden, am 11. Tag war es die dominierende Art. Es ist klar, dass S. cerevisiae anfangs sehr selten war, aber im Überfluss zunahm und die verschiedenen Nicht-Saccharomyces (Abb. 1): Dies stimmt mit den Beobachtungen der Hefepopulationsdynamik anderer traditioneller Fermente überein (Pretorius 2000, Xufre et al. 2006).

Die Veränderung der Zusammensetzung der Hefegemeinschaft, der Temperatur und der Ethanolkonzentration während einer traditionellen Weingärung. Dargestellt ist die Veränderung der Populationsgröße (koloniebildende Einheiten, KBE) der Nicht-Saccharomyces Hefen (dünne schwarze gestrichelte Linien) und S. cerevisiae (dünne schwarze durchgezogene Linien) in vier separaten Fässern über 20 Tage Fermentation. Außerdem wird die durchschnittliche Änderung der Temperatur (starke rote Linie) und des Ethanolgehalts angezeigt, die aus der Änderung des spezifischen Gewichts (starke blaue Linie) für diese vier Fässer über die Tage 6–16 der Fermentation geschätzt wurde.

Traubensaft selbst ist ein aggressives Medium, hat unter anderem einen niedrigen pH-Wert von ∼ 3,5 und übt einen osmotischen Druck aus, da Zucker typischerweise ∼ 200–350 g/L beträgt (Ribereau-Gayon et al. 2006). Um zwischen den Wirkungen von Ethanol allein oder der Wechselwirkung zwischen Ethanol und den anderen Belastungen durch Traubensaft zu unterscheiden, wurden die Wachstumsraten der verschiedenen Arten aus der Gemeinschaft in einem benignen Labormedium (YPD) und in Traubensaft ergänzt getestet mit 0%, 3% und 9% Ethanol bei 30°C. Es zeigte sich, dass die Wachstumsrate signifikant durch den Medientyp, den Ethanolgehalt, die Hefespezies und alle möglichen Interaktionen dieser Effekte beeinflusst wird (Drei-Wege-ANOVA, alle Haupteffekte und mögliche Interaktionen erzeugt) P < 0,001). Die Bedeutung dieser Effekte blieb erhalten, wenn die Hefen in S. cerevisiae und Nicht-Saccharomyces Klassen, abgesehen von der Ethanol-Medien-Interaktion: Die Wachstumsraten beider Klassen nahmen mit steigendem Ethanol-Niveau ab. Abb. 2 zeigt das Ausmaß dieser Effekte und ihre Wechselwirkungen. Eine ANOVA zeigt, dass der Unterschied zwischen der Wachstumsrate von S. cerevisiae und der Nicht-Saccharomyces in Traubensaft ohne Ethanol ist von großer Bedeutung (P < 0,0001): hier hat S. cerevisiae einen Fitnessvorteil von 4,1% pro Stunde (m = 0,04 h –1 ). Dieser Vorteil mag nicht groß erscheinen, aber er würde es S. cerevisiae ermöglichen, in nur 14 Tagen von 0,1% auf 99,9% einer Gemeinschaft zu wachsen. Der Unterschied zwischen S. cerevisiae und dem nicht-Saccharomyces Spezies im Traubensaft bleibt auch nach Zugabe von 3% Ethanol signifikant (Einweg-ANOVA, P < 0,0001). In dieser Umgebung ist S. cerevisiae 6,2 % pro Stunde fitter (m = 0,06 h −1 10 Tage, um von 0,1 % auf 99,9 % zu steigen): Es scheint, dass die Zugabe von Ethanol zu Traubensaft den Wettbewerbsvorteil von S. cerevisiae noch einmal um etwa die Hälfte erhöht hat, als der alleinige Traubensaft. Bei der Untersuchung der Daten stellte ich fest, dass es bei YPD allein keinen signifikanten Unterschied in der Wachstumsrate zwischen einer der Arten gab (ANOVA, P = 0,5), und dass die Zugabe von 3% Ethanol zu YPD dies nicht änderte (ANOVA, P = 0,1). Eine genauere Untersuchung zeigt, dass die meisten nicht-Saccharomyces Arten in YPD mit 9% Ethanol nicht wachsen konnten, zeigte ein Mitglied der Gemeinschaft keinen signifikanten Wachstumsunterschied im Vergleich zu S. cerevisiae (P = 0,19). Bei sonst gleichen Bedingungen ist dieses Isolat von Issatchenkia terricola in Gegenwart von Ethanol bis zu einer Konzentration von 9% ebenso konkurrenzfähig wie S. cerevisiae.

Der Einfluss der Umgebung und der Ethanolkonzentration auf die Wachstumsrate von Arten in der Hefegemeinschaft. Die Abbildung zeigt die Änderung (Mittelwert ± SE) der Wachstumsrate (geschätzt durch die maximale Änderung der optischen Dichte [OD, Absorption bei 660 nm] über 24 Stunden) der nicht-Saccharomyces (Dreiecke Mittelwert von sechs Arten, n = 3 für jede Art) und S. cerevisiae (Quadrate n = 6) in YPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose offene Symbole, gestrichelte Linie) und Traubensaft (durchgezogene Symbole, durchgezogene Linie), ergänzt mit 0%, 3% und 9% Vol./Vol. Ethanol.

Die Natur der Umgebung (Saft vs. YPD) hatte einen großen und signifikanten Einfluss auf den Unterschied in der Wachstumsrate zwischen S. cerevisiae und Nicht-Saccharomyces bei 30°C. Es scheint klar zu sein, dass niedrige Ethanolwerte die Nicht-Saccharomyces Hefe in dieser Gemeinschaft, und dass einige relativ hohe Ethanolwerte tolerieren. Diese Daten legen nahe, dass der ökologische Vorteil von S. cerevisiae darin begründet ist, dass es im Vergleich zu den nicht-Saccharomyces, und dies wird durch die Zugabe von Ethanol weiter verstärkt. Dies liefert den Beweis, dass die Produktion von Ethanol und die Anpassung an besseres Wachstum in Gegenwart von Ethanol ein Beispiel für evolutionäre Rückkopplungen aus dem Nischenbau sind. Sind diese Aspekte die gesamte Erklärung für die veränderte Zusammensetzung der Gemeinschaft? Abgesehen von dem künstlichen Anstieg des Ethanolgehalts gibt es mindestens eine weitere Umweltveränderung, die mit dem Rückgang der nicht-Saccharomyces und die Zunahme von S. cerevisiae: Temperatur (siehe Abb. 1).

Eine Untersuchung der Fermentationschemie zeigt, dass Ethanol und CO2 sind nicht die einzigen Produkte: Da die Reaktion exogon ist, wird auch Energie frei. Die theoretische Energiefreisetzung aus der Umwandlung einer einäquimolaren Glucoselösung: Fructose in Ethanol und CO2 beträgt 104,43 kJ/Mol (Williams 1982). Da Traubensaft nahe bei einem molaren Glucose : Fructose liegt, ist dies nicht weit von der potentiellen Energie entfernt, die während der Fermentation freigesetzt wird. Es braucht ∼ 3,43 J, um 1 ml Traubensaft um 1°C zu erhitzen. Daher würde die Fermentation von 1 l einer äquimolaren Glucose : Fructose-Lösung 104,43 kJ freisetzen, und dies könnte den Traubensaft möglicherweise um ∼30°C erhitzen. Natürlich ist dies eine theoretische Situation, in der die Umwandlung sofort erfolgt, 100% effizient und vollständig isoliert ist. Obwohl diese Bedingungen selten erfüllt sind, ist klar, dass neben Ethanol und CO2Bei der Fermentation wird viel Energie an die Umwelt abgegeben. Tatsächlich kann sich die Temperatur von Fermenten im Verlauf dramatisch ändern (Ribereau-Gayon et al. 2006). Die anschließenden Fermentationen am Kumeu River wurden in einem klimatisierten Raum durchgeführt, stiegen jedoch immer noch von 15°C auf ∼25°C (siehe Abb. 1): Dieser Anstieg korreliert mit der Zunahme der Häufigkeit von S. cerevisiae. Es ist nicht unvernünftig anzunehmen, dass der Temperaturanstieg auf die fermentative Wirkung von S. cerevisiae zurückzuführen ist.

Da sich die Temperatur während der Fermentation änderte, wollte ich wissen, ob dies eine Rolle bei der beobachteten Veränderung der Gemeinschaftszusammensetzung spielte. Wie variieren die Wachstumsraten der verschiedenen Mitglieder der Hefegemeinschaft mit der Temperatur? Das thermische Profil einer Untergruppe von Arten in der Gemeinschaft wurde in YPD und Traubensaft bestimmt, um die mögliche Wechselwirkung zwischen Umwelt und Temperatur zu untersuchen. Die maximale Wachstumsrate wurde signifikant von der Umgebung (YPD oder Traubensaft), der Hefeart, der Temperatur und allen möglichen Wechselwirkungen dieser Effekte beeinflusst (wie durch eine Drei-Wege-ANOVA gezeigt, wurden alle Haupteffekte und möglichen Wechselwirkungen erzeugt P < 0,0001). Abb. 3 zeigt das Ausmaß der Wechselwirkung zwischen Umgebung, Temperatur und Hefespezies. Es ist klar, dass S. cerevisiae einen Wachstumsvorteil gegenüber Nicht-Saccharomyces Art nur in Traubensaft mit >20°C: hier hat S. cerevisiae einen durchschnittlichen Fitnessvorteil von 7,3% pro Stunde (m = 0,07 neun Tage, um von 0,1 % auf 99,9 % zu gehen). Der Vorteil von S. cerevisiae ist weder unter 20°C in Traubensaft noch bei jeder Temperatur in YPD-Medien offensichtlich (es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen S. cerevisiae und Nicht-Saccharomyces im YPD insgesamt P = 0,06 der Rand P Wert ist auf die höhere Wachstumsrate der nicht-Saccharomyces Art bei 30°C). Ein möglicher Grund für den Temperatureffekt im Saft ist auf eine Wechselwirkung zwischen dem niedrigen pH-Wert und der Temperatur zurückzuführen, da beide die Integrität der Zellmembran beeinflussen: Es scheint, dass S. cerevisiae durch evolutionäres Feedback aus der Nischenkonstruktion besser an diese Bedingungen angepasst ist.

Der Einfluss von Umgebung und Temperatur auf die Wachstumsrate von Arten in der Hefegemeinschaft. Die Änderung (Mittelwert ± SE) der Wachstumsrate (geschätzt durch die maximale Änderung der optischen Dichte [OD, Absorption bei 660 nm] pro Stunde) der nicht-Saccharomyces (Dreiecke vier Arten, n = je 3) und S. cerevisiae (Quadrate vier Isolate, n = je 3) in YPD (offene Symbole, gestrichelte Linie) und Traubensaft (durchgezogene Symbole, durchgezogene Linie) über einen Temperaturbereich.


Ergebnisse

Wir verwendeten gemeldete Mittelwerte und Varianzen aus der quantitativen morphologischen Phänotypisierung von 4.718 haploiden YKO-Stämmen [17], um phänotypische Kondensatoren zu identifizieren. Unsere Arbeitsdefinition eines Kondensators ist ein Genprodukt, das bei Deletion eine hohe Varianz in mehreren nicht redundanten Phänotypen verursacht. Um Genprodukte zu identifizieren, die dieses Kriterium erfüllen, müssen drei Hindernisse überwunden werden: (1) Es muss ein vom Mittelwert unabhängiges Varianzmaß generiert werden, um Varianzänderungen nicht mit Änderungen des mittleren Phänotyps zu verwechseln [18] (2 ) müssen biologisch oder physikalisch redundante Phänotypen eliminiert werden (Dimensionsreduktion) und (3) muss ein robuster Score für die Gesamtvarianz in mehreren Phänotypen generiert werden.

Wir haben das erste Hindernis angegangen, indem wir für jeden Phänotyp die Standardabweichung gegen den Mittelwert jedes YKO aufgetragen, eine niedrigste (lokal gewichtete) Regression an jeden Plot angepasst und den Restabstand jedes Punktes von der Regression berechnet haben (Abbildungen 1B und S1 ). Diese Residuen der Standardabweichung, die ein Maß für die Varianz darstellen, das für den Mittelwert kontrolliert wird, wurden standardisiert, um jeden Phänotyp gleich zu gewichten.

Für die Dimensionsreduktion haben wir Partitioning Around Medoids (PAM) verwendet, eine robuste Variante des k-Means-Clustering. Durch Analyse der durchschnittlichen Silhouettenbreite, einem Maß für die Trennung von Clustern, schätzten wir, dass die 220 ursprünglichen Phänotypen auf 70 repräsentative Phänotypen („Medoids“) reduziert werden können (Abbildung S2).

Um ein einzelnes Maß der phänotypischen Gesamtvarianz zu generieren, wenn ein Gen deletiert wird, haben wir die oberen 35 (von 70) Residuen der Standardabweichung für jede YKO gemittelt (Tabelle S1). Dieser Score, den wir als phänotypisches Potenzial bezeichnen, war extrem robust gegenüber selbst großen Veränderungen im Clustering- und Mittelungsverfahren und schien nicht durch potenzielle Randeffekte im Lowess-Verfahren verzerrt zu sein (Abbildungen S3–S6).

Um Gene mit signifikant höheren phänotypischen Potenzialwerten zu identifizieren, als zufällig erwartet, verglichen wir die Verteilung der Werte aller YKOs mit Verteilungen, die erzeugt wurden, wenn die Werte innerhalb jedes Phänotyps zum ersten Mal permutiert wurden. Basierend auf dieser Permutationsanalyse wurden die 502 Gene mit dem höchsten phänotypischen Potenzial als mutmaßliche phänotypische Kondensatoren mit einer geschätzten Rate falscher Entdeckungen (FDR) von 0,34 identifiziert (Abbildung 1C). Diese FDR maximiert die geschätzte Anzahl der wahrhaft positiven Ergebnisse (Abbildung S7 und siehe Materialien und Methoden). Wir schätzen daher, dass 333 der insgesamt 502 identifizierten Gene richtig positiv sind, mit einem höheren phänotypischen Potenzial, als zufällig vorhergesagt würde. Für die Downstream-Analyse wurden die Top 502 Gene in drei Klassen unterteilt.Die Top 60 Gene mit hoher Konfidenz (FDR = 0), die nächsten 206 Gene mit mittlerer Konfidenz (FDR Cutoff = 0,10) und die nächsten 266 Gene mit niedriger Konfidenz (FDR Cutoff = 0,34) werden als „C1“, C2 bezeichnet. bzw. „C3“.

Validierung phänotypischer Kondensatoren

Wir validierten unsere Identifizierung von Kondensatoren, indem wir die Phänotypisierung von 50 C1-Stämmen und 50 Kontrollstämmen in unserem Labor wiederholten. Haploide Mutanten in der YKO-Bibliothek, die für die ursprüngliche Phänotypisierung verwendet wurden, wurden für eine unbekannte Anzahl von Generationen passagiert. Da einige Knockouts die Mutationsraten erhöhen und dadurch eine phänotypische Variabilität verursachen können, die nicht mit einem Verlust der Umweltpufferung verbunden ist, verwendeten wir stattdessen eine haploid-konvertierbare heterozygote diploide YKO-Bibliothek [19] und hielten die Anzahl der Generationen zwischen Sporulation und Fixierung auf ein Maximum von 50. C1-Stämme zeigten mehr phänotypische Variabilität als Kontrollstämme (Abbildungen 2 und S8). Die Phänotypen schienen auch unter den C1-Stämmen sehr heterogen zu sein, was darauf hindeutet, dass Knockouts nicht alle eine kleine Anzahl von Prozessen auf hoher Ebene stören, die zu einer begrenzten Anzahl von Phänotypen führen. Mit den phänotypischen Mittelwerten und Standardabweichungen von nur den 100 haploid-konvertierten Stämmen wiederholten wir die oben beschriebene Berechnung des phänotypischen Potenzials unter Verwendung der 70 bereits identifizierten phänotypischen Medoide (Abbildung 2, unten rechts). Unsere Erwartung war, dass diese wiederholte Analyse die Aussagekraft verringert hätte, da die proportional große Anzahl von C1-Stämmen, die eine hohe Varianz aufweisen, die niedrigste Regression verzerren würde, um die Größe der Residuen zu verringern. Trotz dieser Einschränkung fanden wir, dass die phänotypischen Potenzialwerte bei den C1-Stämmen deutlich höher waren (P < 9,8 × 10 –10 , Wilcoxon-Mann-Whitney-Test). Für ein weniger konservatives Maß des phänotypischen Potenzials haben wir Daten von Kondensator- und Kontrollstämmen in groben Proportionen zu ihrer Anzahl in der ursprünglichen Analyse (fünf bis 42) entnommen, die Punktzahlen bei 1.000 wiederholten Probennahmen berechnet und über alle 1.000 Proben gemittelt, um die endgültige zu berechnen phänotypische Potenziale (Abbildung S9). Während diese Analyse aufgrund einer Reduzierung der Residuen an den Rändern der niedrigsten Regression aufgrund weniger Datenpunkte immer noch zu einer konservativen Verzerrung führt, weisen Kondensatoren ∼2-fach höhere phänotypische Potenziale als Kontrollen auf (P < 2,7 × 10 –10 , Wilcoxon-Mann-Whitney-Test). Eine bemerkenswerte Ausnahme ist RAD27, das ein geringeres phänotypisches Potenzial hat als alle bis auf drei der Kontrollstämme in der konservativeren ersten Analyse und alle bis auf neun in der weniger konservativen Stichprobenanalyse. Die RAD27-Deletion verursacht einen starken spontanen Mutator-Phänotyp [20], was darauf hindeutet, dass die im ursprünglichen YKO beobachtete hohe phänotypische Variabilität auf Mutationsakkumulation zurückzuführen sein könnte. Wir haben auch zehn Kondensatoren der Klassen C2 oder C3 untersucht und auch diese zeigten signifikant höhere phänotypische Potenzialwerte als Kontrollstämme (P < 0,002, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test).

Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von Beispielen von mutmaßlichen phänotypischen Kondensatorstämmen (HPR1, KEM1, SWI6, BEM2, CLA4, DIA2, RAD52) und Kontrollstämmen (YDR279W und YCR100C) werden gezeigt. Die Zellen werden mit FITC-Concanavalin A (grün), Rhodamin-Phalloidin (rot) und DAPI (blau) gefärbt. Unten rechts: Histogramme der phänotypischen Potentiale von Kontroll- (schwarz) und phänotypischen Kondensator- (rot) YKOs von haploid-konvertierten heterozygoten diploiden Stämmen.

Als zusätzliche Validierung haben wir in der Literatur nach Beweisen für Kondensatoren gesucht, die eine erhöhte Variabilität von Zelle zu Zelle verursachen. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass Knockouts der Kondensatoren CCR4, CLN3 und SWI6 jeweils zu einer erhöhten Variabilität der diploiden Zellgröße in flüssigen Medien führen [21]. Knockout von CCR4 verursacht auch eine unregelmäßige Koloniemorphologie auf festem Medium, ein Befund, der mit einer erhöhten Zell-zu-Zell-Variation übereinstimmt [22]. Zwei andere Mitglieder des CCR4-NOT-Kernkomplexes, NOT5 und POP2, werden in unserem Screen als Kondensatoren identifiziert, was darauf hindeutet, dass eine Unterbrechung dieses Transkriptionsregulationskomplexes wahrscheinlich zu zellulärer Heterogenität führt. Darüber hinaus sind zwei von drei Knockouts, die das intrinsische Expressionsrauschen des PHO5-Promotors erhöhen, die Kondensatoren ARP8 und SNF6 [23]. Schließlich wurde gezeigt, dass der Knockout des Kondensators FUS3 die Variation von Zelle zu Zelle als Reaktion auf ein Pheromonsignal erhöht [24].

Phänotypische Kondensatoren sind in mehreren genontologischen Kategorien angereichert

Als nächstes untersuchten wir den gesamten Satz von 502 Kondensatoren zur Anreicherung in den Prozessbegriffen der Geneontologie (GO http://www.geneontology.org/) (Tabelle S2). Phänotypische Kondensatoren sind in zahlreichen Prozessen stark angereichert, von denen die meisten grob in DNA-Erhaltung und -Organisation, Zellzyklus und Zellorganisation, Reaktion auf Stimuli wie Stress, RNA-Verlängerung oder Proteinmodifikation kategorisiert werden können. Dieser vielfältige Satz von angereicherten Begriffen steht wahrscheinlich für Prozesse, die bei Unterbrechung zu umfassenden zellulären Veränderungen führen können.

Insbesondere enthalten Kondensatoren 123 von 565 ORFs, die mit „Chromosomenorganisation und Biogenese“ annotiert sind, und 80 von 275 ORFs, die mit ihrem Tochterbegriff „Telomerorganisation und Biogenese“ annotiert sind (P < 2,9 × 10 –27 und P < 2,1 × 10 –25 bzw. hypergeometrische Verteilung mit Bonferroni-Korrektur). Dazu gehören alle Gene, die mit Rekombinase-Aktivität annotiert sind, der gesamte Telomerase-Holoenzym-Komplex, der gesamte RecQ-Helikase-Topo-III-Komplex, alle bis auf ein Gen aus dem homologen Rekombinationsmodul, alle Gene, die an der Postreplikationsreparatur beteiligt sind, der gesamte CTF18m-Komplex, der an der Schwesterchromatid-Kohäsion beteiligt ist und DNA-Replikations-Checkpoint-Signalisierung, das gesamte MMS22m-Modul, von dem angenommen wird, dass es an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen beteiligt ist, und beide Gene des HEX3m-Moduls [25]. Bemerkenswerterweise fehlen jedoch andere Module, die wahrscheinlich DNA-Instabilität verursachen, einschließlich des Nukleotidexzisionsreparaturmoduls, des DNA-Schadens-Checkpoint-Moduls RAD9m, des MUS81m-Moduls, das an der Spaltung verzweigter DNA beteiligt ist, und des TOF1m-Moduls, das an der Förderung der Schwesterchromatid-Kohäsion beteiligt ist DNA-Schäden reparieren [25].

Zu den Kondensatoren gehören auch 28 Transkriptionsregulatoren zahlreiche Genprodukte, die an der globalen mRNA-Produktion beteiligt sind, darunter alle Mitglieder des Proteinkinase-Komplexes der Carboxy-terminalen Domäne die meisten Mitglieder des THO-Komplexes, von dem angenommen wird, dass er die Transkriptionsverlängerung mit dem mRNA-Metabolismus koppelt und zahlreiche Kernporen exportiert. assoziierte Proteine, einschließlich beider Mitglieder des mRNA-Export-SAC3/THP1-Komplexes mindestens sieben Genprodukte, die am mRNA-Spleißen beteiligt sind etwa die Hälfte der Genprodukte, die an die zytoplasmatischen mRNA-prozessierenden (P) Körpergene annotiert sind, die am Proteintransport und -abbau beteiligt sind, darunter drei Mitglieder des Golgi-lokalisierten alpha-1,6-Mannosyltransferase-Komplexes und acht Genprodukte, die an der vakuolären Ansäuerung beteiligt sind, und Gene, die an der Kontrolle der Aktin- (neun Gene) und Mikrotubuli (12 Gene) Organisation und an der Keimung oder Selektion beteiligt sind.

Phänotypische Kondensatoren sind wahrscheinlich Netzwerk-Hubs

Protein-Protein-Interaktions- (PPI) und synthetische letale Interaktions-(SLI)-Netzwerke haben eine kleine Anzahl von hochgradig verbundenen Knoten (Hubs) und viele mehr schlecht verbundene Knoten [26,27]. In PPI-Netzwerken ist das Löschen eines Hubs wahrscheinlicher tödlich als das Löschen anderer Knoten [26]. Dieser Befund legt nahe, dass genetische Eigenschaften zumindest teilweise auf die globale Netzwerkarchitektur zurückzuführen sind. Unsere numerischen Simulationen von Transkriptionsnetzwerken implizierten, dass Robustheit wahrscheinlich eine emergente Eigenschaft komplexer Netzwerke ist und dass die Netzwerkarchitektur in einigen Fällen funktionale und evolutionäre Eigenschaften einschränkt [15,16,28]. Andere haben vorhergesagt, dass SLIs entscheidend für das Verständnis der Pufferung sind [29] oder dass phänotypische Kondensatoren wahrscheinlich Hubs sind [30,31]. Daher haben wir hier gefragt, ob das phänotypische Potenzial eines Gens auf die Netzwerkposition zurückzuführen ist.

Zuerst haben wir Netzwerke verwendet, die sowohl aus kuratierten Literaturzitaten [32] als auch aus dem fast vollständigen Satz von Affinitätserfassungs-Massenspektrometrie-Wechselwirkungen [33,34] abgeleitet wurden, um zu bestimmen, ob der durchschnittliche PPI-Grad (Anzahl der Wechselwirkungen) von Kondensatoren anders ist von anderen Genen. Wir fanden heraus, dass Kondensatoren mehr physikalische Wechselwirkungen aufweisen als andere nicht-essentielle Genprodukte, aber weniger als essentielle Genprodukte (Abbildung 3A). Da Kondensatoren in ausgewählten GO-Kategorien angereichert werden, besteht eine mögliche Erklärung für den hohen Anteil an Kondensatoren darin, dass sie in GO-Kategorien fallen, deren Mitglieder in der Regel stark verbunden sind. In den meisten Fällen weisen Kondensatoren jedoch deutlich mehr Wechselwirkungen auf als GO-angepasste nichtessentielle Gene (Abbildung S10). Ausnahmen von dieser Regel scheinen hauptsächlich in GO-Kategorien aufzutreten, in denen sich essentielle und nicht-essentielle Gene im PPI-Grad nicht unterscheiden.

(A) Die durchschnittliche Anzahl physikalischer Wechselwirkungen von phänotypischen Kondensatoren mit hohem (C1, dunkelblau), mittlerem (C2, blau) und niedrigem (C3, hellblau) Vertrauen im Vergleich zu allen nicht essentiellen (hellgrau) oder essentiellen (dunkelgrau) Genen unter Verwendung aller physikalischen Wechselwirkungen im literaturkuratierten Netzwerk des BioGRID (durchgezogene Balken) oder nur affinitätserfassende Massenspektrometrie-Wechselwirkungen (Diagonalstreifen).

(B) Das durchschnittliche phänotypische Potenzial aller nicht-essentiellen Gene (blaue Quadrate) oder nicht-essentielle Gene, die nicht als phänotypischer Kondensator (schwarze Dreiecke) klassifiziert wurden, eingeteilt nach ihrer Anzahl von Affinity-Capture-Massenspektrometrie-PPIs.

(C) Die durchschnittliche Anzahl von SLIs, die alle Interaktionen verwenden, die im literaturkuratierten BioGRID-Netzwerk annotiert sind (durchgezogene Balken), Interaktionen, die nur aus SGA-Experimenten abgeleitet wurden, die nur als Köder verwendete Gene berücksichtigen (diagonale Streifen) und Interaktionen, die nur aus SGA-Experimenten abgeleitet wurden, die nur Gene berücksichtigen nicht als Köder verwendet (horizontale Streifen).

(D) Das durchschnittliche phänotypische Potenzial aller nicht-essentiellen (blaue Quadrate) oder nicht-essentiellen Nichtkondensator-Gene (schwarze Dreiecke), eingeteilt nach ihrer Anzahl von Literatur-Zitat-SLIs.

(E) Die durchschnittlichen Wachstumsraten für haploide KO (durchgezogene Balken), heterozygote diploide KO (diagonale Streifen) und homozygote diploide KO (horizontale Streifen) Stämme. Die Werte sind relativ zum Wildtyp.

(F) Das durchschnittliche phänotypische Potenzial aller nicht-essentiellen (blaue Quadrate) oder nicht-essentiellen Nichtkondensator-Gene (schwarze Dreiecke), unterteilt nach ihren haploiden Wachstumsraten. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. Alle P-Werte sind ein Vergleich mit nicht-essentiellen Genen, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: *, P < 0,05 **, P < 0,001 ***, P < 1 × 10 -5 ****, P < 1 × 10 –10 .

Eine Auftragung des phänotypischen Potenzials gegen den binned PPI-Grad zeigt, dass Genprodukte mit einer höheren Konnektivität im Durchschnitt ein höheres phänotypisches Potenzial haben (Abbildung 3B). Diese Beziehung ist fast vollständig durch einen erhöhten Anteil von Kondensatoren in den hochgradig verbundenen Bins zu erklären (Abbildung S11). Interessanterweise fällt der Anteil der Kondensatoren bei PPI-Grad über 30 steil ab, mit ähnlichen Anteilen in den höchsten (>80 PPI) und niedrigsten (<3 PPI) Bins. Die überwiegende Mehrheit der Gene in dieser höchsten Klasse hat ein Duplikat im Genom, darunter 28 ribosomale Proteine, drei Histone und insbesondere die Homologen von Hsp90: HSP82 und HSC82. Obwohl überraschend, stimmt der Befund, dass Hsp90-Homologe in S. cerevisiae gemäß unserer Definition nicht als Kondensatoren wirken, mit einer früheren Studie überein, in der festgestellt wurde, dass die Hsp90-Aktivität und nicht die Beeinträchtigung neue Mutationen unmittelbare phänotypische Konsequenzen haben ließen [35]. Wir finden jedoch, dass ein Homolog des Chaperons Hsp70, SSE1, ein Kondensator in Hefe ist, im Einklang mit Studien an anderen Hsp70-Familienmitgliedern [36].

Als nächstes verwendeten wir alle SLIs aus kuratierten Literaturzitaten [32] und stellten erneut fest, dass Kondensatoren einen höheren Grad aufweisen als andere nicht-essentielle Gene (Abbildung 3C, durchgezogene Balken). Da SLI-Assays im Genommaßstab nur für eine Teilmenge von Genen abgeschlossen wurden (∼267 als Köder in Experimenten mit synthetischen genetischen Arrays [SGA] verwendet), ist eine mögliche Erklärung für den hohen SLI-Grad von Kondensatoren, dass sie eher verwendet wurden als Köder. Um diese Möglichkeit zu kontrollieren, erzeugten wir ein Subnetzwerk, das nur aus SGA-Experimenten stammte und teilten Gene in diesem Netzwerk in diejenigen ein, die als Köder verwendet wurden und solche, die nicht verwendet wurden. Für jede Klasse haben wir festgestellt, dass Kondensatoren einen höheren SLI-Grad aufweisen als andere nicht essentielle Gene (Abbildung 3C, gestreifte Balken). Der höhere SLI-Grad von Kondensatoren bleibt auch dann erhalten, wenn die Anzahl der physikalischen Wechselwirkungen eines Gens kontrolliert wird (Abbildung S12) oder wenn Kondensatoren mit anderen nicht essentiellen Genen innerhalb der GO-Kategorien verglichen werden (Abbildung S13). Ein Diagramm des phänotypischen Potenzials gegen den binned SLI-Grad (Abbildung 3D) zeigt, dass Gene mit einer höheren Konnektivität im Durchschnitt ein höheres phänotypisches Potenzial haben. Diese Beziehung ist fast vollständig durch einen erhöhten Anteil von Kondensatoren in den hoch verbundenen Bins erklärbar (Abbildung S11).

Auswirkungen phänotypischer Kondensator-Knockouts auf die Wachstumsrate

Wir haben gezeigt, dass Kondensatoren wahrscheinlich PPI- und/oder SLI-Hubs sind, dass sie weniger wahrscheinlich vollständig funktional redundant sind und dass sie an einer Reihe von zentralen Prozessen in der Zelle beteiligt sind. An dieser Stelle könnte man sich fragen, ob eine Störung der Kondensatorfunktion zu drastische Auswirkungen auf die Fitness hat, um bei der Anpassung eine Rolle zu spielen. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, fragten wir, ob Kondensatoren weniger entbehrlich sind als andere nicht-essentielle Gene, indem wir die Wachstumsraten von haploiden [37] oder diploiden [38] Mutanten verglichen. Während Kondensatoren beim heterozygoten Diploiden keinen Einfluss auf die Wachstumsrate zu haben scheinen, sind sie bei haploiden und homozygoten diploiden Knockouts weniger entbehrlich, wobei beim Haploiden eine größere Geschwindigkeitsabnahme zu beobachten ist (Abbildung 3E). Dieser Effekt bleibt auch dann erhalten, wenn wir den PPI-Grad kontrollierten (Abbildung S12) oder wenn Kondensatoren mit anderen nicht essentiellen Genen innerhalb der GO-Kategorien verglichen wurden (Abbildung S14). Gen-Knockouts, die zu drastisch reduzierten Wachstumsraten führen (weniger als 70 % des Wildtyps) haben im Durchschnitt höhere phänotypische Potenziale (Abbildung 3F). Dieser Zusammenhang ist vollständig durch einen erhöhten Anteil von Kondensatoren zu erklären, die niedrige Wachstumsraten verursachen (Abbildung S11). In den meisten Fällen verursachen Kondensatoren jedoch weniger starke Abnahmen der Wachstumsrate, wobei 79 % und 95 % der Kondensator-YKOs eine Wachstumsrate von mehr als 0,80 des Wildtyps im haploiden bzw. homozygoten Diploid aufweisen. Tatsächlich weisen 124 Kondensator-YKOs eine erhöhte Wachstumsrate gegenüber dem Wildtyp auf.

Duplikat- und Singleton-Kondensatoren haben unterschiedliche Modi der funktionalen Redundanz

Die Erkenntnis, dass viele der am stärksten verbundenen PPI-Hubs Duplikate, aber keine Kondensatoren sind (Abbildung 3B), legt einen Zusammenhang zwischen funktionaler Redundanz und Pufferung nahe. Wir haben dies weiter untersucht, indem wir gefragt haben, wie sich Kondensatorgene auf die 1.425 eindeutigen Duplikate und 2.375 eindeutigen Singletons verteilen, die im Hefegenom identifiziert wurden [39–41]. Wir fanden heraus, dass Kondensatorgene eher Singletons sind als andere nicht essentielle Gene (Tabelle 1, P < 0,026, G-Test). Kondensator-Singletons und Kondensator-Duplikate neigen dazu, in verschiedenen GO-Prozesskategorien angereichert zu werden. Kondensator-Singletons sind in den Kategorien DNA-Erhaltung und -Organisation, Reaktion auf Stimuli und RNA-Transkription und -Lokalisierung angereichert (Tabelle S3). Kondensatorduplikate sind zwar insgesamt heterogener, neigen aber dazu, in den Kategorien Proteinmetabolismus und Endozytose am stärksten angereichert zu sein. Als nächstes untersuchten wir, ob sich Kondensator-Singletons von Kondensator-Duplikaten in irgendwelchen Netzwerk- oder Entbehrlichkeitseigenschaften unterscheiden. Sowohl Duplikat- als auch Singleton-Kondensator-Gene neigen dazu, eine hohe Anzahl von SLIs aufzuweisen und eine Verringerung der Wachstumsrate zu verursachen, wenn sie im haploiden oder homozygoten Diploid ausgeschaltet werden (Abbildung S15). Allerdings neigen nur Kondensatorduplikate dazu, PPI-Hubs zu sein (Abbildung 4A).

Anzahl von Singletons oder Duplikaten in verschiedenen Genklassen

(A) Die durchschnittliche Anzahl der Affinitätserfassungs-Massenspektrometrie-Wechselwirkungen aller nicht-essentiellen Gene (grau), aller nicht-essentiellen Singletons (hellgrün), Kondensator-Singletons (hellblau), aller nicht-essentiellen Duplikate (dunkelgrün) und Kondensator-Duplikate (dunkelblau) ).

(B) Ks (links) und die Ausdrucksähnlichkeit (rechts) zwischen doppelten Paaren, die mindestens ein essentielles Gen (dunkelgrau), mindestens einen Kondensator (durchgezogen dunkelblau), nur nicht-essentielle Nichtkondensator-Gene (durchgezogen hellgrau) enthalten, at mindestens ein Genprodukt mit über 19 PPIs annotiert im literaturkuratierten BioGRID-Netzwerk und mindestens einem Kondensator (dunkelblaue Streifen) und mindestens ein Genprodukt mit über 19 PPIs und ohne Kondensatoren oder essentiellen Genen (hellgraue Streifen).

(C) Die mRNA-Häufigkeit (links), Protein-Häufigkeit (Mitte) und SLI-Grad (rechts) von Kondensatoren mit nur einem Paralog im Genom (blau) und ihren Paralogen (grün).

(D) Das phänotypische Potenzial von Kondensatoren mit nur einem Paralog im Genom (blau), ihren Paralogen (grün) und allen nicht-essentiellen Genen (grau). Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes. Sofern nicht anders gekennzeichnet, P-Werte sind ein Vergleich zu doppelten Kondensatoren, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: *, P < 0,05 **, P < 0,001 ***, P < 1 × 10 -5 ****, P < 1 × 10 –10 .

Das obige Ergebnis stellt einen offensichtlichen Widerspruch dar: Ein hoher PPI-Grad ist stark mit der Kondensatoridentität in Duplikaten verbunden (Abbildung 4A), aber viele hochgradig verbundene Duplikate sind keine Kondensatoren (Abbildung 3B). Die Lösung dieses Widerspruchs scheint darin zu bestehen, dass Kondensatorduplikatpaare älter sind und weniger funktionale Redundanz aufweisen als andere Hubduplikatpaare. Unter Verwendung der synonymen Substitutionsrate (Ks) zwischen Mitgliedern eines Duplikatpaares als grobe Schätzung des Alters des Duplikationsereignisses [39,42] haben wir festgestellt, dass Duplikatpaare, die mindestens einen Kondensator enthalten, im Durchschnitt weniger alt sind als Duplikatpaare, die enthalten mindestens ein essentielles Gen und scheinen älter zu sein als doppelte Paare, die nur nicht-essentielle Nicht-Kondensator-Gene enthalten ( 4B ). Da die Substitutionsraten negativ mit dem Expressionsniveau eines Gens korrelieren [43,44], ist eine Erklärung für die Unterschiede in Ks, dass Duplikate, die mindestens einen Kondensator enthalten, eine andere Verteilung der Expressionsniveaus aufweisen als andere Duplikatpaare. Wir stellten jedoch fest, dass das Muster auch dann bestehen bleibt, wenn wir das mRNA-Expressionsniveau kontrollieren (Abbildung S16). Der durchschnittliche Altersunterschied zwischen Kondensator-Duplikatpaaren und nicht wesentlichen Duplikatpaaren scheint auf kürzliche Duplikate (Ks < 1) zurückzuführen zu sein, von denen es weniger Kondensator-Duplikatpaare gibt als nicht wesentliche Nichtkondensator-Duplikatpaare (P < 0,002, G-Test, Abbildung S17). Die gleiche Beziehung gilt, wenn nur Hub-Duplikatpaare verglichen werden, die wir als doppelte Paare definiert haben, bei denen mindestens ein Paralog einen PPI-Grad ≥ 20 hat. Um diese Differenz zu berechnen, haben wir die Hub-Duplikatpaare in solche unterteilt, die mindestens einen Kondensator enthalten und solche, die nicht. Der durchschnittliche PPI-Grad von Genprodukten in diesen beiden Kategorien ist ungefähr gleich (P = 0,53, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test).Beim Vergleich dieser beiden Kategorien haben wir festgestellt, dass Duplikate von Nabenkondensatoren im Durchschnitt älter zu sein scheinen, da keine kürzlichen Duplizierungsereignisse aufgetreten sind. Das höhere Durchschnittsalter von Kondensatorduplikatpaaren lässt die Möglichkeit aufkommen, dass es sich überwiegend um Ohnologs handelt, was ihren Ursprung auf die gesamte Genomduplikation in Hefe vor ∼ 100 Millionen Jahren zurückführt [45]. Wir haben jedoch nicht festgestellt, dass ohnologs unter Kondensatorduplikaten im Vergleich zu Nichtkondensatorduplikaten überrepräsentiert sind (P = 0,47, G-Test). Die größere Divergenz der synonymen Stellen von Kondensatorduplikatspaaren scheint nicht mit einer größeren Divergenz übereinzustimmen, gemessen durch die nicht synonyme Substitutionsrate (Ka). Für diesen Vergleich haben wir unsere Analyse auf ohnologs beschränkt, um Unterschiede in der Duplizierungszeit zu kontrollieren, die Fehler in Ka/Ks einführen könnten. Kondensator-Ohnologs weisen Ka-Werte auf, die sich nicht signifikant von nicht-essentiellen Ohnologs unterscheiden, während essentielle Ohnologs eine geringfügig größere Divergenz aufweisen (Abbildung S18).

Ein auffälligerer Unterschied zwischen Kondensatorduplikatpaaren und anderen Duplikatpaaren war in den Korrelationen der Expression zwischen Paralogen unter vielen experimentellen Bedingungen offensichtlich [39]. Doppelte Paare, die mindestens einen Kondensator enthalten, haben im Durchschnitt eine geringere Expressionsähnlichkeit als Doppelpaare, die ein essentielles Gen oder nicht-essentielle Doppelpaare ohne Kondensator enthalten ( 4B ). Hub-Duplikatpaare, die mindestens einen Kondensator enthalten, haben auch eine geringere Ausdrucksähnlichkeit als andere nicht wesentliche Hub-Duplikatpaare. Diese Ergebnisse legen nahe, dass doppelte Kondensatorpaare weniger funktional redundant sind als andere doppelte Paare. Um diesen Unterschied in der korrelierten Expression weiter zu analysieren, haben wir die 64 Kondensator-enthaltenden Duplikatpaare untersucht, in denen beide Mitglieder des Paares nur einen Paralog im Genom haben. Aus diesen Paaren haben wir zwei Paare ausgeschlossen, bei denen beide Kopien für Kondensatoren kodieren (die ribosomalen Proteine ​​RPL8A und RPL8B und die Mannotransferasen HOC1 und OCH1) und zwei Paare, bei denen ein Kondensatorgen mit einem essentiellen Gen gepaart ist (die Cycline CDH1 und CDC20 und die UDP- Glucose-Phosphorylasen YHL012W und UGP1), die 60 Kondensatorgene gepaart mit einem nicht-essentiellen Nicht-Kondensator-Gen ergeben. Beim Vergleich nur dieser 60 Kondensatoren mit ihren Paralogen stellten wir fest, dass der Kondensator wahrscheinlich eine höhere mRNA- und Proteinhäufigkeit aufweist als sein Nichtkondensator-Duplikat (Abbildung 4C).

Vielleicht aufgrund dieser Expressionsprofilunterschiede hat das Kondensatorgen im Durchschnitt etwa dreimal so viele SLIs wie sein Paralog (Abbildung 4C). Der höhere Ausdruck des Kondensators in dem Paar deutet darauf hin, dass vielleicht der Nichtkondensator-Paralog auch einen Einfluss auf die Robustheit hat, aber einen kleineren, der unseren Schwellenwert für die Kondensatoridentifikation nicht überschritten hat. Die Paraloge ohne Kondensator haben jedoch keine erhöhten phänotypischen Potenziale im Vergleich zu allen nicht essentiellen Genen (Abbildung 4D, P = 0,38, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test). Tatsächlich legt die Analyse des Rauschens der Proteinhäufigkeit [46] nahe, dass die Nichtkondensator-Paraloge eher die Ziele als die Quellen der Pufferung sein könnten: Nichtessentielle Duplikate weisen im Durchschnitt eine größere Variabilität in der Proteinhäufigkeit auf als nichtessentielle Singletons (P < 2,2 × 10 –3 , Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Abbildung S15). Ein teilweise redundantes Duplikat (das Kondensatorgen) könnte diese Variabilität puffern, während seine Deletion diese Variabilität auf der Ebene des Phänotyps aufdecken könnte.

Geht man davon aus, dass eine unvollständige funktionelle Redundanz auch bei deletierten Singleton-Kondensatoren eine hohe phänotypische Variabilität verursacht, stellt das Verständnis des Mechanismus dieses Prozesses eine größere Herausforderung dar, da es keine offensichtlichen Kandidatengene gibt, die mit der Singleton-Funktion überlappen. Eine Hypothese ist, dass Redundanz nicht wie bei Duplikaten auf der Ebene des einzelnen Gens, sondern auf der Ebene des Proteinmoduls erreicht wird. Tatsächlich sind viele Singleton-Kondensatoren Teil funktionell überlappender Module im DNA-Integritätsnetzwerk [25]. Um die Hypothese zu testen, dass dies eine allgemeinere Eigenschaft von Singleton-Kondensatoren ist, haben wir deren Netzwerkeigenschaften weiter untersucht. Der Clustering-Koeffizient ist ein Maß für die Interkonnektivität des lokalen Netzwerks. Singleton-Kondensatoren haben im Durchschnitt höhere Clustering-Koeffizienten im PPI-Netzwerk als alle nicht-essentiellen Singletons, was darauf hindeutet, dass sie mit engmaschigeren Proteingruppen interagieren, die funktionelle Module darstellen könnten (Abbildung 5A). Trotz ihrer hohen lokalen Konnektivität nehmen Kondensator-Singletons weniger zentrale Positionen im gesamten PPI-Netzwerk ein als andere nicht essentielle Singletons, gemessen an der Betweenness-Zentralität (Abbildung 5A). Dies steht im krassen Gegensatz zu Kondensatorduplikaten, die im Vergleich zu anderen nicht essentiellen Duplikaten tendenziell zentraler sind (Abbildung S15).


Ergebnisse

Phylogenetische Position der Stämme

Wir verwendeten die Sequenzierung des gesamten Genoms von vier Stämmen, die unterschiedliche Niveaus an Ethanoltoleranz aufweisen (Arroyo-López et al., 2010), um die Beziehung zwischen genomischen Unterschieden und Ethanoltoleranz zu untersuchen. Unsere Assemblierungs- und Annotationspipeline ermöglichte es uns, ungefähr 6.000 kodierende Sequenzen pro Genom zu extrahieren, von denen 2115 verkettete Gensequenzen gemeinsam mit anderen 38 Stämmen (Ergänzungstabelle S1), repräsentativ für verschiedene reine Abstammungslinien, beschrieben für S. cerevisiae (Liti et al., 2009) wurden verwendet, um eine Multi-Locus-ML-Phylogenie zu rekonstruieren (Abbildung 1). Als wir die Platzierung unserer Stämme betrachteten, stellten wir fest, dass Temohaya-MI26 in keiner der von uns ausgewählten Gruppen zu gruppieren scheint und eine zentrale Position im Baum aufweist. Dieser Stamm kann von einer anderen amerikanischen Population stammen, die hier nicht berücksichtigt wird, wie die kürzlich beschriebene ecuadorianische Population (Peter et al., 2018). Die Weinsorten (T73 und die beiden flor Stämme) geclustert mit Wein/europäischen Stämmen, aber innerhalb von zwei Schwester-Clades. Genauer gesagt, die flor Stämme GBFlor-C und CECT10094 Gruppe mit EC1118 und T73 in der anderen Klade, die Weinstämme enthält. Die Position von EC118 stimmt mit früheren Ergebnissen (Coi et al., 2017) überein, die beschreiben, dass der Stamm EC1118 mit flor Stämme, die eine Subpopulation unter Wein/europäischen Stämmen bilden. Da EC1118 eng mit hoch ethanoltoleranten Stämmen verwandt war und eine mittlere Toleranz zeigte, verwendeten wir veröffentlichte Genomdaten dieses Stamms für weitere Analysen.

Abbildung 1. Phylogenie von S. cerevisiae Stämme unterschiedlicher Herkunft. Multilocus Maximum-Likelihood-Baum mit 47 Stämmen, die für verschiedene Kladen repräsentativ sind. Gelb: Asiatisch/Sake, Grün: Amerikanisch/Eiche, Braun: Westafrikanisch, Orange: Malaysisch, Blau: Wein/Europäisch, Rot: Labor. Dehnungsreferenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 zu finden.

Heterozygotie-Level unterscheiden sich zwischen Stämmen

Die Häufigkeit der sexuellen Fortpflanzung und Auskreuzung in S. cerevisiae hat einen großen Einfluss auf die Heterozygotie, was auf Unterschiede im Lebensstil zwischen Stämmen hinweisen kann. Wir haben hier die Heterozygotie-Niveaus bewertet, indem wir die Anzahl der heterozygoten Positionen in den kodierenden Regionen der untersuchten Stämme berechnet haben. Es werden große Unterschiede zwischen den Stämmen gefunden (Ergänzungstabelle S2). Temohaya-MI26 hat mit 2433 heterozygoten Positionen im Genom die niedrigste Heterozygotie. T73 und GBFlor-C haben 4586 bzw. 3094 heterozygote Positionen. EC1118 und CECT10094 weisen jedoch mit 12983 bzw. 13789 heterozygoten SNPs im Genom die höchsten Heterozygotieniveaus auf, was einem Mittelwert von zwei SNPs pro Gen in ihren Genomen entspricht. Interessanterweise wird kein Zusammenhang zwischen Ethanoltoleranz und Unterschieden in der Heterozygotie beobachtet.

Im Allgemeinen waren heterozygote SNPs einheitlich entlang des Genoms vorhanden, obwohl mehrere Fälle von Verlust der Heterozygotie (LOH) beobachtet wurden (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S1). Diese Ereignisse betrafen große Chromosomenteile, meist einschließlich der Chromosomenenden.

Figur 2. Genomstruktur der Stämme. Linkes Feld: SNP-Frequenzen entlang des Genoms. Die Häufigkeitsverteilung zeigt die verschiedenen vorhandenen Ploidien und Aneuploidien. Rechtes Feld: Lesen Sie die Tiefe nach Chromosomen, geglättet durch den Mittelwert in 10-kb-Fenstern, bestätigen Sie die Aneuploidie von Chromosom III sowohl in GBFlor-C als auch CECT10094 und die Chromosom XII-Trisomie in CECT10094.

Um mögliche Gene zu identifizieren, die an der Ethanoltoleranz beteiligt sind, suchten wir nach nicht-synonymen SNPs, die nur in den beiden hoch ethanoltoleranten Stämmen CECT10094 und GBFlor-C fixiert waren. Aufgrund der Heterozygotie und der phylogenen Verwandtschaft, die diese Stämme mit EC1118 aufweisen, wurden nur sieben Aminosäureänderungen fixiert und exklusiv für beide Stämme (Tabelle 1). Diese befinden sich in Proteinen, die von sechs Genen kodiert werden: CUZ1, GCY1, RPN7, KAR3, DPB2, und ATG13. Mit Ausnahme von CUZ1 und GCY1, diese Gene befanden sich auf dem rechten Arm von Chromosom XVI, der von einem LOH-Ereignis betroffen war, das CECT10094 und GBFlor-C teilen. Interessant, CUZ1 und RPN7 sind zwei Gene, die mit Ubiquitin- und Proteasom-Signalwegen in Verbindung stehen, die wichtige Prozesse bei der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase und dem Abbau ungefalteter Proteine ​​sind. Beide Prozesse könnten mit dem Vorhandensein von Aneuploidien in den untersuchten Stämmen und ihrer Ethanoltoleranz in Verbindung gebracht werden, wie unten diskutiert.

Tabelle 1. Gene, die von nicht-synonymen Veränderungen betroffen sind, ausschließlich CECT10094 und GBFlor-C.

Hoch ethanoltolerante Stämme teilen Chromosom III-Aneuploidie

Die meisten Stämme von S. cerevisiae sind diploide, aber es wurde gezeigt, dass industrielle Stämme, die mit menschenbezogenen Umgebungen verbunden sind, unterschiedliche Ploidiegrade aufweisen (Gallone et al., 2016 Peter et al., 2018). Wir bewerteten die Ploidie unserer Stämme durch Durchflusszytometrie und stellten fest, dass T73, CECT10094, EC1118 und Temohaya-MI26 diploide waren. Der zytometrische Durchschnitt der Triplikate im Vergleich zu einem bekannten diploiden war jeweils: 2,117 ± 0,029, 2,200 ± 0,030, 2,196 ± 0,029, 2,218 ± 0,027 (Ergänzungstabelle S3). Im Gegensatz dazu erwies sich GBFlor-C als triploider Stamm (3,510 ± 0,055) (Ergänzungstabelle S3).

Eine andere Methode zur Bestätigung des Ploidiezustands besteht darin, die heterozygote SNP-Häufigkeitsverteilung entlang des Genoms zu verwenden (Abbildung 2, linkes Feld). Die diploiden und heterozygoten Stämme zeigten eine SNP-Häufigkeitsverteilung von etwa 0,5, was ihren diploiden Zustand bestätigt. Ebenso zeigte GBFlor-C, das triploid ist, eine typische SNP-Häufigkeitsverteilung um 0,33 und 0,66. Da Temohaya-MI26 vollständig homozygot ist, konnte der Ploidiezustand mit dieser Methode nicht bestätigt werden.

Eine schnelle Anpassung an eine stressige Umgebung kann durch groß angelegte genomische Umlagerungen vorangetrieben werden. Unter diesen finden Aneuploidien als potenzieller Treiber der Anpassung von industrieller Bedeutung in S. cerevisiae (Gorter de Vries et al., 2017). Wir überprüften das Vorhandensein von Aneuploidien auf zwei Arten: Änderungen der Lesetiefe zwischen den Chromosomen und Änderungen der Häufigkeit heterozygoter SNPs im Vergleich zur Gesamthäufigkeitsverteilung des Genoms (Abbildung 2). Interessanterweise waren die Stämme mit der höchsten Ethanoltoleranz, CECT10094 und GBFlor-C, Aneuploide. CECT10094 hatte eine zusätzliche Kopie der Chromosomen XII und III, und GBFlor-C zeigte auch eine zusätzliche Kopie von Chromosom III. Da die Chromosom-III-Polisomie zwischen diesen beiden Stämmen mit unterschiedlichem ploidie Hintergrund geteilt wurde, untersuchten wir weiter, ob dies von Bedeutung sein könnte, um ihre höhere Ethanoltoleranz zu erklären.

Die Expression von Chromosom III nimmt mit Ethanol-Stress zu

Eine höhere Kopienzahl eines Chromosoms ist mit einer höheren Expression der Gene in diesem Chromosom verbunden (Torres et al., 2007). Wir fragten, ob in diesem Fall die höhere Expression von Chromosom III mit der Ethanoltoleranz zusammenhängen könnte. Wir verwendeten transkriptomische Daten aus einer früheren Studie (Navarro-Tapia et al., 2016), um die Bedeutung der Chromosomenexpression für die Ethanoltoleranz zu beleuchten. Kurz gesagt wurde der Stamm mit der niedrigsten und höchsten Ethanoltoleranz einer Reihe von Stämmen aus verschiedenen Isolationsquellen (Temohaya-MI26 bzw. CECT10094) ausgewählt und ihre RNA wurde nach 1 oder 10 h Wachstum unter zwei Bedingungen extrahiert: nach a 10% Ethanolschock oder ohne Stress. Die Gene wurden nach Chromosomen gruppiert, um ihren globalen Beitrag zum Expressionsprofil der verschiedenen Bedingungen zu zeigen (Abbildung 3). Der Beitrag jedes Chromosoms zum vollständigen Transkriptom der einzelnen Stämme war unterschiedlich, aber hier konzentrierten wir uns auf Chromosom III aufgrund seiner Aneuploidie in den stark ethanoltoleranten Stämmen. Ohne Ethanolstress zeigte Chromosom III eine signifikant höhere Expression nach 1 h Wachstum im Vergleich zu anderen Chromosomen in CECT10094, aber nicht in Temohaya-MI26. Nach 10 h Wachstum ist die globale Expression von Chromosom III in beiden Stämmen und unter beiden Wachstumsbedingungen hochreguliert. Eine Stunde nach Ethanol-Stress ist Chromosom III jedoch sowohl in Temohaya-MI26 als auch in CECT10094 signifikant hochreguliert. Bei Temohaya-MI26 ist Chromosom III das am stärksten überexprimierte Chromosom im Genom nach kurzer Ethanolexposition. Somit könnte das hier beobachtete Expressionsmuster mit einer höheren Expression in CECT10094 aufgrund der Aneuploidie in Verbindung gebracht werden. Darüber hinaus stimmt die Änderung des Expressionsbeitrags von Chromosom III in Temohaya-MI26 nach einem Ethanolschock mit dem Vorhandensein mehrerer Gene im Chromosom überein, die zur Ethanolstressantwort beitragen, selbst in dem wenig ethanoltoleranten Stamm.

Figur 3. Transkriptionsreaktion auf Ethanol auf chromosomaler Ebene. (EIN) Expressionsfaltenänderung von CECT10094 im Vergleich zum Pool bei 1 und 10 h Wachstum mit 0 und 10 % Ethanolstress. (B) Expressionsfaltenänderung für Temohaya-MI26. Statistik Wilcoxon-Test bei allen Gruppen: kA: P > 0,05, ∗ P < 0,05, ∗∗ P < 0,01, ∗∗∗ P < 0,001, ∗∗∗∗ P < 0,0001. Bedeutungssymbole sind rot gefärbt, wenn das Chromosom hochreguliert ist und blau, wenn es herunterreguliert ist.

Chromosom-III-Aneuploidien beeinflussen das Wachstum auf Ethanol in verschiedenen Hintergründen

Mehrere Studien zeigten, dass Aneuploidien unter bestimmten Bedingungen von Bedeutung sein könnten (Gorter de Vries et al., 2017). Insbesondere die Variation der Chromosom-III-Kopienzahl war mit einer höheren Hitzetoleranz verbunden (Yona et al., 2012) und wurde in Ethanol-Anpassungsexperimenten dupliziert (Voordeckers et al., 2015). In einer aktuellen Studie (Peter et al., 2018) wurden mehr als 1000 S. cerevisiae Stämme wurden unter verschiedenen Bedingungen sequenziert und phänotypisiert. Hier verwendeten wir den Phänotyp bei 15% Ethanolstress und die Ploidie- und Aneuploidie-Informationen und gruppierten die Stämme, um nach Unterschieden in der Ethanolstresstoleranz in einem breiteren genetischen Hintergrund zu suchen (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung S2). Die meisten Ploidien und Chromosomenkopienzahlen zeigten keine großen Unterschiede im Vergleich zu diploiden Stämmen, die eine perfekte Euploidie aufwiesen. Da die Gruppen unterschiedlich groß sind und viele Faktoren an der Ethanoltoleranz beteiligt sind, sind Unterschiede schwer zu erkennen. Bei Diploiden zeigte die Zahl der Chromosom-III-Kopien jedoch einen spezifischen Trend (Abbildung 4). Stämme, denen eine der Chromosomenkopien fehlte, waren in Bezug auf den Kontrollzustand signifikant schlechter als Diploide, die auf 15% Ethanol wuchsen. Wenn die Anzahl der Kopien von Chromosom III zunimmt, ist die gezeigte relative Wachstumsrate höher. Stämme mit einer zusätzlichen Kopie waren besser als die Euploiden mit zwei Kopien und diese besser als monosomen Stämme mit einem einzigen Chromosom III.

Figur 4. Relative Wachstumsrate von 1011 Stämmen auf 15% Ethanol. Die relative Wachstumsrate ist das Verhältnis zwischen dem Wachstum des Stamms auf YPD bei 30ଌ und dem Wachstum auf 15% Ethanol. Die Stämme werden nach ihrer Ploidie und dem Vorhandensein verschiedener Aneuploidien gruppiert. In dieser Abbildung sind nur Diploide dargestellt, alle anderen Ploidien sind in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt. Chr III +1, Chr III +2 und Chr III-1 markiert enthalten eine zusätzliche Kopie, zwei zusätzliche Kopien und eine Kopie weniger von Chromosom III, bzw. können andere Aneuploidien aufweisen. “OAndere Aneuploidien”-Gruppe sind Stämme, die verschiedene Arten von Aneuploidien aufweisen, jedoch nicht auf Chromosom III, und 𠇎uploiden” haben keine Aneuploidie. Bedeutung ist Wilcoxon gepaart mit diploiden euploiden Stämmen als Referenz (ns: P > 0,05, ∗ P < 0,05, ∗∗ P < 0,01, ∗∗∗ P < 0,001, ∗∗∗∗ P < 0,0001). Originaldaten wurden von Peter et al. (2018).

Das Entfernen der zusätzlichen Kopie von Chromosom III wirkt sich stark auf die Ethanoltoleranz aus

Um zu bestätigen, dass die Aneuploidie auf Chromosom III die Ethanoltoleranz der Stämme direkt beeinflusst, haben wir die zusätzliche Kopie aus dem Genom entfernt (siehe Abschnitt Materialien und Methoden), wodurch die Stämme in den euploiden Zustand zurückversetzt werden. Leider konnten wir mit dem verwendeten experimentellen Ansatz keinen modifizierten Stamm von CECT10094 und GBFlor-C erhalten. Wir verwendeten daher einen im Labor entwickelten Stamm (2-200-2), der von Voordeckers et al. (2015). Diese Autoren entwickelten sechs prototrophe, isogene S. cerevisiae Stämme unterschiedlicher Ploidie (1n, 2n und 4n), die alle aus den haploiden FY5-Stämmen des S288C-Derivats in Chemostaten mit steigenden Ethanolkonzentrationen (bis zu 12%) während 200 Generationen generiert wurden. Die haploiden und tetraploiden Linien zeigten eine schnelle Konvergenz in Richtung eines diploiden Zustands, und am Ende des Experiments waren alle entwickelten Klone sehr tolerant gegenüber Ethanol, und die meisten von ihnen teilten sich den Erwerb einer zusätzlichen Kopie von Chromosom III, obwohl andere spezifische Aneuploidien waren auch in einigen Klonen vorhanden. Der entwickelte Klon 2-200-2 ist ein von Haploiden abgeleiteter Diploid mit einer Chromosom-III-Trisomie. Da dieser weiterentwickelte Laborklon diese genomische Funktion mit unserem teilte flor Stämme, wurde es in einem Experiment verwendet, um zu testen, ob seine Ethanoltoleranz nach der Entfernung seiner zusätzlichen Chromosom-III-Kopie unter Verwendung der Integration eines Selektions-/Gegenselektionsmarkers rückgängig gemacht wurde.

Wir haben zuerst die Kopienzahl von Chromosom III im Stamm 2-200-2 und im modifizierten Stamm 2-200-2-S4 durch qPCR bestimmt, um die Entfernung der zusätzlichen Kopie zu bestätigen. Wir verwendeten Primer für drei entlang des Chromosoms verteilte Gene und verglichen die Chromosomendosis mit Referenzgenen AKT 1 und YFR057W von Chromosom VI. Die Ergebnisse zeigten, dass 2-200-2-S4 für jedes der getesteten Gene eine zusätzliche Kopie des Chromosoms III verloren hatte, was zu einer Genkopienzahl nahe 2 führte (1,99 ± 0,31 für ARE1, 2,14 ± 0,28 für YCL001W-A und 2,06 ± 0,20 für POF1).

Nach Entfernen der zusätzlichen Kopie von Chromosom III testeten wir das Wachstum der Stämme 2-200-2 und 2-200-2-S4 auf GPY mit unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen (Abbildung 5). Der Stamm 2-200-2, der drei Kopien von Chromosom III besitzt, konnte sogar bei einer Ethanolkonzentration von 14% wachsen. 2-200-2-S4, bei dem die zusätzliche Kopie des Chromosoms III entfernt wurde, konnte auf 10 % Ethanol-Medium nicht wachsen.

Abbildung 5. Das Entfernen der Aneuploidie auf Chromosom III verringert die Ethanoltoleranz. Tropfentest-Assays der Stämme 2-200-2 und 2-200-2-S4 in Ethanolplatten.Die Platten wurden 10 Tage bei 28ଌ inkubiert. 2-200-2 hatte drei Kopien von Chromosom III und 2-200-2-S4 hatte zwei Kopien. Das Entfernen der Aneuploidie beeinflusst die Ethanoltoleranz.


Danksagung

Wir danken Stefania Kapsetaki, Guy Cooper, Jacobus Boomsma und zwei anonymen Gutachtern für Kommentare.

Glossar

Wenn mehrere einzelne Zellen in Kontakt sind. Dazu gehören Zellen, die vorübergehend durch die Produktion einer klebrigen Substanz zusammenkleben, koordinierte Zellgruppen, die kooperatives Verhalten wie die Produktion öffentlicher Güter zeigen, und obligate Zellgruppen, die mehrzellige Organismen bilden, wie wir sie bei Tieren und Pflanzen sehen.

Wenn einzelne Zellen obligatorisch Teil eines vielzelligen Körpers sind und außerhalb des vielzelligen Körpers nicht überleben und sich vermehren können. Obligate Multizellularität ist entwicklungsbedingt und keine Reaktion auf Umweltbedingungen.

Wenn einzelne Zellen als Reaktion auf Umweltbedingungen Teil eines vielzelligen Körpers werden und dann wieder einzellig werden können. Sie sind nicht darauf angewiesen, vielzellig zu sein, um zu überleben und sich zu vermehren. Die fakultative Multizellularität umfasst sowohl einfache Formen, bei denen Zellen aneinander kleben, um einen Klumpen zu bilden (z. B. einige bakterielle Biofilme) als auch komplexere Formen mit differenzierten Zellen (z. B. Schleimpilze und Ciliaten).

Ein großer evolutionärer Übergang in der Individualität tritt ein, wenn einzelne Einheiten (z.

Eine obligat vielzellige Spezies, die einen großen evolutionären Wandel in der Individualität durchgemacht hat.


Regulation des Sekundärstoffwechsels

Fuselalkohole

Fuselalkohole sind die am häufigsten während der Fermentation gebildeten flüchtigen Komponenten und tragen zu essentiellen Aroma- und Geschmacksstoffen in fermentierten Getränken und Lebensmitteln bei (Hazelwood et al. 2008). Fuselalkohole umfassen Propanol, Isoamylalkohol, Isobutanol, aktiver Amylalkohol, 2-Phenylethanol und Tyrosol (Swiegers und Pretorius 2005). Fuselalkohole bilden sich über den Ehrlich-Weg oder über den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel (Abbildung 2A). Der erste Schritt im Ehrlich-Weg ist eine Transaminierungsreaktion zwischen einer Aminosäure und 2-Oxoglutarat (Sentheshanmuganathan 1960). Der Transaminierungsschritt wandelt die Aminosäure in eine α-Ketosäure um, die auch durch den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel geliefert werden kann (Sentheshanmuganathan 1960). Anschließend katalysieren multiple Pyruvatdecarboxylasen die Umwandlung der α-Ketosäure in einen verzweigtkettigen Aldehyd (Sentheshanmuganathan 1960). Schließlich katalysiert eine Alkoholdehydrogenase den NADH-abhängigen letzten Schritt, der den Aldehyd zu einem Fuselalkohol reduziert (Abbildung 2A) (Hazelwood et al. 2008). Nicht alle Enzyme, die an der Katalyse dieses Stoffwechselweges beteiligt sind, sind bekannt. Eine der Schwierigkeiten bei der Aufklärung spezifischer Proteine, die für die Fuselalkoholproduktion notwendig sind, ist ein hohes Maß an Redundanz im Hefegenom. Das Vorhandensein mehrerer Aminotransferase-, Decarboxylase- und Alkoholdehydrogenasegene stellt traditionelle genetische Ansätze zur Untersuchung der Fuselproduktion vor Herausforderungen.

Stoffwechselwege, die zur Bildung von Aromastoffen führen (Carrau et al. 2005) produziert von Saccharomyces cerevisiae während der Gärung. (EIN) Der Fuselalkohol-Weg (über den Ehrlich-Weg) wandelt eine Aminosäure in mehreren Schritten in einen Alkohol um. Die Aminosäuren in diesem Stoffwechselweg umfassen Leucin (L), Valin (V), Isoleucin (I), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y) und Tryptophan (W). (B, C) Die Bildung von Estern erfordert einen Alkohol. Der Alkohol kann entweder Ethanol oder ein Fuselalkohol sein. (B) Der Acetatester-Weg. (C) Der Ethylester-Syntheseweg. (D) In-vivo-Synthese von Monoterpenen über den Mevalonat-Weg. Rote Kästchen: flüchtige Aromastoffe.

Fuselalkohole können je nach Konzentration eine positive oder negative sensorische Wirkung haben. Fuselalkoholkonzentrationen von 400 mg/L oder mehr können im Wein zu einem scharfen, lösungsmittelähnlichen Aroma führen, während Konzentrationen von weniger als 300 mg/L oft als wünschenswerte fruchtige Eigenschaften beschrieben werden (Swiegers und Pretorius 2005). In Apfelwein tragen hohe Konzentrationen von Fuselalkoholen, insbesondere 2-Phenylethanol, wesentlich zum typischen Apfelweingeschmack bei (Beech 1972). Propanol, Butanol und Isobutanol werden als alkoholisch riechend beschrieben, während aktiver Amylalkohol und Isoamylalkohol als marzipanartig oder bananenartig beschrieben werden (Lambrechts und Pretorius 2000). Tyrosol und 2-Phenylethanol verleihen honigartige bzw. blumige Aromen (Lambrechts und Pretorius 2000). Fuselalkohole verleihen in geeigneten Konzentrationen eine günstige Komplexität und dienen auch als Vorläufer für die Bildung von Acetatestern.

Acetat und Ethylester

Ester tragen zu den blumigen und fruchtigen Eigenschaften von Wein und Bier bei und werden durch die Veresterung von Alkohol und Säuren bei niedrigem pH-Wert erzeugt (Saerens et al. 2010). Die Reaktion erfordert ein Alkoholmolekül, Acetyl-CoA, ein Ester synthetisierendes Enzym und Adenosintriphosphat (ATP Abbildung 2B und 2C) (Saerens et al. 2010). Sowohl die Produktion als auch der Abbau von Estern sind streng reguliert.

Die beiden bei der Fermentation entstehenden Estertypen sind Acetat- und Ethylester. Acetatester resultieren aus der Veresterung von Acetyl-CoA und einem Alkohol (Abbildung 2B). Diese Acetate umfassen Ethylacetat, Isoamylacetat, 2-Methylbutylacetat und Phenylethylacetat und werden als Bananen-, Apfel-, Frucht- bzw. aromatische Süße beschrieben (Saerens et al. 2010). Ethylacetat ist der häufigste Acetatester in Fermentationen, vor allem wegen der großen Mengen an Ethanol bei diesen Stoffwechselprozessen und der reaktiveren Natur primärer Alkohole (Saerens et al. 2010).

Die Regulation der Acetatesterproduktion wird hauptsächlich durch die Expression von zwei Alkoholacetyltransferasen (AATase), Atf1p und Atf2p (Abbildung 2B) gesteuert (Yoshimoto et al. 1998). Atf1p hat die größte AATase-Aktivität und führt mehrere Kopien von ein ATF1 in Laborstämme führt zu einer erhöhten Produktion von Acetatestern (Verstrepen et al. 2003). Im Gegensatz dazu verringert die Deletion von Atf1p die Acetatesterkonzentration signifikant (Verstrepen et al. 2003). Die Herstellung von Acetatestern ist ebenfalls substratabhängig, abhängig von der Verfügbarkeit von Fuselalkoholen (Lilly et al. 2006).

Die zweite Gruppe, die Ethylester, bestehen aus Ethanol und einer mittelkettigen Fettsäure (MCFA) (Abbildung 2C) (Saerens et al. 2010). Ethylester umfassen Ethylbutanoat, Ethylhexanoat, Ethyloctanoat und Ethyldecanoat (Saerens et al. 2010). Diese Ethylester unterscheiden sich in ihren sensorischen Eigenschaften, aber Beschreibungen umfassen Apfel, Obst, Erdbeere, Birne und Anis (Saerens et al. 2010). Während der späten exponentiellen Wachstumsphase werden MCFA-Zwischenprodukte vorzeitig aus dem zytoplasmatischen Fettsäure-Synthase (FAS)-Komplex freigesetzt, und diese Freisetzung löst die Estersynthese aus (Taylor und Kirsop 1977). Die MCFAs werden durch Coenzym A aktiviert und in Verbindung mit ATP, Ethanol und Enzymen verestert (Abbildung 2C) (Saerens et al. 2010).

Experimentelle Beweise weisen auf drei Regulationswege hin, die für die Freisetzung von MCFAs und die anschließende Produktion von Ethylestern verantwortlich sind: (1) verminderte Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase (2) Hochregulation der Fettsäurebiosynthesegene FAS1, FAS2, EEB1, und EHT1 und (3) Konzentrationen von MCFAs (Saerens et al. 2006, Dufour et al. 2008). Die Hemmung der Acetyl-CoA-Carboxylase initiiert die Freisetzung von MCFAs aus dem FAS-Komplex (Dufour et al. 2008). Löschung von EEB1 und EHT1 verringert die Produktion von Ethylestern, eine Überexpression beider Enzyme führt jedoch nicht zu einer Erhöhung dieser Ester (Saerens et al. 2006). Mehrere Gene sind an der Produktion und dem Abbau von Estern beteiligt, jedoch wurden noch keine direkten Verbindungen zwischen Vorläufern, Enzymaktivität, Substratkonzentration und Esterproduktion identifiziert, insbesondere nicht für Ethylester.

Carbonyle: Diacetyl

Diacetyl wird mit einem toastigen, butterscotch- und nussigen Aroma beschrieben, aber in hohen Konzentrationen riecht es nach ranziger Butter (Swiegers und Pretorius 2005). Hefezellen können während der Gärung in Wein Diacetyl synthetisieren, Diacetyl wird jedoch überwiegend von Milchsäurebakterien produziert (Laurent et al. 1994). Diacetyl wird extrazellulär durch chemisch getriebene Decarboxylierung von α-Acetolactat gebildet. α-Acetolactat wird als Zwischenprodukt im 2-Ketoisovalerat-Weg synthetisiert oder von Ilv2p aus Acetaldehyd hergestellt (Abbildung 1) (Suomalainen und Ronkainen 1968). Diacetyl wird anschließend in Acetoin umgewandelt, gefolgt von der Umwandlung von Acetoin in 2,3-Butandiol, die beide eine höhere sensorische Schwelle und damit weniger sensorische Wirkung haben (Swiegers und Pretorius 2005).

Schwefelverbindungen

Schwefelhaltige Verbindungen haben eine sehr niedrige sensorische Nachweisschwelle und werden oft mit einem Kohl-, Faulenei- oder Zwiebelaroma beschrieben (Rauhut 1993). Es gibt fünf Kategorien von Schwefelverbindungen: Sulfide, Polysulfide, Thiole, Thioester und heterocyclische Verbindungen (Rauhut 1993). Aromatische Schwefelverbindungen stammen aus schwefelhaltigen Fungiziden oder aus dem Abbau schwefelhaltiger Aminosäuren während der Fermentation, jedoch sind die dafür verantwortlichen Reaktionswege noch nicht vollständig aufgeklärt (Rauhut 1993).

Schwefelwasserstoff (H2S) trägt zu einer der primären Schwefel-Off-Notes bei, die während der Fermentation durch den Sulfat-Reduktions-Sequenzweg produziert wird. Dabei wird Sulfat über eine Sulfatpermease (Sul1p oder Sul2p) aus dem externen Medium aufgenommen und über Met5p bzw. Met10p zu Sulfit und dann zu Sulfid reduziert (Rauhut 1993, Spiropoulos und Bisson 2000). In Gegenwart von nicht limitierenden Cystein- oder Methioninkonzentrationen verbindet sich Sulfid mit Ö-Acetylserin oder Ö-Acetylhomoserin zur Bildung von Homocystein (Swiegers und Pretorius 2005). Unter Methionin- und Cystein-limitierten Bedingungen Ö-Acetylserin und Ö-Acetylhomoserin sind ebenfalls begrenzt, was zu einem Überschuss an Sulfid führt, das in H . umgewandelt wird2S (Thomas und Surdin-Kerjan 1997).

Die landwirtschaftliche Nutzung von elementarem Schwefel, Pantothenatmangel und hohe Konzentrationen von Threonin können ebenfalls H . beeinflussen2S-Produktion während der Fermentation (Spiropoulos und Bisson 2000). Schwefelwasserstoff ist sehr reaktiv, was oft zu zusätzlichen Fehlnoten im Wein führt. Eine der häufigeren Off-Notes, die als Ergebnis von H . erzeugt werden2S-Reaktivität ist Ethanthiol, das gebildet wird, wenn H2S reagiert mit Ethanol (Spiropoulos und Bisson 2000). Schwefelwasserstoff kann durch Kupferstrippen oder Stickstoffbelüftung aus Wein entfernt werden, aber diese Behandlungen können auch wertvolle Aromastoffe entfernen (Swiegers und Pretorius 2005).

Im Gegensatz zu anderen Schwefelverbindungen haben flüchtige Thiole vorteilhafte Aromaeigenschaften. Die Aromen flüchtiger Thiole werden als Buchsbaum, Passionsfrucht, Schwarze Johannisbeere oder Grapefruit beschrieben (Tominaga et al. 1998). Diese Verbindungen sind oft S-Cystein- oder Glutathion-gebunden in Trauben oder Hopfen und werden während der Gärung freigesetzt (Tominaga et al. 1998). Irc7p und Str3p spalten die Kohlenstoff-Schwefel-Bindung zwischen Cystein und Thiol, um das Aroma freizusetzen (Abbildung 1) (Tominaga et al. 1998).

Die drei wirksamsten flüchtigen Thiole sind 4-Mercapto-4-methylpentan-2-on (4MMP), 3-Mercaptohexan-1-ol (3MH) und 3-Mercaptohexylacetat (3MHA). Harschet al. (2013) identifizierten (E)-2-Hexenal und seinen entsprechenden Alkohol, (E)-2-Hexen-1-ol, als Vorläufer der Bildung von 3MH (Harsch et al. 2013). Diese Arbeit zeigte das Potenzial zur Verbesserung von 3MH und 3MHA in Gegenwart eines Schwefeldonors und (E)-2-Hexenal und (E)-2-Hexen-1-ol und öffnete die Tür für die Möglichkeit, Hefe zur Steigerung der Produktion einzusetzen positiver Aromathiole (Abbildung 3) (Harsch et al. 2013).

Der vorhergesagte Weg zur Produktion der Aromathiole 3-Mercaptohexan-1-ol (3-MH) und 3-Mercaptohexylacetat (3-MHA) (nach Harsch et al. 2013). Wenn die Sechs-Kohlenstoff-(C6)-Vorläufer (E)-trans-2-Hexen-1-ol und (E)-trans-2-Hexanal ein relatives Verhältnis von mehr als eins aufweist und ein Schwefeldonor vorhanden ist, wird die Reaktion angetrieben, um 3-MH und 3-MHA zu erzeugen. Wenn die Fermentation beginnt, setzen Hefezellen das Aroma Thiol frei. 3-MH Acetylierung von 3-MH führt zu 3-MHA.

Terpenoide

Terpenoide sind eine Klasse von Aromastoffen, die sortentypische Merkmale in Obst und Hopfen definieren und Aromen erzeugen, die als Rose, Geranie und Blumen beschrieben werden (Swiegers und Pretorius 2005). Terpenoide sind wesentliche Geschmackskomponenten in vielen kommerziellen Produkten, darunter Wein, Bier, Lebensmittelzusatzstoffe, Parfüms und Kosmetika. Die Optimierung der Produktion flüchtiger Terpene während der Hefefermentation ist ein wichtiges Ziel der industriellen Fermentation.

Monoterpenoide werden von der Vorstufe Geraniolpyrophosphat (GPP) in Pflanzen und einigen Pilzen produziert (King und Richard Dickinson 2000). Vitis vinifera (Weinreben) und Humulus lupulus (Hopfen) synthetisieren Monoterpenoide wie Geraniol, Linalool, Nerol und Citronellol (Swiegers und Pretorius 2005). Terpenoide kommen sowohl in freier als auch in gebundener Form vor, wobei die gebundene Form häufiger vorkommt (Swiegers und Pretorius 2005). Hefe-Glycosidase-Enzyme setzen diese Aromastoffe während der Fermentation frei und verflüchtigen sich (Abbildung 1) (Gunata et al. 1988).

Die enzymatische Freisetzung von Monoterpenen ist ein ein- oder zweistufiger Prozess, je nachdem, welcher Zucker an das Vorläuferglucosid (d. h. ein Mono- oder Disaccharid) gebunden ist (Gunata et al. 1988). Bei Disaccharidglykosiden beinhaltet der erste Schritt die Freisetzung des endständigen Zuckers über eine Arabinofuranosidase, Rhamnopyranosidase oder Apiofuranosidase, gefolgt von einer β-Glucosidase-Spaltung, die das Terpenoid freisetzt (Gunata et al. 1988). Weinstämme, die das Zellwandprotein Exg1p überexprimieren, produzieren sowohl in synthetischen Medien als auch in Traubenmost erhöhte Terpene (Gil et al. 2005).

Die Terpenoidproduktion wurde jedoch hauptsächlich der Hydrolyse von glykosidischen Bindungen zugeschrieben. S. cerevisiae ist in der Lage, Monoterpene über den Mevalonsäure-Weg zu produzieren (Abbildung 2D). Carrauet al. (2005) hat gezeigt, dass S. cerevisiae und Hanseniaspora uvarum kann Terpene in chemisch definiertem Medium produzieren, dem Traubensaft, Terpene und Glykokonjugate fehlen. Diese Arbeit ergab, dass Linalool und α-Terpineol von S. cerevisiae unter mikroaeroben und hochassimilierbaren Stickstoffbedingungen in synthetischen Medien. Carrauet al. (2005) haben einen alternativen Weg für die Monoterpen-Synthese vorhergesagt (Abbildung 2D). In diesem Weg werden die Monoterpene de novo in den Mitochondrien gebildet und mit dem Leucin-Katabolismus und einer neuartigen GPP-Synthase verbunden. Ein Zusammenhang zwischen dem Leucin-Katabolismus und dem Isoprenoid-Stoffwechsel wurde im Pilz untersucht und nachgewiesen Aspergillus nidulans, die diesem alternativen Weg Vorrang gibt (Rodríguez et al. 2004).


Resultate und Diskussionen

Aufbau eines Xylose-Verwertungsweges in einem Fettalkohol produzierenden Stamm

Um das auf Xylose basierende 1-Hexadecanol herzustellen, führten wir zunächst den pilzlichen Xylose-Verwertungsweg [29] in eine 1-Hexadecanol-produzierende . ein S. cerevisiae Stamm, XF3 [10] (Abb. 1). Der Xylose-Verwertungsweg wurde aus unserer vorherigen Studie ausgewählt [29], die eine XR von Candida shehatae, ein XDH aus Candida Tropicalis und ein XKS von Pichia pastoris. Der XF3-Stamm produzierte 1-Hexadecanol mit über 1,1 g/l aus Glucose in S. cerevisiae wie in unserer vorherigen Studie berichtet [10]. Die 1-Hexadecanol-Produktion in XF3 wurde durch heterologe Expression eines FAR aus Schleiereulen erreicht, wobei Acetyl-CoA-Carboxylase überexprimiert wurde (ACC1 Gen), einen negativen Regulator auszuschalten, RPD3 Gen, bei der Phospholipid-Synthese und überexprimierenden ATP-Citrat-Lyasen (ACL1 Gen und ACL2 Gen) von Yarrowia lipolytica zur Verbesserung der Versorgung mit zytosolischem Acetyl-CoA (Abb. 1a). Durch die Einführung des pilzlichen Xylose-Verwertungswegs in den XF3-Stamm haben wir erfolgreich a S. cerevisiae Stamm (XF3XP), um das 1-Hexadecanol aus Xylose als einzige Kohlenstoffquelle mit 0,4 g/l herzustellen (Tabelle 2). Der auf Xylose basierende Fettalkoholtiter war niedriger als der auf Glucose basierende 1-Hexadecanol-Titer [10] und nur 15 g/l Xylose wurden verbraucht, um 1-Hexadecanol zu produzieren, was darauf hindeutet, dass die Xyloseverwertung ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt für Fettalkohol sein könnte Produktion. Wir haben auch einen anderen pilzlichen Xylose-Weg eingeführt, bei dem die Promotorstärken von XR, XDH und XKS zuvor optimiert wurden, um die Ethanolproduktion auf Xylosebasis zu steigern (XF3XPi, Tabelle 2). Wir fanden, dass, obwohl die 1-Hexadecanol-Produktion auf 0,48 g/l gesteigert werden konnte, die Xylose-Verwertung noch schlechter war als beim Wildtyp-Weg mit weniger als 5 g/l verbrauchter Xylose. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass der Regulierungsmechanismus von S. cerevisiae zur Kontrolle der Fettalkoholproduktion auf Xylosebasis unterschied sich von der zur Kontrolle der Ethanolproduktion auf Xylosebasis. Daher ist das Metabolic Engineering von S. cerevisiae für die Biokraftstoffproduktion ist zielspezifisch.

Promotor-Engineering zur Verbesserung der 1-Hexadecanol-Produktion aus Xylose

Um die 1-Hexadecanol-Produktion weiter zu verbessern, haben wir einen synthetischen Biologie-Ansatz namens Customized Optimization of Metabolic Pathways by Combinatorial Transcriptional Engineering (COMPACTER) [28] implementiert, um die Genexpressionsniveaus von XR, XDH und XKS präzise zu kontrollieren. Grundsätzlich haben wir drei konstitutive Promotoren gewählt, PPDC1, PTEF1, und PENO2 um XR-, XDH- bzw. XKS-Gene zu exprimieren. Für jeden der konstitutiven Promotoren haben wir die ursprünglichen Promotoren mutiert, um eine Promotorbibliothek mit unterschiedlichen Stärken zu erstellen. Wir wählten dann Promotoren mit hoher, mittlerer und niedriger Stärke aus (Zusatzdatei 1: Abbildung S2) für PPDC1, PTEF1, und PENO2, und konstruierten insgesamt 27 synthetische Xylose-Wege (3 × 3 × 3 = 27) in S. cerevisiae mit allen Promotorkombinationen von PPDC1, PTEF1, und PENO2 mit unterschiedlichen Stärken (Abb. 1b Tabelle 1). Als nächstes verglichen wir die Wachstumsraten und 1-Hexadecanol-Titer aller rekombinanten S. cerevisiae Stämme zu denen der Kontrollstämme XF3XP (Fig. 2). Es ist erwähnenswert, dass der Zweck des kombinatorischen Promotorscreenings darin bestand, den Stamm mit der höchsten Fettalkoholproduktion aus Xylose anstelle des Stamms mit der besten Xyloseverwertung zu finden. Daher haben wir hier die Xylose-Verwertungsraten nicht gemessen. Wir stellten fest, dass die Wachstumsraten der meisten der mit Promotor konstruierten Stämme bis zu einem gewissen Grad reduziert waren und die 1-Hexadecanol-Produktion für die meisten der rekombinanten Stämme nicht signifikant verbessert wurde. Allerdings produzierten die Stämme XF3X07 und XF3X25 1-Hexadecanol um 171 und 140 % höher als die der Kontrollstämme mit einer leicht verringerten Wachstumsrate (0,073 h −1 und 0,080 h −1 ) im Vergleich zur Wachstumsrate des Kontrollstamms (0,093 .). h –1 ). Sowohl XF3X07 als auch XF3X25 verwendeten einen TEF1-Promotor mit hohem Niveau, um XDH zu exprimieren, und einen ENO2-Promotor mit niedrigem Niveau, um XKS zu exprimieren.Nichtsdestotrotz verwendete XF3X07 einen PDC1-Promotor mit niedrigem Niveau, um XR zu exprimieren, während XF3X25 einen PDC1-Promotor mit hohem Niveau verwendete. Diese Entdeckung steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigten, dass die XDH-Enzyme geschwindigkeitsbestimmende Schritte bei der Umwandlung von Xylose in Biomasse und Ethanol waren [30, 31]. Interessanterweise waren die 1-Hexadecanol-Ausbeuten auf Xylosebasis trotz des höheren Titers von 1-Hexadecanol in XF3X07 im Vergleich zu XF3XPi ähnlich in XF3XP07 und XF3XPi (P >0,1). Dies deutete darauf hin, dass das kombinatorische Promotor-Engineering hauptsächlich die Xylose-Aufnahmerate verbesserte, anstatt die Wirtswege zu optimieren, um die Umwandlung von Xylose zu 1-Hexadecanol zu verbessern.

1-Hexadecanol produziert und Wachstumsraten von technisch hergestelltem S. cerevisiae Stämme durch Promotor-Engineering. Alle Stämme wurden 48 h in SC-Xylose (4 %)-Medium kultiviert. Die Balken mit hellerer Farbe waren die Werte für den Kontrollstamm (d. h. XF3XP) mit dem Xylose-Verwertungsweg unter Verwendung der nativen Promotoren

Wir korrelierten die Stärken der Promotoren für XR, XDH und XKS mit den beiden gemessenen Parametern 1-Hexadecanol-Konzentrationen und Wachstumsraten (Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Es wurde keine Korrelation zwischen Promotorstärken und 1-Hexadecanol-Konzentrationen beobachtet. Auch fanden wir keine Korrelation zwischen den Stärken der Promotoren und den Wachstumsraten. Wir korrelierten auch 1-Hexadecanol-Konzentrationen und Wachstumsraten, fanden aber auch keine Korrelation zwischen ihnen (Zusatzdatei 1: Abbildung S4). Daher ist es nicht möglich, allein die Ergebnisse des Promotor-Screenings zu verwenden, um Vorhersagen über die Wahl von Promotoren zu treffen, die für die Xylose-basierte Produktion von 1-Hexadecanol verwendet werden sollten. Dies liegt daran, dass die Einführung von Xylose-Wegen die globale metabolische Neuverdrahtung auslösen würde, wie wir zuvor bei der Untersuchung metabolischer Reaktionen auf verschiedene Xylose-Verwertungswege mittels 13 C-Stoffwechselflussanalyse festgestellt haben [32]. Diese globale Neuverdrahtung des Stoffwechsels beinhaltet die Neuprogrammierung nicht nur des Xylose-Wegs selbst, sondern auch der nachgeschalteten Stoffwechselwege, was den Xylose-Stoffwechsel zu komplex machte, um mit der Aktivität des Xylose-Verwertungswegs selbst korreliert zu werden.

Evolutionäre Technik zur Verbesserung der 1-Hexadecanol-Produktion aus Xylose

Als nächstes wählten wir XF3X07 und XF3X25 als unsere Zielstämme für die weitere evolutionäre Entwicklung, um die 1-Hexadecanol-Produktion zu verbessern. Evolutionäre Technik ist weit verbreitet, um die Pentose-Verwertung und die Xylose-basierte Ethanolproduktion in . zu verbessern S. cerevisiae erfolgreich [33–35]. In Anbetracht der schlechten Xylose-Aufnahme in unseren gentechnisch veränderten Stämmen haben wir das evolutionäre Engineering implementiert, um zu untersuchen, ob die Fettalkoholproduktion mit dem Wachstum verbunden ist, und wenn ja, um die Xylose-basierte Fettalkoholproduktion weiter zu verbessern. Ähnlich wie bei der Untersuchung des kombinatorischen Promotor-Screenings ist es unser Ziel des evolutionären Engineerings, einen Hefestamm zu finden, der so viel wie möglich Fettalkohole aus Xylose herstellen kann. Daher haben wir die Xylose-Verwertungsraten nicht gemessen. Im Allgemeinen übertragen wir die Stämme XF3X07 und XF3X25 seriell zweimal auf synthetisches Medium mit 40 g/L Xylose. Der optimierte Stamm war nämlich die zweite Generation, die aus dem Wildtypstamm entwickelt wurde. Wir fanden heraus, dass die Wachstumsraten von zwei Stämmen allmählich zunahmen (

35 %) für jede Runde wie erwartet. Ein solcher Anstieg war jedoch mit einer verringerten 1-Hexadecanol-Produktion verbunden. Beispielsweise wurde die höchste Wachstumsrate sowohl für XF3X07 als auch für XF3X25 mit dem niedrigsten Titer an 1-Hexadecanol in der zweiten Runde erreicht (Abb. 3). Die Wachstumsraten der entwickelten Stämme in der letzten Runde wurden für XF3XP07 und XF3XP25 signifikant erhöht (P < 0,05). Die 1-Hexadecanol-Produktionen wurden jedoch nicht signifikant verändert (P > 0,05). Diese Diskrepanz zeigte, dass 1-Hexadecanol im Gegensatz zu Ethanol kein wachstumsassoziiertes Produkt war. Da evolutionäres Engineering den Mutantenstamm mit höherer Wachstumsrate selektiert, konnte die 1-Hexadecanol-Produktion aufgrund der Entkopplung zwischen der Zellwachstumsrate und der Fettalkoholproduktion nicht durch adaptive Evolution weiter verbessert werden. Darüber hinaus haben wir eine Flussbilanzanalyse angewendet, um die ATP-, NADH- und NADPH-Synthese unter verschiedenen 1-Hexadecanol-Produktionen zu berechnen (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5). Wir fanden, dass die NADPH- und ATP-Synthese positiv mit der 1-Hexadecanol-Produktion korreliert war, während sich die NADH-Synthese mit der 1-Hexadecanol-Synthese nicht allzu sehr veränderte. Insgesamt wäre der evolutionäre Engineering-Ansatz hilfreich, um das Zellwachstum und wachstumsassoziierte Produkte wie Ethanol zu verbessern, jedoch nicht für nicht-wachstumsassoziierte Produkte wie Fettsäuren-abgeleitete Chemikalien.

Evolutionäres Engineering von XF3X07 und XF3X25. 1-Hexadecanol-Produktion (ein) und Wachstumsraten (B) von XF3X07 und XF3X25 in jeder Runde wurden mit 1-Hexadecanol-Titer und Wachstumsraten von XF3X07 bzw. XF3X25 in Runde Null normalisiert

Batch- und Fed-Batch-Fermentation für die 1-Hexadecanol-Produktion

Mit XF3XP07 als unserem besten Stamm zur Herstellung von Xylose-basiertem 1-Hexadecanol haben wir als nächstes seine 1-Hexadecanol-Produktion durch Batch- und Fed-Batch-Fermentation charakterisiert. Bei der Batch-Fermentation fanden wir, dass 0,79 g/l 1-Hexadecanol aus 7,8 g/l Xylose mit einer Zellwachstumsrate von 0,073 h –1 hergestellt wurden (Tabelle 2). Dieser 1-Hexadecanol-Titer von XF3XP07 ist deutlich höher als der von XF3XP- und XF3XPi-Stamm (P < 0,05). Interessanter ist, dass wir beim Vergleich der Xyloseaufnahme von XF3XP und XF3XPi festgestellt haben, dass der XF3XP-Stamm dreimal mehr Xylose verbraucht als der XF3XPi-Stamm. Diese zusätzliche Xylose wurde hauptsächlich verwendet, um mehr Ethanol in XF3XP-Stämmen zu produzieren (Tabelle 2). Darüber hinaus haben wir die Akkumulation von intrazellulärem 1-Hexadecanol gemessen, die weniger als 5 % der extrazellulären Konzentration von 1-Hexadecanol aus der organischen Schicht betrug. Diese geringe Akkumulation stimmt mit mehreren früheren Studien überein, in denen Hefe mit einer organischen Schicht kultiviert wurde [36], obwohl auch berichtet wird, dass S. cerevisiae Stämme konnten eine große Menge an Fettalkoholen intrazellulär akkumulieren, wenn sie ohne die organische Schicht kultiviert wurden [37].

Bei der Fed-Batch-Fermentation haben wir ruhende Zellen für die Fermentation verwendet, d. h. die Zelldichte wurde auf einem hohen Niveau gehalten, um die Verwendung der Xylose zur Produktion von Biomasse zu verhindern. Obwohl die Fermentation bei hoher Zelldichte die Sauerstoffversorgung für die Fermentation einschränken könnte, was ein wichtiger Faktor für die optimale Expression der Xylose-Weg-Gene ist [38], könnte die marginale Nettowachstumsrate von Hefezellen in Fed-Batch-Prozessen wichtiger sein Fermentation, da in dieser Studie festgestellt wurde, dass die Fettalkoholproduktion nicht wachstumsassoziiert war und daher Hefezellen durch Entfernen der Biomasseproduktion als Biokatalysatoren dienen konnten, um Xylose mit hoher Effizienz in 1-Hexadecanol umzuwandeln. Wir fanden heraus, dass bei der Fed-Batch-Fermentation eine lange Lag-Phase von etwa 40 Stunden anhielt, die auf die Repression von Glucoserückständen aus dem Inokulum zurückzuführen sein könnte, da wir XF3XP und XF3XP07 mit 20 g/L Glucose kultivierten, bevor wir die Zellen in das Medium überführten mit Xylose, und daher brauchten die Zellen lange, um sich an Xylose aus Glucose zu gewöhnen (Fig. 4). Für den XF3XP-Stamm wurde 1-Hexadecanol schnell mit einem geringen Xyloseverbrauch hergestellt und erreicht

0,6 g/l 1-Hexadecanol nach 48 h (Abb. 4a). Für den XP3XP07-Stamm wurde nach der langen Lag-Phase 1-Hexadecanol schnell mit der erhöhten Xyloseaufnahme produziert und erreichte den höchsten Titer von 1-Hexadecanol bei 1,2 g/l nach 69 h ( 4b ). Wenn jedoch die Fed-Batch-Fermentation für beide Stämme fortgesetzt wurde, wurden sowohl die 1-Hexadecanol-Konzentrationen als auch die Xylose-Aufnahmeraten verringert. Die beobachtete niedrige Xylose-Verbrauchsrate, begleitet von der Abnahme von OD600 schlugen einen Hunger wegen der Unfähigkeit zur weiteren Aufnahme des Kohlenstoffsubstrats und der wahrscheinlichen Einschränkung durch andere Nährstoffe wie Stickstoff und Phosphat nach 50 h der Fermentation vor. In unserer vorherigen Studie [10] fanden wir heraus, dass Fettalkohole von S. cerevisiae, Dies könnte der Grund für die verminderte Fettalkoholproduktion sein, als die Xylose-Verwertung eingeschränkt wurde.

Fed-Batch-Fermentation der Xylose-basierten 1-Hexadecanol-Produktion durch ein XF3XP und B XF3XP07. Als einziges Nebenprodukt außer 1-Hexadecanol wurde Ethanol nachgewiesen. Schwarzes Quadrat die 1-Hexadecanol-Konzentration blaues Dreieck die Xylose verbraucht roter Punkt OD600

Beim Vergleich der auf Xylose basierenden Fettalkoholproduktion mit der auf Glucose basierenden in der vorherigen Studie wurde ein ähnlicher Titer von Fettalkohol aus der Fed-Batch-Fermentation beobachtet, was die erfolgreiche Integration des Xylose-Verwertungsweges und des Fettalkohol-Produktionsweges zeigt. Allerdings waren die Ausbeuten an Xylose-basierten Fettalkoholen sowohl in der Batch-Fermentation (0,10 ± 0,02 g/g) als auch in der Fed-Batch-Fermentation (0,08 ± 0,01 g/g) viel höher als die von Glukose-basierten (

0,03 bzw. < 0,01 g/g). Die theoretischen maximalen Ausbeuten durch diesen Produktionsweg aus Xylose und Glucose betrugen

0,35 (g/g) bzw. In diesem Fall erreichte die Ausbeute von Xylose fast ein Drittel der theoretischen Ausbeute, während die Ausbeute von Glucose nur weniger als 10 % der theoretischen Ausbeute erreichte. Die Umgehung der Ethanolproduktion bei der Fütterung von Xylose anstelle von Glucose ist wahrscheinlich auf die hohe Ausbeute an 1-Hexadecanol auf Xylosebasis zurückzuführen, das mehr Kohlenstoffe zur Verwendung in der Fettalkoholproduktion als in der Ethanolproduktion umleiten könnte.


Eine Einführung in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (allgemein bekannt als Bäckerhefe) ist ein einzelliger Eukaryont, der häufig in der wissenschaftlichen Forschung verwendet wird. S. cerevisiae ist ein attraktiver Modellorganismus, da sein Genom sequenziert wurde, seine Genetik leicht zu manipulieren ist und es im Labor sehr einfach zu pflegen ist. Da viele Hefeproteine ​​in Sequenz und Funktion denen in anderen Organismen ähneln, können an Hefe durchgeführte Studien uns dabei helfen zu bestimmen, wie ein bestimmtes Gen oder Protein in höheren Eukaryoten (einschließlich des Menschen) funktioniert.

Dieses Video bietet eine Einführung in die Biologie dieses Modellorganismus, wie er entdeckt wurde und warum Labore auf der ganzen Welt ihn als Modell ihrer Wahl ausgewählt haben. Auch frühere Studien an S. cerevisiae, die zu unserem Verständnis wichtiger zellulärer Prozesse wie Zellzyklus, Alterung und Zelltod beigetragen haben, werden diskutiert. Schließlich beschreibt das Video einige der vielen Möglichkeiten, wie Hefezellen in der modernen wissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden, einschließlich der Proteinreinigung und der Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen und anderen zellulären Prozessen im Zusammenhang mit Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten.

Verfahren

Saccharomyces cerevisiae, auch Bäckerhefe genannt, ist einer von vielen Modellorganismen, die in Labors auf der ganzen Welt untersucht werden. Da ihr Genom sequenziert wurde, ihre Genetik leicht zu manipulieren ist und sie im Labor leicht zu pflegen ist, war diese Hefeart eine unschätzbare Quelle für das Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse wie Zellteilung und Zelltod. Dieses Video gibt Ihnen einen Überblick über diesen Modellorganismus und seine vielfältigen Einsatzmöglichkeiten in der biologischen und biomedizinischen Forschung.

Hefe gehört zur Domäne Eukaryota, die aus Organismen mit membrangebundenen Kernen besteht, die als Eukaryoten bezeichnet werden. Zusammen mit Pilzen und Schimmel, S. cerevisiae gehört zu den Königreichspilzen, da eine Zellwand aus Chitin besteht, einem Polysaccharid-Polymer, das nicht nur in Pilzen, sondern auch in den Exoskeletten von Insekten und Krebstieren vorkommt.

Interessanterweise haben viele in Hefe gefundene Proteine ​​ähnliche Sequenzen mit Proteinen ihrer Artgenossen. Diese Proteine ​​sind oft homolog und ihre ähnlichen Sequenzen weisen darauf hin, dass die Organismen einen gemeinsamen Vorfahren haben. Durch die Untersuchung der Funktion eines bestimmten Proteins in Hefe gewinnen die Forscher Einblicke in die Proteinfunktion in höheren Eukaryoten wie uns Menschen.

In der Natur, S. cerevisiae kommt in warmen, feuchten Umgebungen vor, mit einer Zuckerquelle in der Nähe. Einer seiner beliebtesten Treffpunkte ist der Weinberg, wo er auf der Haut der Trauben wohnt.

S. cerevisiae hat eine runde bis ellipsoid-eiförmige Form und einen Durchmesser von typischerweise 5 bis 10 Mikrometer, wenn sie unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar gemacht wird.

Wenn sich die meisten eukaryotischen Zellen über Mitose und Zytokinese teilen, kommt es zu einer gleichmäßigen Trennung von genetischem Material und Zytoplasma in Tochterzellen. Auf der anderen Seite, S. cerevisiae durchläuft eine Zellteilung durch einen Prozess namens Knospung.

Diese Form der asexuellen Fortpflanzung beinhaltet die Bildung einer neu synthetisierten Knospe aus der Mutterzelle, die während des Zellzyklus bis zur Zytokinese an Größe zunimmt. Im Gegensatz zur typischen eukaryotischen Zellteilung sind die beiden Zellen nach der Mitose nicht gleich groß.

Jetzt, da wir ein bisschen darüber gelernt haben S. cerevisiae Lassen Sie uns als Organismus diskutieren, was ihn zu einem großartigen Modellsystem für die Forschung macht.

Erstens wachsen Hefezellen schnell und teilen sich ungefähr alle 90 Minuten. Zweitens sind sie leicht zu züchten und benötigen nur eine einfache Technik und Instrumentierung für die Vermehrung. Drittens, als erster eukaryotischer Organismus, dessen gesamtes Genom sequenziert wurde, S. cerevisiae hat alle seine Gensequenzen über die Hefegenomdatenbank öffentlich zugänglich.

Auch die genetische Manipulation von Hefe ist äußerst praktisch. Die meisten S. cerevisiae Vektoren, Träger einer interessierenden DNA-Sequenz, sind Shuttle-Vektoren. Shuttle-Vektoren sind normalerweise Plasmide, die sich in zwei verschiedenen Spezies vermehren können, wie z. B. sowohl E. coli als auch S. cerevisiae. Dies ermöglicht die molekulare Klonierung in E. coli, um beispielsweise das Gen für das grün fluoreszierende Protein von Quallen in einen Shuttle-Vektor einzubauen, der in Hefe eingeführt werden kann, um sie zum Leuchten zu bringen.

Das integrative Hefeplasmid ist eine Art Shuttle-Vektor, der den Einbau fremder DNA in das Hefegenom durch einen als homologe Rekombination bezeichneten Prozess ermöglicht. Homologe Rekombination ist ein Austausch von DNA zwischen übereinstimmenden oder ähnlichen Sequenzen, der zu einem genetischen Crossover zwischen dem Vektor und der genomischen Wirts-DNA führt. Dies kann dazu führen, dass ein Gen ausgeschaltet oder ein Gen gegen ein anderes ausgetauscht wird. Da außerdem die homologe Rekombination zur Integration in das Wirtsgenom führt, bleibt die genetische Veränderung nach der Teilung der Hefezelle bestehen.

Jetzt, da Sie wissen, was Hefe so praktisch für das Studium macht, werfen wir einen Blick darauf, warum diese kleinen Lebewesen wissenschaftlich so wichtig sind. Vor langer, langer Zeit, im frühen 6. Jahrtausend v. Chr., war Hefe an der Vergärung von Trauben zu Wein beteiligt. Hefe spielte später eine Rolle beim Brotbacken im alten Ägypten.

Erst 1856 identifizierte Luis Pasteur S. cerevisiae als Schlüsselmikrobe für die Weinherstellung und das Brotbacken. Er stufte Hefe als fakultativ anaerob ein, die in Abwesenheit von Sauerstoff auf Gärung umschaltet, ein Prozess, der es Hefe ermöglicht, Zucker zu verstoffwechseln und als Nebenprodukt Alkohol produziert. Dabei wird Pyruvat, das durch Glykolyse entsteht, zu Acetylaldehyd reduziert, das dann durch die Umwandlung von NADH zu NAD+ zu Ethanol, dem bestimmenden Inhaltsstoff im Wein, reduziert wird.

Mit einem Sprung ins 20. Jahrhundert entdeckten Hartwell und Nurse Proteine, die den Zellzyklus regulieren.

Der Zellzyklus ist eine Reihe von zellulären Ereignissen, die die richtige Replikation und Segregation der nuklearen DNA umfassen, bevor sich eine Zelle teilt. Die Identifizierung des Proteins Cyclin und der cyclinabhängigen Kinase sowie die Veränderung ihrer relativen Häufigkeit durch Interphase und Mitose legten nahe, dass diese Proteine ​​wichtige Regulatoren der Zellteilung sind. Die hochkonservierte Natur dieser Proteine ​​macht ihre Studie in Hefe wertvoll für das Verständnis der Rolle von Cyclin-abhängigen Kinasen in mehrzelligen Organismen, wie beispielsweise die Fehlregulation des Zellzyklus, die zu unkontrollierter Zellteilung oder Krebs führen kann.

15 Jahre später machten Blackburn, Greider und Szostak bahnbrechende Studien zum Verständnis von Telomeren sowie zur Entdeckung von Telomerasen. Telomere sind sich wiederholende DNA-Sequenzen am Ende eines Chromosoms, die die Degeneration der genomischen DNA verhindern. Die Addition dieser repetitiven Sequenzen erfolgt durch Telomerasen am flankierenden 3'-Ende des Chromosoms, und auf die Komplementierung der Nukleotide folgt DNA-Polymerase im nacheilenden Strang. Telomere haben Auswirkungen auf das Altern, da diese DNA-Segmente während der gesamten Lebenszeit eines Organismus kürzer werden.

Noch vor kurzem, 1992, entdeckten Ohsumi und seine Kollegen Gene, die die Autophagie, eine Art Zellrecycling, regulieren. Während des Nährstoffmangels werden entbehrliche Organellen von einem Autophagosom verschlungen. Das Autophagosom wird dann mit einem Lysosom fusionieren, um organellare Proteine ​​weiter in Aminosäuren abzubauen, die für die Bildung neuer Proteine ​​​​wichtig sind. Autophagie ist an den wichtigen zellulären Mechanismen beteiligt, die vor eindringenden Krankheitserregern und Tumorwachstum schützen.

Es gibt eine breite Palette von Anwendungen für die Untersuchung von Hefen. Hefe kann beispielsweise verwendet werden, um die Mitophagie zu untersuchen, also die Entfernung beschädigter Mitochondrien durch Autophagosomen. Dieser Prozess hat Auswirkungen auf Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson. In diesem Video wird Autophagie in Hefezellen durch Zugabe von Stickstoffmangelmedium induziert. Als nächstes werden Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie präpariert, um die Mitophagie in stickstoffarmen Zellen zu beobachten.

S. cerevisiae wird verwendet, um große Mengen an Proteinen zu exprimieren und zu reinigen, beispielsweise das Cystische Fibrose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulationsprotein. In diesem Video werden Hefezellen, die das CFTR-Plasmid tragen, in großen Kulturen gezüchtet. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation der Zellen, um die Mikrosomen abzutrennen. Mikrosomen sind artefaktische Gefäße, die aus dem endoplasmatischen Retikulum gebildet werden, wenn Zellen zerstört werden. Die Isolierung und Reinigung von CFTR aus Mikrosomen wird es Wissenschaftlern ermöglichen, die Struktur des Proteins mit Methoden wie der Röntgenkristallographie zu untersuchen.

Hefe kann auch als Modellsystem für genetische Studien menschlicher DNA-Reparaturproteine ​​verwendet werden. Diese Proteine ​​erkennen und fixieren beschädigte DNA, um die Vermehrung von Zellen, die ein defektes Genom tragen, wie etwa Krebszellen, zu verhindern. Hier sehen Sie Autoren, die Hefezellen mit dem transformierten DNA-Reparaturprotein WRN auf Selektivmedienplatten ausplattieren. Die Zellmorphologie von Mutanten für WRN kann unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, und der Nachweis dieses Proteins im Zelllysat wird durchgeführt, indem ein Proteingel für die Western-Blot-Analyse laufen gelassen wird.

Sie haben sich gerade JoVEs Einführung in S. cereviae angesehen. In diesem Video haben wir Folgendes besprochen: die Geschichte, Zell- und Molekularbiologie und biomedizinische Anwendungen von S. cerevisiae. Wir hoffen, dass Ihnen unser Video gefallen hat und empfehlen Ihnen, es mit einem Freund zu teilen.


Schau das Video: Saccharomyces Cerevisiae (Kann 2022).