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Wie wird ein DNA-Molekül mit deuteriertem Wasser markiert?

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Ich habe eine Veröffentlichung gesehen, in der deuteriertes Wasser verwendet wurde, um sich teilende Zellen zu verfolgen. Die Annahme war, dass deuteriertes Wasser in neu synthetisierte DNA-Moleküle eingebaut wird. Gibt es eine direkte Einbindung von Wasser in den Replikationsprozess? Gibt es einen Protonenaustausch?

Das Papier zur Beschreibung der Methode finden Sie hier: http://www.pnas.org/content/105/16/6115.full.pdf


Ich würde annehmen, dass die Markierung bei der Reduktion von NTPs zu dNTPS erfolgt.

Dieser Prozess (katalysiert durch Ribonukleotidreduktase) beinhaltet die Protonierung der Hydroxylgruppe am 2'-Kohlenstoff, lässt sie als Wasser austreten und fügt dann dem neu gebildeten Carbokation ein Hydrid zu. Die beiden Wasserstoffatome (das Proton und das Hydrid) stammen von zwei Thiolen am Enzym, die dabei oxidiert werden, um eine Disulfidbrücke zu bilden.

Die Crux ist, dass die beiden Thiole in Gegenwart von schwerem Wasser ihren Wasserstoff schnell gegen Deuterium austauschen würden. Das bedeutet, dass das Hydrid, das dem Carbokation hinzugefügt wird, ein Deuterium ist und das resultierende dNTP mit Deuterium markiert ist.

Dies ist der einzige Schritt, für den ich mir vorstellen kann, dass die Markierung funktioniert, da eine Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung gebildet wird (die sich nicht schnell mit dem Lösungsmittel austauscht) unter Verwendung des Wasserstoffs einer Schwefel-Wasserstoff-Bindung (die schnell mit dem Lösungsmittel austauscht) ).


Mechanismus der Urocanase, wie durch Deuteriumisotopeneffekte und Markierungsmuster untersucht

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HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0002] Diese Erfindung betrifft allgemein die Proteomanalyse und insbesondere Verfahren zum Übertragen funktioneller Gruppen auf Moleküle in einer Probe zur Analyse und Quantifizierung der Moleküle.

Der klassische biochemische Ansatz zur Untersuchung biologischer Prozesse basiert auf der Reinigung bis zur Homogenität durch sequentielle Fraktionierungs- und Testzyklen der spezifischen Aktivitäten, die einen Prozess bilden, der detaillierten strukturellen, funktionellen und regulatorischen Analyse jeder isolierten Komponente und der Rekonstitution des Prozesses aus den isolierten Komponenten. Das Human Genome Project und andere Genomsequenzierungsprogramme stellen in rascher Folge die vollständigen Genomsequenzen bestimmter Spezies und damit im Prinzip die Aminosäuresequenz jedes Proteins heraus, das potenziell von dieser Spezies kodiert wird. Es ist zu erwarten, dass diese in der Geschichte der Biologie beispiellose Informationsquelle traditionelle Forschungsmethoden bereichern und Fortschritte in grundlegend anderen Forschungsparadigmen, darunter die Proteomik, katalysieren wird.

[0004] Bemühungen, das gesamte menschliche Genom zusammen mit den Genomen einer Reihe anderer Arten zu sequenzieren, waren außerordentlich erfolgreich. Die Genome von 46 mikrobiellen Arten (TIGR Microbial Database www.tigr.org) sind fertiggestellt und die Genome von über 120 weiteren mikrobiellen Arten werden derzeit sequenziert. Darüber hinaus wurden die komplexeren Genome von Eukaryoten, insbesondere des genetisch gut charakterisierten Einzellers Saccharomyces cerevisiae und der vielzelligen Spezies Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster, vollständig sequenziert. Darüber hinaus wurden „Draft Sequences“ des Reis-, Human- und Arabidopsis-Genoms veröffentlicht. Selbst in Abwesenheit vollständiger genomischer Sequenzen wurden umfangreiche DNA-Sequenzdatenbanken öffentlich zugänglich gemacht, einschließlich solcher, die über 2,1 Millionen menschliche und über 1,2 Millionen murin exprimierte Sequenz-Tags (ESTs) enthalten.

[0005] ESTs sind Abschnitte von ungefähr 300 bis 500 zusammenhängenden Nukleotiden, die partielle Gensequenzen darstellen, die durch systematisches Sequenzieren der Klone in einem einzigen Durchgang in cDNA-Bibliotheken erzeugt werden. Auf der Zeitskala der meisten biologischen Prozesse, mit Ausnahme der Evolution, kann die genomische DNA-Sequenz als statisch betrachtet werden, und eine Datenbank für genomische Sequenzen stellt daher eine Informationsquelle dar, die einer Bibliothek ähnelt. Es wird intensiv daran gearbeitet, einzelnen Sequenzen in Sequenzdatenbanken „Funktion“ zuzuordnen. Dies wird versucht durch die rechnerische Analyse von linearen Sequenzmotiven oder Strukturmotiven höherer Ordnung, die eine statistisch signifikante Ähnlichkeit einer Sequenz mit einer Familie von Sequenzen mit bekannter Funktion anzeigen, oder durch andere Mittel, wie den Vergleich homologer Proteinfunktionen über Spezies hinweg. Es wurden auch andere Methoden verwendet, um die Funktion einzelner Sequenzen zu bestimmen, einschließlich experimenteller Methoden wie Gen-Knockouts und Suppression der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Nukleotid-Technologie, die zeitaufwendig und in einigen Fällen immer noch unzureichend sein können, um die Zuordnung einer biologischen Funktion zu einer Polypeptid, das von der Sequenz kodiert wird.

[0006] Das Proteom wurde als das Proteinkomplement definiert, das von einem Genom exprimiert wird. Diese etwas restriktive Definition impliziert eine statische Natur des Proteoms. In Wirklichkeit ist das Proteom hochdynamisch, da die Typen der exprimierten Proteine, ihre Häufigkeit, ihr Modifikationszustand, ihre subzellulären Lokalisationen und Wechselwirkungen mit anderen Biomolekülen wie Polypeptiden und Nukleinsäuren vom physiologischen Zustand der Zelle oder des Gewebes abhängen. Daher kann das Proteom einen zellulären Zustand oder die äußeren Bedingungen widerspiegeln, denen eine Zelle begegnet, und die Proteomanalyse kann als ein genomweiter Assay angesehen werden, um zelluläre Zustände zu differenzieren und zu untersuchen und die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die sie kontrollieren. Wenn man bedenkt, dass das Proteom einer differenzierten Zelle schätzungsweise aus Tausenden bis Zehntausenden verschiedener Proteintypen besteht, mit einem geschätzten dynamischen Expressionsbereich von mindestens 5 Größenordnungen, erscheinen die Aussichten für die Proteomanalyse erschreckend. Die Verfügbarkeit von DNA-Datenbanken, die die Sequenz jedes potenziell exprimierten Proteins auflisten, kombiniert mit schnellen Fortschritten bei Technologien, die in der Lage sind, die tatsächlich exprimierten Proteine ​​zu identifizieren, machen die Proteomik jedoch zu einem realistischen Vorschlag. Die Massenspektrometrie ist eines der wesentlichen Beine, auf denen die aktuelle Proteomik-Technologie steht.

[0007] Quantitative Proteomik ist die systematische Analyse aller von einer Zelle oder einem Gewebe exprimierten Proteine ​​hinsichtlich ihrer Menge und Identität. Die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle, einem Gewebe, einer biologischen Flüssigkeit oder einem Proteinkomplex exprimierten Proteine ​​definieren genau den Zustand der Zelle oder des Gewebes zu diesem Zeitpunkt. Die quantitativen und qualitativen Unterschiede zwischen Proteinprofilen desselben Zelltyps in verschiedenen Zuständen können verwendet werden, um die Übergänge zwischen den jeweiligen Zuständen zu verstehen. Traditionell wurde die Proteomanalyse unter Verwendung einer Kombination aus hochauflösender Gelelektrophorese, insbesondere zweidimensionaler Gelelektrophorese, um Proteine ​​zu trennen, und Massenspektrometrie zur Identifizierung von Proteinen durchgeführt. Dieser Ansatz ist sequentiell und langwierig, aber noch wichtiger ist er grundsätzlich dadurch eingeschränkt, dass biologisch wichtige Proteinklassen im Wesentlichen nicht nachweisbar sind (Gygi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9390–9395 (2000).

[0008] Die Vervollständigung der genomischen Sequenz einer Reihe von Arten hat einen neuen Ansatz in der Biologie katalysiert, der typischerweise als Entdeckungswissenschaft bezeichnet wird. Das Wesen der Entdeckungswissenschaft ist die systematische und quantitative Analyse aller Mitglieder einer bestimmten Klasse von Molekülen, die von einer Zelle oder einem Gewebe exprimiert werden. Beispielhafte Implementierungen der Entdeckungswissenschaft umfassen die systematische Analyse von mRNA-Molekülen, die von einer Zelle oder einem Gewebe exprimiert werden, durch Genexpressionsarrays und quantitative Proteomik, die systematische Analyse der in einer biologischen Probe enthaltenen Proteine. Ein Hauptziel der Entdeckungswissenschaft ist die Beschreibung des Zustands einer Zelle oder eines Gewebes (Aktivität, Pathologie, Stress) basierend auf den Daten aus der systematischen Messung von Biomolekülen und der Identifizierung der molekularen Mechanismen, die den Übergang einer Zelle von einem Zustand zum anderen durch die vergleichende Analyse der molekularen Zusammensetzung von Zellen, die die beiden Zustände repräsentieren. Für die molekulare Beschreibung eines zellulären Zustands und seiner Kontrollmechanismen sind möglichst viele Parameter wünschenswert. Aktuelle Expression-Array-Methoden ermöglichen die systematische Analyse der mRNA-Moleküle in einer Zelle.

[0009] Kürzlich wurde ein Verfahren basierend auf einer Klasse von Reagenzien, die als Isotopen-kodierte Affinitäts-Tags bezeichnet werden, und Massenspektrometrie beschrieben, das geeignet ist, die in biologischen Proben vorhandenen Proteine ​​systematisch zu identifizieren und zu quantifizieren. Andere für den Zustand einer Zelle relevante Eigenschaften wie Proteinphosphorylierung und andere posttranslationale Modifikationen sowie die quantitativen Profile anderer Biomoleküle als Proteine ​​oder Nukleinsäuren, zum Beispiel Lipide, Second Messenger, Metabolite, sind systematisch und quantitativ schwer zu messen mit aktueller Technik.

[0010] Somit besteht ein Bedarf an schnellen, effizienten und kosteneffektiven Verfahren zur Analyse von Molekülen in einer Zelle. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und bietet auch damit verbundene Vorteile.


Wie wird ein DNA-Molekül mit deuteriertem Wasser markiert? - Biologie

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Ortsspezifische Markierung von synthetischen Peptiden und Proteinen

Die ortsspezifische 13 C- und 15 N-Markierung liefert weiterhin reichhaltige Strukturinformationen über Polypeptide, die zu klein sind, um rekombinant exprimiert zu werden, oder Proteine, die zu groß sind, um einheitlich 13 C-markierte Spektren analysieren zu können. Für Polypeptide, die kürzer als 40 Aminosäuren sind, ist im Allgemeinen eine chemische Synthese möglich, daher können 13 C, 15 N-markierte Aminosäuren in ihren geschützten Formen zur ortsspezifischen Markierung in die Peptidsynthese eingebaut werden.

Eine übliche ortsspezifische Aminosäuremarkierungsstrategie ist die verstreute einheitliche 13 C, 15 N-Markierung von Resten. Solange die Ausbeute der Peptidsynthese nicht unerschwinglich niedrig ist, kann die Kombination mehrerer Proben mit unterschiedlichen U- 13 C, 15 N-markierten Resten schließlich die vollständige Struktur des interessierenden Polypeptids kartieren. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um Amyloidpeptide 29 und Membranpeptide 30-32 zu untersuchen. Es wurde auch eine uneinheitliche 13 C- und 15 N-Markierung spezifischer Aminosäurereste angewendet. Die am häufigsten markierten Stellen sind 13 CO des Polypeptidrückgrats und manchmal die Seitenkette 15 N von Lysinresten. Anwendungen umfassen normalerweise Abstandsmessungen mit heteronuklearen REDOR 33- oder homonuklearen 13 C-Rückkopplungsexperimenten 34.

Da die meisten Peptide unter Verwendung der Fmoc-Festphasenchemie synthetisiert werden, erfordert die ortsspezifische Aminosäuremarkierung Fmoc-geschützte Aminosäuren. Für hydrophobe Aminosäuren sind ihre Fmoc-geschützten Formen üblicherweise im Handel erhältlich und können auch leicht aus ihren ungeschützten Formen synthetisiert werden. Andererseits erfordern polare Aminosäuren sowohl Schutz des Rückgrats als auch der Seitenkette und sind daher teurer und schwieriger herzustellen. Während die Fmoc-Festphasensynthese die dominierende Chemie in der Peptidsynthese ist, wurde die t-Boc-Festphasensynthese auch für interessante Strukturbestimmungsziele verwendet 35 . Boc-geschützte 13 C, 15 N-markierte Aminosäuren sind bisher viel seltener. Daher sind eine erhöhte kommerzielle Produktion und Verfügbarkeit von t-Boc-geschützten Aminosäuren wünschenswert.


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Wissenschaft

Band 372, Ausgabe 6538
09. April 2021

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Von D. Sorigué , K. Hadjidemetriou , S. Blangy , G. Gotthard , A. Bonvalet , N. Coquelle , P. Samire , A. Aleksandrov , L. Antonucci , A. Benachir , S. Boutet , M. Byrdin , M Cammarata, S. Carbajo, S. Cuiné, RB Doak, L. Foucar, A. Gorel, M. Grünbein, E. Hartmann, R. Hienerwadel, M. Hilpert, M. Kloos, TJ Lane, B. Légeret, P Legrand, Y. Li-Beisson, SLY Moulin, D. Nurizzo, G. Peltier, G. Schirò, RL Shoeman, M. Sliwa, X. Solinas, B. Zhuang, TRM Barends, J.-P. Colletier, M. Joffre, A. Royant, C. Berthomieu, M. Weik, T. Domratcheva, K. Brettel, M. H. Vos, I. Schlichting, P. Arnoux, P. Müller, F. Beisson

Schnappschüsse eines Photoenzyms zeigen strukturelle Veränderungen während der Fettsäuredecarboxylierung.


Kernspinresonanzanalyse von Protein𠄽NA-Wechselwirkungen

Jüngste methodische und instrumentelle Fortschritte bei der Kernspinresonanz im Lösungszustand haben den Weg zur Untersuchung anspruchsvoller Probleme der Strukturbiologie wie etwa großer makromolekularer Komplexe geebnet. Dieser Aufsatz konzentriert sich auf die experimentellen Strategien, die derzeit angewendet werden, um Strukturen von Protein-DNA-Komplexen aufzuklären und ihre Dynamik zu analysieren. Es zeigt auf, wie diese Ansätze zum Verständnis detaillierter molekularer Mechanismen der Zielerkennung beitragen können.

1. Einleitung

Transkription, DNA-Replikation und -Reparatur sind wichtige dynamische zelluläre Prozesse, die eine extrem strenge Regulierung durch DNA-bindende Proteine ​​erfordern. Insbesondere müssen diese Proteine ​​ihre spezifischen DNA-Ziele in Gegenwart einer großen Menge unspezifischer DNA-Bindungsstellen erkennen.

In den meisten Fällen erweitern Transkriptionsfaktoren eine modulare Organisation [1], die eine auf DNA-Erkennung spezialisierte DNA-Bindungsdomäne umfasst [2] und zusätzliche Domänen, die über Interaktion mit anderen Proteinpartnern an der Signalübertragung beteiligt sind [3]. Die große Menge an verfügbaren Strukturdaten zu DNA-Bindungsdomänen hat eine wichtige strukturelle Vielfalt aufgezeigt, die es ermöglicht, strukturelle Klassifikationen vorzuschlagen [4] und Hinweise zum Verständnis der molekularen Mechanismen der DNA-Erkennung liefert. Die DNA-Bindungsdomäne ist meist darauf beschränkt, spezifische DNA im Genom zu erkennen und darauf abzuzielen, und während der Evolution wurden starke Bindungsaffinitäten ausgewählt.

Um Einblicke in die Mechanismen der spezifischen DNA-Erkennung zu gewinnen, sind detaillierte Strukturinformationen zu DNA-Protein-Komplexen erforderlich. Röntgenbeugung bleibt die leistungsfähigste Methode zur Bestimmung der Struktur großer makromolekularer Komplexe, wie die Kristallstruktur des Komplexes aus acht an den Interferon-β-Enhancer gebundenen Transkriptionsfaktoren veranschaulicht [5,6]. Obwohl die Röntgenkristallographie für große molekulare Anordnungen sehr nützlich ist, wird ihre allgemeine Anwendung jedoch durch die Schwierigkeiten bei der Kristallisation hochdynamischer und transienter Komplexe begrenzt. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Kernspinresonanz (NMR) im flüssigen Zustand in Bezug auf Empfindlichkeit und spektrale Auflösung mit der Herstellung von Spektrometern mit sehr hohen Magnetfeldern zusammen mit wichtigen methodischen Entwicklungen, wie der transversalen Relaxationsoptimierten Spektroskopie [7,8] (TROSY) weiterentwickelt. , was den Weg für NMR-Untersuchungen größerer Makromoleküle oder Komplexe öffnet. Im Fall von Protein-DNA-Komplexen können die meisten der jüngsten NMR-Fortschritte angewendet werden, die strukturelle Beschränkungen bieten, die zur Durchführung von Strukturrechnungen verwendet werden können. Zwei Kategorien von Informationen können gesammelt werden: mehrdeutige Beschränkungen, die im Allgemeinen aus Interaktionsoberflächenkartierungen abgeleitet werden, und eindeutige Beschränkungen, die durch intermolekulare nukleare Overhauser-Effekte (NOEs) bereitgestellt werden, restliche dipolare Kopplungen und Experimente zur Verstärkung der paramagnetischen Relaxation (PRE). All diese Daten können miteinander kombiniert werden, um hochwertige Strukturen von Protein-DNA-Komplexen zu berechnen.

Darüber hinaus wird die NMR-Spektroskopie im Gegensatz zur Röntgenbeugung bei Raumtemperatur durchgeführt und bietet Zugang zu den dynamischen Eigenschaften von Makromolekülen. Durch die Untersuchung von 15 N Relaxationsraten von Amidstickstoffen können aus der Analyse spektraler Dichtefunktionen Informationen über die Gesamtdiffusion und das lokale Verhalten der Proteine ​​gewonnen werden.

Die wichtigen Arbeiten zum Lac-Operator [9–13] haben Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen geliefert, durch die der Lac-Repressor an ein spezifisches Ziel und ein unspezifisches Ziel bindet. Im Fall der Protein-DNA-Erkennung scheinen Anpassung und Plastizität die beiden Haupteigenschaften zu sein, die eine spezifische Erkennungsfähigkeit verleihen. Darüber hinaus kann die Flüssigzustands-NMR auch verwendet werden, um Zugang zu hochtransienten Intermediaten zu erhalten, und es ist nun möglich, die Proteindiffusion durch NMR zu verfolgen und den Suchmechanismus entlang der DNA zu bestimmen [14]. Die kürzlich durchgeführten Arbeiten zur Erkennung von HoxD9-DNA der Homöodomäne haben eindeutig gezeigt, dass HoxD9 an unspezifische DNA mit dem gleichen Bindungsmodus und der gleichen Orientierung wie im spezifischen Komplex bindet [15]. Unspezifische DNA-Bindung ist jedoch immer mit Austauschprozessen verbunden, was zu unterschiedlichen dynamischen Verhaltensweisen der Seitenketten an der Grenzfläche zur DNA führt.

Dieser Artikel gibt einen Überblick über die aktuellen Ansätze auf dem Gebiet der NMR-Strukturstudien speziell für Protein-DNA-Komplexe durch NMR und konzentriert sich auf neue Entwicklungen. Alle wichtigen Phasen von der Probenvorbereitung, der Grenzflächenkartierung und der Sammlung der strukturellen Beschränkungen bis hin zur Strukturberechnung und dynamischen Charakterisierung werden diskutiert.

2. Probenvorbereitung

Im Allgemeinen werden beim Umgang mit makromolekularen Komplexen unterschiedliche Markierungsstrategien verwendet. In den meisten Fällen ist nur ein Partner markiert, während der andere unmarkiert bleibt, was den Vorteil hat, dass die Anzahl der beobachtbaren NMR-Signale ausgewählt werden kann. Es können zwei Proben hergestellt werden: In der ersten, die am häufigsten vorkommt, ist das Protein 15 N und/oder 13 C markiert, während die DNA unmarkiert ist, und in der anderen, die optional ist, ist die DNA 15 N und/oder 13 C-markiert und das Protein unmarkiert.

Dies bietet eine bequeme Möglichkeit, die Resonanzen während Titrationsexperimenten zu verfolgen und gefilterte Experimente zu verwenden, um die Magnetisierung bestimmter Protonensätze auszuwählen oder herauszufiltern. Die Fortschritte in der Biochemie und dedizierten Isotopenmarkierungstechniken ermöglichen die Herstellung markierter Proteine, während Proben von markierter DNA durch chemische oder enzymatische Methoden hergestellt werden können, wie bereits zuvor ausführlich beschrieben [16]. Doppelsträngige DNA wird nach dem Annealing der beiden Stränge bei hoher Temperatur und anschließendem langsamen Abkühlen gebildet. Der DNA-Duplex kann auf einer präparativen Ionenaustauschersäule weiter gereinigt und durch Dialyse entsalzt werden, bevor der Protein-DNA-Komplex hergestellt wird [17]. Um die beiden Stränge in äquimolaren Mengen zu mischen, ist es am einfachsten, einen der beiden Stränge nach und nach zu einer Lösung des komplementären Strangs zuzugeben, und NMR-Spektren werden nach jedem Zugabeschritt aufgenommen und integriert.

Die Herstellung stabiler Protein-DNA-Komplexe für die NMR, d. h. 0.1–1 mM Komplexlösungen, bleibt aufgrund der basischen Natur der DNA-bindenden Domänen (also positiv geladen) im Gegensatz zu den negativ geladenen Nukleinsäurephosphatgruppen eine schwierige Aufgabe. Bei hoher Konzentration tritt eine starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen den beiden Partnern auf und kann zu Probenausfällungen führen. In der Literatur wurden verschiedene Strategien beschrieben, um dieses Problem anzugehen: (i) Erhöhung der Salzkonzentration, (ii) Verringerung der Anzahl der DNA-Ladungen durch Verkürzung ihrer Länge und (iii) Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese, um basische Reste auf der zu ersetzen Proteinoberfläche außerhalb der DNA-Erkennungsschnittstelle. Andere Methoden erwiesen sich als nützlich, um das Löslichkeitsproblem zu verbessern, wie im Fall des Dread-Ringer-Protein-DNA-Komplexes, bei dem ein C-terminaler Phenylalaninrest, der für den Austauschprozess verantwortlich ist, zu einem Leucinrest mutiert wurde, wodurch eine Erhöhung die Qualität der NMR-Spektren [18]. Es wurde gezeigt, dass die Mutation von Cysteinresten, um eine Oxidation zu verhindern, die Stabilität des Protein-DNA-Komplexes verbessert, wie in Studien des Integrase-DNA-Komplexes, bei denen ein Cystein zu einem Alanin mutiert wurde [19], oder im Fall des THAP-Domäne von hTHAP1, in der zwei freie Cysteine ​​außerhalb des C2CH-Zink-Koordinationsmotiv wurden zu Serinen mutiert [20].

Die Hauptprobleme bei der Probenvorbereitung bleiben die Löslichkeit und die Stabilität des Komplexes, denn um intermolekulare NOEs zu identifizieren, muss die Probe hochkonzentriert und bei einer vernünftigen Temperatur (zwischen 25 °C und 40 °C) stabil sein, um um ein scharfes Signal zu erhalten.

3. Interaktionsoberflächen-Mapping

3.1. Abbildung der chemischen Verschiebung

Eine Vielzahl von Techniken wurde vorgeschlagen, um Protein-Bindungsschnittstellen zu kartieren und werden kurz beschrieben. Die einfachste NMR-Methode ist als Chemical Shift Mapping bekannt und basiert im Allgemeinen auf der Detektion der chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats 15 N und HN in heteronuklearen Einzelquantenkohärenzspektroskopie (HSQC)-Spektren. Die Entwicklung von TROSY ermöglicht die Aufnahme von NMR-Spektren für große Komplexe mit hoher spektraler Auflösung. Durch die Aufnahme von 15 N HSQC-Spektren des freien und des gebundenen 15 N-markierten Proteins können normalisierte chemische Verschiebungsstörungen (CSPs) berechnet werden mit

Chemische Verschiebungen reagieren sehr empfindlich auf subtile Störungen der chemischen Umgebung. Während bindungsinduzierte interne Strukturumlagerungen des Proteins in einigen Fällen chemische Verschiebungen des Proteins beeinflussen können, sind im Allgemeinen die Nähe von DNA-Phosphaten oder die durch aromatische Basen induzierten Ringströme für wichtige CSPs verantwortlich. Daher werden NMR-Methoden, die CSPs von Proteinamidgruppen nach DNA-Bindung überwachen, häufig verwendet, um die Interaktionsoberfläche schnell zu kartieren [21–23].

Im Fall der Wechselwirkung zwischen dem C2CH THAP Zinkfingerdomäne von humanem THAP1 und seinem spezifischen DNA-Ziel wurden sehr kleine CSP-Werte für Reste in der α-Helix-Region beobachtet, während Reste innerhalb des β-Faltblatts oder der N-Terminus-Schleife stark betroffen waren (Abbildung 1ein), was beweist, dass die Domäne ihr β-Faltblatt und die umgebenden Schleifen verwendet, um die DNA anstelle ihrer α-Helix zu erkennen [20].

Abbildung 1. Interaktionsoberflächenkartierung durch Kombination von chemischer Verschiebungsstörung (CSP) und Imino-Kreuzsättigung auf der THAP-Domäne von hTHAP1. (ein) Histogramm des normalisierten CSP, das bei DNA-Bindung als Funktion der Restzahl beobachtet wurde. (B) Imino-Kreuzsättigungsraten (RD) als Funktion der Restzahl. (C) Beispiele für experimentelle Punkte und angepasste Kurven der Imino-Kreuzsättigungsdaten. Experimentelle Punkte und angepasste Kurven sind für die α-helikalen Reste (von der DNA entfernt) blau und für β-Faltblatt-Reste (nahe der DNA) schwarz gefärbt. (D) Kartierung der Interaktionsfläche auf der Lösungsstruktur der THAP-Domäne von hTHAP1.

Bemerkenswert ist, dass sich die DNA-bindende Oberfläche in einem kontinuierlichen Proteingrenzflächenbereich befinden muss. Im Fall des Transkriptionsfaktors Myb1, der zwei Myb-ähnliche DNA-bindende Motive enthält, zeigten CSP-Experimente Reste mit großen Veränderungen der chemischen Verschiebung, die sich in mehreren diskontinuierlichen Seiten des freien Proteins befinden. Die Struktur des Proteins in DNA-gebundener Konformation zeigte Konformationsänderungen bei der DNA-Bindung, was in Übereinstimmung mit CSP-Daten zu einer strukturellen Neuordnung der Domänen führte, die eine kontinuierliche Interaktionsoberfläche im Komplex bilden [24].

In einem ergänzenden Ansatz ist es möglich, 15 N HSQC-Spektren an gut aufgelösten DNA-Iminoprotonen aufzunehmen, um lokale Verformungen von DNA-Basenpaaren sowie DNA-Biegungen und größere Konformationsübergänge zu beurteilen. Im letzteren Fall ist es üblich, signifikante chemische Verschiebungen zu beobachten, die sich auf Bereiche erstrecken, die nicht Teil der Grenzfläche sind. Kürzlich wurden spezifische Pulsprogramme zum Nachweis von Nukleinsäure-Iminoprotonen entwickelt [25]. Allerdings ist die Interpretation von CSPs in DNA in Bezug auf das Protein aufgrund des konformativen dynamischen Verhaltens in der DNA und des Iminoprotonenaustauschs, der zu einer starken Linienverbreiterung führt, schwieriger. CSPs von Iminoprotonen wurden als Werkzeug verwendet, um Regionen in der DNA zu identifizieren, die bei Wechselwirkung mit dem Protein große Konformationsänderungen erfahren. Eine aktuelle interessante Anwendung dieses Ansatzes wurde verwendet, um die Interaktion des Reis-Telomer-bindenden Proteins RTBP1 mit seiner Ziel-DNA zu analysieren [26].

Bemerkenswert ist, dass spezifische DNA-Bindungsstellen häufig mit molekularbiologischen Methoden charakterisiert werden, wie z Ssystematisch Evolution von Ligands von EXponentielle Anreicherung (SELEX) und Mutagenese gekoppelt an DNA-Bindungsassays [27].

3.2. Imino-Protonen kreuzen die Sättigung

Kreuzsättigungsexperimente wurden zuerst eingeführt, um die Grenzflächen großer Protein-Protein-Komplexe zu identifizieren [28] und wurden erfolgreich zur Kartierung der Bindungsoberflächen in Protein-Nukleinsäure-Komplexen angewendet [29,30]. Diese Methode basiert auf der selektiven Sättigung von Protonen eines Molekülpartners, die zu einer Abnahme der Magnetisierung im gesamten Molekül führt, die hauptsächlich durch Spindiffusion gesteuert wird. Die Sättigung wird auf den anderen Partner übertragen, was zu einer verringerten NMR-Intensität führt. Im Fall von DNA-Protein-Komplexen werden DNA-Imino-Protonenresonanzen (von Thymin H3 und Guanin H1) selektiv mit einer Schleife gesättigt, die einen adiabatischen bandselektiven Inversionspuls im Imino-Frequenzbereich (δ 1 H, 12–15 ppm .) enthält ) [31]. Während der DNA-Sättigung stören Imino-Proton-Relaxationsprozesse das thermodynamische Gleichgewicht benachbarter Spins, was zur Übertragung der Sättigung auf das Protein führt. Durch Einführung der Sättigungsperiode vor einer klassischen 15 N HSQC-Pulssequenz werden Imino-Kreuzsättigungsexperimente mit mehreren Sättigungszeiten (im Bereich von 0,1 bis 2 s) aufgezeichnet. Anschließend wird die normalisierte Intensität der HSQC-Kreuzpeaks als Funktion der Sättigungszeit aufgetragen (Abbildung 1C).

Diese Methode wurde kürzlich zusätzlich zu Chemical-Shift-Mapping-Experimenten verwendet, um die spezifische DNA-bindende Schnittstelle der THAP-Domäne von THAP1 zu definieren [20]. Durch Anpassen experimenteller Daten mit einer monoexponentiellen Gleichung (Abbildung 1C), eine charakteristische abnehmende Zeit (TD) wurde für jeden Nicht-Prolin-Rest extrahiert und die RD Parameter (1/TD) wurde als Funktion der Proteinsequenz aufgetragen (Abbildung 1B). Da die Spindiffusion durch dipolare Wechselwirkung kontrolliert wird (für kleine Sättigungszeiten), ist die RD Parameter bewertet die räumliche Nähe der DNA. Wie in Abbildung 1 gezeigt, stimmen die Kreuzsättigungsdaten qualitativ gut mit den CSP-Daten überein, was eine zuverlässige Identifizierung der DNA-bindenden Schnittstelle ermöglicht (Abbildung 1D).

3.3. Lösungsmittelzugänglichkeit

Amidwasserstoffaustauschexperimente werden häufig verwendet, um Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit von Grenzflächenresten zu identifizieren und zusätzliche Beweise für die DNA-Protein-Grenzfläche zu liefern. Die quantitative Analyse der Amid-Protonen-Austauschraten des freien Proteins und des DNA-gebundenen Proteins wurde angewendet, um Informationen über die Bindungsschnittstelle und auch über die Proteinfaltung bei der DNA-Erkennung zu erhalten [12].

Ein alternativer Ansatz besteht darin, wasserlösliche Relaxationsmittel zu verwenden, um den Relaxationsprozess der dem Lösungsmittel ausgesetzten Atome zu erhöhen. Tatsächlich schützt die DNA-Bindung die Atome, die sich an der Bindungsgrenzfläche befinden, was zu unterschiedlichem Relaxationsverhalten zwischen der freien und der gebundenen Form führt [32].

All diese Techniken, die ein Interface-Mapping ermöglichen, liefern wichtige Informationen über den Erkennungsmodus und öffnen die Tür zu Modellierungsansätzen. Wenn es um eine Familie homologer Proteine ​​geht, für die bereits eine Struktur vorliegt, kann die molekulare Modellierung in Verbindung mit Mutagenesedaten ausreichen, um den Mechanismus der DNA-Erkennung zu verstehen. Wenn die Struktur eines homologen Proteins jedoch nicht verfügbar ist, reichen Schnittstellenkartierungstechniken nicht aus, um den DNA-Erkennungsprozess zu verstehen, und es müssen zusätzliche strukturelle Einschränkungen gesammelt werden, um eine genaue Beschreibung des DNA-Erkennungsprozesses zu erhalten.

4. Intermolekulare Beschränkungen

4.1. Intermolekulare Distanzbeschränkungen im Nahbereich: nuklearer Overhauser-Effekt

Die räumliche Nähe von Resten nahe der Protein-DNA-Grenzfläche kann zu einer intermolekularen Dipol-Dipol-Wechselwirkung führen, die ausreichend groß ist, um messbare NOEs zu erzeugen. Die resultierende Kreuzrelaxation zusammen mit den intermolekularen NOEs liefert einen direkten Hinweis auf ihre räumliche Nähe. Offensichtlich müssen Resonanzen beider Partner im Komplex vor der Identifizierung der intermolekularen NOEs zugeordnet werden. However, strong resonance overlapping and line broadening associated with the size of the complex and/or chemical exchange make it very difficult to unambiguously assign NOEs. Recent progress in different NMR processes, such as labelling strategies, pulse sequence developments and the availability of high magnetic fields, has largely contributed to solve this problem.

In most studies of DNA–protein complexes, the protein is uniformly 13 C/ 15 N labelled while the DNA remains unlabelled. Consequently, proton frequencies of the protein in the complex are generally assigned using a combination of classical triple-resonance experiments (HNCA, HNCACB) and TOCSY and nuclear Overhauser spectroscopy (NOESY) experiments (three-dimensional 15 N HSQC-NOESY, three-dimensional 15 N HSQC-TOCSY, three-dimensional HCCH-TOCSY, three-dimensional 13 C HSQC-NOESY). The development of isotope filtering and editing schemes has largely contributed to reducing the tedious task of DNA assignment. In particular, it is possible to select the 1 H atoms that are or are not one-bond scalar linked to a specific heteroatom, 15 N or 13 C. General considerations and experimental details on isotope-filtered NMR methods have been well reviewed by Breeze [33].

For instance, in the NMR studies of the complex formed by calmodulin and a peptide, peptide 1 H frequencies and intermolecular NOEs were assigned using a combination of two-dimensional NMR experiments [34,35]. This strategy has also been used for protein–DNA complexes ([18,36–38] [39, p. 423]). Firstly, two-dimensional [F1, F2] 13 C-filtered NOESY experiments were recorded for the protein–DNA complex to observe NOEs between the 1 H atoms that are one-bond scalar coupled to 12 C spins, i.e. protons of the unlabelled DNA while the protein is uniformly 13 C- and 15 N-labelled. The two-dimensional [F1, F2] 13 C-filtered NOESY was first proposed using a filter based on the chemical shift-optimized adiabatic 13 C inversion pulse [40] and was then optimized using 1 JHC coupling constant properties [15], providing a sensitivity gain of up to 40 per cent in the most favourable case. Once DNA proton frequencies are assigned, intermolecular NOEs can be detected using two-dimensional [F2] 13 C-filtered NOESY experiments that provide correlations owing to cross relaxation between all protons (bound to DNA 12 C atoms and to protein 13 C atoms). The resulting spectrum corresponds to two-dimensional [F1, F2] 13 C-filtered NOESY plus intermolecular NOEs.

If resonance overlap persists, filtering and editing schemes in three-dimensional experiments may be combined to increase resolution. Using three-dimensional [F1] 13 C filtered–[F3] 13 C edited–NOESY-HSQC experiments [40], it has been possible to detect intermolecular NOE positions on a three-dimensional experiment. Briefly, all the protons are excited but for 13 C-linked protons, then the mixing time permits DNA protons to perform cross relaxation with surrounding protons finally, magnetization is transferred to 13 C atoms and back to 1 H before detection.

Obtaining intermolecular distance restraints remains difficult and time-consuming, but they permit the interface of protein–DNA complexes to be defined with high accuracy and precision to enable structure calculations. Gathering a significant number of intermolecular NOEs is certainly the most precise and efficient way to define the interface with high accuracy.

4.2. Angular intermolecular restraints: residual dipolar couplings

Structural determination of DNA using the NOE approach is more difficult than it is for proteins and has, for a long time, been severely hampered by a lack of precision and accuracy in the structures. The low proton density together with the elongated shape of the DNA molecule often lead to a small number of NOE restraints. The majority of observable 1 H– 1 H contacts are between directly adjoining base pairs in the DNA sequence, leading to a lack of long-range structural restraints. Therefore, although the local structure is relatively well defined, the global NOE-derived structure of DNA suffers from a lack of long-range distances [41]. The introduction of additional orientational restraints using a small degree of alignment [42] turned out to be useful for DNA, improving both local and global structures [17,43]. The first example of a really extensive use of residual dipolar couplings (RDCs) for a protein–DNA structure determination was performed by Murphy and co-workers [17], who measured and included, in the structure calculation protocol, 274 protein RDCs and 46 DNA RDCs on the HMG-box domain of the human male sex-determining factor SRY, hSRYHMG, bound to a DNA 14-mer.

In solution, the dipolar coupling between two nuclei is averaged to zero because of the isotropic Brownian motion of molecules, unless the movement is restricted to a preferred direction relative to the magnetic field.

DNA molecules are naturally sensitive to an external magnetic field and are aligned partially with respect to the high magnetic field. In order to determine the orientation of the GATA-1 protein on its 16-base pair oligonucleotide, 1 DHN/N and 1 DHα/Cα RDCs were collected on the protein backbone inside the protein–DNA complex at several external magnetic fields without adding liquid crystals [44]. The magnetic susceptibility tensor for the complex is dominated by contributions of the bases in the DNA duplex, yielding an axially symmetric susceptibility tensor with the main axis approximately parallel to the double helix. Using this information, a method for refining the solution structure of this protein–DNA complex using RDC was proposed. This approach, however, had to rely on very precise measurements of dipolar couplings of a fraction of a hertz, owing to a molecular order parameter of these complexes of about 10 −4 or less.

A stronger partial alignment of molecules can be achieved by using dilute aqueous liquid crystalline media (phages Pf1, bicelles, PEG/alcohol, etc.). Thus, weak alignment (here weak alignment means molecular order parameter S of the order of 10 −3 ) of the molecule will lead to the loss of its purely isotropic motion, resulting in partial dipolar coupling between spins while retaining conditions of high-resolution solution NMR [42]. Pulse programmes have been specifically developed to measure coupling constants, allowing scalar couplings to be assessed under isotropic conditions and apparent scalar couplings (i.e. scalar coupling plus residual dipolar coupling) under anisotropic conditions. Several dipolar couplings can be extracted on the protein backbone bonds, such as 1 DHN/N, 1 DHα/Cα, 1 DCα/C′ and 1 DN/C′. Several methods have been proposed to determine the alignment tensor [45], allowing the transformation of RDC values into orientational restraints of the covalent bonds with respect to the alignment tensor (figure 2).

Figure 2. The residual dipolar coupling formalism, illustration and equations.

We have seen the importance of introducing RDCs in DNA structure determination to remedy the limited number of classical NOE restraints and to increase the accuracy of global DNA structures. The utility of employing RDCs was also established in the accurate determination of subtle structural features such as the DNA helix curvature, as in oligonucleotides containing AnTn segments [46]. Over the last decade, several pulse programmes have been developed for the measurement of residual dipolar couplings on DNA molecules [47–49]. However, in the simplest manner, RDCs can be extracted using two-dimensional IPAP 15 N/HN HSQC centred on the amide proton regions (for 1 DHN/N RDCs). Once the alignment tensor has been determined, RDCs can be transformed into orientation restraints of covalent bonds in the molecular frame using the equations given in figure 2. Care should be taken to remove from the analysis the mobile loops (which do not follow such simple equations because of dipolar coupling averaging from internal motions), which can be clearly identified from 15 N relaxation analysis.

In the context of protein–DNA complexes with both labelled partners, RDCs can be measured for both molecules within the same sample. Alignment tensors are extracted for each molecule and, if they are identical, RDCs could be used differently. In fact, RDC restraints are transformed into purely intermolecular projection angle restraints [50]. This approach was recently developed and has been successfully applied to define protein–protein interactions [51] and the relative orientation of protein subdomains [52], and may be used for protein–DNA interactions. By collecting RDCs on each partner, it is possible to derive intermolecular projection angle restraints useful for orientating each partner with respect to the other. It represents a new class of intermolecular restraints that could be included in structure calculations of protein–DNA complexes. In particular, combination of these restraints with shape restraints derived from small-angle X-ray scattering (SAXS) represents a very powerful approach [53].

4.3. Long-range intermolecular distance restraints: paramagnetic relaxation enhancement

Magnetic dipolar interaction between a spin and an unpaired electron of a paramagnetic centre can result in chemical shift changes or in an increase in the relaxation rate of the nuclear magnetization, a phenomenon called PRE. Considering the distance R between the nucleus of interest and the paramagnetic centre, the magnitude of the PRE is proportional to R −6 . However, in contrast to the NOE effect that is limited to short distances (typically less than 5 Å, slightly more with fully deuterated proteins), the PRE effect can be observed up to 35 Å, depending on the magnetic moment of the paramagnetic centre. Therefore, paramagnetic NMR represents a valuable source of long-range distances that can complement NOE restraints for a complex in the slow-exchange regime. When the molecule does not contain an intrinsic paramagnetic centre, extrinsic spin labels need to be judiciously incorporated to the molecule of interest, usually by designing nitroxide spin labels and cysteine point mutations. In the case of protein–DNA complexes, a paramagnetic agent is commonly conjugated to the DNA. For instance, the use of DNA-containing EDTA-derivatized deoxythymidine chelated to Mn 2+ in the SRY/DNA complex allowed the intermolecular PRE effects to be measured and the polarity of the SRY binding on the DNA to be defined [54]. More recently, the incorporation of deoxy-4-thiouracil into each end of the oligonucleotide reacting with 3-(2-iodoacetamido)-proxyl enabled label both 5′ DNA extremities to be spin labelled [55], and a protocol was described to incorporate nitroxide spin labels into specific 2′-sites within nucleic acids [56].

The PRE effect induced by the spin labelling leads to line broadening, the magnitude of which depends on the distance between the nucleus and the spin label. By combining different labelling sites, PRE data are extracted for different positions of the paramagnetic centre, allowing long-range distance restraint to be determined [57]. This strategy was used to compute solution structures of the SRY–DNA complex [58] (figure 3) and the Mrf2–DNA complex [55].

Figure 3. Long-range distance restraints from PRE, adapted from Iwahara et al. [58]. Impact of intermolecular PRE data on coordinate accuracy of the SRY–DNA complex when only a single intermolecular NOE restraint located at the centre of the protein–DNA interface is employed. Best-fit superposition of 30 simulated annealing structures (SRY, red DNA, blue) calculated (ein) without and (B) with 438 intermolecular 1 H-PRE restraints.

5. Structural restraints for dna structure calculation

The determination of DNA structural restraints requires prior assignment of DNA resonances following standard procedure [59]. Briefly, sequential assignment of non-labile protons in B-DNA is accomplished by following short 1 H– 1 H distance connectivities between the bases (purine H8/pyrimidine H6) and the H2′/H2″ and H1′ sugar protons in NOESY spectra recorded in 2 H2O. The intraresidue cross peaks may be independently confirmed by DQF-COSY. In B-DNA, connectivities are also observed between the base (purine H8/pyrimidine H6) and C H5 or T CH3 protons in the direction of 5′ to 3′. At the same time, the A H2 protons are identified by their weak inter- and intrastrand connectivities with H1′ sugar protons. Assignment of the H3′, H4′, H5′ and H5″ sugar protons is also based on the NOESY spectra following standard procedures. Assignment of the labile protons requires that a NOESY spectrum is recorded in H2O buffer and at low temperature to ensure slowing down of proton exchange with the solvent. The main assignment pathway relies on detectable 1 H– 1 H NOEs between the hydrogen-bonded imino protons of adjacent stacked base pairs [59].

The DNA double helix is a highly flexible structure that can adopt different classes of conformations, B, A and Z, and DNA local structural perturbations are often observed upon protein binding as well as larger conformational transitions. One should be particularly cautious in the description of the experimental restraints used in the structure calculation protocol as accurate DNA structure calculation needs to incorporate observables based on a combination of dedicated experiments. The resulting structure may range from a simple DNA classification (here, we are not talking about mere modelling in which the force field could play a major role) up to a precise description of the structure, including sugar puckering, base pair stacking and proper base pair parameters. A number of dedicated NMR experiments have been described, many of which are based on uniform 15 N– 13 C labelling of the DNA. The sugar conformation can be estimated from the analysis of proton intraresidual NOEs within sugar rings in a NOESY spectrum recorded with short mixing time and, in particular, from the ratio of the cross-peak volumes for the intraresidue H8/6–H2′ und H8/6–H3′ interactions, which is higher than 1 in the presence of a predominant C2′ Endo conformation [60]. Similarly, the orientation of the base relative to the deoxyribose ring (syn oder Anti conformation) can be determined from the ratio of H8/6–H2′ nach H8/6–H1′, which should be higher than 1 in the B-DNA form. Information on both the sugar pucker and base torsion angles is needed to estimate the DNA conformation [59]. These measurements have been done in the NMR study of the THAP zinc finger in complex with its DNA target, and have confirmed that the DNA target adopts a B-DNA form in the complex (figure 4). Alternatively, the type and degree of DNA sugar puckering in protein–DNA complexes can be assessed by recording a NOESY sequence preceded by a constant-time scalar coupling period [61]. Notably, other methods have been developed to study sugar puckering of high molecular weight oligonucleotides based on the measurement of deoxyribose 3 JHH scalar couplings [62] or cross-correlated relaxation rates involving 13 C chemical shift anisotropy (CSA) and 13 C– 1 H dipolar interactions [63], making use of uniform 13 C labelling of the DNA. Alternatively, structural information and DNA conformational changes induced by protein binding can be provided by means of 31 P NMR [64,65]. It is noteworthy that 31 P NMR can be used to identify Bich/BII DNA conformational transitions, which are likely to play a role in sequence-specific recognition [66,67].

Figure 4. Computational strategies for calculation of protein–DNA complex structures using a data-driven docking protocol. (ein) Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including solely interface mapping restraints as ambiguous interface restraints. On the graph, the intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the structure calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best models is shown. (B) Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including interface mapping restraints as ambiguous interface restraints, 39 intermolecular NOEs and 49 1 DHN-N RDCs for refinement. In the graph, the intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best structures is shown (PDB ID 2ko0). (C) Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including interface mapping restraints as ambiguous interface restraints, 39 intermolecular NOEs and 49 1 DHN-N RDCs and 49 1 DC′-Cα RDCs for refinement. In the graph, intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best structures is shown and, in both graphs, a comparison between experimentally measured RDCs and backcalculated RDCs is shown for 1 DHN-N RDCs and 1 DC′-Cα RDCs. For each ensemble, pair-wise RMSD on backbone heavy atoms is shown.

Furthermore, without major conformational change, the DNA double helix has to accommodate the protein-binding surface by modifying base pair step parameters (i.e. twist, tilt, roll, shift, slide and rise [68,69]), which may result in DNA bending [70]. Assessing the global bending magnitude in DNA–protein complexes is of particular interest, but classical NMR methods are inefficient in capturing DNA bending. However, the use of RDCs proved their ability to give a reliable view of bending in intrinsically curved DNA [46] or changes in DNA bending induced by protein binding.

To experimentally estimate protein interaction with the DNA and DNA bending, electrophoretic mobility experiments [71,72] have been used based on the observation that bent DNA migrates more slowly in a gel matrix than straight DNA [73]. An alternative method called the circular permutation DNA-bending assay, which is based on differences in the electrophoretic mobility of protein–DNA complexes with DNA-binding sites located at different positions, may be used to provide information on protein-induced DNA bending [74,75].

In addition, several software programs have been developed to model DNA bending such as the 3DNA program, which allows analysis of DNA structural parameters and enables it to be rebuilt with customized DNA models [76]. Several Web servers have been created recently and provide interesting tools to analyse and rebuild DNA models [77,78].

6. Structure calculation strategies

In most cases, several types of structural restraints (NOEs, RDCs, CSAs, PREs, low-resolution envelopes obtained from SAXS, small-angle neutron scattering (SANS) or cryoEM and so on) are combined to calculate protein–DNA structures, thus increasing precision and accuracy. Solution structures are commonly computed by simulated annealing protocols using CNS [79] or XPlor-NIH [19,36,38,80–82]. These protocols permit a complete exploration of the conformational space. Xplor-NIH includes a number of possibilities such as using a database potential of mean force describing base–base positional interactions, which has been shown to improve the structure quality, as viewed from an independent check with experimental observables (RDCs, NOEs) [83].

In some cases, the knowledge of both interaction surfaces is sufficient to orient the protein onto its DNA target. For this simpler purpose, several programs based on molecular docking have been developed. They use biophysical and/or biochemical interaction information, encoded into ambiguous interaction restraints (AIRs) [84], to drive the docking process. Provided that solution structures of the free partners are known and that no major conformational change occurs upon binding, the data-driven docking program HADDOCK can be applied to a large variety of biomolecular complexes [85,86] from protein–protein to protein–nucleic acid complexes [87]. In the context of full structure determination, and of including a wide range of experimental restraints, HADDOCK may be used as a python interface allowing a very simple and easy way to launch CNS for structure calculation of macromolecular complexes and analysis. The protocol includes three steps: a rigid body docking of the two partners based on interaction surface definition, a semi-flexible simulated annealing stage followed by a water-refinement step. The full HADDOCK program has been recently implemented into a HADDOCK Web server [88]. A specific protocol has been recently described for DNA–protein complex modelling using this approach, which highlights the importance of DNA flexibility to explore the conformational space [87,89].

The HADDOCK approach was used to gain insights into the DNA-binding mode by the THAP domain of hTHAP1. In the first step, AIRs derived from NMR chemical shift mapping and imino cross-saturation experiments were used to guide the docking, providing an ensemble of the 15 lowest energy structures with medium resolution (figure 4ein). The structure calculation convergence is illustrated by plotting intermolecular energy as a function of the backbone RMSD from the lowest energy structure. In this case, several ensembles of solutions were generated.

This docking approach can take into account ambiguous as well as unambiguous intramolecular and intermolecular restraints such as intermolecular NOEs, RDCs as intermolecular projection angle restraints and long-range distances derived from PRE experiments [20,55]. It is noteworthy that the inclusion of a few unambiguous intermolecular data in the docking process can greatly increase the structure precision. In the case of the complex formed by the THAP domain and its DNA target, 39 intermolecular NOEs were included in the docking approach and the water-refinement step was done using 1 DHN-N RDC restraints. Following this protocol, the structure calculation was highly convergent and an ensemble of 15 structures under high resolution is shown in figure 4B. By including additional 1 DC′-Cα RDC restraints, an even better calculation convergence was obtained (figure 4C).

7. Refined structures using shape restraints

Cryo-electron microscopy can provide low-resolution shape restraints, which may be used in conjunction with NMR data [90,91].

During the last decade, small-angle scattering of biomolecules in solution has gained popularity with the availability of powerful beamlines and the generation of new data analysis programmes [92–94]. There has been a growing interest in including low-resolution techniques such as SANS and SAXS to tackle challenging problems in structural biology [95–99]. X-ray scattering is generated during the interaction of light with electrons while neutron scattering is due to the interaction with the atom nuclei. The scattered intensity is a function of the macromolecule shape and of the contrast (the scattering density difference) between the macromolecule and the solvent [100]. In order to collect data, the sample ideally needs to be pure, highly homogeneous and monodisperse, without attractive or repulsive interaction among the scattering particles. The resulting one-dimensional diffusion curves contain information about the radius of gyration and the molecular mass, and the three-dimensional structural model of the shape of the particle can be extracted [101]. This information can be incorporated into structure calculation protocols in various ways: (i) for scoring the NMR-derived structures [102], (ii) directly in combination with NMR data (particularly RDCs) in order to perform a grid search using a rigid body protocol [103], or (iii) for direct refinement during NMR structure calculations [104–107]. An example of an application to DNA may be found in Schwieters & Clore [108], who have investigated by a combination of NMR and SAXS the structural and dynamic behaviour of the Dickerson DNA dodecamer. The resulting ensembles provided a detailed description of the conformational space sampled by the dodecamer in solution and of the fluctuations in helicoidal parameters, sugar puckers and Bich–BII backbone transitions.

So far, very few examples have explored the potential of SANS for DNA–protein complexes. SANS is extremely sensitive to contrast variation and, by changing the solvent composition (typically by modifying the H2O/D2O ratio), it is possible to observe specifically one component of the macromolecular complex [101,109]. An early historical success of SANS in the area of protein–DNA complexes was the mapping of the relative topology of DNA and histone in the nucleosome [110]. A recent study by Falb and co-workers [111] has focused on the structure of the U4 RNA in solution. After NMR solution structure calculation, a SANS low-resolution model was constructed in order to validate the free U4 RNA structure. The authors concluded that the SANS data fully supported the NMR analysis and independently corroborate that the sharply bent K-turn motif (observed in the crystal structure of protein-bound U4 RNA) is not formed in solution in the absence of protein and divalent cations.

8. Dynamic study of protein–dna interaction using nuclear magnetic resonance

8.1. Backbone dynamic analysis in a protein–DNA complex

Protein and DNA motions are known to play important roles in the recognition mechanism and specificity [112,113]. In a number of cases, unfolded or partially folded protein domains may provide scaffolds for DNA interaction, and intrinsically disordered protein domains or tails may facilitate DNA search efficiency as reviewed in Wright & Dyson [114] and Vuzman & Levy [115]. An extreme case of dynamic transition upon DNA binding has been described for the Brinker repressor, for which the protein domain Brk is unfolded and highly flexible throughout the entire backbone in the absence of DNA and folds into a helix–turn–helix motif upon DNA binding [116].

The dynamic behaviour of a protein in solution can be monitored by 15 N NMR relaxation studies of backbone amides. With the Lipari–Szabo formalism, the 15 N relaxation rates of individual amide 15 N nuclei (R1, R2, heteronuclear NOE) can be fitted to a generalized order parameter S 2 , which reports amplitudes of ps–ns internal motions, to an internal correlation time (τe), to an exchange term (REx), caused by μs–ms exchange processes, and finally to a global isotropic correlation time (τC) [113]. In most cases, DNA-binding sites are flexible and undergo rapid μs–ms conformational fluctuations characterized by large values of REx for residues located at the target interface. This flexibility often decreases upon target binding. The structural study of the lac repressor system has provided keys to understanding the dynamic features of protein–DNA recognition [12,117]. The NMR solution structures of the lac DNA binding domain (DBD) in the free state or bound to non-specific or specific DNA targets have been solved and dynamic features of the protein in every state have been characterized. In the non-specific DNA-bound state, the Lac repressor displays a large number of sub-millisecond motions with large REx values that are observed at the DNA–protein interface, indicating a very transient and labile interface, whereas these motions are quenched upon binding of the protein to its cognate operator. These results have been confirmed using H/D exchange [12]. To conclude, the determination of the conformational exchange term for 15 N backbone atoms at the protein–DNA interface gives access to the interaction strength and stability of the DNA–protein complex.

8.2. Search mechanism of the DNA target site

Recognition and binding of specific sites on DNA by proteins are central for many cellular functions such as transcription, replication and recombination, as recently reviewed [118–120]. The proteins have to find their DNA target sites in the bulk of non-specific sequences present in the cell. Yet, it has been widely demonstrated that rate constants for association of proteins with their specific DNA targets can surpass the diffusion limit by almost two orders of magnitude. This observation can be explained by a kinetically optimized pathway involving a combination of three-dimensional diffusion and one-dimensional sliding diffusion along the DNA.

The one-dimensional diffusion rates of LacI repressor proteins along elongated DNA have been measured using single-molecule imaging techniques [121,122]. This implies the existence of transient intermediates involving non-specific binding modes. PRE experiments allow the characterization of these transient intermediates and have been used to show diffusion of the DNA-binding domain along the non-specific DNA aiming to find its specific target [14]. Using different paramagnetic labelling positions on an oligonucleotide containing the HOXD9 homeodomain target site [15], PRE values could be extracted in various ionic strength conditions. At low ionic strength, PRE data are consistent with the previously described solution structure of the specific protein–DNA complex. However, at high ionic strength, several significant differences appear in the PRE data which indicate the existence of other modes of binding. This work provides for the first time NMR evidence of the one-dimensional diffusion along the DNA helix towards the recognition site. Interestingly, the PRE experiments give access to the dynamic of the DNA–protein interaction. Intermolecular jumping from one double-stranded DNA to another has also been observed using this method [14]. Theoretical studies and other evidence highlight the role of protein and DNA conformational flexibility on the rates of one-dimensional diffusion and hopping [123,124].

9. Conclusions and perspectives

Solution-state NMR developments have generated new methods to collect structural restraints on protein–DNA complexes. Mapping the interaction surfaces, using chemical shift mapping or cross-saturation experiments, gives answers with the lowest resolution and helps with modelling the complex. If detailed residue-specific knowledge is required, intermolecular restraints are needed. Various kinds of data can be extracted with different levels of difficulty. Intermolecular NOEs appear to be the most precise for interface definition but are time-consuming, requiring residue and atom-specific NOE assignments. Alternatively, intermolecular restraints can be represented by angular restraints with RDCs as intervector projection angles or by long-range distances with PRE. These approaches can be combined in order to increase structural accuracy. In some cases, combination of RDC and SAXS low-resolution shape restraints has been described as a powerful approach. NMR is limited by the size of the macromolecular edifice but offers useful possibilities in terms of dynamic characterization. During the last decade, dynamic descriptions of protein–DNA interactions have played an increasing role in understanding recognition specificity and kinetics.


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Fascinating information thank you. What do you think of the electric hydrogen makers on the market? There seems to be an abundance of them. I am not sure how they work but get the impression that they split the water molecule into oxygen and hydrogen.

If we were supposed to consume more hydrogen would nature not have added more to the air or a different ration in our water supply?

Hydrogen is most often produced by electrolysis (the splitting of the water molecule) although there are variations on the theme. A good article can be found here: http://energy.gov/eere/fuelcells/hydrogen-production-electrolysis. There is significant evidence to indicate that the early Earth atmosphere contained MUCH more hydrogen that it does today (see page 70 in Dancing with Water)

In our continued work with Deuterium-depleted water, we have found that the degree to which water can be depleted often depends on the minerals in the water (influencing hydrogen/deuterium bond strength) We had the water tested by a certified lab in Eastern Europe where they have more experience with this kind of testing and found that the process we originally posted removed very little deuterium, so since the process was so involved, we felt it was not worth people’s time.

What is your opinion of the John Eliis E5, which makes deuterium depleted water? It is expensive, but if it works it is worth it. Unless you can recommend another effective machine that makes DDW.

The last time we looked into it, there was no information on the degree to which the Ellis distiller may reduce deuterium. We use the word “may” because there is no evidence of testing or analytical work to support the claims. Any reduction in deuterium would depend on the nature of the source water and the kind (and amount) of minerals present. If the distiller does reduce deuterium, we are of the opinion that in some instances it may be so small as to be insignificant. Perhaps that is why there is an obvious lack of information on the subject. You don’t have to reduce the deuterium by much to say that it is “depleted” but whether or not it is significant enough to produce any results is another story.
The level of expertise required to produce deuterium-depleted drinking water of reputable quality (and with low levels of deuterium) is quite high and has only been achieved by a handful of companies so far. Unfortunately none of those companies are in the US.

Shalom, I have tested the output of Ellis water and the ppm of Deuterium increased by 1ppm.
That machine is NOT a DDW producing machine as it is not designed to take it’s “distilled” output and run it through the machine again repeatedly.
I owned one to carry out this research at an ISO 17925 accredited lab by Health Canada.
I asked Mr. Ellis to remove his ad for false advertising and he fails to do so, therefore my comment here.
DDW is produced by vapour distillation towers that are designed to capture to the “light isotopes” which evaporate “UP”.
They are up to 20 feet tall and about 15cm in diameter.
The Ellis machine is sold on mainly third party claims. I have several taped calls with the man.
Mr. Ellis could not substantiate or even name the methods or means to measure the hydrogen bond angle he repeats in his messaging.

We tried a method similar to this, (based on the fact that heavy water freezes before deuterium-depleted water) But we were not able to reduce the deuterium content–even by repeating the process several times.


EXAMPLE IV

This example describes the capture of polypeptides and modification of captured phosphopeptides.

Polypeptides from a sample are captured on beads essentially as described in Example I. The captured polypeptides are modified essentially as described in Zhou et al., Natur Biotechnologie. 19:375–378 (2001), which is incorporated herein by reference.

Briefly, the captured polypeptides are modified by the following steps. (1) Amino protection: peptide amino groups are optionally protected using t-butyl-dicarbonate (tBoc) chemistry to eliminate the potential for intra- and intermolecular condensation in subsequent reactions. (2) Condensation reaction: carbodiimide catalyzes condensation reactions between the peptides and excess amine to form amide and phosphoramidate bonds at the carboxylate and phosphate bonds of the peptides, respectively. (3) Phosphate regeneration: free phosphate groups are regenerated by brief acid hydrolysis of the phosphoramidate bonds. (4) Condensation and reduction: a carbodiimide-catalyzed condensation reaction attaches a cystamine to the regenerated phosphate group(s). Reduction of the internal disulfide of cystamine next generates a free sulfhydryl group for every phosphate of the captured phosphopeptides. (5) Release of modified polypeptides: the captured polypeptides are released from the solid support by cleavage of the chemical cleavage group, for example, using light as described in Example I. (6) Solid-phase capture: the released polypeptides, including the modified phosphopeptides containing a free sulfhydryl, are attached to a second solid phase by reacting the free sulfhydryl groups in the peptides with iodoacetyl groups immobilized on glass beads. (7) Phosphopeptide recovery: following stringent washing of the resin, phosphopeptides are recovered by cleavage of phosphoramidate bonds using trifluoracetic acid (TFA) at a concentration that also removes the tBoc protection group, thus regenerating peptides with free amino and phosphate groups. The carboxylate groups remain blocked from step (2).

The chemical reactions are carried out as described below in more detail. The solid phase containing captured polypeptides is incubated in 50% (vol/vol) of 0.1 M phosphate buffer, pH 11, and acetonitrile. 0.1 M tBoc is added for 4 h at room temperature. Acetonitrile is then removed. The solid phase containing captured polypeptides is incubated in 1M ethanolamine, 25 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 0.5 M of N,N′-dimethylaminopropyl ethyl carbodiimide HCL (EDC) and incubated for 2 h at room temperature. 10% TFA is added and incubated 30 min at room temperature. The solid phase is washed to remove excess reagents and to desalt, and 1 M imidazole, pH 6.0, is added. 0.5 M EDC is added for 3 hours at room temperature. The solid phase is washed and then incubated with 1 M cystamine, pH 8.0, for 2 h at 50° C. The solid phase is washed with water and then reduced with 10 mM dithiothreitol (DTT) to generate free sulfhydryl groups. The solid phase is washed to remove DTT, and then the captured molecules are released by cleavage of the cleavable functional group.

The released polypeptides, including the phosphopeptides modified with sulfhydryl groups, are incubated for at least 2 h with a second type of solid phase beads, which have iodoacetyl groups and are titrated to pH 8.0 with 1 M Tris, pH 8.0, 50 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Beads with immobilizede iodoacetyl groups are prepared by a 2 h reaction between 3 equivalents of iodoacetic anhydride and 1 equivalent of amino beads (G4643 Sigma St. Louis Mo.) with 3.3 equivalents of diisopropylethylamine in dimethylformide. Since a tyrosine adduct with carbodiimide is a possible side reaction, the captured phosphopeptides modified with sulfhydryl groups are incubated in 1 M hydroxylamine, pH 10, for 2 h at room temperature to restore any modified tyrosines. The beads are then washed sequentially with 2 M NaCl, methanol and water to remove nonspecifically bound molecules. The beads are incubated with 100% TFA for 30 min to recover phosphopeptides and concurrently remove tBoc protection from tBoc modified groups. The recovered phosphopeptides are then analyzed, for example, by mass spectrometry.

The molecules captured on the first solid support are generally released just prior to re-capture on the second solid phase, which selectively captures the modified phosphopeptides, allowing efficient washing and removal of chemicals used to modify the captured polypeptides. However, the peptides can be released at an earlier stage, even after the initial capture, if binding to the first solid phase is intended only to transfer a label or tag to the captured polypeptides. Alternatively, the modification of phosphopeptides can be carried out essentially as described in Zhou et al., and then the recovered phosphopeptides captured and labeled essentially as described in Example I.

This example demonstrates the selective modification and isolation of phosphopeptides.

Throughout this application various publications have been referenced. The disclosures of these publications in their entireties are hereby incorporated by reference in this application in order to more fully describe the state of the art to which this invention pertains.

Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, those skilled in the art will readily appreciate that the specific experiments detailed are only illustrative of the invention. It should be understood that various modifications can be made without departing from the spirit of the invention.


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