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NpF2164g3 - Biologie

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Klasse: Cyanobacteriochrom

Familie: Cystein-Einsatz

Herkunft: Nostoc punctiforme

Chromophor(e): PCB

Statische Grundzustandsabsorptionsspektren sind für die 15ZPv dunkler Grundzustand (violette Kurve) und im 15EPÖ Grundzustand (orange Kurve). Spektren sind auf die Spitzenabsorption bei 280 nm skaliert (nicht gezeigt).

Verweise

  1. Die Photokonversion verändert die Bilin-Chromophor-Konjugation und die Protein-Sekundärstruktur im violett/orangefarbenen Cyanobacteriochrom NpF2163g3. Lim S1, Rockwell NC, Martin SS, Dallas JL, Lagarias JC, Ames JB.
  2. Diverse Zwei-Cystein-Photozyklen in Phytochromen und Cyanobakteriochromen. Rockwell NC1, Martin SS, Feoktistova K, Lagarias JC.
  3. Primäre und sekundäre Photodynamik der Violett/Orange Dual-Cystein NpF2164g3 Cyanobacteriochrome Domäne von Nostoc Punctiforme, Sean M. Gottlieb, Peter W. Kim, Scott C. Corley, Dörte Madsen, Samuel J. Hanke, Che-Wei Chang, Nathan C. Rockwell, Shelley S. Martin, J. Clark Lagarias und Delmar S. Larsen, Biochemie, 53, 1029–1040 (2014).


Hydrophobe Rückstände in der Nähe der Bilin-Chromophor-Bindungstasche modulieren die spektrale Abstimmung der Cyanobakteriochrome der Insert-Cys-Unterfamilie

Cyanobacteriochrome (CBCRs) sind eine Unterfamilie von Phytochrom-Photorezeptoren, die ausschließlich in photosynthetischen Cyanobakterien vorkommen. Vier CBCRs mit einem zweiten Cys in der Insert-Region (Insert-Cys) wurden aus dem nicht heterozystischen Cyanobakterium identifiziert Mikrokoleus B353 (Mbr3854g4 und Mbl3738g2) und das stickstofffixierende, heterozyste Cyanobakterium Nostoc punctiforme (NpF2164g3 und NpR1597g2). Diese Insert-Cys-CBCRs können Licht im nahen UV- bis orangefarbenen Bereich wahrnehmen, aber Schlüsselreste, die für die Abstimmung ihrer Farbempfindlichkeit verantwortlich sind, wurden nicht beschrieben. In der vorliegenden Studie wurden die Photosensoren Mbr3854g4 (UG1) und Mbl3738g2 (UG2) im nahen UV/Grün (UG) zur weiteren spektroskopischen Analyse ihrer spektralen Empfindlichkeit und Abstimmung ausgewählt. In Übereinstimmung mit den meisten Dual-Cys-CBCRs bildeten beide UGs über das Insert-Cys eine zweite Thioether-Bindung zum Phycocyanobilin (PCB)-Chromophor. Diese Bindung unterliegt während der Vorwärts- und Rückwärts-Photoumwandlung einem Bruch und einer Neuverknüpfung. Variationen in Phe-äquivalenten Resten, die in engem Kontakt mit dem PCB-Chromophor-D-Ring in kanonischen Rot/Grün-CBCRs stehen, sind für die Abstimmung der Lichtabsorptionspeaks sowohl von dunklen als auch von Photoprodukten verantwortlich. Dies ist das erste Mal, dass diese Schlüsselreste, die die Lichtabsorption in CBCRs der Insert-Cys-Familie steuern, identifiziert und charakterisiert wurden.


Abstrakt

Cyanobacteriochrome (CBCRs) sind photoschaltbare lineare Tetrapyrrol (bilin)-basierte Lichtsensoren der Phytochrom-Superfamilie mit einem breiten Spektralbereich vom nahen UV bis zum fernen Rot (330 bis 760 nm). Die jüngste Entdeckung von dunkelrot absorbierenden CBCRs (frCBCRs) hat aufgrund der tiefen Penetration von dunkelrotem Licht in Säugetiergewebe und der geringen Größe des CBCR-Proteingerüsts erhebliches Interesse in der optogenetischen und bildgebenden Gemeinschaft geweckt. Die vorliegenden Studien wurden durchgeführt, um die strukturelle Grundlage für die Absorption von Dunkelrot durch JSC1_58120g3, ein frCBCR aus dem thermophilen Cyanobakterium, zu bestimmen Leptolyngbya sp. JSC-1, das ein repräsentatives Mitglied einer phylogenetisch unterschiedlichen Klasse ist. Im Gegensatz zu den meisten CBCRs, die Phycocyanobilin (PCB) binden, ein Phycobilin, das natürlicherweise in Cyanobakterien und nur wenigen eukaryotischen Phototrophen vorkommt, entsteht die dunkelrote Absorption von JSC1_58120g3’ durch den Einbau des PCB-Biosynthese-Intermediats 18 1 ,18 2 -Dihydrobiliverdin (18 1 ,18 2-DHBV) und nicht das reduziertere und häufiger vorkommende PCB. JSC1_58120g3 kann auch ein dunkelrotes �sorbierendes Addukt mit dem weiter verbreiteten linearen Tetrapyrrol Biliverdin IXα (BV) ergeben, wodurch die Notwendigkeit der Koproduktion oder Ergänzung optogenetischer Zelllinien mit PCB umgangen wird. Unter Verwendung hochauflösender Röntgenkristallstrukturen von 18 1 ,18 2 -DHBV- und BV-Addukten von JSC1_58120g3 zusammen mit strukturgesteuerter Mutagenese haben wir Reste definiert, die für seine Verdin-Bindungspräferenz und seine dunkelrote Absorption entscheidend sind. Far-Rot-Sensorik und Verdin-Einbau machen diese frCBCR-Linie zu einer attraktiven Vorlage für die Entwicklung robuster optogenetischer und bildgebender Reagenzien für Anwendungen im tiefen Gewebe.

Fast alle Organismen nutzen photosensorische Proteine, um die Lichtumgebung zu erkennen und darauf zu reagieren. Bei vielen Tieren wird das Sehen durch Opsin-Photorezeptoren vom Typ II vermittelt, die einen retinalen Chromophor verwenden (1). Opsine vom Typ I umfassen lichtgesteuerte Protonen- und Ionenkanäle in Archaeen, Bakterien, Grünalgen und Pilzen (2, 3). Die Mitnahme zirkadianer Rhythmen in Hell-Dunkel-Zyklen kann retinalbasierte Opsine (4), Flavin-basierte Cryptochrome (5) oder Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensing-Domänen (LOV) umfassen (6, 7). LOV-Domänen werden auch in Phototropinen gefunden, den Photorezeptoren, die den Pflanzenphototropismus kontrollieren (8). Lineare auf Tetrapyrrol (Bilin) ​​basierende Phytochrom-Photorezeptoren sind in Pflanzen, Algen, Pilzen, Cyanobakterien und anderen Bakterien weit verbreitet (9, 10). Pflanzliche Phytochrome nutzen die 15,16-Doppelbindungs-Photoisomerisierung ihrer Bilin-Chromophore, um zwischen einem dunkeladaptierten 15Z rotabsorbierender Photozustand (PR) und ein 15E dunkelrot�sorbierend (PNS) Photoprodukt, das verschiedene Entwicklungsprozesse reguliert, einschließlich Samenkeimung, Chloroplastenentwicklung, Keimlingsbildung, Schattenvermeidung und Blüte (9, 11, 12).

Mitglieder der Phytochrom-Superfamilie sind attraktive Ziele für die Entwicklung optogenetischer und bildgebender Werkzeuge aufgrund ihrer starken Absorption im Nahinfrarotfenster, die eine optimale Lichtdurchlässigkeit und minimale Interferenz durch zelluläre Komponenten in Säugetiergewebe bietet (13). Reversible Rot- und Dunkelrot–vermittelte Bindung von Arabidopsis thaliana Phytochrom-B-Phytochrom-Interaktionsfaktoren wurden verwendet, um Gentranskription, Aktin-Assemblierung und GTP-abhängige Signalmodule mit Licht zu kontrollieren (14 �). Photoreversible Transkriptionskontrolle wurde auch in Bakterien unter Verwendung der Lichteintragsdomäne des cyanobakteriellen Phytochrom 1 (Cph1) von erreicht Synechozystis sp. PCC 6803 fusioniert mit der Empfänger-Ausgangsdomäne von OmpR (17 �). Umfangreiches Engineering bakterieller Phytochrome (BphPs) hat rot absorbierende und dunkelrot emittierende fluoreszierende Proteine ​​hervorgebracht (20 �). BphPs stellen eine nützliche Vorlage für solche Anwendungen dar, da sie ein stärker konjugiertes und längerwellig absorbierendes Biliverdin IXα (BV)-Chromophor anstelle der reduzierten Phycobiline Phycocyanobilin (PCB) und Phytochromobilin (P㩫) enthalten, die von Cyanobakterien, Algen, und pflanzliche Phytochrome (SI-Anhang, Abb. S1EIN). PCB und P㩫 sind auf sauerstoffhaltige photosynthetische Taxa beschränkt, während BV in einem breiteren Spektrum von Organismen einschließlich Säugetieren vorkommt (9, 25).

Kanonische Phytochrome, zu denen BphPs und pflanzliche/cyanobakterielle Phytochrome gehören, sind meist dimere Proteine ​​mit einem konservierten, N-terminalen photosensorischen PAS-GAF-PHY-Tridomänen-Kernmodul von � Aminosäuren. Versuche, kleinere, monomere Fluoreszenzsonden auf Basis von BphPs zu erzeugen, waren erfolgreich, aber die robustesten von diesen weisen im Wesentlichen blauverschobene Spektren auf (26). Die Entdeckung von Cyanobacteriochromen (CBCRs), entfernt verwandten, nur Bilin bindenden GAF-Photorezeptoren, die Licht im nahen UV-Bereich bis zum fernen Rot wahrnehmen (27 �), hat sich als aufregende Möglichkeit für die Entwicklung kleinerer optogenetischer Reporter und Kontrollelemente erwiesen. Mit strukturgesteuerten und zufälligen Mutagenese-Ansätzen haben zwei Gruppen BV-bindende CBCRs für Fluoreszenzanwendungen im dunkelroten Spektralbereich entwickelt (37, 38). Obwohl diese manipulierten Proteine ​​geringere Fluoreszenzquantenausbeuten aufweisen als manipulierte BV-bindende Phycobiliproteine ​​(39 �), könnten fluoreszierende CBCRs aufgrund der Kombination aus photoschaltbarer und lang anhaltender Fluoreszenz dennoch als Sonden für die superauflösende Mikroskopie vielversprechend sein (43). Aktuelle Far-Rot-Sensor-CBCRs (frCBCRs) sind möglicherweise vielversprechender als optogenetische Aktoren und photoakustische Kontrastmittel, die unter dunkelrotem Licht photokonvertieren, um lichtregulierte Reaktionen zu erzielen. Tatsächlich wurden CBCR-regulierte Histidin-Kinasen (cHKs) (18, 19, 44) und CBCR-regulierte photoschaltbare Adenylylzyklasen (cPACs) (45) genutzt, um die Genexpression in Zellen mit Grün/Rot, UV/Grün, Blau/ grüne und dunkelrote/rote Photozyklen.

Vor kurzem wurden zwei phylogenetisch unterschiedliche Cluster von natürlich vorkommenden frCBCRs identifiziert. Mitglieder des ersten Clusters von frCBCRs wurden nur von . gemeldet Acaryochloris marina MBIC 11017. Diese frCBCRs erkennen dunkelrotes Licht aufgrund ihrer Fähigkeit, BV in Abwesenheit von PCB einzubauen (37, 46 �). Diese frCBCR-Klade entstand innerhalb der erweiterten R ed/G reen (XRG) CBCR-Linie, und repräsentative Mitglieder zeigen typischerweise dunkelrot/orange (FR/O) Photozyklen, wenn sie an BV gebunden sind (15Z λmax ∼ 697 bis 702 nm) und Rot/Grün-Photozyklen bei Bindung an PCB (47 �). Basierend auf vier konservierten Resten, die ausreichend sind, um BV-Bindung zu verleihen (37), werden wir diese frCBCR-Familie als AmBV4-Linie bezeichnen. Interessant, A. Marina MBIC 11017 besitzt einen ungewöhnlich komplexen Stoffwechselweg für die PCB-Biosynthese. Dieses Cyanobakterium hat die Ferredoxin-abhängige Bilin-Reduktase PcyA dupliziert, die BV in PCB umwandelt (46, 50, 51). Eines dieser Enzyme wandelt BV schnell in PCB um, das andere ist ein langsameres Enzym, das das Zwischenprodukt 18 1 ,18 2 -DihydroBV (18 1 ,18 2 -DHBV) akkumuliert, das auch AmBV4-CBCRs binden können (46). Der zweite Cluster von frCBCRs entstand stattdessen innerhalb der größeren Grün/Rot-(GGR)-Linie, die evolutionär weit von der XRG-Linie entfernt ist (52). Wir werden diese frCBCRs als “ F ar-R ed of the Greater G reen/R ed” (FRoGGR) CBCRs bezeichnen. FRoGGRs enthalten PCB und zeigen die am stärksten rotverschobene bekannte Absorption in ihren dunklen Zuständen mit PCB-abgeleiteten Chromophoren (λmax 725 bis 755 nm), aber binden BV nicht (35).

In diesem Bericht charakterisieren wir eine dritte Gruppe von frCBCRs. Typisiert durch das far-red/red (FR/R) CBCR JSC1_58120g3 von Leptolyngbya sp. Stamm JSC-1, der kürzlich verwendet wurde, um ein dunkelrotes–-responsives cPAC (45) zu entwickeln, Mitglieder dieser frCBCR-Linie schließen Phycobiline aus und integrieren BV oder 18 1 ,18 2 -DHBV, um Sensoren mit dunkelroten Absorptionsmaxima (& #x003bbmax 712 bis 728 nm). Diese monophyletische Klasse von CBCRs entstand ebenfalls innerhalb der XRG-Linie, unterscheidet sich jedoch phylogenetisch von der AmBV4-Klasse der frCBCRs. Hochaufgelöste Kristallstrukturen von JSC1_58120g3 identifizieren einen konservierten Prolinrest in der Nähe des Bilin-A-Rings, der für den Ausschluss von Phycobilinen mit reduzierten A-Ringen essentiell ist. Aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit, BV und ihrer rotverschobenen FR/R-Photozyklen im Vergleich zu AmBV4-Proteinen zu binden, schlagen wir vor, dass diese frCBCRs ausgezeichnete Kandidaten für optogenetische und/oder dunkelrote Bildgebungsanwendungen sind.


Ergebnisse

Identifizierung von entscheidenden Rückständen für die BV-Gründung.

Um zu überprüfen, ob AnPixJg2 BV inkorporieren könnte, wurde His-markiertes AnPixJg2 aus dem BV-produzierenden . gereinigt Escherichia coli. Obwohl AnPixJg2 BV binden konnte und eine reversible Photokonversion zwischen einer Pfr-Form mit einem Absorptionsmaximum bei 698 nm und einer Po-Form mit einem Maximum bei 614 nm zeigte, war die Bindungseffizienz im Vergleich zu AM1_C0023g2 (70%) relativ gering (3,7 ± 1,9 %) und AM1_1557g2 (40%) (Abb. 1 EIN und B, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN und B) (25, 26). Wir haben auch berichtet, dass die BV-Bindungseffizienz von AM1_1870g3 so niedrig ist wie die von AnPixJg2 (27). Diese Tatsachen legen nahe, dass ein Sequenzvergleich basierend auf der AnPixJg2-Struktur (24) Hinweise auf den molekularen Mechanismus des BV-Einbaus geben könnte. Aus diesem Vergleich fanden wir, dass neun Reste zwischen AM1_C0023g2 und AM1_1557g2 innerhalb von 6 Å des Chromophors spezifisch konserviert waren, nämlich Val273, Gln307, Tyr310, Lys318, Thr325, Ser334, Tyr335, Asp337 und Val353 in AM1_C0023g2. Diese entsprechen den Resten Ala256, Glu290, His293, Arg301, Phe308, Gly317, His318, Ser320 und Ile336 in AnPixJg2 (SI-Anhang, Abb. S1 C und D). Unter diesen wurde bereits gezeigt, dass die Ser334/Gly317-Position für die BV-Bindung in AM1_C0023g2 wichtig ist, und der Ersatz von Ser334 durch Gly verbessert die Stabilität des BV-bindenden Holoproteins (25). Dies legt nahe, dass Gly317 in AnPixJg2 potenziell wichtig für die BV-Bindungsfähigkeit ist. Daher haben wir uns auf die anderen acht Reste in AnPixJg2 konzentriert (Details zur Gly/Ser-Position finden Sie im Abschnitt „Gly/Ser-Position“ in SI-Anhang) und führte individuelle ortsgerichtete Mutagenesen an AnPixJg2 durch: A256V, E290Q, H293Y, R301K, F308NS318Y, S320D, und ich336V. Alle E coli Zellen, die diese Varianten exprimierten, zeigten ähnliche Farben und waren visuell nicht von denen zu unterscheiden, die das Wildtyp-Protein exprimierten (SI-Anhang, Abb. S1E).

Protein-Engineering von AnPixJg2 für den BV-Einbau. (EIN) Phänotypen des nicht manipulierten AnPixJg2-Wildtyps. Abgebildet sind E coli Zellpellet (Oben links), Farbänderung einer Lösung bei Bestrahlung mit dunkelrotem oder orangefarbenem Licht (Oben rechts), normalisierte Absorptionsspektren des dunklen Zustands (Pfr-Form, dunkelrot) und des Photoprodukts (Po-Form, orange) (Untere). (B) BV-bindende Wirkungsgrade (Oberer, höher, tiefrosa) und relative Ausdrucksverbesserungen (Untere, hellblau) von AnPixJg2 und seinen Varianten. Die Effizienzen wurden basierend auf den Protein- und Chromophorkonzentrationen (Mittelwert ± SD, n = 5). Die Verstärkungen wurden basierend auf der Extinktionspeakfläche bei 700 nm während der Chromatographie geschätzt und auf das Frischzellgewicht normalisiert (Mittelwert ± SD, n = 4). Details wurden in . gegeben Materialen und Methoden. Signifikante Unterschiede im Vergleich zu AnPixJg2_BV4 wurden von der Studentin statistisch nachgewiesen T Prüfung (*P < 0,05 und **P < 0,01 jeweils). (C) Phänotypen von konstruiertem AnPixJg2_BV4. Abgebildet sind E coli Zellpellet (Oben links), Farbänderung einer Lösung bei Bestrahlung mit dunkelrotem oder orangefarbenem Licht (Oben rechts) und normierte Absorptionsspektren des dunklen Zustands und des Photoprodukts (Untere).

Biochemische Eigenschaften von BV-gebundenem AnPixJg2 und seinen Varianten

Daher konstruierten wir eine Mutante, in der die acht Reste von AnPixJg2 gleichzeitig durch die entsprechenden Reste ersetzt wurden, die zwischen AM1_C0023g2 und AM1_1557g2 konserviert wurden. Die Mutante AnPixJg2_BV8 (A256V, E290Q, H293Y, R301K, F308NS318Y, S320D, und ich336V) zeigte eine signifikante Verbesserung der BV-Inkorporation unter Beibehaltung einer reversiblen Photokonversion von tiefrot/orange. Um die BV-Einbaufähigkeit der Proteinvarianten zu bewerten, haben wir zwei Parameter festgelegt: die BV-Bindungseffizienz des gereinigten Proteins und die Expressionsverstärkung des Holoproteins im Vergleich zum Wildtyp-Protein (Berechnungsdetails sind beschrieben als Materialen und Methoden). Die Bindungseffizienz und Expressionsverstärkung von AnPixJg2_BV8 betrugen das 52,6 ± 9,1 % bzw. das 52,6 ± 19,5fache (Abb. 1B, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN und B).

Basierend auf der PCB-bindenden AnPixJg2-Struktur ist es unwahrscheinlich, dass die Seitenketten von Ala256, Glu290 und Ser320 direkt an der Chromophor-Bindung beteiligt sind (SI-Anhang, Abb. S1C). Darüber hinaus identifizierten wir eine weitere BV-bindende CBCR-GAF-Domäne, AM1_6305g2, aus dem Cyanobakterium A. Marina (SI-Anhang, Abb. S3 und Tabelle S1). Diese Domäne besitzt ein His anstelle des Lys in AM1_C0023g2 und AM1_1557g2 an der Position, die Arg301 in AnPixJg2 entspricht (SI-Anhang, Abb. S1D). So konstruierten wir eine Mutante, AnPixJg2_BV4 (H293Y, F308NS318Y und ich336V), in dem die oben genannten vier Reste zu Originalen zurückgeführt wurden. Die Mutante konnte BV binden, zeigte eine dunkelrot/orange reversible Photokonversion, und ihre Bindungseffizienz und Expressionsverstärkung betrugen das 74,7 ± 13,0 % bzw. 75,7 ± 8,6-fache, was signifikant höher war als die von AnPixJg2_BV8 (Abb. 1 .). B und C, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN und B). Dies legt nicht nur nahe, dass die anderen vier Reste für die BV-Bindung entbehrlich sind, sondern dass einige tatsächlich inhibitorisch waren.

Um die Anzahl der mutagenisierten Reste weiter zu reduzieren, konstruierten wir vier Arten von Mutanten, bei denen jeder mutierte Rest von AnPixJg2_BV4 wieder auf das Original zurückgeführt wurde: AnPixJg2_BV3H293 (F308NS318Y und ich336V), AnPixJg2_BV3F308 (H293Y, H318Y und ich336V), AnPixJg2_BV3H318 (H293Y, F308T, und ich336V) und AnPixJg2_BV3I336 (H293Y, F308T und H318Y). Alle Mutanten zeigten eine dunkelrot/orange reversible Photokonversion (SI-Anhang, Abb. S2EIN). Die Bindungseffizienz von AnPixJg2_BV3H293, AnPixJg2_BV3F308, AnPixJg2_BV3H318, und AnPixJg2_BV3I336 54,2 ± 18,6 %, 4,0 ± 2,1 %, 41,4 ± 15,7 % bzw. 38,5 ± 13,8 %, während ihre Expressionsverbesserungen das 44,7 ± 4,0, 1,3 ± 0,3, 49,0 ± 3,4 bzw. 22,5 ± 5,9-fache betrugen (Abb. 1B, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2B). Die Bindungseffizienz und Expressionsverstärkung aller AnPixJg2_BV3-Varianten waren signifikant niedriger als die von AnPixJg2_BV4, aber AnPixJg2_BV3F308 zeigten die größten Verringerungen sowohl der Bindungseffizienz als auch der Expressionsverstärkung, was darauf hindeutet, dass es die wichtigste Rolle bei der BV-Inkorporation spielt. Außerdem AnPixJg2_BV3I336 zeigte einen größeren Defekt in der Expressionsverstärkung als AnPixJg2_BV3H293 und AnPixJg2_BV3H318, was darauf hindeutet, dass die I336V-Ersetzung kann eine wichtigere Rolle spielen als H293Y und H318Y-Ersatz. Diese Überlegung veranlasste uns, AnPixJg2_BV2 (F308T und ich336V.). AnPixJg2_BV2 band BV mit einer Bindungseffizienz von 37,8 ± 21,3% und einer 23,1 ± 7,4-fachen Expressionsverstärkung und zeigte eine reversible Photokonversion von tiefrot/orange (Abb. 1 .).B, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN und B). Obwohl seine Bindungseffizienz und Expressionsverstärkung etwas geringer waren als die von AnPixJg2_BV3H293 und AnPixJg2_BV3H318, AnPixJg2_BV2 behielt im Vergleich zum Wildtyp-Protein eine mäßig hohe BV-Einbaufähigkeit bei. Außerdem hatten wir bereits AnPixJg2_F . konstruiert308T und AnPixJg2_I336V und hatten festgestellt, dass ihre BV-Bindungseffizienzen (10,1 ± 10,1 % bzw. 13,0 ± 6,7 %) und Expressionsverstärkungen (3,5 ± 1,0 bzw. 1B, Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN und B). Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die Reste Tyr293, Thr308, Tyr318 und Val336 für den BV-Einbau essentiell sind, wobei Thr308 und Val336 wahrscheinlich kritischer sind als Tyr293 und Tyr318.Zusammenfassend ist AnPixJg2_BV4 die Variante mit der effizientesten und stabilsten BV-Einbindung. Die Sektion "Spektraler Vergleich von AnPixJg2 und seinen Varianten" in SI-Anhang präsentiert die Details der spektralen Eigenschaften dieser Proteinvarianten (Tabelle 1 und SI-Anhang, Abb. S2 EIN, C, und D).

Strukturelle Einblicke in die BV-Gründung.

Um direkte Einblicke in den molekularen Mechanismus des BV-Einbaus zu erhalten, haben wir die Kristallstruktur (1.6 Å Auflösung) der Pfr-Form von AnPixJg2_BV4 (SI-Anhang, Abb. S4 EINC und Tabelle S2, siehe Abschnitt „SI-Anhang, Bestimmung der Kristallstruktur“ für Details), das die beste BV-Integration unter den AnPixJg2-Varianten aufwies. Die Gesamtstruktur von BV-gebundenem AnPixJg2_BV4 war der von PCB-gebundenem AnPixJg2 ziemlich ähnlich (der quadratische Mittelwert der Abweichung betrug 0,908 Å für die Cα-Atome der Reste 233–388), außer dass die N-terminale α-Helix in der orientiert war entgegengesetzte Richtung, die ein Artefakt sein kann, das von der Kristallpackung herrührt (SI-Anhang, Abb. S4 D und E). Insbesondere Elektronendichtekarten (2|FÖ| − |FC|) zeigte deutlich, dass der kanonische Cys-Rest (Cys321) von AnPixJg2_BV4 an die C3 2 -Position in der Vinylgruppe von BV gebunden war, während der von AnPixJg2 an die C3 1 -Position in der Ethylidengruppe von PCB gebunden war (Abb. 2 EIN und B und SI-Anhang, Abb. S4 D und E). Da zusätzlicher Kohlenstoff (C3 2 ) in die kovalente Bindung zwischen dem C3 des A-Rings und dem Schwefelatom von Cys321 eingefügt wurde, wurde das in AnPixJg2_BV4 eingebaute BV relativ zum PCB der WT-Struktur verschoben, wobei die Verschiebung berechnet wurde als etwa 0,75 . Bemerkenswert ist, dass der Ring C im Vergleich zu dem in AnPixJg2 eingebauten PCB zu den β-Faltblättern der Chromophor-Bindungstasche verschoben ist (Abb. 2C). Dennoch waren die strukturellen Anordnungen von fünf Resten (Trp289, Asp291, Arg301, His322 und Tyr352), von denen berichtet wurde, dass sie für die Chromophorstabilität wichtig sind (24), zwischen diesen beiden Strukturen hoch konserviert (Abb. 2 .). EIN und B und SI-Anhang, Abb. S4 F und g, dargestellt als gelbgrün bzw. tiefrosa). Obwohl Tyr352 an den β-Faltblättern lokalisiert war, verlagerte sich sein Interaktionspartner, die D-Ring-Carbonylgruppe, kaum in Richtung der β-Faltblätter, sodass diese Wechselwirkung zwischen diesen beiden Strukturen erhalten bleiben sollte. Arg301 nahm in den beiden Proteinen auf unterschiedliche Weise an der Chromophor-Bindung teil. In AnPixJg2_BV4 stabilisierte es das Ring-C-Propionat von BV durch Wasserstoffbrückenbindung über ein Wassermolekül, während es in AnPixJg2 direkt über Wasserstoffbrücken mit dem gleichen Propionat von PCB interagierte.

Kristallstruktur der Pfr-Form von AnPixJg2_BV4 gebunden an BV (PDB-ID-Code: 5ZOH) im Vergleich mit der Pr-Form von AnPixJg2 gebunden an PCB (PDB-ID-Code: 3W2Z). (EIN und B) Strukturelle Anordnungen von konservierten und BV4-Resten in AnPixJg2_BV4 (tiefrosa bzw. tiefrot) und AnPixJg2 (gelbgrün bzw. blaugrün). (C) Strukturvergleich zwischen BV (hellgrün) und PCB (blau) mit dem kanonischen Cys (Cys321) als Stabmodell mit Darstellung von β-Faltblättern als Bandmodell. (D) Raumfüllende Modelle der Chromophore mit Phe/Thr308- und Ile/Val336-Resten: AnPixJg2_BV4 (Oberer, höher) und Überlagerung von BV auf AnPixJg2 (Mitte) und AnPixJg2 (Untere).

Obwohl die Seitenketten der vier Mutationsstellen (His293, Phe308, His318 und Ile336) in beiden Strukturen um den Ring C der Chromophore positioniert waren, waren die Protein-Chromophor-Wechselwirkungen dieser Seitenketten zwischen diesen beiden Strukturen völlig unterschiedlich ( Abb. 2 EIN und B und SI-Anhang, Abb. S4 F und g, dargestellt als blaugrün bzw. tiefrot). In den Positionen Phe/Thr308 und Ile/Val336 hielten die sperrigen Phe308- und Ile336-Reste von AnPixJg2 den C-Ring durch hydrophobe Wechselwirkungen (Abb. 2D, Untere). Da diese Reste an den β-Faltblättern um den C-Ring lokalisiert waren, sollten diese Reste durch die Chromophorverschiebung beeinflusst werden. Die Tatsache, dass AnPixJg2 BV nicht effizient binden konnte, bedeutet, dass diese sperrigen Reste eine sterische Hinderung des C-Rings verursachen können, der im Vergleich zu PCB stark in Richtung der β-Faltblätter verschoben ist (Abb. 2C). Diese Interpretation wird durch die Überlagerung von BV auf der AnPixJg2-Struktur unterstützt (Abb. 2D, Mitte). Umgekehrt vermieden die kompakten Reste Thr308 und Val336 von AnPixJg2_BV4 eine sterische Hinderung mit dem C-Ring (Abb. 2D, Oberer, höher). Bemerkenswert ist, dass das Ring-C-Propionat von BV in vertikaler Richtung zur B–C-Ebene lag, während das von PCB parallel zur Ebene lag (Abb. 2 EIN und B). Dies legt nahe, dass nicht nur der Ersatz durch kompakte Reste, sondern auch eine flexible Umlagerung des Ring-C-Propionats für den BV-Einbau wichtig ist (Abb. 2 EIN und B). In diesem Zusammenhang tragen die anderen Ersetzungen an den Positionen His/Tyr293 und His/Tyr318 zur Umlagerung bei (Abb. 2 EIN und B und SI-Anhang, Abb. S4 F und g). Das His318 von AnPixJg2 wechselwirkte mit dem Ring-B-Propionat von PCB über eine direkte Wasserstoffbrücke, während das Tyr318 von AnPixJg2_BV4 direkt mit dem Ring-C-Propionat von BV über eine Wasserstoffbrücke wechselwirkte. Das His293 von AnPixJg2 stabilisierte das Ring-C-Propionat von PCB durch Wasserstoffbrückenbindung über ein Wassermolekül, während Tyr293 von AnPixJg2_BV4 keine Wasserstoffbrücken mit dem Chromophor bildete. Diese charakteristischen Wechselwirkungsnetzwerke sollten „parallele“ und „vertikale“ Konformationen des Ring-C-Propionats ermöglichen. Der Austausch von His318 durch Tyr führte nämlich zum Wechsel des Wechselwirkungspartners vom Ring-B-Propionat zum Ring-C-Propionat und trug direkt zur vertikalen Konformation bei, während der Austausch von His293 durch Tyr zur Entfernung von Wasserstoffbrücken mit dem Ring-C-Propionat führte, um einen Beitrag zu zur Destabilisierung der Parallelkonformation. Darüber hinaus ist die Hydroxygruppe von Thr308 indirekt über ein Wassermolekül mit dem Ring-C-Propionat von BV Wasserstoffbrückenbindungen verbunden (Abb. 2EIN und SI-Anhang, Abb. S4F), was auch die vertikale Konformation erleichterte. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch von Phe308 durch Thr nicht nur Auswirkungen auf die Verringerung der sterischen Hinderung hat, sondern auch auf die Umlagerung des Ring-C-Propionats, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass F308T-Ersatz hatte den größten Beitrag zur effizienten BV-Inkorporation (Abb. 1B und Tabelle 1). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese vier Reste in AnPixJg2_BV4 kooperativ arbeiten, um Probleme zu lösen, die durch die Chromophorverschiebung ausgelöst werden, was zu einem stabilen BV-Einbau führt.

Proteinengineering der anderen GAF-Domänen.

Um unsere Strategie auf andere CBCR-GAF-Domänen innerhalb der XRG-Linie auszudehnen, zielten wir auf mehrere Domänen mit einem PCB-Chromophor ab, die atypische spektrale Eigenschaften aufweisen: AnPixJg4 (Pg-to-Pr-schnelle Dunkelreversion) (28) AM1_1186g2 (rot/blau reversible Photokonversion) (29) AM1_1870g3 (rotverschobene rot/grüne reversible Photokonversion) (27) NpF2164g3 (violett/orange reversible Photokonversion) (30) und NpF2164g5 (intensive dunkelrote Fluoreszenz ohne Photokonversion) (31). Da alle diese Wildtyp-Proteine ​​einen geringen oder keinen BV-Einbau aufweisen (Abb. 3 A–C und SI-Anhang, Abb. S5 EINJ und Tabelle S1) haben wir diese Domänen für den BV-Einbau basierend auf der AnPixJg2_BV4-Sequenz (SI-Anhang, Abb. S5K).

Protein-Engineering anderer XRG-CBCR-GAF-Domänen für den BV-Einbau. (EIN) Normalisierte Absorptionsspektren der dunklen Zustände (Pfr-Form, dunkelrot) und der Photoprodukte (Po-Form, orange) von AnPixJg4 (gepunktet) und seiner BV4-Variante gebunden an BV (durchgezogen). (B) Normalisierte Absorptionsspektren der dunklen Zustände und der Photoprodukte von AM1_1870g3 (gestrichelt) und seiner BV4-Variante gebunden an BV (durchgezogen). (C) Normalisierte Absorptionsspektren der dunklen Zustände von NpF2164g5 (gestrichelt) und seiner BV4-Variante gebunden an BV (durchgezogen). (D) Normalisierte Absorptionsänderungen von AnPixJg4_BV4 (gelb) und AnPixJg2_BV4 (grün) während eines Hell-Dunkel-Übergangs. Die Halbwertszeiten von AnPixJg4_BV4 und AnPixJg2_BV4 betrugen 2,8 s ± 0,1 und 1.199 s ± 12,9 (Mittelwert ± SD, n = 3) jeweils bei 25 °C. (E) Normalisierte Differenzabsorptionsspektren (Pfr – Po) von AM1_1870g3_BV4 (rot) und AnPixJg2_BV4 (grün). Die positiven Peaks lagen bei 718 nm bzw. 700 nm. (F) Normalisierte Fluoreszenzanregungs- (blau) und Fluoreszenzemissionsspektren (rot) von NpF2164g5_BV4 gebunden an BV (tiefe Farben) und NpF2164g5 gebunden an PCB (helle Farben). Die Fluoreszenzanregungs- und Emissionspeaks von BV-gebundenem NpF2164g5_BV4 lagen bei 680 nm bzw. 700 nm, während diejenigen von PCB-gebundenem NpF2164g5 bei 637 nm bzw. 656 nm lagen.

Die Einführung von Mutationen in AnPixJg4, AM1_1870g3 und NpF2164g5 verbesserte die BV-Bindungseffizienz signifikant, die 44 %, 82 % bzw. 70 % betrug (Abb. 3 .). A–C und SI-Anhang, Abb. S5 EINC und Fh und Tabelle S1). Im Gegensatz dazu verbesserte die Einführung derselben Mutationen in AM1_1186g2 und NpF2164g3, deren Sequenzen in der Nähe des Chromophors stark von denen typischer XRG-CBCR-GAF-Domänen einschließlich AnPixJg2 abweichen, die BV-Bindungseffizienz nicht (SI-Anhang, Abb. S5 D, E, ich, und J und Tabelle S1). AnPixJg4_BV4 zeigte eine Pfr-zu-Po-Photokonversion und eine schnelle Po-zu-Pfr-Dunkelreversion, wobei die Halbwertszeit der AnPixJg4_BV4-Dunkelreversion 2,8 s ± 0,1 bei 25 °C betrug. Dies ist etwa 400-mal schneller als bei AnPixJg2_BV4 (1.199 s ± 12,9 bei 25 °C) (Abb. 3 EIN und D und SI-Anhang, Abb. S5EIN). Eine schnellere Dunkelreversion ermöglicht die Regulierung biologischer Aktivitäten durch monochromatische Beleuchtung mit tiefrotem Licht. AM1_1870g3_BV4 zeigte eine reversible Dunkelrot/Orange-Photokonversion, deren Differenzspektrum (Pfr – Po) einen positiven Peak bei 718 nm besitzt, der im Vergleich zu AnPixJg2_BV4 um 18 nm rotverschoben ist (Abb. 3 B und E und SI-Anhang, Abb. S5B). Diese rotverschobene Eigenschaft ist für die optogenetische Kontrolle in tiefen Geweben bei Säugetieren von Vorteil. NpF2164g5_BV4 absorbierte dunkelrotes Licht stabil ohne Photokonversion und zeigte eine Fluoreszenz, die den nahen Infrarotbereich (NIR) mit einer Quantenausbeute von 4% bedeckte. Anregungs- und Emissionsspektren von NpF2164g5_BV4, das an BV gebunden ist, erreichten einen Peak bei 680 nm bzw. 700 nm und waren im Vergleich zu denen von NpF2164g5, das an PCB gebunden war, rotverschoben (Abb. 3 C und F und SI-Anhang, Abb. S5C). Es ist anzumerken, dass das Fluoreszenzanregungsspektrum eine markante Schulter bei 641 nm zeigte, was eine heterogene Population widerspiegeln könnte. Detaillierte Studien wie die Strukturbestimmung dieses Moleküls sind erforderlich, um diese einzigartige Fluoreszenzeigenschaft zu verstehen. Im Gegensatz dazu sind Variantenproteine ​​basierend auf AnPixJg2_BV2 und dem AnPixJg2_BV3H293 Sequenzen konnten BV nicht effizient binden (SI-Anhang, Abb. S5 EINC). Diese Ergebnisse zeigen, dass der „BV4“-Ersatz ein robustes Konstruktionsdesign ist, um die BV-Bindungsfähigkeit zu erzeugen.

Fluoreszenzbildgebung bei lebenden Mäusen unter Verwendung von NpF2164g5_BV4.

Wir zeigen, dass das kompakte NIR-Fluoreszenzprotein NpF2164g5_BV4 für die In-vivo-Bildgebung in lebenden Mäusen geeignet ist. Um seine Anwendbarkeit zu bestimmen, haben wir zuerst getestet, ob die NIR-Fluoreszenz von NpF2164g5_BV4 in einer lebenden Säugerzelle beobachtet werden kann. COS-7-Zellen wurden mit NpF2164g5_BV4 transfiziert. Nach der Inkubation mit BV wurden die Zellen unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops abgebildet. Um die NIR-Fluoreszenz von NpF2164g5_BV4 quantitativ zu bewerten, fusionierten wir es mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) und normalisierten Variationen seiner Expressionsniveaus, indem wir die NIR-Fluoreszenz durch die GFP-Fluoreszenz dividierten. Die Zellen, die NpF2164g5_BV4 exprimierten, zeigten eine helle NIR-Fluoreszenz im Vergleich zu denen, die GFP als Negativkontrolle exprimierten (Abb. 4 .). EIN und B). Als nächstes untersuchten wir, ob die NIR-Fluoreszenz von NpF2164g5_BV4 in lebenden Mäusen in vivo abgebildet werden könnte. Wir transfizierten die Leber von Mäusen vorübergehend mit NpF2164g5_BV4 durch Injektion in die hydrodynamische Schwanzvene (HTV). Die transfizierten Mäuse wurden i.v. BV injiziert und dann unter Verwendung eines in-vivo-Fluoreszenz-Imagers abgebildet. NIR-Fluoreszenz von NpF2164g5_BV4 wurde aus der Leber der transfizierten Mäuse beobachtet (Abb. 4 C und D). Außerdem wurde bestätigt, dass die isolierte Leber der transfizierten Mäuse im Vergleich zu der der nicht injizierten Mäuse eine helle NIR-Fluoreszenz aufwies (Fig. 4'). E und F). Diese Ergebnisse zeigen, dass NpF2164g5_BV4 auf die in vivo-Fluoreszenz-Bildgebung von tiefen Geweben lebender Mäuse anwendbar ist.

Fluoreszenzbildgebung in lebenden Säugerzellen und Mäusen mit NpF2164g5_BV4. (EIN) Konfokale Fluoreszenzbilder von mit GFP-NpF2164g5_BV4 transfizierten COS-7-Zellen (Links), GFP als Negativkontrolle (Center) oder GFP-iRFP (Rechts). NIR-Fluoreszenz wurde bei 640 nm bei Anregung bei 633 nm nachgewiesen. GFP-Fluoreszenz wurde bei 500 nm nach Anregung bei 488 nm nachgewiesen. Der Farbbalken unter jedem Bild zeigt den Bereich der Fluoreszenzintensität (FI). Repräsentative Bilder aus drei unabhängigen Experimenten (n = 24). (B) NIR-Fluoreszenzintensitäten von COS-7-Zellen, die mit GFP-NpF2164g5_BV4, GFP als Negativkontrolle oder GFP-iRFP transfiziert wurden. Um Variationen ihrer Expressionsniveaus zwischen den transfizierten Zellen zu normalisieren, wurde die NIR-Fluoreszenz durch die GFP-Fluoreszenz geteilt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 24, aus drei unabhängigen Experimenten). Zahlen über den Balken geben die Mittelwerte an. Die Daten wurden statistisch von zweischwänzigen Welchs analysiert T Prüfung (*P < 0,05). (C) Überlagerung von Licht- und NIR-Fluoreszenzbildern von lebenden Mäusen. Gezeigt ist eine transfizierte Maus mit GFP-NpF2164g5_BV4 (C, Links) und nicht injizierte Maus als Negativkontrolle (Rechts). Die NIR-Fluoreszenzbilder wurden mit Anregung bei 630 ± 6,5 nm und Emission bei 700 ± 37,5 nm aufgenommen und spektral entmischt, um die NIR-Fluoreszenz aus der Autofluoreszenz von Mausgeweben zu extrahieren. Details finden Sie in Materialen und Methoden. Fluoreszenzintensitäten sind in Pseudofarbe dargestellt. Repräsentative Bilder aus zwei unabhängigen Experimenten (n = 3). (D) Fluoreszenzintensitäten der Leber lebender Mäuse, die mit GFP-NpF2164g5_BV4 transfiziert oder nicht injiziert wurden (Mittelwert ± SD, n = 3, aus zwei unabhängigen Experimenten). Die Daten wurden statistisch von zweischwänzigen Welchs analysiert T Prüfung (*P < 0,05). (E) NIR-Fluoreszenzbilder der isolierten Leber einer transfizierten Maus (Oberer, höher) und Maus ohne Injektion (Untere). Gezeigt werden Lichtbild (E, Links) und NIR-Fluoreszenzbild aufgenommen mit Anregung bei 630 ± 6,5 nm und Emission bei 700 ± 37,5 nm (Rechts). Fluoreszenzintensitäten sind in Pseudofarbe dargestellt. Repräsentative Bilder stammen aus zwei unabhängigen Experimenten (n = 3). (F) Fluoreszenzintensitäten der isolierten Leber von Mäusen, die mit GFP-NpF2164g5_BV4 transfiziert oder nicht injiziert wurden (Mittelwert ± SD, n = 3, aus zwei unabhängigen Experimenten). Die Daten wurden statistisch von zweischwänzigen Welch's analysiert T Prüfung (*P < 0,05). (Skalenbalken: EIN, 20 μm E, 1cm.)

Wir verglichen NpF2164g5_BV4 mit iRFP, einem im nahen Infrarot fluoreszierenden Protein, das häufig für die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung verwendet wird (6). Mit iRFP transfizierte COS-7-Zellen wurden mit BV vor der Bildgebung wie im Fall von NpF2164g5_BV4 inkubiert. iRFP wurde zuvor durch umfangreiche Mutagenese eines BV-gebundenen Bakteriophytochroms hergestellt, RpBphP2, wie D202H-Mutation, um seine Photokonversion zu hemmen, und weitere 13 Mutationen, einschließlich derer um den D-Ring von BV, um seine Fluoreszenz stark zu erhöhen (6). NpF2164g5_BV4 weist jedoch Mutationen um die B- und C-Ringe auf, um die BV-Bindungseigenschaft zu verleihen, wurde jedoch noch keiner Mutagenese um den D-Ring von BV unterzogen, um seine Fluoreszenz zu verbessern. Dennoch hat die NIR-Fluoreszenzintensität von NpF2164g5_BV4 bereits 20 % der von iRFP erreicht (Abb. 4 EIN und B), was darauf hindeutet, dass NpF2164g5_BV4 eine Plattform zur Entwicklung einer leistungsstarken, kompakten NIR-Fluoreszenzsonde für die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung sein könnte.


NpF2164g3 - Biologie

Cyanobacteriochrome (CBCRs) sind cyanobakterielle Photorezeptoren, die entfernt mit Phytochromen verwandt sind. Wie Phytochrome wandeln sich CBCRs photoineinander um zwischen zwei Photozuständen, die die Photoisomerisierung ihrer Bilin-Chromophore begleiten. Während Phytochrome typischerweise Rot/Far-Rot-Photozyklen aufweisen, sind CBCR-Photozyklen viel vielfältiger und umfassen den nahen Ultraviolett- und den gesamten sichtbaren Bereich. Alle bisher beschriebenen CBCRs haben einen konservierten Cys-Rest, der kovalent an den linearen Tetrapyrrol(bilin)-Chromophor gebunden ist. Hier präsentieren wir die photodynamische Analyse des Insert-Cys CBCR NpF2164g3, einem Vertreter der zweiten Klasse von Zwei-Cystein-CBCRs. Mit Breitband-Transient-Absorptions-Pump-Probe-Spektroskopie charakterisieren wir die primäre (100 fs bis 10 ns) und sekundäre (10 ns bis 1 ms) Photodynamik in beide Richtungen und untersuchen die Photodynamik über neun Jahrzehnte. Primäre Isomerisierungsdynamiken treten sowohl bei Vorwärts- als auch bei Rückwärtsreaktionen auf einer Zeitskala von ∼10 ps auf. Im Gegensatz zu früheren Studien zu Tlr0924, einem Vertreter der anderen Klasse von Zwei-Cystein-CBCRs, sind Bildung und Eliminierung der zweiten Bindung langsamer als der hier untersuchte experimentelle Bereich von 1 ms. Diese Ergebnisse erweitern unser Verständnis von Dual-Cystein-CBCR-Photozyklen in der Phytochrom-Superfamilie


Dokument: Photochemische und neue Untersuchungen neuartiger Bilin-bindender Photorezeptoren

Diese Thesis beinhaltet insbesondere die kinetische Untersuchung verschiedener Photozyklen in Bezug auf mögliche Intermediate und deren Lebenszeiten. Dabei werden klassische Phytochrome aus den Familien der Cyanobakteriellen (Cph), der Bakteriophy-Tochromen (BphP) und der Pilzlichen (Fph) Phytochrome as also auch die neuartigen Cyanobacteriochrome (CBCRs) untersucht. Die zeitaufgelösten kinetischen Absorptionsmessungen wurden mittels der Methode der Blitzlichtphotolyse durchgeführt.

i) Vergleich der Photozyklen klassischer Phytochrome
Der erste Teil dieser Thesis beschäftigt sich mit der vergleichenden Gegenüberstellung von vier Phytochromen aus drei Phytochrom-Unterfamilien. Untersucht wurde SynCph2(1-2) aus Synechocystis sp. PCC 6803, welches eine GAF-GAF Bidomäne besitzt, wobei die Charakterisierung des Wildtyp-Proteins insbesondere die stabilisierende Wirkung der GAF2-Domäne auf den Bilin-Chromophor mit Hilfe von Punktmutationen genauer untersucht wurde. Außerdem wurden zwei Bacteriophytochrome, PstBphP1 aus Pseudomo-nas syringae pv. tomato und PaBphP aus Pseudomonas aeruginosa, welches zu den bathy-Phytochromen zählt, sowie ein pilzliches Phytochrom, FphA aus Aspergillus nidulans, spektroskopisch charakteristisch.

Es konnte gezeigt werden, dass die Alanin-Mutanten S385A und W389A von SynCph2(1-2) einen deutlichen Einfluss auf den Photozyklus und vor allem auf die Bil-dung des Pfr-Zustandes haben, wohingegen sich der Austausch in einer ähnlichen großen und aromatischen Aminosäure (W389F) nicht auswirkt. Der Bathychrom-Charakter von PaBphP wirkt nicht auf den Photozyklus aus und ist sehr vergleichbar zu den kanoni-schen Phytochromen wie CphA bzw. Cph1, wobei die Konversion aus dem Grundzustand in das Photoprodukt keine sichtbaren Intermediate aufzeigt. PstBphP1 und FphA fehlt im Vergleich zu den kanonischen Phytochromen ein Zwischenprodukt beim Übergang in den Pfr-Zustand was auf einen unterschiedlichen Prozess bei der Bildung des Photoprodukts hin-deutet. Die Rückkonversion verläuft bei PstBphP1 ‚klassisch‘, wohingegen bei FphA keine Intermediate identifiziert werden can.

ii) Spektroskopische Untersuchung dreier GAF-Domänen der CBCRs
Im zweiten Teil der Arbeit werden drei Vertreter der Cyanobacteriochrome unter-sucht. Die CBCRs nehmen in der Klasse der Phytochrome eine außergewöhnliche Stellung ein. Dies zeigt sich u.a. durch ihre Fähigkeit, mit Hilfe einer einzelnen GAF-Domäne den Chromophor kovalent zu binden und einen reversiblen, photochromen Photozyklus zu durchlaufen. Untersucht wurde die GAF3-Domäne von Slr1393 aus Synechocystis sp. PCC 6803, die einen Rot/Grün-Photozyklus zeigt, die GAF1-Domäne aus AphC aus Nostoc sp. PCC 7120, welcher einen klassischen Rot/Dunkelrot-Photozyklus aufweist, sowie sterben GAF3-Domäne aus einem gemeinsamen Organismus mit einem außergewöhnlichen Rot/Orange-Photozyklus, der durch sterben Erstellung zweier Punktmutationen in der Nähe des Chromo-phors (S487R und S487G) genauer untersucht wurde. Zusätzlich wurde bei 1393gaf3 der Einfluss der Chromophor-Bindung bei Zugabe in vivo als auch in vitro genauer untersucht. Genauere Informationen über Chromophor-Protein-Anwendungen konnten durch drei Mutanten (R508N, D531T und N532Y) erhalten werden, die bereits großen Einfluss auf die stationäre Absorption des Pg-Photoproduktes aufweisen.

Die CBCR GAF-Domänen zeigen im Vergleich zu den klassischen Phytochromen einen deutlich vereinfachten Photozyklus, der vermutlich auf die geringe Proteingröße und die dadurch mögliche hohe Flexibilität verursacht IST, sterben es leichter möglich macht, der durch die Chromophor-Isomerisierung erzwungenen Konfirmationsänderungen zu fol-gen . Das außergewöhnliche thermisch sehr instabile und deutlich weniger hypsochrom verschobene Photoprodukt der GAF3-Domäne von AphC lässt sich mit einem möglicher-weise gehinderten Intermediat eines rot/grün Photozyklus erklären. Die generierten Mutationen bewirkten eine deutlich stabilisierende Wirkung auf die thermische Rückkehr in den Grundzustand.

Photorezeptoren sind lichtdetektierende Systeme, die das externe Reizlicht in ein physiologisches Signal umwandeln, indem sie Intensität, Wellenlänge, Periodizität und Richtung erfassen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf den Phytochrom-Photorezeptoren. Phytochrome können in fünf gut definierte Familien unterteilt werden, die für ihre Chromophorstruktur und ihre jeweilige Photochemie spezifiziert sind. Eine dieser Familien, die „klassischen“ Phytochrome, erfüllen wichtige regulatorische Funktionen bei der Photomorphogenese von Pflanzen. Ihr lichtempfindlicher Teil besteht aus einer PAS-GAF-PHY-Struktur mit einem offenkettigen Tetrapyrrol (Bilin)-Chromophor, der kovalent an ein Cystein in der GAF-Domäne gebunden ist. In den letzten Jahrzehnten konnten auch in Bakterien und Pilzen kanonische Phytochrome mit einer solchen Domänenarchitektur nachgewiesen werden.

Diese Dissertation widmet sich insbesondere kinetischen Studien verschiedener Photozyklen mit dem Ziel, potenzielle Zwischenstufen und deren Lebensdauer zu identifizieren. Dazu wurden klassische Phytochrome aus den Familien der Cyanobakterien (Cph), Bakteriophytochrome (BphP) und Pilzphytochrome (Fph) sowie die neuartigen Cyanobakterien (CBCRs) untersucht. Die zeitaufgelösten kinetischen Absorptionsmessungen wurden mit der Methode der Blitzphotolyse durchgeführt.

i) Vergleich der Photozyklen klassischer Phytochrome
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden Analyse von vier Phytochromen, die zu drei Phytochrom-Unterfamilien gehören. Die Untersuchung von SynCph2(1-2) aus Synechocystis sp. PCC 6803, das eine photosensorische GAF-GAF-Bidomäne trägt, basiert auf der Charakterisierung des Wildtyp-Proteins und insbesondere auf der Mutationsanalyse der stabilisierenden Wirkung auf den Chromophor der GAF2-Domäne. Außerdem wurden zwei Bakteriochrome, PstBphP1 aus Pseudomonas syringae pv. Tomate und PaBphP aus Pseudo-monas aeruginosa (Mitglied der Bathy-Phytochrome) sowie ein Pilz-Phytochrom, FphA aus Aspergillus nidulans, wurden spektroskopisch charakterisiert.

Die Ergebnisse zeigen einen wichtigen Einfluss der Position 385 und 389 von SynCph2(1-2) auf den Photozyklus. Der Austausch dieser Aminosäuren in Alanine (S385A und W389F) beeinflusst insbesondere die Bildung des Pfr-Photoprodukts, während der Austausch an Position 389 in eine ähnlich große aromatische Aminosäure (W389F) keinen merklichen Effekt hat. Die bathochrome Natur von PaBphP verändert den Photozyklus nicht signifikant. Seine lichtgetriebenen Umwandlungen sind denen von kanonischen Phytochromen wie CphA oder Cph1 sehr ähnlich, obwohl die Photoumwandlung vom Ausgangszustand zum Photoprodukt keine merklichen Zwischenstufen zeigt. Sowohl PstBphP1 als auch FphA fehlt eine Zwischenstufe beim Übergang in den Pfr-Zustand (im Vergleich zu kanonischen Phytochromen), was auf unterschiedliche Prozesse bei der Bildung des Photoprodukts schließen lässt. Die Rückwandlung von PstBphP1 verläuft „klassisch“, während FphA keine identifizierbaren Zwischenstufen aufweist.

ii) Spektroskopische Untersuchung von drei GAF-Domänen von CBCRs
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden drei Vertreter der Cyanobacteriochrome untersucht. Innerhalb der Phytochrom-Photorezeptoren nehmen die CBCRs eine Ausnahmestellung ein. Dies zeigt sich unter anderem in ihrer Fähigkeit, den Chromophor kovalent zu binden und mit Hilfe nur einer GAF-Domäne einen reversiblen photochromen Photozyklus einzugehen. Diese Studie umfasste die GAF3-Domäne von Slr1393 von Synechocystis sp. PCC 6803, der einen Rot/Grün-Photozyklus zeigt, die GAF1-Domäne von AphC von Nostoc sp. PCC 7120, das einen klassischen Rot/Dunkelrot-Photozyklus sowie die GAF3-Domäne desselben Organismus mit einem außergewöhnlichen Rot/Orange-Photozyklus zeigt. Für diese CBCR-GAF-Domäne wurden auch zwei chromophornahe Punktmutationen (S487R und S487G) in die zeitaufgelöste Analyse einbezogen. Das bemerkenswerte thermisch sehr instabile und deutlich weniger hypsochrom verschobene Photoprodukt der GAF3-Domäne von AphC kann durch ein möglicherweise gehindertes Intermediat eines Rot/Grün-Photozyklus erklärt werden. Die erzeugten Mutationen bewirkten einen bemerkenswert stabilisierenden Effekt auf die thermische Erholung in den Mutterzustand.

Darüber hinaus wurde der Einfluss des Chromophor-Bindungsmodus entweder durch in-vivo- oder in-vitro-Addition für 1393gaf3 genauer untersucht. Weitere Informationen zu den Chromophor-Protein-Wechselwirkungen wurden anhand von drei Mutanten (R508N, D531T und N532Y) erhalten, die einen großen Einfluss auf die Steady-State-Absorption des Pg-Photoprodukts haben.


NpR3784 ist der Prototyp für eine charakteristische Gruppe rot/grüner Cyanobacteriochrome, die alternative Phe-Reste zur Abstimmung von Photoprodukten verwenden

Cyanobacteriochrome (CBCRs) sind photosensorische Proteine, die in Cyanobakterien vorkommen und mit den weit verbreiteten Phytochromen entfernt verwandt sind. Während pflanzliche Phytochrome auf rotes und tiefrotes Licht reagieren, verwenden CBCRs die gleiche Photoisomerisierung eines linearen Tetrapyrrol-(bilin)-Chromophors, um auf eine breite Palette von Farben zu reagieren. NpR6012g4 von Nostoc punctiforme und AnPixJ von Anabaena sp. PCC 7120 gehört zu einer großen Unterfamilie von Rot/Grün-CBCRs, die einen Rot-absorbierenden Dunkelzustand ähnlich dem von Phytochrom aufweisen, aber ein Grün-absorbierendes Photoprodukt eher als ein Dunkelrot-absorbierendes. In diesen kanonischen Rot/Grün-CBCRs ist das Photoprodukt relativ zur orangefarbenen Absorption in Abwesenheit der nativen Proteinstruktur blauverschoben. Diese spektrale Abstimmung des Photoprodukts erfordert einen konservierten Phe-Rest auf dem zweiten β-Strang der CBCR-GAF-Domäne, im Einklang mit einem Trapped-Twist-Mechanismus, bei dem das Bilin im Photoprodukt sterisch eingeschränkt ist. N. punctiforme produziert auch NpR3784, ein CBCR mit einem ähnlichen Rot/Grün-Photozyklus wie NpR6012g4. NpR3784 fehlen sowohl das &beta 2 Phe als auch andere Reste, die für die kanonischen Rot/Grün-CBCRs charakteristisch sind. In der aktuellen Arbeit identifizieren wir NpR3784-Homologe mit Rot/Grün-Photozyklen in anderen Cyanobakterien. Die spektrale Abstimmung in dieser NpR3784-Gruppe wird durch einen anderen Satz konservierter Phe-Reste erreicht, einschließlich eines charakteristischen Phe-Rests auf &beta. Dieser Satz von Phe-Resten kann nicht mit den Phe-Resten ausgetauscht werden, die in kanonischen rot/grünen CBCRs wie NpR6012g4 gefunden werden. Unsere Ergebnisse liefern neue Einblicke in die flexiblen Protein- und Chromophor-Wechselwirkungen, die von CBCRs verwendet werden, um ihre bemerkenswerte spektrale Vielfalt zu erzeugen.

Tagebuch

Photochemische und photobiologische Wissenschaften &ndash Royal Society of Chemistry


NpF2164g3 - Biologie

Arch Microbiol (2014) 196:357–367 DOI 10.1007/s00203-014-0974-2

Das Exo-Proteom und Exo-Metabolom von Nostoc punctiforme (Cyanobakterien) in Gegenwart und Abwesenheit von Nitrat Laura Vilhauer · Judith Jervis · W. Keith Ray · Richard F. Helm

Eingegangen: 5. Februar 2014 / Angenommen: 27. Februar 2014 / Online veröffentlicht: 19. März 2014 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

Zusammenfassung Die Fähigkeit stickstofffixierender filamentöser Cyanobakterien, sich an mehrere Umgebungen anzupassen, beruht zum Teil auf der Bewertung und Reaktion auf externe Stimuli, ein Ereignis, das im extrazellulären Milieu initiiert wird. Obwohl bekannt ist, dass diese Organismen zahlreiche extrazelluläre Substanzen produzieren, wurde wenig Arbeit geleistet, um sowohl die Metaboliten als auch die Proteine ​​zu charakterisieren, die unter Standard-Laborwachstumsbedingungen vorhanden sind. Wir haben das extrazelluläre Milieu von Nostoc punctiforme untersucht, wenn es in Flüssigkultur in Gegenwart und Abwesenheit einer Stickstoffquelle (Nitrat) gezüchtet wurde. Die identifizierten extrazellulären Proteine ​​waren mit Integrin-β-Propellor-Domänen und Calcium-Bindungsstellen mit für N. punctiforme einzigartigen Sequenzen angereichert, was eine Rolle extrazellulärer Proteine ​​bei der Modulation speziesspezifischer Erkennungs- und Verhaltensprozesse unterstützt. Extrazelluläre Proteasen sind unter beiden Bedingungen vorhanden und aktiv, wobei die mit Nitrat gezüchteten Zellen eine höhere Aktivität aufweisen, wenn sie auf Chlorophyllspiegel normalisiert werden. Die freigesetzten Metaboliten sind mit Peptidoglycan-abgeleiteten Tetrasacchariden angereichert, mit höheren Konzentrationen in nitratfreien Medien. Schlüsselwörter Extrazellulär · Metabolom · Nostoc punctiforme · Peptidoglycan · Protease · Proteome

Übermittelt von Erko Stackebrandt. Elektronisches Zusatzmaterial Die Online-Version dieses Artikels (doi:10.1007/s00203-014-0974-2) enthält Zusatzmaterial, das autorisierten Benutzern zur Verfügung steht. L. Vilhauer · J. Jervis · W. K. Ray · R. F. Helm (*) Department of Biochemistry, Virginia Tech, 143 Life Sciences 1, Blacksburg, VA 24061‑0910, USA E-Mail: [email protected]

Einleitung Nostoc punctiforme ist ein filamentöses Cyanobakterium (photosynthetischer Prokaryot), das zu mehreren Phänotypen fähig ist. Unter stickstofflimitierenden Bedingungen werden terminal differenzierte Heterozysten gebildet, die sich kontrolliert über ein einzelnes Filament verteilen (Meeks und Elhai 2002 Kumar et al. 2010). Bedingungen geringer Zelldichte (Medienaustausch), Exposition gegenüber rotem Licht oder die Etablierung einer symbiotischen Beziehung können dazu führen, dass sich der Organismus in kleinere und kürzere bewegliche Filamente, die als Hormogonien bezeichnet wird, ausdifferenziert (Risser und Meeks 2013). Dieser Zelltyp ist in der Lage, das normale vegetative Wachstum wiederherzustellen, indem er ein „Primordia“-Stadium durchläuft, in dem die kurzen Filamente terminale Heterozysten enthalten. Ein Mangel an für Wachstum und Entwicklung notwendigen Nährstoffen kann auch zur Bildung von einzelligen Akineten oder cyanobakteriellen Sporen führen (Kaplan-Levy et al. 2010). Die beiden Hauptstämme von N. punctiforme, die in der Forschung verwendet werden, werden als ATCC29133 und PCC73102 bezeichnet. Das ursprüngliche Isolat für beide Linien wurde 1973 aus einem Wurzelabschnitt einer Palmfarne (Macrozamia sp.) gewonnen (Rippka et al. 1979), wobei die beiden Organisationen seit der ursprünglichen Hinterlegung der PCC-Isolate bei der ATCC getrennte Linien unterhalten. Der sequenzierte Stamm (ATCC29133) hat eine Genomgröße von 9,06 Mb, enthält ein Chromosom und fünf Plasmide und ist derzeit so annotiert, dass er ungefähr 6.700 Proteine ​​kodiert (Meeks et al. 2001). Dies ist das drittgrößte zyanobakterielle Genom, das bisher sequenziert wurde (Shih et al. 2013). Die Analyse der genomischen Daten von Cyanobakterien legt nahe, dass der von N. punctiforme gezeigte multizelluläre Phänotyp ein frühes Merkmal des Cyanobakterien-Stammes war, wobei die heutigen Vorgänger seit dem Aufkommen der Kohlenstofffixierung Multizellularität gewonnen, verloren und wiedergewonnen haben (Schirrmeister et al. 2011, 2013). Phänotypisch

Die Einteilung von Cyanobakterien in fünf separate Klassen basiert auf der exquisiten Arbeit von Rippka et al. (1979), eine Phänologie, die bis heute das wichtigste Klassifikationssystem ist. Mit dem Aufkommen der genotypischen Charakterisierung weisen Vergleiche von „Kernproteinen“ aus mehreren Cyanobakterienarten darauf hin, dass die heutigen filamentösen Cyanobakterien klar in solche, die Stickstoff fixieren können und nicht, getrennt werden (Shi und Falkowski 2008). Neuere Sequenzierungs- und Bioinformatik-Bemühungen haben unser Verständnis der Cyanobakterien-Diversität dramatisch erweitert (Schirrmeister et al. 2011 Shih et al. 2013) mit einer weiteren Bestätigung der Hypothese, dass die Cyanobakterien monophyletisch sind. Während bei den Cyanobakterien Gensets für die Produktion von Sekundärmetaboliten über nicht-ribosomale Peptidsynthase (NRPS), Polyketid-Synthase (PKS) und ribosomale Wege weit verbreitet sind, zeigt die Analyse der bisher gewonnenen Informationen nur wenige wichtige phänotypische Determinanten (Shih et al. 2013 Leao et al. 2012). Die mikrobielle Anpassung an jede Umgebung erfordert Bewertungs- und Reaktionsphasen, Prozesse, die eine kontinuierliche Abfrage der lokalen Umgebung erfordern. Viele filamentöse Cyanobakterien, einschließlich N. punctiforme, besetzen den Raum direkt außerhalb der äußeren Membran durch die Entwicklung einer auffälligen extrazellulären Matrix (ECM) (Helm und Potts 2012). Der von einem Cyanobakterium beeinflusste oder kontrollierte Raumbereich ist schlecht definiert, insbesondere bei Laborkulturen, die ständiger Bewegung ausgesetzt sind. Materialien können aus laborbasierten Flüssigkulturen in Mengen freigesetzt werden, die sich von denen einer natürlichen Umgebung unterscheiden, und daher werden Laborkulturmedienisolate im Allgemeinen als „konditioniert“ bezeichnet. Beispiele für extrazelluläre Faktoren, die das Verhalten von filamentösen Cyanobakterien beeinflussen, sind seit Jahrzehnten dokumentiert (Herdman und Rippka 1988) und kürzlich genauer nachgewiesen (Liaimer et al. 2011). Es gibt jedoch nur wenige Informationen über die Strukturen der extrazellulären Faktoren, die von Cyanobakterien stammen, die an Verhaltensprozessen beteiligt sind. Die Diversität in den Gensätzen von Sekundärmetaboliten kann direkt mit dem zusammenhängen, was jede Cyanobakterienart zeigt oder von ihrer äußeren Membran freisetzt, um mit der lokalen Gemeinschaft zu kommunizieren und eine spezifische Umweltnische zu besetzen. Studien zur ECM-Zusammensetzung und ihren Auswirkungen auf die Lebensweise von Cyanobakterien haben die Aufnahme und Freisetzung von Metaboliten wie Aminosäuren und Kohlenhydraten (Mary et al. 2008 Mikkat et al. 1997 Zubkov et al. 2003) sowie den photoheterotrophen Metabolismus und/oder inter -Artenkommunikation (Yang et al. 2011). Neuere ungezielte Ansätze zur Aufnahme und Freisetzung von Metaboliten aus dem marinen Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7002 stellte fest, dass eine breite Palette von Metaboliten vom Organismus aufgenommen und/oder freigesetzt wurde, wobei die Aufnahme und Freisetzung von dem für das Wachstum verwendeten Medium abhängt (Baran

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

et al. 2010, 2011). Studien zur extrazellulären Domäne filamentöser Cyanobakterien befassten sich mit der Polysaccharidproduktion (Otero und Vincenzini 2004 Read et al. 2007 Pereira et al. 2009) und der UV-Stressantwort (Bohm et al. 1995 Ehling-Schulz et al. 1997, 2002) . Es wurde festgestellt, dass das extrazelluläre Proteom von N. commune von WspA dominiert wird, einem Protein, das eine zentrale Rolle bei der globalen Stressantwort spielen kann, indem es die Struktur und Funktion der ECM moduliert (Morsy et al. 2008). WspA ist jedoch auf zwei verschiedene Nostoc-Arten (N. commune und N. verrucosum) beschränkt (Sakamoto et al. 2011) und kommt in N. punctiforme nicht vor. Die Charakterisierung des extrazellulären Proteoms und Metaboloms eines biologischen Systems kann Einblicke in die intrazelluläre Physiologie und die Phänotypentwicklung geben. Aufgrund des Mangels an Informationen über freigesetzte Proteine ​​und Metaboliten aus filamentösen Cyanobakterien starteten wir ein Projekt, das darauf abzielte, die von N. punctiforme PCC73102 freigesetzten Proteine ​​und Metaboliten unter Standardkulturbedingungen mit und ohne Anwesenheit von Nitrat (BG-11 bzw. BG-110-Medien) (Rippka et al. 1979). Dreiunddreißig Proteine ​​wurden im extrazellulären Proteom identifiziert, wobei mehrere nur in einer Bedingung vorhanden waren. Wir bewerteten auch die Proteaseaktivitäten in zellfreien Überständen, indem wir das Schicksal von Rinder-β-Casein in Zeitverlaufsassays unter Verwendung von zellfreien konditionierten Medien überwachten. Schließlich haben wir in Bezug auf die freigesetzten Metaboliten festgestellt, dass N. punctiforme unter beiden bewerteten Bedingungen signifikante Mengen an Peptidoglykanfragmenten ohne Peptidstamm freisetzt. Diese Ergebnisse werden in Bezug auf die Cyanobakterienphysiologie diskutiert.

Materialien und Methoden Kulturbedingungen und allgemeine Methoden Zellkulturmedien wurden gemäß den Empfehlungen der Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria (PCC, CRBIP Medium 539) hergestellt. Der für diese Studie verwendete Stamm wurde vom PCC (N. punctiforme 73102) erhalten, der im Vergleich zum ATCC-Stamm einen stärker aggregierten Phänotyp aufweist. Die vom PCC erhaltene Originalprobe wurde auf Agarplatten (BG-11) gezüchtet und anschließend in Flüssigkultur überführt, beginnend mit kleinen Erlenmeyerkolben und Überführen von Zellen in größere, wobei die letzten Experimente in 30 ml Medium in 250 ml . durchgeführt wurden Flaschen. Aus dem anfänglichen Flüssigkulturisolat wurde eine Reihe von Primärstammlösungen hergestellt und als Schrägagar gelagert, wobei diese primären Schrägagars routinemäßig alle sechs Monate in neue Schrägkulturen überführt wurden. Alle Kulturen (flüssig und fest) wurden in einem 12-stündigen Lichtzyklus gehalten, wobei alle Probennahmen erfolgten, wenn die Zellen Licht ausgesetzt wurden. Die flüssigen Kulturen

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Die für die Experimente verwendeten Medien wurden in Medien mit oder ohne Nitrat (im Folgenden als BG-11 bzw. BG-110 bezeichnet) unter Verwendung eines Lampensatzes mit 166 Mikroeinsteins/m2 s Licht gehalten, wobei die Mischung mit einem Rotator mit 100 Umdrehungen erreicht wurde pro Minute. Kulturmedien wurden routinemäßig alle 2 Wochen ausgetauscht, wobei experimentelle Daten von Proben gesammelt wurden, die mindestens 4 Wochen lang nur einem Medium ausgesetzt waren (sofern nicht anders angegeben). Ammenkulturen wurden alle 2 Wochen zwischen BG-11- und BG-110-Medien rotiert, um genügend Biomasse für das Experimentieren aufzubauen. Experimentelle Kulturen wurden ungefähr 6 Monate lang gehalten, bevor die Flüssigkulturen von einem primären Schrägagar wieder aufgenommen wurden. Chlorophyll-Spiegel (Chl a) wurden nach den Standardmethoden zur Messung der Absorption bei 665 nm bestimmt (siehe Ergänzende Methoden). Methoden der optischen Dichte wurden wegen der Fähigkeit dieser Organismen, in Flüssigkulturen zu aggregieren, nicht routinemäßig für die Bewertung der Biomasse verwendet, was die Messungen der optischen Dichte unzuverlässig macht. Bewertung des extrazellulären Proteoms Die Experimente wurden in biologischen Duplikaten durchgeführt. Die Kulturen wurden nach 2 Wochen Wachstum in frischer Flüssigkultur bewertet. Die Kulturen wurden anschließend in Zentrifugenröhrchen (50 ml) überführt und zentrifugiert (4000 × g, 10 min) und der Überstand wurde gesammelt. Die Zellen wurden ein weiteres Mal mit ihrem entsprechenden Wachstumsmedium (5 ml) gewaschen und erneut zentrifugiert, wobei der resultierende Überstand dem ursprünglichen Isolat zugesetzt wurde. Aliquots des Zellpellets wurden sowohl für die Chlorophyll-a-Bestimmungen als auch für die mikroskopische Auswertung verwendet und anschließend verworfen. Die Überstände wurden filtriert (0,22 µm) und die resultierenden zellfreien Medienproben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gefriergetrocknet. Die resultierenden Feststoffe wurden mit Wasser (1 ml) in kleinere Zentrifugenröhrchen (1,5 ml) überführt und gefriergetrocknet. Diese getrockneten Proben wurden anschließend einem In-Lösung-Aufschlussprotokoll unterzogen, dessen Einzelheiten in den ergänzenden Methoden zu finden sind. Die resultierenden Peptide wurden auf einem LC-MALDI-Platten-Spotting-Gerät (Eksigent nano2D-LC und Ekspot) aufgetrennt, wobei Matrix (α-Cyano4-Hydroxyzimtsäure, CHCA) unmittelbar vor der Analyse durch MALDI-TOF/TOF (AB Sciex 4800 .) hinzugefügt wurde MALDITOF/TOF). Ein MS-Scan für den m/z-Bereich von 800–4.000 wurde mit Durchschnittsdaten von 1.000 Laserschüssen im Reflektor-Positivionenmodus erfasst. Die 15 häufigsten Peaks oberhalb eines minimalen Signal-Rausch-Verhältnisses (>50) wurden dann automatisch für die nachfolgende MS/MS-Analyse ausgewählt. MS/MS-Scans waren der Durchschnitt von 3.000 aufgenommenen Laserschüssen (1 kV, positiver Ionenmodus). Die vom Massenspektrometer erhaltenen Peaklisten wurden mit dem MASCOT-Algorithmus (Matrix Science) unter Verwendung der N. punctiforme FASTA-Datenbank ausgewertet, die mit dem Reverse-Decoy und den Kontaminanten angehängt wurde

Datenbanken. Die resultierenden Dateien wurden zur weiteren Auswertung an Scaffold (Proteome Software) übertragen. Bewertung des extrazellulären Metaboloms Die Kulturpräparation war die gleiche wie für das Proteom durch Gefriertrocknen in 1,5-ml-Röhrchen und wurde typischerweise paarweise hergestellt (BG-11- und BG-110-Überstände). Für Metabolitenanalysen wurden die getrockneten Proben in 9:1:0,001 (Wasser/Acetonitril/Ameisensäure v/v/v) suspendiert, kurz gevortext und 10 min beschallt und dann 10 min (13.000 × g) zentrifugiert. Aliquots der gelösten Metaboliten (200 μL) wurden in LC-MS-Fläschchen überführt, wobei ein zusätzliches Fläschchen vorbereitet wurde, das eine gleiche Mischung (1:1, v/v) jeder Probe (BG-11 und BG-110) enthielt. Der Probensatz wurde dann dreifach durch LC-MS analysiert. Das LC-MS-System bestand aus einer UPLC (Acquity I-Class), die mit einem SynaptG2-S HDMS-Massenspektrometer verbunden war. Die für die Trennungen verwendete Säule war eine BEH C18 (50 × 2,1 mm), die auf 40 °C gehalten wurde. Die Gradiententrennung (200 μL/min) bestand aus einer anfänglichen Zusammensetzung von 95 % Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure) und 5 % Lösungsmittel B (Acetonitril) für 2 min gefolgt von einem linearen Gradienten zu 5 % Lösungsmittel A über einen Zeitraum von 10 Minuten. Das Massenspektrometer wurde im hochauflösenden positiven Ionenmodus unter Verwendung von Leucinenkephalin als Sperrmasse betrieben. Die Datensätze wurden mit der Software MarkerLynx (Waters Corp.) ausgewertet, die ein statistisches Profil signifikanter Unterschiede zwischen den Proben sowie eine Liste von Ionen liefert, die sich zwischen den Probengruppen signifikant ändern. Extrazelluläre Proteaseaktivität Stammlösungen von β-Casein (Rind, Sigma) wurden durch Auflösen von 2 mg in Medium (BG-11 oder BG-110, 10 ml) unter Verwendung von Hitze (65 °C) und Mischen hergestellt. Die resultierenden Proben wurden zentrifugiert (4.000 × g, 10 min) und Aliquots (jeweils 1 ml) wurden in neue Röhrchen überführt. Zellkulturen wurden wie oben beschrieben verarbeitet (einschließlich des Waschschritts), wobei die verbleibenden Zellen für Chlorophyll-a-Bestimmungen verwendet wurden (siehe Ergänzende Methoden). Die Überstände wurden dann auf äquivalente Chlorophyllkonzentrationen normalisiert, was eine Verdünnung der BG-11-Probe erforderte, und filtriert (0,22 µm). Die resultierenden Überstände wurden dann in 6-Well-Platten (5 ml) aliquotiert, gefolgt von der Zugabe der β-Casein-Lösungen (1 ml). Protease-Hemmungsproben enthielten ein zusätzliches Volumen eines kommerziellen Inhibitor-Cocktails (Sigma, P8465, 30 µl), der gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde. Kontrollspuren mit β-Casein wurden mit frischem Medium ergänzt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei Aliquots über einen Zeitraum von bis zu 24 h entnommen wurden. Die Proben aus dem Zeitverlaufstest wurden dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gefriergetrocknet. Die

Proben wurden dann in einer 1:1-Mischung von SDSPAGE-Laufpuffer (Tris/Glycine/SDS, 50 &mgr;l) und Laemmli-Puffer mit β-Mercaptoethanol (50 &mgr;l) gelöst. Die Proben wurden 5 min bei 95 °C erhitzt, gefolgt von Vortexen und Zentrifugieren (13.000 × g, 2 min). Proben (45 μL) wurden dann zu einem 18 % vernetzten Gel (Bio-Rad, Kriterium) gegeben. Trennungen wurden bei konstanter Spannung (130 V) durchgeführt, wobei die resultierenden Gele über Nacht unter Verwendung von Coomassie (ProtoBlue Safe, National Diagnostics) gefärbt wurden. Überschüssige Färbung wurde vor der Bildgebung mit Wasser entfernt. Ausgewählte Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten und einem In-Gel-Verdauungsprotokoll ohne Reduktion und Alkylierung unter Verwendung von Glu-C (Sigma) als Protease unterzogen. Die resultierenden Peptide wurden entsalzt (C18 Ziptips, Millipore) und durch MALDITOF/TOF-Massenspektrometrie (CHCA-Matrix) analysiert, wobei die Ergebnisse gegen eine Datenbank abgefragt wurden, die nur β-Casein ohne Enzymspaltungsspezifität enthielt.

Ergebnisse Der Ansatz zur Proteinidentifizierung basierte auf einem Lösungsverdau konditionierter Medien ohne weitere Schritte außer Filtration (0,22 µm) und Gefriertrocknung. Die resultierenden Lösungen wurden dann reduziert, alkyliert und mit Trypsin verdaut. Die resultierenden Peptide wurden anschließend durch Gradienten-basierte Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie getrennt, wobei der Säuleneluent direkt auf eine MALDI-Platte getüpfelt wurde. Die resultierenden Spots wurden auf Vorläuferionen- und Fragmentierungsmuster (MS/MS) analysiert, wobei die Ergebnisse gegen das N entstehen durch tryptische Aktivität). Für die Proteinidentifizierung waren zwei Peptide erforderlich, wobei die Peptid- und Proteinschwellen auf 95 bzw. 99 % festgelegt wurden (0 % Falscherkennungsrate). Die Experimente wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt, wobei die Zellernte nach 2 Wochen Wachstum durchgeführt wurde, wobei die Proteinverdauungen (BG11 vs. BG110) auf Chlorophyllbasis normalisiert wurden. Es wurden 33 Proteine ​​unter Verwendung der beschriebenen Verfahren identifiziert und sind in Tabelle 1 aufgeführt. 23 wurden in beiden Medien identifiziert, wobei 4 hauptsächlich in nitrathaltigen Medien und 6 in nitratfreien Medien gefunden wurden. Nur wenige Proteine ​​hatten mehr als drei Peptide, die mit jedem einzelnen Protein assoziiert waren, und die Anzahl der MS/MS-Spektren für jedes Peptid war zu gering, um relative Proteinhäufigkeiten durch spektrale Zählverfahren bereitzustellen. Es war jedoch möglich, die Anwesenheit oder Abwesenheit in einem bestimmten Wachstumsmedium zu beurteilen. Eine Auflistung aller identifizierten Proteine ​​und zugehöriger Massenspektrometriedaten finden Sie in den ergänzenden Materialien (Tabelle S1). Da berichtet wurde, dass Überstände mehrerer Anabaena-Stämme eine Proteaseaktivität (Prasanna

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et al. 2008) und es wurde gefunden, dass ein extrazelluläres S-Layer-Protein mehrere unterschiedliche Größen in Synechocystis sp. PCC 6803 (Trautner und Vermaas 2013) haben wir auf diese Aktivität getestet. Zellfreie Überstände von konditionierten Medien (2 Wochen Wachstum) wurden mit kommerziellem Rinder-β-Casein für einen Zeitraum von bis zu 15 h inkubiert ( 1 ). Beim Vergleich der Aktivitäten bei äquivalenten Chlorophyllspiegeln (ein Surrogat für die Zellzahl) wurde festgestellt, dass die nitrathaltigen Proben β-Casein schneller abbauen als die nitratfreien Medien, obwohl die Abbaumuster ähnlich waren. Wir interpretieren diese Ergebnisse als Spiegel der Zellwachstumsraten. In Gegenwart einer Stickstoffquelle differenziert sich N. punctiforme schneller und produziert eine größere Menge an extrazellulärem Material, das einen Umbau erfordert, wobei dieser Umbau eine Proteaseaktivität erfordert. Leider können wir die Aktivität keinem bestimmten Protein zuschreiben, da keines der identifizierten Proteine ​​eng mit bekannten Proteasen übereinstimmt. Obwohl mehrere Proteine ​​tatsächlich Serralysin-Motive aufweisen, sind die erforderlichen Schlüsselmetallbindungsreste nicht vorhanden. Es ist auch offensichtlich, dass der kommerzielle Cocktail bakterieller Protease-Inhibitoren die Protease-Aktivität reduzierte, aber nicht vollständig eliminierte. Die zellfreien Überstände können Verbindungen/Proteine ​​enthalten, die die Inhibitorwirksamkeit abbauen oder verringern. Die Bewertung von metabolitbasierten Unterschieden zwischen BG-11- und BG-110-Medien beruhte auf Umkehrphasenchromatographie/Massenspektrometrie, wobei der Schwerpunkt auf den Metaboliten lag, die zum gleichen Zeitpunkt wie die proteomischen Analysen (2 Wochen Wachstum) vorhanden waren. Ein ionenchromatographischer Basispeak-Vergleich ist in Fig. 2a gezeigt. Die statistische Analyse des Datensatzes trennte die beiden Kulturmedienproben sauber, und unter Verwendung strenger Probenvergleichsmethoden wurden 89 Ionen als statistisch unterschiedlich identifiziert (Abb. 2b und ergänzende Tabelle S2). Im nitratfreien Medium waren im Vergleich zum stickstoffhaltigen Medium mehr Ionen vorhanden. Ob dies auf die Freisetzung von Metaboliten aus den Heterozysten und/oder Zelltrümmern zurückzuführen ist, die mit der Veränderung verbunden sind, kann an dieser Stelle nicht festgestellt werden. Die Auswertung der Massenspektrometriedaten zeigte, dass der Hauptbeitrag zum Unterschied zwischen den beiden Medien das Ergebnis der Peptidoglycan-Oligomer-Freisetzung aus den Zellen in BG-110-Medium war. Die Ionen, die die stärkste Änderung zwischen den beiden Proben zeigten, waren Verbindungen, die auf der Grundlage massenspektrometrischer Analysen als Peptidoglycan-Tetrasaccharide ohne Peptidstamm identifiziert wurden, wobei die anomere Position des reduzierenden Endes eine 1–6-Anhydrobindung aufweist (Abb. 2c und Supplemental .). Abb. S1). Diese Zuordnung basierte auf der Analyse der Massenspektren, die aus der Analyse des MS1-Scans erhalten wurden, wobei ein Zerfall in der Quelle sowie eine Fragmentierung des Elternions beobachtet wurden. Interessanterweise fehlten beiden im Detail analysierten Ionen eine (915 m/z Ion) oder zwei (873 m/z Ion) Acetylgruppen.

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Tabelle 1 Die identifizierten extrazellulären Proteinea in konditionierten Nostoc punctiforme-Medien Npun ID

F0770 F0888 F1457 F3469 F3639 F3787 F4195 F4306 F4555 F4679 F5213 F5289 F5290 F5395 F5938 R0415 R0421 R0716 R1349 R2605 R2608 R3259 R3508 R3701 R3806 R3807 R4059 R4084 R4842 R5387 R6491 R6614

B2IT19 B2IU54 B2IZM8 B2J126 B2J2W2 B2J460 B2J8T2 B2JA04 B2IVV3 B2IXX6 B2J393 B2J4C0 B2J4C1 B2J5H4 B2ITU1 B2J6Y6 B2J6Z2 B2J9G9 B2IYH3 B2ITC8 B2ITD1 B2IYW8 B2J1R2 B2J324 B2J478 B2J479 B2J7J2 B2J7L7 B2J037 B2J5G8 B2IZB2 B2J0I2

Hypothetisches Protein Hypothetisches Protein Mutmaßliches Adhäsin-ähnliches Protein der äußeren Membran PA14-Domäne-enthaltendes Protein Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase, Cyclophilin-Typ Transport-assoziierte Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase, großkettige RbcL Hypothetisches Protein Kohlenhydrat-selektives Porin OprB Hämolysin-Typ Calcium-bindende Region Photosystem I Eisen-Schwefel-Zentrum, PsaC Phycocyanin, Beta-Untereinheit Phycocyanin, Alpha-Untereinheit PcyA Sulfat-ABC-Transporter, periplasmatisches Sulfat-bindendes Protein Phosphoglyceratkinase, Pgk Nitrogenase Eisenprotein NifH Glucose/Sorboson-Dehydrogenase-ähnliches Protein Protein unbekannter Funktion CP12 . FG-GAP Repeat enthaltendes Protein Hypothetisches Protein Hypothetisches Protein Niedrigtemperatur-induziertes Protein Enolase Calcium-bindende Region vom Hämolysin-Typ Phycobilisom-Protein CpeA Phycobilisom-Protein CpeB Hypothetisches Protein Hypothetisches Protein Phycobilisom-Protein ApcA Glutaminsynthetase GlnA Superoxiddismutase Hypothetisches Protein

all3292 (54 %) all4578 (53 %) – – —c alr0804 (69 %) alr1524 (96 %) – alr4550 (78 %) **d asr3463 (99 %) alr0528 (73 %) alr0529 (72 %) all0322 ( 76 %) all4131 (96 %) all1455 (87 %) – asl2850 (77 %) alr0267 (63 %) ** ** all0459 (69 %) all3538 (91 %) alr3659 (47 %)e alr0529 (42 %) alr0528 (48 %) – – alr0021 (86 %) alr2328 (91 %) alr2938 (87 %) alr0199 (70 %)

Protein-Konfidenz-Cutoff, 99,0 %

Zahlen in Klammern sind prozentuale Identitäten. Ein Protein wurde in PCC 7120 (–) als nicht vorhanden betrachtet, wenn die prozentuale Identität über die gesamte Länge des Proteins weniger als 40 % betrug c

PCC 7120 kodiert für eine Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (all4287), ist jedoch deutlich kleiner als F3639 (137 vs. 261 Aminosäuren)

Sternchen (**) bedeuten, dass die Suche keine cyanobakterielle Proteinübereinstimmung ergab (einzigartig für N. punctiforme).

Alr3659 (589 AAs) ist zu 47 % identisch gegenüber 334 AAs (R3701 ist 401 AAs)

Die Freisetzung solcher Verbindungen erfordert Amidase-, Muramidase- sowie Deacetylase-Aktivitäten.

Diskussion Vier Proteine ​​überschritten die Identifizierungsschwellen und wurden nur in den nitrathaltigen Medien gefunden: Npun_F3639,

Npun_F4679, Npun_F5395 und Npun_R0421. F3639 ist als Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase vom Cyclophilin-Typ annotiert, ein Protein, das zuvor aus Zelllysat-Präparaten beobachtet wurde (Hunsucker et al. 2004 Anderson et al. 2006), ebenso wie F5395, das als periplasmatisches Sulfat annotiert ist Transporter. Npun_F4679 scheint bisher nicht identifiziert worden zu sein und wird als RTX (Repeats-in-Toxin) und verwandtes Calcium-bindendes Protein klassifiziert, a

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BG-11 BG-110 βC T0 T2 T10T15 TPI βC T0 T2 T10T15 TPI

B RELEELNVPG PFAQTQSLVY AMAPKHKEMP LPPTVMFPPQ VRGPFPIIV

EIVESLSSSE PFPGPIPNSL FPKYPVEPFT SVLSLSQSKV

ESITRINKKI PQNIPPLTQT ESQSLTLTDV LPVPQKAVPY

EKFQSEEQQQ PVVVPPFLQP ENLHLPLPLL PQRDMPIQAF

TEDELQDKIH EVMGVSKVKE QSWMHQPHQP LLYQEPVLGP

Abb. 1 Die Proteaseaktivität von konditionierten Medien ist in nitrathaltigen Medien höher, wenn sie auf Chlorophyllspiegel normalisiert wird. a Die SDS-PAGE-Analyse eines Zeitverlaufsassays auf Proteaseaktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Nitrat (BG-11 bzw. BG-110). βC = β-Casein in unkonditioniertem Medium, nach einer 15-stündigen Inkubation (Kontrolle). Die numerischen Indizes der T-Serie stehen für

Stunden Inkubation. Der Index PI ist eine Probe, die mit konditioniertem Medium und Protease-Inhibitor für 15 h inkubiert wurde. b Die kanonische primäre β-Casein-Sequenz vom Rind (prozessierte Form). Bekannte Phosphorylierungsstellen auf Serin (S) sind eingerahmt, Glu-C-Spaltungsstellen sind fett gedruckt (C-terminale Spaltung) und die im MALDI-basierten Assay identifizierten Hauptpeptide sind grau dargestellt


Veröffentlichungen von Autoren mit dem Namen "Ji Young Song"

Abteilung für Dermatologie, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 222, Banpo-daero, Seocho-gu, Seoul 06591, Korea.

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Implantatkomplikationen bei Bruxismuspatienten.

Autoren:

J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2021 Apr47(2):149-150

Department of Dentistry, School of Medicine, Jeju National University, Jeju, Korea.

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Humanes Papillomavirus E7 vom Typ 2 attenuiert die Expression von E-Cadherin in menschlichen Keratinozyten.

Autoren:

J Microbiol 2021 Juni 2959(6):616-625. Epub 2021 29. März.

Department of Biological Sciences and Biotechnology, College of Life Sciences and Nanotechnology, Hannam University, Daejeon, 34054, Republik Korea.

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Epigallocatechin-3-gallat kann das humane Papillomavirus Typ 2 daran hindern, Interferon-stimulierte Gene zu unterdrücken.

Autoren:

Int J Mol Sci 2021 Feb 2822(5). Epub 2021 28. Februar

Programm für Immunologie & Mikrobiologie, Department of Biomedicine & Health Sciences, Graduate School, The Catholic University of Korea, 222, Banpo-daero, Seocho-gu, Seoul 06591, Korea.

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TM4SF4 und LRRK2 sind potenzielle therapeutische Ziele bei Lungen- und Brustkrebs durch Ausreißeranalyse.

Autoren:

Krebs Res Treat 2021 Jan 1653 (1): 9-24. Epub 2020 16.09.2020

Department of Health Sciences and Technology, SAIHST, Sungkyunkwan University, Seoul, Korea.

Zweck: Um Biomarker für Krankheiten zu finden, wird ständig versucht, die Gene zu untersuchen, die sich von denen in den Krankheitsgruppen unterscheiden. Die Werte, die außerhalb des Gesamtmusters einer Verteilung liegen, die Ausreißer, werden jedoch in traditionellen Analysemethoden häufig ausgeschlossen, da sie als „irgendwie ein Problem“ angesehen werden. Solche Ausreißer können in der Krankheitsgruppe eine biologische Rolle spielen. Daher erforschte diese Studie neue Biomarker mittels Ausreißeranalyse und verifizierte die Eignung des therapeutischen Potenzials von zwei Genen (TM4SF4 und LRRK2).

Materialen und Methoden: Modified Tukey's Fences Outlier Analysis wurde durchgeführt, um neue Biomarker unter Verwendung der öffentlichen Genexpressionsdatensätze zu identifizieren. Und wir haben das Vorhandensein der ausgewählten Biomarker in anderen klinischen Proben über maßgeschneiderte Genexpressionspanels und Gewebe-Microarrays nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein siRNA-basierter Knockdown-Test durchgeführt, um den Einfluss der Biomarker auf onkogene Phänotypen zu bewerten.

Ergebnisse: TM4SF4 bei Lungenkrebs und LRRK2 bei Brustkrebs wurden als Kandidaten unter den aus der Analyse abgeleiteten Genen ausgewählt. TM4SF4 und LRRK2 waren in der kleinen Anzahl von Proben mit Lungenkrebs (4,20 %) bzw. Brustkrebs (2,42 %) überexprimiert. Der Knockdown von TM4SF4 und LRRK2 unterdrückte das Wachstum von Lungen- und Brustkrebszelllinien. Die LRRK2-überexprimierenden Zelllinien waren empfindlicher gegenüber LRRK2-IN-1 als die LRRK2-unterexprimierenden Zelllinien.

Abschluss: Unsere modifizierte auf Ausreißern basierende Analysemethode hat bewiesen, dass sie Biomarker retten kann, die zuvor bei der traditionellen Analyse übersehen oder unbemerkt waren, und zeigt, dass TM4SF4 und LRRK2 neue Zielkandidaten für Lungen- bzw. Brustkrebs sind.

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[Eröffnungsstatus der Geburtszentren für Hebammen in Korea und Entwicklung einer Leitlinie für die Hebammenpraxis].

Autoren:

J Korean Acad Nurs 2020 Aug50(4):583-598

College of Nursing, Korea University, Seoul, Korea.

Zweck: Diese Studie sollte den Betriebsstatus der Geburtshäuser der Hebammen (MBCs) und den Berufsstatus der Hebammen (Phase 1) untersuchen und Leitlinien für die Hebammenpraxis (MPG) (Phase 2) in Korea entwickeln.

Methoden: In der ersten Phase handelte es sich bei den Probanden um 15 Hebammen, die 11 von 14 im August 2018 eröffneten MBCs betrieben. Der Fragebogen bestand aus Items zur Messung des Betriebsstatus des MBCs und des Stellenstatus der Hebammen. In der zweiten Phase wurde das MPG aus Literaturrecherche, Interviews mit fünf Hebammen zur Eröffnung ihrer MBC, Befragungen mit 74 Hebammen und einer Validitätsbewertung durch sieben Experten entwickelt.

Ergebnisse: Die Zahl der aktiven MBCs betrug fünf in Gyunggi-do, je zwei in Seoul und Incheon, je eine in Busan, Chungcheongbuk-do, Gyeongsangbuk-do, Gyeongsangnam-do und Jeju-do. Das Durchschnittsalter der Hebammen betrug 54,3 und alle waren weiblich. Im Jahr 2017 wurden insgesamt 762 Geburten, davon 81 Hausgeburten, von Hebammen durchgeführt. Die Arbeitsleistung war in der Reihenfolge Neugeborenenbetreuung 3,81, Geburtsbetreuung 3,56 und Wochenbettbetreuung 3,53 am höchsten. Das MPG umfasste sieben Bereiche Schwangerschaftsvorsorge, Geburtshilfe, Wochenbettbetreuung, Neugeborenenbetreuung, medizinische Grundversorgung, Recht/Ethik und Verwaltung mit 56 Aufgaben und 166 Aufgabenelementen.

Abschluss: Diese Studie liefert die validen Basisdaten zum Betriebsstatus des MBC und zum Berufsstatus der Hebammen. Das MPG beschreibt den Beruf der Hebamme und kann als Basisdaten für die Ausarbeitung von Richtlinien für die Entwicklung der Hebammenpraxis in Korea verwendet werden.

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Spektrale und photochemische Diversität von Tandem-Cystein-Cyanobakterien-Phytochromen.

Autoren:

J. Biol. Chem. 2020 05 17295 (19): 6754-6766. Epub 2020 17. März

Department of Biological Sciences, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea

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Amplifikation als prädiktiver Biomarker als Reaktion auf Ceritinib bei kleinzelligem Lungenkrebs.

Autoren:

Mol Ther Onkolytika 2020 März 1016:188-196. Epub 2020 10. Januar.

Abteilung für Pathologie und Translationale Genomik, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul 06351, Korea.

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Peptidtransporter2 (PTR2) verbessert die Wasseraufnahme während der frühen Samenkeimung in Arabidopsis thaliana.

Autoren:

Plant Mol Biol 2020 Apr 29102(6):615-624. Epub 2020 29. Januar.

Department of Biological Sciences, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Republik Korea.

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Genomische Untersuchung von Salzakklimatisierungs-bezogenen Genen in dem halophilen Cyanobakterium Euhalothece sp. Z-M001.

Autoren:

Sci Rep 2020 01 2010(1):676. Epub 2020 20. Januar.

Department of Biological Sciences, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Korea.

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Erhöhung des Ballaststoffgehalts in Isomaltooligosacchariden durch Dextransucrase-Reaktion mit Saccharose als Glucosyldonor.

Autoren:

Carbohydr Polym 2020 Feb 11230:115607. Epub 2019 11.11.

Department of Food Science & Biotechnology und Carbohydrate Bioproduct Research Center, Sejong University, Seoul 05006, Republik Korea. Elektronische Adresse:

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Wirkungen von Eupatilin auf die durch Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 induzierte Lipogenese und Entzündung von SZ95-Sebozyten.

Autoren:

Ann Dermatol 2019 Aug 131 (4): 479-482. Epub 2019 1. Juli

Abteilung für Dermatologie, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea.

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Molekulare Veränderungen der solitären fibrösen Tumorprogression.

Autoren:

J. Mol Med (Berl) 2019 10 1897(10):1413-1425. Epub 2019 Juli 18.

Department of Health Sciences and Technology, SAIHST, Sungkyunkwan University, Seoul, Südkorea.

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Nabelschnur-abgeleitete mesenchymale Stammzellextrakte lindern atopische Dermatitis bei Mäusen, indem sie die T-Zell-Antworten reduzieren.

Autoren:

Sci Rep 2019 04 299(1):6623. Epub 2019 29. April.

Abteilung für Pathologie, Universität Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center, Seoul, Korea.

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Integrin-β3-Hemmung verstärkt die Antitumoraktivität des ALK-Inhibitors bei -rearrangiertem NSCLC.

Autoren:

Clin Cancer Res 2018 09 1824(17): 4162-4174. Epub 2018 18. Mai

Department of Health Sciences and Technology, SAIHST, Sungkyunkwan University, Seoul, Korea.

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Schweineknochen mit eingebautem 4-Hexylresorcinol erhöht die Knochenneubildung durch Unterdrückung des Kappa-B-Signalwegs des nuklearen Faktors.

Autoren:

J Craniofac Surg 2018 Okt29(7):1983-1990

Department of Biochemistry and Cell Biology, BK21 Plus KNU Biomedical Convergence Program, Skeletal Diseases Genome Research Center, Cell and Matrix Research Institute, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Republik Korea.

Zielsetzung: Die Ziele dieser Studie waren die Untersuchung der Suppression des nuklearen Faktors Kappa B (NF-kB)-Signalwegs durch 4-Hexylresorcinol (4HR), das durch Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) in Osteoblasten aktiviert wurde, und neu Knochenbildung durch 4HR-inkorporierten Schweineknochen in einem Tiermodell.

Studiendesign: Zur Bestätigung des erfolgreichen Einbaus von 4HR in Schweineknochen wurden Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR)-Analyse durchgeführt. Zur Analyse des 4HR-Freisetzungsprofils aus Schweineknochen wurde eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt. MC 3T3-E1-Zellen wurden für die Analyse der Aktivierung des NF-kB-Signalwegs durch Western-Blotting und Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet. Die Knochenneubildung und die Analyse der Markerproteinexpression wurden in einem kritischen Defektmodell der Schädeldecke der Ratte untersucht.

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Psychologische Risikofaktoren für posttraumatische Belastungsstörungen bei Arbeitnehmern nach Verschütten giftiger Chemikalien in Gumi, Südkorea.

Autoren:

Gesundheit am Arbeitsplatz Saf 2018 Aug 1366(8):393-402. Epub 2018 13. Februar

2 Ilsan-Krankenhaus der Dongguk-Universität.

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Engrailed 1-Überexpression als potenzieller prognostischer Marker bei fünffach-negativem Brustkrebs.

Autoren:

Cancer Biol Ther 2018 04 1319(4):335-345. Epub 2018 13. Februar

a Laboratory of Cancer Genomics and Molecular Pathology, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea.

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Verletzungsbedingte Krankenhauseinweisung von Feuerwehrfrauen in Südkorea.

Autoren:

Int J Occup Saf Ergon 2019 Dez 525(4):575-582. Epub 2018 5. Februar

c Abteilung für Arbeits- und Umweltmedizin, Ilsan-Krankenhaus der Dongguk-Universität, Republik Korea.

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Unvorhergesehene klonale Evolution der Tumorzellpopulation bei rezidivierenden und metastasierten Dermatofibrosarcoma protuberans.

Autoren:

PLoS One 2017 412(10):e0185826. Epub 2017 Okt. 4.

Labor für Molekulare Pathologie und Krebsgenomik, College of Pharmacy, Seoul National University, Seoul, Korea.

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Aus der Nabelschnur gewonnene mesenchymale Stammzellextrakte reduzieren die Kolitis bei Mäusen, indem sie Darmmakrophagen repolarisieren.

Autoren:

Sci Rep 2017 08 257 (1): 9412. Epub 2017 25. August.

Abteilung für Pathologie, Universität Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center, Seoul, Korea.

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Präzisionsmedizinische Ansätze zum Lungenadenokarzinom mit gleichzeitiger MET- und HER2-Amplifikation.

Autoren:

BMC Krebs 2017 Aug 1017(1):535. Epub 2017 10. August.

Abteilung für Pathologie und Translationale Genomik, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 81 Irwon-ro, Gangnam-gu, Seoul, 06351, Südkorea.

Hintergrund: Patient-derived Xenograft (PDX)-Modelle sind wichtige Werkzeuge in der Präzisionsmedizin und für die Entwicklung zielgerichteter Therapien zur Behandlung von Krebspatienten. Diese Studie zielte darauf ab, unsere Strategie für Präzisionsmedizin zu evaluieren, die genomische Profilerstellung und präklinische Wirkstoff-Screening-Plattformen integriert, um Krebsbehandlungen mithilfe von PDX-Modellen zu personalisieren.

Methoden: Wir führten Array-vergleichende genomische Hybridisierungs-, Microarray- und gezielte Next-Generation-Sequencing-Analysen durch, um die onkogenen Treibermutationen zu bestimmen. PDX-Zellen wurden aus PDXs gewonnen und anschließend in vitro mit 17 zielgerichteten Wirkstoffen gescreent.

Ergebnisse: PDX-Tumoren rekapitulierten die histopathologischen und genetischen Merkmale der Patiententumore. Unter den Proben von Lungenkrebspatienten, die molekular profiliert wurden, identifizierte die Kopienzahlanalyse eine einzigartige fokale MET-Amplifikation in einer Probe, 033 T, ohne RTK/RAS/RAF-Onkogen-Mutationen. Obwohl im Krebspanel keine HER2-Amplifikation in 033 T nachgewiesen wurde, wurde die Selektion von HER2-amplifizierten Klonen in PDXs und PDX-Zellen gefunden. Darüber hinaus wurde eine MET- und HER2-Überexpression in Patiententumoren, PDXs und PDX-Zellen gefunden. Crizotinib- oder EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor-Behandlungen hemmten das Zellwachstum signifikant und beeinträchtigten die Tumorsphärenbildung in 033 T PDX-Zellen.

Schlussfolgerungen: Wir erstellten PDX-Zellmodelle mit chirurgischen Proben von Lungenkrebspatienten und untersuchten ihre präklinischen und klinischen Implikationen für eine personalisierte zielgerichtete Therapie. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass eine MET- und EGFR-Inhibitor-basierte Therapie zur Behandlung von MET- und HER2-überexprimierendem Lungenkrebs ohne Veränderungen des Rezeptor-Tyrosinkinase-/RAS-/RAF-Signalwegs verwendet werden kann.

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Prävalenz und mikrobiologische Eigenschaften von qacA/B-positiven Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Isolaten auf einer chirurgischen Intensivstation.

Autoren:

Microb Drug Resist 2018 Apr 1124(3):283-289. Epub 2017 11. August

1 Abteilung für Innere Medizin, Gyeongsang National University Hospital, Gyeongsang National University School of Medicine, Jinju, Republik Korea.

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Molekularer Aufschlüsselung: eine umfassende Ansicht des anaplastischen Lymphomkinase (ALK)-rearrangierten nicht-kleinzelligen Lungenkrebses.

Autoren:

J. Pathol 2017 11 28243(3):307-319. Epub 2017 28. September.

Department of Health Sciences and Technology, SAIHST, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea.

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MET Exon 14 Überspringende Mutationen beim Lungenadenokarzinom: Klinisch-pathologische Implikationen und prognostische Werte.

Autoren:

J Thorac Oncol 2017 08 1012(8):1233-1246. Epub 2017 10. Mai.

Abteilung für Thorax- und Herz-Kreislauf-Chirurgie, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Republik Korea.

Einführung: Die Reaktion auf mesenchymal-epitheliale Transition (MET)-Inhibitoren bei NSCLC mit mesenchymal-epithelialem Transition-Gen (MET) Exon 14 Skipping (METex14) hat molekulare Screening-Bemühungen und die Suche nach optimalen Therapien vorangetrieben. Es sind jedoch weitere Arbeiten erforderlich, um die klinisch-pathologischen und prognostischen Auswirkungen des METex14-Skippings zu verfeinern.

Methoden: Unter 795 ostasiatischen Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff wegen NSCLC unterzogen, haben wir 45 Patienten mit fünffach-negativem (EGFR-negativ/KRAS-negativ/anaplastisches Lymphomkinase-Gen [ALK]-negativ/ROS1-negativ/ret-Proto-Onkogen [ RET]-negative) Lungenadenokarzinome unter Verwendung der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion und fanden 17 Patienten (37,8%) mit METex14-Skipping. Wir untersuchten auch die Wirkung von Small Interfering RNA (siRNA), die auf die Skipping Junction in Zellen mit METex14-Skipping abzielt.

Ergebnisse: Das Durchschnittsalter der 17 Patienten betrug 73 Jahre. Der azinöse Subtyp war vorherrschend (52,9%), gefolgt vom soliden Subtyp (35,3%). Die MET-Immunhistochemie zeigte 100 % Sensitivität und 70,4 % Spezifität. Multivariate Analysen zeigten, dass Patienten mit METex14-Skipping eine höhere Rezidivrate aufwiesen als Patienten mit ALK-Fusion (im Vergleich zu METex14-Skipping) (Hazard Ratio = 0,283, 95%-Konfidenzintervall: 0,119-0,670) im Krankheitsstadium I bis IIIA jedoch die Unterschiede in der Gesamt- Überleben war nach Anpassung für das pathologische Stadium nicht signifikant (p = 0,669). Unterdessen verringerte siRNA die MET-gesteuerten Signalwege in Hs746T-Zellen und die kombinierte Behandlung mit siRNA und Crizotinib hemmte die Zellproliferation in Crizotinib-resistenten H596-Zellen.

Schlussfolgerungen: Die Prävalenz von METex14-Skipping war bei ostasiatischen Patienten ohne andere Treibermutationen bei Lungenadenokarzinomen recht hoch. Das Überspringen von METex14 war mit hohem Alter, dem azinären oder soliden histologischen Subtyp und einer hohen immunhistochemischen Expression von MET verbunden. Die Prognose von Patienten mit METex14-Skipping war ähnlich wie die von Patienten mit Major-Treiber-Mutationen. siRNA, die auf die Verbindungsstelle des METex14-Skippings abzielt, könnte MET-gesteuerte Signalwege in Zellen mit METex14-Skipping hemmen.