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8: Transkription - Biologie

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Obwohl DNA ein ausgezeichnetes Medium für die Speicherung von Informationen ist, macht es gerade die Eigenschaft, die sie so stabil und von Natur aus selbstkorrigierend macht – ihre Doppelsträngigkeit – auch unhandlich, diese genetische Information zur Herstellung von Zellkomponenten zu verwenden. Da die Informationsteile des Moleküls (die stickstoffhaltigen Basen) innerhalb der Leiter eingeschlossen sind, erfordert das Lesen die energetisch aufwendige Aufgabe, alle Wasserstoffbrückenbindungen aufzubrechen, die die beiden Stränge zusammenhalten. Dies für jede einzelne Kopie jedes von der Zelle benötigten Proteins zu tun, würde nicht nur viel Energie, sondern auch viel Zeit kosten. Stattdessen muss es einen Mechanismus geben, um die Informationen einmal (oder einige Male) aus der DNA zu entnehmen und dann viele Kopien eines Proteins aus dieser einzelnen Information zu erstellen. Dieser Mechanismus ist die Transkription.

Miniaturansicht: Vereinfachtes Diagramm der mRNA-Synthese und -Verarbeitung. (CC BY 3.0 - nicht portiert; Kelvinsong).


8: Transkription - Biologie

Am Ende dieses Abschnitts können Sie:

  • Listen Sie die Schritte der eukaryotischen Transkription auf
  • Diskutieren Sie die Rolle von RNA-Polymerasen bei der Transkription
  • Vergleichen und kontrastieren Sie die drei RNA-Polymerasen
  • Erklären Sie die Bedeutung von Transkriptionsfaktoren

Prokaryoten und Eukaryoten führen im Wesentlichen den gleichen Transkriptionsprozess durch, mit einigen wesentlichen Unterschieden. Der wichtigste Unterschied zwischen Prokaryoten und Eukaryoten sind deren membrangebundener Kern und Organellen. Da die Gene in einem Zellkern gebunden sind, muss die eukaryontische Zelle ihre mRNA ins Zytoplasma transportieren und ihre mRNA vor dem Abbau schützen, bevor sie translatiert wird. Eukaryoten verwenden auch drei verschiedene Polymerasen, die jeweils eine andere Untergruppe von Genen transkribieren. Eukaryotische mRNAs sind in der Regel monogen, das heißt, sie spezifizieren ein einzelnes Protein.


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Die Genexpression wird durch eine Reihe von Merkmalen gesteuert – die Regulation der Transkription und Translation:

Bei Eukaryoten können Transkriptions- oder Zielgene stimuliert oder gehemmt werden, wenn spezifische Transkriptionsfaktoren aus dem Zytoplasma in den Zellkern wandern. Da nur Zielgene transkribiert werden, bedeutet dies, dass spezifische Proteine ​​hergestellt werden. Jede Art von Körperzelle hat unterschiedliche Zielzellen, sodass sie unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, d. h. eine Nervenzelle unterscheidet sich von einem roten Blutkörperchen. Transkriptionsfaktoren können die Transkriptionsrate ändern und der Prozess ist wie folgt:

  • Die Transkriptionsfaktoren gelangen durch Diffusion aus dem Zytoplasma in den Zellkern.
  • Wenn sie sich im Kern befinden, können sie an die Promotorsequenz (die Sequenz, die der Start des Zielgens ist) binden.
  • Die Transkriptionsfaktoren erhöhen oder verringern entweder die Transkriptionsrate, je nachdem, ob sie an die Promotorsequenz gebunden haben.

Einige Transkriptionsfaktoren werden Aktivatoren genannt, da sie die Transkriptionsrate erhöhen. Dies geschieht durch die Transkriptionsfaktoren, die der RNA-Polymerase helfen, an die Promotorsequenz zu binden, um die Transkription zu aktivieren. Andere werden als Repressoren bezeichnet und verringern die Transkriptionsrate. Dies geschieht dadurch, dass die Transkriptionsfaktoren an die Promotorsequenz binden und die RNA-Polymerase an der Bindung hindern. Dies stoppt die Transkription.

Östrogen kann die Transkription von Zielgenen initiieren. Hinweis: Manchmal kann es dazu führen, dass ein Transkriptionsfaktor ein Repressor ist. Für die AQA-Prüfung müssen Sie dies nicht wissen. Ein Transkriptionsfaktor kann an einen Inhibitor gebunden sein, der ihn daran hindert, an die Promotorsequenz zu binden. Östrogen bindet an den Transkriptionsfaktor, bildet einen Östrogen-Östrogen-Rezeptor-Komplex und verändert die Stelle, an der der Inhibitor angelagert wird (genannt DNA-Bindungsstelle). Dies bedeutet, dass der Inhibitor abgelöst wird, wodurch sich der Transkriptionsfaktor an die Promotorsequenz anlagern kann. Hinweis: Sie müssen den Namen des Inhibitors nicht kennen. Auch die DNA-Bindungsstelle am Transkriptionsfaktor bleibt verändert, während das Östrogen daran gebunden hat.

Bei Eukaryoten und einigen Prokaryoten kann die Translation der von Zielgenen produzierten mRNA durch RNA-Interferenz, bekannt als RNAi, gehemmt werden. Kurze RNA-Moleküle wie Mikro-RNA, bekannt als miRNA, und kleine Interferenz-RNA, bekannt als siRNA, bilden mit Proteinen einen RNA-induzierten Silencing-Komplex, bekannt als RISC. Hinweis: Die kleinen RNA-Moleküle, die in den Überarbeitungsleitfäden oder in Lehrbüchern als doppelsträngig bekannt sind, sind verwirrend, daher ist es besser, den Prozess als einzelsträngige miRNA und siRNA zu starten. RNA bildet einen Komplex mit einem Protein, einem Enzym namens RNA-Hydrolase. miRNA bildet keinen Komplex mit RNA-Hydrolase, sondern mit einem anderen Protein. Diese RNA-Moleküle können jeweils ein RISC mit mehr als einem Protein bilden und die beteiligten Proteine ​​müssen für die AQA nicht bekannt sein. Die Komplexe heften sich jeweils an ihre Ziel-mRNA-Sequenz und verhindern die Translation auf unterschiedliche Weise. So wird es für jedes kleine RNA-Molekül gemacht:

  • siRNA/miRNA in Pflanzen:
  • Die Basen der siRNA heften sich durch komplementäre Basenpaarung an die Basen der mRNA.
  • RNA-Hydrolase hydrolysiert den mRNA-Strang in Fragmente und verhindert, dass eine Translation stattfindet, da nicht die gesamte Polypeptidkette hergestellt wird

Hinweis: Es ist nicht erforderlich zu wissen, dass die Fragmente im Verarbeitungskörper abgebaut werden. Wenn Sie dies lernen möchten, schadet das nicht.

  • miRNA bei Säugetieren:
  • Die Basen der miRNA heften sich durch komplementäre Basenpaarung an die Basen der mRNA.
  • Ribosomen werden daran gehindert, sich an den mRNA-Strang anzuheften, wodurch die Translation verhindert wird.

Hinweis: Auch hier ist es nicht notwendig zu wissen, dass mRNA im Prozessierungskörper abgebaut oder gespeichert wird.

Epigenetik beinhaltet vererbbare Veränderungen der Genfunktion ohne Veränderungen der DNA-Basensequenz. Diese Veränderungen werden durch Veränderungen in der Umwelt (mehr Umweltverschmutzung) verursacht, die die Transkription hemmen durch:

  • Erhöhte Methylierung von DNA:An Cytosin bindet eine Methylgruppe (bekannt als epigenetische Markierung), die Teil des Nukleotids sein muss, das über eine Phosphodiesterbindung an Guanin gebunden ist. Hinweis: Sie sind jetzt vielleicht verwirrt, aber schauen Sie sich das Diagramm unten eines DNA-Strangs an und beachten Sie, an welches der Cytosin-Nukleotide sich die Methylgruppe anschließt. Beachten Sie, dass das Nukleotid ganz rechts am Strang und das dritte von links keine Methylgruppe haben, da sie nicht neben einem Nukleotid mit Guanin als Base stehen. Die Anknüpfung der Methylgruppe sollte nicht durch Anknüpfen an Cytosin verwechselt werden, das am anderen Strang zu Guanin komplementär ist, da dies falsch ist. Auch die Methylgruppe – CH3 – ändert nicht die Basensequenz, sondern die Struktur. Da sich die Struktur verändert hat, ist es für Enzyme schwieriger geworden, sich an die DNA zu binden und die Expression eines Gens zu stoppen. Wenn das Tumorsuppressorgen nicht transkribiert wird, kann es Krebs verursachen.

  • Verminderung der assoziierten Histone: Eine Acetylgruppe – COCH3 – ist eine weitere epigenetische Markierung, die an Histonproteine ​​bindet, um das Chromatin (eine um Histonproteine ​​gewundene DNA-Mischung) weniger kondensiert zu machen, damit eine einfache genetische Expression erfolgen kann. Das Problem entsteht, wenn die Histon-Deacetylase die Bindung zwischen dem Histon-Protein und der Acetylgruppe aufbricht. Die DNA wird stark kondensiert, was es Enzymen erschwert, die Genexpression durchzuführen. Hinweis: Histon-Deacetylase kann mit HDAC abgekürzt werden, aber es ist am besten, wenn Sie beim vollständigen Namen bleiben.

Epigenetische Veränderungen der DNA sind glücklicherweise reversibel und sind daher gute Angriffspunkte für Medikamente, um die Auswirkungen epigenetischer Ereignisse zu stoppen. Diese Medikamente können entweder die DNA-Methylierung stoppen oder die Histondeacetylase hemmen, wodurch die Acetylgruppen an die DNA gebunden bleiben.


Wie funktionieren Transkriptionsfaktoren?

Aktivatoren

Repressoren


Abstrakt

Oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphorylcholin (Ox-PAPC) reguliert ein Spektrum an Entzündungszytokinen und Adhäsionsmolekülen hoch, das sich von denen unterscheidet, die durch klassische Entzündungsmediatoren wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder Lipopolysaccharid induziert werden. Interessanterweise induziert Ox-PAPC auch die Expression einer Reihe von Proteinen, die denen ähnlich sind, die durch TNF-α oder Lipopolysaccharid induziert werden, zu denen die Chemokine Monocyte chemotaktisches Protein-1 (MCP-1) und Interleukin (IL)-8 gehören. Um die molekularen Mechanismen der Ox-PAPC-induzierten Genexpression aufzuklären und zu bestimmen, ob Ox-PAPC und andere Entzündungsmediatoren wie TNF-α gemeinsame Signalwege nutzen, untersuchten wir die transkriptionelle Regulation von IL-8 durch Ox-PAPC und TNF- α in menschlichen Aorten-Endothelzellen. Sowohl Ox-PAPC als auch TNF-α induzierten dosisabhängig die Expression von IL-8-mRNA, jedoch unterschied sich die Kinetik der IL-8-mRNA-Akkumulation zwischen den beiden Liganden. Ox-PAPC-induzierte IL-8-mRNA wurde bereits nach 30 Minuten beobachtet, erreichte ihren Höhepunkt zwischen 4 und 8 Stunden und nahm nach 24 Stunden erheblich ab. Im Gegensatz dazu war die TNF-α-induzierte IL-8-mRNA-Synthese nach 30 Minuten erhöht, erreichte nach 2 Stunden ihren Höhepunkt und erreichte nach 6 Stunden basale/nicht nachweisbare Werte. Actinomycin D-Experimente legten nahe, dass sowohl Ox-PAPC als auch TNF-α die Expression von IL-8 auf Transkriptionsebene regulieren. Darüber hinaus war die Halbwertszeit von IL-8-mRNA für beide Liganden ähnlich (< 30 Minuten), was darauf hindeutet, dass die mRNA-Stabilität nicht für die Unterschiede in der Kinetik der IL-8-Akkumulation zwischen den beiden Liganden verantwortlich war. Transiente Transfektionsstudien mit Reporterkonstrukten, die 1,48 kb des IL-8-Promotors enthielten, identifizierten eine Ox-PAPC-spezifische Antwortregion zwischen –133 und –1481 bp des IL-8-Promotors. Im Gegensatz dazu wurde die TNF-α-Aktivierung des IL-8-Promotors fast vollständig durch die nuklearen Faktor-κB- und Aktivierungsprotein-1-Antwortelemente vermittelt, die zwischen –70 und –133 bp des IL-8-Promotors vorhanden waren. Obwohl Ox-PAPC und TNF-α beide die IL-8-Synthese induzierten, legen unsere Daten daher nahe, dass die beiden Liganden unterschiedliche Mechanismen bei der Regulation der IL-8-Transkription verwenden.

Wir haben bereits gezeigt, dass oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphorylcholin (Ox-PAPC), ein wichtiger bioaktiver Bestandteil von minimal modifiziertem LDL (MM-LDL), kommt in atherosklerotischen Läsionen und anderen chronischen Entzündungsherden vor. 1,2 Ähnlich wie andere inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) aktiviert Ox-PAPC Endothelzellen, um Monozyten-Endothel-Wechselwirkungen teilweise durch die Induktion von Chemokinen wie Monozyten chemotaktisches Protein-1 (MCP-1 .) zu verstärken ) und Interleukin (IL)-8. 3,4 Interessanterweise verstärkt Ox-PAPC (oder MM-LDL), aber nicht TNF-α die Monozyten-Endothel-Bindung, indem es die Aktivierung von β1-Integrinen vermittelt, was zur Ablagerung der verbindenden Segment-1-Domäne von Fibronektin auf der apikalen Oberfläche von . führt Endothelzellen. 5 Andererseits verstärkt TNF-α die Endothel-Monozyten-Wechselwirkungen durch die Induktion von E-Selectin und dem vaskulären Zelladhäsionsmolekül-1, die von Ox-PAPC nicht beeinflusst werden. 6 Somit verwenden Ox-PAPC und TNF-α sowohl ähnliche als auch unterschiedliche Induktionsmuster der Genexpression, um Endothel-Monozyten-Interaktionen zu initiieren. Obwohl die molekularen Mechanismen der Geninduktion durch TNF-α gut verstanden sind, sind die Zielrezeptoren, Signalwege und molekularen Mechanismen, durch die Ox-PAPC (1) funktionelle Veränderungen in Endothelzellen initiiert und (2) Endothel-Monozyten-Interaktionen verstärkt, nicht bekannt bekannt.

IL-8, ein Mitglied der CXC-Chemokinfamilie, wurde ursprünglich als ein neutrophiler chemotaktischer und aktivierender Faktor charakterisiert. 7,8 IL-8 wurde anschließend als wichtige Rolle bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen identifiziert. 9,10 In jüngerer Zeit wurde IL-8 mit der Monozytenaktivierung und der endothelialen Chemotaxis während der Angiogenese in Verbindung gebracht. 11 IL-8-mRNA wurde in atherosklerotischen Läsionen aus atherektomierten menschlichen Halsschlagadern sowie in Makrophagen-Schaumzellen in menschlichen Atheromen erhöht. 12 Ox-LDL-Behandlung und Cholesterin-Beladung induzieren IL-8-mRNA in Makrophagen. 13 Gerszten et al. 14 zeigten, dass IL-8 entscheidend für die feste Adhäsion von Monozyten an aktivierte Endothelzellen ist. Die Knochenmarktransplantation von Mäusen ohne CXC-Rezeptor-2 (ein Ortholog für den menschlichen IL-8-Rezeptor) in Mäuse mit LDL-Rezeptor-Mangel führte zu einer Verringerung der Entwicklung von Atherosklerose in den Aorten der Empfänger. 15 Diese Daten legen nahe, dass IL-8 zur Entstehung von Arteriosklerose beiträgt.

Eine Reihe von Liganden wie TNF-&agr; und Lipopolysaccharid induzieren die IL-8-Synthese in einer Reihe von Zelltypen, einschließlich Endothelzellen. 16–18 Die IL-8-Induktion durch TNF-α, IL-1β, IL-6 und Lipopolysaccharid wird auf Transkriptionsebene reguliert. 18,19 Der IL-8-Promotor enthält Konsensus-Bindungsstellen für den nuklearen Faktor-κB (NF-κB), das CCAAT-Enhancer-Bindungsprotein-β (C/EBPβ) und das Aktivierungsprotein-1 (AP-1), alle in die proximale Region zwischen –70 und –133 bp des humanen IL-8-Promotors. 20 In Makrophagen und Epithelzellen aktivieren TNF-α und andere inflammatorische Zytokine den IL-8-Promotor durch kooperative Bindung dieser 3 Transkriptionsfaktoren an ein zusammengesetztes Enhanceosom innerhalb von –70 bis –133 bp des proximalen Promotors. 21–24 Ox-PAPC und MM-LDL induzieren die Akkumulation von IL-8-Protein in Überständen von humanen Endothelzellen der Aorta (HAEC) 3 jedoch sind die Mechanismen der Ox-PAPC-induzierten IL-8-Synthese nicht bekannt. Um die molekularen Mechanismen zu bestimmen, durch die Ox-PAPC die IL-8-Genexpression induziert, haben wir die Regulation von IL-8 durch Ox-PAPC und TNF-α in HAECs untersucht.

Methoden

Reagenzien

Gewebekulturmedien und Reagenzien wurden von Irvine Scientific Inc. bezogen. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Hyclone bezogen. PAPC wurde von Sigma gekauft und Ox-PAPC wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. 2 Die Oxidation wurde durch Massenspektrometrie überwacht und beendet, wenn >90% PAPC oxidiert waren. Unter diesen Bedingungen wurde eine minimale Bildung von Lysophosphatidylcholin beobachtet. Somit waren die Massenspektrometrieprofile des Ox-PAPC, die in den vorliegenden Studien verwendet wurden, ähnlich den zuvor gezeigten. 2 Endotoxinkonzentrationen in den Phospholipidlösungen waren <0,1 pg/ml. TNF-α wurde von R&D bezogen. AP-1 (5′-CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC-3′), NF-κB (5′-GATCCAGGGGACTTTCCCTAGC-3′) und Oct-1 (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA-3′) Oligonukleotide für den elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay wurden von Santa . gekauft Cruz Biotechnologie. Radioisotope wurden von Amersham Pharmacia Biotech bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)/Hochglucose-Medium für die HeLa-Zellkultur und M199-Medium für die HAEC-Kultur wurden von Gibco/BRL bezogen.

Zellkultur

HAECs wurden aus den Aortenringen explantierter Spenderherzen wie zuvor beschrieben isoliert 1 und in M199-Medium, ergänzt mit 20 % (Vol./Vol.) FBS, Penicillin-Streptomycin (100 U/ml bzw. 100 µg/ml Gibco/BRL) kultiviert. , Natriumpyruvat (1 mmol/l), Heparin (90 μg/ml, Sigma) und Endothelzellwachstumsfaktor (20 μg/ml, Fisher Scientific). HeLa-Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, Va) wurden in DMEM/Hochglucose-Medium mit 10 % (Vol./Vol.) FBS und Penicillin-Streptomycin kultiviert.

Plasmide und ortsgerichtete Mutagenese

Konstruktion von Luciferase-Reporterplasmiden mit einem längeren humanen IL-8-Promotor (−1481 bis +44 bp), einem kürzeren IL-8-Promotor (−133 bis +44 bp) und mehreren Kopien einzelner NF-κB, C/EBPβ, oder AP-1-Elemente wurde zuvor beschrieben. 25 Mutationen in den NF-κB- und AP-1-Elementen im Kontext des Luciferase-Reporterkonstrukts mit dem längeren IL-8-Promotor von −1481 bis +44 bp (p[−1481/+44]-Luc) wurden mit a . erzeugt im Handel erhältliches Kit für ortsgerichtete Mutagenese (QuickChange, Stratagene) und vom Hersteller bereitgestellte Protokolle. Mutationsprimer der 3 Elemente wurden wie zuvor beschrieben 26,27 entworfen und von Invitrogen angepasst. Das NF-κB-Element wurde von TGAATTTCCT zu TGGAATTT . mutiertaaa und das AP-1-Element, von TGACTCA bis TGACTgt.

Transiente Transfektion

HeLa-Zellen wurden in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen (2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung) in DMEM/Hochglukose-Medium, das 10 % FBS enthielt, ausplattiert. Alle Transfektionen wurden mit insgesamt 1 µg DNA pro Well mit dem Superfect Reagent (8 µL pro Well, Qiagen) gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Vier Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen entweder mit Ox-PAPC oder TNF-α in DMEM/Hochglukosemedium/1% FBS stimuliert. Nach 12 Stunden wurden Gesamtzelllysate gesammelt und auf Luciferase-Aktivität unter Verwendung eines Luciferase-Assay-System-Kits (Promega) analysiert. Die Luciferase-Aktivität wurde auf die von cotransfizierter pSV-β-Galactosidase (Promega) normalisiert.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Die IL-8-Spiegel in den HAEC-Überständen wurden mit einem IL-8-ELISA-Kit (Quantikine, R&D) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

Northern Blotting

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus HAECs und HeLa-Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenzien (Gibco/BRL) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die humane IL-8-cDNA-Sonde (eine 1,2-kb .- ÖkoRI-Fragment der menschlichen IL-8-cDNA) wurde mit [α- 32 P]dCTP durch das Random-Priming-Verfahren radioaktiv markiert. Zur Normalisierung wurde eine Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Sonde eingeschlossen, und in allen Experimenten wurden quantitative Analysen mit einem Phosphoimager (Kodak) durchgeführt.

Extraktion nuklearer Proteine ​​und elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay

HeLa-Zellen wurden 1 Tag mit 1% FBS-enthaltendem DMEM/Hochglukose-Medium vorinkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit Ox-PAPC, TNF-&agr; und Phorbol-12-myristat-13-acetat (Sigma) behandelt. Die Zellen wurden dann geerntet und in 50 μl Zelllysepuffer (10 mmol/l HEPES pH 7,9, 10 mmol/l KCl, 1,5 mmol/l MgCl .) resuspendiert2, 0,5 mmol/L Dithiothreitol [DTT] und 0,1% NP-40) und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zelllysate wurden kurz gemischt und bei 10 000 Upm für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Als nächstes wurden die Pellets in 15 μl Nukleilysepuffer (20 mmol/l HEPES pH 7,9, 1,5 mmol/l MgCl .) resuspendiert2, 5 mmol/l DTT, 0,5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l PMSF, 25% Glycerin und 0,42 mol/l NaCl) und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Kernlysate wurden kurz gemischt und 15 Minuten bei 4°C bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und bei –80°C für zukünftige elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay-Studien gelagert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode bestimmt.

Der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. 28 Kurz gesagt, Oligonukleotide wurden mit [γ- 32 P]ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase endmarkiert und in Microspin-Säulen (Bio-Rad) gereinigt. Für jede 10-μl-Reaktion wurden 8 μg Kernextraktprotein und 1 μl gereinigte markierte Oligonukleotide mit 1 μl dI-dC (1 μg/μl) und 1 μl 10× Bindungspuffer (10 mmol/l Tris- HCl pH 7,5, 50 mmol/L NaCl, 0,5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/L DTT und 4% Glycerin) bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Die Proben wurden auf einem 4% nicht denaturierten Polyacrylamidgel in 0,5 × Tris-Borat-EDTA-Puffer bei 100 V für 1 Stunde einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und je nach Intensität der Radioaktivität auf den getrockneten Gelen 2 Stunden bis über Nacht einem 32 P-Phosphoimager ausgesetzt.

Ergebnisse

Ox-PAPC induzierte IL-8 mRNA und Proteinsynthese in HAECs

Wir haben zuvor gezeigt, dass Ox-PAPC die Akkumulation von IL-8-Protein in HAEC-Überständen induziert. 3 Um zu bestimmen, ob die Ox-PAPC-induzierte Akkumulation von IL-8-Protein das Ergebnis einer neuen IL-8-mRNA-Synthese war, führten wir eine Northern-Blotting-Analyse an HAECs durch, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ox-PAPC und PAPC behandelt wurden. Ox-PAPC induzierte die IL-8-mRNA-Synthese in einer dosisabhängigen Weise ( 1A ). Unbehandelte und PAPC-behandelte (bis zu 100 μg/ml) HAECs hatten, wenn überhaupt, eine sehr minimale IL-8-Botschaft (Abbildung 1A). Ox-PAPC induzierte auch die Akkumulation von IL-8-Protein in HAEC-Überständen in einer dosisabhängigen Weise ( 1B ).

Abbildung 1. Ox-PAPC induziert die IL-8-Botschaft und das Protein. HAECs wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Ox-PAPC (0 bis 100 µg/ml) und PAPC (0 bis 100 µg/ml) behandelt. Vier Stunden später wurden Gesamt-RNA und Überstand gesammelt, um die Spiegel von Ox-PAPC-induzierter IL-8-mRNA (A) und Protein (B) zu bestimmen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 4 separate Experimente. Fehlerbalken wurden statistisch mit Triplikaten der gleichen Bedingung in 1 Experiment bestimmt.

Kinetik der IL-8-mRNA-Akkumulation unterscheidet sich bei mit Ox-PAPC behandelten und TNF-α-behandelten HAECs

Als nächstes untersuchten wir den Zeitverlauf der TNF-α-induzierten und Ox-PAPC-induzierten IL-8-Botschaftsakkumulation in HAECs. Ox-PAPC-induzierte IL-8-Transkripte wurden bereits nach 30 Minuten (3-facher Anstieg) beobachtet, erreichten seinen Höhepunkt zwischen 4 und 8 Stunden (≈60-facher Anstieg) und nahmen nach 24 Stunden signifikant ab (8-facher Anstieg Abbildungen 2A und 2B). Im Gegensatz dazu waren die TNF-&agr;-induzierten IL-8-mRNA-Spiegel nach 2 Stunden maximal (300-fache Induktion), kehrten jedoch nach 6 Stunden zur Grundlinie zurück ( 2A und 2B ). In Gegenwart von Cycloheximid war die IL-8-mRNA immer noch um das 65-fache erhöht, was darauf hindeutet, dass die neue Proteinsynthese bei dieser verlängerten Induktion durch Ox-PAPC keine Rolle spielt. IL-8-Protein wurde in Ox-PAPC-behandelten HAEC-Überständen bereits nach 2 Stunden nachgewiesen, und die Spiegel nahmen nach 24 Stunden noch zu (Fig. 2C). TNF-α-induziertes IL-8-Protein akkumulierte bereits nach 1 Stunde und erreichte zwischen 8 und 12 Stunden seinen Höhepunkt. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Spiegel von IL-8 nach 12 Stunden ( 2D ). Diese Daten legen nahe, dass die Akkumulation von IL-8-Protein parallel zur IL-8-mRNA-Induktion durch die beiden Mittel verläuft.

Figur 2. Ox-PAPC und TNF-α induzieren IL-8 mRNA und Protein, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. HAECs wurden entweder mit Ox-PAPC (50 μg/ml) oder TNF-α (2 ng/ml) behandelt. Gesamt-RNA und Medium wurden in unterschiedlichen Zeitintervallen (0 bis 24 Stunden) gesammelt. A, Northern-Blots wurden mit 5 &mgr;g Gesamt-RNA durchgeführt, die aus Ox-PAPC- (oberes Feld) oder TNF-α- (unteres Feld) behandelten HAECs extrahiert wurde. B, Phosphoimage-Analyse von Northern-Blots von IL-8-mRNA, die durch Ox-PAPC und TNF-&agr; induziert wurde. Alle IL-8-Message-Spiegel wurden auf die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Spiegel normalisiert. C und D, ELISAs wurden an HAEC-Überständen durchgeführt, um die Spiegel der durch Ox-PAPC (C) und TNF-&agr; (D) induzierten IL-8-Proteinsynthese in unterschiedlichen Zeitintervallen (0 bis 24 Stunden) zu bestimmen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 separate Experimente.

Ox-PAPC erhöhte die IL-8-mRNA-Akkumulation durch Erhöhung der Transkription

Um zu bestimmen, ob die IL-8-mRNA-Akkumulation auf Transkriptionsebene auftritt, wurden HAECs 30 Minuten lang mit Actinomycin D (400 nmol/l) vorbehandelt und dann entweder mit Ox-PAPC (50 μg/ml) oder TNF-α (20 .) behandelt ng/ml) für 2 Stunden. Northern-Blot-Analyse (Fig. 3A) zeigte, dass Actinomycin D die IL-8-Transkription sowohl durch Ox-PAPC als auch durch TNF-α vollständig inhibierte (87 % bzw. 91 % Reduktion, Abbildung 3B). Um festzustellen, ob die Unterschiede in der posttranskriptionalen Regulation von IL-8 für die Unterschiede in der Kinetik der IL-8-Induktion durch Ox-PAPC und TNF-α verantwortlich sind, wurden HAECs 2 Stunden lang entweder mit Ox-PAPC oder TNF-α behandelt, bevor Actinomycin D (400 nmol/l) Behandlung und IL-8 mRNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert. Das IL-8-mRNA-Transkript wurde sowohl für TNF-α als auch Ox-PAPC nach 1 Stunde vollständig abgebaut (Fig. 3B), was anzeigt, dass die Halbwertszeit von IL-8-mRNA für beide ähnlich war (< 30 Minuten). These data suggest that both Ox-PAPC-induced and TNF-α-induced IL-8 expression is regulated at the level of transcription in HAECs (Figure 3C).

Figur 3. Ox-PAPC and TNF-α regulate IL-8 message at the level of transcription. HAECs were treated with or without actinomycin D (400 nmol/L) for 30 minutes and then with Ox-PAPC (40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL). Two hours later, total RNA were extracted and IL-8 message induced by TNF-α and Ox-PAPC was determined by Northern blot (A) and quantified by phosphoimage analysis (B). All IL-8 message levels were normalized to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase levels. The stability of induced IL-8 mRNA by both ligands was determined by measuring the message half-life. HAECs were first treated with either Ox-PAPC or TNF-α. Two hours later, actinomycin D (400 nmol/L) was added to inhibit any further synthesis of new message. Total RNA was extracted at different time intervals (0, 1, 2, and 4 hours) after addition of actinomycin D. Northern blots and phosphoimager analysis were performed to quantify the levels of IL-8 mRNA (expressed as the percentage of IL-8 message amount at 0 hours) induced by Ox-PAPC (solid line) or TNF-α (dashed line). Results are representative of 2 separate experiments.

Ox-PAPC and TNF-α Activated Reporter Constructs Containing a 1.48-kb IL-8 Promoter

Both Ox-PAPC and TNF-α induced IL-8 protein synthesis in HeLa cells (data not shown) therefore, IL-8 promoter regulation study was performed in this easily transfected cell type. To determine whether Ox-PAPC can induce transcriptional activation of the human IL-8 promoter, HeLa cells were transiently transfected with a luciferase reporter plasmid containing −1481 to +44 bp of the human IL-8 promoter and were then treated with various concentrations of Ox-PAPC. Ox-PAPC induced luciferase activity in a dose-dependent fashion, suggesting that Ox-PAPC response elements are present in the first 1.48 kb of the IL-8 promoter (Figure 4).

Figur 4. Ox-PAPC and TNF-α activate luciferase reporter constructs containing the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected for 2 hours with 0.8 μg per well of p(−1481/+44)-Luc, together with 0.2 μg per well of β-galactosidase expression plasmid, as described in Methods. Transfected cells were treated with various concentrations of Ox-PAPC (from 25 to 40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL) for 12 hours. Cell lysates were collected and assayed for luciferase and β-galactosidase activities. Luciferase activities were expressed in arbitrary units after being normalized against β-galactosidase activities. Results are representative of 3 separate experiments.

Studies on NF-κB, AP-1, and Oct-1 Activation

To determine whether NF-κB, C/EBPβ, or AP-1 response elements participate in Ox-PAPC-mediated transcriptional activation, reporter constructs containing multiple NF-κB (p[NF-κB]3-Luc), C/EBPβ (p[C/EBPβ]3-Luc), or AP-1 (p[AP-1]3-Luc) elements were transiently transfected into HeLa cells. TNF-α strongly activated p[NF-κB]3-Luc by 7-fold, whereas Ox-PAPC had no effect (Figure 5A). On the other hand, Ox-PAPC mildly activated the p[AP-1]3-Luc construct (Figure 5B), whereas TNF-α had no effect. Plasmid p[C/EBPβ]3-Luc was not activated by either TNF-α or Ox-PAPC (data not shown). Furthermore, nuclear extracts from cells treated with TNF-α but not Ox-PAPC showed increased binding activity to a [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB consensus sequence from the human IL-8 promoter (Figure 5C). TNF-α did not affect AP-1 binding activity in HeLa nuclear extracts, whereas a minimal increase was seen with Ox-PAPC (Figure 5C). Phorbol 12-myristate 13-acetate, an AP-1 activator, served as a positive control. Previous studies had shown that the induction of IL-8 may be the result of downregulation of Oct-1, a constitutive repressor of the C/EBPβ response element. 29 Because Ox-PAPC did not induce NF-κB and only minimally induced AP-1 activity, we hypothesized that Oct-1 binding activity might be decreased by Ox-PAPC and result in induction of IL-8. However, nuclear extracts from HeLa cells treated with Ox-PAPC or TNF-α showed no decrease in Oct-1 binding activity on the electrophoretic mobility shift assay (Figure 5C).

Abbildung 5. Activation of NF-κB, AP-1, and Oct-1. HeLa cells were transiently transfected with 0.8 μg of (A) p[NF-κB]3-Luc or (B) p[AP-1]3-Luc as per the aforementioned protocol in the legend to Figure 4. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (solid black bar) or 2 ng/mL TNF-α (dotted bar) for 12 hours. Results were shown in luciferase activity units that were normalized against β-galactosidase activities. p[NF-κB]3-Luc is a luciferase reporter construct with 3 copies of the NF-κB responsive element and p[AP-1]3-Luc, with 3 copies of the AP-1 responsive element. C, HeLa cell nuclear extracts were harvested after 30 minutes of stimulation with Ox-PAPC (40 μg/mL), TNF-α (2 ng/mL), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/mL), or control media (C). [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB, AP-1, and Oct-1 oligonucleotides were individually incubated with 5 μg of nuclear extracts at room temperature for 20 minutes. Reaction products were run on nondenatured gels and exposed to phosphoimage analysis. These image values were used to calculate the fold induction (above lanes) compared with untreated cells, and all values obtained were well within the linear range of phosphoimage measurement. Results are representative of 2 separate experiments.

An Ox-PAPC-Responsive Element Is Located in the Upstream Region of the Human IL-8 Promoter

To determine the sequences in the IL-8 promoter important for Ox-PAPC-induced transcription, reporter constructs containing different lengths of the IL-8 promoter (−1481 to +44 and −133 to +44) were transiently transfected into HeLa cells. The IL-8 promoter construct containing p[−1481/+44]-Luc was activated by Ox-PAPC however, the construct containing p[-133/+44]-Luc was only mildly activated by Ox-PAPC (Figure 6B). In contrast, TNF-α activated both the longer p[−1481/+44]-Luc and the shorter p[−133/+44]-Luc constructs (>17-fold, Figure 6A). Thus, deletion of the upstream region of the IL-8 promoter from −1481 to −133 bp resulted in a 75% reduction in promoter activation by Ox-PAPC (Figures 6A and 6B), suggesting that an Ox-PAPC-response region resides between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. Individual mutations in the conserved response elements (NF-κB and AP-1) generated in the context of the longer construct p[−1481/+44]-Luc] resulted in significant inhibition of TNF-α-induced IL-8 promoter activation but only slightly decreased Ox-PAPC-induced activation (Figures 6A and 6B).

Abbildung 6. Ox-PAPC mediates IL-8 promoter activation through an Ox-PAPC-specific response region between −133 and −1481 bp of the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected with 2 luciferase reporter plasmids, p[−1481/+44]-Luc and p[−133/+44]-Luc, or with 3 separate p[−1481/+44]-Luc constructs containing site-directed mutations of the NF-κB or AP-1 element, as described in Methods. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (A) or 1 ng/mL TNF-α (B). Results are shown as the fold induction above control. P-1481 indicates p[−1481/+44]-Luc P-133, p[−133/+44]-Luc. Results are representative of 3 separate experiments.

Diskussion

This study is the first to examine the mechanism by which Ox-PAPC, an oxidatively fragmented lipid component of MM-LDL, regulates transcription. In this study, Ox-PAPC was compared with the more thoroughly characterized regulation of IL-8 by TNF-α. Our results demonstrate that the major effect of Ox-PAPC on the IL-8 promoter is involved with an upstream sequence between −1481 and −133 bp. There are several responsive elements present in this region of the human IL-8 promoter that have been known for years, eg, the glucocorticoid responsive element and the hepatocyte nutrition factor-1 binding site, which are located at positions −330 to −325 bp and −381 to −376 bp, respectively, upstream from the TATA box. 20 Neither has been demonstrated to have a transcription-enhancing property in fact, activated glucocorticoid responsive element mediates the downregulation of NF-κB-activated transcription by interfering with the binding of NF-κB p65 to its cis-element 30 or by directly interfering with transactivation of the NF-κB p65 subunit. 31 There is no other cis-element in the human IL-8 promoter that has been described. Thus, we propose that there is a novel cis-element located in the 5′-flanking region between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. One likely candidate for this putative distant enhancer may be the peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE).

Recently, work from our laboratory has shown that MM-LDL and Ox-PAPC activate PPRE and peroxisome proliferator-activated receptor-α activators and stimulate the production of MCP-1 and IL-8 in HAECs. 3 Additionally, the PPRE has been reported to function as an indispensable cis-enhancing element that may be located as far as −2 kb upstream from the transcription initiation site. 32 These observations support the notion that the PPRE may be the cis-enhancing element responsive to Ox-PAPC in the 5′-flanking sequence of the human IL-8 promoter.

In our current study, by using both gel shift assays and transient transfection experiments, neither the NF-κB nor AP-1 signaling pathway was activated by Ox-PAPC. This result is different from previous data showing activation of NF-κB and AP-1 signaling by Ox-LDL, 33–35 MM-LDL, 36 or oxidized phospholipids, such as platelet-activating factor-like lipids. 37 Activation of NF-κB by Ox-LDL was demonstrated to be a result of enhanced phosphorylation of inhibitor-κB in monocytes. 34 Platelet-activating factor-like lipids, enzymatically oxidative fragmentation products of ether-containing phosphatidylcholine, activate NF-κB signaling in the cells expressing platelet-activating factor receptors, such as monocytes. 37 MM-LDL was also shown by electrophoretic mobility shift assay to activate binding to an NF-κB consensus sequence. 36 Although Ox-PAPC activates the AP-1 element in isolation, it only minimally increased AP-1 binding on the electrophoretic mobility shift assay and activated the longer IL-8 promoter with the AP-1 mutation. Thus, we have demonstrated that unlike Ox-LDL, the AP-1 element is not important in the human IL-8 promoter activation by Ox-PAPC.

The difference in the effects of Ox-LDL, MM-LDL, platelet-activating factor-like lipids, and Ox-PAPC may be related to the different cell types used for these studies. Furthermore, they may be related to the different bioactive lipid components in Ox-PAPC versus Ox-LDL and platelet-activating factor-like lipids. We found that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine, an oxidative fragmented product purified from Ox-PAPC, is the major bioactive lipid that enhances monocyte binding to endothelial cells. 38 The level of this phospholipid is quite low in Ox-LDL furthermore, Ox-PAPC, being ester derived, does not contain platelet-activating factor-like lipids. In a separate study, it will be shown that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine and its dehydration product are the lipids in Ox-PAPC that are mainly responsible for inducing IL-8 in HAECs.

In summary, this current study has provided information on the mechanism by which Ox-PAPC induces IL-8 transcription. We have demonstrated that Ox-PAPC transcriptionally regulates IL-8 and causes a prolonged increase in transcription, compared with TNF-α. This prolonged increase was not secondary to new protein synthesis. We have also shown that the induction of IL-8 by Ox-PAPC, unlike that by Ox-LDL or TNF-α, is not mediated by way of the NF-κB signaling pathway. IL-8 upregulation by Ox-PAPC is also not a result of activation of NF-κB, C/EBPβ, and AP-1 or of downregulation of a constitutive transcriptional repressor Oct-1. Rather, we have demonstrated that Ox-PAPC induces IL-8 expression by activation of a putative cis-enhancer element in the upstream IL-8 promoter sequence. Our results showing differential regulation of the IL-8 promoter by Ox-PAPC compared with that by TNF-α provide a basis for the differences previously reported in genes activated by the 2 agents.

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grant HL30568 and NIH training grant 5T32HL07895.

Received July 16, 2001 revision accepted July 27, 2001.

We thank Dr Yin Tintut for her technical support in several key experiments in this work.


Transcription: from DNA to mRNA

Both prokaryotes and eukaryotes perform fundamentally the same process of transcription, with the important difference of the membrane-bound nucleus in eukaryotes. With the genes bound in the nucleus, transcription occurs in the nucleus of the cell and the mRNA transcript must be transported to the cytoplasm. The prokaryotes, which include bacteria and archaea, lack membrane-bound nuclei and other organelles, and transcription occurs in the cytoplasm of the cell. In both prokaryotes and eukaryotes, transcription occurs in three main stages: initiation, elongation, and termination.

Initiation

Transcription requires the DNA double helix to partially unwind in the region of mRNA synthesis. The region of unwinding is called a transcription bubble . The DNA sequence onto which the proteins and enzymes involved in transcription bind to initiate the process is called a promoter . In den meisten Fällen existieren Promotoren stromaufwärts der Gene, die sie regulieren. The specific sequence of a promoter is very important because it determines whether the corresponding gene is transcribed all of the time, some of the time, or hardly at all (Figure 2).

Figur 2: The initiation of transcription begins when DNA is unwound, forming a transcription bubble. Enzymes and other proteins involved in transcription bind at the promoter.

Verlängerung

Transcription always proceeds from one of the two DNA strands, which is called the template strand . The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand , with the exception that RNA contains a uracil (U) in place of the thymine (T) found in DNA. During elongation, an enzyme called RNA polymerase proceeds along the DNA template adding nucleotides by base pairing with the DNA template in a manner similar to DNA replication, with the difference that an RNA strand is being synthesized that does not remain bound to the DNA template. As elongation proceeds, the DNA is continuously unwound ahead of the core enzyme and rewound behind it (Figure 3).

Figur 3: During elongation, RNA polymerase tracks along the DNA template, synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction, and unwinds then rewinds the DNA as it is read.

Beendigung

Sobald ein Gen transkribiert ist, muss die prokaryontische Polymerase angewiesen werden, von der DNA-Matrize zu dissoziieren und die neu hergestellte mRNA freizusetzen. Depending on the gene being transcribed, there are two kinds of termination signals, but both involve repeated nucleotide sequences in the DNA template that result in RNA polymerase stalling, leaving the DNA template, and freeing the mRNA transcript.

On termination, the process of transcription is complete. In a prokaryotic cell, by the time termination occurs, the transcript would already have been used to partially synthesize numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently using multiple ribosomes (polyribosomes) (Figure 4). Im Gegensatz dazu schließt das Vorhandensein eines Kerns in eukaryotischen Zellen eine gleichzeitige Transkription und Translation aus.

Figur 4: Mehrere Polymerasen können ein einzelnes bakterielles Gen transkribieren, während zahlreiche Ribosomen gleichzeitig die mRNA-Transkripte in Polypeptide übersetzen. Auf diese Weise kann ein bestimmtes Protein in der Bakterienzelle schnell eine hohe Konzentration erreichen.


Was ist der Zusammenhang zwischen Transkription und Übersetzung?

Transkription ist der Prozess der Herstellung einer RNA-Kopie einer Gensequenz. Übersetzung ist der Prozess der Übersetzung der Sequenz eines Boten-RNA-Moleküls in eine Sequenz von Aminosäuren während der Proteinsynthese. Die Beziehung zwischen den beiden Prozessen besteht also darin, dass sie beide an der Proteinsynthese beteiligt sind und dass zuerst die Transkription und dann die Translation an zweiter Stelle steht. Letztendlich ist dies alles, was wir über Transkription und Translation in Bezug auf die Genetik wissen. Lesen Sie weiter, wenn Sie mehr über Transkription und Übersetzung erfahren möchten wenn wir über Dienstleistungen sprechen.

Ob es sich um eine öffentliche Rede, ein Interview, eine Marktforschung oder einen Finanzbericht handelt, wenn Sie hoffen, dass Ihre Botschaft ein möglichst breites Publikum erreicht, sollten Sie erwägen, sie zu transkribieren und dann in Ihre Zielsprachen zu übersetzen. Auf geht's!

Die Transkription

Genau wie in der Genetik muss zuerst die Transkription erfolgen. Laut Merriam Webster wird eine schriftliche, gedruckte oder getippte Kopie gesprochener Wörter erstellt. Ein dokumentiertes Textformat Ihrer Audio- und Videodateien ist beispielsweise für Unternehmen unbedingt erforderlich. Es ist ein pragmatischer Weg, um den Überblick zu behalten und besser zu verstehen, was gesagt wird. Wenn Ihnen die Idee gefallen hat, planen Sie sorgfältig, da es für jeden, der keine Erfahrung mit Transkription hat, viel Zeit in Anspruch nimmt, um eine Audioaufzeichnung in ein Klartextdokument zu verwandeln. Tipp: Überlassen Sie diese ermüdende und mühsame Aufgabe unseren professionellen Transkriptionisten, die Vertraulichkeit, Genauigkeit und höchste Qualität garantieren.

Die Übersetzung

Sobald Sie ein fertiges und Korrektur gelesenes Transkript haben, können Sie mit der Übersetzung fortfahren. Es ist im Grunde der Akt der Umwandlung einer Sprache in eine andere. In der Praxis geht es jedoch nicht nur darum, Wörter in ihre Äquivalente in verschiedenen Sprachen umzuwandeln. Eine qualitativ hochwertige Übersetzung beinhaltet die Kenntnis des Kontexts und des kulturellen Hintergrunds, aus dem die Wörter im Originaltext stammen, und dann die Auswahl von Wörtern und Phrasen in der neuen Sprache, die den Inhalt und die Bedeutung des Originals in einem neuen und anderen kulturellen Kontext am besten vermitteln. Wenn dies nicht alles passiert, kann die Nachricht falsch interpretiert werden oder sogar verloren gehen. Wenn Sie Ressourcen für diesen Dienst investieren möchten, achten Sie außerdem darauf, dass Sie nach dem besten Timing, der Einfachheit und der Anpassung an das Publikum suchen.


Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor.

Glucose represses the transcription of many genes in bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae). Mig1 is a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex Ssn6-Tup1. We have found that the subcellular localization of Mig1 is regulated by glucose. Mig1 is imported into the nucleus within minutes after the addition of glucose and is just as rapidly transported back to the cytoplasm when glucose is removed. This regulated nuclear localization requires components of the glucose repression signal transduction pathway. An internal region of the protein separate from the DNA binding and repression domains is necessary and sufficient for glucose-regulated nuclear import and export. Changes in the phosphorylation status of Mig1 are coincident with the changes in its localization, suggesting a possible regulatory role for phosphorylation. Our results suggest that a glucose-regulated nuclear import and/or export mechanism controls the activity of Mig1.


Schau das Video: Transcription DNA to mRNA (Kann 2022).