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Lysepuffer für bakterielle Zellen, der in Proteomikverfahren verwendet wird

Lysepuffer für bakterielle Zellen, der in Proteomikverfahren verwendet wird


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Welche Arten von detergenzfreien bakteriellen Lysepuffern gibt es? Die Proteine, die wir extrahieren, werden später mit LC-MS/MS analysiert, und wir suchen nach einem Lysepuffer, der diese nachgelagerte Analyse nicht stört.


Ich bin ein GROSSER Fan von FASP (Filter-Aided Sample Preparation), einer In-Lösung-Aufbereitung/Aufschluss. Es ist sehr schnell, ermöglicht Ihnen, sich keine Gedanken über einen Proteinpräzipitationsschritt zu machen, und entfernt alle MS-inkompatiblen Substanzen mit den Waschschritten (also egal, welchen Lysepuffer Sie verwenden). Es erfordert nur sehr wenige, kostengünstige Materialien (eine Packung mit 100 Zentrifugenfiltereinheiten kostet weniger als 250 USD von VWR) und hat eine große Rückgewinnung. Dies ist der Link zum Nature Methods-Papier, auf dem das verlinkte Protokoll basiert (das verlinkte Protokoll ist eine aktualisierte, schnellere Version des Nature Methods-Protokolls).


Dafür stehen einige Techniken zur Verfügung.

Einige empfehlen eine harnstoffbasierte Technik, andere empfehlen ein Chloroform. Haben Sie weitere Informationen zu Ihren spezifischen Bedürfnissen?

Eine Chloroform-unterstützte Proteinisolierungsmethode gefolgt von Kapillar-NanoLC-MS Identifizieren östrogenregulierter Proteine ​​aus MCF7-Zellen


Warum nicht eine French Press verwenden? Geben Sie ein paar tausend PSI auf die Probe und die Zellen knallen einfach auf. Der Lysepuffer enthält keine Detergenzien:

Lysepuffer: 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50-200 mM NaCl* 1 mM MgCl2 5 mM DTT 1 mM PMSF

die Salzkonzentration ist variabel und du könntest wahrscheinlich auch auf die DTT verzichten, wenn das ein Problem ist…


Wie in pstew erwähnt, ist eine SDS-basierte Lyse gefolgt von FASP ein sehr guter Weg. FASP kann jedoch zu Probenverlusten führen. Ich würde es nur verwenden, wenn Sie eine große Kultur von Bakterienzellen haben.

Wenn Sie eine vollständig detergenzienfreie Methode wünschen, lysieren Sie die Zellen in 8 M Guanidiniumhydrochlorid, gepuffert auf pH 7,5-8,2, unter Verwendung von 50 mM Tris-Puffer oder 50 mM frisch zubereitetem Ammoniumbicarbonat. Wenn Ihr Zellpellet ungefähr 20 ul enthält, dann fügen Sie 60 ul 8 M GuHCL-gepufferte Lösung hinzu, so dass die Endkonzentration von GuHCL ~ 6 M beträgt, erhitzen Sie auf 65 ° C und schütteln Sie es etwa 30 Minuten lang. Drehen Sie nach unten, um alle unlöslichen Rückstände zu entfernen. Messen Sie die Proteinkonzentration, wenn Sie möchten, mit dem BCA-Assay. Dann mit 10 mM DTT für 30 Minuten bei 56 °C reduzieren, mit 25 mM Iodacetamid bei Raumtemperatur und im Dunkeln alkylieren (für diesen Schritt ist es entscheidend, dass der pH-Wert Ihrer Probe bei etwa 8,0 liegt, sonst verursacht Iodacetamid Nebenreaktionen). Mindestens 8-fach verdünnen und über Nacht mit Trypsin verdauen.


Einfrier-/Auftauverfahren bei der Zelllyse - Wie wird das gemacht? (10. Juli 2006)

Hallo,
Ich muss einen Western Blot in MCF7-Zellen machen und bin verwirrt darüber, wie man die Zellproteinextrakte macht. Ich werde verwenden, um RIPA-Puffer und das Einfrieren / Auftauen zu lysieren, aber ich kenne die Reihenfolge nicht, in der ich dies tun muss. Ich habe dieses Protokoll, ich bin mir nicht sicher, ob es richtig ist. Bitte hilf mir.
1. Zellen in kaltem PBS waschen und PBS entfernen
2. fügen Sie 10 ml eiskaltes PBS hinzu und kratzen Sie die Zellen ab, pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in RIPA
3. aliquotieren und 30min auf Eis inkubieren
4. beschallen <------ Ich kann nicht beschallen, ich muss einfrieren / auftauen, aber ich weiß nicht, wo in diesen Schritten es hingehen soll und wie es geht (sollte ich in RIPA-Puffer einfrieren / auftauen? oder PBS?? )
5.Zentrifugieren, Überstand entfernen und bei -80 . lagern

Kann mir bitte jemand sagen wie das geht??

Einfrieren und auftauen 3X in einem beliebigen Puffer ist ausreichend, um Zellen aufzubrechen.

Wie ist die Zusammensetzung von RIPA? RIPA kann die bessere Wahl sein, wenn es Proteasehemmer enthält.

Sofern Ihr spezielles Protokoll dies nicht als Behandlungsschritt erfordert, müssen Sie die Zellsuspension nicht 30 Minuten lang in RIPA auf Eis halten. Sie können direkt zu F-T 3X gehen.

Sie können Ihrem Lysepuffer auch Lysozym und DNase hinzufügen, die beide die Schritte der Lyse / des genomischen DNA-Scherens beschleunigen, sodass Sie zu den lustigen Teilen übergehen können, z. B. der Reinigung des Proteins.

Ja, Sie fügen RIPA Protease-Inhibitoren hinzu:
* 150 mM NaCl
* 50 mM Tris, pH 7,4
* 1 % NP-40
* 0,25 % Natriumdesoxycholat
* EDTA 1 mM
Wenn ich nach RIPA-Rezept suche, sind sie alle unterschiedlich, einige verwenden 50 mM HEPES anstelle von Tris. Gibt es da einen Unterschied?

Vielen Dank, Ihr Vorschlag hat mich klargestellt.

Einfrieren und auftauen 3X in einem beliebigen Puffer ist ausreichend, um Zellen aufzubrechen.

Wie ist die Zusammensetzung von RIPA? RIPA kann die bessere Wahl sein, wenn es Proteasehemmer enthält.

Sofern Ihr spezielles Protokoll dies nicht als Behandlungsschritt erfordert, müssen Sie die Zellsuspension nicht 30 Minuten lang in RIPA auf Eis halten. Sie können direkt zu F-T 3X gehen.

Ihre Mischung hat bereits eine sehr starke membranlytische Aktivität, es sollte ausreichen, um Zellen in 5-10 min auf Eis zu lysieren und F-T wird nicht benötigt. PBS enthält keine Reinigungsmittel wie NP-40 und SDS, daher wird FT 3X benötigt.

Puffer-Tris und Hepes machen kaum einen Unterschied, abgesehen davon, dass Tris ein schwaches Amin hat und mit Amin-reaktiven Mitteln wie Glutaldehyd reagieren kann. Sie müssen sich für Ihr Zelllyse-Experiment darüber keine Gedanken machen.

Ich schlage vor, dass Sie Protease-Cooktail hinzufügen, um den Proteinabbau zu reduzieren.

Wenn Sie zytosolische Proteine ​​untersuchen, reicht dies für die Probenvorbereitung aus.

Wenn Sie kein Ultraschallgerät haben, können Sie Ihre Extrakte auch durch die Nadel einer Spritze führen. Sie sollten die 1-ml-Spritze mit der sehr kleinen Nadel verwenden (wie die, die Menschen für Insulin oder Medikamente verwenden).

Da RIPA-Puffer viele Detergenzien (SDS) enthält, sind die meisten Enzyme darin nicht aktiv
(die DNAse, die wir für Beispiele verwenden, ist in RIPA nicht aktiv) -
Sie müssen also die Beschreibung der Enzymaktivität des Herstellers überprüfen

Das ist großartig!! vielen Dank für die Vorschläge.

Ich bin so glücklich, dass ich auf die Unterstützung und den Rat von euch allen zähle!!

Ihre Mischung hat bereits eine sehr starke membranlytische Aktivität, es sollte ausreichen, um Zellen in 5-10 min auf Eis zu lysieren und F-T wird nicht benötigt. PBS enthält keine Reinigungsmittel wie NP-40 und SDS, daher wird FT 3X benötigt.

Puffer-Tris und Hepes machen kaum einen Unterschied, abgesehen davon, dass Tris ein schwaches Amin hat und mit Amin-reaktiven Mitteln wie Glutaldehyd reagieren kann. Sie müssen sich für Ihr Zelllyse-Experiment darüber keine Gedanken machen.

Ich schlage vor, dass Sie Protease-Cooktail hinzufügen, um den Proteinabbau zu reduzieren.

Wenn Sie zytosolische Proteine ​​untersuchen, reicht dies für die Probenvorbereitung aus.

Ich mache RIPA von Grund auf neu, ich habe keine Herstelleranweisungen, aber ich glaube nicht, dass ich Lysozym und DNase hinzufügen werde.

Da RIPA-Puffer viele Detergenzien (SDS) enthält, sind die meisten Enzyme darin nicht aktiv
(die DNAse, die wir für Beispiele verwenden, ist in RIPA nicht aktiv) -
Sie müssen also die Beschreibung der Enzymaktivität des Herstellers überprüfen

Ich mache RIPA von Grund auf neu, ich habe keine Herstelleranweisungen, aber ich glaube nicht, dass ich Lysozym und DNase hinzufügen werde.

Da RIPA-Puffer viele Detergenzien (SDS) enthält, sind die meisten Enzyme darin nicht aktiv
(die DNAse, die wir für Beispiele verwenden, ist in RIPA nicht aktiv) -
Sie müssen also die Beschreibung der Enzymaktivität des Herstellers überprüfen

Ich habe versucht, DNase hinzuzufügen, obwohl der Hersteller sagte, dass es nicht funktionieren würde und es keinen Unterschied auf der GL machte, also lass es einfach sein.


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Es stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung, um Zellen aufzuschließen und ihren Inhalt für die Analyse aufzubereiten. Im Allgemeinen werden schonende Methoden angewendet, wenn die Probe aus leicht lysierten kultivierten Zellen oder Blutzellen besteht, während energischere Methoden zum Aufschluss robusterer Bakterien- oder Pflanzenzellen oder in Bindegewebe eingebetteter Säugerzellen verwendet werden.

    Lyse auf Waschmittelbasis: Lyse auf Waschmittelbasis: Die Waschmittellyse ist eine schonende Methode, die für Säugerzellen, Bakterienzellen, Hefen und Pflanzen verwendet werden kann. Zellsuspensionen werden vorsichtig zentrifugiert und in Lyselösung resuspendiert, die Detergenzien enthält, die die Zellmembran zerstören. Die Membranen werden solubilisiert, lysieren die Zellen und setzen ihren Inhalt frei. Reinigungsmittel müssen möglicherweise stromabwärts entfernt werden, wenn sie die Analyse oder Produktion beeinträchtigen. Gefrier-Auftau-Lyse: Dieses Verfahren ist auf Suspensionen von Säugetier- oder Bakterienzellen anwendbar. Die Zellsuspension wird mit flüssigem Stickstoff schnell eingefroren. Anschließend wird die Probe aufgetaut und durch Pipettieren oder vorsichtiges Vortexen in Lysepuffer resuspendiert, wobei der Vorgang mehrmals wiederholt wird. Zwischen den Zyklen wird die Probe zentrifugiert, und der Überstand, der lösliches Protein enthält, wird zurückbehalten. Osmotischer Schock: Dies ist eine sehr schonende Methode, die für die Lyse suspendierter Säuger- oder Bakterienzellen ohne Verwendung eines Detergens ausreichend sein kann. Das Verfahren, oft kombiniert mit mechanischem Aufbrechen, beruht auf dem Wechsel von hoch- zu niedrig-osmotischem Medium und ist gut geeignet für Anwendungen, bei denen das Lysat anschließend in subzelluläre Komponenten fraktioniert werden soll. Ultraschall: Diese Methode der Proteinextraktion wird am häufigsten bei Zellsuspensionen angewendet. Über eine in die Probe eingeführte Sonde werden Zellen durch hochfrequente Schallwellen aufgebrochen. Die Schallwellen erzeugen einen Bereich mit niedrigem Druck, der die Zellmembranen zerstört. Mechanische Methoden: Proteine ​​können aus Zellen und Geweben unter Verwendung verschiedener grober, aber wirksamer Maßnahmen zum "Zerkleinern und Mahlen" extrahiert werden. Zum Beispiel können Zellmembranen durch Flüssigkeitsscherkräfte unter Verwendung von Dounce- oder Potter-Elvehjem-Homogenisierung aufgebrochen werden. Gewebe können durch Zerhacken oder Zerkleinern in gekühltem Puffer unter Verwendung eines Waring-Mischers oder Polytron®-Homogenisators homogenisiert werden. Gewebe oder Zellen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und unter Verwendung eines Mörsers und Pistills mit Aluminiumoxid oder Sand zu einem feinen Pulver gemahlen werden. Die schnelle Bewegung der Zellen mit feinen Glaskügelchen zerstört die Zellwände, was für die meisten grampositiven und gramnegativen Bakterien wirksam ist. Enzymatische Verdauung: Enzymatische Verdauung: Enzymatische Methoden werden häufig verwendet, wenn Proteine ​​aus Bakterien, Hefen oder eukaryontischen Zellen extrahiert werden, die in Fasergewebe eingebettet sind, wobei die Zellmembranen von einer robusten Schutzstruktur umgeben sind. Zelllyseenzyme oder -cocktails wie Lysozym, Mutanolysin, MetaPolyzyme, Lysonase und Pronase können in Kombination mit Gewebeverdauungsenzymen (dh Collagenase, Chondroitinase, Hyaloronidase) verwendet werden, um Zellwände, Hüllen, Kapseln, Kapside oder andere Strukturen aufzulösen oder zu zerstören durch mechanische Methoden allein nicht leicht zu scheren. Auf den enzymatischen Verdau kann eine Homogenisierung, Beschallung oder kräftiges Vortexen in einem Lysepuffer folgen.

Da endogene Proteasen und Phosphatasen beim Zellaufschluss freigesetzt werden und das Zielmolekül abbauen können, sollte die Probe außerdem während des Zellaufschlusses und der anschließenden Reinigung unter Verwendung von Protease- und Phosphatase-Inhibitoren geschützt werden, um einen unkontrollierten Zielverlust zu vermeiden.


Bakterielles PE LB™ (9 Zitate)

Bakterielles PE LB&trade wurde für die Extraktion von löslichen Proteinen und Einschlusskörperchen aus Bakterienzellen entwickelt. Es ist eine proprietäre Verbesserung der Lysozym-basierten Lyse, die die Extraktion von löslichen Proteinen und die gleichzeitige Entfernung von Nukleinsäuren (DNA und RNA), die während der Zelllyse freigesetzt werden, ermöglicht. Bakterielle PE LB&trade-Lyse eliminiert den Viskositätsaufbau und ermöglicht eine effektive Klärung mit geringerer Zentrifugalkraft.

Dieses Kit wird mit einem optionalen Protokoll für die Bildung von Sphäroplasten und die Entfernung des lytischen Enzyms (Lysozym) vor der Lyse und Extraktion der bakteriellen Proteine ​​geliefert. Bakterielles PE LB&trade basiert auf organischen Puffersubstanzen und verwendet ein mildes nichtionisches Detergens und eine geschützte Kombination verschiedener Salze und Wirkstoffe, um die Extraktion und Stabilität von Proteinen zu verbessern. Je nach Anwendung können Bacterial PE LB&trade zusätzliche Wirkstoffe wie Reduktionsmittel, Chelatbildner und Protease-Inhibitoren-Cocktail zugegeben werden. Dieses Reagenz wurde für die Verwendung mit mehreren weit verbreiteten Bakterien, einschließlich E. coli-Stämmen, getestet.

Bakterielles PE LB&trade ist mit den meisten Downstream-Anwendungen kompatibel, einschließlich der Ausführung verschiedener Chromatographie-, Gelelektrophorese-Anwendungen und Proteinfaltungsverfahren. Bakterielles PE LB&trade ist auch für die Proteinbestimmung mit dem NI&trade Proteinassay (Non-Interfering Protein Assay)&trade kompatibel.

Zur bakteriellen Lyse eignen sich die Kits zur Extraktion von löslichen Proteinen aus ca. 30 g nassen Zellpellets pro 100 ml Bacterial PE LB&trade. Wenn die Kits zur Extraktion löslicher Proteine ​​aus Sphäroplasten verwendet werden, sind sie für ca. 9 g nasse Zellpellets pro 25 ml mitgeliefertem Bakteriensuspensionspuffer geeignet.

Bakterielles PE LB&Trade-Formate

Komplettsets (Kat. # 786-176, 786-187, 786-188)

Die kompletten Kits enthalten bakterielles PE LB&trade, bakteriellen Suspensionspuffer und PE LB&trade Lysozym. Das PE LB&trade Lysozym ist eine proprietäre Mischung aus Lysozym, um Zellen aufzubrechen, und DNase und RNase, um Nukleinsäuren zu entfernen. Der Enzymmix ist gebrauchsfertig und in Konzentrationen für eine optimale enzymatische Aktivität.

Nur bakterieller PE LB&Trade-Puffer (Kat. # 786-177, 786-185, 786-186)

Die Nur-Puffer-Option ermöglicht es Forschern, den Bacterial PE LB&trade-Puffer in ihren bestehenden Protokollen zu ersetzen, um die Lyse zu verbessern oder in weiteren nachgelagerten Anwendungen zu verwenden.

Bakterielles PE LB&trade [2X] (Kat. # 786-189)

Bacterial PE LB&trade [2X] ist eine modifizierte Formulierung von Bacterial PE LB&trade, mit der die Hälfte des Lysepuffervolumens verwendet werden kann, während die Lyseraten beibehalten werden. Es wird zur Extraktion von Proteinen verwendet, die in geringen Mengen exprimiert werden, und kann auch verwendet werden, wenn hohe Konzentrationen an extrahierten Proteinen erwünscht sind.

Bakterielles PE LB&trade in Phosphatpuffer (Kat. # 786-191)

Bacterial PE LB&trade in Phosphatpuffer ist eine Variation von Bacterial PE LB&trade Puffern nur in Phosphatpuffer. Es hat die gleiche Effizienz wie Bacterial PE LB, jedoch können die resultierenden Lysate für Proteinmarkierungen und Kupplungsreaktionen verwendet werden, die primäre Amine verwenden.


Optimierter Zelllysepuffer für die Aufreinigung von affinitätsmarkierten Proteinen:

  • Extrahieren von Proteinen aus Bakterien-, Hefe-, Säugetier- und Baculovirus-infizierten Zellen
  • Schnelles, einfaches Verfahren&mdasherfordert nur eine 10-minütige Inkubation
  • Milde, nicht denaturierende Extraktion trägt zur Erhaltung der biologischen Aktivität bei
  • Kompatibel mit allen IMAC-Harzen, was eine schnelle Reinigung von His-markierten Proteinen ermöglicht
  • Universell&mdashgeeignet für Proteinextraktion in jedem Maßstab & jeden Tag (Verwendung mit his-, GST-, FLAG-HA- oder anderen markierten Proteinen)
  • Effizient & besser als Beschallung oder andere Zelllysepuffer

4. Mikrofabrizierte Plattformen für die Zelllyse

Mikrofluidik ist eine der aufstrebenden Plattformen für die Zelllyse im Mikromaßstab. Mikrofluidik ist die Manipulation und Handhabung kleiner Volumina (Nano- bis Pikoliter) von Flüssigkeit in Mikrokanälen. Aufgrund des Betriebsregimes im Mikromaßstab ist die Mikrofluidik gut geeignet für Anwendungen, bei denen die Probe oder das Probenvolumen klein ist. Dies senkt die Kosten der Analyse aufgrund des geringen Reagenzienverbrauchs [46]. Die Mikrofluidik ermöglicht auch die Integration verschiedener Module (oder Operationen) in ein Gerät. Zum Beispiel können Zellen lysiert und die intrazellulären Produkte direkt im selben Gerät nachbearbeitet werden (PCR oder DNA-Isolierung für die Diagnostik) [47,48]. Obwohl es in den letzten 10 Jahren eine Reihe von Übersichten zur Zelllyse gab [7,8,49], wurden einige der jüngsten Entwicklungen auf diesem Gebiet nicht überprüft. Dieser Rückblick konzentriert sich auf die jüngsten Entwicklungen ab 2014 und geht kurz auf die Entwicklungen von früher ein, die ausführlich untersucht wurden. Einige der Techniken im Makromaßstab wurden in mikrogefertigten Vorrichtungen zur Zelllyse implementiert. Techniken wie elektrische Lyseverfahren sind nur im Mikromaßstab anwendbar. Die Mikrofluidik-Lyse-Technologie kann grob in sechs Typen eingeteilt werden. Sie umfassen mechanische Lyse, thermische Lyse, chemische Lyse, optische Lyse, akustische Lyse und elektrische Lyse.

4.1. Mechanische Lyse

Die mechanische Lyse in der Mikrofluidik beinhaltet das physikalische Aufbrechen der Zellmembran unter Verwendung von Scher- oder Reibungskräften und Druckspannungen. Berasaluceet al. [50] entwickelten eine miniaturisierte Methode zum Aufschlagen von Beads, um große Zellvolumina zu lysieren. Zirkonium/Siliciumdioxid-Kügelchen wurden zusammen mit einem Permanentmagneten in eine Zelllysekammer eingebracht, und die Betätigung eines externen Magnetfelds verursachte die Bewegung der Kügelchen in der Kammer. Abbildung 7 zeigt die verschiedenen Komponenten und Vorrichtungen, die für die Zelllyse zusammengebaut wurden. Staphylococcus epidermidis Zellen wurden in dieser Studie verwendet und sie untersuchten die Wirkung von Perlengröße, Volumen, Flussrate und Tensid (Tween-20) auf die Lyseeffizienz. Sie fanden heraus, dass die optimalen Parameter eine um 43 % höhere Ertragseffizienz bei einer Durchflussrate von 60 μL/min im Vergleich zu Off-Chip-Bead-Bead-Systemen erreichten.

Miniaturisiertes Bead-Beading-Zelllysesystem: (ein) verschiedene Komponenten: (1) Einlass (2) Auslass (3) Rührmagnet (4) Zirkonoxid/Silikatperlen (5) Wulstwehr (6) Drehmagnet und (7) Elektromotorkupplung und (B) Bild des Geräts zur Lyse. Wiedergabe mit Genehmigung aus [50].

Phamet al. [51] haben kürzlich Nanotechnologie verwendet, um schwarze Silizium-Nanosäulen herzustellen, um Erythrozyten in etwa 3 Minuten zu lysieren. Sie stellten diese Nanosäule mit

12 nm Spitzendurchmesser und 600 nm Höhe auf Siliziumsubstrat mit reaktiver Ionenätztechnologie. Die Autoren zeigten, dass die Interaktion von Erythrozyten, die auf Nanosäulen-Arrays kultiviert wurden, eine stressinduzierte Zelldeformation, Ruptur und Lyse in etwa 3 Minuten verursacht. Abbildung 8 zeigt die Interaktion von Erythrozyten mit den Nanostrukturen.

Zelllyse mit Nanosäulen: (ein,B) Draufsicht und Seitenansicht der Zellen, die mit den Nanosäulen interagieren und (C) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bilder von intakten, deformierten und aufgebrochenen Zellen. Wiedergabe mit Genehmigung aus [51].

Die mechanische Lyse wurde durch die Verwendung von Widerhaken im Nanomaßstab nachgewiesen [52]. Wenn Zellen durch eine kleine Öffnung gepresst werden, führen hohe Scherkräfte zum Zerreißen der Zellmembran. Ein ähnliches Prinzip wurde hier verwendet, wo “nanoknives” in der Wand von Mikrokanälen durch modifiziertes tiefes reaktives Ionenätzen (DRIE) hergestellt wurden. Der Abstand zwischen diesen scharfen Kanten betrug 0,35 μm und die Breite des Kanals betrug 3 μm. Der Lyseabschnitt dieses Geräts bestand aus einem Array dieser “nanoknives”, die auf einem Mikrokanal gemustert waren, wie in Abbildung 9 b gezeigt. Humane Promyelozytose-Leukämiezellen (HL-60) wurden verwendet, um diesen Abschnitt mit ausreichender Geschwindigkeit zu passieren. Das Hinzufügen dieses “nanoknives”-Musters erhöhte die Lysemenge. Dieses Gerät wurde verwendet, um Protein aus dem Inneren der Zelle zu extrahieren. Es wurde geschätzt, dass bis zu 99% der Zelle lysiert wurden, aber nur 6% Protein freigesetzt wurden.

Mechanische Lyse mit nanoskaligen Widerhaken: (ein) Mikrofluidik-Gerät mit verschiedenen Einlass- und Auslasskanälen (B) Schema der Widerhaken (C) tiefes reaktives Ionenätzen (DRIE) hergestellte Nanomesser (D) vergrößertes Bild von Nanomessern, die mit der DRIE-Technik gemustert wurden und (e) Abmessungen der zur Zelllyse verwendeten Nanomesser. Wiedergabe mit Genehmigung aus [52].

Alternativ wurde auch mechanisches Impingement durch Kollision verwendet, um im Mikromaßstab zu lysieren [53, 54, 55]. Die Zellen wurden mit Glaskügelchen in Lösung suspendiert und auf die Mikrofluidik-Compact-Disc-(CD)-Vorrichtung gelegt, die dann mit einer sehr hohen Geschwindigkeit rotiert wurde. Die durch die Rotation erzeugte Zentrifugalkraft verursacht Kollision und Reibung zwischen Zellen und Kügelchen, was zur Zelllyse führt. Verschiedene Arten von Zellen, einschließlich Säugerzellen, Bakterien und Hefen, wurden unter Verwendung dieser Technik lysiert.

Obwohl die Effizienz der mechanischen Lyse sehr hoch ist, haben diese Aufschlussverfahren einige Nachteile bei der Anwendung im Mikromaßstab. Die Herstellung dieser Vorrichtungen ist sowohl komplex als auch teuer und das Sammeln der Zielmaterialien aus einer komplexen Mischung ist sehr schwierig.

4.2. Thermische Lyse

Bei der thermischen Lyse wird den Zellen Wärme zugeführt, um die Membranproteine ​​zu denaturieren und die Zellen zu lysieren. Ein Vorteil der thermischen Lyse ist die einfache Integration von mikrofluidischen Geräten wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die thermische Lyse kann in solchen Geräten ohne zusätzliche Modifikation durchgeführt werden. Die Zellen werden im Allgemeinen auf über 90 °C erhitzt und die intrazellulären Produkte werden beispielsweise in einem PCR-Gerät durch verschiedene Temperaturen zyklisiert. Tsougeni et al. [56] stellten ein mikrofluidisches Gerät her, das Zellen einfangen und lysieren kann. Sie verwendeten eine thermische Lyse bei 95 °C für 10 Minuten, um Bakterien einzufangen und zu lysieren. Nanostrukturen wurden in Poly(methylmethacrylat) unter Verwendung von Lithographie und Plasmaätztechnik hergestellt. Mikrofluidische PCR-Geräte mit integrierter thermischer Zelllyse [57,58,59] bestehen aus einer Glaskammer und einer Widerstandsheizung zum Erhitzen der Kammer.

Im Allgemeinen ist die thermische Lyse in einer mikrofluidischen Plattform effektiv, jedoch sind diese Geräte nicht für die Probenvorbereitung geeignet, bei der die Probe ein großes Volumen hat und Zellen aus einem kontinuierlichen Fluss lysiert werden müssen [29]. Zellen müssen jedoch mit Lysozym behandelt werden, um die Zellwand aufzubrechen und Bakterien zu Protoplasten zu machen. Die Zugabe dieses Lysozyms ist zeitaufwendig und erfordert komplexe Strukturen. Darüber hinaus wird die Konservierung des Enzyms in der Vorrichtung problematisch, wenn die Vorrichtung über einen langen Zeitraum verwendet werden muss. Eine höhere Lysezeit und ein erhöhter Energieverbrauch sind weitere Nachteile dieses Verfahrens.

4.3. Chemische Lyse

Chemische Lyseverfahren verwenden chemische Reagenzien wie Tenside, Lysepuffer und Enzyme, um Lipide und Proteine ​​in der Zellmembran zu solubilisieren, um Poren zu erzeugen und Zellen zu lysieren. Obwohl chemische und enzymatische Verfahren getrennt in Verfahren im Makromaßstab kategorisiert werden, werden diese beiden Verfahren in dieselbe Gruppe für Zelllyseverfahren im Mikromaßstab aufgenommen. Buseret al. [60] lysierten grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus) und RNA-Viren (respiratorisches Synzytialvirus) unter Verwendung einer getrockneten Enzymmischung (Achromopeptidase). Sie konnten in weniger als einer Minute lysieren und verwendeten dann eine chemische Einwegheizung, um das Lyseenzym zu deaktivieren. Sie konnten das Lysat ohne Aufreinigung amplifizieren (off-chip) und zeigten den Machbarkeitsnachweis für ein Point-of-Care-Gerät für die Diagnostik.

Kashyapet al. [61] entwickelten eine mikrofluidische Sonde zur selektiven lokalen Lyse adhärenter Zellen (

300 Zellen) für die Nukleinsäureanalyse. Hallet al. [62] verwendeten ein Gerät für Zelllyseexperimente, das zwei Versorgungsbrunnen und einen Druckbrunnen aufwies. Das Mischen von Zell- und Lyselösung wurde durch Einstellen des Drucks der Wells kontrolliert. Es wurden drei verschiedene Arten von Lösungen verwendet: Lösung A, die nur SDS (detergenzienbasiertes Reagens) enthielt, Lösung B, die Tensid enthält, Triton X-100, Tween-20 mit Enzymen wie Lysozym, Protease, Proteinase K und Lösung C, die ein Antibiotikum namens Polymyxin enthält B. Gram-negative und gram-positive Bakterien wurden zur Lyse verwendet. Es wurde geschlussfolgert, dass Detergens allein nicht zur Lyse geeignet ist, während Lösung B, eine Mischung aus chemischen Tensiden und biologischen Reagenzien, die Zellmembran auflösen und verschiedene Bakterienarten lysieren kann. Polymyxin B kann jedoch potenziell nur für gramnegative Bakterien in einer mikrofluidischen Zelllyseplattform verwendet werden.

Kimet al. [63] entwickelten außerdem ein mikrofluidisches Gerät mit zwei Ein- und Auslässen, um ein optimales Lysereagenz für gramnegative Bakterien zu entwickeln. Heo et al. [64] demonstrierten einen mikrofluidischen Bioreaktor, der in der Lage war, E coli durch die Verwendung von Hydrogel-Pflastern. Dann die Immobilisierten E coli wurde unter Verwendung von SDS lysiert, da es Hydrogel durchdringen kann. Die Zelllyse wurde innerhalb von 20 min erreicht. Dieses Gerät war zur Zelllyse nur unter Verwendung von SDS in der Lage, das vorherige konnte jedoch aufgrund der kürzeren Expositionszeit in einer chemischen Umgebung nicht. In einer anderen Studie haben Sethu et al. [65] entwickelten auch einen mikrofluidischen Chip ( Abbildung 10 ), um Erythrozyten zu lysieren, um Leukozyten zu isolieren. Innerhalb von 40 s war eine hundertprozentige Erholung möglich. Das Gerät besteht aus drei Einlassreservoirs und einem Auslassreservoir. Ein Einlass wurde verwendet, um das gesamte Blut durchfließen zu lassen. Ein zweiter Einlass wurde für Lysepuffer verwendet, der hauptsächlich Aluminiumoxid enthielt, und zwei Seitenkanäle wurden mit diesem Einlass verbunden, die zusammenliefen, um das gesamte Blut in einen schmalen Strom zu leiten. Dies erhöht den Oberflächenkontakt zwischen dem Lysepuffer und den Zellen. Die Mischung aus Zellen und Lysepuffer wurde dann durch einen langen Kanal mit einer Reihe von “U”-Umdrehungen laufen gelassen, um den Puffer zu verstärken. Schließlich wurde der dritte Einlass verwendet, um den Phosphatpuffer zu fließen, um die Probe zur Wiederherstellung der physiologischen Konzentration zu verdünnen [66,67].

Schema einer einfachen Kammer und eines serpentinenförmigen Mikrofluidikkanals für die chemische Lyse. Wiedergabe mit Genehmigung aus [65].

Obwohl ein chemisches Lyseverfahren in vielen Mikrofluidikvorrichtungen weit verbreitet ist, erfordert dieses Verfahren einen zusätzlichen zeitaufwendigen Schritt für die Reagenzienabgabe. Daher werden komplexe Mikrofluidikstrukturen einschließlich Injektionskanälen und Mikromischern zur Homogenisierung der Proben benötigt [66,68]. Nach der Lyse können diese Reagenzien den nachgeschalteten Assay stören, da es sehr schwierig ist, die Zielmoleküle zu trennen [69]. Außerdem ist die Lagerung dieser Reagenzien ein Problem, weshalb das Gerät nicht für längere Zeit verwendet werden kann.

4.4. Optische Lyse

Die optische Lyse von Zellen beinhaltet die Verwendung von Lasern und optisch induzierten Dielektrophorese-(ODEP)-Techniken, um die Zellmembran aufzubrechen. Bei der Laserlyse lysiert eine durch eine Kavitationsblase erzeugte Stoßwelle die Zellmembran. Ein fokussierter Laserpuls an der Grenzfläche der Zelllösung erzeugt diese Kavitationsblase. Bei ODEP werden eine leitfähige Elektrode und eine photoleitfähige Schicht (zum Beispiel amorphes Silizium) auf der oberen Oberfläche des Glasobjektträgers gebildet. Durch Bestrahlen der photoleitfähigen Schicht mit Licht wird ein ungleichmäßiges elektrisches Feld erzeugt, das dann über die Zellmembran ein Transmembranpotential erzeugt, das die Zellmembran aufbricht. Huanget al. [70] entwickelten einen optisch induzierten Mikrofluidik-Chip zur Zelllyse, um HEK293T-Zellen zu lysieren und intakten Zellkern zu extrahieren. Sie berichten über die Effizienz der Zelllyse und der Zellkerntrennung mit 78% bzw. 80% bei Verwendung dieses Geräts.

Kremeret al. [71] lysierten Zellen mit einem optoelektrischen Aufbau. Sie waren in der Lage, Zellen zu lysieren, die basierend auf der Form der Zelle ausgewählt wurden. Sie verwendeten ODEP, um rote Blutkörperchen in einer Mischung aus roten und weißen Blutkörperchen zu lysieren. Sie entwickelten eine Methode, die eine Formselektivität ermöglichte, sodass Zellen mit unterschiedlicher Geometrie in einer Mischung von Zelltypen lysiert werden. Die Zelle mit einer anderen Form induziert ein ungleichmäßiges elektrisches Feld, das zur Lyse verwendet wird. Abbildung 11 zeigt das Schema des Lyse-Chips und die Lyse unterschiedlich geformter Zellen.

Optisches Zelllysegerät: (ein) Zelllysechip mit optisch induzierter Dielektrophorese (ODEP) (BD) Zelllyse roter Blutkörperchen in einer Mischung aus weißen und roten Blutkörperchen und (eg) Lyse von roten Blutkörperchen in einer Mischung aus roten Blutkörperchen und Trypanosomen. Wiedergabe mit Genehmigung aus [71].

Die Verwendung von Laserlicht zum Induzieren von Lyse wurde auch in Mikrofluidikvorrichtungen versucht. In einem Fall wurde die optische Lyse durch die Anwendung eines Nanosekunden-Laserpulses von 532 nm induziert [72], der lokal ein Mikroplasma erzeugt. Der Plasmakollaps verursacht Kavitation, Blasenexpansion und deren Kollaps, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, sind der Hauptgrund für eine laserinduzierte Zelllyse. Verschiedene Arten von Zelllinien wie basophile Rattenleukämie (RBL) [73], Ratten-Känguru (Potorous tridactylis) epitheliale Nierenzellen (PtK2) [74] und murines Interleukin-3-abhängiges Pro-B (BAF-3) [75 ] wurden mit dieser laserinduzierten Methode lysiert. Alle diese Experimente wurden jedoch für die Einzelzellanalyse durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die Mikrokanaleffizienz der Lyse abnahm, wenn eine laserbasierte Lyse mit Polydimethylsiloxan (PDMS) eingebaut wurde [75]. Es wurde vermutet, dass dies auf die Verformung der PDMS-Wände zurückzuführen ist, die die mechanische Energie aus dem Blasenkollaps ableitet. Aus diesem Grund wurde viel Energie benötigt.

Zur Lyse der Zelle wurde eine ultraviolette (UV) Lichtanordnung in Kombination mit Titanoxid verwendet [76]. Titanoxid besitzt photolytische Eigenschaften und eine Anregungsenergie, die in den UV-Bereich fällt. Wenn Titanoxide mit UV-Licht-Array angeregt werden, werden Elektronen im Valenzband angeregt, um das Ionenband zu leiten, was zu Elektronen-&-Loch-Paaren führt. In wässriger Umgebung reagieren diese Elektron–Loch-Paare mit umgebenden Molekülen und erzeugen freie Radikale wie OH, O und O2 − . Diese reagieren mit der Zellmembran und lysieren die Zelle. E coli Zellen wurden mit der obigen Technik lysiert. Ein Hauptnachteil der Ultraviolett-Lyse bestand darin, dass die zur Lyse der Zelle benötigte Zeit sehr hoch war (45 min).

4.5. Akustische Lyse

Bei der akustischen Lyse wird eine hochenergetische Schallwelle erzeugt, die zur Zelllyse verwendet wird. Diese akustische Oberflächenwelle (SAW) wird auf einem piezoelektrischen Substrat erzeugt. Ein Interdigitaltransducer (IDT) kann verwendet werden, um eine SAW elektrisch zu erzeugen, wobei sich die Welle auf der Oberfläche weg von ihr ausbreitet. Talleret al. [77] haben On-Chip-Oberflächenwellen-Lyse zum Nachweis von exosomaler RNA für Pankreaskrebsstudien verwendet. Sie erreichten mit dieser Technik eine Lyserate von 38%. Abbildung 12 zeigt das hergestellte Gerät mit dem SAW-Wandler.

Mikrofluidisches Gerät zur Lyse mit akustischen Oberflächenwellen (SAW): (ein) Montage des Gerätes und (B,C) als fabriziertes Gerät mit Flüssigkeitseinlass und -auslass für die Exosomen-Lyse. Wiedergabe mit Genehmigung aus [77].

Sie berichten, dass die Lyse von Exosomen aufgrund der Auswirkungen der akustischen Strahlungskraft und der dielektrischen Kraft, die auf kleine Partikel einwirken, möglich ist [78,79]. Die SAW-Vorrichtung wurde unter Verwendung einer Standard-Photolithographie-Technologie hergestellt. Zwanzig Paare von Titan-Aluminium-Elektroden wurden auf einem piezoelektrischen Lithiumniobat-Substrat gemustert, um einen einphasigen, unidirektionalen SAW-Wandler zu bilden. Dieser Wandler kann SAW nur ​​in einer Richtung erzeugen. Das Rohmedium wurde SAW für 30 s bei 1 W Leistung zum Lysieren ausgesetzt. Die Autoren berichten, dass eine mit dieser Methode erreichte Lyseeffizienz von 38% ausreichte, um genügend Exosom-RNA für den Nachweis zu erhalten.

Marentiset al. [80] lysierten sowohl die eukaryontischen Zellen als auch Bakterien durch Beschallung. Dieses Gerät besteht aus einem mikrofluidischen Kanal mit integriertem Transducer. Der Kanal wurde auf einem Glassubstrat hergestellt und ein piezoelektrischer Wandler wurde durch Abscheiden von Zinkoxid und Gold auf einem Quarzsubstrat hergestellt. Die Wandler wurden von einer Sinusquelle im 360-MHz-Bereich angesteuert. Achtzigprozentige Lyse von HL-60 und 50% Lyse von Bacillus Subtilis-Sporen wurden unter Verwendung dieser Vorrichtung erhalten. Der Temperaturanstieg aufgrund der Beschallung wurde durch die Verwendung von Eisbeutel und Kühlfinger abgemildert. Ultraschallhornspitze und Flüssigkeitsbereich werden in einem mikrofluidischen Chip durch Erhöhung des Fluiddrucks gekoppelt, um die Effizienz der Lyse zu erhöhen [81].

Reboud et al. [82] haben einen mikrofluidischen Einwegchip zum Nachweis des Nagetier-Malaria-Parasiten Plasmodium berghei im Blut entwickelt. Sie verwendeten SAW, um die roten Blutkörperchen und parasitären Zellen in einem Blutstropfen zu lysieren. Sie berichten von einer Zelllyseeffizienz von mehr als 99,8 % mit ihrem Gerät. Xueyonget al. [83] haben ein mikrofluidisches SAW-Gerät hergestellt, das rote Blutkörperchen mit hoher Effizienz (95 %) lysieren kann.

Die Beschallung hat jedoch Einschränkungen, wie beispielsweise die Erzeugung von Wärme, einen komplexen Mechanismus sowie einen teuren Herstellungsprozess. Due to this excessive heat generation denaturation of protein and excessive diffusion of the cell contents have been observed [8,84]. To reduce the operation time, cells were first treated with some weak detergent such as digitonin [8,85] before ultrasonic exposure. Digitonin weakened the cell membrane and facilitated lysis.

4.6. Electrical Lysis

In electrical method, cells are lysed by exposing them to a strong electric field. An electric field is applied across the cell membrane which creates a transmembrane potential. A potential higher than the threshold potential is required to form pores in the cell membrane. If the value of the potential is lower than the threshold potential, the pores can be resealed by the cell. On the other hand, a high enough potential can completely disintegrate the cell. At such high voltages, it is found that the electric field does not have any effect on the intracellular components [86]. Electric field is the critical parameter to lyse the cell. As higher electric field is required for cell lysis, high voltage generator is required in order to generate this high electric field in macroscale. Thus, this method is not common in macroscale. However, in microscale due to small size of the devices, higher electric field can be obtained at lower voltage. For this reason and as a method for fast and reagentless procedure of lysis, electrical lysis has achieved substantial popularity in microfluidic community.

Ameri et al. [87] used a direct current (DC) source to lyse cells in a microfluidic chip. Figure 13 shows the fabrication and working principle of their chip. Their device consists of a glass slide coated with indium tin oxide coating patterned for electrodes. The 6400-Microwell arrays are fabricated using SU-8 polymer by photolithography technique. Inlet and outlet channels are created using PDMS polymer and is sealed using a glass slide with ITO electrode for impedance measurement. Red blood cells (10 7 cells/mL) are flown through the device at 20 μL/min and dielectrophoresis (DEP) is used to immobilize the cells into the microarray. A DC voltage of 2 V for 10 s was applied to the cell for lysis. The lysis process was monitored using impedance measurement before and after lysis and a decrease in impedance suggested a complete lysis of cells. They report a lysis efficiency of 87% in their device. The authors proposed a device for cell lysis by electric fields and optical free monitoring of the lysis process on a microfluidic platform which could have potential use in the medical diagnostic field.

Electrical cell lysis device: (ein) fabrication protocol of the device (B) working principle of the device and (C) microfluidic device used in the study for lysing red blood cells. Reproduced with permission from [87].

Jianget al. [88] developed a low cost microfluidic device for cell lysis using electric fields. They applied a 10 V square pulse to lyse cells at 50% efficiency. They report a device which had the capability to lyse cells at a much lower voltage compared to a commercially available electropolator device which operated at 1000 V to lyse 200 μL of PK15 cells. They observed bubble formation in their device during cell lysis due to joule heating effect. De Lange et al. [89] have lysed cells in droplets using electric fields. They demonstrated a robust new technique for detergent free cell lysis in droplets. In their device, electric field was applied to lyse bacteria immediately before merging the cell stream with lysozyme and encapsulating the mixture in droplets. They report that with lysozyme alone the lysis efficiency is poor (less than 50%) but when combined with electric fields they were able to obtain up to 90% cell lysis efficiency. Figure 14 shows their microfluidic device for cell lysis in droplets. The authors suggest that their device could be used in applications where use of cell lysis detergents could hinder the cell analysis such as binding assays or studying the chemical activity of proteins and in mass spectroscopy studies where chemical lysis agents can hamper the results.

Electrical cell lysis microfluidic device: (EIN) schematic of the electrical lysis and coflow droplet generation microfluidic chip (B) actual image of the droplet generation part and (C) complete electrical lysis with electroporation channels. Reproduced with permission from [89].

Escobedo et al. [90] showed electrical lysis of cells inside a microfluidic chip using a hand held corona device. They were able to lyse baby hamster kidney cells (BHK), enhanced green fluorescent protein human-CP cells (eGFP HCP) 116 and non-adherent K562 leukemia cells completely inside a microfluidic channel. A metal electrode was embedded inside the channel which was used to discharge 10 to 30 kV to lyse the cells in less than 300 ms. Lysis was assessed by observing before and after images of cells using bright field and high speed microscope and also by cell-viability fluorescence probes. They also report no bubble formation during lysis indicating no joule heating effect thereby making this method suitable for analyzing sensitive proteins and intracellular components. Figure 15 shows the setup and results of the study.

Electrical lysis through handheld plasma device: (ein) schematic of the device. Cells were lysed using a hand held corona device by applying electric field at the inlet of the device (B) bright field and fluorescent images of before and after of lysis of K562 cells. Reproduced with permission from [90].

Besant et al. [91] detected mRNA molecules of E coli by electrochemical lysis technique. They applied a potential of 20 V, which initiated the cell lysis by producing hydroxide ions from water at cathode to break down bacterial membranes. The sensor electrodes were placed 50 μm away which was enough to detect the mRNA molecules in 10 min. They reported lysis and detection of E coli mRNA at concentrations as low as 0.4 CFU/μL in 2 min which was relevant for clinical application in both sensitivity and time.

Gabardo et al. [92] developed a low cost and easy method to fabricate multi-scale 3D electrodes that could be used for bacterial lysis using a combination of electrical and electrochemical means. These micron-sized electrodes can be rapidly prototyped using craft cutting, polymer induced wrinkling and electro-deposition techniques. They report that these tunable electrodes performed better as compared to lithographically prepared electrodes. They were able to successfully extract nucleic acids extracted from lysed bacteria on a microfluidic platform. They reported 95% lysis efficiency at 4 V using their electrodes. Figure 16 shows the device and electrode structures.

Bacterial lysis device: (ein) schematic of the lysis device (B) scanning electron micrographs of: (ich) planar (ii) wrinkled and (iii) electrodeposited electrodes (C) cyclic voltammetry scan of the electrodes. Reproduced with permission from [92].

Liet al. [93] developed a double nano-electrode electrical cell lysis device to lyse single neuronal cells. Similarly, Wassermann et al. [94] showed cell specific lysis of up to 75% of the total human blood cells using SiO2 passivated electrical cell lysis electrodes at an applied voltage of 8� V. Ma et al. [95] reported a 10�-fold increase in mRNA extracted from M. smegmatis using electrical lysis in a microfluidic platform as compared to a commercial bead beading instrument. They used a 4000� V/cm field intensity to lyse the bacteria with long pulses (5 s). They report that their device can be effective for mRNA release from hard to lyse cells.

Islam et al. [96] showed the proof of concept of a simple microfluidic device for electrical lysis of larger volumes of sample. They used a nanoporous membrane sandwiched between two microfluidic channels to trap and lyse E coli bacteria by applying 300 V. They report a lysis efficiency of 90% in less than 3 min. Figure 17 shows the schematic of the device used for lysis in their study.

Electrical cell lysis microfluidic device: (ein) schematic of cell lysis device and (B) experimental setup. Reproduced with permission from [96].

Different types of voltages such as alternating current (AC) [97,98], DC pulses [99,100,101] and continuous DC voltages [102] have been used in order to lyse the cells. Along with electric field, exposure time of cells within that electric field is also an important parameter for cell lysis. It has been found that cells can be lysed by using higher electric field for short period of time as well as lower electric field for long period of time [103]. For that reason, AC and DC pulses of a higher electric field are needed as compared to a continuous DC electric field. As the electric field depends on the distance between the electrodes, microfabricated electrodes have been used during AC or DC pulses. An overview of different electrical lysis devices and the characteristics of the designed system is presented in Table 4 .

Tabelle 4

Different electrical lysis devices used for cell lysis.

ReferenzSpeziesType of CellCell Size (μm)ElectrodeType of Voltage (AC/DC)Lysing Voltage (V)
[104]MenschlichHT-2910GoldAC8.5
[97]MenschlichA43110GoldAC20
[98]-FITC-BSA laden vesicle50ITOAC5
[99]-Leukozyten-3DDC pulse10
[100]Menschlichrote Blutkörperchen6𠄸Pt wireDC/AC30�
[105]BakterienE coli-GoldDC pulse50
[106]HamsterCHO10�Pt wireDC pulse1200
[106]BakterienE coli Pt wireDC930
[102]Menschlichrote Blutkörperchen6𠄸Pt wireDC50
[87]Menschlichrote Blutkörperchen6𠄸ITODC2
[96]BakterienE coli-Pt wireDC300

Lu et al. [104] developed a microfluidic electroporation platform in order to lyse human HT-29 cell. Microfabricated saw-tooth electrode array was used in order to intensify the electric field periodically along the channel. Seventy-four-percent efficiency was obtained for an operational voltage of 8.5 V. However, this mode of lysis is not suitable for bacteria due their sizes and shapes. Compared to mammalian cell, high electric field and longer exposure is needed to lyse bacteria. Rosa [105] developed a chip to lyse bacteria consisting of an array of circular gold electrodes. DC pulses were used and lysis with 17% efficiency was achieved by using an operational voltage 300 V. This efficiency was increased up to 80% after adding enzyme with cell solution. In 2006, Wang et al. [107] proposed application of continuous DC voltage along the channel for cell lysis. The device consists of a single channel with uniform depth and variable width. Since the electric field is inversely proportional to width of the channel, high electric field can be obtained at the narrow section of the channel. Thus, lysis occurs into a predetermined portion of the device. Exposure time of the cell to the electric field can be tuned by changing the length of this narrow section. The configuration of the device was optimized and lysis of complete E coli bacteria was possible at 930 V. Complete disintegration of cell membrane was observed when the electric field was higher than 1500 V/cm. This device was very simple and did not need any microfabricated electrodes. Pt wires were used as electrodes. Only a power generator was needed to operate it. However, bubble generation and Joule heating issue could not be completely eliminated. Similar kind of device was used by Lee [102] where the length and width of the narrow section was modified in order to lyse mammalian cell. Bao et al. [108] also developed a device to lyse E coli by using DC pulses. Release of intracellular materials was observed when the electric field was higher than 1000 V/cm.

In conclusion, electrical method offers a simple, fast and reagent less lysis procedure to lyse various kinds of cells. This method is also suitable for selective lysis and is compatible with other downstream assays such as amplification and separation. Although requirement of high voltage is a problem in this procedure, it can be overcome by decreasing the gap between electrodes through microfabrication. However, heat generation and formation of bubble is a major problem for electric lysis method.

4.7. Comparison of Different Microfluidic Technologies for Cell Lysis

Various microfluidic technologies for cell lysis are compared in Table 5 . The advantages and disadvantages of different methods are listed for each technique.

Table 5

Comparison of different microfluidic lysis methods. Cell lysis efficiency was determined by averaging the lysis efficiencies from the references cited. Low: 0%�% Medium: 50%�% High: 80%�%.


Over the past decade significant progress has been found in the upstream production processes, shifting the main bottlenecks in current manufacturing platforms for biopharmaceuticals towards the downstream processing. Challenges in the purification process include reducing the production costs, developing robust and efficient purification processes as well as integrating both upstream and downstream processes. Microfluidic technologies have recently emerged as effective tools for expediting bioprocess design in a cost-effective manner, since a large number of variables can be evaluated in a small time frame, using reduced volumes and manpower. Their modularity also allows to integrate different unit operations into a single chip, and consequently to evaluate the effect of each stage on the overall process efficiency.

This paper describes the development of a diffusion-based microfluidic device for the rapid screening of continuous chemical lysis conditions. The release of a recombinant green fluorescent protein (GFP) expressed in Escherichia coli (E. coli) was used as model system due to the simple evaluation of cell growth and product concentration by fluorescence. The concept can be further applied to any biopharmaceutical production platform. The microfluidic device was successfully used to test the lytic effect of both enzymatic and chemical lysis solutions, with lysis efficiency of about 60% and close to 100%, respectively, achieved. The microfluidic technology also demonstrated the ability to detect potential process issues, such as the increased viscosity related with the rapid release of genomic material, that can arise for specific lysis conditions and hinder the performance of a bioprocess. Finally, given the continuous operation of the lysis chip, the microfluidic technology has the potential to be integrated with other microfluidic modules in order to model a fully continuous biomanufacturing process on a chip.


How to Make a Cell Lysis Solution

The precise components and procedure required for making a cell lysis solution depends on several factors, including the type of cells and the objective of the experiment. This BiologyWise article explains how to make cell lysis solution with respect to the major ingredients, and how they vary with different experimental setups.

The precise components and procedure required for making a cell lysis solution depends on several factors, including the type of cells and the objective of the experiment. This BiologyWise article explains how to make cell lysis solution with respect to the major ingredients, and how they vary with different experimental setups.

Sodium dodecyl sulfate (SDS), the most commonly used detergent for cell lysis and protein denaturation, is also widely used in several soaps, shampoos, laundry detergents, and toothpastes.

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A cell lysis solution is a detergent-based buffer solution used to break open the desired cells and further isolate a particular cellular component of interest. It is also referred to as a cell lysis buffer or simply, lysis buffer. This process of lysing cells using chemical agents is termed as chemical disruption.

Apart from detergent and buffering agents, additional agents are added that aid the lysing process, eliminate unwanted cellular components, and/or protect the desired cellular component. These additions depend on the cell type involved, the cellular component to be studied, and the precise techniques that need to be performed on the lysate.

Given below is the basic procedure to prepare a cell lysis solution, followed by a description of the components required to prepare the solutions, and their variations with respect to the commonly followed protocols for different experiments.

Procedure to Make a Cell Lysis Solution

Given below is the procedure to prepare a lysis solution containing 10mM Tris-HCl buffer, 1mM EDTA as the chelating agent, and 0.5% SDS as the detergent.

Dissolve 121 g Tris-HCL (molecular weight = 157.60 g) in 800 ml distilled water, adjust the pH to 8 using HCl solution, and make up the volume to 1 L using distilled water.

Step 2: Preparation of 500 ml of 0.5 M EDTA stock solution

Dissolve 93.0 g of EDTA [EDTA.Na2.2H2O] (molecular weight = 372.24 g)] in 400 ml of distilled water, add 10 g (approx.) NaOH pellet to adjust pH to 8, and make up the volume to 500 ml using distilled water.

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Step 3: Preparation of 10% SDS stock solution

Dissolve 10 g of SDS in 90 ml distilled water, and make up the volume to 100 ml using distilled water.

Step 4: Preparation of 500 ml of the Tris-EDTA SDS lysis buffer

Choosing the Reagents for a Cell Lysis Buffer

All cell lysis solutions are prepared using a suitable buffer solution, so as to maintain the appropriate pH. Disruption of the cells will disturb the internal pH of the cell, which alters the structural integrity of proteins and other macromolecules. In order to avoid this, generally a buffer solution adjusted at a pH equal to the normal intracellular pH is used.

A buffer solution comprises a weak base and its conjugate acid, or a weak acid and its conjugate base. Each buffering agent can work as an effective buffer only within a specific pH range called the buffer range. The choice of buffering agent depends on this buffer range. Generally, the buffers are used at a concentration of 10 – 50 mM and are adjusted to pH 7.4 – 8.

The two commonly used buffers for making cell lysis solutions, and their buffer range are as follows:

Cell membranes are made up of phospholipid layers which are held together through polar interactions. A detergent serves as an emulsifier and disrupts these polar interactions. It also forms complexes with the lipid molecules and protein molecules embedded in the membrane, and precipitates them out of the solution.

Detergents can be grouped as ionic or non-ionic, depending on the nature of the hydrophilic group, or as mild or strong depending on their ability to solubilize membranes and proteins. Ionic detergents with positively charged groups are termed cationic detergents, and those with negatively charged groups are termed anionic detergents.

Mild detergents are used when cells need to be lysed for purifying and/or studying cellular proteins, so as to avoid denaturation of the desired proteins. On the other hand, strong detergents that denature cellular proteins are used while lysing cells for DNA isolation.

Given below are some of the commonly used detergents, their application as cell lysing agents, and usual concentrations in which they are used for cell lysis.

1) SDS (sodium dodecyl sulfate) [anionic]

General use: DNA isolation from any cell type, protein isolation under denaturing conditions
Concentration: 1 – 10 %

2) Sodium Deoxycholate [anionic]

General use: Purification of membrane proteins
Concentration: 0.5 %

3) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) [cationic]

1) NP-40 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)

General use: Nuclei isolation
Concentration: 0.1 – 1.0 %

2) Triton X-100

General use: Purification of membrane proteins, DNA isolation
Concentration: 0.1 – 5.0 %

3) Polysorbate 20

General use: Purification of membrane proteins, immunoprecipitation
Concentration: 0.05 – 0.5 %

Role: The chelating agent is a chemical that sequesters divalent cations, like Mg ++ , and Ca ++ , which are required for membrane stability. Due to such chelation, these cations are no longer associated with the membrane, thereby, weakening it. Moreover, the lysing of membrane results in exposing the nucleic acids to nucleases, which are otherwise sequestered inside the lysosomes. These nucleases are inactive in the absence of divalent ions. Thus, chelating agents protect the DNA and RNA molecules from degradation by these nucleases.

Osmotic Stabilizers: Glucose, sucrose, sorbitol, and glycerol may be added for osmotic stability, and preventing the cellular components from osmotic shock that may occur during the sudden rupturing of cell membrane. In addition, they also help stabilize lysosomal membranes, thereby, reducing the release of degradative enzymes from the lysosomal lumen.

Salts: Disruption of cells and the release of cellular components into the medium, may alter the ionic strength of the medium. In order to deal with this and maintain ionic strength, salts, like sodium chloride [NaCl], potassium chloride [KCl], and ammonium sulfate [(NH4)2SO4] may be added.

Enzymes: Depending on the target macromolecules to be isolated from cells, lytic enzymes may be added to either protect them from the action of other enzymes, or degrade the remaining macromolecules that may contaminate the lysate.

Cell lysis solutions are used for the chemical disruption of cells, and may also be used in a combination with other methods, like homogenization, sonication, grinding, freeze-thaw techniques, etc. This is especially useful for lysis of fungal cells and plant cells, since they have strong cell walls around the cell membranes.

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Lysis and Extraction Systems

An array of reagents and accessories for extraction of proteins from biological samples. Depending on applications and biological sample type, researchers are offered the options to choose from one or more of the following lysis and protein extraction systems. These protein extraction systems also offer researcher the option to select buffering agents either amine based, non-amine or phosphate buffering agents. These lysis systems are designed to cover the most extensive range of applications in protein research.

The Protein Extraction and Lysis Buffer systems (PE LB&trade series) utilize a mild detergent, ensuring efficient protein recovery while maintaining the biological activity of the proteins. The solubilized proteins are suitable for enzyme assays, electrophoresis, ELISA, Western blot, folding studies, chromatographic studies, and many other downstream applications. The PE LB&trade systems offer a wide selection of lysis buffers for extraction of proteins from bacteria, insects, mammalian cell cultures, mammalian tissues, and yeast.

PopLysis&trade protein extraction systems utilize a cocktail of membrane solubilizing detergents and are optimized to rapidly solubilize and &ldquopop open&rdquo membrane structures, allowing cellular proteins to spill out into lysis solution. The cellular proteins are stable in PopLysis&trade buffer and suitable for downstream applications such as enzyme assays, chromatography studies, ELISA, Western blot, protein folding studies, and gel electrophoresis. These systems are also suitable for high throughput applications such as screening recombinant proteins. PopLysis&trade buffers contain amine-free buffering agents making them suitable for applications that require proteins in amine free buffers. PopLysis&trade buffer systems are optimized kits for lysis and extraction of proteins from bacteria, yeast, neurons, mammalian cells, mammalian tissue, and insect cells.

FOCUS&trade Proteome Kits are optimized for the preparation of total protein for downstream screening and protein discovery. These kits have been optimized for the isolation of several protein types including soluble, insoluble, membrane, cytoplasmic, nuclear, signal, phosphoproteins and glycoproteins. These kits are simple to use, save time, improve the quality of protein analysis and improve the likelihood of novel protein discovery. FOCUS&trade Proteome Kits are suitable for the analysis of proteins using 1D and 2D electrophoresis, mass-spectrometry, and other sensitive biochemical techniques. Each kit is specifically designed for protein isolation from either mammalian cells, mammalian tissues, bacteria, insects, plants, yeast, and other biological samples.

Other lysis buffer offerings include the extensively cited RIPA lysis buffer, and a modified mild version Mild-RIPA lysis and extraction buffer that does not contain SDS detergent. Inclusion bodies solubilization buffers, IBS&trade and HP- IBS&trade Buffers. A kit for Total Protein Extraction (TPE&trade) for the extraction of total proteins from cells and tissues for electrophoresis and other applications. RBC lysis buffer specifically designed for lysis of red blood cells.

Accessories are also offered to assist with protein extraction and isolation procedures which include our EZ Grind&trade and Molecular Grinding Resin&trade, sample grinding tools, they are available either as single use tubes with matching pestles or just grinding resin with or without matching tubes and pestles. We also offer ProteaseArrest&trade, a complete range of protease Inhibitor cocktail solutions. PhosphataseArrest, for phosphatase sensitive protein extraction applications. Metal chelators (EDTA & EGTA), reducing agents, various salts (both monovalent and divalent), lytic enzymes, denaturing agents, proteomic detergents, and other additives for protein research.


Schlussfolgerungen

It is widely acknowledged that bias exists in 16S rRNA studies describing microbiota profiles and that no currently available method is able to perfectly describe the community being analysed [10]. However, an understanding of how the choice of laboratory methods affects the results of such studies is important in order to accurately interpret the results and make valid comparisons between different studies. Although we were able to identify significant differences in DNA yield and diversity between the different methods used in this study, the effects of this were much smaller than those due to the sample and did not alter the grouping of extracts by hierarchical clustering and principal coordinate analysis. However, since there was an observable effect of lysis method on microbiota composition, we recommend that the same method is used within a study to reduce the risk of introducing a differential bias. Furthermore, comparisons between studies using different lysis methods should be made with care, but will likely be of much smaller magnitude than differences caused by the choice of extraction kit and 16S rRNA primers [12]. Additionally, studies with a focus on the abundance of a particular bacterial species should include additional techniques such as qPCR to confidently identify any differences between groups.


Schau das Video: RNA Extraction Tutorial (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Malanos

    Ich weiß nicht

  2. Stod

    Sie erlauben den Fehler. Geben Sie ein, wir werden darüber diskutieren.



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