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12.2H: Fluoreszierende Antikörper - Biologie

12.2H: Fluoreszierende Antikörper - Biologie


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Fluoreszierende Antikörper sind Antikörper, die mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert wurden, um ihren Nachweis im Labor zu erleichtern.

Lernziele

  • Beschreiben Sie, wie fluoreszierende Antikörper-Konjugate in Immunoassays zum Proteinnachweis verwendet werden können

Wichtige Punkte

  • Die Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern wird anstelle von Radioisotopen und Enzymen verwendet, um die Sensitivität und Spezifität immunologischer Tests zu erhöhen.
  • Fluoreszierende Antikörper können verwendet werden, um Proteine ​​aus Patientenserum oder Gewebeschnitten, die auf einem Objektträger fixiert sind, oder lebenden Zellen in Suspension zu färben.
  • Fluoreszierende Antikörper können mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fließzellensorter nachgewiesen werden.

Schlüsselbegriffe

  • Radioisotop: Ein radioaktives Isotop eines Elements.

Die Fluoreszenzmarkierung ist eine weitere Methode, um die Komplexität von Antigenen und Antikörpern zu demonstrieren. Fluoreszierende Moleküle werden als Ersatz für Radioisotopen- oder Enzymmarkierungen verwendet. Die Fluoreszenz-Antikörper-Technik besteht darin, Antikörper mit Farbstoffen wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) zu markieren. Diese Verbindungen haben eine hohe Affinität zu Proteinen, mit denen sie konjugieren.

Fluoreszenztechniken sind sehr spezifisch und empfindlich, daher erfordern Techniken auf der Grundlage von Fluoreszenzantikörpern ein Fluoreszenzmikroskop. Eine fluoreszierende Substanz absorbiert Licht einer Wellenlänge und emittiert Licht einer längeren Wellenlänge. Fluorescein fluoresziert eine intensive apfelgrüne Farbe, wenn es unter Fluoreszenzmikroskopie angeregt wird. Die chemische Manipulation bei der Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen, um den Nachweis durch direkte mikroskopische Untersuchung zu ermöglichen, beeinträchtigt die Antikörperaktivität nicht.

Nach der Markierung eines spezifischen Antikörpers mit einem fluoreszierenden Molekül kann dieser noch mit seinem Antigen umgesetzt und mikroskopisch identifiziert werden. Fluoreszierende Antikörper-Konjugate werden üblicherweise in Immunoassays verwendet. Zu den grundlegenden Verfahren, die fluoreszierende Antikörper verwenden, gehören der direkte, der Inhibitions- und der indirekte Immunfluoreszenz-Assay.

Bei der direkten Technik wird ein fluoreszierender Antikörper verwendet, um Antigen-Antikörper-Reaktionen auf mikroskopischer Ebene nachzuweisen. Der Inhibitions-Immunfluoreszenz-Assay ist ein Blockierungstest, bei dem ein Antigen zuerst einem unmarkierten Antikörper ausgesetzt wird, dann einem fluoreszierenden Antikörper und schließlich gewaschen und untersucht wird. Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay basiert auf der Fähigkeit von Antikörpern, sowohl mit Antigenen zu reagieren als auch als Antigene zu wirken und mit Anti-Antikörpern (Anti-Immunglobulin) zu reagieren. Diese Technik wird in großem Umfang zum Nachweis von Autoantikörpern und Antikörpern gegen Gewebe- und Zellantigene verwendet. Die beschriebenen Methoden werden meist auf Objektträgern mit Patientenserum oder Gewebeschnitten durchgeführt. Immunfluoreszenz kann auch durchgeführt werden, um spezifische Antigene auf lebenden Zellen in Suspension zu identifizieren. Dieses Verfahren ist als Durchflusszytometrie bekannt und erfordert eher einen Durchflusszellensortierer als ein Fluoreszenzmikroskop.


Tipps zur Optimierung von Immunfluoreszenzprotokollen um das beste Bild zu erhalten

Zu den Anwendungen für Immunfluoreszenz (IF) – bei der ein Antikörper an ein Molekül konjugiert wird, das bei Anregung durch Laser fluoresziert – gehören die Proteinlokalisierung, die Bestätigung der posttranslationalen Modifikation oder Aktivierung und die Nähe zu/Komplexierung mit anderen Proteinen. Immunzytochemie (ICC) ist eine etablierte Technik, die Antikörper verwendet, um an Ziele in Zellproben zu binden, und Coons et al beschrieben erstmals 1942 die Immundetektion mit einem fluoreszierenden Reportermolekül. Neben der Bereitstellung von Informationen über subzelluläre Ziele liefert die Kombination von Immunfluoreszenz mit Immunzytochemie einige der überzeugendsten visuellen Daten in den Biowissenschaften. In diesem Leitfaden teilen Antikörperwissenschaftler, was wir über das bestmögliche Bild aus Ihren IF-ICC-Experimenten gelernt haben.

Abbildung 1. Immunzytochemie (ICC) lokalisiert Proteine, die mit neuronalen Kernen, Soma und Axonen assoziiert sind (links). Rechts, Immunfluoreszenzfärbung der humanen Zelllinie U-251 MG.


Enzymtranslokationen während der Aktivierung der glatten Muskulatur

Raouf A. Khalil, Kathleen G. Morgan, in Biochemie der glatten Muskelkontraktion, 1996

1 Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Zellen

Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Untersuchung der subzellulären Verteilung von Enzymen in intakten Zellen. Es stehen relativ wenige Sonden zur Verfügung, um die Verteilung von Kinasen in lebenden Zellen direkt zu überwachen. Ein Beispiel ist das fluoreszierende Phorbolester-Derivat Bodipy phorbol, das verwendet wurde, um PKC-Verteilungen in lebenden Zellen zu verfolgen (Khalil und Morgan, 1991). Diese Verbindung ist membrandurchlässig, hat jedoch den Nachteil, dass sie die PKC-Agonistenaktivität beibehält. Eine Gruppe von Verbindungen, die den gegenteiligen Nachteil zeigt, d. h. die Beibehaltung der PKC-Antagonistenaktivität, ist verfügbar geworden (Chen und Poenie, 1993). Die Verwendung eines ratiometrischen Indikators zur Überwachung der cAMP-abhängigen Proteinkinase-Verteilung und -Aktivität in lebenden Zellen wurde beschrieben ( Bacskai et al, 1993), aber zu diesem Zeitpunkt wurde über seine Verwendung in glatter Muskulatur nicht berichtet. Ein anderer verwandter Ansatz besteht darin, markierte Antikörper in permeabilisierte physiologisch intakte Zellen einzuführen (Iizuka et al, 1994). Die Schwierigkeit dieses Ansatzes ist das Problem, ob unspezifische Bindungsstellen in der intakten Zelle "blockiert" werden können.


INSTRUMENTIERUNG

Traditionelle Durchflusszytometer

Herkömmliche Durchflusszytometer bestehen aus drei Systemen: Fluidik, Optik und Elektronik. Das Fluidiksystem besteht aus Hüllenflüssigkeit (normalerweise eine gepufferte Kochsalzlösung), die unter Druck gesetzt wird, um die Probe an den Laserintercept- oder Abfragepunkt zu liefern und zu fokussieren, an dem die Probe analysiert wird. Das optische System besteht aus Anregungsoptiken (Lasern) und Sammeloptiken (Photomultiplier-Röhren oder PMTs und Photodioden), die die sichtbaren und fluoreszierenden Lichtsignale erzeugen, die zur Analyse der Probe verwendet werden. Eine Reihe dichroitischer Filter lenkt das Fluoreszenzlicht zu bestimmten Detektoren und Bandpassfilter bestimmen die Wellenlängen des ausgelesenen Lichts, damit jedes einzelne Fluorochrom erkannt und gemessen werden kann. Genauer gesagt sind dichroitische Filter Filter, die Licht mit entweder kürzerer oder längerer Wellenlänge durchlassen und das verbleibende Licht in einem Winkel reflektieren. Zum Beispiel lässt ein 450 dichroitischer Langpassfilter (DLP) Licht mit einer längeren Wellenlänge als 450 nm durch den Filter und prallt die kürzeren Wellenlängen des Lichts in einem Winkel ab, um an einen anderen Detektor gesendet zu werden. Bandpassfilter erkennen ein kleines Fenster einer bestimmten Lichtwellenlänge. Ein 450/50-Bandpassfilter lässt beispielsweise Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge von 450 nm +/− 25 nm durch den Filter, um vom Detektor gelesen zu werden. Das elektronische System wandelt die Signale der Detektoren in digitale Signale um, die von einem Computer gelesen werden können.

Mehrfachlasersysteme sind bei Instrumenten üblich, die oft 20 Parameter haben (FSC, SSC und 18 Fluoreszenzdetektoren). Es werden neue Instrumentenplattformen mit fünf oder mehr Lasern und 30� Parametern eingeführt, diese sind jedoch weniger verbreitet. Die am häufigsten in herkömmlichen Durchflusszytometern verwendeten Laser sind 488 nm (blau), 405 nm (violett), 532 nm (grün), 552 nm (grün), 561 nm (grün-gelb), 640 nm (rot) und 355 nm (ultraviolett). . Für spezielle Anwendungen stehen zusätzliche Laserwellenlängen zur Verfügung. Darüber hinaus gibt es Instrumente, die PMTs durch Avalanche-Photodioden (APD) für die Fluoreszenzdetektion ersetzt haben, um die Empfindlichkeit zu erhöhen.

Akustische Fokussierungszytometer

Dieses Zytometer verwendet Ultraschallwellen, um Zellen für die Laserabfrage besser zu fokussieren. Diese Art der akustischen Fokussierung ermöglicht einen höheren Probeneingang und weniger Verstopfung der Probe. Dieses Zytometer kann bis zu 4 Laser und 14 Fluoreszenzkanäle verwenden.

Zellsortierer

Ein spezifischer Typ eines traditionellen Durchflusszytometers ist der Zellsortierer, der Proben für die weitere Analyse reinigen und sammeln kann. Ein Zellsortierer ermöglicht es dem Benutzer, eine Population von Zellen oder Partikeln auszuwählen, die positiv (oder negativ) für die gewünschten Parameter ist, und dann diese Zellen in ein Sammelgefäß zu leiten. Der Zellsortierer trennt Zellen, indem er den Probenflüssigkeitsstrom mit hoher Frequenz in Schwingung versetzt, um Tropfen zu erzeugen. Die Tropfen werden dann entweder positiv oder negativ geladen und durch metallische Ablenkplatten geleitet, wo sie entsprechend ihrer Ladung in ein spezielles Sammelgefäß geleitet werden. Die Sammelgefäße können Röhrchen, Objektträger oder Platten sein (96-Well oder 384-Well sind üblich).

Es gibt zwei Arten von Zellsortierern, Quarzküvetten und “jet-in-air”, die sich darin unterscheiden, wo sich der Laserabfragepunkt befindet. Die Quarzküvetten-Zellsorter haben eine feste Laserausrichtung und sind einfacher für eine Sortierung vorzubereiten. Bei den “jet in air” Zellsortierern müssen die Laser täglich ausgerichtet werden und sind schwieriger einzurichten, aber für die Erkennung kleiner Partikel anpassungsfähiger.

Bildgebende Zytometer

Bildgebende Durchflusszytometer (IFC) kombinieren traditionelle Durchflusszytometrie mit Fluoreszenzmikroskopie. Dies ermöglicht eine schnelle Analyse einer Probe auf Morphologie und Multiparameter-Fluoreszenz sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene (Barteneva, Fasler-Kan, & Vorobjev, 2012). IFC kann Proteinverteilungen innerhalb einzelner Zellen wie ein Konfokal- oder Fluoreszenzmikroskop verfolgen, aber auch eine große Anzahl von Zellen wie ein Durchflusszytometer verarbeiten. Sie sind besonders nützlich bei zahlreichen Anwendungen wie Zellsignalisierung, Co-Lokalisierungsstudien, Zell-Zell-Interaktionen, DNA-Schädigung und -Reparatur und jeder Anwendung, die in der Lage sein muss, die zelluläre Lokalisierung mit der Fluoreszenzexpression in großen Zellpopulationen zu koordinieren.

Massenzytometer

Massenzytometer kombinieren Flugzeit-Massenspektrometrie und Durchflusszytometrie. Zellen werden mit Schwermetallionen-markierten Antikörpern (normalerweise aus der Lanthanoid-Reihe) anstelle von fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels Flugzeit-Massenspektrometrie nachgewiesen. Massenzytometer haben keine FSC- oder SSC-Lichtdetektion, die das herkömmliche Verfahren zum Detektieren von Zellaggregaten nicht ermöglicht. Zu diesem Zweck können jedoch auch andere Methoden wie das Cell Barcoding eingesetzt werden (Leipold, Newell, & Maecker, 2015). Außerdem weist die Massenzytometrie keine zellulären Autofluoreszenzsignale auf und Reagenzien weisen nicht die mit Fluoreszenzmarkierungen verbundene spektrale Emissionsüberlappung auf, so dass keine Kompensation erforderlich ist. Die Probe wird jedoch während der Analyse zerstört, sodass eine Zellsortierung nicht möglich ist und die Erfassungsrate viel niedriger ist als bei einem Standard-Durchflusszytometer (1000 Zellen/Sekunde statt 10.000 Zellen/Sekunde). Derzeit gibt es kommerziell erhältliche Reagenzien für 40 Kanäle, aber diese Zahl wird mit der Einführung anderer Metallionen wie Platin zur Konjugation an Antikörper zunehmen (Mei, Leipold, & Maecker, 2016).

Zytometer für die Bead-Array-Analyse

Multiplex-Bead-Arrays sind populär geworden, um große Mengen von Analyten in kleinen Probenvolumina zu analysieren. Kurz gesagt verwenden diese Assays Einfangkügelchen mit einer bekannten Fluoreszenzmenge in einem spezifischen Kanal und ein Reportermolekül, das durch einen separaten Laser nachgewiesen wird, um die Menge des eingefangenen Analyten, die mit dem spezifischen Kügelchen assoziiert ist, zu quantifizieren. Es entspricht im Wesentlichen 100 ELISA-Tests.

Zur Analyse dieser Assays wurden kleine Durchflusszytometer mit normalerweise 2 Lasern und 96-Well-Loadern entwickelt. Diese Instrumente haben eine kleine Grundfläche und ein optisches Bankdesign, das optimiert ist, um Kügelchen mit unterschiedlichen Fluoreszenzmengen entlang zweier Kanäle zu erkennen und zu unterscheiden. Es wurden Instrumente entwickelt, die 100� verschiedene Perlenkombinationen erkennen können.

Spektralanalysatoren

Eine der Herausforderungen der Multiparameter-Durchflusszytometrie ist die Kompensation (oder das Löschen der spektralen Überlappung) zwischen Fluorochromen. Der Spektralanalysator, ein neuartiger Durchflusszytometer, wurde speziell für dieses Problem entwickelt. Ein Spektralanalysator misst die gesamten Fluoreszenzemissionsspektren für jedes Fluorochrom in einer mehrfarbigen Probe, um einen spektralen Fingerabdruck zu erstellen. Dann wird während der Analyse jedes Spektrum entmischt, um ein reines Signal für jedes Fluorochrom zu liefern (Sony, 2017). Die Spektralanalyse beginnt, traditionelle PMTs als Nachweisverfahren für die hochdimensionale Durchflusszytometrie zu ersetzen.

Neue Detektortechnologien

Photomultiplier-Röhrchen (PMTs) bleiben die Standard-Detektortechnologie für die Durchflusszytometrie. Ihre hohe Empfindlichkeit und ihr niedriger Hintergrund machen sie für die Fluoreszenztechnologie nützlich. In einigen Zytometern tauchen jedoch allmählich Festkörperdetektoren auf. Avalanche-Photodioden (APDs) sind kostengünstig, empfindlich und hochlinear und reagieren im langen roten Bereich spektral stärker. Silizium-Photodioden (SiPDs) sind auch eine vielversprechende Option für Festkörperdetektoren.


Fluoreszenz

2005 erwarb Active Motif die Chromeon GmbH, ein deutsches Unternehmen, das 2001 von Professor Otto Wolfbeis gegründet wurde, einem weltweit führenden Unternehmen für fluoreszierende Biosensoren. Die Chromeon GmbH hatte frühzeitig den Bedarf erkannt, verbesserte fluoreszenzbasierte biologische Assays zu entwickeln.

Durch die Kombination der Assay-Entwicklung von Active Motif mit der Fluoreszenzchemie von Chromeon streben wir die Entwicklung innovativer zell- und molekularbiologischer Assays an, die die proprietären Fluoreszenzfarbstoffe und -substrate der Chromeon GmbH beinhalten. Die Active Motif Chromeo-Farbstoffe bieten Empfindlichkeit und Flexibilität und weisen hervorragende Lumineszenzeigenschaften auf, einschließlich eines breiten Spektrums an Fluoreszenzanregung und -emission, großer Stokes-Verschiebungen, begrenzter Photobleichung und einer breiten pH-Toleranz.

Fluoreszenzmikroskopie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (Immunfluoreszenz oder IF) wird häufig verwendet, um spezifische Proteine ​​in ihrer zellulären Umgebung nachzuweisen und Fragen zu ihrer Lokalisierung, Modifikation, Wechselwirkungen und ihrem Lebenszyklus zu beantworten. Bis vor kurzem war der Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie in der zellbiologischen Forschung jedoch durch die Auflösung begrenzt, die in bildgebenden Experimenten erreicht werden kann.

Die Auflösung der Bilder ist auf die Größe des Flecks beschränkt, auf den der Anregungsstrahl des Mikroskops fokussiert werden kann. Dies ist abhängig von der Wellenlänge des emittierten Lichts und den Parametern des Instruments. Die höchste erreichbare Auflösung wird durch das Abbesche Gesetz definiert:

Abbildung 1: Das Abbesche Gesetz beschreibt die in der Mikroskopie erreichbare Auflösung.

x = Ortsauflösung Lambda = Wellenlänge des angeregten Lichts
2n sin &alpha = Numerische Apertur des Mikroskops

Die Abbe-Grenze schränkt die Fähigkeit des Beobachters ein, Objekte, die weniger als voneinander entfernt sind, visuell aufzulösen

200 nm. Dies macht es unmöglich, kleinere Bakterien, Viren, Ribosomen oder Proteincluster fluoreszenzmikroskopisch zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden jedoch mehrere neuartige Technologien entwickelt, die diese Einschränkung überwinden.

Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie (auch bekannt als hochauflösende Mikroskopie) beschreibt eine Gruppe von Techniken, die die Beugungsbarriere „durchbrechen&rdquo, wodurch eine Auflösung von nur 20-30 nm ermöglicht wird. Diese Techniken nutzen spezielle Physik- und Instrumenteneinstellungen sowie die Eigenschaften hochwertiger Fluoreszenzfarbstoffe, um die Auflösung dramatisch zu verbessern. Obwohl diese Techniken in zwei verschiedene Ansätze unterteilt werden können, haben sie eine gemeinsame Grundlage: die Fähigkeit, fluoreszierende Moleküle bei Bedarf auszuschalten.

Abbildung 2: Primärantikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper von Active Motif in der konfokalen und STED-Mikroskopie.

HeLa-Zellen wurden mit alpha-Tubulin-Maus-mAb (Klon 5-B-1-2) und ATTO 647N (STED/GSD) Ziegen-Anti-Maus-IgG (Katalog-Nr. 15038) gefärbt. Histon H3 wurde mit dem polyklonalen Histon H3-Trimethyl-Lys4-Kaninchen-Antikörper (Katalog-Nr. 39159) und dem Chromeo 488 Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Katalog-Nr. 15041)-Sekundärantikörper gefärbt. Die konfokalen (links) und STED-Bilder (rechts) wurden mit freundlicher Genehmigung von Leica Microsystems, Deutschland, erstellt.

Superauflösung durch direkte optische Abbildung

Der erste Ansatz basiert auf der konfokalen Mikroskopie, bei der Moleküle in den äußeren Bereichen des Brennflecks ausgeschaltet werden. Dadurch wird die Größe des Fluoreszenzflecks verringert, da nur Farbstoffe im Zentrum des Anregungsbereichs fluoreszieren dürfen. STED (NSimitiert EMission DErschöpfung) und STED CW (Cununterbrochen Wave) gehören zu diesen direkten optischen Abbildungstechniken. Sie erfordern keine rechnerische Auswertung, da die Proben auf normale Weise gescannt werden. Für weitere Informationen besuchen Sie bitte unsere Produktseiten für STED-Mikroskopie.

Superauflösung durch Lokalisierung

Bei diesem Ansatz wird die Mehrheit der Moleküle innerhalb des angeregten Bereichs in einen dunklen Zustand versetzt, nur einige einzelne Farbstoffmoleküle können Fluoreszenzlicht emittieren. Die Position dieser einzelnen Moleküle wird durch einen mathematischen Algorithmus bestimmt und jedes einzelne visualisiert. Durch Wiederholen des Zyklus des Ausschaltens der Farbstoffe und des Erfassens der Fluoreszenz der verbleibenden einzelnen Emitter werden Tausende von Bildern erstellt, diese Bilder werden kombiniert, um das endgültige hochauflösende Bild zu bilden. Mehrere Techniken gehören zu dieser Klasse des stochastischen Auslesens einzelner Moleküllokalisationen: STURM (NSochastic Öptisch Rökonomie mMikroskopie), PALME (PheißEINaktiviert Lokalisierung mMikroskopie) und GSDIM (grunden State DErschöpfung mit ichindividuell molecule Rückkehr). Weitere Informationen zur lokalisierungsbasierten Mikroskopie finden Sie auf unseren Produktseiten für GSDIM-Mikroskopie.

Mit hochauflösender Mikroskopie ist es möglich, die Abbe-Grenze zu überschreiten und Auflösungsverbesserungen um das bis zu 12-fache gegenüber der klassischen konfokalen Mikroskopie zu erzielen. Die Möglichkeit, bildgebende Experimente bei Auflösungen unter 50 nm durchzuführen, erleichtert die Trennung von subzelluläre Strukturen die zuvor nicht gelöst werden konnten, und erhöht das Vertrauen in die biologische Rolle von Proteinen und Strukturen, die sich kolokalisieren.


Erkennung

Erkennung wird typischerweise unter Verwendung eines von zwei Verfahren erreicht: (a) kolorimetrischer oder enzymvermittelter Nachweis und (b) fluoreszenzbasierter Nachweis.

In dem kolorimetrische Methode, wird der gebundene primäre oder sekundäre Antikörper an ein Substrat konjugiert, das bei Umwandlung durch ein Enzym ein Fällungsprodukt ergibt. Dieser Niederschlag ist bei Betrachtung durch Lichtmikroskopie als farbige Färbung sichtbar.

In dem fluoreszenzbasierte Detektion Methode wird ein Antikörper, der an das interessierende Antigen im Gewebe gebunden ist, direkt oder indirekt an ein Fluorophor (manchmal auch als Fluorochrom bezeichnet) konjugiert, ein Molekül, das in Gegenwart von Licht einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert.


12.2H: Fluoreszierende Antikörper - Biologie

Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins in den frühen 1960er Jahren läutete schließlich eine neue Ära in der Zellbiologie ein, indem es Forschern ermöglichte, molekulare Klonierungsmethoden anzuwenden und die Fluorophor-Einheit an eine Vielzahl von Protein- und Enzymzielen zu fusionieren, um zelluläre Prozesse in lebenden Systemen zu überwachen unter Verwendung optischer Mikroskopie und verwandter Methoden.In Verbindung mit den jüngsten technischen Fortschritten in der Weitfeld-Fluoreszenz und der konfokalen Mikroskopie, einschließlich ultraschneller Digitalkameras mit geringer Lichtstärke und Multitracking-Lasersteuerungssystemen, haben das grün fluoreszierende Protein und seine farbverschobenen genetischen Derivate in vielen Tausenden von Lebendzell-Imaging-Experimenten unschätzbare Dienste erwiesen .

Abbildung 1 - Fluoreszierende Proteinmarkierungen in lebenden Zellen

Osamu Shimomura und Frank Johnson, die 1961 an den Friday Harbor Laboratories der University of Washington arbeiteten, isolierten erstmals ein kalziumabhängiges biolumineszierendes Protein aus Aequorea victoria Quallen, die sie genannt haben aequorin. Während des Isolierungsverfahrens wurde ein zweites Protein beobachtet, dem die blau emittierenden biolumineszenten Eigenschaften von Aequorin fehlten, das jedoch bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht eine grüne Fluoreszenz erzeugen konnte. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde das Protein schließlich auf den unzeremoniellen Namen getauft grün fluoreszierendes Protein (GFP). In den nächsten zwei Jahrzehnten stellten die Forscher fest, dass Aequorin und das grün fluoreszierende Protein in den Lichtorganen der Qualle zusammenarbeiten, um kalziuminduzierte Lumineszenzsignale in die für die Spezies charakteristische grüne Fluoreszenz umzuwandeln.

Obwohl das Gen für das grün fluoreszierende Protein erstmals 1992 kloniert wurde, wurde das bedeutende Potenzial als molekulare Sonde erst einige Jahre später erkannt, als Fusionsprodukte verwendet wurden, um die Genexpression in Bakterien und Nematoden zu verfolgen. Seit diesen frühen Studien wurde grün fluoreszierendes Protein manipuliert, um eine große Anzahl verschiedenfarbiger Mutanten, Fusionsproteine ​​und Biosensoren herzustellen, die allgemein als fluoreszierende Proteine ​​bezeichnet werden. In jüngerer Zeit wurden fluoreszierende Proteine ​​anderer Spezies identifiziert und isoliert, was zu einer weiteren Erweiterung der Farbpalette führte. Mit der schnellen Entwicklung der fluoreszierenden Proteintechnologie wird die Nützlichkeit dieses genetisch kodierten Fluorophors für ein breites Anwendungsspektrum über die einfache Verfolgung von markierten Biomolekülen in lebenden Zellen hinaus nun voll erkannt.

Illustriert in Abbildung 1 sind zwei Beispiele für die mehrfache fluoreszierende Proteinmarkierung in lebenden Zellen unter Verwendung von Fusionsprodukten, die auf subzelluläre (Organellen) Orte abzielen. Die Epithelzelle des Opossum-Nierenkortex proximalen Tubulus (OK Zeile) präsentiert in Abbildung 1(a) wurde mit einem Cocktail von fluoreszierenden Proteinvarianten transfiziert, die an Peptidsignale fusioniert sind, die den Transport zu einem der Kerne vermitteln (erweitertes cyan fluoreszierendes Protein ECFP), die Mitochondrien (DsRed fluoreszierendes Protein DsRed2FP) oder das Mikrotubuli-Netzwerk (verstärktes grün fluoreszierendes Protein) EGFP). Ein ähnliches Exemplar, bestehend aus humanen zervikalen Adenokarzinom-Epithelzellen (HeLa Linie) wird in . dargestellt Abbildung 1(b). Die HeLa-Zellen wurden mit an Cyan fusionierten subzellulären Lokalisierungsvektoren (mTürkis) und gelb (mVenus) fluoreszierende Protein-kodierende Sequenzen (Golgi-Komplex bzw. der Kern) sowie das "Fruit"-Protein mCherry, das auf das mitochondriale Netzwerk abzielt.

Grün fluoreszierendes Protein und seine mutierten allelischen Formen, blau, cyan und gelb fluoreszierende Proteine ​​werden verwendet, um fluoreszierende chimäre Proteine ​​zu konstruieren, die nach Transfektion mit den gentechnisch veränderten Vektoren in lebenden Zellen, Geweben und ganzen Organismen exprimiert werden können. Rot fluoreszierende Proteine ​​wurden aus anderen Arten, einschließlich Korallenrifforganismen, isoliert und sind ähnlich nützlich. Die Fluoreszenz-Protein-Technik vermeidet das Problem der Reinigung, Markierung und Einführung markierter Proteine ​​in Zellen oder die Aufgabe, spezifische Antikörper für Oberflächen- oder interne Antigene herzustellen.

Eigenschaften und Modifikationen von Aequorea victoria Green Fluorescent Protein

Einer der wichtigsten Aspekte des grün fluoreszierenden Proteins ist, dass die gesamte native 27-Kilo-Dalton-Peptidstruktur für die Entwicklung und Aufrechterhaltung seiner Fluoreszenz wesentlich ist. Es ist bemerkenswert, dass das Hauptfluorophor von einem Triplett benachbarter Aminosäuren abgeleitet ist: den Serin-, Tyrosin- und Glycinresten an den Positionen 65, 66 und 67 (bezeichnet als Ser65, Tyr66, und Gly67 sehen Figur 2). Obwohl dieses einfache Aminosäuremotiv in der Natur häufig vorkommt, führt es im Allgemeinen nicht zu Fluoreszenz. Die Besonderheit des fluoreszierenden Proteins ist, dass sich dieses Peptidtriplett im Zentrum einer bemerkenswert stabilen Barrel-Struktur befindet, die aus 11 . besteht Beta-Blätter zu einer Röhre gefaltet.

In der hydrophoben Umgebung im Zentrum des grün fluoreszierenden Proteins findet eine Reaktion zwischen dem Carboxylkohlenstoff von Ser65 und dem Aminostickstoff von Gly67 statt, die zur Bildung eines heterocyclischen Imidazolin-5-on-Stickstoffringsystems führt (wie in Figur 2). Eine weitere Oxidation führt zur Konjugation des Imidazolinrings mit Tyr66 und zur Reifung einer fluoreszierenden Spezies. Es ist wichtig anzumerken, dass das native grün fluoreszierende Protein-Fluorophor in zwei Zuständen existiert. Eine protonierte Form, der vorherrschende Zustand, hat ein Anregungsmaximum bei 395 Nanometern und eine weniger verbreitete, nicht protonierte Form, die bei ungefähr 475 Nanometern absorbiert. Ungeachtet der Anregungswellenlänge hat die Fluoreszenzemission jedoch eine maximale Spitzenwellenlänge bei 507 Nanometern, obwohl die Spitze breit und nicht gut definiert ist.

Figur 2 - Grüne fluoreszierende Protein-Fluorophor-Reifung

Zwei vorherrschende Eigenschaften des fluoreszierenden Protein-Fluorophors haben wichtige Auswirkungen auf seine Nützlichkeit als Sonde. Erstens sind die photophysikalischen Eigenschaften des grün fluoreszierenden Proteins als Fluorophor ziemlich komplex und daher kann das Molekül eine beträchtliche Menge an Modifikationen aufnehmen. Viele Studien haben sich auf die Feinabstimmung der Fluoreszenz von nativem grün fluoreszierendem Protein konzentriert, um ein breites Spektrum an molekularen Sonden bereitzustellen, aber das bedeutendere und enorme Potenzial der Verwendung des Proteins als Ausgangsmaterial für die Konstruktion fortschrittlicher Fluorophore kann nicht unterschätzt werden. Das zweite wichtige Merkmal des grün fluoreszierenden Proteins besteht darin, dass die Fluoreszenz stark von der molekularen Struktur abhängt, die das Tripeptid-Fluorophor umgibt.

Die Denaturierung des grün fluoreszierenden Proteins zerstört erwartungsgemäß die Fluoreszenz, und Mutationen an Resten, die das Tripeptid-Fluorophor umgeben, können die Fluoreszenzeigenschaften dramatisch verändern. Die Packung von Aminosäureresten im Inneren des Beta Barrel ist extrem stabil, was zu einer sehr hohen Fluoreszenzquantenausbeute (bis zu 80 Prozent) führt. Diese enge Proteinstruktur verleiht auch eine Resistenz gegenüber Fluoreszenzschwankungen aufgrund von Schwankungen des pH-Werts, der Temperatur und Denaturierungsmitteln wie Harnstoff. Die hohe Stabilität wird in der Regel durch fluoreszenzstörende Mutationen im grün fluoreszierenden Protein negativ verändert, was zu einer Verringerung der Quantenausbeute und einer höheren Umweltempfindlichkeit führt. Obwohl einige dieser Defekte durch zusätzliche Mutationen überwunden werden können, sind abgeleitete fluoreszierende Proteine ​​im Allgemeinen empfindlicher gegenüber der Umwelt als die nativen Spezies. Diese Einschränkungen sollten bei der Planung von Experimenten mit genetischen Varianten ernsthaft berücksichtigt werden.

Um fluoreszierende Proteine ​​für die Verwendung in Säugersystemen anzupassen, wurden mehrere grundlegende Modifikationen des grün fluoreszierenden Proteins vom Wildtyp vorgenommen, die heute in allen gängigen Varianten zu finden sind. Der erste Schritt bestand darin, die Reifung der Fluoreszenz auf eine Umgebung von 37 Grad Celsius zu optimieren. Die Reifung des Wildtyp-Fluorophors ist bei 28 Grad ziemlich effizient, aber eine Erhöhung der Temperatur auf 37 Grad reduziert die Gesamtreifung erheblich und führt zu einer verringerten Fluoreszenz. Mutation des Phenylalaninrestes an Position 64 (Phe64) zu Leucin führt zu einer verbesserten Reifung der Fluoreszenz bei 37 Grad, was mindestens der bei 28 Grad beobachteten entspricht. Diese Mutation ist in den beliebtesten Varianten von fluoreszierenden Proteinen vorhanden, die von Aequorea victoria, ist aber nicht die einzige Mutation, die die Faltung bei 37 Grad verbessert, wie andere Varianten entdeckt wurden.

Zusätzlich zur Verbesserung der Reifung bei 37 Grad hat die Optimierung der Codon-Nutzung für die Säugerexpression auch die Gesamthelligkeit des grün fluoreszierenden Proteins verbessert, das in Säugerzellen exprimiert wird. Insgesamt wurden über 190 stille Mutationen in die kodierende Sequenz eingeführt, um die Expression in menschlichen Geweben zu verstärken. Eine Kozak-Translationsinitiationsstelle (enthält die Nukleotidsequenz A/GCCAT) wurde ebenfalls durch Insertion von Valin als zweite Aminosäure eingeführt. Diese haben zusammen mit einer Vielzahl anderer Verbesserungen (unten diskutiert) zu einer sehr nützlichen Sonde für die Bildgebung von Säugerzellen in lebenden Zellen geführt und sind allen derzeit verwendeten fluoreszierenden Sonden gemeinsam, die von dem ursprünglichen Quallenprotein abgeleitet sind.

Die fluoreszierende Protein-Farbpalette

Es wurde eine breite Palette von genetischen Varianten von fluoreszierenden Proteinen entwickelt, die Fluoreszenz-Emissions-Spektralprofile aufweisen, die fast das gesamte Spektrum des sichtbaren Lichts umfassen (siehe Tabelle 1). Mutagenese-Bemühungen im Original Aequorea victoria Das grün fluoreszierende Protein von Quallen hat zu neuen fluoreszierenden Sonden geführt, deren Farbe von blau bis gelb reicht und die zu den am häufigsten verwendeten gehören in vivo Reportermoleküle in der biologischen Forschung. Aus der Meeresanemone wurden längerwellige fluoreszierende Proteine ​​entwickelt, die im orangen und roten Spektralbereich emittieren. Discosoma striata, und Riffkorallen der Klasse Anthozoen. Noch andere Spezies wurden abgebaut, um ähnliche Proteine ​​mit Cyan-, Grün-, Gelb-, Orange- und tiefroter Fluoreszenzemission zu produzieren. Es werden Entwicklungsforschungsbemühungen unternommen, um die Helligkeit und Stabilität von fluoreszierenden Proteinen zu verbessern, wodurch deren Gesamtnutzen verbessert wird.

Tabelle 1 - Fluoreszierende Proteineigenschaften

Protein
(Akronym)
Erregung
Maximal
(nm)
Emission
Maximal
(nm)
Molar
Aussterben
Koeffizient
Quantum
Ertrag
in vivo
Struktur
Relativ
Helligkeit
(% von EGFP)
GFP (Gew.)395/47550921,0000.77Monomer*48
Grün fluoreszierende Proteine
EGFP48450756,0000.60Monomer*100
Smaragd48750957,5000.68Monomer*116
Superfolder GFP48551083,3000.65Monomer*160
Azamigrün49250555,0000.74Monomer121
mWasabi49350970,0000.80Monomer167
TagGFP48250558,2000.59Monomer*110
TurboGFP48250270,0000.53Dimer102
AcGFP48050550,0000.55Monomer*82
ZsGrün49350543,0000.91Tetramer117
T-Saphir39951144,0000.60Monomer*79
Blau fluoreszierende Proteine
EBFP38344529,0000.31Monomer*27
EBFP238344832,0000.56Monomer*53
Azurit38445026,2000.55Monomer*43
mTagBFP39945652,0000.63Monomer98
Cyan fluoreszierende Proteine
ECFP43947632,5000.40Monomer*39
mECFP43347532,5000.40Monomer39
Himmelblau43347543,0000.62Monomer*79
mTürkis43447430,0000.84Monomer*75
CyPet43547735,0000.51Monomer*53
AmCyan145848944,0000.24Tetramer31
Midori-Ishi Cyan47249527,3000.90Dimer73
TagCFP45848037,0000.57Monomer63
mTFP1 (blaugrün)46249264,0000.85Monomer162
Gelb fluoreszierende Proteine
EYFP51452783,4000.61Monomer*151
Topas51452794,5000.60Monomer*169
Venus51552892,2000.57Monomer*156
mCitrin51652977,0000.76Monomer174
YPet517530104,0000.77Monomer*238
TagYFP50852464,0000.60Monomer118
PhiYFP525537124,0000.39Monomer*144
ZsGelb152953920,2000.42Tetramer25
mBanane5405536,0000.7Monomer13
Orange fluoreszierende Proteine
Kusabira Orange54855951,6000.60Monomer92
Kusabira Orange255156563,8000.62Monomer118
mOrange54856271,0000.69Monomer146
mOrange254956558,0000.60Monomer104
dTomate55458169,0000.69Dimer142
dTomaten-Tandem554581138,0000.69Monomer283
TagRFP555584100,0000.48Monomer142
TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99
DsRed55858375,0000.79Tetramer176
DsRed256358243,8000.55Tetramer72
DsRot-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58
DsRed-Monomer55658635,0000.10Monomer10
mMandarine56858538,0000.30Monomer34
Rot fluoreszierende Proteine
mRuby558605112,0000.35Monomer117
mApple56859275,0000.49Monomer109
mErdbeere57459690,0000.29Monomer78
AsRed257659256,2000.05Tetramer8
mRFP158460750,0000.25Monomer37
JRed58461044,0000.20Dimer26
mCherry58761072,0000.22Monomer47
HcRed158861820,0000.015Dimer1
mHimbeere59862586,0000.15Monomer38
dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21
HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19
mPlum59064941,0000.10Monomer12
AQ14359565590,0000.04Tetramer11
* Schwaches Dimer

Vorgestellt in Tabelle 1 ist eine Zusammenstellung der Eigenschaften einiger der beliebtesten und nützlichsten fluoreszierenden Proteinvarianten. Zusammen mit dem gebräuchlichen Namen und/oder Akronym für jedes fluoreszierende Protein, den Peak-Absorptions- und Emissionswellenlängen (angegeben in Nanometern), dem molaren Extinktionskoeffizienten, der Quantenausbeute, der relativen Helligkeit und in vivostrukturelle Assoziationen aufgeführt. Die berechneten Helligkeitswerte wurden aus dem Produkt des molaren Extinktionskoeffizienten und der Quantenausbeute dividiert durch den Wert für EGFP abgeleitet. Diese Auflistung wurde aus wissenschaftlichen und kommerziellen Literaturquellen erstellt und soll keinen Anspruch auf Vollständigkeit erheben, sondern stellt stattdessen fluoreszierende Proteinderivate dar, die in der Literatur erhebliche Beachtung gefunden haben und sich bei Forschungsbemühungen als wertvoll erweisen können. Darüber hinaus wurden die in Tabellen aufgeführten und unten dargestellten Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren unter kontrollierten Bedingungen aufgenommen und sind nur zu Vergleichs- und Anzeigezwecken normalisiert. Bei tatsächlichen fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen können Spektralprofile und Wellenlängenmaxima aufgrund von Umwelteinflüssen wie pH, Ionenkonzentration und Lösungsmittelpolarität sowie Schwankungen der lokalisierten Sondenkonzentration variieren. Daher können die aufgeführten Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeuten von den tatsächlich unter experimentellen Bedingungen beobachteten abweichen.

Grün fluoreszierende Proteine

Obwohl natives grün fluoreszierendes Protein eine signifikante Fluoreszenz erzeugt und extrem stabil ist, liegt das Anregungsmaximum nahe dem ultravioletten Bereich. Da ultraviolettes Licht besondere optische Überlegungen erfordert und lebende Zellen schädigen kann, ist es im Allgemeinen nicht gut für die Bildgebung lebender Zellen mit optischer Mikroskopie geeignet. Glücklicherweise wird das Anregungsmaximum des grün fluoreszierenden Proteins leicht auf 488 Nanometer (in der Cyan-Region) verschoben, indem eine einzelne Punktmutation eingeführt wird, die das Serin an Position 65 in einen Threoninrest ändert (S65T). Diese Mutation kommt in der beliebtesten Variante des grün fluoreszierenden Proteins vor, genannt erweitert GFP (EGFP). Darüber hinaus kann die verbesserte Version mit handelsüblichen Filtersätzen für Fluorescein abgebildet werden und gehört zu den hellsten der derzeit erhältlichen fluoreszierenden Proteine. Diese Eigenschaften haben das verstärkte grün fluoreszierende Protein zu einer der beliebtesten Sonden und zur besten Wahl für die meisten Experimente mit fluoreszierendem Einzelmarkierungsprotein gemacht. Die einzigen Nachteile bei der Verwendung von EGFP sind eine geringe pH-Empfindlichkeit und eine schwache Neigung zur Dimerisierung.

Neben dem verstärkten grün fluoreszierenden Protein werden derzeit mehrere andere Varianten in der Bildgebung lebender Zellen verwendet. Eine der besten davon in Bezug auf Photostabilität und Helligkeit ist möglicherweise die Smaragd Variante, aber das Fehlen einer kommerziellen Quelle hat ihre Verwendung eingeschränkt. Mehrere Quellen liefern humanisierte grün fluoreszierende Proteinvarianten, die deutliche Vorteile für den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer bieten (BUND) Experimente. Substitution des Phenylalaninrestes an Position 64 für Leucin (F64L GFP2) ergibt eine Mutante, die den 400-Nanometer-Anregungspeak beibehält und als effektiver Partner für verstärktes gelb fluoreszierendes Protein gekoppelt werden kann. Eine Variante des S65C Mutation (normalerweise Cystein für Serin ersetzend) mit einer Spitzenanregung bei 474 Nanometern wurde kommerziell als ein besser geeigneter FRET-Partner für verstärktes blaues fluoreszierendes Protein als die rotverschobene verstärkte grüne Version eingeführt. Schließlich ein Riffkorallenprotein, genannt ZsGrün1 und mit einem Emissionspeak bei 505 Nanometern, wurde als Ersatz für verstärktes grün fluoreszierendes Protein eingeführt. Wenn es in Säugerzellen exprimiert wird, ist ZsGreen1 im Vergleich zu EGFP sehr hell, hat jedoch einen begrenzten Nutzen bei der Herstellung von Fusionsmutanten und neigt ähnlich wie andere Riffkorallenproteine ​​dazu, Tetramere zu bilden.

Gelb fluoreszierende Proteine

Die Familie der gelb fluoreszierenden Proteine ​​wurde initiiert, nachdem die Kristallstruktur des grün fluoreszierenden Proteins zeigte, dass der Threoninrest 203 (Thr203) befand sich in der Nähe des Chromophors. Die Mutation dieses Rests zu Tyrosin wurde eingeführt, um das Dipolmoment des angeregten Zustands des Chromophors zu stabilisieren und führte zu einer 20-Nanometer-Verschiebung zu längeren Wellenlängen sowohl für die Anregungs- als auch für die Emissionsspektren. Weitere Verfeinerungen führten zur Entwicklung des erweitert gelb fluoreszierendes Protein (EYFP), das eines der hellsten und am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Proteine ​​ist. Die Kombination aus Helligkeit und Fluoreszenzemissionsspektrum des verstärkten gelb fluoreszierenden Proteins macht diese Sonde zu einem ausgezeichneten Kandidaten für Mehrfarben-Imaging-Experimente in der Fluoreszenzmikroskopie. Verstärktes gelb fluoreszierendes Protein ist auch für Energietransferexperimente nützlich, wenn es mit verstärktem cyan fluoreszierendem Protein (ECFP) oder GFP2. Gelb fluoreszierendes Protein weist jedoch einige Probleme auf, da es gegenüber einem sauren pH-Wert sehr empfindlich ist und bei pH 6,5 etwa 50 Prozent seiner Fluoreszenz verliert. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass EYFP gegenüber Chloridionen und Photobleichen viel leichter empfindlich ist als die grün fluoreszierenden Proteine.

Figur 3 - Spektralprofile gängiger fluoreszierender Proteine

Die kontinuierliche Entwicklung der fluoreszierenden Proteinarchitektur für die gelbe Emission hat mehrere der Probleme mit den gelben Sonden gelöst. Die Citrin Variante des gelb fluoreszierenden Proteins ist im Vergleich zu EYFP sehr hell und hat sich als viel resistenter gegenüber Photobleichen, saurem pH und anderen Umwelteinflüssen erwiesen. Ein weiteres Derivat, genannt Venus, ist die am schnellsten reifende und eine der hellsten bisher entwickelten gelben Varianten. Das Korallenriffprotein, ZsGelb1, ursprünglich geklont von a Zoanthus Arten, die im Indischen und Pazifischen Ozean beheimatet sind, erzeugt eine echte gelbe Emission und ist ideal für mehrfarbige Anwendungen. Wie ZsGreen1 ist dieses Derivat für die Bildung von Fusionen nicht so nützlich wie EYFP und neigt dazu, Tetramere zu bilden. Viele der robusteren gelb fluoreszierenden Proteinvarianten waren für quantitative Ergebnisse in FRET-Studien wichtig und sind möglicherweise auch für andere Untersuchungen nützlich.

Illustriert in Figur 3 sind die Absorptions- und Emissionsspektralprofile für viele der üblicherweise verwendeten und kommerziell erhältlichen fluoreszierenden Proteine, die das sichtbare Spektrum von Cyan bis Dunkelrot umfassen. Die Varianten abgeleitet von Aequorea victoria Quallen, einschließlich verstärkter Cyan-, Grün- und Gelbfluoreszenzproteine, weisen Spitzenemissionswellenlängen im Bereich von 425 bis 525 Nanometern auf. Fluoreszierende Proteine ​​aus Korallenriffen, DsRed2 und HcRed1 (siehe unten), emittieren längere Wellenlängen, leiden jedoch unter Oligomerisierungsartefakten in Säugerzellen.

Blau und Cyan fluoreszierende Proteine

Die blauen und cyanfarbenen Varianten des grün fluoreszierenden Proteins resultieren aus einer direkten Modifikation des Tyrosinrests an Position 66 (Tyr66) im nativen Fluorophor (siehe Figur 2). Die Umwandlung dieser Aminosäure in Histidin führt zu einer blauen Emission mit einem Wellenlängenmaximum bei 450 Nanometern, wohingegen die Umwandlung in Tryptamin zu einem Hauptfluoreszenzpeak bei etwa 480 Nanometern zusammen mit einer Schulter mit einem Peak bei etwa 500 Nanometern führt.Beide Sonden sind nur schwach fluoreszierend und erfordern sekundäre Mutationen, um die Faltungseffizienz und Gesamthelligkeit zu erhöhen. Selbst mit Modifikationen können die verbesserten Versionen dieser Klasse von fluoreszierenden Proteinen (EBFP und ECFP) sind nur etwa 25 bis 40 Prozent so hell wie das verstärkte grün fluoreszierende Protein. Darüber hinaus ist die Anregung von blau- und blaugrün fluoreszierenden Proteinen in Spektralbereichen am effizientesten, die nicht häufig verwendet werden, sodass spezielle Filtersätze und Laserquellen erforderlich sind.

Trotz der Nachteile blau- und cyan fluoreszierender Proteine ​​hat das weit verbreitete Interesse an Mehrfarbenmarkierung und FRET ihre Anwendung in einer Reihe von Untersuchungen populär gemacht. Dies gilt insbesondere für verstärktes Cyan-Fluoreszenzprotein, das durch einen Argon-Ionen-Laser (unter Verwendung der 457-Nanometer-Spektrallinie) außerhalb des Peaks angeregt werden kann und deutlich widerstandsfähiger gegen Photobleichen ist als das blaue Derivat. Im Gegensatz zu anderen fluoreszierenden Proteinen gab es kein großes Interesse an der Entwicklung besserer Sonden im blauen Bereich des sichtbaren Lichtspektrums, und ein Großteil der Entwicklungsforschung zu Fluorophoren dieser Klasse konzentrierte sich auf Cyan-Varianten.

Figur 4 - Spektralprofile von fluoreszierenden Protein-FRET-Eimer-Varianten

Unter den verbesserten Cyan-Fluoreszenzproteinen, die eingeführt wurden, AmCyan1 und eine verbesserte Cyan-Variante namens Himmelblau zeigen die meisten Versprechen. Abgeleitet von der Riffkoralle, Anemonia majano, wurde die fluoreszierende Proteinvariante AmCyan1 mit humanen Codons optimiert, um eine hohe relative Helligkeit und Resistenz gegenüber Photobleichen im Vergleich zu einem verstärkten cyan fluoreszierenden Protein während der Expression in Säugetieren zu erzielen. Auf der anderen Seite neigt diese Sonde, ähnlich wie die meisten anderen Riffkorallenproteine, dazu, Tetramere zu bilden. Die Cerulean-Fluoreszenzsonde wurde durch ortsgerichtete Mutagenese von verstärktem Cyan-Fluoreszenzprotein entwickelt, um einen höheren Extinktionskoeffizienten und eine verbesserte Quantenausbeute zu erzielen. Cerulean ist mindestens 2-mal heller als das verstärkte cyan fluoreszierende Protein und es hat sich gezeigt, dass es das Signal-Rausch-Verhältnis signifikant erhöht, wenn es mit gelb emittierenden fluoreszierenden Proteinen wie Venus gekoppelt wird (siehe Figur 4), bei FRET-Untersuchungen.

Rot fluoreszierende Proteine

Ein Hauptziel der Entwicklung fluoreszierender Proteine ​​ist die Konstruktion eines rot emittierenden Derivats, das die fortschrittlichen Eigenschaften eines verstärkten grün fluoreszierenden Proteins erreicht oder übertrifft. Zu den Vorteilen eines geeigneten rot fluoreszierenden Proteins gehören die potenzielle Kompatibilität mit bestehenden konfokalen und Weitfeldmikroskopen (und deren Filtersätzen) sowie eine erhöhte Kapazität, ganze Tiere abzubilden, die für rotes Licht deutlich transparenter sind. Da die Konstruktion rotverschobener Mutanten aus dem Aequorea victoria Quallengrün fluoreszierendes Protein jenseits des gelben Spektralbereichs hat sich als weitgehend erfolglos erwiesen, die Ermittler haben ihre Suche auf die tropischen Riffkorallen gerichtet.

Das erste fluoreszierende Protein aus Korallen, das in großem Umfang genutzt wurde, stammt von Discosoma striata und wird allgemein als bezeichnet DsRed. Nach der vollständigen Reifung weist das Fluoreszenzemissionsspektrum von DsRed einen Peak bei 583 Nanometern auf, während das Anregungsspektrum einen Hauptpeak bei 558 Nanometern und einen Nebenpeak bei etwa 500 Nanometern aufweist. Mit der Verwendung von DsRed sind jedoch mehrere Probleme verbunden. Die Reifung der DsRed-Fluoreszenz erfolgt langsam und verläuft über einen Zeitraum, in dem die Fluoreszenzemission im grünen Bereich liegt. Genannt die grüner Zustand, hat sich dieses Artefakt für mehrere Markierungsexperimente mit anderen grün fluoreszierenden Proteinen aufgrund der spektralen Überlappung als problematisch erwiesen. Darüber hinaus ist DsRed ein obligates Tetramer und kann in lebenden Zellen große Proteinaggregate bilden. Obwohl diese Merkmale für die Verwendung von DsRed als Reporter der Genexpression belanglos sind, ist die Nützlichkeit von DsRed als Epitop-Tag stark eingeschränkt. Im Gegensatz zu den fluoreszierenden Proteinen der Qualle, die erfolgreich verwendet wurden, um Hunderte von Proteinen zu markieren, haben sich DsRed-Konjugate als viel weniger erfolgreich erwiesen und sind oft toxisch.

Einige der Probleme mit DsRed-Fluoreszenzproteinen wurden durch Mutagenese überwunden. Das DsRed der zweiten Generation, bekannt als DsRed2, enthält mehrere Mutationen am Peptid-Aminoterminus, die die Bildung von Proteinaggregaten verhindern und die Toxizität reduzieren. Außerdem wird mit diesen Modifikationen die Reifungszeit des Fluorophors verkürzt. Das DsRed2-Protein bildet immer noch ein Tetramer, ist aber aufgrund der schnelleren Reifung in mehreren Markierungsexperimenten besser mit grün fluoreszierenden Proteinen kompatibel. Eine weitere Verkürzung der Reifungszeit wurde mit der dritten Generation von DsRed-Mutanten erzielt, die auch ein erhöhtes Helligkeitsniveau in Bezug auf die zelluläre Spitzenfluoreszenz aufweisen. Rote Fluoreszenzemission von DsRed-Express kann innerhalb einer Stunde nach der Expression beobachtet werden, verglichen mit ungefähr sechs Stunden für DsRed2 und 11 Stunden für DsRed. Eine hefeoptimierte Variante, genannt Roter Stern, wurde entwickelt, das auch eine verbesserte Reifungsrate und eine erhöhte Helligkeit aufweist. Das Vorhandensein eines grünen Zustands in DsRed-Express und RedStar ist nicht offensichtlich, was diese fluoreszierenden Proteine ​​zur besten Wahl im orange-roten Spektralbereich für mehrere Markierungsexperimente macht. Da diese Sonden obligate Tetramere bleiben, sind sie nicht die beste Wahl zum Markieren von Proteinen.

Abbildung 5 - Spektralprofile von orangen und roten monometrischen fluoreszierenden Proteinen

Mehrere zusätzliche rot fluoreszierende Proteine, die viel versprechend sind, wurden aus den Riffkorallenorganismen isoliert. Eine der ersten, die für Säugetieranwendungen angepasst wurde, ist HcRed1, die isoliert wurde von Heteractis Crispa und ist jetzt im Handel erhältlich. HcRed1 wurde ursprünglich von einem nicht fluoreszierenden Chromoprotein abgeleitet, das rotes Licht durch Mutagenese absorbiert, um ein schwach fluoreszierendes obligates Dimer mit einem Absorptionsmaximum bei 588 Nanometern und einem Emissionsmaximum von 618 Nanometern zu erzeugen. Obwohl das Fluoreszenzemissionsspektrum dieses Proteins für die Trennung von DsRed ausreichend ist, neigt es dazu, mit DsRed zu koaggregieren und ist weit weniger hell. Ein interessantes HcRed-Konstrukt, das zwei Moleküle hintereinander enthält, wurde hergestellt, um die Dimerisierung zu überwinden, die im Prinzip bevorzugt innerhalb der Tandempaarung auftritt, um einen monomeren Tag zu erzeugen. Da die Gesamthelligkeit dieses Zwillingsproteins jedoch noch nicht verbessert wurde, ist es für Routineanwendungen in der Lebendzellmikroskopie keine gute Wahl.

Entwicklung von monomeren fluoreszierenden Proteinvarianten

In ihrem natürlichen Zustand existieren die meisten fluoreszierenden Proteine ​​als Dimere, Tetramere oder Oligomere höherer Ordnung. Gleichfalls, Aequorea victoria Es wird angenommen, dass grün fluoreszierendes Protein an einem tetrameren Komplex mit Aequorin beteiligt ist, aber dieses Phänomen wurde nur bei sehr hohen Proteinkonzentrationen beobachtet und die Tendenz von fluoreszierenden Quallenproteinen zur Dimerisierung ist im Allgemeinen sehr schwach (mit einer Dissoziationskonstante von mehr als 100 Mikromolar). Eine Dimerisierung von fluoreszierenden Proteinen wurde daher im Allgemeinen nicht beobachtet, wenn sie in Säugersystemen exprimiert werden. Wenn fluoreszierende Proteine ​​jedoch auf spezifische Zellkompartimente, wie die Plasmamembran, gerichtet werden, kann die lokalisierte Proteinkonzentration theoretisch hoch genug werden, um eine Dimerisierung zu ermöglichen. Dies ist ein besonderes Problem bei der Durchführung von FRET-Experimenten, die komplexe Datensätze liefern können, die leicht durch Dimerisierungsartefakte beeinträchtigt werden.

Der Aufbau von monomeren DsRed-Varianten hat sich als schwierige Aufgabe erwiesen. Für die Bildung des monomeren DsRed-Proteins der ersten Generation (genannt RFP1). Dieses Derivat weist jedoch im Vergleich zum nativen Protein eine deutlich reduzierte Fluoreszenzemission auf und verfärbt sich sehr schnell, was es viel weniger nützlich macht als monomere grün und gelb fluoreszierende Proteine. Mutagenese-Forschungsbemühungen, einschließlich neuer Techniken wie der somatischen Hypermutation, werden auf der Suche nach gelb, orange, roten und tiefrot fluoreszierenden Proteinvarianten fortgesetzt, die die Tendenz dieser potenziell wirksamen biologischen Sonden zur Selbstassoziation weiter reduzieren und gleichzeitig die Emissionsmaxima erhöhen hin zu längeren Wellenlängen.

Es werden verbesserte monomere fluoreszierende Proteine ​​entwickelt, die erhöhte Extinktionskoeffizienten, Quantenausbeuten und Photostabilität aufweisen, obwohl noch keine einzelne Variante nach allen Kriterien optimiert wurde. Darüber hinaus werden die Expressionsprobleme mit obligaten tetrameren rot fluoreszierenden Proteinen durch die Bemühungen um die Generierung von monomeren Varianten überwunden, die Derivate ergeben haben, die mit der biologischen Funktion besser kompatibel sind.

Die vielleicht spektakulärste Entwicklung an dieser Front war die Einführung einer neuen Ernte von fluoreszierenden Proteinen, die aus monomerem rot fluoreszierendem Protein durch gezielte Mutagenese mit dem Ziel der Q66 und Y67 Rückstände. Benannt nach Früchten, die Farben ähnlich dem Fluoreszenzemissions-Spektralprofil reflektieren (siehe Tabelle 1 und Abbildung 5) zeigt dieser Kader von monomeren fluoreszierenden Proteinen Maxima bei Wellenlängen im Bereich von 560 bis 610 Nanometern. Eine weitere Erweiterung dieser Klasse durch iterative somatische Hypermutation lieferte fluoreszierende Proteine ​​mit Emissionswellenlängen bis zu 650 Nanometern. Diese neuen Proteine ​​füllen im Wesentlichen die Lücke zwischen den am stärksten rotverschobenen fluoreszierenden Proteinen von Quallen (wie Venus) und den rot fluoreszierenden Proteinen des Korallenriffs. Obwohl einigen dieser neuen fluoreszierenden Proteine ​​die für viele bildgebende Experimente erforderliche Helligkeit und Stabilität fehlt, ist ihre Existenz ermutigend, da sie die Möglichkeit von hellen, stabilen, monomeren fluoreszierenden Proteinen über das gesamte sichtbare Spektrum vermuten lässt.

Optische Textmarker

Eine der interessantesten Entwicklungen in der Fluoreszenzproteinforschung war die Anwendung dieser Sonden als molekular oder optische Highlighter (sehen Tabelle 2), die aufgrund einer externen Photonenstimulation oder im Laufe der Zeit ihre Farbe oder Emissionsintensität ändern. Beispielsweise erzeugt eine einzelne Punktmutation des nativen Quallenpeptids eine photoaktivierbare Version des grün fluoreszierenden Proteins (bekannt als PA-GFP), die eine Photokonversion des Anregungspeaks von Ultraviolett nach Blau durch Beleuchtung mit Licht im 400-Nanometer-Bereich ermöglicht. Nicht umgewandeltes PA-GFP weist einen Anregungspeak auf, der im Profil dem des Wildtyp-Proteins ähnlich ist (ungefähr 395 bis 400 Nanometer). Nach der Photokonversion steigt der Anregungspeak bei 488 Nanometern ungefähr um das 100-fache an. Dieses Ereignis ruft sehr hohe Kontrastunterschiede zwischen den nicht umgewandelten und umgewandelten PA-GFP-Pools hervor und ist nützlich, um die Dynamik molekularer Subpopulationen innerhalb einer Zelle zu verfolgen. Illustriert in Abbildung 6(a) ist eine transfizierte lebende Säugerzelle, die PA-GFP im Zytoplasma enthält und mit 488-Nanometer-Argon-Ionen-Laseranregung vor (Abbildung 6(a)) und danach (Abbildung 6(d)) Photokonversion mit einem blauen 405-Nanometer-Diodenlaser.

Tabelle 2 - Eigenschaften ausgewählter optischer Textmarker

Protein
(Akronym)
Erregung
Maximal
(nm)
Emission
Maximal
(nm)
Molar
Aussterben
Koeffizient
Quantum
Ertrag
in vivo
Struktur
Relativ
Helligkeit
(% von EGFP)
PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41
PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16
PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3
CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259
CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59
wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112
wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68
mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101
mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53
dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165
dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59
mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140
mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90
Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67
Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57
CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240
Anzünden (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12

Als optische Highlighter können auch andere fluoreszierende Proteine ​​eingesetzt werden. Eine Drei-Photonen-Anregung (bei weniger als 760 Nanometern) des fluoreszierenden Proteins DsRed ist in der Lage, die normalerweise rote Fluoreszenz in Grün umzuwandeln. Dieser Effekt ist wahrscheinlich auf das selektive Photobleichen der roten Chromophore in DsRed zurückzuführen, was zu einer beobachtbaren Fluoreszenz aus dem grünen Zustand führt. Die Timer DsRed-Variante wechselt im Verlauf mehrerer Stunden allmählich von hellgrün (500-Nanometer-Emission) zu hellem Rot (580-Nanometer-Emission). Das relative Verhältnis von grüner zu roter Fluoreszenz kann dann verwendet werden, um zeitliche Daten für Genexpressionsuntersuchungen zu sammeln.

Ein photoschaltbarer optischer Highlighter, genannt PS-CFP, abgeleitet durch Mutagenese einer grün fluoreszierenden Proteinvariante, wurde beobachtet, dass bei Belichtung mit 405 Nanometern von Cyan zu grüner Fluoreszenz übergeht (man beachte die Photokonversion der zentralen Zelle in Abbildungen 6(b) und 6(e)). Als Monomer ausgedrückt, ist diese Sonde potentiell nützlich bei Photobleaching-, Photokonversions- und Photoaktivierungsuntersuchungen. Die Fluoreszenz von PS-CFP ist jedoch ungefähr 2,5-fach schwächer als die von PA-GFP und ist anderen Highlightern in Bezug auf die Photokonversionseffizienz unterlegen (die 40-Nanometer-Verschiebung der Fluoreszenzemission bei der Photokonversion ist geringer als bei ähnlichen Sonden). Eine zusätzliche Mutagenese dieses oder verwandter fluoreszierender Proteine ​​hat das Potenzial, nützlichere Varianten in diesem Wellenlängenbereich zu ergeben.

Abbildung 6 - Optische Highlighter fluoreszierende Proteine

Optische Highlighter wurden auch in fluoreszierenden Proteinen entwickelt, die aus Korallen- und Anemonenarten kloniert wurden. Kaede, ein fluoreszierendes Protein, das aus Steinkorallen isoliert wurde, wandelt sich in Gegenwart von ultraviolettem Licht von Grün in Rot um. Im Gegensatz zu PA-GFP erfolgt die Umwandlung der Fluoreszenz in Kaede durch Absorption von Licht, das sich spektral von seiner Beleuchtung unterscheidet. Leider ist dieses Protein ein obligates Tetramer, was es für die Verwendung als Epitop-Tag weniger geeignet macht als PA-GFP. Eine weitere tetramere Steinkoralle (Lobophyllia hemprichii) fluoreszierende Proteinvariante, genannt EosFP (sehen Tabelle 2) emittiert eine hellgrüne Fluoreszenz, die sich bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht bei ungefähr 390 Nanometern in orange-rot ändert. In diesem Fall wird die spektrale Verschiebung durch eine photoinduzierte Modifikation erzeugt, die einen Bruch des Peptidrückgrats neben dem Chromophor beinhaltet. Eine weitere Mutagenese des "Wildtyp"-EosFP-Proteins ergab monomere Derivate, die bei der Konstruktion von Fusionsproteinen nützlich sein können.

Ein dritter Nicht-Aequorea optischer Highlighter, der Anzündholz fluoreszierendes Protein (KFP1) wurde aus einem nicht fluoreszierenden Chromoprotein entwickelt, das in isoliert wurde Anemonia sulcata, und ist jetzt im Handel erhältlich (Evrogen). Anzündendes fluoreszierendes Protein zeigt keine Emission, bis es mit grünem Licht beleuchtet wird. Licht geringer Intensität führt zu einer vorübergehenden roten Fluoreszenz, die innerhalb weniger Minuten abklingt (siehe Mitochondrien in Abbildung 6(c)). Die Beleuchtung mit blauem Licht löscht die angezündete Fluoreszenz sofort, was eine genaue Kontrolle über die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht. Im Gegensatz dazu führt eine hochintensive Beleuchtung zu irreversiblem Anzünden und ermöglicht eine stabile Hervorhebung ähnlich wie bei PA-GFP (Abbildung 6(f)). Die Fähigkeit, die Fluoreszenz präzise zu steuern, ist besonders nützlich, wenn die Partikelbewegung in einer überfüllten Umgebung verfolgt wird. Dieser Ansatz wurde beispielsweise erfolgreich verwendet, um das Schicksal von Neuralplattenzellen in der Entwicklung zu verfolgen Xenopus Embryonen und die Bewegung einzelner Mitochondrien in PC12-Zellen.

Während die Entwicklung optischer Highlighter fortschreitet, sollten sich fluoreszierende Proteine, die für die optische Markierung nützlich sind, zu helleren, monomeren Varianten entwickeln, die leicht photokonvertiert werden können und ein breites Spektrum an Emissionsfarben aufweisen. In Verbindung mit diesen Fortschritten werden Mikroskope, die für die reibungslose Orchestrierung zwischen Beleuchtungsmodi für die Fluoreszenzbeobachtung und die regionale Markierung ausgestattet sind, in zellbiologischen Labors alltäglich werden. Letztlich haben diese Innovationen das Potenzial, bedeutende Fortschritte in der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Signalübertragungssystemen zu erzielen.

Fluoreszierende Proteinvektoren und Gentransfer

Fluoreszierende Proteine ​​sind sehr vielseitig und werden in fast allen biologischen Disziplinen von der Mikrobiologie bis zur Systemphysiologie erfolgreich eingesetzt. Diese allgegenwärtigen Sonden waren als Reporter für Genexpressionsstudien in kultivierten Zellen und Geweben sowie in lebenden Tieren äußerst nützlich. In lebenden Zellen werden fluoreszierende Proteine ​​am häufigsten verwendet, um die Lokalisation und Dynamik von Proteinen, Organellen und anderen Zellkompartimenten zu verfolgen. Eine Vielzahl von Techniken wurde entwickelt, um fluoreszierende Proteinfusionsprodukte zu konstruieren und ihre Expression in Säugetier- und anderen Systemen zu verstärken. Die primären Vehikel zur Einführung fluoreszierender chimärer Proteinsequenzen in Zellen sind gentechnisch veränderte bakterielle Plasmide und virale Vektoren.

Fluoreszierende Proteingen-Fusionsprodukte können in Säuger- und andere Zellen unter Verwendung des geeigneten Vektors (normalerweise ein Plasmid oder Virus) entweder vorübergehend oder stabil eingeführt werden. In transienten oder temporären Gentransfer-Experimenten (oft als vorübergehende Transfektion), in den Wirtsorganismus eingebrachte Plasmid- oder virale DNA nicht unbedingt in die Chromosomen integriert, sondern für kurze Zeit im Zytoplasma exprimiert werden kann. Die Expression von Genfusionsprodukten, die durch Beobachtung der Fluoreszenzemission unter Verwendung eines mit dem fluoreszierenden Protein kompatiblen Filtersatzes leicht überwacht werden kann, findet normalerweise über einen Zeitraum von mehreren Stunden nach der Transfektion statt und dauert 72 bis 96 Stunden nach Einführung der Plasmid-DNA in Säugerzellen . In vielen Fällen kann die Plasmid-DNA dauerhaft in das Genom eingebaut werden, um stabil transformierte Zelllinien zu bilden. Die Wahl der transienten oder stabilen Transfektion hängt von den Zielen der Untersuchung ab.

Abbildung 7 - EYFP-Lokalisierungsvektor für das endoplasmatische Retikulum

Die grundlegende Plasmidvektorkonfiguration, die in Experimenten zum Gentransfer mit fluoreszierendem Protein nützlich ist, weist mehrere erforderliche Komponenten auf. Das Plasmid muss prokaryontische Nukleotidsequenzen enthalten, die für einen bakteriellen Replikationsursprung für DNA und ein Antibiotikaresistenzgen kodieren. Diese Elemente, oft als bezeichnet pendeln Sequenzen ermöglichen die Vermehrung und Selektion des Plasmids innerhalb eines bakteriellen Wirts, um ausreichende Mengen des Vektors für Säugertransfektionen zu erzeugen. Außerdem muss das Plasmid ein oder mehrere eukaryontische genetische Elemente enthalten, die die Initiation der Messenger-RNA-Transkription kontrollieren, ein Säuger-Polyadenylierungssignal, ein Intron (optional) und ein Gen für die Co-Selektion in Säugerzellen. Transkriptionselemente sind für den Säugetierwirt notwendig, um das interessierende Genfusionsprodukt zu exprimieren, und das Selektionsgen ist normalerweise ein Antibiotikum, das Zellen, die das Plasmid enthalten, Resistenz verleiht. Diese allgemeinen Merkmale variieren je nach Plasmiddesign, und viele Vektoren haben ein breites Spektrum zusätzlicher Komponenten, die für bestimmte Anwendungen geeignet sind.

Illustriert in Abbildung 7 ist das Restriktionsenzym und die genetische Karte eines kommerziell erhältlichen (BD Biosciences Clontech) bakteriellen Plasmidderivats, das die kodierende Sequenz für das verstärkte gelb fluoreszierende Protein fusioniert mit der endoplasmatischen Retikulum-Targeting-Sequenz von Calreticulin (einem residenten Protein) enthält. Die Expression dieses Genprodukts in anfälligen Säugerzellen ergibt ein chimäres Peptid, das EYFP enthält, das im Membrannetzwerk des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist und speziell für die Fluoreszenzmarkierung dieser Organelle entwickelt wurde. Der Wirtsvektor ist eine Ableitung von pUC Plasmid mit hoher Kopienzahl (ca. 500), das den bakteriellen Replikationsursprung enthält, was es für die Reproduktion in spezialisierten . geeignet macht E coli Stämme. Das Kanamycin-Antibiotikum-Gen wird leicht in Bakterien exprimiert und verleiht Resistenz, um als selektierbarer Marker zu dienen.

Zusätzliche Merkmale des oben vorgestellten EYFP-Vektors sind ein humanes Cytomegalovirus (CMV) Promotor, um die Genexpression in transfizierten menschlichen und anderen Säugerzelllinien zu steuern, und an f1 Bakteriophagen-Replikationsursprung für die einzelsträngige DNA-Produktion. Das Vektorrückgrat enthält auch ein Affenvirus 40 (SV40) Replikationsstartpunkt, der in Säugerzellen aktiv ist, die das SV40 T-Antigen exprimieren. Selektion stabiler Transfektanten mit dem Antibiotikum G418 wird durch eine Neomycin-Resistenzkassette ermöglicht, die aus dem frühen SV40-Promotor, dem Neomycin-Resistenzgen (Aminoglykosid-3’-Phosphotransferase) und Polyadenylierungssignalen der Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus besteht (HSV-TK) für Messenger-Stabilität. Sechs einzigartige Restriktionsenzymstellen (siehe Abbildung 7) auf dem Plasmidrückgrat vorhanden sind, was die Vielseitigkeit dieses Plasmids erhöht.

Vermehrung, Isolierung und Transfektion von fluoreszierenden Proteinplasmiden

Erfolgreiche Säuger-Transfektionsexperimente beruhen auf der Verwendung hochwertiger Plasmid- oder viraler DNA-Vektoren, die relativ frei von bakteriellen Endotoxinen sind. Im nativen Zustand weisen zirkuläre Plasmid-DNA-Moleküle eine tertiäre supercoiled Konformation, die die Doppelhelix mehrmals um sich selbst dreht. Viele Jahre lang war die Methode der Wahl für die Reinigung von supercoiled Plasmid- und Virus-DNA die Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation in Gegenwart eines Interkalationsmittels (wie Ethidiumbromid oder Propidiumiodid). Diese Technik, die sowohl apparativ als auch materiell teuer ist, trennt die supercoiled (Plasmid-)DNA von linearer chromosomaler und eingekerbter zirkulärer DNA gemäß der Auftriebsdichte, was die Gewinnung hochreiner Plasmid-DNA ermöglicht. Kürzlich wurden vereinfachte Methoden der Ionenaustausch-Säulenchromatographie (allgemein als a . bezeichnet) Mini-Vorbereitung) haben das umständliche und zeitaufwendige Zentrifugationsprotokoll weitgehend ersetzt, um in relativ kurzer Zeit große Mengen an Endotoxin-freier Plasmid-DNA zu erhalten.

Spezialisierte Bakterienmutanten, genannt kompetent Zellen, wurden für eine bequeme und relativ billige Amplifikation von Plasmidvektoren entwickelt. Die Bakterien enthalten eine Palette von Mutationen, die sie besonders anfällig für die Plasmidreplikation machen, und wurden chemisch permeabilisiert, um die DNA durch die Membran und Zellwand in einem Verfahren namens . zu übertragen Transformation. Nach der Transformation werden die Bakterien in Gegenwart des vom Plasmid diktierten Selektionsantibiotikums bis zur logarithmischen Phase gezüchtet. Die Bakterienkultur wird durch Zentrifugation konzentriert und durch Lyse mit einer alkalischen Detergenslösung, die Enzyme enthält, um kontaminierende RNA abzubauen, aufgeschlossen. Das Lysat wird dann filtriert und auf die Ionenaustauschersäule gegeben. Unerwünschte Materialien, einschließlich RNA, DNA und Proteine, werden gründlich von der Säule gewaschen, bevor die Plasmid-DNA mit einem Hochsalzpuffer eluiert wird. Die Präzipitation mit Alkohol (Isopropanol) konzentriert die eluierte Plasmid-DNA, die durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in Puffer wieder aufgelöst wird. Die gereinigte Plasmid-DNA ist für Transfektionsexperimente einsatzbereit.

Abbildung 8 - Lipid-vermittelte Transfektion in Säugetierzellen

Säugerzellen, die für die Transfektion verwendet werden, müssen sich in einem ausgezeichneten physiologischen Zustand befinden und während des Verfahrens in einer logarithmischen Phase wachsen. Ein breites Spektrum von Transfektionsreagenzien wurde kommerziell entwickelt, um die Aufnahme von Plasmid-DNA durch kultivierte Zellen zu optimieren. Diese Techniken reichen von der einfachen Calciumphosphat-Präzipitation bis zur Sequestrierung der Plasmid-DNA in Lipidvesikeln, die mit der Zellmembran fusionieren und den Inhalt an das Zytoplasma abgeben (wie in Abbildung 8). Zusammenfassend bezeichnet Lipofektion, hat sich die lipidbasierte Technologie aufgrund ihrer Wirksamkeit in einer Vielzahl beliebter Zelllinien auf breite Akzeptanz gestoßen und ist heute die Methode der Wahl für die meisten Transfektionsexperimente.

Obwohl transiente Transfektionen in der Regel über einen relativ kurzen Zeitraum (mehrere Tage) zum Verlust des Plasmid-Genprodukts führen, produzieren stabil transfizierte Zelllinien die Gastproteine ​​kontinuierlich und langfristig (von Monaten bis Jahren). Stabile Zelllinien können mit antibiotischen Markern selektiert werden, die im Plasmidrückgrat vorhanden sind (siehe Abbildung 7). Eines der beliebtesten Antibiotika zur Selektion stabiler Transfektanten in Säugerzelllinien ist das die Proteinsynthese hemmende Medikament G418, aber die erforderliche Dosis variiert stark je nach Zelllinie. Andere gängige Antibiotika, einschließlich Hydromycin-B und Puromycin, wurden ebenso für die stabile Zellselektion entwickelt wie genetische Marker. Das effizienteste Verfahren zum Erhalten stabiler Zelllinien besteht darin, eine hocheffiziente Technik für die anfängliche Transfektion zu verwenden. In dieser Hinsicht, Elektroporation hat sich bewährt, stabile Transfektanten mit linearisierten Plasmiden und gereinigten Genen zu erzeugen. Bei der Elektroporation werden kurze Hochspannungsimpulse an eine Zellsuspension angelegt, um die Porenbildung in der Plasmamembran zu induzieren, wodurch anschließend die Transfektions-DNA in die Zelle eindringen kann. Für die Elektroporation ist eine spezielle Ausrüstung erforderlich, jedoch ist die Technik in den Kosten mit Lipofektionsreagenzien vergleichbar, wenn eine große Anzahl von Transfektionen durchgeführt wird.

Die Zukunft fluoreszierender Proteine

Der Fokus der aktuellen Entwicklung fluoreszierender Proteine ​​liegt auf zwei grundlegenden Zielen. Die erste besteht darin, die aktuelle Palette von blau bis gelb fluoreszierenden Proteinen zu perfektionieren und zu verfeinern, die von Aequorea victoria Quallen, während das zweite Ziel darin besteht, monomere fluoreszierende Proteine ​​zu entwickeln, die im orangen bis tiefroten Bereich des sichtbaren Lichtspektrums emittieren. Die Fortschritte auf dem Weg zu diesen Zielen sind beeindruckend, und es ist nicht undenkbar, dass im nahen Infrarot fluoreszierende Proteine ​​am Horizont auftauchen.

Die neueste Generation von Quallenvarianten hat die meisten Mängel der fluoreszierenden Proteine ​​der ersten Generation behoben, insbesondere bei den gelben und grünen Derivaten. Die Suche nach einem monomeren, leuchtenden und schnell reifenden rot fluoreszierenden Protein hat zu mehreren neuen und interessanten Klassen von fluoreszierenden Proteinen geführt, insbesondere solchen, die aus Korallenarten stammen. Die Entwicklung bestehender fluoreszierender Proteine ​​zusammen mit neuen Technologien, wie dem Einbau nichtnatürlicher Aminosäuren, wird die Farbpalette weiter erweitern. Mit zunehmender Entwicklung und Verbreitung optischer spektraler Trenntechniken werden diese neuen Sorten die bestehende Palette ergänzen, insbesondere in den gelben und roten Bereichen des Spektrums.

Der aktuelle Trend in der Fluoreszenzsondentechnologie besteht darin, die Rolle von Farbstoffen zu erweitern, die bis ins ferne Rot und nahes Infrarot fluoreszieren. In Säugerzellen sind sowohl die Autofluoreszenz als auch die Lichtabsorption am roten Ende des Spektrums stark reduziert. Daher wäre die Entwicklung von tiefroten Fluoreszenzsonden für die Untersuchung dicker Proben und ganzer Tiere äußerst nützlich. Angesichts des Erfolgs von fluoreszierenden Proteinen als Reporter in transgenen Systemen wird der Einsatz von tiefrot fluoreszierenden Proteinen in ganzen Organismen in den kommenden Jahren immer wichtiger.

Schließlich wird das enorme Potenzial fluoreszierender Proteinanwendungen für die Entwicklung von Biosensoren gerade erst erkannt. Die Zahl der Biosensor-Konstrukte wächst rasant. Durch die Nutzung struktureller Informationen hat die Entwicklung dieser Sonden zu einer verbesserten Sensitivität geführt und wird dies auch weiterhin tun. Der Erfolg dieser Bemühungen deutet sicherlich darauf hin, dass fast jeder biologische Parameter mit dem geeigneten fluoreszierenden Protein-basierten Biosensor gemessen werden kann.

Beitragende Autoren

David W. Kolben - Abteilung für Molekulare Physiologie und Biophysik, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, 37232.

George H. Patterson und Jennifer Lippincott-Schwartz - Abteilung für Zellbiologie und Stoffwechsel, Nationales Institut für Kindergesundheit und menschliche Entwicklung, Nationale Gesundheitsinstitute, Bethesda, Maryland, 20892.

Nathan S. Claxton und Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

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ORIGINAL FORSCHUNGSPAPIERE

Coons, A.H., Creech, H.J. & Jones, R.N. Immunologische Eigenschaften eines Antikörpers, der eine fluoreszierende Gruppe enthält. Proz. Soz. Erw. Biol. Med. 47, 200–202 (1941)

Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. & Berliner, E. Der Nachweis von Pneumokokken-Antigen in Geweben durch die Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern. J. Immunol. 45, 159–170 (1942)

WEITERLESEN

Coons, A. H. & Kaplan, M. H. Lokalisation von Antigen in Gewebezellen: Verbesserungen eines Verfahrens zum Nachweis von Antigen mittels fluoreszierender Antikörper. J. Erw. Med. 91, 1–13 (1950)

Coons, A. H. Die Anfänge der Immunfluoreszenz. J. Immunol. 87, 499–503 (1961)


Wissensbasiertes Design reagenzfreier fluoreszierender Biosensoren aus rekombinanten Antikörpern

Die Möglichkeit, von jedem Antikörper ein fluoreszierendes Konjugat zu erhalten, das auf die Bindung des Antigens durch eine Variation seiner Fluoreszenz reagiert, wäre für die analytischen Wissenschaften und für die Konstruktion von Proteinchips von großem Interesse. Diese Möglichkeit wurde mit dem Antikörper mAbD1.3 untersucht, der gegen Hühnereiweiß-Lysozym gerichtet ist. Designregeln wurden entwickelt, um die Reste des Antikörpers zu identifizieren, an die ein Fluorophor chemisch gekoppelt werden könnte, nachdem sie durch Mutagenese in Cystein umgewandelt wurden. Diese Regeln beruhten auf: dem Zielrest, der zu einer topologischen Nachbarschaft des Antigens in der Struktur des Komplexes zwischen Antikörper und Antigen gehört, seiner Abwesenheit von funktioneller Bedeutung für die Interaktion mit dem Antigen und seiner Lösungsmittelzugänglichkeit in der Struktur des freien Antikörpers. Siebzehn Konjugate zwischen dem einzelkettigen variablen Fragment scFv von mAbD1.3 und einem umweltempfindlichen Fluorophor wurden konstruiert. Für sechs der zehn Reste, die die Designregeln vollständig erfüllten, lag die relative Variation der Fluoreszenzintensität zwischen dem freien und dem gebundenen Zustand des Konjugats zwischen 12 und 75 % (in nicht optimalem Puffer) und die Affinität des Konjugats für Lysozym blieb im Vergleich zum elterlichen scFv unverändert. Im Gegensatz dazu trafen solche Ergebnisse nur für einen der sieben Reste zu, die eine der Regeln nicht erfüllten und als Kontrollen verwendet wurden. Eines der Konjugate wurde genauer untersucht. Seine Fluoreszenz stieg proportional zur Konzentration von Lysozym im nanomolaren Bereich, bis zu 90 % in einem definierten Puffer und 40 % im Serum. Dieser Anstieg war spezifisch für Hühnerei-Lysozym und wurde bei einem eng verwandten Protein, Putenei-Lysozym, nicht beobachtet. Die Reste, die funktionsfähige Konjugate ergaben (sechs in VL und einer in Vh) befanden sich in unmittelbarer Nähe von funktionell wichtigen Resten entlang der Sequenz von FvD1.3. Die Ergebnisse legen Konstruktionsregeln für die Konstruktion von Antigen-sensitiven fluoreszierenden Konjugaten aus einem beliebigen Antikörper in Abwesenheit von Strukturdaten nahe.