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Bindung eines Makromoleküls M an ein kleines Molekül L - Biologie

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Bindung eines Makromoleküls M an ein kleines Molekül L

GSK4112, eine niedermolekulare chemische Sonde für die Zellbiologie des nukleären Hämrezeptors Rev-erbα

Die Identifizierung von Nicht-Porphyrin-Liganden für den nuklearen Orphan-Rezeptor Rev-erbα wird Untersuchungen seiner Rolle als Häm-Sensor und Regulator der metabolischen und zirkadianen Signalübertragung ermöglichen. Wir beschreiben die Entwicklung eines biochemischen Assays, der die Interaktion zwischen Rev-erbα und einem Peptid des nuklearen Rezeptors Corepressor-1 (NCoR) misst. Der Assay wurde verwendet, um einen kleinen Molekülliganden für Rev-erbα, GSK4112 (1), zu identifizieren, der mit Häm kompetitiv war. In Zellen, 1 als Rev-erbα-Agonist in Zellen profiliert, um die Expression des zirkadianen Zielgens bmal1 zu hemmen. Darüber hinaus unterdrückte 1 die Expression glukoneogener Gene in Leberzellen und reduzierte die Glukoseproduktion in primären Hepatozyten. Daher ist 1 als chemisches Werkzeug nützlich, um die Funktion von Rev-erbα bei der Transkriptionsrepression, der Regulation der zirkadianen Biologie und bei Stoffwechselwegen zu untersuchen. Außerdem kann 1 als Ausgangspunkt für das Design chemischer Rev-erbα-Sonden mit pharmakologischer In-vivo-Aktivität dienen.


Kleinmolekül-Targeting der MUSASHI-RNA-Bindungsaktivität bei akuter myeloischer Leukämie

Die MUSASHI (MSI)-Familie von RNA-bindenden Proteinen (MSI1 und MSI2) trägt zu einem breiten Spektrum von Krebsarten einschließlich akuter myeloischer Leukämie bei. Wir stellen fest, dass das kleine Molekül Ro 08-2750 (Ro) direkt und selektiv an MSI2 bindet und in biochemischen Assays um seine RNA-Bindung konkurriert. Die Ro-Behandlung in myeloischen Leukämiezellen der Maus und des Menschen führt zu einer Erhöhung der Differenzierung und Apoptose, Hemmung bekannter MSI-Targets und einer gemeinsamen globalen Genexpressionssignatur ähnlich der ShRNA-Depletion von MSI2. Ro zeigt eine In-vivo-Hemmung von c-MYC und reduziert die Krankheitslast in einem murinen AML-Leukämiemodell. Somit identifizieren wir ein kleines Molekül, das auf die onkogene Aktivität von MSI abzielt. Unsere Studie bietet einen Rahmen für das Targeting von RNA-bindenden Proteinen bei Krebs.

Interessenkonflikt-Erklärung

J.D.C. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Schrödinger. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Figuren

Ro 08–2750 (Ro) ist ein selektiver MSI-RNA-bindender Aktivitätsinhibitor. ein Fluoreszenzpolarisation…

Ro interagiert mit der RNA-Erkennung…

Ro interagiert mit dem RNA-Erkennungsmotiv 1 (RRM1) von MSI2. ein Proteinoberfläche…

Ro 08–2750 erhöht die Differenzierung und…

Ro 08–2750 erhöht die Differenzierung und Apoptose in myeloischen Leukämiezellen. ein Zytotoxizitätstest…

Ro 08–2750 Behandlung hemmt das Überleben…

Die Behandlung mit Ro 08-2750 hemmt das Überleben von menschlichen AML-Zelllinien und Patientenzellen.…

Ro 08–2750 Behandlung entspricht…

Die Behandlung mit Ro 08–2750 entspricht der MSI2-shRNA-depletierten Gensignatur. ein Schema von…

Ro 08-2750 zeigt Wirksamkeit bei…

Ro 08–2750 zeigt die Wirksamkeit in einem MLL-AF9-In-vivo-Modell. ein Schema von…


Einführung

Ribonukleinsäuren (RNAs) spielen eine zentrale Rolle bei vielen zellulären Prozessen wie der Übertragung genetischer Informationen, der Wahrnehmung und Kommunikation von Reaktionen auf zelluläre Signale und sogar der Katalyse chemischer Reaktionen [1]. Diese Prozesse werden oft durch andere Moleküle wie Ionen oder kleine Moleküle moduliert, was RNA zu einem attraktiven therapeutischen Ziel für neue Medikamente macht [2–4]. Ein gut untersuchtes und klinisch validiertes Beispiel ist das bakterielle Ribosom, ein molekularer Angriffspunkt vieler Antibiotika [5]. Riboswitches, eine Klasse regulatorischer RNA-Strukturelemente, die in untranslatierte Regionen von mRNAs eingebettet sind, umfassen eine weitere interessante Gruppe von RNA-Targets. Diese Strukturelemente können einen Liganden direkt binden, um die Genfunktion zu regulieren, ohne dass Protein-Cofaktoren erforderlich sind [6,7]. Riboswitches sind in Bakterienzellen weit verbreitet und kommen selten in eukaryontischen Zellen vor, was sie zu geeigneten Angriffspunkten für neue antibakterielle Medikamente macht. Ein gut untersuchtes Beispiel ist der FMN-Riboswitch, der die Expression von Genen steuert, die für die Biosynthese und den Transport von Riboflavin (Vitamin B2) in Bakterien benötigt werden [8]. Mehrere niedermolekulare Inhibitoren des FMN-Riboswitch mit nachgewiesenen antibakteriellen Eigenschaften wurden identifiziert. Einige dieser niedermolekularen Inhibitoren umfassen Verbindungen wie Roseoflavin [9,10] oder 5FDQD [11], die dem natürlichen Liganden strukturell ähnlich sind, sowie strukturell unähnliche Liganden mit einem anderen Chemotyp, zum Beispiel Ribocil und seine Derivate [ 12]. Andere medizinisch relevante RNAs sind neben Riboswitches virale RNAs (Dimerisierungs-Initiationsstelle der HIV-1-RNA [13]), selbstspleißende Gruppe-I-Introns (z td Intron-RNA [14]), Gruppe-II-Introns (z. B. Inhibitoren des Gruppe-IIB-Intron-Spleißens [15]) und virale Ribozyme (z. B. Hepatitis-D-Virus-Ribozym-Hemmung durch Aminoglykoside [16]) (für Details siehe [17]) .

Die Aufklärung der Rolle von RNA-Ligand-Wechselwirkungen und das Design neuer RNA-bindender Moleküle können durch die Analyse dreidimensionaler (3D) Strukturen der interessierenden RNA oder ihres Komplexes mit einem Liganden erleichtert werden. Leider ist die experimentelle Bestimmung von 3D-Strukturen eine intensive Aufgabe und muss oft durch computergestützte Modellierung [18] unterstützt oder vollständig durchgeführt werden in silico (Übersicht über Methoden zur Modellierung von Ribonukleinsäure-Ligand-Wechselwirkungen siehe: [19]). Diese Einschränkungen, zusammen mit einem zunehmenden Interesse an RNA als Ziel für therapeutische Interventionen, verdeutlichen die Notwendigkeit, neue Methoden zur Vorhersage der 3D-Struktur von RNA-Ligand-Komplexen zu entwickeln.

Eine der am häufigsten verwendeten Computermethoden zur Vorhersage der 3D-Strukturen von Makromolekülen mit Liganden ist das molekulare Andocken [20,21]. Viele der derzeit verfügbaren Docking-Programme wurden ursprünglich für das Protein-Protein- oder Protein-Ligand-Docking entwickelt (z. B. als AutoDock [22], AutoDock Vina [23], ICM [24] oder iDock [25]), während einige von ihnen wurden später angepasst oder umparametriert, um das Andocken von RNA-Liganden zu ermöglichen, wobei RNA als Rezeptor spezifiziert ist (Dock6, [26], ICM [27] oder AutoDock [28]). Einige Programme wurden speziell für das Andocken von Liganden an RNA entwickelt und optimiert. MORDOR ermöglicht sowohl Liganden- als auch Rezeptorflexibilität und verwendet eine Bewertungsfunktion, die die Gesamtenergie der Komplexe abschätzt und aus mehreren Termen besteht (elektrostatisch, van der Waals, Diederwinkel, Torsionswinkel, Bindung und Urey-Bradley) [29]. rDock (früher: RiboDock) besteht aus einer stochastischen Suchmaschine mit genetischem Algorithmus als Posengenerator und einer intermolekularen Bewertungsfunktion, die gegen Protein- und RNA-Ziele validiert wurde [30,31]. Die Hauptkomponente dieser Bewertungsfunktion ist ein Van-der-Waals-Potential, ein empirischer Begriff für anziehende und abstoßende polare Wechselwirkungen, und ein optionales Desolvatationspotential, das einen gewichteten lösungsmittelzugänglichen Oberflächenansatz kombiniert. Das rDock-Programm kann auch zum erneuten Bewerten von Posen verwendet werden, die von einem externen Tool generiert wurden.

In einem Portfolio von Methoden, die die Vorhersage von 3D-RNA-Ligand-Strukturen erleichtern, gibt es auch eigenständige Bewertungsfunktionen, die für RNA-Ligand-Komplexe spezifisch sind und für die Bewertung von Modellen verwendet werden sollen, die durch molekulares Andocken generiert wurden. Eine eigene Gruppe solcher Methoden bilden statistische Potenziale (statistische Scoring-Funktionen oder wissensbasierte Potenziale), die aus einer Analyse experimentell gelöster Strukturen abgeleitet werden. Pfeffer und Gohlke entwickelten eine Bewertungsfunktion namens DrugScore RNA , die ein abstandsabhängiges Potenzial verwendet, das auf der Grundlage von Kontakten zwischen Liganden- und Rezeptoratomen berechnet wird [32]. Beide Interaktionspartner sind in All-Atom-Darstellung unter Verwendung von Tripos-Atomtypen. Ähnlich ist eine KScore-Bewertungsfunktion, beschrieben von Zhao et al., ist ebenfalls ein abstandsabhängiges Potential, das zusätzlich zum Standardsatz von Tripos-Atomtypen einen erweiterten Atomtypensatz verwendet, um die Metall-Ligand- und Wasser-Ligand-Wechselwirkungen besser zu charakterisieren. Es definiert ebenfalls ein spezielles Atomtypisierungsschema für Nukleinsäuren und wurde auf Ligandenkomplexe mit Proteinen (2422 Komplexe), DNA (300 Komplexe) und RNA (97 Komplexe) parametrisiert. Yan und Wang beschrieben eine abstandsabhängige Bewertungsfunktion namens SPA-LN, bei der Tripos-Atomtypen für die RNA- und Ligandendarstellung verwendet werden [33]. Bei der Optimierung der Parameter konzentrierten sie sich nicht nur auf die Rekapitulation der nahezu nativen Pose des Liganden, sondern auch auf die Affinitätsabschätzung. Die Verbesserung der Affinitätsvorhersagen war ein Ziel von Chen et al., Autoren der Funktionen iMDLScore1 und iMDLScore2 [34]. Sie optimierten AutoDock4.1-Scoring-Terme mit multilinearen Regressionsmethoden und Bindungsaffinitätsdaten für 45 RNA-Komplexe. Unsere Gruppe entwickelte LigandRNA – ein anisotropes abstands- und winkelabhängiges statistisches Potenzial [35]. Es wurde aus einem diversifizierten Satz von 251 experimentell gelösten RNA-Ligand-Komplexen abgeleitet und verwendet die Gesamtatomdarstellung mit Tripos-Atomtypen. Es wurde gezeigt, dass es den zuvor beschriebenen Bewertungsfunktionen in Bezug auf die Genauigkeit beim Auffinden einer nahezu nativen Konformation von Liganden überlegen ist. Chhabra et al. in den RNAPosers verwendeten einen entfernungsabhängigen Fingerabdruck, um eine Bindungspose eines Liganden in der RNA-Bindungstasche zu beschreiben [36]. Daten aus 80 experimentell gelösten RNA-Ligand-Komplexen wurden verwendet, um einen maschinellen Lernalgorithmus zu trainieren, der dann verwendet wurde, um Docking-Posen einzuordnen. Ähnlich wie die oben beschriebenen Programme verwendet RNAPosers eine All-Atom-Darstellung mit Tripos-Atomtypen.

In dieser Studie beschreiben wir AnnapuRNA, eine neue wissensbasierte Bewertungsfunktion zur Bewertung komplexer RNA-Ligand-Strukturen, die durch eine beliebige computergestützte Docking-Methode generiert wird. Wir präsentieren auch einen Benchmark, in dem wir AnnapuRNA mit anderen verfügbaren Scoring-Funktionen vergleichen. Wir präsentieren eine Fallstudie, in der wir molekulares Docking in Kombination mit der AnnapuRNA-Scoring-Funktion verwendet haben, um eine kürzlich veröffentlichte Struktur eines FMN-Riboschalters, der mit einem neuen niedermolekularen Inhibitor kokristallisiert wurde, vorherzusagen. Unsere Methode hat die Struktur dieses Komplexes basierend auf der zuvor veröffentlichten Struktur von FMN im Komplex mit einem anderen Liganden sowie der niedrigaufgelösten Apo-Struktur dieser RNA erfolgreich vorhergesagt.

AnnapuRNA ist für die wissenschaftliche Gemeinschaft unter https://github.com/filipspl/AnnapuRNA frei verfügbar.


Ein kleines RAS-Mimetikum unterbricht die RAS-Assoziation mit Effektorproteinen, um die Signalübertragung zu blockieren

Die onkogene Aktivierung von RAS-Genen über Punktmutationen tritt bei 20-30% der menschlichen Krebserkrankungen auf. Die Entwicklung wirksamer RAS-Inhibitoren war eine Herausforderung und erforderte neue Ansätze zur Hemmung dieses onkogenen Proteins. Funktionelle Studien haben gezeigt, dass die Schalterregion von RAS mit einer Vielzahl von Effektorproteinen interagiert, die eine gemeinsame RAS-Bindungsdomäne (RBD) enthalten. Da RBD-vermittelte Interaktionen für die RAS-Signalgebung essentiell sind, stellt die Blockierung der RBD-Assoziation mit kleinen Molekülen einen attraktiven therapeutischen Ansatz dar. Hier präsentieren wir Beweise dafür, dass Rigosertib, ein Styryl-Benzylsulfon, als RAS-Mimetikum wirkt und mit den RBDs von RAF-Kinasen interagiert, was dazu führt, dass sie nicht an RAS binden können, die RAF-Aktivierung unterbrochen und das RAS-RAF . gehemmt wird -MEK-Pfad. Wir finden auch, dass Ribosertib an die RBDs von Ral-GDS und PI3Ks bindet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die gezielte Ansteuerung von RBDs über mehrere Signalwege durch Rigosertib eine wirksame Strategie zur Inaktivierung des RAS-Signalwegs darstellen könnte.

Schlüsselwörter: MAPK PI3K RAF RAS RAS-bindende Domäne Rigosertib.

Copyright © 2016 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Figuren

Abbildung 1. Rigosertib bindet an die RBDs…

Abbildung 1. Rigosertib bindet an die RBDs von c-RAF und B-RAF

Abbildung 2. NMR-Analyse des B-RAF…

Abbildung 2. NMR-Analyse der B-RAF RBD-Rigosertib-Wechselwirkung: Chemische Verschiebungsstörungsstudien und NMR…

Abbildung 3. Rigosertib interagiert mit dem β1…

Abbildung 3. Rigosertib interagiert mit dem β1-Strang, β2-Strang und der α1-Helix des…

Abbildung 4. Rigosertib interferiert mit Wachstumsfaktor-induzierten…

Abbildung 4. Rigosertib interferiert mit Wachstumsfaktor-induzierter RAF-Dimerisierung und MEK/ERK-Aktivierung

Abbildung 5. Behandlung menschlicher Tumorzellen…

Abbildung 5. Die Behandlung menschlicher Tumorzellen mit Rigosertib hemmt die c-RAF-Ser338-Phosphorylierung und hemmt…

Abbildung 6. Rigosertib hemmt die RAS-vermittelte Transformation und…

Abbildung 6. Rigosertib hemmt die RAS-vermittelte Transformation und das Tumorwachstum

(A) Rigosertib hemmt die Transformation von Hühnern…

Abbildung 7. Behandlung mit Rigosertib unterdrückt die…

Abbildung 7. Behandlung mit Rigosertib unterdrückt das Wachstum von RAS-getriebener intraepithelialer Pankreasneoplasie


Abstrakt

Ein alternativer Ansatz zur Förderung der Kristallisation von Proteinen besteht darin, intermolekulare Kontakte zwischen Makromolekülen zu verstärken oder intermolekulare Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen mit Lösungsmitteln zu eliminieren, die die Kristallisation hemmen könnten. Ortsspezifische Mutationen wurden ebenso verwendet wie Verkürzungen durch genetische oder proteolytische Mittel. Es gibt jedoch erhebliche Probleme. Da die Struktur des Zielmakromoleküls unbekannt ist, gibt es möglicherweise keine gute Grundlage für das Design von Mutanten oder Verkürzungen. Darüber hinaus erfordert der Ansatz, dass das Protein durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wird, was häufig nicht der Fall ist. Wir haben versucht, diese Probleme zu lösen, indem wir Experimente initiiert haben, die auf zwei Ideen basieren. Der erste besteht darin, dass während des Kristallisationsscreenings eine Vielzahl konventioneller kleiner Moleküle systematisch in Mutterlaugen eingeführt werden könnte. Durch den Einbau in das Kristallgitter könnten die zusätzlichen intermolekularen Wechselwirkungen, die die kleinen Moleküle bereitstellen, die Kristallkeimbildung und das Kristallwachstum fördern. Ein zweiter Ansatz, den wir verfolgen, ist die chemische Modifikation verschiedener Aminosäureseitenketten mit Hilfe der klassischen Proteinchemie. Wir glauben, dass in einigen Fällen chemisch modifizierte Proteine ​​dazu gebracht werden könnten, besser zu kristallisieren als das native Protein.


Ein kleines Molekül, das auf die mutagene Transläsionssynthese abzielt, verbessert die Chemotherapie

Intrinsische und erworbene Arzneimittelresistenzen sowie die Induktion sekundärer Malignome schränken eine erfolgreiche Chemotherapie ein. Da die mutagene Transläsionssynthese (TLS) sowohl zur Chemoresistenz als auch zu behandlungsinduzierten Mutationen beiträgt, ist das Targeting von TLS ein attraktiver Weg zur Verbesserung von Chemotherapeutika. Die Entwicklung kleiner Moleküle mit hoher Spezifität und In-vivo-Wirksamkeit für mutagenes TLS war jedoch eine Herausforderung. Hier berichten wir über die Entdeckung eines niedermolekularen Inhibitors, JH-RE-06, der mutagenes TLS stört, indem er die Rekrutierung von mutagenem POL ζ verhindert. Bemerkenswerterweise zielt JH-RE-06 auf eine nahezu strukturlose Oberfläche von REV1, die mit der REV7-Untereinheit von POL ζ interagiert. Die Bindung von JH-RE-06 induziert die REV1-Dimerisierung, die die REV1-REV7-Interaktion und die POL--Rekrutierung blockiert. JH-RE-06 hemmt mutagenes TLS und verstärkt die Cisplatin-induzierte Toxizität in kultivierten menschlichen und Mauszelllinien. Die gleichzeitige Verabreichung von JH-RE-06 mit Cisplatin unterdrückt das Wachstum von humanen Xenotransplantat-Melanomen bei Mäusen und schafft einen Rahmen für die Entwicklung von TLS-Inhibitoren als eine neue Klasse von Chemotherapie-Adjuvanzien.

Schlüsselwörter: POL ζ REV1 REV7 Chemoresistenz Chemotherapie Cisplatin-Transläsionssynthese.

Copyright © 2019 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Interessenkonflikt-Erklärung

P.Z. und J. H. sind Erfinder eines Patents auf JH-RE-06. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Figuren

Abbildung 1.. Entdeckung und Charakterisierung von JH-RE-06,…

Abbildung 1.. Entdeckung und Charakterisierung von JH-RE-06, einem niedermolekularen Inhibitor, der die REV1…

Abbildung 2. Strukturelle und biochemische Charakterisierung von…

Abbildung 2. Strukturelle und biochemische Charakterisierung des cREV1-CTD/JH-RE-06-Komplexes.

Abbildung 3.. JH-RE-06 erhöht die Zytotoxizität von Cisplatin und…

Abbildung 3. JH-RE-06 verstärkt die Zytotoxizität von Cisplatin und unterdrückt die durch Cisplatin induzierte Mutagenese.

Zellen wurden mit DMSO behandelt…

Abbildung 4.. JH-RE-06 sensibilisiert Zellen für Cisplatin…

Abbildung 4. JH-RE-06 sensibilisiert Zellen gegenüber Cisplatin und reduziert HPRT-Mutationen in REV1-abhängiger Weise.

Abbildung 5.. JH-RE-06 verbessert die Reaktion von Tumorzellen…

Abbildung 5. JH-RE-06 verbessert die Tumorzellantwort auf Cisplatin in einem Xenotransplantat-Mausmodell.


Abstrakt

Die zellulären Prozesse, die dem Leben zugrunde liegen, werden durch Proteine ​​und ihre Interaktionen orchestriert. Die damit verbundene strukturelle und dynamische Heterogenität stellt, obwohl sie funktionsentscheidend ist, eine grundlegende Herausforderung für bestehende analytische und strukturelle Methoden dar. Wir haben interferometrische Streumikroskopie verwendet, um die Masse einzelner Biomoleküle in Lösung mit einer Sequenzmassengenauigkeit von 2%, einer Auflösung von bis zu 19 Kilodalton und einer Präzision von 1 Kilodalton zu quantifizieren. Wir haben oligomere Verteilungen im hohen Dynamikbereich aufgelöst, die Bindung kleiner Moleküle nachgewiesen und Proteine ​​mit assoziierten Lipiden und Zuckern in Massenabbildungen abgebildet. Diese Fähigkeiten ermöglichten es uns, die molekulare Dynamik so unterschiedlicher Prozesse wie die Vernetzung von Glykoproteinen, die amyloidogene Proteinaggregation und die Aktinpolymerisation zu charakterisieren. Die interferometrische Streu-Massenspektrometrie ermöglicht die räumlich-zeitlich aufgelöste Messung eines breiten Spektrums biomolekularer Wechselwirkungen, ein Molekül nach dem anderen.

Biomolekulare Wechselwirkungen und Anordnungen sind von zentraler Bedeutung für eine Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse, die Längenskalen von kleinen Komplexen (1) bis zur Mesoskala (2, 3). Trotz erheblicher Entwicklungen bei Techniken, die hochauflösende Strukturinformationen liefern können (4) sind solche Techniken typischerweise statisch, beinhalten eine Mittelung über viele Moleküle in der Probe und erfassen daher oft die Vielfalt der Strukturen und Wechselwirkungen nicht vollständig. Lösungsbasierte Ensemble-Methoden ermöglichen dynamische Studien, aber es fehlt die Auflösung der Trennung, die erforderlich ist, um verschiedene Arten zu unterscheiden (57). Einzelmolekülmethoden bieten eine Möglichkeit, Heterogenität in Struktur und Dynamik zu umgehen, und Fortschritte wurden bei der Charakterisierung von Wechselwirkungen erzielt (8) und Mechanismen (9, 10). Bisher war jedoch kein Einzelmolekülansatz in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungen von Biomolekülen mit der erforderlichen raumzeitlichen Genauigkeit und Auflösung zu quantifizieren und zu verfolgen.

Bei ausreichender Empfindlichkeit ist die Lichtstreuung aufgrund ihrer universellen Anwendbarkeit ein ideales Mittel zum Nachweis und zur Charakterisierung von Molekülen unter streuarmen in vitro-Bedingungen. In einem interferometrischen Detektionsschema (Abb. 1A) skaliert das Streusignal mit der Polarisierbarkeit, die eine Funktion des Brechungsindex und proportional zum Partikelvolumen ist (11). Kombiniert man die Näherung, dass sich einzelne Aminosäuren effektiv wie einzelne Nanoobjekte verhalten, mit der Beobachtung, dass die spezifischen Volumina von Aminosäuren und Brechungsindizes von Proteinen nur um

1% (Abb. S1 und Tabelle S1) legt nahe, dass die Anzahl der Aminosäuren in einem Polypeptid und damit seine Masse proportional zu seinem Streusignal sind. Diese enge Beziehung zwischen Masse und interferometrischem Kontrast, die vorhergesagt wurde (12, 13) und beobachtet (14, 15) auch auf Einzelmolekülebene grob zu halten, könnte somit prinzipiell zur Erzielung einer hohen Massengenauigkeit verwendet werden.

(EIN) Schema des experimentellen Ansatzes, der auf der Immobilisierung einzelner Moleküle in der Nähe einer Brechungsindexgrenzfläche beruht. Oligomere Zustände sind aus Gründen der Klarheit unterschiedlich gefärbt. (B) Differentielles interferometrisches Streubild von BSA. Maßstabsleiste, 0,5 µm. (C) Repräsentative Bilder von Monomeren (oben links), Dimeren (unten links), Trimeren (oben rechts) und Tetrameren (unten rechts) von BSA. Maßstabsbalken, 200 nm. (D) Streudiagramm von Einzelmolekül-Bindungsereignissen und ihren Streukontrasten für 12 nM BSA aus 14 Filmen (unteres Feld). Entsprechendes Histogramm (n = 12.209) mit einer vergrößerten Ansicht der Region für größere Arten (oberes Bild). Die Verringerung der Landerate resultiert aus einer zeitlichen Abnahme der BSA-Konzentration aufgrund des großen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisses unserer Probenzelle (Ergänzungsmaterialien).

Aufbauend auf den jüngsten Fortschritten im experimentellen Ansatz (Abb. S2), der die Bildkontraste für die interferometrische Streumikroskopie verbessert (15, 16) konnten wir qualitativ hochwertige Bilder einzelner Proteine ​​erhalten, die aus der Lösung diffundierten, um unspezifisch an die Grenzfläche Deckglas/Lösung des Mikroskops zu binden (Abb. 1, B und C sowie Film S1). Erreichen von Signal-Rausch-Verhältnissen >10, auch für kleine Proteine ​​wie Rinderserumalbumin (BSA), zusammen mit einem optimierten Datenanalyseansatz (16), ermöglichte es uns, den Streukontrast für jedes molekulare Bindungsereignis mit hoher Präzision zu extrahieren (Abb. 1D und Abb. S3). Diese Daten zeigten klare Signaturen verschiedener oligomerer Zustände von BSA mit relativen Häufigkeiten von Monomer zu Tetramer von 88,63, 9,94, 1,18 und 0,25% der nachgewiesenen Partikel. Für die unspezifische Bindung an ein unfunktionalisiertes Mikroskop-Deckglas war die Oberflächenanhaftung effektiv irreversibel (12.209 Bindung gegenüber 372 Entbindungsereignissen). Als Ergebnis konnten wir (große) Bindungsgeschwindigkeitskonstanten bestimmen, die im Allgemeinen nur geringe Variationen mit dem oligomeren Zustand aufwiesen. Diese könnten angepasst werden, um kleinere Korrekturen der aufgenommenen Massenspektren zu erhalten und die Lösungsverteilung zu erhalten (Abb. S4). Unsere Ergebnisse, einschließlich der Detektion und Quantifizierung seltener Komplexe wie BSA-Tetrameren, demonstrieren die Fähigkeit der interferometrischen Streumassenspektrometrie (iSCAMS), Lösungsverteilungen von oligomeren Spezies und molekularen Komplexen im hohen dynamischen Bereich zu charakterisieren.

Der regelmäßige Abstand im Kontrasthistogramm von BSA bestätigt vorläufig die erwartete lineare Skalierung zwischen Masse und interferometrischem Kontrast. Das Wiederholen dieser Messungen für acht verschiedene Proteine, die 53 bis 803 kDa umfassen, validiert die lineare Beziehung ( 2A und 5A ). Die Abweichung zwischen gemessener und Sequenzmasse betrug <5 kDa, was zu einem durchschnittlichen Fehler von 1,9 % führte, und diese Abweichung zeigte keine nachweisbare Korrelation mit der Brechkraft in Bezug auf die Gesamtform des Moleküls (Abb. S6A). Selbst bei großen strukturellen Unterschieden, wie z. B. zwischen den ausgedehnten und gefalteten Konformationen von Myosin der glatten Muskulatur (530,6 kDa Abb. 2A und Abb. S5B und S7), fanden wir keine messbaren Unterschiede in der scheinbaren Molekularmasse über die für erwartete Zunahme hinaus die Zugabe von Glutaraldehydmolekülen, die verwendet werden, um Myosin in die gefaltete Konformation zu vernetzen (erweitert, 528,4 ± 16,2 kDa gefaltet, 579,4 ± 14,8 kDa Abb. S5B). Die Auflösung, definiert durch die Halbwertsbreite des gemessenen Kontrasts, erreichte für Streptavidin 19 kDa. In allen Fällen wurde die Auflösung durch Photonenschussrauschen begrenzt und durch die Molekülmasse beeinflusst, die von 19 kDa für Streptavidin auf 102 kDa für Thyreoglobulin anstieg (Abb. S6, B und C). Die Abweichung von <0,5% von der Sequenzmasse für Spezies von >100 kDa lässt sich gut mit der nativen Massenspektrometrie vergleichen (17) und demonstriert den intrinsischen Nutzen von iSCAMS für die genaue Massenmessung von Biomolekülen mit oligomerer Auflösung.

(EIN) Kontrast versus Molekularmasse, einschließlich für Proteine ​​zur Massenkalibrierung (schwarz), Charakterisierung der Formabhängigkeit (gelb), Protein-Ligand-Bindung (grün), Lipid-Nanodisc-Zusammensetzung (rot) und Glykosylierung (blau). Der Massenfehler (oberes Feld) wird als Prozentsatz der Sequenzmasse relativ zur gegebenen linearen Anpassung angegeben. (B) Nanodisc-Massenmessung für verschiedene Lipidzusammensetzungen und Proteingürtel. Massen, die mit alternativen Methoden für MSP1D1/DMPC erhalten wurden, werden markiert und auf die anderen Zusammensetzungen extrapoliert. Die horizontalen Balken zeigen den erwarteten Massenbereich als Funktion der Charakterisierungstechnik an, wobei die dünnen Balken den gemessenen Kontrast und die dicken Balken die Messunsicherheit in Bezug auf den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für wiederholte Experimente darstellen. Für jede Probe bezeichnet der obere Text das verwendete Membrangerüstprotein (MSP) und der untere Text die Lipide in der Nanoscheibe. (C) Aufgezeichneter differentieller Kontrast für Env, ausgedrückt in Gegenwart oder Abwesenheit von Kifunensin und zugehörige Massenbereiche, die für verschiedene Glykosylierungsniveaus erwartet werden. (D) Massensensitiver Nachweis der Ligandenbindung im Biotin-Streptavidin-System, entsprechend der Sequenzmasse von Streptavidin und den Massen von Biotin und zwei biotinylierten Peptiden relativ zu der aus (A) erhaltenen Kalibrierung. Abkürzungen sind in Tabelle S8 definiert. In (A) und (D) repräsentieren Fehlerbalken SEM.

Über die rein aus Aminosäuren bestehenden Spezies hinaus sind Lipid-Nanodiscs aufgrund ihrer Flexibilität in Bezug auf Polypeptid- und Lipidgehalt ein ideales System, um die breite Anwendbarkeit von iSCAMS zu testen (18). Für Nanoscheiben aus dem Gürtelprotein MSP1D1 und DMPC (1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-phosphocholin)-Lipide erhielten wir eine Masse von 141,0 ± 1,6 kDa, in guter Übereinstimmung mit dem Massenbereich von 124 bis 158 kDa, der von anderen Verfahren berichtet wurde ( 2B und 5D ). Das Ersetzen von MSP1D1 durch das kleinere MSP1ΔH5 reduzierte den Nanoscheibendurchmesser und den Lipidgehalt um

20%, nach Berücksichtigung der Dicke des Proteingürtels (19). Angesichts der Massen von MSP1D1 und MSP1ΔH5 (47 bzw. 42 kDa) sagten wir eine Masse für die MSP1ΔH5-Nanoscheibe von 113.6 kDa voraus, in ausgezeichneter Übereinstimmung mit unserer Messung (114,1 ± 1,9 kDa). Massenverschiebungen, die mit Veränderungen der Lipidzusammensetzung verbunden sind, wie die durch teilweise ungesättigte Lipide und Cholesterin eingeführten, stimmten mit denen überein, die aus den Anordnungsverhältnissen vorhergesagt wurden ( 2B und Tabellen S2 bis S6).

Um zu sehen, ob unser Ansatz auch auf lösungsmittelexponierte Einheiten anwendbar ist, die eine andere dielektrische Umgebung erfahren als die in einem Protein vergrabenen, haben wir den HIV-Hüllglykoproteinkomplex (Env) ausgewählt, der ein Trimer von gp41-gp120-Heterodimeren ist. Env ist weitgehend N-glykosyliert, wobei die Kohlenhydrate fast die Hälfte seiner Masse ausmachen (20). Für ein Env-Trimer-Mimetikum, das in Gegenwart von Kifunensin exprimiert wird, einem Mannosidase-Inhibitor, der überwiegend zu unverarbeitetem Man . führt9GlcNAc2 Glykane (Mann, Mannose GlcNAc, n-Acetylglucosamin) (Abb. S8), registrierten wir eine Masse von 350,0 ± 5,7 kDa. In grober Näherung, dass Glykane und Aminosäuren ähnliche Polarisierbarkeiten aufweisen, entspricht dies einer Glykanbesetzung von 74 ± 3 von 84 möglichen Stellen (Abb. 2C und Abb. S5E), was mit jüngsten Beobachtungen einer hohen Besetzung von gp120, exprimiert mit Kifunensin ., übereinstimmt (21). Für ohne Kifunensin exprimiertes Env verzeichneten wir eine geringere Masse von 315,3 ± 10,5 kDa. Der Massenunterschied ist nur teilweise auf die geringere durchschnittliche Masse der verarbeiteten Glykane zurückzuführen (Abb. S8) und ergibt insgesamt n-Glykanbelegung von 61 ± 6. Obwohl die genauen Werte für die Belegung unserer Kalibrierung (Abb. 2A) unterliegen, stimmt das Vorhandensein unbesetzter Stellen mit ihrer Beobachtung in Proteomikdaten überein (22).

Die hohe Präzision von 1,8 ± 0,5% bezogen auf die Proteinmasse (Abb. 2A) weist auf das Potenzial für den direkten Nachweis der Bindung kleiner Moleküle hin. Um die aktuellen Grenzen von iSCAMS in Bezug auf die Präzision auszuloten, haben wir daher das Biotin-Streptavidin-System untersucht (Abb. 2D und Abb. S5C). Wir haben die Massen für Streptavidin in Abwesenheit (55,7 ± 1,1 kDa) und Anwesenheit (57,4 ± 0,9 kDa) von Biotin gemessen und einen Unterschied von 1,7 ± 1,4 kDa festgestellt, in guter Übereinstimmung mit den erwarteten 0,98 kDa für eine vollständige Besetzung der vier Bindungsstellen . Bei Zugabe von zwei verschiedenen biotinylierten Peptiden (3705.9 und 4767,4 Da) fanden wir Zunahmen von 16,1 ± 2,8 und 22,0 ± 2,2 kDa (verglichen mit den erwarteten 14,8 und 19,1 kDa) (Abb. 2D und Abb. S5C). Diese Daten zeigen, dass iSCAMS die Assoziation von Liganden in Kilodalton-Größe nachweisen kann, was seine Eignung für empfindliche Ligandenbindungsstudien in Lösung demonstriert.

Nachdem wir die Fähigkeiten von iSCAMS etabliert hatten, versuchten wir, es an komplexeren Systemen zu testen, die mit bestehenden Techniken aufgrund von Heterogenität und mehrstufigen Montagemechanismen nur schwer quantitativ zu bewerten sind (Abb. 3). Darüber hinaus zielten wir darauf ab, die Nukleations- und Polymerisationsdynamik mesoskopischer Strukturen bis auf Einzelmolekülebene zu verfolgen, was aufgrund der gleichzeitigen Anforderung an einen hohen Dynamikbereich, eine hohe Bildgebungsgeschwindigkeit und eine direkte Korrelation zwischen den beobachteten Signalen und den assoziierten Molekülen eine Herausforderung darstellt Veranstaltungen. Das Biotin-Streptavidin-System weist eine nahezu kovalente Bindung auf, was die Frage aufwirft, ob iSCAMS nicht nur in der Lage ist, Massenverteilungen zu bestimmen, sondern auch schwächere Gleichgewichte zu quantifizieren, wie sie häufig bei Protein-Protein-Wechselwirkungen anzutreffen sind.

(EIN) Massenverteilungen für Env in Gegenwart von 0,5 bis 40 nM BanLec-Monomer, neben erwarteten Positionen für Vielfache von gebundenen BanLec-Tetrameren. Einschub, eine vergrößerte Ansicht der Region für größere Arten. (B) Oligomere Fraktionen, gefärbt gemäß (A) gegen BanLec-Konzentration, einschließlich Vorhersagen (Kurven) unter Verwendung des gezeigten Modells.

Wir untersuchten daher die Wechselwirkung von Env mit dem antiviralen Lektin BanLec, das HIV durch Bindung an die Oberfläche neutralisiert n-Glykane (23, 24) durch einen unbekannten Mechanismus. Wir konnten die Wechselwirkungen und kurzlebigen Komplexe vor der Aggregation beobachten, wobei die Zugabe von BanLec zu Env zu einer Reduktion einzelner Env-Einheiten führte, gekoppelt mit dem Auftreten von Dimeren und Aggregaten höherer Ordnung (Abb. 3A). Die Beschreibung der experimentellen oligomeren Evolution mit einem einfachen Modell (Abb. 3B) ermöglichte es uns, die zugrunde liegenden Assoziationskonstanten zu extrahieren [KBanLec = 0,12 nM -1 KUmgebung = 8 nM -1 KBanLec = 0,4 nM −1 (wie in Abb. 3B definiert)], in guter Übereinstimmung mit neueren Bulk-Studien (KBanLec = 0.19 nM −1 ), die auch Signaturen eines sekundären Bindungsereignisses (2.85 nM −1 ) (25). Unsere Fähigkeit, die Evolution verschiedener oligomerer Spezies zu verfolgen und zu modellieren, ermöglichte es uns, trotz der Heterogenität dieses Mehrkomponentensystems den Wechselwirkungsmechanismus und die der Lectin-Glykoprotein-Wechselwirkung zugrunde liegenden Energetik zu extrahieren. Als Ergebnis konnten wir zeigen, dass die Bindung von Env an BanLec, die bereits an Env gebunden ist (KUmgebung) ist viel stärker als BanLec zu befreien (KBanLec), ein Schlüsselmerkmal kooperativen Verhaltens. Darüber hinaus ermöglichte es uns die Massenauflösung unseres Ansatzes, die Anzahl der gebundenen BanLecs pro Dimer (eins bis zwei), Trimeren (zwei bis drei) und Tetrameren (drei bis vier) von Env zu quantifizieren, was die bivalente Bindung demonstrierte. Diese Ergebnisse sind direkt relevant für die Charakterisierung und Optimierung antiretroviraler Medikamente, da vorgeschlagen wurde, dass Multivalenz und Aggregation mit der Neutralisationsstärke in Verbindung stehen (25). Wir gehen davon aus, dass ähnliche quantitative Erkenntnisse für andere therapeutische Zielproteine ​​und Protein-Protein-Wechselwirkungen im Allgemeinen erreichbar sind.

Ein Vorteil unseres bildgebenden Ansatzes ist seine Fähigkeit, Massenänderungen orts- und lokalkonzentrationssensitiv zeitauflösend aufzulösen. Dies ermöglicht es uns, oberflächenkatalysierte Nukleationsereignisse zu untersuchen, die schließlich zur Amyloidbildung führen können (26). Frühere Studien mit Fluoreszenzmarkierung fanden Aggregate von

0,6 µm Durchmesser innerhalb einer Minute nach Zugabe des amyloidogenen Proteins α-Synuclein bei 10 µM zu einer entsprechend geladenen Doppelschicht (27). Bei Zugabe von α-Synuclein zu einem planaren, negativ geladenen DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphocholin)/DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- l -serine) (3:1) membrane at physiological pH, we observed the appearance and growth of nanoscopic objects within seconds, even at low micromolar concentrations (Fig. 4A and movie S2). We were unable to determine the sizes of the initial nucleating species or individual assembly steps owing to the low molecular mass of α-synuclein (14 kDa), but we could monitor the nanoscale formation of associated structures in the range of hundreds of kilodaltons and determine the kinetics (Fig. 4B). Growth of these clusters was uniform across the field of view, with the initial rates following expectations for a first-order process (Fig. 4B and fig. S9A), pointing to a simple growth mechanism. We did not detect such structures on neutral, DOPC-only bilayers, and we found evidence for thioflavin T–positive aggregates after overnight incubation (fig. S9B), suggesting that our assay probes early stages of amyloid assembly.

(EIN) Schematic and iSCAMS images of α-synuclein (1 μM) aggregation on a negatively charged bilayer membrane. (B) Initial growth rate versus α-synuclein concentration, shown with the best fit assuming first-order kinetics. Error bars denote SEM for different particles. Inset, individual (gray) and average (black) growth trajectories for 21 particles from (A). (C) Schematic and iSCAMS images of actin polymerization. The arrow highlights a growing filament. (D) Representative traces of actin filament tip position (gray) and corresponding detected steps (black). (E) Step and mass histogram from 1523 steps and 33 filaments, including a fit to a Gaussian mixture model (black) and individual contributions (colored according to fig. S10G). Scale bars, 1 μm. In these experiments, background correction involved removal of the static background before acquisition, rather than continuous differential imaging as in Figs. 2 and 3 (supplementary materials).

At the extremes of its current sensitivity, iSCAMS enables mass imaging of mesoscopic self-assembly, molecule by molecule. In an actin polymerization assay, subtraction of the constant background revealed the growth of surface-immobilized filaments. In contrast to α-synuclein, where the growth of interest took place within a diffraction-limited spot, in this case we could quantify length changes of filaments larger than the diffraction limit upon the attachment and detachment of actin subunits (Fig. 4C, fig. S10C, and movie S3). We observed distinct, stepwise changes in the filament length (Fig. 4D fig. S10, D to F and movie S4), the most frequent forward and backward step sizes in the traces being 3.0 ± 0.8 and 2.7 ± 0.7 nm, respectively—very close to the expected length increase of 2.7 nm upon binding of a single actin subunit to a filament (Fig. 4E). Detection of larger step sizes represents the addition of multiple actin subunits within our detection time window. The contrast changes associated with the different step sizes corresponded to mass changes of one, two, or three actin monomers binding to (and unbinding from) the tip of the growing filaments during acquisition (fig. S10, G and H). Even though we cannot yet distinguish between models invoking monomer (28) or oligomer (29) addition to a growing filament at the current level of spatiotemporal resolution, these results demonstrate the capability of iSCAMS to quantitatively image mesoscopic dynamics and determine how they are influenced by associated proteins at the single-molecule level.

We anticipate that combining iSCAMS with established surface modifications (30) will dramatically expand its capabilities. Passivation decreases surface binding probabilities and thereby should provide access to much higher analyte concentrations (greater than micromolar), and surface activation will reduce measurement times at low concentrations (less than nanomolar). Specific functionalization and immobilization of individual subunits or binding partners could allow for the determination of on and off rates, in addition to equilibrium constants, and enable targeted detection in the presence of other analytes (14). Although studies within complex three-dimensional environments such as the cell may prove to be beyond reach, the advances reported here will make iSCAMS a key approach for dynamic in vitro studies of biomolecular interactions, assembly, and structure at the single-molecule level.


ADVICE ON EXPERIMENTAL DESIGN

An ideal binding experiment has a fixed total concentration of one of the two reactants, let's choose A, that is lower than the KD. Ten-fold lower than the KD ist gut. Using a low concentration of total A simplifies the execution of the experiment and interpretation of the data, because essentially all of the other reactant B is free under all conditions. The practical limitation is that the assay must be able to measure the concentration of free or bound A.

If one chooses a low concentration of total A, then the experiment is to determine the extent of the reaction over a wide range of concentrations of B. When the concentration of B is below the KD, most of B is free, because, given the low concentrations of both reactants, little binding will occur. At higher concentrations of B more AB forms, but the concentration of A is so low that virtually all of B is free. Because most of B is free both below and above the KD, Bkostenlos ∼ Bgesamt one does not have to compensate for any B bound to A when analyzing the data.

If the assay lacks the sensitivity to do the experiment with a concentration of A below the KD, then use the lowest practical concentration of A. Later, when analyzing the data (see below), compensate for the finite amount of B bound to A at each concentration of total B in the sample.


Binding a Macromolecule M with a Small Molecule L - Biology

The multiple equilibria for the binding of a ligand A by a macromolecule P with n binding sites may be formulated in terms of a stoichiometric analysis or on the basis of a site-oriented scrutiny. The dependence of binding on ligand concentration can always be correlated in terms of n stoichiometric binding constants,Ki, even if there are interactions between sites that accentuate or attenuate binding affinities. A corresponding correlation in terms of site binding constants, kj, under the most general circumstances depends on the definition of n2n-1 different constants of which 2n-1 are independent. If experimental data are correlated in terms of n parameters kalpha, kbeta . klambda in an equation of the site-binding form, (see article for formular) then there is no guarantee that the values of ka, kb, etc., have any unique relationships to site binging constants. Examples are given to illustrate this point. Equation are derived for relating stoichiometric binding constants to site binding constants, for the general case and for various special circumstances. These equations make it possible to define and analyze binding insystems with interactions and conformational accommodations. Accordingly, a graphical procedure is described (in which iKi is plotted against i, the stoichiometric binding step) that provides an affinity profile for concise representation of magnitudes of binding constants and for detecting interactions that accentuate or attenuate site binding affinities.