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5A: Einführung in die reversible Bindung – Biologie

5A: Einführung in die reversible Bindung – Biologie


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Lernziele

  • Schreiben Sie Gleichungen für die Dissoziationskonstante (KD), Massenbilanz des Gesamtmakromoleküls (M0), Gesamtligand (L0) und [ML] als Funktion von L oder Lo ([ML] = [M0][L]/(KD+ .) [L]) (wenn Lo >> Mo oder wenn frei [L] bekannt ist) und Y = fraktionale Sättigung = Y = ([ML]/[M0] = [L]/(KD+ [L])
  • entscheiden, welche von zwei gegebenen Gleichungen für [ML] unter Bedingungen verwendet werden soll, wenn die obigen Bedingungen für L0 und L gegeben sind
  • basierend auf der Gleichung ([ML] = [M0][L]/(KD+ [L]) zeichne qualitative Graphen für verschiedene gegebene L0-, L- und Kd-Werte
  • Bestimmung der Fraktionssättigung bei gegebenen relativen Werten von Kd und L, unter der Annahme L0 >> M0
  • Vergleich der relativen %-Bindung für die kovalente Bindung von Protonen an eine Säure und die nichtkovalente Bindung eines Liganden an ein Makromolekül bei gegebenen pka/pH- und Kd/L-Werten
  • beschreiben Unterschiede in den Bindungskurven für die Bindung eines Liganden an ein Makromolekül und die Dimerisierung eines Makromoleküls
  • Leiten Sie eine Gleichung her, die die Beziehungen zwischen der Geschwindigkeitskonstante für Bindung (kon), Dissoziation (koff) und der thermodynamischen Dissoziation (Kd) oder Gleichgewichtskonstante (Keq) zeigt.
  • beschreiben die strukturellen und mathematischen Unterschiede zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung
  • Schätzen Sie bei gegebenem Kd die t1/2-Werte für die Lebensdauer des ML-Komplexes.
  • beschreiben Techniken, die verwendet werden, um ML für gegebene L- oder L0-Werte zu bestimmen, einschließlich solcher, die eine Trennung von ML von M erfordern und nicht erfordern, so dass Kd-Werte für eine M- und L-Wechselwirkung bestimmt werden können
  • Nennen Sie die Vorteile der isothermen Titrationskalorimetrie und der Oberflächenplasmonenresonanz bei der Bestimmung von Bindungswechselwirkungsparametern

Cis-regulatorisches Element

Cis-regulatorische Elemente (CREs) oder Cis-regulatorische Module (CRMs) sind Regionen nicht-kodierender DNA, die die Transkription benachbarter Gene regulieren. CREs sind wichtige Komponenten genetischer Regulationsnetzwerke, die wiederum die Morphogenese, die Entwicklung der Anatomie und andere Aspekte der Embryonalentwicklung kontrollieren, die in der evolutionären Entwicklungsbiologie untersucht wurden.

CREs befinden sich in der Nähe der Gene, die sie regulieren. CREs regulieren typischerweise die Gentranskription durch Bindung an Transkriptionsfaktoren. Ein einzelner Transkriptionsfaktor kann an viele CREs binden und somit die Expression vieler Gene kontrollieren (Pleiotropie). Das lateinische Präfix cis bedeutet "auf dieser Seite", d. h. auf demselben DNA-Molekül wie das (die) zu transkribierende(n) Gen(e).

CRMs sind DNA-Abschnitte, normalerweise 100–1000 DNA-Basenpaare lang, [1] in denen eine Reihe von Transkriptionsfaktoren nahe gelegene Gene binden und die Expression regulieren und ihre Transkriptionsraten regulieren können. Sie sind gekennzeichnet als cis weil sie sich typischerweise auf demselben DNA-Strang befinden wie die Gene, die sie kontrollieren, im Gegensatz zu trans, was sich auf die Auswirkungen auf Gene bezieht, die sich nicht auf demselben Strang oder weiter entfernt befinden, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren. [1 Eins cis-regulatorisches Element kann mehrere Gene regulieren, [2] und umgekehrt kann ein Gen mehrere haben cis-Regulatorische Module. [3] Cis-Regulatorische Module erfüllen ihre Funktion, indem sie die aktiven Transkriptionsfaktoren und die zugehörigen Co-Faktoren zu einem bestimmten Zeitpunkt und an einem bestimmten Ort in die Zelle integrieren, wo diese Informationen gelesen und ausgegeben werden. [4]

CREs befinden sich oft, aber nicht immer stromaufwärts der Transkriptionsstelle. CREs stehen im Gegensatz zu transregulatorischen Elementen (TREs). TREs kodieren für Transkriptionsfaktoren. [ Zitat benötigt ]


Inhalt

Die Bindung eines Liganden an eine Bindungsstelle auf einem Protein löst häufig eine Konformationsänderung im Protein aus und führt zu einer veränderten Zellfunktion. Daher sind Bindungsstellen auf Proteinen kritische Teile von Signaltransduktionswegen. [10] Arten von Liganden umfassen Neurotransmitter, Toxine, Neuropeptide und Steroidhormone. [11] Bindungsstellen führen in einer Reihe von Zusammenhängen zu funktionellen Veränderungen, einschließlich Enzymkatalyse, Signalübertragung auf molekularen Wegen, homöostatischer Regulation und physiologischer Funktion. Elektrische Ladung, sterische Form und Geometrie der Stelle ermöglichen selektiv die Bindung hochspezifischer Liganden, wodurch eine bestimmte Kaskade zellulärer Interaktionen aktiviert wird, für die das Protein verantwortlich ist. [12] [13]

Katalyse Bearbeiten

Enzyme katalysieren, indem sie stärker an Übergangszustände binden als Substrate und Produkte. An der katalytischen Bindungsstelle können mehrere verschiedene Wechselwirkungen auf das Substrat einwirken. Diese reichen von Elektrokatalyse, Säure- und Basenkatalyse, kovalenter Katalyse und Metallionenkatalyse. [11] Diese Wechselwirkungen verringern die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion, indem sie günstige Wechselwirkungen zur Stabilisierung des hochenergetischen Moleküls bereitstellen. Die Enzymbindung ermöglicht eine größere Nähe und den Ausschluss von Substanzen, die für die Reaktion irrelevant sind. Auch Nebenreaktionen werden durch diese spezifische Bindung verhindert. [14] [11]

Arten von Enzymen, die diese Wirkungen ausführen können, umfassen Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. [fünfzehn]

Beispielsweise katalysiert die Transferase Hexokinase die Phosphorylierung von Glucose, um Glucose-6-phosphat herzustellen. Hexokinase-Reste im aktiven Zentrum ermöglichen die Stabilisierung des Glucosemoleküls im aktiven Zentrum und fördern den Beginn eines alternativen Weges günstiger Wechselwirkungen, wodurch die Aktivierungsenergie verringert wird. [16]

Hemmung Bearbeiten

Proteinhemmung durch Inhibitorbindung kann eine Blockierung der Stoffwechselregulation, der homöostatischen Regulierung und der physiologischen Funktion induzieren.

Kompetitive Inhibitoren konkurrieren mit dem Substrat um die Bindung an freie Enzyme an aktiven Zentren und behindern somit die Produktion des Enzym-Substrat-Komplexes bei der Bindung. Zum Beispiel wird eine Kohlenmonoxidvergiftung durch die konkurrierende Bindung von Kohlenmonoxid im Gegensatz zu Sauerstoff im Hämoglobin verursacht.

Nichtkompetitive Inhibitoren binden alternativ gleichzeitig mit dem Substrat an den aktiven Zentren. Bei Bindung an einen Enzymsubstrat (ES)-Komplex wird ein Enzymsubstrat-Inhibitor (ESI)-Komplex gebildet. Ähnlich wie bei kompetitiven Inhibitoren wird auch die Geschwindigkeit bei der Produktbildung verringert. [5]

Schließlich können gemischte Inhibitoren sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym-Substrat-Komplex binden. Im Gegensatz zu kompetitiven und nichtkompetitiven Inhibitoren binden gemischte Inhibitoren jedoch an die allosterische Stelle. Die allosterische Bindung induziert Konformationsänderungen, die die Affinität des Proteins für das Substrat erhöhen können. Dieses Phänomen wird positive Modulation genannt. Umgekehrt ist eine allosterische Bindung, die die Affinität des Proteins für das Substrat verringert, eine negative Modulation. [17]

Aktive Site Bearbeiten

Am aktiven Zentrum bindet ein Substrat an ein Enzym, um eine chemische Reaktion auszulösen. [18] [19] Substrate, Übergangszustände und Produkte können an das aktive Zentrum binden, ebenso wie alle kompetitiven Inhibitoren. [18] Im Zusammenhang mit der Proteinfunktion kann beispielsweise die Bindung von Calcium an Troponin in Muskelzellen eine Konformationsänderung von Troponin induzieren. Dies ermöglicht es Tropomyosin, die Aktin-Myosin-Bindungsstelle freizulegen, an die der Myosinkopf bindet, um eine Kreuzbrücke zu bilden und eine Muskelkontraktion zu induzieren. [20]

Im Zusammenhang mit Blut ist ein Beispiel für eine kompetitive Bindung Kohlenmonoxid, das mit Sauerstoff um das aktive Zentrum am Häm konkurriert. Die hohe Affinität von Kohlenmonoxid kann Sauerstoff in Gegenwart einer niedrigen Sauerstoffkonzentration verdrängen. Unter diesen Umständen induziert die Bindung von Kohlenmonoxid eine Konformationsänderung, die Häm von der Bindung an Sauerstoff abhält, was zu einer Kohlenmonoxidvergiftung führt. [5]

Allosterische Seite Bearbeiten

An der regulatorischen Stelle kann die Bindung eines Liganden eine verstärkte oder gehemmte Proteinfunktion hervorrufen. [5] [21] Die Bindung eines Liganden an eine allosterische Stelle eines multimeren Enzyms induziert häufig eine positive Kooperativität, dh die Bindung eines Substrats induziert eine günstige Konformationsänderung und erhöht die Wahrscheinlichkeit des Enzyms, an ein zweites Substrat zu binden. [22] Liganden an regulatorischen Stellen können homotrope und heterotrope Liganden umfassen, bei denen einzelne oder mehrere Molekültypen die Enzymaktivität beeinflussen. [23]

Enzyme, die stark reguliert werden, sind oft in Stoffwechselwegen essentiell. Beispielsweise wird die Phosphofructokinase (PFK), die Fructose bei der Glykolyse phosphoryliert, weitgehend durch ATP reguliert. Seine Regulierung bei der Glykolyse ist zwingend erforderlich, da er der bestimmende und geschwindigkeitsbegrenzende Schritt des Stoffwechselwegs ist. PFK kontrolliert auch die Menge an Glucose, die zur Bildung von ATP durch den katabolen Weg bestimmt ist. Daher wird PFK bei ausreichenden ATP-Spiegeln allosterisch durch ATP gehemmt. Diese Regulierung konserviert effizient Glukosereserven, die für andere Stoffwechselwege benötigt werden können. Citrat, ein Zwischenprodukt des Zitronensäurezyklus, wirkt auch als allosterischer Regulator von PFK. [23] [24]

Ein- und mehrkettige Bindungsstellen Bearbeiten

Bindungsstellen können auch durch ihre strukturellen Merkmale charakterisiert werden. Einkettige Stellen (von „monodesmischen“ Liganden, μόνος: single, δεσμός: Bindung) werden von einer einzelnen Proteinkette gebildet, während mehrkettige Stellen (von „polydesmischen“ Liganden, πολοί: viele) in Proteinen häufig vorkommen Komplexe und werden von Liganden gebildet, die mehr als eine Proteinkette binden, typischerweise in oder in der Nähe von Proteingrenzflächen.Neuere Forschungen zeigen, dass die Struktur der Bindungsstellen tiefgreifende Konsequenzen für die Biologie von Proteinkomplexen hat (Funktionsentwicklung, Allosterie).[26] [ 27]

Kryptische Bindungsstellen Bearbeiten

Kryptische Bindungsstellen sind die Bindungsstellen, die vorübergehend in einer Apo-Form gebildet werden oder die durch Ligandenbindung induziert werden. Die Berücksichtigung der kryptischen Bindungsstellen erhöht die Größe des potenziell „wirkstofffähigen“ menschlichen Proteoms aus

78% der krankheitsassoziierten Proteine. [28] Die Bindungsstellen wurden untersucht durch: Support-Vektor-Maschine, angewendet auf den "CryptoSite"-Datensatz, [28] Erweiterung des "CryptoSite"-Datensatzes, [29] Langfristige Molekulardynamiksimulation mit Markov-Zustandsmodell und mit biophysikalischen Experimenten, [30] und kryptischer Site-Index, der auf der relativen zugänglichen Oberfläche basiert. [31]

Bindungskurven beschreiben das Bindungsverhalten eines Liganden an ein Protein. Kurven können durch ihre Form charakterisiert werden, sigmoidal oder hyperbolisch, die widerspiegeln, ob das Protein kooperatives bzw. nichtkooperatives Bindungsverhalten zeigt oder nicht. [32] Typischerweise beschreibt die x-Achse die Konzentration des Liganden und die y-Achse die partielle Sättigung von Liganden, die an alle verfügbaren Bindungsstellen gebunden sind. [5] Zur Bestimmung der Kurvenform wird üblicherweise die Michaelis-Menten-Gleichung verwendet. Die Michaelis-Menten-Gleichung basiert auf stationären Bedingungen und berücksichtigt die in einer Lösung ablaufenden Enzymreaktionen. Findet die Reaktion jedoch statt, während das Enzym an ein Substrat gebunden ist, läuft die Kinetik anders ab. [33]

Modellierungen mit Bindungskurven sind nützlich, wenn die Bindungsaffinitäten von Sauerstoff zu Hämoglobin und Myoglobin im Blut bewertet werden. Hämoglobin, das vier Hämgruppen aufweist, zeigt eine kooperative Bindung. Dies bedeutet, dass die Bindung von Sauerstoff an eine Hämgruppe von Hämoglobin eine günstige Konformationsänderung induziert, die eine erhöhte Bindungsvorteile von Sauerstoff für die nächsten Hämgruppen ermöglicht. Unter diesen Umständen wird die Bindungskurve von Hämoglobin aufgrund seiner erhöhten Bindungsvorteil für Sauerstoff sigmoidal sein. Da Myoglobin nur eine Hämgruppe aufweist, zeigt es eine nichtkooperative Bindung, die auf einer Bindungskurve hyperbolisch ist. [34]

Biochemische Unterschiede zwischen verschiedenen Organismen und Menschen sind für die Arzneimittelentwicklung nützlich. Penicillin tötet beispielsweise bakterielle Enzyme ab, indem es die DD-Transpeptidase hemmt, die Entwicklung der bakteriellen Zellwand zerstört und den Zelltod induziert. Daher ist die Untersuchung von Bindungsstellen für viele Forschungsgebiete relevant, darunter Krebsmechanismen, [35] Arzneimittelformulierung [36] und physiologische Regulation. [37] Die Formulierung eines Inhibitors zur Stummschaltung der Funktion eines Proteins ist eine gängige Form der pharmazeutischen Therapie. [38]

Im Bereich von Krebs werden Liganden, die so bearbeitet wurden, dass sie ein ähnliches Aussehen wie der natürliche Ligand aufweisen, verwendet, um das Tumorwachstum zu hemmen. Methotrexat, ein Chemotherapeutikum, wirkt beispielsweise als kompetitiver Inhibitor am aktiven Zentrum der Dihydrofolat-Reduktase. [39] Diese Wechselwirkung hemmt die Synthese von Tetrahydrofolat und stoppt die Produktion von DNA, RNA und Proteinen. [39] Die Hemmung dieser Funktion unterdrückt das neoplastische Wachstum und verbessert schwere Psoriasis und rheumatoide Arthritis bei Erwachsenen. [38]

Bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen werden Medikamente wie Betablocker zur Behandlung von Patienten mit Bluthochdruck eingesetzt. Betablocker (β-Blocker) sind blutdrucksenkende Mittel, die die Bindung der Hormone Adrenalin und Noradrenalin an β1- und β2-Rezeptoren im Herzen und in den Blutgefäßen blockieren. Diese Rezeptoren vermitteln normalerweise die sympathische "Kampf-oder-Flucht"-Reaktion, die eine Verengung der Blutgefäße verursacht. [40]

Auch kompetitive Inhibitoren sind weitgehend kommerziell zu finden. Botulinumtoxin, im Handel als Botox bekannt, ist ein Neurotoxin, das aufgrund der Bindung an Acetylcholin-abhängige Nerven schlaffe Lähmungen im Muskel verursacht. Diese Wechselwirkung hemmt die Muskelkontraktionen, wodurch das Aussehen einer glatten Muskulatur entsteht. [41]

Für die Vorhersage der Position von Bindungsstellen auf Proteinen wurden eine Reihe von Computerwerkzeugen entwickelt. [21] [42] [43] Diese können grob in sequenzbasiert oder strukturbasiert eingeteilt werden. [43] Sequenzbasierte Methoden beruhen auf der Annahme, dass die Sequenzen von funktionell konservierten Teilen von Proteinen wie der Bindungsstelle konserviert sind. Strukturbasierte Methoden erfordern die 3D-Struktur des Proteins. Diese Verfahren lassen sich wiederum in schablonen- und taschenbasierte Verfahren unterteilen. [43] Template-basierte Methoden suchen nach 3D-Ähnlichkeiten zwischen dem Zielprotein und Proteinen mit bekannten Bindungsstellen. Die taschenbasierten Methoden suchen nach konkaven Oberflächen oder vergrabenen Taschen im Zielprotein, die Eigenschaften wie Hydrophobie und Wasserstoffbindungskapazität aufweisen, die es ihnen ermöglichen würden, Liganden mit hoher Affinität zu binden. [43] Auch wenn hier der Begriff Tasche verwendet wird, können ähnliche Methoden verwendet werden, um Bindungsstellen für Protein-Protein-Wechselwirkungen vorherzusagen, die normalerweise planarer sind, nicht in Taschen. [44]


Inhalt

Arten von reversiblen Inhibitoren Bearbeiten

Reversible Inhibitoren binden an Enzyme mit nicht-kovalenten Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophoben Wechselwirkungen und Ionenbindungen. Mehrere schwache Bindungen zwischen dem Inhibitor und dem aktiven Zentrum verbinden sich, um eine starke und spezifische Bindung zu erzeugen. Im Gegensatz zu Substraten und irreversiblen Inhibitoren gehen reversible Inhibitoren in der Regel keine chemischen Reaktionen ein, wenn sie an das Enzym gebunden sind, und können leicht durch Verdünnung oder Dialyse entfernt werden.

Es gibt vier Arten von reversiblen Enzyminhibitoren. Sie werden nach der Wirkung der Variation der Konzentration des Enzymsubstrats auf den Inhibitor klassifiziert. [3] [4] [1]

  • In Konkurrenzhemmung, Substrat und Inhibitor können nicht gleichzeitig an das Enzym binden, wie in der Abbildung rechts gezeigt. Dies resultiert normalerweise daraus, dass der Inhibitor eine Affinität zum aktiven Zentrum eines Enzyms hat, wo das Substrat auch das Substrat und den Inhibitor bindet wetteifern für den Zugang zum aktiven Zentrum des Enzyms. Diese Art der Hemmung kann durch ausreichend hohe Substratkonzentrationen (Vmax konstant bleibt), d. h. durch Auskonkurrieren des Inhibitors. Allerdings ist das offensichtliche Km wird zunehmen, da eine höhere Konzentration des Substrats erforderlich ist, um die Km Punkt oder die Hälfte Vmax. Konkurrierende Inhibitoren haben oft eine ähnliche Struktur wie das reale Substrat (siehe Beispiele unten).
  • In nicht wettbewerbsfähige Hemmung, bindet der Inhibitor nur an den Substrat-Enzym-Komplex. Diese Art der Hemmung verursacht Vmax abnehmen (die maximale Geschwindigkeit nimmt ab, da der aktivierte Komplex entfernt wird) und Km zu verringern (aufgrund der besseren Bindungseffizienz infolge des Le-Chatelier-Prinzips und der effektiven Eliminierung des ES-Komplexes, wodurch die Km was auf eine höhere Bindungsaffinität hinweist).
  • In nicht kompetitive Hemmung, verringert die Bindung des Inhibitors an das Enzym seine Aktivität, beeinflusst jedoch nicht die Substratbindung. Als Ergebnis hängt das Ausmaß der Hemmung nur von der Konzentration des Inhibitors ab. Vmax sinkt, da die Reaktion nicht so effizient ablaufen kann, aber Km gleich bleiben wird, da die tatsächliche Bindung des Substrats per Definition immer noch richtig funktioniert.
  • In gemischte Hemmung, kann der Inhibitor gleichzeitig mit dem Substrat des Enzyms an das Enzym binden. Die Bindung des Inhibitors beeinflusst jedoch die Bindung des Substrats und umgekehrt. Diese Art der Hemmung kann durch Erhöhung der Substratkonzentration reduziert, aber nicht überwunden werden. Obwohl es für gemischte Inhibitoren möglich ist, an der aktiven Stelle zu binden, resultiert diese Art der Hemmung im Allgemeinen aus einer allosterischen Wirkung, bei der der Inhibitor an eine andere Stelle eines Enzyms bindet. Die Bindung des Inhibitors an diese allosterische Stelle ändert die Konformation (d. h. Tertiärstruktur oder dreidimensionale Form) des Enzyms, so dass die Affinität des Substrats für die aktive Stelle verringert wird.

Diese Typen können auch durch die Wirkung einer Erhöhung der Substratkonzentration [S] auf den Grad der durch eine gegebene Inhibitormenge verursachten Hemmung unterschieden werden. Bei kompetitiver Hemmung wird der Hemmgrad mit steigendem [S] reduziert, bei nicht-kompetitiver Hemmung bleibt der Hemmgrad unverändert und bei nicht-kompetitiver (auch antikompetitiver) Hemmung steigt der Hemmgrad mit [S]. [6]

Quantitative Beschreibung der reversiblen Hemmung Bearbeiten

Die reversible Hemmung kann quantitativ über die Bindung des Inhibitors an das Enzym und an den Enzym-Substrat-Komplex und seine Auswirkungen auf die kinetischen Konstanten des Enzyms beschrieben werden. Im klassischen Michaelis-Menten-Schema unten bindet ein Enzym (E) an sein Substrat (S), um den Enzym-Substrat-Komplex ES zu bilden. Bei der Katalyse zerfällt dieser Komplex, um Produkt P und freies Enzym freizusetzen. Der Inhibitor (I) kann entweder an E oder ES mit den Dissoziationskonstanten binden Kich oder Kich', bzw.

  • Kompetitive Inhibitoren können an E binden, aber nicht an ES. Die Wettbewerbshemmung nimmt zu Km (d. h. der Inhibitor stört die Substratbindung), beeinflusst aber nicht Vmax (der Inhibitor behindert die Katalyse in ES nicht, da er nicht an ES binden kann).
  • Nichtkompetitive Inhibitoren binden an ES. Unkompetitive Hemmung verringert beide Km“ und „Vmax. Der Inhibitor beeinflusst die Substratbindung, indem er die Affinität des Enzyms zum Substrat erhöht (abnehmend) Km) sowie Hemmung der Katalyse (verringert Vmax).
  • Nicht-kompetitive Inhibitoren haben identische Affinitäten für E und ES (Kich = Kich'). Nicht-kompetitive Hemmung ändert sich nicht Km (d. h. es beeinflusst die Substratbindung nicht), nimmt aber ab Vmax (d. h. Inhibitorbindung behindert die Katalyse).
  • Gemischte Inhibitoren binden sowohl an E als auch an ES, aber ihre Affinitäten für diese beiden Formen des Enzyms sind unterschiedlich (KichKich'). Daher beeinflussen gemischte Inhibitoren die Substratbindung (erhöhen oder verringern Km) und behindern die Katalyse im ES-Komplex (Abnahme Vmax).

Wenn ein Enzym mehrere Substrate hat, können Inhibitoren unterschiedliche Arten der Hemmung zeigen, je nachdem, welches Substrat in Betracht kommt. Dies resultiert daraus, dass die aktive Stelle zwei verschiedene Bindungsstellen innerhalb der aktiven Stelle enthält, eine für jedes Substrat. Zum Beispiel könnte ein Inhibitor mit Substrat A um die erste Bindungsstelle konkurrieren, aber in Bezug auf Substrat B an der zweiten Bindungsstelle ein nicht-kompetitiver Inhibitor sein. [7]

Messung der Dissoziationskonstanten eines reversiblen Inhibitors Edit

Wie oben erwähnt, ist ein Enzyminhibitor durch seine zwei Dissoziationskonstanten gekennzeichnet, Kich und Kich', zum Enzym bzw. zum Enzym-Substrat-Komplex. Die Enzym-Inhibitor-Konstante Kich kann mit verschiedenen Methoden direkt gemessen werden. Eine äußerst genaue Methode ist die isotherme Titrationskalorimetrie, bei der der Inhibitor in eine Enzymlösung titriert und die freigesetzte oder aufgenommene Wärme gemessen wird. [8] Die andere Dissoziationskonstante Kich“ ist schwer direkt zu messen, da der Enzym-Substrat-Komplex kurzlebig ist und eine chemische Reaktion zum Produkt durchläuft. Somit, Kich“ wird normalerweise indirekt gemessen, indem die Enzymaktivität unter verschiedenen Substrat- und Inhibitorkonzentrationen beobachtet und die Daten [9] an eine modifizierte Michaelis-Menten-Gleichung angepasst werden

wobei die modifizierenden Faktoren α und α' durch die Inhibitorkonzentration und ihre beiden Dissoziationskonstanten definiert sind

Somit ist das Enzym in Gegenwart des Inhibitors wirksam Km und Vmax werden (α/α')Km und (1/α')Vmax, bzw. Die modifizierte Michaelis-Menten-Gleichung geht jedoch davon aus, dass die Bindung des Inhibitors an das Enzym ein Gleichgewicht erreicht hat, was für Inhibitoren mit subnanomolaren Dissoziationskonstanten ein sehr langsamer Prozess sein kann. In diesen Fällen ist es in der Regel praktischer, den Tight-Binding-Inhibitor als irreversiblen Inhibitor zu behandeln (siehe unten), dennoch kann eine Abschätzung möglich sein Kich' kinetisch, wenn Kich wird unabhängig gemessen.

Die Auswirkungen verschiedener Typen von reversiblen Enzyminhibitoren auf die enzymatische Aktivität können mit grafischen Darstellungen der Michaelis-Menten-Gleichung visualisiert werden, wie Lineweaver-Burk-Plots, Eadie-Hofstee-Plots oder Hanes-Woolf-Plots. In den Lineweaver-Burk-Plots auf der rechten Seite schneiden sich die kompetitiven Hemmungslinien beispielsweise auf der ja-Achse, die veranschaulicht, dass solche Inhibitoren nicht beeinflussen Vmax. In ähnlicher Weise schneiden sich die nicht-kompetitiven Hemmungslinien auf der x-Achse, die zeigt, dass diese Inhibitoren keinen Einfluss haben Km. Es kann jedoch schwierig zu schätzen sein Kich und Kich' genau aus solchen Diagrammen, [10] daher ist es ratsam, diese Konstanten mit zuverlässigeren nichtlinearen Regressionsmethoden zu schätzen, wie oben beschrieben.

Reversible Inhibitoren Bearbeiten

Herkömmlicherweise werden reversible Enzyminhibitoren entsprechend ihrer Wirkung auf Km und Vmax. Diese unterschiedlichen Effekte resultieren aus der Bindung des Inhibitors an das Enzym E, an den Enzym-Substrat-Komplex ES oder an beide. Die Aufteilung dieser Klassen ergibt sich aus einem Problem bei ihrer Ableitung und führt dazu, dass zwei verschiedene Bindungskonstanten für ein Bindungsereignis verwendet werden müssen. Die Bindung eines Inhibitors und seine Wirkung auf die enzymatische Aktivität sind zwei deutlich unterschiedliche Dinge, ein weiteres Problem, das die traditionellen Gleichungen nicht anerkennen. Bei der nichtkompetitiven Hemmung führt die Bindung des Inhibitors nur zu einer 100%igen Hemmung des Enzyms und lässt die Möglichkeit dazwischen liegen. [11] Die gebräuchliche Form des inhibitorischen Begriffs verschleiert auch die Beziehung zwischen der Bindung des Inhibitors an das Enzym und seiner Beziehung zu jedem anderen Bindungsterm, sei es die Michaelis-Menten-Gleichung oder eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die mit der Ligandenrezeptorbindung verbunden ist. Um den Zusammenhang zu demonstrieren, kann die folgende Umordnung vorgenommen werden:

Diese Umlagerung zeigt, dass die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ähnlich wie bei der Michaelis-Menten-Gleichung vom Anteil der Enzympopulation abhängt, die mit ihrem Substrat wechselwirkt.

durch Substrat gebundener Anteil der Enzympopulation

Anteil der Enzympopulation, die durch Inhibitoren gebunden ist

die Wirkung des Inhibitors ist das Ergebnis des Prozentsatzes der Enzympopulation, der mit dem Inhibitor interagiert. Das einzige Problem bei dieser Gleichung in ihrer gegenwärtigen Form besteht darin, dass sie eine absolute Hemmung des Enzyms mit Inhibitorbindung annimmt, obwohl tatsächlich ein breites Spektrum von Effekten irgendwo von 100 % Hemmung des Substratumsatzes bis zu nur >0 % auftreten kann. Um dies zu berücksichtigen, kann die Gleichung leicht modifiziert werden, um verschiedene Grade der Hemmung zu berücksichtigen, indem ein delta Vmax Begriff.

Dieser Begriff kann dann die restliche enzymatische Aktivität definieren, die vorhanden ist, wenn der Inhibitor mit einzelnen Enzymen in der Population wechselwirkt. Die Aufnahme dieses Begriffs hat jedoch den Mehrwert, dass die Möglichkeit der Aktivierung ermöglicht wird, wenn die sekundäre Vmax Die Laufzeit ist höher als die ursprüngliche Laufzeit. Um auch der möglichen Aktivierung Rechnung zu tragen, kann die Notation dann umgeschrieben werden, indem der Inhibitor "I" durch einen Modifiziererterm ersetzt wird, der hier als "X" bezeichnet wird.

Diese Terminologie führt zwar zu einem vereinfachten Umgang mit kinetischen Effekten in Bezug auf die maximale Geschwindigkeit der Michaelis-Menten-Gleichung, hebt jedoch mögliche Probleme mit dem Begriff hervor, der zur Beschreibung von Effekten in Bezug auf die Km. Die Km in Bezug auf die Affinität des Enzyms für das Substrat sollte sich in den meisten Fällen auf mögliche Veränderungen der Bindungsstelle des Enzyms beziehen, die direkt aus Enzym-Inhibitor-Wechselwirkungen resultieren würden. Als ein solcher Begriff, der dem oben vorgeschlagenen ähnelt, um zu modulieren Vmax sollte in den meisten Situationen angemessen sein: [12]

Sonderfälle Bearbeiten

  • Der Mechanismus von teilweise kompetitive Hemmung ist dem nicht-kompetitiven ähnlich, außer dass der EIS-Komplex eine katalytische Aktivität aufweist, die niedriger oder sogar höher sein kann (teilweise kompetitive Aktivierung) als die des Enzym-Substrat(ES)-Komplexes. Diese Hemmung zeigt typischerweise einen niedrigeren Vmax, aber ein unberührter Km Wert. [13]
  • Unkompetitive Hemmung tritt auf, wenn der Inhibitor nur an den Enzym-Substrat-Komplex bindet, nicht an das freie Enzym, der EIS-Komplex ist katalytisch inaktiv. Diese Art der Hemmung ist selten und führt zu einer Abnahme beider Vmax und der Km Wert. [13]
  • Substrat- und Produkthemmung ist, wo entweder das Substrat oder das Produkt einer Enzymreaktion die Aktivität des Enzyms hemmt. Diese Hemmung kann kompetitiven, nicht kompetitiven oder gemischten Mustern folgen. Bei der Substrathemmung kommt es bei hohen Substratkonzentrationen zu einer progressiven Abnahme der Aktivität. Dies kann auf die Existenz von zwei Substratbindungsstellen im Enzym hinweisen. [1] Bei niedrigem Substrat ist die hochaffine Stelle besetzt und die normale Kinetik wird verfolgt. Bei höheren Konzentrationen wird jedoch die zweite Hemmstelle besetzt, wodurch das Enzym gehemmt wird. [14] Produkthemmung ist oft ein regulatorisches Merkmal im Stoffwechsel und kann eine Form negativer Rückkopplung sein.
  • Slow-tight Hemmung tritt auf, wenn der anfängliche Enzym-Inhibitor-Komplex EI zu einem zweiten, fester gehaltenen Komplex, EI*, isomerisiert, der gesamte Inhibitionsprozess jedoch reversibel ist. Dies äußert sich als langsam zunehmende Enzymhemmung. Unter diesen Bedingungen liefert die traditionelle Michaelis-Menten-Kinetik einen falschen Wert für Kich, die zeitabhängig ist. [1] Der wahre Wert von Kich kann durch eine komplexere Analyse der on erhalten werden (kAn) und aus (kaus) Geschwindigkeitskonstanten für die Inhibitorassoziation. Weitere Informationen finden Sie unten in der irreversiblen Hemmung.
  • Bi-Substrat-Analog-Inhibitoren sind Inhibitoren mit hoher Affinität und Selektivität, die für Enzyme hergestellt werden können, die bimolekulare Reaktionen katalysieren, indem sie die Bindungsenergie jedes Substrats in ein Molekül einfangen. [15][16] Beispielsweise wurde in Formyltransferreaktionen der Purinbiosynthese ein potenter Multi-Substrat-Addukt-Inhibitor (MAI) an GAR-TFase synthetisch hergestellt, indem Analoga des Glycinamid-Ribonukleotid-(GAR)-Substrats und des N-10 -Formyltetrahydrofolat-Cofaktor zusammen, um Thioglycinamid-Ribonukleotid-Dideazafolat (TGDDF) zu produzieren, [17] oder enzymatisch aus dem natürlichen GAR-Substrat, um GDDF zu ergeben. [18] Hier war die subnanomolare Dissoziationskonstante (KD) von TGDDF größer als vorhergesagt, vermutlich aufgrund der gewonnenen entropischen Vorteile und/oder der positiven Wechselwirkungen, die durch die Atome, die die Komponenten verbinden, erworben wurden. Es wurde auch beobachtet, dass MAIs in Zellen durch Reaktionen von Prodrugs wie Isoniazid[19] oder Enzyminhibitorliganden (z. B. PTC124) [20] mit zellulären Cofaktoren wie NADH bzw. ATP produziert werden.

Beispiele für reversible Inhibitoren Bearbeiten

Da sich Enzyme so entwickelt haben, dass sie ihre Substrate fest binden, und die meisten reversiblen Inhibitoren im aktiven Zentrum von Enzymen binden, überrascht es nicht, dass einige dieser Inhibitoren in ihrer Struktur den Substraten ihrer Zielmoleküle auffallend ähnlich sind. Inhibitoren von DHFR sind prominente Beispiele. Ein weiteres Beispiel für diese Substratnachahmer sind die Protease-Inhibitoren, eine sehr erfolgreiche Klasse von antiretroviralen Medikamenten, die zur Behandlung von HIV verwendet werden. [21] Die Struktur von Ritonavir, einem auf einem Peptid basierenden Protease-Inhibitor mit drei Peptidbindungen, ist rechts dargestellt. Da dieses Medikament dem Protein ähnelt, das das Substrat der HIV-Protease ist, konkurriert es mit diesem Substrat im aktiven Zentrum des Enzyms.

Enzyminhibitoren werden oft entwickelt, um den Übergangszustand oder das Zwischenprodukt einer enzymkatalysierten Reaktion nachzuahmen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Inhibitor die übergangszustandsstabilisierende Wirkung des Enzyms ausnutzt, was zu einer besseren Bindungsaffinität (geringere Kich) als substratbasierte Designs. Ein Beispiel für einen solchen Übergangszustandsinhibitor ist das antivirale Medikament Oseltamivir, dieses Medikament ahmt die planare Natur des Ringoxoniumions bei der Reaktion des viralen Enzyms Neuraminidase nach. [22]

Allerdings basieren nicht alle Inhibitoren auf den Strukturen von Substraten. Links ist beispielsweise die Struktur eines anderen HIV-Protease-Inhibitors Tipranavir dargestellt. Dieses Molekül basiert nicht auf einem Peptid und weist keine offensichtliche strukturelle Ähnlichkeit mit einem Proteinsubstrat auf. Diese Nicht-Peptid-Inhibitoren können stabiler sein als Inhibitoren, die Peptidbindungen enthalten, da sie keine Substrate für Peptidasen sind und weniger wahrscheinlich abgebaut werden. [23]

Beim Wirkstoffdesign ist es wichtig, die Konzentrationen der Substrate zu berücksichtigen, denen die Zielenzyme ausgesetzt sind. Einige Proteinkinase-Inhibitoren haben beispielsweise ähnliche chemische Strukturen wie Adenosintriphosphat, eines der Substrate dieser Enzyme. Medikamente, die einfache kompetitive Inhibitoren sind, müssen jedoch mit den hohen Konzentrationen von ATP in der Zelle konkurrieren. Proteinkinasen können auch durch Konkurrenz an den Bindungsstellen, an denen die Kinasen mit ihren Substratproteinen interagieren, gehemmt werden, und die meisten Proteine ​​sind in den Zellen in Konzentrationen vorhanden, die viel niedriger sind als die Konzentration von ATP. Wenn also zwei Proteinkinase-Inhibitoren beide mit ähnlicher Affinität im aktiven Zentrum binden, aber nur einer mit ATP konkurrieren muss, dann hemmt der kompetitive Inhibitor an der Proteinbindungsstelle das Enzym effektiver. [24]

Arten der irreversiblen Hemmung (kovalente Inaktivierung) Bearbeiten

Irreversible Inhibitoren modifizieren normalerweise ein Enzym kovalent, und die Hemmung kann daher nicht rückgängig gemacht werden. Irreversible Inhibitoren enthalten oft reaktive funktionelle Gruppen wie Stickstoffsenf, Aldehyde, Halogenalkane, Alkene, Michael-Akzeptoren, Phenylsulfonate oder Fluorphosphonate. Diese nukleophilen Gruppen reagieren mit Aminosäureseitenketten, um kovalente Addukte zu bilden. Die modifizierten Reste sind solche mit Seitenketten, die Nukleophile wie Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen enthalten. Dazu gehören die Aminosäuren Serin (wie in DFP, rechts), Cystein, Threonin oder Tyrosin. [25]

Die irreversible Hemmung unterscheidet sich von der irreversiblen Enzyminaktivierung. Irreversible Inhibitoren sind im Allgemeinen spezifisch für eine Enzymklasse und inaktivieren nicht alle Proteine, sie funktionieren nicht, indem sie die Proteinstruktur zerstören, sondern indem sie spezifisch das aktive Zentrum ihres Ziels verändern. Extreme pH-Werte oder Temperaturen verursachen beispielsweise normalerweise eine Denaturierung der gesamten Proteinstruktur, aber dies ist ein unspezifischer Effekt. In ähnlicher Weise zerstören einige unspezifische chemische Behandlungen die Proteinstruktur: Zum Beispiel hydrolysiert das Erhitzen in konzentrierter Salzsäure die Peptidbindungen, die Proteine ​​zusammenhalten, und setzt freie Aminosäuren frei. [26]

Irreversible inhibitors display time-dependent inhibition and their potency therefore cannot be characterised by an IC50 Wert. [1] [27] This is because the amount of active enzyme at a given concentration of irreversible inhibitor will be different depending on how long the inhibitor is pre-incubated with the enzyme. Stattdessen, kobs/[ich] values are used, [28] where kobs is the observed pseudo-first order rate of inactivation (obtained by plotting the log of % activity vs. time) and [ich] is the concentration of inhibitor. Die kobs/[ich] parameter is valid as long as the inhibitor does not saturate binding with the enzyme (in which case kobs = kinact).

Analysis of irreversible inhibition Edit

As shown in the figure to the right, irreversible inhibitors have a short instance where they form a reversible non-covalent complex with the enzyme (EI or ESI) and this then reacts to produce the covalently modified "dead-end complex" EI* (an irreversible covalent complex). The rate at which EI* is formed is called the inactivation rate or kinact. Since formation of EI may compete with ES, binding of irreversible inhibitors can be prevented by competition either with substrate or with a second, reversible inhibitor. This protection effect is good evidence of a specific reaction of the irreversible inhibitor with the active site.

The binding and inactivation steps of this reaction are investigated by incubating the enzyme with inhibitor and assaying the amount of activity remaining over time. The activity will be decreased in a time-dependent manner, usually following exponential decay. Fitting these data to a rate equation gives the rate of inactivation at this concentration of inhibitor. This is done at several different concentrations of inhibitor. If a reversible EI complex is involved the inactivation rate will be saturable and fitting this curve will give kinact und Kich. [29]

Another method that is widely used in these analyses is mass spectrometry. Here, accurate measurement of the mass of the unmodified native enzyme and the inactivated enzyme gives the increase in mass caused by reaction with the inhibitor and shows the stoichiometry of the reaction. [30] This is usually done using a MALDI-TOF mass spectrometer. In a complementary technique, peptide mass fingerprinting involves digestion of the native and modified protein with a protease such as trypsin. This will produce a set of peptides that can be analysed using a mass spectrometer. The peptide that changes in mass after reaction with the inhibitor will be the one that contains the site of modification.

Special cases Edit

Not all irreversible inhibitors form covalent adducts with their enzyme targets. Some reversible inhibitors bind so tightly to their target enzyme that they are essentially irreversible. These tight-binding inhibitors may show kinetics similar to covalent irreversible inhibitors. In these cases, some of these inhibitors rapidly bind to the enzyme in a low-affinity EI complex and this then undergoes a slower rearrangement to a very tightly bound EI* complex (see figure above). This kinetic behaviour is called slow-binding. [32] This slow rearrangement after binding often involves a conformational change as the enzyme "clamps down" around the inhibitor molecule. Examples of slow-binding inhibitors include some important drugs, such methotrexate, [33] allopurinol, [34] and the activated form of acyclovir. [35]

Examples of irreversible inhibitors Edit

Diisopropylfluorophosphate (DFP) is shown as an example of an irreversible protease inhibitor in the figure above right. The enzyme hydrolyses the phosphorus–fluorine bond, but the phosphate residue remains bound to the serine in the active site, deactivating it. [36] Similarly, DFP also reacts with the active site of acetylcholine esterase in the synapses of neurons, and consequently is a potent neurotoxin, with a lethal dose of less than 100 mg. [37]

Suicide inhibition is an unusual type of irreversible inhibition where the enzyme converts the inhibitor into a reactive form in its active site. An example is the inhibitor of polyamine biosynthesis, α-difluoromethylornithine or DFMO, which is an analogue of the amino acid ornithine, and is used to treat African trypanosomiasis (sleeping sickness). Ornithine decarboxylase can catalyse the decarboxylation of DFMO instead of ornithine, as shown above. However, this decarboxylation reaction is followed by the elimination of a fluorine atom, which converts this catalytic intermediate into a conjugated imine, a highly electrophilic species. This reactive form of DFMO then reacts with either a cysteine or lysine residue in the active site to irreversibly inactivate the enzyme. [31]

Since irreversible inhibition often involves the initial formation of a non-covalent EI complex, it is sometimes possible for an inhibitor to bind to an enzyme in more than one way. For example, in the figure showing trypanothione reductase from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi, two molecules of an inhibitor called quinacrine mustard are bound in its active site. The top molecule is bound reversibly, but the lower one is bound covalently as it has reacted with an amino acid residue through its nitrogen mustard group. [38]

New drugs are the products of a long drug development process, the first step of which is often the discovery of a new enzyme inhibitor. In the past the only way to discover these new inhibitors was by trial and error: screening huge libraries of compounds against a target enzyme and hoping that some useful leads would emerge. This brute force approach is still successful and has even been extended by combinatorial chemistry approaches that quickly produce large numbers of novel compounds and high-throughput screening technology to rapidly screen these huge chemical libraries for useful inhibitors. [39]

More recently, an alternative approach has been applied: rational drug design uses the three-dimensional structure of an enzyme's active site to predict which molecules might be inhibitors. [40] These predictions are then tested and one of these tested compounds may be a novel inhibitor. This new inhibitor is then used to try to obtain a structure of the enzyme in an inhibitor/enzyme complex to show how the molecule is binding to the active site, allowing changes to be made to the inhibitor to try to optimise binding. This test and improve cycle is then repeated until a sufficiently potent inhibitor is produced. [41] Computer-based methods of predicting the affinity of an inhibitor for an enzyme are also being developed, such as molecular docking [42] and molecular mechanics.

Enzyme inhibitors are found in nature and are also designed and produced as part of pharmacology and biochemistry. Natural poisons are often enzyme inhibitors that have evolved to defend a plant or animal against predators. These natural toxins include some of the most poisonous compounds known. Artificial inhibitors are often used as drugs, but can also be insecticides such as malathion, herbicides such as glyphosate, or disinfectants such as triclosan. Other artificial enzyme inhibitors block acetylcholinesterase, an enzyme which breaks down acetylcholine, and are used as nerve agents in chemical warfare.

Chemotherapy Edit

The most common uses for enzyme inhibitors are as drugs to treat disease. Many of these inhibitors target a human enzyme and aim to correct a pathological condition. However, not all drugs are enzyme inhibitors. Some, such as anti-epileptic drugs, alter enzyme activity by causing more or less of the enzyme to be produced. These effects are called enzyme induction and inhibition and are alterations in gene expression, which is unrelated to the type of enzyme inhibition discussed here. Other drugs interact with cellular targets that are not enzymes, such as ion channels or membrane receptors.

An example of a medicinal enzyme inhibitor is sildenafil (Viagra), a common treatment for male erectile dysfunction. This compound is a potent inhibitor of cGMP specific phosphodiesterase type 5, the enzyme that degrades the signalling molecule cyclic guanosine monophosphate. [43] This signalling molecule triggers smooth muscle relaxation and allows blood flow into the corpus cavernosum, which causes an erection. Since the drug decreases the activity of the enzyme that halts the signal, it makes this signal last for a longer period of time.

Another example of the structural similarity of some inhibitors to the substrates of the enzymes they target is seen in the figure comparing the drug methotrexate to folic acid. Folic acid is a substrate of dihydrofolate reductase, an enzyme involved in making nucleotides that is potently inhibited by methotrexate. Methotrexate blocks the action of dihydrofolate reductase and thereby halts the production of nucleotides. This block of nucleotide biosynthesis is more toxic to rapidly growing cells than non-dividing cells, since a rapidly growing cell has to carry out DNA replication, therefore methotrexate is often used in cancer chemotherapy. [44]

Antibiotics Edit

Drugs also are used to inhibit enzymes needed for the survival of pathogens. For example, bacteria are surrounded by a thick cell wall made of a net-like polymer called peptidoglycan. Many antibiotics such as penicillin and vancomycin inhibit the enzymes that produce and then cross-link the strands of this polymer together. [45] This causes the cell wall to lose strength and the bacteria to burst. In the figure, a molecule of penicillin (shown in a ball-and-stick form) is shown bound to its target, the transpeptidase from the bacteria Streptomyces R61 (the protein is shown as a ribbon-diagram).

Antibiotic drug design is facilitated when an enzyme that is essential to the pathogen's survival is absent or very different in humans. In the example above, humans do not make peptidoglycan, therefore inhibitors of this process are selectively toxic to bacteria. Selective toxicity is also produced in antibiotics by exploiting differences in the structure of the ribosomes in bacteria, or how they make fatty acids.

Metabolic control Edit

Enzyme inhibitors are also important in metabolic control. Many metabolic pathways in the cell are inhibited by metabolites that control enzyme activity through allosteric regulation or substrate inhibition. A good example is the allosteric regulation of the glycolytic pathway. This catabolic pathway consumes glucose and produces ATP, NADH and pyruvate. A key step for the regulation of glycolysis is an early reaction in the pathway catalysed by phosphofructokinase-1 (PFK1). When ATP levels rise, ATP binds an allosteric site in PFK1 to decrease the rate of the enzyme reaction glycolysis is inhibited and ATP production falls. This negative feedback control helps maintain a steady concentration of ATP in the cell. However, metabolic pathways are not just regulated through inhibition since enzyme activation is equally important. With respect to PFK1, fructose 2,6-bisphosphate and ADP are examples of metabolites that are allosteric activators. [46]

Physiological enzyme inhibition can also be produced by specific protein inhibitors. This mechanism occurs in the pancreas, which synthesises many digestive precursor enzymes known as zymogens. Many of these are activated by the trypsin protease, so it is important to inhibit the activity of trypsin in the pancreas to prevent the organ from digesting itself. One way in which the activity of trypsin is controlled is the production of a specific and potent trypsin inhibitor protein in the pancreas. This inhibitor binds tightly to trypsin, preventing the trypsin activity that would otherwise be detrimental to the organ. [47] Although the trypsin inhibitor is a protein, it avoids being hydrolysed as a substrate by the protease by excluding water from trypsin's active site and destabilising the transition state. [48] Other examples of physiological enzyme inhibitor proteins include the barstar inhibitor of the bacterial ribonuclease barnase. [49]

Pestizide Bearbeiten

Many pesticides are enzyme inhibitors. Acetylcholinesterase (AChE) is an enzyme found in animals, from insects to humans. It is essential to nerve cell function through its mechanism of breaking down the neurotransmitter acetylcholine into its constituents, acetate and choline. This is somewhat unusual among neurotransmitters as most, including serotonin, dopamine, and norepinephrine, are absorbed from the synaptic cleft rather than cleaved. A large number of AChE inhibitors are used in both medicine and agriculture. Reversible competitive inhibitors, such as edrophonium, physostigmine, and neostigmine, are used in the treatment of myasthenia gravis and in anaesthesia. The carbamate pesticides are also examples of reversible AChE inhibitors. The organophosphate pesticides such as malathion, parathion, and chlorpyrifos irreversibly inhibit acetylcholinesterase.

The herbicide glyphosate is an inhibitor of 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, [50] other herbicides, such as the sulfonylureas inhibit the enzyme acetolactate synthase. Both these enzymes are needed for plants to make branched-chain amino acids. Many other enzymes are inhibited by herbicides, including enzymes needed for the biosynthesis of lipids and carotenoids and the processes of photosynthesis and oxidative phosphorylation. [51]

Natural poisons Edit

Animals and plants have evolved to synthesise a vast array of poisonous products including secondary metabolites, peptides and proteins that can act as inhibitors. Natural toxins are usually small organic molecules and are so diverse that there are probably natural inhibitors for most metabolic processes. [52] The metabolic processes targeted by natural poisons encompass more than enzymes in metabolic pathways and can also include the inhibition of receptor, channel and structural protein functions in a cell. For example, paclitaxel (taxol), an organic molecule found in the Pacific yew tree, binds tightly to tubulin dimers and inhibits their assembly into microtubules in the cytoskeleton. [53]

Many natural poisons act as neurotoxins that can cause paralysis leading to death and have functions for defence against predators or in hunting and capturing prey. Some of these natural inhibitors, despite their toxic attributes, are valuable for therapeutic uses at lower doses. [54] An example of a neurotoxin are the glycoalkaloids, from the plant species in the family Solanaceae (includes potato, tomato and eggplant), that are acetylcholinesterase inhibitors. Inhibition of this enzyme causes an uncontrolled increase in the acetylcholine neurotransmitter, muscular paralysis and then death. Neurotoxicity can also result from the inhibition of receptors for example, atropine from deadly nightshade (Atropa belladonna) that functions as a competitive antagonist of the muscarinic acetylcholine receptors. [55]

Although many natural toxins are secondary metabolites, these poisons also include peptides and proteins. An example of a toxic peptide is alpha-amanitin, which is found in relatives of the death cap mushroom. This is a potent enzyme inhibitor, in this case preventing the RNA polymerase II enzyme from transcribing DNA. [56] The algal toxin microcystin is also a peptide and is an inhibitor of protein phosphatases. [57] This toxin can contaminate water supplies after algal blooms and is a known carcinogen that can also cause acute liver hemorrhage and death at higher doses. [58]

Proteins can also be natural poisons or antinutrients, such as the trypsin inhibitors (discussed above) that are found in some legumes, as shown in the figure above. A less common class of toxins are toxic enzymes: these act as irreversible inhibitors of their target enzymes and work by chemically modifying their substrate enzymes. An example is ricin, an extremely potent protein toxin found in castor oil beans. This enzyme is a glycosidase that inactivates ribosomes. Since ricin is a catalytic irreversible inhibitor, this allows just a single molecule of ricin to kill a cell. [59]


Mechanism of Transformation (With Diagram) | Genetik

Notani and Setlow (1974) have described the mechanism of bacterial transformation. Moreover, in S. pneumoniae the competent state is transient and persists only for a short period. The competent state is induced by the competence activator protein of molecular weight of 1,000 Dalton.

It binds to the plasma membrane of receptor and triggers the synthesis of 10 new proteins within 10 minutes. The competence factor (CF) accelerates the process of transport or leakage of autolysin molecules into the periplasmic space. Moreover, in H. influenzae no competence factors have been reported.

Only Changes in cell envelope accompany the development of competence state. The cell envelope of competent cells contains increased level of polysacccharide as compared to the cells of log phase.

Structural changes in competent cells induce numerous vesicles called transformosome buds on the surface that contains protein and mediates the uptake of transforming DNA. Transformation is accomplished in the following steps (Fig.8.4).

Fig. 8.4 : Diagrammatic presentation of transformation in streptococci.

As a result of random collision, DNA comes first in the contact of cell surface of competent bacteria (Figs. 8.4 and 8.5 A-B). First the DNA binding is reversible and lasts for about 4-5 seconds. Thereafter, it becomes irreversible permanently. For about 2 minutes it remains in non-transforming state. Thereafter, before 5 minutes it is converted into the transforming state.

The period (about 10 minutes) during which no transformation occurs in competent recipient cells is called eclipse. Both types of DNA, transforming and non-transforming, bind to the cell surface where the receptor sites are located. In B. subtilis membrane vesicles in competent cells are found that bind to 20 mg of dsDNA/mg of membrane protein. The competent cells show six fold more DNA binding sites than the non-competent cells.

In H influenzae transformosome bud forms the surface and contains proteins that mediate DNA uptake. It binds with conserved sequence (5’AAGTGCGGTCA 3′) present at 4 kb interval on DNA. The DNA uptake site contains two proteins of 28 and 52 kilo-Daltons. After binding, the receptor proteins present the donor DNA to the membrane associated uptake sites.

In S. pneumoniae the CF induces the ability to bind DNA molecules.

The DNA molecules that bind permanently enter the competent recipient cells. DNA is also resistant to DNase degradation. The nucleolytic enzymes located at the surface of competent recipient cells act upon the donor DNA molecule when it binds the cell membrane.

The endonuclease-1 of the recipient cells which is associated with cell membrane acts as DNA translocase by attacking and degrading one strand of the dsDNA. Consequently only complementary single strand of DNA enters into the recipient cells (Figs. 8.4 and 8.5A).

It has been confirmed by performing the experiments with radiolabelling of donor DNA. The mutant cells of S. pneumoniae lack endonuclease – 1, therefore, transformation does not occur. Interestingly in B. subtilis degradation of one strand is being delayed. Hence, both the strands enter the recipient cell. The upper limit of peneterating DNA into the recipient cell is about 750 base pairs.

The size of donor DNA affects transformation. Successful transformation occurs with the donor DN.A of molecular weight between 30,00,000 and 8 million Dalton. With increasing the concentration of donor DNA the number of competent cells increases. DNA uptake process is the energy requiring mechanism because it can be inhibited by the energy requiring inhibitors.

After penetration the donor DNA migrates from periphery of cell to the bacterial DNA. This movement in different bacteria differs. For example, in B. subtilis this movement occurs for about 16-60 minutes. During this movement, DNA is associated with mesosomes which possibly transport it to the bacterial DNA.

(C) Synapsis formation:

The single stranded DNA is coated with SSB proteins, which maintain, the single stranded region in a replication fork (Fig. 8.5B). The single strand of the donor DNA or portion of it is linearly inserted into the recipient DNA (Fig. 8.5 C-D). The bacterial protein like E. coli RecA protein probably facilitates the DNA pairing during recombination. It causes the local unwinding of dsDNA of the recipient cell from the 5′ end.

How the displaced single strand is cut, still not known? Base pairing i.e. synapsis occurs between the homologous donor ssDNA and the recipient DNA. Unwinding of the recipient DNA continues at the end of assimilated DNA and allows the fraction of invading DNA to increase base pairs. This process is called branch migration (F).

The endonuclease cuts the unpaired free end of donor DNA or the recipient DNA. This process is called trimming (Fig. 8.5E-F). The nick is sealed by DNA ligase (G). Consequently, a heteroduplex region containing a mismatched base pairs is formed (H). Furthermore, in the progenies whether the donor marker is or is not recovered, depends on the occurrence of mismatch repair.

If the mismatch repair occurs again, it depends whether the unpaired base in the donor or recipient strand is removed. After replication the heteroduplex forms the homo-duplexes, one of these is of normal type and the second is transformed duplex. The normal duplex is from the recipient cell in origin, whereas the transformed duplex is from the donor genome.

The efficiency of integration of genetic markers into the genome of recipient cell varies with different genes that the recipient cell possesses. This genetic trait is called hex (high efficiency of integration). The hex system eliminates a large fraction of low efficiency (LE) markers and permits high efficiency (HE) markers to be integrated. Therefore, the hex function is a mismatch-base correction system.

The donor genes differing from the recipient genes by a single base pair create a mismatch when integrated initially. The hex mismatch repair system (with LE markers) can correct either of donor strands. Therefore, there is fifty-fifty chance for a given marker to be retained. The HE markers correct only the recipient strand.

For the LE markers, hex mismatch repair system unusually removes the mismatched bases of the donor DNA and the cell retains the recipient genotype, whereas for HE markers the same system removes the mismatched bases of recipient DNA and the cell consists of donor genotype.

In the later case, after replication of chromosome and cell division the one progeny cell contains the donor genotype and the other has the recipient genotype. These two types of cells can be differentiated through plating method by using the antibiotic markers.

However, for pneumococci it is a general feature that all the strains discriminate between LH and HE markers when transformation has occurred with homologous DNA. The hex – cells (mutant in hex function) fail to discriminate between the two markers and, therefore, integrate all markers with high efficiency, because one of the two daughter cells after cell division contains the genotype.


Summary – Reversible vs Irreversible Inhibition

Enzyme inhibition can be either reversible or irreversible. In summarizing the difference between reversible and irreversible inhibition in reversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme non-covalently. Hence, the unbinding of the inhibitor from the enzyme is easy and rapid. On the other hand, in irreversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme covalently. Therefore, the inhibitor strongly binds with the enzyme and the dissociation of the enzyme-inhibitor complex is slow and hard. Therefore, this is the key difference between reversible and irreversible inhibition. Furthermore, in reversible inhibition, the reaction can be reversed, and the enzyme can be reactivated again. But in irreversible inhibition, the reaction cannot be reversed, and the enzyme cannot be activated again.

Referenz:

1. “Enzyme Inhibitor.” Wikipedia, Wikimedia Foundation, 1 Jan. 2019. Available here
2. “Enzyme Inhibitor.” NeuroImage, Academic Press. Hier verfügbar

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1.”DHFR methotrexate inhibitor”By Thomas Shafee – Own work, (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2.”Covalent-drugs-silence-proteins”By Dr. Juswinder Singh (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia


5A: Introduction to Reversible Binding - Biology

There are two types of reversible inhibitors:

In both cases reversible inhibitors can be removed from the enzymes - but only under certain conditions.

Wettbewerbshemmung

Competitive inhibitors are inhibitors that compete with substrates for the active site. They resemble the substrate in that they can fit into the active site,fooling the enzyme into thinking that they are substrates. They differ from the substrate in that they are unreactive. They therefore reduce the number of enzymes available to catalyse a reaction. If there is enough substrate available though, the chances of an enzyme attracting an inhibitor is smaller - most enzymes will still attract the correct substrates and a reaction can still occur. To help overcome the effect of a competitive inhibitor, the substrate concentration should be increased. The inhibitors usually leave the active site when the substrate concentration is high enough.


Inhibitors are not always poisons or harmful. An example of an inhibitor used in treating poisons is in poisoning. Ethylene glycol is a component of car antifreezes. By itself it is a harmless substance but it is broken down in the body into oxalic acid (a deadly poison) by the enzyme, alcohol dehydrogenase. Alcohol (ethanol) acts as a competitive inhibitor for alcohol dehydrogenase. Giving the patient large amounts of alcohol will cause the ethanol to compete with ethylene glycol for the active site of alcohol dehydrogenase. Alcohol is the preferred substrate for alcohol dehydrogenase so when it is present, it binds with the enzyme. After a while, the ethylene glycol is harmlessly excreted.

Various poisons such as cyanide, arsenic and mercury - in fact many heavy metal ions - act as inhibitors. HCN binds to the active site of various cytochromases which are enzymes that are responsible for catalysing oxidation and reduction processes in cellular respiration. Many diet pills of the 1920s contained arsenic! These inhibited certain digestive enzymes in the human alimentary canal.

Non-competitive inhibition

These substances do not bind to the active site of an enzyme, but rather to other parts of the enzyme. In doing so, they may change the conformation of the active site as has already been explained (breaking certain hydrogen bonds and forming incorrect ones, changing the shape of the active site) and possibly inactivate it.

A non-competitive inhibitor will eventually leave the binding site. Substrate molecules have nothing to do with this, as these inhibitors do not bind to the active site, and therefore have a greater inhibitory effect. A greater substrate concentration will not help as substrate molecules only compete for positions at the active site. Examples include lead, mercury and chromium.


Many pesticides and herbicides are also inhibitors. Read the pamphlet inside the boxes of garden or household poisons and see how these function. Look at medicine pamphlets as well. You will often find that many use inhibitors that block active sites of bacterial enzymes, killing them or stopping their reproduction. Some painkillers also act as inhibitors, eg aspirin.

Erläuterung

When a competitive inhibitor is present, the enzyme activity is decreased compared to when no inhibitor is present. As the substrate concentration is increased, the activity eventually becomes the same.

You will notice that the optimum substrate concentration is much higher.

With a non-competitive inhibitor, the inhibition is not dependent on the substrate concentration and the effect is similar to an irreversible inhibitor.


Reversible Reactions

In reversible reactions, the reactants and products are never fully consumed they are each constantly reacting and being produced. A reversible reaction can take the following summarized form:

This reversible reaction can be broken into two reactions.

Reaction 1: [ A + B xrightarrowC+D ]

Reaction 2: [ C + D xrightarrow>A+B ]

These two reactions are occurring gleichzeitig , which means that the reactants are reacting to yield the products, as the products are reacting to produce the reactants . Collisions of the reacting molecules cause chemical reactions in a closed system. After products are formed, the bonds between these products are broken when the molecules collide with each other, producing sufficient energy needed to break the bonds of the product and reactant molecules.

Below is an example of the summarized form of a reversible reaction and a breakdown of the reversible reaction N2Ö4 &harr 2NO2

Reaction 1 and Reaction 2 happen at the same time because they are in a closed system.

Blue : Nitrogen Red : Oxygen

Imagine a ballroom. Let reactant A be 10 girls and reactant B be 10 boys. As each girl and boy goes to the dance floor, they pair up to become a product. Once five girls and five boys are on the dance floor, one of the five pairs breaks up and moves to the sidelines, becoming reactants again. As this pair leaves the dance floor, another boy and girl on the sidelines pair up to form a product once more. This process continues over and over again, representing a reversible reaction.

Unlike irreversible reactions, reversible reactions lead to equilibrium: in reversible reactions, the reaction proceeds in both directions whereas in irreversible reactions the reaction proceeds in only one direction. To learn more about this phenomenon, click here: Chemical Equilibrium

If the reactants are formed at the same rate as the products, a dynamic equilibrium exists. For example, if a water tank is being filled with water at the same rate as water is leaving the tank (through a hypothetical hole), the amount of water remaining in the tank remains consistent.


Reversible covalent direct thrombin inhibitors

Einführung: In recent years, the traditional treatments for thrombotic diseases, heparin and warfarin, are increasingly being replaced by novel oral anticoagulants offering convenient dosing regimens, more predictable anticoagulant responses, and less frequent monitoring. However, these drugs can be contraindicated for some patients and, in particular, their bleeding liability remains high.

Methoden: We have developed a new class of direct thrombin inhibitors (VE-DTIs) and have utilized kinetics, biochemical, and X-ray structural studies to characterize the mechanism of action and in vitro pharmacology of an exemplary compound from this class, Compound 1.

Ergebnisse: We demonstrate that Compound 1, an exemplary VE-DTI, acts through reversible covalent inhibition. Compound 1 inhibits thrombin by transiently acylating the active site S195 with high potency and significant selectivity over other trypsin-like serine proteases. The compound inhibits the binding of a peptide substrate with both clot-bound and free thrombin with nanomolar potency. Compound 1 is a low micromolar inhibitor of thrombin activity against endogenous substrates such as fibrinogen and a nanomolar inhibitor of the activation of protein C and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. In the thrombin generation assay, Compound 1 inhibits thrombin generation with low micromolar potency but does not increase the lag time for thrombin formation. In addition, Compound 1 showed weak inhibition of clotting in PT and aPTT assays consistent with its distinctive profile in the thrombin generation assay.

Abschluss: Compound 1, while maintaining strong potency comparable to the current DTIs, has a distinct mechanism of action which produces a differentiating pharmacological profile. Acting through reversible covalent inhibition, these direct thrombin inhibitors could lead to new anticoagulants with better combined efficacy and bleeding profiles.

Interessenkonflikt-Erklärung

MS, MR, KL, TPS, DMC, LI, SC, PZ, MAE, KMS, DCW, AD, and DBK are employees of Verseon Corporation. EDC discloses a financial interest in Verseon Corporation and funding through NIH grants HL049413, HL073813, and HL112303. NP discloses a financial interest in Hemadvance, LLC and funding through AHA grant AHA15SDG25550094. KMS and DCW are inventors on a patent application (WO/2014/149139) that includes Compound 1 and has local applications pending in numerous jurisdictions worldwide. This does not alter our adherence to PLOS ONE policies on sharing data and materials.

Figuren

Fig 1. Structures of Compound 1, the…

Fig 1. Structures of Compound 1, the dansylated Compound 2, and the deacylated Compound 3…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with thrombin.

Compound 1 at 1 μM was incubated…

Fig 4. Structural model of the thrombin…

Fig 4. Structural model of the thrombin active site.

The structural model of the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin active site modified by Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

% Thrombin activity was recorded as a function…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation assay for argatroban, dabigatran, and Compound 1.


AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF MINIMAL AMOUNT OF ACETYLCHOLINESTERASE FROM NERVOUS TISSUES AND ERYTHROCYTE MEMBRANES

Publisher Summary

This chapter discusses the affinity chromatography of minimal amount of acetylcholinesterase from nervous tissues and erythrocyte membranes. It discusses a study in which a suitable method for the selective isolation of AChE from other proteins, by affinity chromatography, was worked out by integrating and modifying three available methods. Affigel 202 (Bio-Rad) was covalently linked to a specific and reversible AChE inhibitor. This inhibitor was synthesized, and its properties as the differential inhibitor of AChE and butyrilcholinesterase (3.1.1.8.) (BuChE) were examined. The values of PI 50 were found to be 3.8, 4.0, and 2.0 for rat brain AChE, electric eel AChE, and horse serum BuChE, respectively. According to the batchwise procedure, finally adopted, the sample containing at least 60 mU was loaded onto a similar volume of the affinity chromatography gel and the unbound proteins were removed by centrifugation. After three washings with a threefold volume of saline phosphate buffer, AChE was eluted in two steps from the gel by choline chloride solution, which proved effective because of the poor affinity of the linked inhibitor for AChE. The AChE activity, recovered after centrifugation and dialysis of the supernatant, was about 90% of the activity in the sample.

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