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15.4O: Dendritische Zellen - Biologie

15.4O: Dendritische Zellen - Biologie


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Dendritische Zellen (DCs) haben ihren Namen von ihren Oberflächenprojektionen (die den Dendriten von Neuronen ähneln). Sie kommen in den meisten Geweben des Körpers vor und sind besonders häufig dort, wo sie Schnittstellen zwischen der äußeren und inneren Umgebung (z solche, die von eindringenden Krankheitserregern exprimiert werden.

Obwohl es mehrere verschiedene Untertypen von DCs gibt, haben sie alle diese Funktionen:

  • Sie sind aktiv beweglich.
  • Sie nehmen kontinuierlich Proben aus ihrer Umgebung – nehmen Antigene durch Endozytose auf (unter Verwendung von Phagozytose, rezeptorvermittelter Endozytose und Pinozytose).
    • Viele dieser Antigene sind "Selbst"-Antigene, z. B. tote Zellen, Proteine ​​in der extrazellulären Flüssigkeit.
    • Die Antigene können aber auch Fremdantigene sein, beispielsweise Bakterien, die im Körper (z. B. im Dickdarm) resident sind oder in den Körper eindringen.

    In jedem Fall werden die aufgenommenen Antigene in Lysosomen zu Peptidfragmenten abgebaut, die dann an der Zelloberfläche, eingebettet in Klasse-II-MHC-Moleküle, präsentiert werden.

Nachdem sie Antigen in das Gewebe aufgenommen haben, wandern sie zu Lymphknoten und Milz, wo sie auf T-Zellen treffen können, die den entsprechenden T-Zell-Rezeptor für Antigen (TCR) tragen.

Was als nächstes passiert, hängt von der Art des Antigens ab.

  • Selbstantigene werden T-Zellen ohne kostimulatorische Moleküle präsentiert. Diese Wechselwirkung bewirkt, dass sich die T-Zellen für kurze Zeit teilen, dann aber durch Apoptose Selbstmord begehen und so Körpergewebe nicht angreifen können. Das Tier wird gegenüber diesem Antigen tolerant.
  • Fremde Antigene führen zu einem anderen Ergebnis. Die dendritischen Zellen werden "aktiviert" und beginnen sich nicht nur anzuzeigen
    • der MHC-Peptid-Komplex für den TCR der T-Zellen aber auch
    • kostimulatorische Moleküle, z.B. B7, das an CD28 auf der T-Zelle bindet

Die Bedeutung dendritischer Zellen für die Entwicklung einer Immunität gegen Krankheitserreger zeigt sich dramatisch bei jenen seltenen Säuglingen, denen ein funktionierendes Gen fehlt, das für die Bildung von dendritischen Zellen benötigt wird. Sie sind so stark immundefizient, dass sie lebensbedrohlichen Infektionen ausgesetzt sind.

Was erklärt die Aktivierung dendritischer Zellen durch Fremdantigene, aber nicht durch Eigenantigene? Krankheitserreger, insbesondere Bakterien, haben molekulare Strukturen, die

  • werden nicht mit ihrem Gastgeber geteilt
  • werden von vielen verwandten Krankheitserregern geteilt
  • sind relativ unveränderlich; das heißt, entwickeln sich nicht schnell (im Gegensatz beispielsweise zu Krankheitserregermolekülen wie Hämagglutinin und Neuraminidase von Influenzaviren).

Diese werden Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) genannt.

Beispiele:

  • das Flagellin von bakteriellen Flagellen
  • das Peptidoglycan grampositiver Bakterien
  • das Lipopolysaccharid (LPS, auch genannt Endotoxin) von gramnegativen Bakterien
  • doppelsträngige RNA. (Einige Viren sowohl von Pflanzen als auch von Tieren haben ein Genom von dsRNA. Und viele andere Viren von Pflanzen und Tieren haben ein RNA-Genom, das in der Wirtszelle kurzzeitig in dsRNA umgewandelt wird).
  • unmethylierte DNA (Eukaryoten haben um ein Vielfaches mehr Cytosine, im Dinukleotid CpG, mit angehängten Methylgruppen).

Dendritische Zellen haben eine Reihe von Transmembranrezeptoren, die verschiedene Arten von PAMPs erkennen. Diese werden aufgrund ihrer Homologie zu den zuerst in Drosophila entdeckten und benannten Rezeptoren als Toll-like-Rezeptoren (TLRs) bezeichnet.

TLRs identifizieren die Art des Pathogens und aktivieren eine Effektorreaktion, die für den Umgang mit ihm geeignet ist. Diese Signalkaskaden führen zur Expression verschiedener Zytokin-Gene.

  • Interleukin 12 (IL-12) treibt die nahegelegenen T-Zellen zu Th1-Zellen, die die zellvermittelte Immunität unterstützen, einschließlich des Angriffs gegen intrazelluläre Krankheitserreger.
  • IL-23, das die Differenzierung der T-Zellen zu Th17-Helferzellen fördert, die mit extrazelluläre Bakterien.
  • IL-4, das die Differenzierung der T-Zellen zu Th2-Zellen fördert, die die Antikörperproduktion durch B-Zellen unterstützen.

Unter anderen Umständen können aktivierte dendritische Zellen TGF-β und sezernieren IL-10, was zur Bildung von regulatorischen T-Zellen (Treg) führt, die die Immunantwort dämpfen.

Dendritische Zelluntergruppen

Obwohl alle DCs bestimmte Merkmale gemeinsam haben, repräsentieren sie tatsächlich eine Vielzahl von Zelltypen mit unterschiedlichen Differenzierungsgeschichten, phänotypischen Merkmalen und, wie oben beschrieben, unterschiedlichen Effektorfunktionen.

Beispiele:

Myeloische dendritische Zellen

Wie der Name schon sagt, stammen diese Zellen ("mDCs") von denselben myeloischen Vorläufern im Knochenmark ab, aus denen Granulozyten und Monozyten entstehen. Sie präsentieren T-Zellen Antigen und aktivieren die T-Zellen, indem sie große Mengen an IL-12 absondern.

Plasmazytoide dendritische Zellen

Diese Zellen ("pDCs") haben ihren Namen von ihrem ausgedehnten endoplasmatischen Retikulum, das dem von Plasmazellen ähnelt. Im Gegensatz zu Plasmazellen, die Maschinen zum Abpumpen von Antikörpern sind, sezernieren pDCs jedoch insbesondere als Reaktion auf Virusinfektionen große Mengen an Interferon-alpha.

Plasmazytoide DCs haben interne Toll-like-Rezeptoren:

  • TLR-7 und TLR-8, die an die einzelsträngigen RNA (ssRNA)-Genome von Viren wie Influenza, Masern und Mumps binden.
  • TLR-9, das an die . bindet unmethylierte Cytosine im Dinukleotid CpG in der DNA des Erregers. (An die Cytosine in den CpG-Dinukleotiden des Wirts sind oft Methylgruppen gebunden.)

CD8+ vs. CD8− Dendritische Zellen

Diese Untergruppen werden in der Milz der Maus gefunden.

  • Der CD8 Untergruppe präsentiert Antigen, das von der Umgebung verschlungen wurde – unter Verwendung des Klasse-II-Wegs – zu CD4+ T-Helferzellen.
  • Der CD8+ Untergruppe kann auch extrazelluläre Antigene unter Verwendung des Klasse-I-Wegs präsentieren. Die Peptid/MHC-Klasse-I-Moleküle werden CD8 . präsentiert+ T-Zellen, die zu zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) werden. Dieses Phänomen heißt Cross-Präsentation.

Dendritische Zellen können B-Zellen auch nicht abgebautes Antigen präsentieren; das heißt Antigen, das nicht zu Peptid/MHC-Komplexen prozessiert wurde.

Von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen (Mo-DCs)

Menschen (und Mäuse) haben eine andere Population von dendritischen Zellen, die sich aus durch Blut übertragenen Monozyten entwickeln, die Gram-negativen Bakterien (oder deren LPS) ausgesetzt waren. Das LPS wird durch ihre TLR4-Moleküle nachgewiesen. Mo-DCs können Antigene präsentieren beide CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen (Kreuzpräsentation).

Ralph Steinmann

Ralph Steinman, der Pionier in der Erforschung dendritischer Zellen, hat eindrucksvolle visuelle Beweise für die zellulären Interaktionen zwischen Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen, T-Zellen und B-Zellen geliefert. Wenn Milzzellen mit Antigen kultiviert werden, bilden sich enge Zellcluster (siehe Abbildung). Die Clusterbildung erfolgt in zwei Phasen:

  • eine frühe Phase (Tage 0–2), in der nur die dendritischen Zellen und T-Zellen vorhanden sein müssen, um Cluster zu bilden
  • eine spätere Phase (Tage 2–5), wenn Antigen-geprimte B-Zellen in den Cluster eintreten und sich in Antikörper-sezernierende Zellen differenzieren

Bilder mit freundlicher Genehmigung von Ralph Steinman von K. Inaba et al., J. Erw. Med. 160:858, 1984

Referenzfahrt

Einige dendritische Zellen aktivieren nicht nur T-Zellen, um auf ein bestimmtes Antigen zu reagieren, sondern sagen ihnen, wo sie mit diesem Antigen umgehen sollen.

Zwei Beispiele:

Antigene in der Haut

  • Dendritische Zellen verschlingen Antigene in (oder sogar auf!*) die Haut und wandeln dabei Calciferol (Vitamin D3) in der Haut in Calcitriol (1,25[OH]2 Vitamin-D3).
  • Wenn sie die entsprechenden T-Zellen in einem nahegelegenen Lymphknoten aktivieren, induziert das Calcitriol diese T-Zellen, einen Oberflächenrezeptor mit der Bezeichnung CCR10 (ein Mitglied der CC-Chemokinrezeptorfamilie) zu exprimieren.
  • CCR10 bindet das Chemokin CCL27, das in der Haut vorhanden ist.
  • Wenn also diese T-Zellen die Haut reajavascript:void('Remove Anchor')ch reajavascript:void('Remove Anchor')ch der Haut, stoppen sie ihre Reise und gehen dort an die Arbeit.

Antigene im GI-Trakt

  • Dendritische Zellen in der Darmschleimhaut sind ständig damit beschäftigt, die vielen dort vorhandenen Antigene zu verschlingen.
  • Dabei wandeln sie dort die reichlich vorhandene Menge an Retinol (Vitamin A) in Retinsäure um.
  • Wenn sie die entsprechenden T-Zellen in einem nahegelegenen Lymphknoten aktivieren, induziert die Retinsäure diese T-Zellen, einen anderen CC-Chemokinrezeptor mit der Bezeichnung CCR9 zu exprimieren.
  • CCR9 bindet das im Darm vorhandene Chemokin CCL25.
  • Wenn diese T-Zellen den Darm erreichen, stoppen sie ihre Reise und machen sich an die Arbeit. (CCL25 zieht auch IgA-sezernierende B-Zellen an.)

Umschalten der Referenzfahrtrichtungen

Die meisten Impfstoffe werden durch Injektion in Muskeln oder Haut verabreicht. Dies funktioniert sehr gut, um eine systemische Immunität zu induzieren; dh IgG-Antikörper im Blut, die im Blut vorhandene Krankheitserreger (z. B. Tetanus) angreifen können.

Injizierte Impfstoffe wirken nicht so gut bei Erkrankungen, die durch Darmpathogene verursacht werden, wie z

  • Typhus (verursacht durch Salmonellen typhi)
  • Cholera (verursacht durch Vibrio cholerae)

Eine Gruppe deutscher Immunologen berichtete jedoch im Juli 2011, dass:

  • in der Erwägung, dass dendritische Zellen, die Antigene durch Injektionen unter die Haut erhalten, die T-Zellen beeinflussen, zurück in die Haut zu wandern (wie wir oben gesehen haben),
  • wenn diese subkutanen Injektionen von Injektionen von . begleitet werden Retinsäure, wandern die T-Zellen stattdessen in den Darm.
  • CCR9+ Plasmazellen, die Antigen-spezifische IgA-Antikörper sezernierten, traten auch im Darm auf.

Mit dieser Technik konnten diese Arbeiter ihre Mäuse vor Mäusetyphus schützen (Salmonella typhimurium) und Cholera-Toxin.


Oxidiertes Lipoprotein niedriger Dichte stimuliert die Reifung dendritischer Zellen über den LOX-1-vermittelten MAPK/NF-[kappa]B-Weg.

Atherosklerotische Gefäßerkrankungen sind nach wie vor eine der häufigsten Todes- und Morbiditätsursachen weltweit. Die Arteriosklerose ist als chronisch-entzündliche Erkrankung der Gefäßwand charakterisiert und wird durch eine Ansammlung von Lipiden in den Arterienwänden, die Infiltration vieler Arten von Immunzellen und die Bildung einer fibrösen Kappe charakterisiert (1). Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass dendritische Zellen (DCs) eine entscheidende Rolle als zentrale Orchestratoren der Immunantwort bei der Initiierung und Progression von Atherosklerose innerhalb der Arterienwände spielen (2-5).

Die Aufnahme von oxidiertem Low-Density-Lipoprotein (oxLDL) über Scavenger-Rezeptoren durch Endothelzellen und Immunzellen gilt als kritischer Schritt bei der Initiierung und Progression der Atherosklerose (6). Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) kann sowohl endogene als auch exogene Liganden erkennen und spielt eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung der Wirkungen von oxLDL auf die Endothelbiologie (7-9). Die frühere Arbeit unserer Gruppe legte nahe, dass LOX-1 an der Dynamik der Immunreifung von DCs beteiligt ist, die mit oxLDL und hohem Glukosegehalt stimuliert werden (10,11).

Der LOX-1/p38-Weg der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) ist nachweislich an der endothelialen Dysfunktion bei Atherosklerose beteiligt (12,13). Die Dynamik und Mechanismen der Regulation von LOX-1 durch oxLDL in DCs bleiben jedoch unklar. Daher versuchten wir, die Auswirkungen von oxLDL auf die Expression von LOX-1 in DCs zu untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die an diesem Prozess beteiligt sind.

Kultur und Transfektion von dendritischen Zellen

Wie zuvor beschrieben, wurden Knochenmarks-DCs von C57BL/6-Mäusen erhalten (14). Kurz gesagt wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, und Knochenmarksvorläufer wurden aus den langen Knochen (Oberschenkel und Schienbein) ausgewaschen und in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco, USA) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Invitrogen, USA) mit 10 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und 1 ng/ml Interleukin (IL)-4 (PeproTech, USA). Nicht-adhärente Zellen wurden nach 48 h vorsichtig ausgewaschen. Die restlichen Cluster, die lose an der Petrischale hafteten, wurden kultiviert und das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Am 7. Tag wurden die Zellen für die Behandlung mit unterschiedlichen Protokollen in Abhängigkeit von den nachfolgenden Studien gesammelt.

Zur Immunreifung wurden DCs 24 h mit oxLDL (20 oder 50 [micro]g/mL Meilun Technology, China) oder PBS behandelt.

Für die Transfektionsstudie wurden DCs 24 h mit siRNA LOX-1 transfiziert und anschließend weitere 24 h mit oxLDL oder PBS behandelt. Die DCs wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines riboFECT CP-Transfektionskits (Ribobio, China) verarbeitet. LOX-1-siRNA wurde von Ribobio gekauft und die transfizierte Konzentration betrug 50 nM. Die siR-Ribo Transfection Control (Cy3) wurde in Zellen transfiziert und die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Immunfluoreszenzmikroskopie (Zeiss, Deutschland) beobachtet. Wir verwendeten die siR-Ribo-Negativkontrolle während der Transfektionsstudie.

Die Expression von DCs-Oberflächenmarkern wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zellen bestimmt, die mit Anti-CD80, Anti-CD86, Anti-CD40, Anti-83 und Anti-CD11c (BD Pharmingen, USA) gefärbt wurden. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und eine Immunfluoreszenzanalyse wurde unter Verwendung des FACScan-Durchflusszytometers (BD Biosciences, USA) und der Cell Quest-Software (BD Biosciences) durchgeführt.

Gesamt-RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Sangon, China) gemäß den Protokollen und Richtlinien des Herstellers extrahiert. ReverTra Ace qRT-PCR Kit (TOYOBO, Japan) wurde verwendet, um cDNA aus mRNA zu erzeugen. SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan) wurde für die qRT-PCR auf der ABI 7500 Real-time PCR-Systemplattform gemäß den Protokollen und Anweisungen des Herstellers verwendet. Primer-Sets für die Amplifikation von Maus-IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, Tumornekrosefaktor (TNF)-&agr; und Interferon (IFN)-&ggr; sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die isolierten Zellen wurden in RIPA-Puffer, ergänzt mit vollständigen Protease-Inhibitor-Cocktailtabletten (Roche, Schweiz), lysiert. Nach 30 Minuten Lyse wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.800 g für 20 Minuten bei 4°C entfernt. Zelllysate wurden unter Verwendung von SDS-PAGE-Gelen getrennt. Die Bestandteile wurden auf PVDF-Membranen (Bio-Rad, USA) übertragen und die Membranen mit den entsprechenden Antikörpern wie oben angegeben inkubiert. Die relativen Intensitäten der Proteinbanden wurden unter Verwendung der Software von Quantity One (BioRad, USA) analysiert. Alle Werte wurden auf die GAPDH-Beladungskontrolle normalisiert. Anti-p-p38-, c-fos- und p-p105-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology (USA) gekauft und Anti-LOX-1 wurde von Abcam (USA) gekauft.

Für quantifizierungsbasierte Analysen wurden für jedes Experiment mindestens drei unabhängige Replikate für jede Probe verwendet. Die Daten werden als Mittelwert [+ oder –] SD angegeben. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer einmaligen ANOVA analysiert, gefolgt von einem exakten Fisher-Test, um zwei Gruppen zu vergleichen. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 6 (USA) durchgeführt. Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit P<0,05 als signifikant angesehen.

Die Studie wurde vom Animal Care and Use Committee der Fudan University genehmigt. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den US National Institutes of Health veröffentlicht wurde.

Kultur dendritischer Zellen und Stimulation mit oxLDL

Für die Gültigkeit von IMDM bei der Kultivierung von Knochenmarks-DCs wurden die Zellen durch ein Mikroskop beobachtet und am 7. Tag durch die CD11c-Expression durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine zufriedenstellende morphologische Struktur (Abbildung 1A) und 85-90% der Zellen waren CD11c-positiv.

In kultivierten Knochenmarks-DCs regulierte die oxLDL-Behandlung die Reifungsmarker der DCs wie CD40, CD80, CD83 und CD86 (Abbildung 1B) und erhöhte proinflammatorische Zytokine, einschließlich TNF-&agr;, IL-12, IL-1, IL -6 und IFN-&ggr; (Fig. 1C). Die Expression des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 war jedoch verringert ( 1C ).

OxLDL erhöhte die LOX-1-Expression und aktivierte MAPK/NF-[kappa]B-Signalwege

OxLDL hochregulierte LOX-1-Expression bei Konzentrationen von 20 und 50 [micro] g/ml (Abbildung 2A und B). Die Expressionen von p-p38, c-fos und p-p105 wurden in DCs erhöht, die mit 20 [micro] mg/ml oxLDL stimuliert wurden (Abbildung 2C und D).

Die LOX-1-Expression wurde durch siRNA . herunterreguliert

Um die Rolle von LOX-1 zu untersuchen, verwendeten wir siRNA, um eine Herunterregulierung der Expression von LOX-1 in DCs zu induzieren. Die transfizierte siRNA-cy3 in DCs bestätigte die erfolgreiche Transfektion durch Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3A). Die Transfektion von LOX-1-siRNA unterdrückte die oxLDL-induzierte Hochregulierung von LOX-1 (Abbildung 3B und C).

Hemmung von LOX-1 abgeschwächten MAPK/NF-[kappa]B-Signalwegen und entzündlichen Zytokinen

Schließlich untersuchten wir die Rolle von LOX-1 bei der Regulation von MAPK/NF-[kappa]B-Signalwegen und inflammatorischen Zytokinen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung von LOX-1 die Expression von p-p38 und p-p105 verringerte ( 4A und B). Anschließend unterdrückte die Transfektion von LOX-1-siRNA die oxLDL-induzierte Hochregulierung von inflammatorischen Zytokinen, einschließlich IL-6, TNF-&agr; und IFN-&ggr;, in DCs (Abbildung 4C).

In dieser Studie fanden wir, dass oxLDL die Reifung von DCs über den LOX-1-vermittelten MAPK/NF-[kappa]B-Weg stimuliert. Diese Ergebnisse könnten dazu beitragen, besser zu verstehen, wie unreife DCs in vaskulärer Intima durch oxLDL aktiviert werden und zur Initiierung von Arteriosklerose beitragen.

Bei Mäusen befinden sich CD11c+-DCs häufig in der Aortenintima in Bereichen, die für Atherosklerose prädisponiert sind. DCs können auch in der arteriellen Intima gesunder junger Personen nachgewiesen werden, und eine erhöhte Anzahl von DCs wird in atherosklerotischen Läsionen gefunden (2,15). In der normalen arteriellen Intima gelten diese residenten DCs als unreif (16). Die Reifung von DCs ist der entscheidende Schritt für ihre Funktion in der Immunreaktion. Eine Vielzahl von Stimuli kann die Reifung von DCs wie Krankheitserregern (Lipopolysaccharide, bakterielle DNA) und Zytokinen initiieren (17). Unsere Studie zeigte, dass oxLDL die Reifung von DCs induzierte, begleitet von einer erhöhten phänotypischen Expression von Reifungsmarkern (CD40, CD80, CD83 und CD86) und proinflammatorischen Zytokinsekretionen (TNF-&agr;, IL-12, IL-1, IL-6 und IFN-&ggr;), was mit den Ergebnissen von Zaguri et al. (18). Außerdem wurde die Sekretion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 verringert. Zytokine, die an der menschlichen Atherosklerose beteiligt sind, können grob als proinflammatorisch und proatherogen (wie IL-1, IL-6 und TNF) oder als entzündungshemmend und antiatherogen (wie IL-10 und IL-1rA .) klassifiziert werden ) (19). Perrin-Coconet al. berichteten auch, dass die Zugabe von oxLDL während des späten Stadiums der Monozytendifferenzierung direkt zu phänotypisch reifen DCs führt, die IL-12, aber nicht IL-10 sezernieren (20). Die Induktion einer Hypercholesterinämie bei Mäusen löst eine schnelle Aufnahme von Lipiden durch residente Intima-DCs aus, die die Bildung einer naszierenden Schaumzellläsion initiieren (21).

Die OxLDL-Aufnahme wird durch die Scavenger-Rezeptoren vermittelt (22).LOX-1 ist der dominante Scavenger-Rezeptor, der oxLDL in Endothelzellen erkennt und internalisiert und auch auf der Oberfläche von glatten Muskelzellen, Blutplättchen, Fibroblasten, DCs, B-Zellen und Makrophagen exprimiert wurde (9). Die LOX-1-oxLDL-Wechselwirkung induziert eine endotheliale Dysfunktion, Leukozytenadhäsion, Makrophagen-abgeleitete Schaumzellbildung, Proliferation und Migration glatter Muskelzellen und Thrombozytenaktivierung (7). Unsere frühere Arbeit legt nahe, dass LOX-1 an der Dynamik der Immunreifung von DCs beteiligt ist, die mit oxLDL, hohem Glucosegehalt und Angiotensin II stimuliert werden (10,11). In Endothelzellen induziert oxLDL die Aktivierung von LOX-1, die mit dem p38-MAPK-Signalweg assoziiert ist (23). Eine In-vivo-Studie zeigte auch, dass die Phosphorylierung von p38 MAPK bei den LOX-1-Knockout-Mäusen reduziert ist (24), aber einige Studien deuten darauf hin, dass die Aktivierung von NF-[kappa]B die Expression von LOX-1 in Endothelzellen erhöht ( 7,8). Unsere Studien zeigten, dass oxLDL die Expression von LOX-1 in DCs erhöhte und dass sowohl der p38-MAPK-Weg als auch der NF-[kappa]B-Weg an diesem Prozess beteiligt waren.

Nickelet al. fanden, dass oxLDL die Expression der Scavenger-Rezeptoren CD205 und CD36 erhöht und ein proinflammatorisches Zytokinprofil in humanen DCs induziert, was zur DC-Reifung und Differenzierung führt, die LOX-1-Expression jedoch nicht beeinflusst wird (22). Im Gegensatz dazu fanden wir, dass oxLDL die Expression von LOX-1 von Knochenmarks-DCs bei Mäusen mit einer relativ höheren Konzentration (20 und 50 [Mikro]g/ml) hochreguliert als die in der vorherigen Studie verwendeten 10 [Mikro]g/ml . Beide Studien zeigten, dass die Blockade des LOX-1 die oxLDL-Aufnahme und die DC-Reifung reduzieren könnte.

Die Hochregulierung von LOX-1 förderte die Aufnahme von oxLDL und die Bildung von Schaumzellen. Von therapeutischer Relevanz haben sich mehrere Naturstoffe und klinisch eingesetzte Medikamente, darunter Aspirin (25), Losartan (26) und sogar Testosteron (27), als LOX-1-Inhibitoren mit anti-atherosklerotischer Wirkung erwiesen (7). Unsere Studien zeigten, dass die Hemmung von LOX-1 die durch verschiedene Stimuli wie oxLDL, Angiotensin II und hohe Glukose induzierte Reifung von DCs abschwächte und anschließend die Bildung von Schaumzellen reduzierte (10,11). Alle Studien hoben das Potenzial von LOX-1 als vielversprechendes Therapieziel bei Arteriosklerose und verwandten Erkrankungen hervor.

Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2016 YFC1301203) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China unterstützt.

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(20.) Perrin-Cocon L, Coutant F, Agaugue S, Deforges S, Andre P, Lotteau V. Oxidiertes Low-Density-Lipoprotein fördert den Übergang von reifen dendritischen Zellen von differenzierenden Monozyten. J Immunol 2001 167: 3785–3591, doi: 10.4049/jimmunol.167.7.3785.

(21.) Paulson KE, Zhu SN, Chen M, Nurmohamed S, Jongstra-Bilen J, Cybulsky MI. Residente dendritische Zellen der Intima akkumulieren Lipide und tragen zur Initiierung von Atherosklerose bei. Circ Res 2010 106: 383-390, doi: 10.1161/CIRCRESAHA. 109.210781.

(22.) Nickel T, Schmauss D, Hanssen H, Sicic Z, Krebs B, Jankl S, et al. Die Aufnahme von oxLDL durch dendritische Zellen induziert eine Hochregulierung von Scavenger-Rezeptoren, Reifung und Differenzierung. Arteriosklerose 2009 205: 442-450, doi: 10.1016/j.atherosklerose.2009.01.002.

(23.) Van Vre EA, Hoymans VY, Bult H, Lenjou M, Van Bockstaele DR, Vrints CJ, et al. Verminderte Anzahl von zirkulierenden plasmazytoiden dendritischen Zellen bei Patienten mit atherosklerotischer koronarer Herzkrankheit. Coron Artery Dis 2006 17: 243-248, doi: 10.1097/00019501-200605000-00007.

(24.) Mehta JL, Sanada N, Hu CP, Chen J, Dandapat A, Sugawara F, et al. Die Deletion von LOX-1 reduziert die Atherogenese bei LDLR-Knockout-Mäusen, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden. Circ Res 2007 100: 1634-1642, doi: 10.1161/CIRCRESAHA.107.149724.

(25.) Mehta JL, Chen J, Yu F, Li DY. Aspirin hemmt die ox-ldl-vermittelte lox-1-Expression und Metalloproteinase-1 in menschlichen Koronarendothelzellen. Cardiovasc Res 2004 64: 243-249, doi: 10.1016/j.cardiores.2004.07.002.

(26.) Ge J, Huang D, Liang C, Luo Y, Jia Q, Wang K. Hochregulation der lektinähnlichen oxidierten Low-Density-Lipoproteinrezeptor-1-Expression trägt zur Venentransplantat-Arteriosklerose bei: Modulation durch Losartan. Arteriosklerose 2004 177: 263-268, doi: 10.1016/j.atherosklerose.2004.07.021.

(27.) Gao S, Geng YJ. Lox-1: ein männlicher hormonregulierter Scavenger-Rezeptor für Atherosklerose. Vascul Pharmacol 2013 59: 138-143, doi: 10.1016/j.vph.2013.10.003.

D. Huang [1] * [ID], W. Gao [1] * [ID], H. Lu [1] [ID], J.Y. Qian [1] [ID] und J.B. Ge [1] [ID] ([Mail])

[1] Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, VR China

Korrespondenz: Junbo Ge: [email protected]>

* Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.

Eingegangen am 8. Januar 2021 | Angenommen 20. April 2021

Bildunterschrift: Abbildung 1. Kultur von dendritischen Knochenmarkzellen (BMDC) und Stimulation mit oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (oxLDL). A, Typische Morphologie von BMDCs am Tag 7. Maßstabsbalken = 200 [micro]m. B, Statistische Ergebnisse der Oberflächenmarker von reifen BMDCs durch Durchflusszytometrie. C, qRT-PCR-Analyse von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen in BMDCs nach Behandlung mit oxLDL. Die Daten werden als Mittelwert [+ oder –] SD (n=3) angegeben. * P<0,05 vs. Kontrolle, *** P<0,01 vs. Kontrolle (ANOVA).

Bildunterschrift: Abbildung 2. Lektin-ähnliche oxidierte Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-1 (LOX-1)-Expression und MAPK/NF-[kappa]B-Signalweg in dendritischen Zellen (DCs), stimuliert durch oxidiertes Low-Density-Lipoprotein (oxLDL) (A und B). C und D, Expression von p-p38, c-fos und p-p105 in DCs nach Behandlung mit oxLDL. Die Daten werden als Mittelwert [+ oder –] SD (n=3) angegeben. * P<0,05 vs. Kontrolle, *** P<0,01 vs. Kontrolle (ANOVA).

Bildunterschrift: Abbildung 3. Dendritische Zellen (DCs) transfiziert mit siRNA-LOX-1- und LOX-1-Expression. A, Die Fluoreszenzbeobachtung von DCs nach Transfektion mit siRNA-cy3. Maßstabsbalken=200 [micro]m. B und C, Expression von LOX-1 in DCs nach Transfektion mit siRNA-LOX-1 und Behandlung mit oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (oxLDL). Die Daten werden als Mittelwert [+ oder –] SD (n=3) angegeben. *** P<0,01 vs. Kontrolle, ### P<0,01 vs. nicht transfizierte Gruppen (ANOVA).

Bildunterschrift: Abbildung 4. Hemmung von LOX-1 abgeschwächten MAPK/NF-[kappa]B-Signalwegen und entzündlichen Zytokinen. A und B, Expression von p-p38 und p-p105 in dendritischen Zellen (DCs) nach Transfektion mit siRNA-LOX-1 und Behandlung mit oxidiertem Low-Density-Lipoprotein (oxLDL). C, qRT-PCR-Analyse von proinflammatorischen Zytokinen in DCs nach Transfektion mit siRNA-LOX-1 und Behandlung mit oxLDL. Die Daten werden als Mittelwert [+ oder –] SD (n=3) angegeben. * P<0,05, *** P<0,01 vs. Kontrolle (#) P<0,05, (###) P<0,01 vs. nicht transfizierte Gruppen (ANOVA).


Einführung

Dendritische Zellen (DCs) stellen eine heterogene Gruppe von Antigen-präsentierenden Zellen dar, die eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der adaptiven Immunantwort spielen, indem sie die naive T-Zell-Aktivierung in sekundären lymphatischen Geweben induzieren. Aufgrund ihrer eigenen Entwicklungsdivergenz in funktionell spezialisierte Untergruppen und aufgrund ihrer Fähigkeit, ihr funktionelles Repertoire als Reaktion auf eine Vielzahl von Signalen wie mikrobielle Verbindungen, Zytokine oder Metaboliten.

Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um antigenspezifische Immunantworten mit Hilfe von Ex-vivo erzeugte autologe DCs 1,2 . Anti-Krebs-Impfstoffe auf DC-Basis könnten potenziell tumorassoziierte Antigene an Lymphgewebe abgeben und die Aktivierung antigenspezifischer CD4+- und CD8+-T-Zellen induzieren, die neoplastische Läsionen beherbergen und eine Tumorregression vermitteln können. DC-Impfstoffe wurden bei mehr als 3000 Patienten angewendet, die an Melanom, Prostatakrebs, Gliom oder Nierenzellkrebs litten, und die Ergebnisse dieser Studien zeigten eine erhöhte mediane Überlebenszeit in den meisten geimpften Kohorten 1 . Allerdings zeigte nur ein kleiner Anteil der behandelten Personen eine nachweisbare Tumorregression und eine Diskordanz zwischen immunologischen und klinischen Reaktionen wurde häufig festgestellt, wobei nachweisbare tumorspezifische Immunreaktionen oft zu einem geringen Einfluss auf die Gesamterkrankungslast beitragen 1 .

Die geringe Zahl von Individuen, die positiv auf DC-Impfungen ansprechen, weist auf die Notwendigkeit hin, mehr immunogene DC-Impfstoffe zu entwickeln und die Gründe zu analysieren, die den sehr unterschiedlichen klinischen Reaktionen zugrunde liegen. Frühere Ergebnisse haben mehrere Mechanismen hervorgehoben, die zur Wirksamkeit des DC-Impfstoffs beigetragen haben, darunter eine höhere IL-12-Produktion 3,4 , effiziente kostimulatorische Signale 5 , eine stärkere Induktion von Antigen-spezifischen TH1-Antworten 6,7,8 oder niedrigere regulatorische T-Zellzahlen in der Tumorgewebe 6,9 ​​. Andere Parameter, wie die Injektionsstelle, die Anzahl der injizierten DCs oder die Anzahl der DCs, die die T-Zellzone der Lymphknoten erreichen, sind ebenfalls kritisch für die DC-Impfstoffeffizienz 10,11,12. Es wurde gezeigt, dass nur ein kleiner Bruchteil der injizierten DCs den drainierenden Lymphknoten erreicht 10,11,12 und eine zunehmende DC-Mobilität das Überleben bei Gliobastoma-Patienten verbesserte 13 .

Interessanterweise wurde nicht nur eine signifikante Heterogenität bei den Oberflächenmarkern und funktionellen Eigenschaften von DC-Zellen festgestellt in vivo aber auch unter Ex-vivo erzeugte DCs. Koexistierende CD1a + CD14 – und CD1a – CD14 niedrige Populationen entwickelten sich aus Blutmonozyten in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 oder aus CD34 + hämatopoetischen Vorläufern, die mit GM-CSF und Flt3-L kultiviert wurden, und diese beiden DC-Untergruppen wiesen einzigartige funktionelle Merkmale auf 14,15 . Insbesondere war die CD1a + CD14 – -Population bei der Induktion der TH1-Polarisation und der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)-Killeraktivität im Vergleich zum CD1a – CD14-niedrigen Gegenstück überlegen. Wichtig ist, dass das CD1a + /CD1a – DC-Verhältnis zwischen den Blutspendern stark variierte, was darauf hindeutet, dass eine Entwicklungsheterogenität die Immunogenität in einzelnen DC-Impfstoffpräparaten beeinflussen könnte 14 .

Wir haben kürzlich einen zellkonzentrationsabhängigen Differenzierungsschalter in DC-Kulturen beschrieben, der weiter zur Diversität der DC-Phänotypen beigetragen hat in vitro. Durch Erhöhung der Zellkonzentration in der frühen Entwicklungsphase reduzierten wir die CCR7-abhängige Chemotaxis und die Fähigkeit, TH1-Antworten in menschlichen Monozyten-abgeleiteten DCs (MoDCs) zu induzieren, und wir beobachteten eine erhöhte IL-10-Produktion 16,17 . Solche Wirkungen könnten möglicherweise die Fähigkeit von DC-Impfstoffen beeinträchtigen, eine Immunität gegen Krebs oder Krankheitserreger zu induzieren, jedoch weiter in vivo Experimente sind notwendig, um zu verstehen, ob die dichteabhängigen endogenen Brüche DC-basierte Therapien beeinflussen könnten.

In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass die DC-Differenzierung in spärlichen Kulturen mehrere funktionelle Eigenschaften fördert, die für immunogene DC-Impfstoffe erforderlich sind, nämlich die Fähigkeit, zu sekundären lymphatischen Organen zu wandern und die Lymphknotenzellularität zu erhöhen, zusätzlich zur Induktion einer massiven Proliferation und TH1-Polarisierung von Antigen -spezifische CD4+ T-Zellen. Wir analysierten die Transkriptionsprogramme, die der DC-Differenzierung in dichten oder spärlichen Kulturen zugrunde liegen, und entschlüsselten mehrere charakteristische immunregulatorische Wege in den einzigartigen dichteabhängigen Linien. Interessanterweise entdeckten wir eine erhöhte Expression mehrerer Gene, die an der Fettsäure- und Cholesterinbiosynthese beteiligt sind, in den stärker immunogenen DC-Präparaten, die aus spärlichen Kulturen gewonnen wurden, was auf eine mögliche Rolle der Lipidhomöostaseregulation bei der Förderung der Entwicklung von DCs mit einem immunogenen Phänotyp hindeutet.


Fibroblastische retikuläre Zellantwort auf dendritische Zellen erfordert eine koordinierte Aktivität von Podoplanin, CD44 und CD9

Charlotte M de Winde, Spyridon Makris, Lindsey Millward, Jesús Cantoral Rebordinos, Agnesska C. Benjamin, Víctor G. Martínez, Sophie E. Acton Fibroblastische retikuläre Zellantwort auf dendritische Zellen erfordert eine koordinierte Aktivität von Podoplanin, CD44 und CD9. J Cell Wissenschaft 2021 jcs.258610. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.258610

Bei der adaptiven Immunität kontaktieren CLEC-2 + dendritische Zellen (DCs) fibroblastische retikuläre Zellen (FRCs) und hemmen die Podoplanin-abhängige Aktomyosin-Kontraktilität, wodurch die FRC-Ausbreitung und die Lymphknoten-(LN)-Expansion ermöglicht werden. Die molekularen Mechanismen, die das LN-Remodeling steuern, sind unvollständig verstanden. Wir fragten, wie Podoplanin auf FRCs in der frühen Phase der LN-Expansion reguliert wird und welche anderen Proteine ​​für die FRC-Antwort auf DCs benötigt werden. Wir stellen fest, dass Podoplanin und seine Partnerproteine ​​CD44 und CD9 von spezifischen LN-Stromapopulationen unterschiedlich exprimiert werden in vivo, und ihre Expression in FRCs wird durch CLEC-2 koreguliert. Sowohl CD44 als auch CD9 unterdrücken die Podoplanin-abhängige Kontraktilität. Wir stellen fest, dass Podoplanin über die Kontraktilität hinaus für die FRC-Polarität und -Ausrichtung erforderlich ist. Unabhängig von Podoplanin beeinflussen CD44 und CD9 die FRC-FRC-Interaktionen. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass der Umbau des FRC-Zytoskeletts als Reaktion auf DCs ein zweistufiger Prozess ist, der die Podoplanin-Partnerproteine ​​CD44 und CD9 erfordert. Erstens hemmt die CLEC-2/Podoplanin-Bindung die FRC-Kontraktilität, und zweitens bilden FRCs Vorsprünge und breiten sich aus, was sowohl CD44 als auch CD9 erfordert. Zusammen zeigen wir eine facettenreiche FRC-Reaktion auf DCs, die neben Podoplanin auch CD44 und CD9 benötigt.


Aus Hefe stammendes humanes Immunschwächevirus Typ 1 p55 Gag Virusähnliche Partikel aktivieren dendritische Zellen (DCs) und induzieren die Perforin-Expression in Gag-spezifischen CD8 + T-Zellen durch Kreuzpräsentation von DCs

FEIGE. 1. Reinheit von Hefe-VLPs, analysiert durch SDS-PAGE. Gereinigtes VLP (erhalten durch Gag-Expression) und VLP-EGFP (erhalten durch Gag-EGFP-Expression) wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einer Coomassie-Brillantblau-Färbung. Die aus dem Kontrollkulturüberstand von Hefe (CS) gereinigte Fraktion wurde in ähnlicher Weise analysiert. Die Massen (in Kilodalton) von Proteinen wurden basierend auf den parallel laufenden vorgefärbten Molekularmassenmarkern angegeben. Bahnen: 1, CS 2, VLP 3, VLP-EGFP. FEIGE. 2. Aufnahme und Lokalisierung von Hefe-VLP-EGFP durch DCs. Von Monozyten stammende unreife DCs wurden in Gegenwart von 40-μg/ml-Hefe-VLP-EGFP für 20 min (a bis c), 1 h (d) oder über Nacht (e) kultiviert, gewaschen und auf Objektträgern ausgestrichen. Die Objektträger wurden mit 1% Formalin-PBS für 20 min bei RT fixiert und dann entweder mit Anti-Mannose-Rezeptor (a), Anti-DC-SIGN (b), Anti-DC-LAMP (c und d) oder Anti- Golgin 97 (e) MAbs für 1 h in Abwesenheit (a und b) oder Anwesenheit (c bis e) von Digitonin zur Permeabilisierung.Die Objektträger wurden dann mit Alexa 660-konjugiertem Anti-Maus-IgG inkubiert und gewaschen, und PI wurde zur Kernfärbung zugegeben. FEIGE. 3 . Aufnahmemechanismus von Hefe-VLP-EGFP. Unreife DCs wurden nicht behandelt (fette Linie) oder mit 2 mg Mannan/ml (durchgezogene Linie) oder 10 μg Anti-Mannose-Rezeptor-MAb/ml (gepunktete Linie) (a) oder mit 50 μM LY294002 (gepunktete Linie) ( b) für 30 Minuten. Dann wurden 10 µg VLP-EGFP (oben), 100 µg FITC-mannosyliertes BSA (Mitte) oder 100 µg Alexa 546-detran (unten) zu den DCs gegeben und 20 min inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, weitere 15 min inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Hintergrund wird als Schatten dargestellt. FEIGE. 4. Reifung von DCs durch Hefe-VLP. Unreife DCs wurden in Abwesenheit (a) oder Anwesenheit von 10 ng TNF-α/ml (b) oder 1 (c) oder 10 (d) ug Hefe-VLPs/ml für 2 Tage inkubiert. Die Expression von CD83 (durchgezogene Linie) oder HLA-DR (gepunktete Linie) wurde von FACSCalibur analysiert. Die Hintergrundfärbung mit Kontroll-IgG ist als Schatten dargestellt. FEIGE. 5. Die Wirkung von Hefe-VLPs auf die DC-Reifung ist teilweise auf Hefemembrankomponenten zurückzuführen. Unreife DCs (durchgezogene Linie) wurden in Gegenwart von 10 &mgr;g Hefe-VLPs/ml (fette Linie) oder 10 &mgr;g Hefemembrankomponentenkontrolle (CS)/ml (gestrichelte Linie) 2 Tage lang inkubiert. (a) Die Oberflächenexpression von CD83 (oberes Feld) und HLA-DR (unteres Feld) wurde analysiert. Die Hintergrundfärbung mit Kontroll-IgG ist als Schatten dargestellt. (b) Zytokine, die von Hefe-VLP- oder CS-stimulierten DCs während der Kultivierung produziert wurden, wurden gemessen. (c) Allogene CD4 + T-Zellen (10 5 ) von drei Spendern wurden ohne DCs oder mit unreifen CS-gepulsten oder VLP-gepulsten DCs (je 10 4 ) für 5 Tage in 96-Well-Flachboden-Mikroplatten cokultiviert. Dann wurde [ 3 H]Thymidin (0,5 μCi pro Vertiefung) zu der Kultur zugegeben und die Zellen wurden nach Inkubation über Nacht geerntet. FEIGE. 6. Hefe-VLPs induzieren eine höhere IL-12-Expression als LPS, die unabhängig von TLR2 ist. Unreife DCs (immDC) wurden entweder mit Hefe-VLP (schattierte Balken) oder LPS (100 ng/ml, offene Balken) in Gegenwart von blockierenden MAbs oder Kontroll-IgG2a bei 20 &mgr;g/ml 2 Tage lang stimuliert. Der Zytokinspiegel im Kulturüberstand wurde unter Verwendung eines FACS-basierten CBA-Kits gemessen. Das repräsentative Ergebnis von drei Experimenten wird gezeigt. (a) IL-12 p70 (b) TNF-α (c) IL-10. αTLR-2, Anti-TLR2 αTLR-4, Anti-TLR4. FEIGE. 7. Hefe-VLPs stimulieren T-Zellen von HIV-infizierten Personen, IFN-γ zu produzieren. Unreife DCs wurden aus Monozyten erzeugt und über Nacht entweder mit Hefe-VLPs oder CS gepulst. Sie wurden dreimal gewaschen und mit autologen Monozyten-depletierten (CD14 – ) PBMCs gemischt, und die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde durch ELISPOT-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse für 6 nicht-infizierte [HIV(–)] und 16 HIV-infizierte [HIV(+)]-Individuen sind durch Kreise dargestellt. Ein kurzer horizontaler Balken stellt den Mittelwert jeder Gruppe dar. P Werte werden für Intergruppenvergleiche notiert. Das Ergebnis einer bemerkenswert hohen CS-Reaktion, die bei einem Patienten beobachtet wurde, ist durch eine gestrichelte Linie mit dem der VLP-Reaktion verbunden. ns, nicht signifikant. FEIGE. 8. Kreuzpräsentation von Hefe-VLPs durch DCs. Monozyten-depletierte (CD14 – ) PBMCs von 8 HIV-infizierten Individuen wurden für CD4 + oder CD8 + T-Zellen angereichert, und die ELISPOT-Analyse wurde wie in der Legende zu Fig. 7 beschrieben durchgeführt. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden T Zellen, die nach der Cokultur mit Hefe-VLP-gepulsten DCs vorhanden waren, wurde durch Subtrahieren der Anzahl derjenigen bestimmt, die nach der Cokultur mit CS-gepulsten DCs vorhanden waren. Schattige Box, CD4 + angereicherte T-Zellen (85 bis 90%) offene Box, CD8 + angereicherte T-Zellen (93 bis 95%). FEIGE. 9. Die meisten der Gag- und EBV-Peptid-spezifischen T-Zellen in Patient L2 exprimierten Perforin. Gefrorene PBMCs wurden aufgetaut, direkt mit PE-markiertem Gag-Tetramer (a und b) oder EBV-Tetramer (c und d) in Kombination mit APC-markiertem Anti-CD8 gefärbt, fixiert und permeabilisiert. Die intrazelluläre Färbung wurde mit FITC-markiertem Anti-Perforin (b und d) oder Kontroll-IgG2a (a und c) MAb durchgeführt. Tote Zellen wurden durch EMA-Färbung ausgeschlossen, und CD8 + T-Zellen wurden gegatet. Die Prozentsätze von Gag-Tetramer-positiven CD8 + T-Zellen und EBV-Tetramer-positiven CD8 + T-Zellen in der gesamten CD8 + T-Zellpopulation betrugen 1,72 bzw. 0,43%. FEIGE. 10. Die Perforin-Expression wird durch Kreuzpräsentation von mit Hefe-VLPs beladenen DCs induziert. Unreife DCs wurden mit Monozyten-defizienten PBMCs in Gegenwart von CS- oder Hefe-VLPs 7 Tage lang kultiviert. Die Perforin-Expression von Gag-Tetramer-positiven T-Zellen wurde durch FACS analysiert. CD8 + T-Zellen (R3) in der Lymphozytenfraktion (FSC low SSC low-high ) wurden in den Feldern a und b gegatet. In den Feldern c und d wurden nur aktivierte CD8 + T-Zellen (SSC hoch, R4) gesteuert. Der Prozentsatz von Gag-Tetramer-positiven CD8 + -T-Zellen an der gesamten CD8 + -T-Zellpopulation betrug 2,24 bzw. 1,14 % bei den Patienten L1 und L3.

15.4O: Dendritische Zellen - Biologie

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Inhalt

  • 460-377 v. Chr. beschrieb Hippokrates eine Hodenentzündung im Zusammenhang mit Mumps [1]
  • 1785 Hunter und Michaelis führten Transplantationsexperimente an Haushühnern durch [2]
  • 1849 Berthold transplantierte Hoden zwischen Hähnen und zeigte nur bei Vögeln mit erfolgreich transplantierten Hoden die Erhaltung der männlichen Geschlechtsmerkmale [2]
  • 1899-1900 Spermien von Landsteiner (1899) und Metchinikoff (1900) als immunogen erkannt (verursachen eine Autoimmunreaktion, wenn sie aus dem Hoden in einen anderen Körperbereich transplantiert werden) [1]
  • 1913-1914 Menschliche Hodentransplantationen durchgeführt von Lespinasse (1913) und Lydson (1914), der eine Transplantation an sich selbst durchführte! [2]
  • 1954 Entdeckung, dass Spermien-Autoantikörper zur Unfruchtbarkeit beitragen, [3]
  • 1977 Billingham erkannte, dass der Hoden Ort des Immunprivilegs ist[4]

Immunzellen des menschlichen Hodens sind aufgrund der Seltenheit normaler menschlicher Hoden, die für Experimente zur Verfügung stehen, nicht so gut charakterisiert wie die von Nagetieren. In den meisten Experimenten wurde der Rattenhoden aufgrund seiner Zweckmäßigkeit untersucht: Er ist relativ groß und lässt sich leicht aus Versuchstieren entnehmen.

Makrophagen Bearbeiten

Makrophagen sind direkt am Kampf gegen eindringende Mikroorganismen beteiligt und sind Antigen-präsentierende Zellen, die Lymphozyten aktivieren. Frühe Studien zeigten das Vorhandensein von Makrophagen im Rattenhoden [5] Hodenmakrophagen sind die größte Population von Immunzellen im Hoden von Nagetieren. [6] [7] Makrophagen wurden auch in den Hoden von Menschen, [8] Meerschweinchen, Hamstern, [9] Ebern, [10] Pferden [11] und Bullen gefunden. [12] Sie stammen aus Blutmonozyten, die in den Hoden wandern und dann zu Makrophagen heranreifen. Bei der Ratte wurden Hodenmakrophagen entweder als „resident“ oder „neu eingetroffen“ aus der Blutversorgung beschrieben. [13] [14] Es ist wahrscheinlich, dass der Großteil der erwachsenen Population von Hodenmakrophagen bei erwachsenen Ratten das Ergebnis einer sehr schnellen Proliferation von frühen Vorläufern ist, die während der postnatalen Reifung in den Hoden gelangten [15]

Hodenmakrophagen können auf infektiöse Reize reagieren und aktiviert werden (verändern sich, die das Abtöten des eindringenden Mikroorganismus ermöglichen), tun dies jedoch in geringerem Maße als andere Arten von Makrophagen. [16] [17] Ein Beispiel ist die Produktion der entzündlichen Zytokine TNFα und IL-1β durch aktivierte Rattenhodenmakrophagen: Diese Makrophagen produzieren deutlich weniger TNFα und IL-1β als aktivierte Rattenperitonealmakrophagen. [17] [18] Neben der Reaktion auf infektiöse Reize sind Hodenmakrophagen auch an der Aufrechterhaltung der normalen Hodenfunktion beteiligt. Es wurde gezeigt, dass sie 25-Hydroxycholesterin sezernieren, ein Sterol, das von Leydig-Zellen in Testosteron umgewandelt werden kann. [19] Ihre Anwesenheit ist für die normale Entwicklung und Funktion der Leydig-Zellen notwendig, [20] [21] [22] die testosteronproduzierenden Zellen des Hodens.

B-Lymphozyten Bearbeiten

B-Lymphozyten nehmen an der adaptiven Immunantwort teil und produzieren Antikörper. Diese Zellen werden normalerweise nicht im Hoden gefunden, selbst bei entzündlichen Zuständen. Der Mangel an B-Lymphozyten im Hoden ist signifikant, da es sich um die Antikörper-produzierenden Zellen des Immunsystems handelt. Da Antikörper gegen Spermien Unfruchtbarkeit verursachen können, ist es wichtig, dass Antikörper-produzierende B-Lymphozyten vom Hoden getrennt gehalten werden.

T-Lymphozyten Bearbeiten

T-Lymphozyten (T-Zellen) sind weiße Blutkörperchen, die an der zellvermittelten Immunität beteiligt sind. Sie werden oft in Geweben gefunden, wo sie bei einer Infektion durch Antigen-präsentierende Zellen aktiviert werden können. Sie kommen in Ratten [23] [24] und menschlichen Hoden [25] vor, wo sie etwa 10 bis 20 % der vorhandenen Immunzellen ausmachen, sowie in Mäusen [26] und Widder [24] Hoden. In den Hoden von Ratten werden sowohl zytotoxische T-Zellen als auch Helfer-T-Zellen gefunden. [27] Auch in den Hoden von Ratten und Menschen sind natürliche Killerzellen vorhanden [1] [27] und natürliche Killer-T-Zellen wurden bei Ratten und Mäusen gefunden.

Mastzellen Bearbeiten

Mastzellen sind Regulatoren von Immunantworten, insbesondere gegen Parasiten. Sie sind auch an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und Allergien beteiligt. Mastzellen wurden in relativ geringer Zahl in den Hoden von Menschen, Ratten, Mäusen, Hunden, Katzen, Bullen, Wildschweinen und Hirschen gefunden. [28] [29] In den Hoden von Säugetieren regulieren Mastzellen die Testosteronproduktion. [29] Es gibt zwei Beweislinien dafür, dass eine Einschränkung der Mastzellaktivierung im Hoden während der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen von Vorteil sein könnte (1) In experimentellen Modellen der Hodenentzündung waren Mastzellen in 10-fach höherer Anzahl vorhanden und zeigten Anzeichen von Aktivierung, [30] und (2) Die Behandlung mit Medikamenten, die die Mastzellaktivierung stabilisieren, hat sich bei der Behandlung einiger Arten männlicher Unfruchtbarkeit als vorteilhaft erwiesen. [31] [32] [33]

Eosinophile Bearbeiten

Eosinophile bekämpfen direkt parasitäre Infektionen und sind an allergischen Reaktionen beteiligt. Sie wurden in relativ geringer Zahl in den Hoden von Ratten, Mäusen, Hunden, Katzen, Bullen und Hirschen gefunden. [28] Über ihre Bedeutung oder Funktion im Hoden ist fast nichts bekannt.

Dendritische Zellen Bearbeiten

Dendritische Zellen initiieren adaptive Immunantworten. In den Hoden von Menschen, [34] Ratten [35] und Mäusen wurden relativ geringe Mengen an dendritischen Zellen gefunden. [36] [37] Die funktionelle Rolle dendritischer Zellen im Hoden ist nicht gut verstanden, obwohl in Tierversuchen gezeigt wurde, dass sie an der Autoimmunorchitis beteiligt sind. [28] [35] Wenn bei Ratten eine Autoimmunorchitis induziert wird, nimmt die dendritische Zellpopulation des Hodens stark zu. [35] Dies trägt wahrscheinlich zur Hodenentzündung bei, wenn man die gut etablierte Rolle dendritischer Zellen bei anderen Arten von Autoimmunentzündungen bedenkt. [38]

Neutrophile Bearbeiten

Neutrophile sind weiße Blutkörperchen, die im Blut, aber normalerweise nicht im Gewebe vorhanden sind. Sie wandern bei einer Infektion oder Beschädigung aus dem Blut in Gewebe und Organe. Sie bekämpfen eingedrungene Krankheitserreger wie Bakterien direkt. Neutrophile werden unter normalen Bedingungen in den Hoden von Nagetieren nicht gefunden, können aber bei einer Infektion oder einem Entzündungsreiz aus der Blutversorgung gelangen. Bei Ratten wurde gezeigt, dass nach Injektion mit bakteriellen Zellwandkomponenten eine Immunreaktion ausgelöst wurde. [39] Neutrophile gelangen auch in den Rattenhoden nach der Behandlung mit Hormonen, die die Durchlässigkeit der Blutgefäße erhöhen. [40] Beim Menschen wurden Neutrophile in den Hoden gefunden, wenn sie mit einigen Tumoren assoziiert waren. [41] In Rattenexperimenten führt eine Hodentorsion zum Eintritt von Neutrophilen in den Hoden. [42] Die Aktivität der Neutrophilen im Hoden ist eine entzündliche Reaktion, die vom Körper streng reguliert werden muss, da eine entzündungsbedingte Schädigung des Hodens zu Unfruchtbarkeit führen kann. [43] [44] Es wird angenommen, dass die Rolle der immunsuppressiven Umgebung des Hodens darin besteht, sich entwickelnde Spermien vor Entzündungen zu schützen.

Spermien sind immunogen – das heißt, sie lösen eine Autoimmunreaktion aus, wenn sie aus dem Hoden in einen anderen Körperteil transplantiert werden. Dies wurde in Experimenten an Ratten von Landsteiner (1899) und Metchinikoff (1900), [1] [29] Mäusen [45] und Meerschweinchen nachgewiesen. [46] Der wahrscheinliche Grund dafür ist, dass Spermien erst in der Pubertät reifen, nachdem eine Immuntoleranz aufgebaut wurde, daher der Körper sie als fremd erkennt und eine Immunreaktion gegen sie auslöst. Daher müssen in diesem Organ Mechanismen zu ihrem Schutz vorhanden sein, um jede Autoimmunreaktion zu verhindern. Die Blut-Hoden-Schranke trägt wahrscheinlich zum Überleben der Spermien bei. Auf dem Gebiet der Hodenimmunologie wird jedoch angenommen, dass die Blut-Hoden-Schranke nicht für die gesamte Immunsuppression im Hoden verantwortlich sein kann, aufgrund (1) ihrer Unvollständigkeit in einer Region namens Rete testis [29] und (2) des Vorhandenseins von immunogenen Molekülen außerhalb der Blut-Hoden-Schranke, auf der Oberfläche von Spermatogonien. [1] [29] Ein weiterer Mechanismus, der wahrscheinlich Spermien schützt, ist die Unterdrückung von Immunreaktionen im Hoden. [17] [47] Sowohl die Unterdrückung von Immunantworten als auch das erhöhte Überleben von Transplantaten im Hoden haben zu seiner Anerkennung als immunologisch privilegierter Ort geführt. Andere immunologisch privilegierte Lokalisationen sind das Auge, das Gehirn und die Gebärmutter. [48]

Die beiden Hauptmerkmale des Immunprivilegs beim Rattenhoden sind

  • eine Verminderung der Aktivierung von Hodenmakrophagen durch Infektionen wie Bakterien, [17][47] und
  • ein Defekt in der Aktivierung von T-Zellen, wenn ihnen ein Antigen präsentiert wird, was zum Fehlen einer adaptiven Immunantwort auf Spermien im Hoden führt. [29] [zusätzliches Zitat(e) erforderlich]

Es wird auch vorhergesagt, dass der hohe Gehalt an entzündlichen Zytokinen im Hoden zum Immunprivileg beiträgt. [29]

Immunprivileg bei Nagetieren und anderen Versuchstieren Bearbeiten

Die Existenz eines Immunprivilegs in den Hoden von Nagetieren wird gut akzeptiert, da viele Experimente ein verlängertes und manchmal unbestimmtes Überleben von in den Hoden transplantiertem Gewebe [49] [50] oder anderswo transplantiertem Hodengewebe zeigen. [51] [52] Beweise umfassen die Verträglichkeit von Hodentransplantaten bei Mäusen und Ratten sowie das erhöhte Überleben von Transplantaten von insulinproduzierenden Pankreaszellen bei Ratten, wenn dem transplantierten Material Zellen aus den Hoden (Sertoli-Zellen) zugesetzt werden . [53] Eine vollständige Spermatogenese, die funktionelle Schweine- oder Ziegensperma bildet, kann durch die Transplantation von Schweine- oder Ziegenhodengewebe auf den Rücken von Mäusen hergestellt werden – jedoch mussten immundefiziente Mäuse verwendet werden. [51]

Immunprivileg beim Menschen Bearbeiten

Das Vorhandensein von Immunprivilegien im menschlichen Hoden ist umstritten und es gibt keine ausreichenden Beweise, um dieses Phänomen zu bestätigen oder auszuschließen.

Spermien sind vor Autoimmunangriffen geschützt, die beim Menschen zu Unfruchtbarkeit führen. [54] Eine lokale Schädigung der Samenkanälchen durch Feinnadelbiopsien beim Menschen verursacht keine Hodenentzündung (Orchitis). [55] Darüber hinaus tolerieren menschliche Hodenzellen eine frühe HIV-Infektion mit geringer Reaktion. [56]

In Transplantationsexperimenten können Primatenhoden Transplantate von Affen-Schilddrüsengewebe nicht unterstützen. [57] Menschliches Hodengewebe, das in die Maus transplantiert wurde, rief eine Immunantwort hervor und wurde abgestoßen, diese Immunantwort war jedoch nicht so ausgeprägt wie die gegen andere Arten von transplantiertem Gewebe. [58]

Wie unterdrückt der Hoden Immunantworten? Bearbeiten

Wie das Hodenmilieu die Immunantwort unterdrückt, ist nur teilweise verstanden. Jüngste Experimente haben eine Reihe biologischer Prozesse aufgedeckt, die höchstwahrscheinlich zum Immunprivileg in den Hoden von Nagetieren beitragen:

  • 1. Experimente an der Ratte haben gezeigt, dass Sertoli-Zellen zum Schutz vor Transplantatabstoßung beitragen können. Diese Zellen wurden aus dem Hoden isoliert und dann Transplantaten der insulinproduzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse (Langerhans-Inseln) zugesetzt, was zu einem erhöhten Überleben des Transplantats führte. [59] Von den Sertoli-Zellen freigesetzte Moleküle sollen das Transplantat schützen. [53]
  • 2. Es ist wahrscheinlich, dass die testikuläre Umgebung selbst die Aktivierung von T-Zellen hemmt, um die sich entwickelnden, immunogenen Spermien zu schützen. [60][61] Die im Hoden vorhandene Flüssigkeit ist ein starker Inhibitor der Aktivierung von T-Zellen unter Laborbedingungen. [60]
  • 3. Die Verminderung der entzündlichen Reaktion des Hodens ist wahrscheinlich auf relativ geringe Mengen an entzündlichen Zytokinen zurückzuführen, die von aktivierten Hodenmakrophagen freigesetzt werden. [17] [47]

Da der Schutz der sich entwickelnden Spermien für das Überleben einer Art so wichtig ist, wäre es nicht überraschend, wenn mehr als ein Mechanismus verwendet würde.

Seltsamerweise enthält der Hoden Faktoren wie Zytokine, die normalerweise nur bei Infektionen und Gewebeschäden produziert werden. Die Zytokine Interleukin-1α (IL-1α), IL-6 und Activin A werden im Hoden häufig in hohen Konzentrationen gefunden. [62] [63] [64] [65] [66] In anderen Geweben würden diese Zytokine eine Entzündung fördern, aber hier kontrollieren sie die Hodenfunktion. Sie regulieren die Entwicklung von Spermien, indem sie ihre Zellteilung und ihr Überleben kontrollieren. [67] [68] [69] [70] [71]

Andere im Hoden gefundene Immunfaktoren sind das Enzym induzierbare Stickoxid-Synthase (iNOS) und sein Produkt Stickoxid (NO), [72] [73] [74] Transforming Growth Factor Beta (TGFβ), [75] das Enzym Cyclooxygenase -2 (COX-2) und sein Produkt Prostaglandin E2, [76] und viele andere.Weitere Forschung ist erforderlich, um die funktionelle Rolle dieser Immunfaktoren im Hoden zu definieren.

Mumps Bearbeiten

Mumps ist eine Viruserkrankung, die eine Schwellung der Speicheldrüsen und Hoden verursacht. Das Mumpsvirus lebt in den oberen Atemwegen und verbreitet sich durch direkten Kontakt mit Speichel. [77] Vor weit verbreiteten Impfprogrammen war es eine häufige Kinderkrankheit. Mumps ist bei Kindern im Allgemeinen nicht schwerwiegend, aber bei Erwachsenen, bei denen Spermien im Hoden gereift sind, kann es zu schwerwiegenderen Komplikationen wie Unfruchtbarkeit führen.

Sexuell übertragbare Krankheiten Bearbeiten

Gonorrhoe ist eine sexuell übertragbare Krankheit, die durch die Bakterien verursacht wird Niesseria gonorrhoe was zu Hodenschmerzen und Schwellungen führen kann. Gonorrhoe infiziert auch das weibliche Fortpflanzungssystem um den Gebärmutterhals und die Gebärmutter herum und kann in Mund, Rachen, Augen und Anus wachsen. [78] Es kann effektiv mit Antibiotika behandelt werden, jedoch kann Gonorrhoe unbehandelt bei Männern zu Unfruchtbarkeit führen. Chlamydien werden durch die sexuell übertragbaren Bakterien verursacht Chlamydia trachomatis die die Genitalien infiziert. Es betrifft häufiger Frauen und kann unbehandelt zu entzündlichen Erkrankungen des Beckens und Unfruchtbarkeit führen. [79] Schwerwiegende Symptome bei Männern sind selten, umfassen aber geschwollene Hoden und einen ungewöhnlichen Ausfluss aus dem Penis. Es wird effektiv mit Antibiotika behandelt.

Antisperm-Antikörper Bearbeiten

Antisperma-Antikörper (ASA) gelten bei etwa 10–30% der unfruchtbaren Paare als Ursache für Unfruchtbarkeit. [80] Die ASS-Produktion richtet sich gegen Oberflächenantigene auf Spermien, die die Spermienmotilität und den Transport durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt beeinträchtigen können, die Kapazitation und Akrosomenreaktion hemmen, die Befruchtung beeinträchtigen, den Implantationsprozess beeinflussen und das Wachstum und die Entwicklung des Embryos beeinträchtigen können . Risikofaktoren für die Bildung von Antikörpern gegen Spermien bei Männern sind der Zusammenbruch der Blut-Hoden-Schranke, Traumata und Operationen, Orchitis, Varikozele, Infektionen, Prostatitis, Hodenkrebs, Versagen der Immunsuppression und ungeschützter rezeptiver Anal- oder Oralsex mit Männern. [80] [81]

Hodentorsion Bearbeiten

Hodentorsion ist ein Zustand der körperlichen Verdrehung des Hodens, der zur Unterbrechung der Blutversorgung führt. Es führt zu Schäden, die, wenn sie nicht innerhalb weniger Stunden behandelt werden, zum Absterben des Hodengewebes führen und eine Entfernung des Hodens erforderlich machen, um Gangrän zu verhindern, und kann daher zu Unfruchtbarkeit führen. [82]

Autoimmunorchitis Bearbeiten

Orchitis ist ein Zustand von Hodenschmerzen mit Schwellungen, Entzündungen und möglicherweise Infektionen. Orchitis kann durch eine Autoimmunreaktion (Autoimmunorchitis) verursacht werden, die zu einer Verringerung der Fruchtbarkeit führt. Autoimmunorchitis ist beim Menschen selten, im Vergleich zu Anti-Sperma-Antikörpern. [1] Um die Orchitis im Hoden zu untersuchen, wurde eine Autoimmunorchitis im Hoden von Nagetieren induziert. Die Krankheit beginnt mit dem Auftreten von Hodenantikörpern, dann der Bewegung von Makrophagen und Lymphozyten aus dem Blutstrom in den Hoden, dem Aufbrechen der physikalischen Interaktionen zwischen den sich entwickelnden Spermien und den Sertoli-Zellen, dem Eindringen von Neutrophilen oder Eosinophilen und schließlich dem Absterben der sich entwickelnden Spermien , was zu Unfruchtbarkeit führt. [83] [84] [85]

Entzündungsmodelle im Nagetier Bearbeiten

Experimente an Ratten haben den Ablauf von Hodenereignissen während einer bakteriellen Infektion detailliert untersucht. Kurzfristig (3 Stunden) werden mehrere Entzündungsfaktoren von Hodenmakrophagen produziert und freigesetzt. Beispiele sind Prostaglandin E2, [86] [76] induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS), [39] [87] TNFα [88] und IL-1β, wenn auch in geringeren Konzentrationen als andere Gewebe. [86] [47] Nichtimmune Zellen des Hodens wie Sertoli-Zellen und Leydig-Zellen können ebenfalls auf Bakterien reagieren. [63] [89] Während einer bakteriellen Infektion sind der Testosteronspiegel und die Menge der interstitiellen Hodenflüssigkeit reduziert. [39] Neutrophile treten etwa 12 Stunden nach der Infektion in den Hoden ein. [39] Wichtig ist, dass die sich entwickelnden Spermien geschädigt werden, die bei schweren Infektionen zu sterben beginnen. [39] [90] Trotz aller Daten über die Wirkung von Bakterien auf normale Hodenparameter gibt es nur wenige experimentelle Daten zu ihrer Wirkung auf die Fruchtbarkeit von Nagetieren.

Andere Krankheiten, bei denen eine Hodenentzündung ein Symptom sein kann Bearbeiten

Hodenentzündungen können ein Symptom folgender Erkrankungen sein: Coxsackie-A-Virus, [91] [92] Varizellen (Windpocken) [91] [93] Humanes Immunschwächevirus (HIV), [94] Dengue-Fieber, [95] Epstein Barr virusassoziierte infektiöse Mononukleose, [91] [96] Syphilis, [97] Lepra, [98] Tuberkulose. [99]


Übertragung von Toxoplasma gondii von infizierten dendritischen Zellen zu natürlichen Killerzellen

FEIGE. 1. NK-Zellen werden mit GFP + . infiziert T. gondii Tachyzoiten. Durchflusszytometrie-Analyse der Lymphozytenpopulation von Peritonealexsudaten 48 h nach der Infektion. (A) Infektion von NK-Zellen und T-Zellen nach i.p. Injektion von 5 × 10 5 GFP + Tachyzoiten. (B) Infektion von NK-Zellen und T-Zellen nach i.p. Injektion von 5 × 10 5 DC, die mit GFP + Tachyzoiten (MOI von 1) infiziert sind. Balkendiagramme zeigen die Unterschiede zwischen infizierten NK-Zellen und T-Zellen (n = 6 Mäuse *, P < 0,05 [Studenten T Prüfung]). Ex-vivo-Untersuchung infizierter NK- und T-Zellen. (C und D) Infizierte NK-Zellen. (E) Infizierte T-Zelle. Maßstabsbalken = 3 µm. FEIGE. 2. Die NK-Zell-vermittelte Lyse von DC wird bei Infektion mit . verstärkt T. gondii und ist abhängig von Perforin und einer Infektion mit lebenden Parasiten. (A) Lyse von DC infiziert mit Tachyzoiten (MOI von 3) durch NK-Zellen von B6 und B6.pfp –/– Mäusen gegen das Effektor-zu-Ziel-Zell-Verhältnis. Die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten sind gezeigt ± der Standardfehler des Mittelwerts. (B) Lyse von DC, die mit Tachyzoiten infiziert sind, mit Pyrimethamin vorbehandelte Tachyzoiten oder durch Hitze abgetötete Tachyzoiten gegen das Verhältnis von Effektor zu Zielzelle. Die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten sind gezeigt ± der Standardfehler des Mittelwerts. (C) Lyse von Tachyzoit-infizierten B6-NK-Zellen und DC durch nicht-infizierte B6-NK-Zellen gegen das Effektor-zu-Ziel-Zell-Verhältnis. Die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten sind gezeigt ± der Standardfehler des Mittelwerts. FEIGE. 3 . NK-Zellen werden nach Lyse infizierter DC in vitro infiziert. (A) Lymphokin-aktivierte Killerzellkulturen mit einer NK-Zelle (linke Seite) bis drei T-Zellen (rechte Seite) nach 2 h Kultur mit GFP + Tachyzoit-infizierten DC (MOI von 1). Balkendiagramme zeigen den Unterschied zwischen infizierten NK-Zellen und T-Zellen. Kumulierte Daten aus drei Experimenten werden gezeigt (P < 0,01 [Studenten T Prüfung]). (B) Infektion von B6 (linke Seite) und B6.pfp –/– (rechte Seite) NK-Zellen nach 2 h Kultur mit DC infiziert mit GFP + Tachyzoiten (MOI von 1). Ein Vertreter von drei Experimenten ist gezeigt. Das NK-Zell/DC-Verhältnis betrug 3:1. Balkendiagramme zeigen den Unterschied zwischen infizierten B6- und B6.pfp –/– NK-Zellen. Kumulierte Daten aus drei separaten Experimenten werden gezeigt (P < 0,01 [Studenten T Prüfung]). FEIGE. 4. Die konfokale Echtzeitanalyse zeigt die Flucht von Parasiten aus DC und die anschließende Infektion von NK-Zellen. GFP + T. gondii Tachyzoiten durften DC (MOI von 1) 12 h vor der Zugabe von NK-Zellen infizieren. Gemischte Zellpopulationen wurden für ungefähr 2 h durch Zeitraffer-Mikroskopie mit künstlichem rotem Phasenkontrast sichtbar gemacht. Kurz nach der Zugabe von NK-Zellen führte der Austritt von Parasiten aus beweglichen infizierten DC zur Infektion von Effektor-NK-Zellen. (A bis C) Weiße Pfeile zeigen ein bewegliches DC an, das GFP + . beherbergt T. gondii Tachyzoiten als grüne Vakuole im DC gesehen. Der Interaktion zwischen den kleineren NK-Zellen und den größeren DC für ungefähr 5 min folgte (D und E) die Lyse der infizierten DC und ein schneller Austritt von Parasiten (durch ein Sternchen gekennzeichnet). (F) Kurz nach dem Austritt der Parasiten wurden umliegende NK-Zellen von den GFP-exprimierenden Parasiten infiziert (weiße Pfeile). Maßstabsbalken = 25 μm. FEIGE. 5. Die NK-Zell-vermittelte Lyse infizierter DC führt in vivo zur Infektion von NK-Zellen. Durchflusszytometrie-Analyse der NK1.1 + CD3 – Lymphozytenpopulation von peritonealen Exsudaten 72 h nach der Infektion. (A) Infektion von B6 und B6.pfp –/– NK-Zellen nach i.p. Injektion von 5 × 10 5 DC, die mit GFP + Tachyzoiten (MOI von 1) infiziert sind. (B) Infektion von B6 und B6.pfp –/– NK-Zellen 72 h nach i.p. Injektion mit 5 × 10 5 GFP + Tachyzoiten. Balkendiagramme stellen das unterschiedliche Ausmaß der Infektion von NK- und T-Zellen zwischen B6 und B6.pfp –/– Mäusen dar (n = 6 oder 7 Mäuse). *, P < 0,05 (Varianzanalyse).

Ergebnisse

Selektives Priming der Th2-Differenzierung durch CD103 + DCs

Eine allergische Sensibilisierung durch die Atemwege kann durch Instillation von Hühnerovalbumin (OVA) zusammen mit niedrigen Dosen von Lipopolysaccharid (OVA-LPS) in die Atemwege erreicht werden. 21, 22, 23 Um die Lungenfunktion von DC während einer allergischen Sensibilisierung zu untersuchen, haben wir zunächst bestätigt, dass beide Hauptuntergruppen der DC inhalative Antigene aufnehmen können. Alexa Fluor-647-farbstoffmarkierte OVA wurde in die Atemwege instilliert, und DCs in der Lunge und LNs wurden 16 h später mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abbildung 1a und b). Wie erwartet, bestanden nicht-autofluoreszierende konventionelle CD11c hi-DCs aus zwei Hauptuntergruppen, CD11b hi und CD103 + -DCs. Obwohl auch Alveolarmakrophagen CD11c aufweisen, sind sie autofluoreszierend, wodurch sie von DCs unterschieden werden können. 24 In der Lunge waren die Häufigkeit OVA-positiver Zellen und die Intensität der OVA-Signale bei CD11b hi-DCs höher als bei CD103 + -DCs (Abbildung 1c). Interessanterweise war das Gegenteil der Fall bei der Entwässerung von LNs (Abbildung 1d), in Übereinstimmung mit einem früheren Bericht. 25 Somit können CD11b-hi-DCs der Lunge mehr OVA aufnehmen, aber OVA-tragende CD103+-DCs könnten effizienter in die LK wandern als CD11b-hi-DCs. Nichtsdestotrotz weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine beträchtliche Anzahl von CD11b hi- und CD103 + -DCs inhalierte Antigene aufnehmen können.

Aufnahme von inhaliertem Antigen und naive T-Zell-Stimulation durch CD11b Hi-Dendritische Zellen (DCs) und CD103 + DCs. (ein, B) Durchflusszytometrisches Gating für nicht-autofluoreszierende CD11c hi-DCs aus der Lunge (ein) und mediastinalen Lymphknoten (LNs B) von C57BL/6-Mäusen. (C, D) Aufnahme von Ovalbumin (OVA) durch DC-Untergruppen aus der Lunge (C) und mediastinale LK (D) von unbehandelten Mäusen (gestrichelte Linie) oder von Mäusen, denen 100 &mgr;g Alexa Fluor (AF)-647-markiertes OVA (OVA-AF647) zusammen mit Lipopolysaccharid (LPS durchgezogene Linie) instilliert wurde. Ein repräsentatives Ergebnis von zwei unabhängigen Experimenten wird gezeigt. (e) Wirkung der enzymatischen Verdauung auf die DC-Wiederherstellung in der Lunge. Gehacktes Lungengewebe wurde ohne Enzyme (offene Säule) oder mit den Enzymen Collagenase (Coll) D, DNase I (DN), Liberase (Lib), Coll XI und Hyaluronidase (Hya .) inkubiert n=5). (F) Reinheit sortierter Lungen-CD11b-hi-DCs und CD103+-DCs. Repräsentative Bilder jeder Population werden gezeigt. (g, h) T-Zell-Proliferation. (g). (h) Prozentsatz der CFSE lo-Zellen unter den CD4T-Zellen und mittlere Fluoreszenzintensität von CFSE. P-Werte von Student's T-Prüfung (n=3).

Um die Fähigkeit von Lungen-DCs zu testen, naive CD4 + T-Zellen zu stimulieren, reinigten wir CD11b hi-DCs und CD103 + -DCs aus den Lungen von C57BL/6-Mäusen, die OVA-LPS erhalten hatten. Ein neuartiger Enzymcocktail wurde verwendet, um höhere Ausbeuten an gereinigten DCs zu erhalten, als dies zuvor mit weit verbreiteten Enzymen möglich war (Abbildung 1e). Die Analyse der sortierten Zellpopulationen durch analytische Durchflusszytometrie und durch Mikroskopie ergab, dass jede Population hochrein war und fast ausschließlich aus DCs bestand (Abbildung 1f). Um die Fähigkeit dieser beiden DC-Untergruppen zu beurteilen, die T-Zell-Proliferation zu induzieren, wurden sie separat mit 5,6-Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)-markierten naiven CD4 + T-Zellen, die aus OVA-spezifischem T-Zell-Rezeptor transgenem OT . gereinigt wurden, cokultiviert -II Mäuse. Beide DC-Untergruppen induzierten die T-Zell-Proliferation, wie durch Verdünnung der CFSE-Markierung in den sich teilenden Zellen bestimmt, wobei CD103 + -DCs in dieser Hinsicht etwas effizienter waren ( 1g und h). Diese Befunde wurden durch T-Zellzählungen nach der 5-tägigen Kultur bestätigt (Ergänzende Abbildung S1a online).

Um festzustellen, ob sich die beiden Hauptuntergruppen der Lungen-DC in ihrer Fähigkeit zur Förderung der naiven T-Zell-Differenzierung zu T-Helferzellen unterscheiden, untersuchten wir zunächst die intrazellulären Spiegel von Signaturzytokinen in T-Zellen nach Kokulturen. Durchflusszytometrische Analysen dieser Zellen zeigten, dass in Cokulturen mit CD11b hi-DCs mehr Interferon (IFN)-γ + -T-Zellen vorhanden waren, während IL-4 + - und IL-13 + -T-Zellen in Cokulturen mit CD103 + -DCs häufiger vorkamen (Abbildung 2a und b). Die Analyse der Zytokine in den Überständen dieser Zellen bestätigte, dass die T-Zell-Produktion der IFN-γ-Produktion vorzugsweise durch CD11b hi-DCs induziert wurde und dass die Produktion von IL-5 und IL-13 durch CD103 + -DCs induziert wurde, obwohl IL-4 die Werte waren unter beiden Bedingungen niedrig (Ergänzende Abbildung S1b online). Um die Induktion von Th2-Zellen durch CD103 + -DCs weiter zu testen, kultivierten wir Lungen-DCs von BALB/c-Mäusen zusammen mit naiven CD4 + -T-Zellen von OVA-spezifischem DO11.10 T-Zell-Rezeptor-transgenem IL-4-GFP-Reporter (4get) Mäuse. IL-4-GFP + -Zellen waren nach Kultur mit CD103 + -DCs häufiger als nach Kultur mit CD11b-hi-DCs (Abbildung 2c und d), was bestätigt, dass die ehemalige DC-Untergruppe bei der Förderung der Th2-Differenzierung wirksamer ist. Zytokinspiegel in Überständen von primären DC-T-Zell-Kokulturen können durch mehrere Faktoren beeinflusst werden, einschließlich von DC-abgeleiteten Zytokinen, T-Zell-Proliferation und Zytokin-Internalisierung. Aus diesen Gründen wird die Zytokinproduktion aus differenzierten T-Zellen häufig durch kurzfristige Restimulation ausgelöst. 26 Nach Inkubation in plattengebundenen Anti-CD3ɛ- und -CD28-Antikörpern produzierten CD4+-T-Zellen, die mit CD103+-Lungen-DCs kultiviert worden waren, hohe IL-4-, IL-5- und IL-13-Spiegel, aber nur geringe .-Spiegel IFN-γ (Abbildung 2e). Umgekehrt produzierten T-Zellen, die mit CD11b hi-DCs kokultiviert worden waren, hohe Mengen an IFN-γ, aber nur geringe Mengen an IL-4, IL-5 und IL-13. Lungen-CD103 + -DCs, aber nicht CD11b-hi-DCs, stimulierten auch die Produktion des Th17-Signaturzytokins IL-17 auf niedrigem Niveau. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, ob OT-II CD4 + T-Zellen oder Rag2 –/– OT-II CD4 + T-Zellen wurden verwendet. Die selektive Fähigkeit der CD103 + -DCs der Lunge, Th2-Antworten auszulösen, war kein einzigartiges Merkmal von C57BL/6-Mäusen, da ähnliche Ergebnisse beobachtet wurden, wenn DCs von BALB/c-Mäusen verwendet wurden (ergänzende Abbildung S2 online). Die Th2-stimulierende Aktivität von CD103 + Lungen-DCs wurde auch nicht durch die enzymatische Verdauung von Lungengewebe verursacht, denn obwohl die Rückgewinnung von DCs aus der Lunge stark reduziert war, wenn keine Enzyme in der Zubereitung verwendet wurden, induzierten die gewonnenen CD103 + -DCs auch T -Zellproliferation und Th2-Differenzierung (Ergänzende Abbildung S3 online).

CD103 + dendritische Zellen (DCs) fördern die Th2-Differenzierung naiver CD4 + T-Zellen. (ein, B) DCs, die aus den Lungen von C57BL/6-Mäusen hergestellt wurden, die mit Ovalbumin zusammen mit Lipopolysaccharid (OVA-LPS) behandelt wurden, wurden mit naiven CD4 + T-Zellen von . cokultiviert Lappen-2 −/− OT-II-Mäuse. Intrazelluläre Zytokine in CD4 + T-Zellen wurden nach 6 Tagen Kokultur analysiert. Der Prozentsatz der Zytokin-positiven CD4-T-Zellen wird in Konturdiagrammen angezeigt (ein) und Histogramme zusammengestellter Daten (B). Die gezeigten Daten repräsentieren eines von drei ähnlichen Experimenten P-Werte von Student's T-Prüfung. (C, D) DCs, die aus den Lungen von mit OVA-LPS behandelten BALB/c-Mäusen hergestellt wurden, wurden mit naiven CD4 + -T-Zellen von Interleukin (IL)-4-grün fluoreszierendem Protein (GFP) DO11.10-Mäusen cokultiviert. Der Prozentsatz von IL-4-GFP + CD44 hi-Zellen unter allen CD4 + T-Zellen nach 5 Tagen Kokultur ist in Konturdiagrammen angegeben (C) und Histogramme der zusammengestellten Daten (D). (e, F) Zytokinproduktion durch DC-stimulierte T-Zellen. Die angegebenen Lungen-DC-Untergruppen wurden aus den Lungen oder mediastinalen Lymphknoten hergestellt (F) von OVA-LPS-behandelten Mäusen und für 5 Tage mit naiven cokultiviert Rag2 –/– OT-II CD4 + T-Zellen. Kultivierte T-Zellen wurden 24 h in anti-CD3ɛ- und anti-CD28-beschichteten Platten inkubiert. Zytokine in den Überständen wurden durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay gemessen. Die präsentierten Daten repräsentieren eines von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die ähnliche Ergebnisse liefern. IFN-γ, Interferon-γ IL, Interleukin.

Lungendränierende mediastinale LN-DCs wurden in ähnlicher Weise auf ihre Fähigkeit getestet, die Th2-Differenzierung zu fördern. Sowohl CD11b hi-DCs als auch CD103 + -DCs aus LNs waren in der Lage, eine robuste Proliferation von T-Zellen zu stimulieren (Daten nicht gezeigt). LN CD103 + DCs stimulierten auch selektiv und stark die Th2-Differenzierung, wie durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-13 bestimmt, während die CD11b hi-Untergruppe selektiv die Th1-Differenzierung stimulierte ( 2f ). Im Gegensatz zu CD103 + -DCs, die aus der Lunge stammen, induzierte keine der DC-Untergruppen, die aus LNs hergestellt wurden, die IL-17-Produktion.

CD103 + DCs fördern die Th2-Differenzierung zu inhalierten klinisch relevanten Allergenen

Obwohl OVA häufig in Studien zur T-Zell-Differenzierung und allergischen Lungenentzündung eingesetzt wird, ist es kein klinisch relevantes Allergen. Um die pulmonale DC-Aufnahme von Umweltallergenen zu untersuchen, wurden Schabenantigen (CA) und Hausstaubmilbe (HDM) mit Alexa Fluor-647 markiert und separat in die Atemwege von Mäusen injiziert. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass beide DC-Untergruppen in der Lunge diese Allergene aufnehmen könnten, obwohl CD11b-hi-DCs etwas höhere Konzentrationen aufnahmen (Abbildung 3a). In mediastinalen LK war die Häufigkeit von CA-tragenden DCs zwischen den beiden Untergruppen vergleichbar, während HDM-tragende Zellen häufiger bei CD11b-hi-DCs auftraten (Abbildung 3b). Obwohl die Menge der Allergenaufnahme variieren kann, können also beide Hauptuntergruppen der DC diese klinisch relevanten Allergene aufnehmen. Um zu testen, ob CD103 + -DCs auch Th2-Antworten auf diese Allergene auslösen, wurden CD11b hi und CD103 + -DCs aus den Lungen von CA- oder HDM-behandelten Mäusen gereinigt und mit naiven CD4 + -T-Zellen von C57BL/6-Mäusen kultiviert. Wie erwartet war das Ausmaß der T-Zell-Proliferation geringer als zuvor für OT-II-T-Zellen nach OVA-Präsentation durch DCs (Abbildung 3c und d), da nur eine kleine Anzahl naiver T-Zellen in unbehandelten C57BL/6-Mäusen von CA oder HDM erwartet werden. Die Inkubation mit Anti-CD3ɛ- und CD28-Antikörpern rief jedoch die IL-4-Produktion durch T-Zellen hervor, die mit CD103 + -DCs von CA- oder HDM-behandelten Mäusen cokultiviert worden waren (Abbildung 3c und d). Somit ist die Fähigkeit von CD103 + -DCs, Th2-Antworten auszulösen, nicht auf das experimentelle Allergen OVA beschränkt, sondern erstreckt sich auch auf klinisch relevante Allergene.Zusätzlich zum Th2-Priming primten CD103 + -DCs auch die Differenzierung von IL-17-produzierenden T-Zellen als Reaktion auf CA und HDM. Im Gegensatz zu Experimenten mit OVA, bei denen CD103 + -DCs jedoch nicht in der Lage waren, Th1-Antworten zu stimulieren, konnten CA- und HDM-tragende CD103 + -DCs auch die Differenzierung von IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen stimulieren. Um zu testen, ob mikrobielle Komponenten, die sich in CA und HDM befinden, die Fähigkeit von CD103 + DCs zur Förderung der Th1-Differenzierung verbessern könnten, wurde den Atemwegen von Mäusen OVA zusammen mit entweder LPS oder poly I:C, einem synthetischen Analogon von doppelsträngiger RNA, instilliert. CD103 + -DCs, die aus den Lungen von OVA-Poly I:C (Polyinosin-Polycytidylsäure)-behandelten Mäusen hergestellt wurden, förderten höhere Niveaus der Th1-Differenzierung als CD103 + -DCs von OVA-LPS-behandelten Mäusen (ergänzende Abbildung S4 online). Dieses Ergebnis stimmt mit einem früheren Bericht überein, dass CD103 + Lungen-DCs die Th1-Differenzierung nach einer Influenzavirus-Infektion vorantreiben. 27 Somit kann die Th1-Differenzierung je nach verwendetem Adjuvans entweder durch CD103 + DCs oder CD11b hi DCs geprimt werden, während die Th2-Differenzierung nur durch CD103 + DCs geprimt werden kann.

CD103 + dendritische Zellen (DCs) lösen Th2-Antworten auf klinisch relevante Allergene aus. (ein, B) DCs in der Lunge (ein) oder mediastinalen Lymphknoten (B) von unbehandelten C57BL/6-Mäusen (gestrichelte Linie) oder Mäusen, die 16 h früher eine oropharyngeale Aspiration von Alexa Fluor-647-markiertem Schabenantigen (CA) oder Hausstaubmilbe (HDM) erhielten (durchgezogene Linie). Mittelwert±s.e. (n=3) Prozent Antigen-positive DCs sind in jedem Histogramm angegeben. (C, D) Gereinigte Lungen-DCs von C57BL/6-Mäusen, die CA erhalten (C) oder HDM (D) wurden mit naiven CD4 + T-Zellen von C57BL/6-Mäusen cokultiviert. Proliferation von T-Zellen, wie aus der T-Zell-Erholung nach 5 Tagen Kokultur abgeleitet. Zytokine in Überständen von T-Zellen nach 24 h Inkubation in anti-CD3ɛ- und anti-CD28-beschichteten Platten, gemessen durch Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. IFN, Interferon-IL, Interleukin.

Bedarf an CD103 + DCs für die Th2-Differenzierung

Unsere bisherigen Daten hatten gezeigt, dass gereinigte CD103 + -DCs eine größere Fähigkeit haben, die Th2-Differenzierung naiver T-Zellen zu stimulieren als CD11b-hi-DCs. Um dies zu bestätigen, haben wir die T-Zell-Stimulation durch lungendrainierende, mediastinale LN-DCs von . getestet Ccr7 −/− Mäuse, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie sehr wenige CD103 + -DCs enthalten. 28 Wir kamen zu dem Schluss, dass, wenn CD103 + DCs für das Th2-Priming erforderlich sind, die Gesamt-DCs aus LNs von Ccr7 −/− Mäuse sollten die Th2-Differenzierung nicht effizient vorbereiten. Um dies zu testen, haben wir zunächst verifiziert, dass mediastinale LK von Ccr7 −/− Mäuse enthalten CD11b hi DCs, aber fast keine CD103 + DCs (Abbildung 4a und b). Wir verglichen dann die T-Zell-Priming-Aktivität der gesamten CD11c + -DCs, die aus LNs von OVA-instilliertem WT und gewonnen wurden Ccr7 −/− Mäuse. T-Zellen kultiviert mit dem Ccr7 −/− DCs produzierten hohe Mengen an IFN-γ, aber sehr wenig IL-4 im Vergleich zu T-Zellen, die mit Wildtyp (WT) DCs kultiviert wurden (Abbildung 4c). Also CD11b hallo DCs von Ccr7 –/– LNs können die Th1-Zelldifferenzierung effektiv anregen, aber nicht die Th2-Differenzierung. Um zu bestätigen, dass die Unfähigkeit von LN DCs von Ccr7 −/− Mäusen zum Primen der Th2-Differenzierung war auf das Fehlen von CD103 + DCs und nicht auf einen intrinsischen Defekt in zurückzuführen Ccr7 −/− DCs untersuchten wir das T-Zell-Priming durch CD103 + DCs, die aus den Lungen von Ccr7 −/− Mäuse. Diese DCs waren beim Th2-Priming genauso effizient wie ihre WT-Gegenstücke (Abbildung 4d). Somit ist die Unfähigkeit von LN DCs von Ccr7 −/− Mäusen zur Förderung der Th2-Differenzierung ist nicht auf ein intrinsisches Erfordernis von CCR7 zurückzuführen, sondern eher auf das selektive Fehlen von CD103 + -DCs in mediastinalen LNs dieser Tiere.

CD103 + dendritische Zellen (DCs) werden für die Th2-Zelldifferenzierung benötigt. (ein, B) Analyse von DCs aus Lymphknoten (LNs) von Ccr7 −/− Mäuse. (ein) Durchflusszytometrie-Plots, die Prozentsätze von CD11b hi und CD103 + DCs in mediastinalen LK von Wildtyp (WT) C57BL/6 und zeigen Ccr7 −/− Mäuse. (B) Histogramme, die die Gesamtzahl der DC für jede DC-Untergruppe anzeigen (n=5−6). Die gezeigten Daten stammen aus einem der beiden unabhängigen Experimente, die ähnliche Ergebnisse liefern. (C, D) Induktion von T-Zell-Zytokinen durch Gesamt-LN-DCs (C) oder lungenresidente DC-Untergruppen (D). Naive CD4 + OT-II T-Zellen wurden mit den angegebenen DCs kultiviert, und die Zytokinproduktion aus T-Zellen wurde durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay nach Auslösen durch Anti-CD3ɛ- und CD28-Antikörper gemessen. P-Werte von Student's T-Prüfung. IFN, Interferon IL, Interleukin NS, nicht signifikant.

Allergische Atemwegsentzündungen sind bei Mäusen, denen CD103 + DCs fehlen, beeinträchtigt

Nachdem festgestellt wurde, dass CD103 + DCs erforderlich sind für Ex-vivo Priming von Th2-Reaktionen untersuchten wir als nächstes, ob diese DC-Untergruppe auch für das Priming von allergischen Reaktionen auf inhalierte Allergene erforderlich ist in vivo. Wir untersuchten allergische Reaktionen des rekombinanten Inzuchtstamms BXH2/TyJ, dem CD103 + -DCs in den meisten nicht lymphoiden Organen, einschließlich der Lunge, aufgrund einer Punktmutation in der kodierenden Region des IFN-Regulators 8 fehlen. 29, 30 Wir bestätigten zunächst, dass CD103 + -DCs in den Lungen von BXH2-Mäusen fehlen (Abbildung 5a und b), aber in den B6C3F1-Mäusen vorhanden sind, die von den gleichen Elternstämmen stammen. Um eine allergische Sensibilisierung auszulösen in vivo, haben wir OVA-LPS in die Atemwege von Mäusen eingeflößt. 21, 22, 23 Wie erwartet entwickelten WT B6C3F1-Mäuse, die auf diese Weise sensibilisiert wurden, bei anschließender Provokation mit OVA eine eosinophile und neutrophile Atemwegsentzündung (Ergänzende Abbildung S5 online). Ähnlich behandelte BXH2-Mäuse entwickelten jedoch keine Entzündung. Um festzustellen, ob BXH2-Mäuse auch refraktär gegenüber einer Sensibilisierung gegenüber klinisch relevanten Umweltallergenen sind, führten wir Versuche mit Extrakten aus gewöhnlichem Hausstaub durch. Hausstaub enthält sowohl Allergene als auch Adjuvantien, und wenn HDEs wiederholt in die Atemwege injiziert wird, lösen HDEs mehrere asthmaähnliche Reaktionen aus, einschließlich Atemwegsentzündungen. 31 B6C3F1-Mäuse wurden gegenüber HDE-Komponenten sensibilisiert, was durch das Vorhandensein von Entzündungszellen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit nach der Exposition der Mäuse mit dem gleichen Extrakt nachgewiesen wurde (Fig. 5c). Diese Entzündung resultierte eher aus adaptiven Immunantworten auf HDE als aus angeborenen Immunantworten, da nur sehr wenige Zellen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von exponierten Mäusen gefunden wurden, die zuvor nicht mit HDE sensibilisiert worden waren. Im Gegensatz zu B6C3F1-Mäusen wurden CD103 + DC-defiziente BXH2-Mäuse nicht durch HDE sensibilisiert und entwickelten keine signifikante Atemwegs- oder interstitielle Lungenentzündung bei Belastung (Abbildung 5c ​​und d). BXH2-Mäuse hatten auch wesentlich weniger schleimproduzierende Zellen in den Atemwegen als B6C3F1-Mäuse (Fig. 5e) und hatten niedrigere Spiegel von IL-4, IL-13 und IL-17 in der Lunge (Fig. 5f). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn Mäuse sensibilisiert und mit CA herausgefordert wurden (Fig. 5g). Diese Ergebnisse legten nahe, dass pulmonale CD103 + -DCs für eine allergische Sensibilisierung gegenüber inhalativen Allergenen erforderlich sind. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die bei BXH2-Mäusen beobachtete reduzierte allergische Lungenentzündung auf einen Defekt in anderen Zellen als CD103 + -DCs zurückzuführen ist, testeten wir die Fähigkeit von BXH2-Mäusen, nach subkutaner Sensibilisierung Th2-Reaktionen zu entwickeln, die durch mehrere DC-Untergruppen vermittelt wird . 32 Die Analyse der Reaktionen in hautdränierenden LNs ergab, dass T-Zellen von immunisierten BXH2-Mäusen geringere Mengen an IFN-γ produzierten als ihre Gegenstücke von WT-Mäusen (Abbildung 5h), möglicherweise weil die IFN-regulatorische Faktor-8-Mutation zu einer beeinträchtigten Produktion von . führt IL-12 und IFN-α durch APCs. 33 Die Produktion von IL-4 und IL-13 war jedoch bei BXH2- und B6C3F1-Mäusen vergleichbar. Die Anzahl der Knochenmark-Eosinophilen war in den beiden Stämmen ebenfalls ähnlich (Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass die reduzierte allergische Reaktion bei BXH2-Mäusen nach Sensibilisierung durch die Atemwege nicht auf eine allgemeine Beeinträchtigung der Th2-Reaktion oder der Entwicklung von Eosinophilen zurückzuführen war, sondern eher auf das Fehlen von CD103 + -DCs in der Lunge und drainierenden LNs.

Beeinträchtigte allergische Atemwegsentzündung bei CD103 + dendritischen Zellen (DC)-defizienten BXH2-Mäusen. (ein, B) Analyse von CD11c hi-Lungen-DCs von B6C3F1- und BXH2-Mäusen. (ein) Repräsentative Durchflusszytometrie-Plots, die Prozentsätze jeder DC-Untergruppe zeigen. (B) Kompilierte Daten, die die Gesamtzahl der Zellen für jede Teilmenge anzeigen (n=3). (CF) Reaktionen von B6C3F1- und BXH2-Mäusen auf Sensibilisierung und Provokation mit Hausstaubextrakt (HDE siehe METHODEN). (C) Entzündung der Atemwege. Mittelwerte ±s.e.m. der angegebenen Leukozyten-Untergruppen in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit (BALF) sind nach HDE-Challenge von unsensibilisierten (offene Säulen) und sensibilisierten Mäusen (gefüllte Säulen) gezeigt. P-Werte von Student's T-Prüfung (n=3–7). (D) Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung von Lungenschnitten. (e) Atemwegsschleim (dunkelviolett), sichtbar durch Periodsäure-Schiff-Färbung und Alcian-Blau-Färbung von Lungenschnitten. (F) Zytokin-Produktion. Die linken Lungenlappen wurden 2 Tage lang in Kulturmedium, das HDE enthielt, inkubiert und die Zytokine in den Überständen wurden durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. (g) Allergische Reaktionen auf die Herausforderung des Schabenantigens (CA). Mäuse wurden sensibilisiert und mit CA herausgefordert (siehe METHODEN) und die angezeigten Zellen im BALF wurden durch Differentialfärbung bewertet. P-Werte von Student's T-Prüfung (n=3–7). (h) Th2-Antworten bei B6C3F1- und BXH2-Mäusen nach subkutaner Sensibilisierung. Mäuse wurden durch Injektionen von Ovalbumin (OVA)/Alaun in die Fußballen immunisiert, und Zellen aus drainierenden Kniekehlen-LNs wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von OVA kultiviert. Zytokine in Kulturüberständen wurden durch ELISA analysiert. Mittelwerte±s.e.m. in Dreifach-Assays gezeigt. Die Daten repräsentieren eines der drei unabhängigen Experimente, die ähnliche Ergebnisse liefern. IFN, Interferon-IL, Interleukin.

Differentielle Expression von Molekülen durch lungenresidente DC-Untergruppen

Um die Mechanismen zu untersuchen, die für das Priming der Th1- und Th2-Differenzierung durch CD11b hi bzw. CD103 + Lungen-DCs verantwortlich sein könnten, verglichen wir die Expression mehrerer Kandidatenmoleküle. Es wurde vorgeschlagen, dass die unterschiedliche Expression von Notch-Liganden zur Differenzierung von T-Helferzellen beiträgt, wobei Jagged 1 und Jagged 2 die Th2-Differenzierung fördern und Delta-like 4 die Th1-Differenzierung fördert. 34 Das haben wir gefunden Zacke 1 Expression war in den beiden DC-Untergruppen ähnlich, wohingegen Zacke 2 Expression war in CD103 + DCs höher als in CD11b hi DCs (ergänzende Abbildung S6 online). Im Gegensatz, Dll 4 Expression war in CD11b hi DCs geringfügig höher, wenn auch nicht statistisch signifikant. Somit könnte eine unterschiedliche Expression dieser Notch-Liganden durch die beiden Hauptuntergruppen von Lungen-DC zu ihrer Fähigkeit beitragen, die T-Helfer-Differenzierung zu fördern.

Analyse der Zytokinproduktion von DCs nach ihrer Aktivierung Ex-vivo zeigten, dass CD11b-hi-DCs höhere IFN-γ-Spiegel aufwiesen als CD103 + -DCs (ergänzende Abbildung S7a und c-e online). IFN-γ-defiziente CD11b-hi-DCs erlangten jedoch keine Th2-induzierende Fähigkeit (ergänzende Abbildung S8a online). Wie erwartet produzierten weder CD11b hi-DCs noch CD103 + -DCs nachweisbares IL-4 (Ergänzende Abbildung S7a online), und IL-4-defiziente CD103 + -DCs stimulierten die Th2-Differenzierung mindestens so effizient wie ihre WT-Gegenstücke (Ergänzende Abbildung S8b online). CD103 + DCs produzierten auch höhere Spiegel von IL-1β, IL-2, IL-9, IL-10 und CCL11 als CD11b hi DCs (ergänzende Abbildung S7a und b online). IL-2-defiziente und IL-9-defiziente CD103 + DCs stimulierten die Th2-Differenzierung jedoch ebenso effizient wie ihre WT-Kontrollen (ergänzende Abbildung S8c und d online). IL-10-defiziente CD103 + DCs hatten eine mäßige, aber signifikante Verringerung ihrer Fähigkeit, die IL-4- und IL-13-Produktion durch T-Zellen zu induzieren, verglichen mit WT-Gegenstücken (ergänzende Abbildung S8e online und Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass CD103 + Die DC-Produktion von IL-10 trägt zur Th2-Induktion bei.

Die Analyse der Zelloberflächenmoleküle ergab, dass die meisten auf CD11b hi und CD103 + DCs in ähnlichen Konzentrationen präsentiert wurden (ergänzende Abbildungen S9a und b online). Zu diesen Molekülen gehörten CD70 und OX40L, von denen berichtet wird, dass sie Th1- bzw. Th2-Antworten fördern. 35, 36, 37 CD103 + -DCs hatten etwas höhere CD86-Spiegel, die mit Th2-Priming verbunden sind, 38 während CD11b-hi-DCs höhere CD14- und Ly-6C-Spiegel aufwiesen, die mit Th1-stimulierenden entzündlichen DCs verbunden sind (Ergänzende Abbildung S9b online). 3, 4, 39 CD103 + DCs zeigten auch höhere Konzentrationen von CD117/c-Kit, von dem berichtet wird, dass es am Priming von Th2- und Th17-Antworten beteiligt ist. 40 CD103 + DCs aus der Lunge der c-Kit-Mutante W/W v Mäuse induzierten die Th2-Differenzierung ebenso effizient wie die von WT-Mäusen (Ergänzende Abbildung S8f online).

Die Selektivität der T-Helfer-Induktion durch lungenresidente DCs wird durch das Ausmaß der Antigenpräsentation vermittelt

In unseren Analysen der Zelloberflächenmolekülexpression stellten wir fest, dass CD11b hi-DCs etwas höhere Spiegel der MHC-Klasse II und viel höhere Spiegel des Makrophagen-Mannose-Rezeptors zeigten (Abbildung 6a). Letzteres Molekül vermittelt die Aufnahme mehrerer löslicher Antigene, einschließlich OVA. 41 Diese Beobachtungen legten nahe, dass CD11b-hi-DCs mehr Antigen aufnehmen und diesen gegenüber T-Zellen präsentieren könnten als CD103 + -DCs. Mit Alexa Fluor-647-markiertem OVA bestätigten wir, dass CD11b-hi-DCs über einen weiten Bereich von OVA-Konzentrationen höhere Mengen an OVA aufnehmen als CD103 + -DCs (Abbildung 6b und c). Da wir festgestellt hatten, dass Poly I:C CD103 + -DCs einen Th1-induzierenden Phänotyp verlieh (ergänzende Abbildung S4 online), analysierten wir Lungen-DCs nach Instillation dieses mikrobiellen Produkts in die Atemwege. Die Poly-I:C-Instillation erhöhte die MHC-Klasse II und CD86 sowohl auf CD103 + -DCs als auch auf CD11b-hi-DCs. Poly I:C erhöhte auch das Niveau der OVA-Aufnahme durch CD103 + DCs, jedoch nicht durch CD11b hi DCs (ergänzende Abbildung S10 online). Um zu bestimmen, ob das Ausmaß der Antigenpräsentation die T-Helfer-Differenzierung beeinflusst, wurden CD103 + und CD11b hi DCs aus den Lungen unbehandelter Mäuse sortiert und anschließend geladen Ex-vivo mit verschiedenen Mengen an OVA-Peptid. Obwohl beide DC-Untergruppen die Proliferation von CD4 + OT-II-T-Zellen in Abhängigkeit von der Peptidkonzentration induzierten, waren CD103 + -DCs bei niedrigen Peptidkonzentrationen wirksamer ( 6d ). CD11b hi-DCs primten die Th1-Differenzierung bei allen Peptidkonzentrationen, obwohl diese Priming bei höheren Peptidkonzentrationen stärker war ( 6e ). Jedoch waren CD11bhi-DCs nicht in der Lage, die Th2-Differenzierung effizient zu primen, unabhängig von der verwendeten Peptidkonzentration. Im Gegensatz dazu war das CD103 + DC-Priming von Th2-Zellen stark von den Peptidspiegeln abhängig. Bei niedrigen Peptidkonzentrationen stimulierten CD103 + -DCs ausschließlich Th2-Antworten, während diese DCs bei hohen Konzentrationen sowohl die Th1- als auch die Th17-Differenzierung stimulierten. Zusammengefasst zeigen die aktuellen Daten, dass CD11b hi-DCs selektiv Th1-Antworten auf OVA anregen, während CD103 + -DCs je nach Stärke der Peptidpräsentation entweder Th2- oder Th1- und Th17-Antworten anregen können.

Wirkung der Antigenaufnahme durch Untergruppen von dendritischen Lungenzellen (DC) auf die T-Zell-Differenzierung. (ein) Oberflächenmolekülanzeige. Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) und Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II auf Lungen-DC-Untergruppen von unbehandelten C57BL/6-Mäusen wurden mit spezifischen Antikörpern (durchgezogene Linie) oder mit Isotyp-Kontrollantikörpern (gepunktete Linie) gefärbt. (B) Aufnahme von Ovalbumin (OVA) durch DC-Untergruppen. Flussdiagramme sind für die OVA-Alexa Fluor (AF)-647-Fluoreszenz in CD11b hi und CD103 + lungenresidenten DCs 24 h nach Instillation von 100 μg OVA-AF647 zusammen mit Lipopolysaccharid (LPS) gezeigt. (C) OVA-AF647-Aufnahme (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) durch die lungenresidenten DCs nach Instillation verschiedener Mengen von OVA-AF647. P-Wert von Student's T-Prüfung (n=3). Ergebnisse von einem der beiden ähnlichen Experimente sind gezeigt. (D, e) Wirkung der Peptidkonzentration auf die T-Zell-Proliferation und die Zytokin-Produktion. CD11b hi und CD103 + lungenresidente DCs wurden aus Lungen unbehandelter C57BL/6-Mäuse hergestellt, beladen mit den angegebenen Mengen an OVA323−339 Peptid Ex-vivound mit naiven CD4 + OT-II T-Zellen kultiviert. Proliferation von T-Zellen in Kokulturen (D) und Zytokinproduktion aus T-Zellen, gemessen durch Enzyme-Linked Immunosorbent Assay nach Auslösung durch Anti-CD3ɛ- und CD28-Antikörper (e) Sind angegeben. Gezeigt wird eines der beiden unabhängigen Experimente mit ähnlichen Ergebnissen. IFN, Interferon IL, Interleukin ND, nicht nachgewiesen.


CD40-Aktivität an dendritischen Zellen, jedoch nicht an B- oder T-Zellen, ist für die langfristige Kontrolle des murinen Gammaherpesvirus 68 . erforderlich

FEIGE. 1. Die Expression von CD40 auf T-Zellen ist für eine wirksame Langzeitkontrolle von MHV-68 oder für die antivirale Antikörperproduktion nicht erforderlich. Athymische C57BL/6-Nacktmäuse (nackte Foxn1nu-Mäuse) wurden mit syngenen CD4- und CD8-T-Zellen von entweder CD40 +/+ oder CD40 –/– C57BL/6-Mäusen rekonstituiert. Mäuse wurden dann intranasal mit 2 × 10 4 PFU MHV-68 infiziert. Als Kontrollen (CTR) wurden auch CD40 –/– C57BL/6-Mäuse infiziert. (A) Am Tag 50 nach der Infektion wurden Virustiter in Lungenhomogenaten durch Plaque-Assay gemessen. Die Daten werden als PFU/0,1 g Lungengewebe für einzelne Mäuse ausgedrückt. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus zwei Einzelexperimenten mit vier Mäusen pro Gruppe. Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied in den Virustitern von Nacktmäusen, die entweder mit CD40 +/+ oder CD40 –/– T-Zellen rekonstituiert wurden, und denen von CD40 –/– Kontrollmäusen (P < 0,001 Schüler T Prüfung). (B) Anti-MHV-68-spezifische Antikörpertiter (Gesamt-Ig) wurden durch ELISA unter Verwendung von Seren von infizierten Tieren und Kontrollen zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion bestimmt. Seren von vier einzelnen Mäusen zu jedem Zeitpunkt wurden getestet. Die Daten werden als mittlere Extinktionswerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, die ähnliche Ergebnisse lieferten. Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied in den Serumantikörpertitern von Nacktmäusen, die mit CD40 –/– T-Zellen rekonstituiert wurden, und denen von CD40 –/– Kontrollmäusen (P < 0,001 Schüler T Prüfung). FEIGE. 2. Die CD40-Expression auf T-Zellen ist für die Langzeitkontrolle von MHV-68 in Abwesenheit einer antiviralen Antikörperantwort nicht erforderlich. (A) Rag1 –/– -Mäuse wurden mit CD4- und CD8-T-Zellen von entweder CD40 +/+ oder CD40 –/– -Mäusen rekonstituiert und dann intranasal mit MHV-68 infiziert. Virustiter in Lungenhomogenaten wurden am Tag 50 nach der Infektion bestimmt. Die Daten werden als PFU/0,1 g Lungengewebe für einzelne Mäuse ausgedrückt. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus zwei Einzelexperimenten mit vier oder fünf Mäusen in jeder Gruppe. Als Kontrollen wurden auch Gruppen von zwei oder drei WT-Mäusen infiziert.Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Lungenvirustitern von Rag1 −/− -Mäusen, die entweder mit CD40 +/+ oder CD40 −/− T-Zellen rekonstituiert wurden, und denen von CD40 −/− Kontrollmäusen (P < 0,01 Mann-Whitney-Rangsummentest). (B und C) Anti-MHV-68-spezifische Antikörpertiter wurden durch ELISA unter Verwendung von Seren von infizierten Tieren und Kontrollen am Tag 15 oder 50 nach der Infektion bestimmt. Die Daten werden als mittlere Extinktionswerte ± Standardabweichungen (Fehlerbalken) ausgedrückt. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei Einzelexperimente mit vier oder fünf Mäusen in jeder Gruppe. FEIGE. 3 . Der adoptive Transfer von Anti-CD40-behandelten B-Zellen stellt die antivirale Antikörperproduktion oder die Langzeitkontrolle von MHV-68 in CII –/– -Mäusen nicht wieder her. Ruhende B-Zellen (CD19 + CD43 – ) wurden aus Milzen von CII –/– -Donormäusen gereinigt und mit anti-CD40-Antikörper für 48 h inkubiert. Als Negativkontrollen wurden frisch gereinigte, unstimulierte ruhende B-Zellen verwendet. (A) Die Expression von kostimulatorischen Molekülen wurde durch FACS analysiert. Der Prozentsatz an CD19 + B-Zellen, die CD80 und CD86 exprimierten, war signifikant höher, wenn B-Zellen mit Anti-CD40-Antikörpern inkubiert wurden, als in unbehandelten ruhenden B-Zellen (P < 0,05 Schüler T Prüfung). CII –/– -Mäusen wurden i.v. mit Anti-CD40-behandelten oder ruhenden B-Zellen und infiziert mit 2 × 10 4 PFU von MHV-68. Als Kontrollen (CTR) wurden auch unbehandelte CII –/– -Mäuse infiziert. (B) MHV-68-Titer in Lungenhomogenaten wurden durch Plaque-Assay am Tag 50 nach der Infektion bestimmt. Die Daten werden als PFU/0,1 g Lungengewebe für einzelne Mäuse ausgedrückt. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen an. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten mit fünf Mäusen in jeder Gruppe. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Mäusegruppen. (C) Anti-MHV-68-spezifische Antikörpertiter wurden durch ELISA am Tag 50 nach der Infektion bestimmt. Die Daten werden als mittlere Extinktionswerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei individuelle Experimente mit fünf Mäusen in jeder Gruppe. FEIGE. 4. Der adoptive Transfer von Anti-CD40-behandelten DC stellt die Langzeitkontrolle von MHV-68 in CII –/– -Mäusen wieder her. Nach 5 Tagen in Kultur wurden BMDC mit unstimuliertem Anti-CD40-Antikörper inkubiert oder Ratten-Ig-behandelte BMDC wurden als Negativkontrollen verwendet. Nach 24 h wurde die Expression von Reifungsmarkern mittels FACS analysiert. (A) Die Anti-CD40-Behandlung erhöhte signifikant den Prozentsatz der Zellen, die hohe Mengen an CD80 und CD86 exprimieren (P = 0,012 bzw. 0,018). (B) Der Prozentsatz an CD11c + -Zellen, die hohe Konzentrationen des kostimulatorischen CD70-Moleküls exprimieren, war in der Anti-CD40-behandelten Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe (P < 0,001). (C) CII –/– Mäuse wurden mit 2 × 10 4 PFU von MHV-68 infiziert. An den Tagen 1 und 15 nach der Infektion wurde den Mäusen intraperitoneal Anti-CD40-konditioniertes oder Kontroll-BMDC injiziert. Als Kontrollen wurden auch CII –/– -Mäuse, die keine DC erhielten, infiziert. Am Tag 50 nach der Infektion wurden Virustiter in Lungenhomogenaten durch Plaque-Assay bestimmt. Die Daten werden als PFU/0,1 g Lungengewebe ausgedrückt. Das Diagramm zeigt die Durchschnittswerte für fünf Experimente mit fünf Mäusen in jeder Gruppe. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler an. Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied in den Lungenvirustitern von Mäusen, die Anti-CD40-behandelte DC erhielten, und denen von Mäusen, die Kontroll-DC erhielten (P = 0,032 Schüler T Prüfung).