Information

Warum sollte ich meine Gellösung für Polyacrylamidgele entgasen?

Warum sollte ich meine Gellösung für Polyacrylamidgele entgasen?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

In Protokollen für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) sehe ich oft Anweisungen, die Gellösung zu entgasen, indem man sie 10-15 Minuten lang unter Vakuum setzt, bevor das Gel polymerisiert wird.

Normalerweise mache ich das nicht, und als ich es einmal ausprobiert habe, konnte ich keinen Unterschied feststellen. Da frage ich mich, was genau die Entgasung bewirken soll und wie groß der Effekt sein soll.

  • Welche Wirkung soll die Entgasung der Gellösung haben?
  • Wie wichtig ist die Entgasung, um gute Gele zu erzielen?

Jegliche Literatur, die die Wirkung der Entgasung untersucht, wäre willkommen.


Der Grund für das Entgasen Ihrer Gele ist die Entfernung von Sauerstoff. Sauerstoff im Gel stört die Polymerisation, verlangsamt sie und macht sie weniger konsistent, so dass die Entgasung sie schneller und gleichmäßiger macht.

Aus dem EncorBio SDS-PAGE-Protokoll:

Die Polymerisation verläuft schneller und gleichmäßiger, wenn Sie die ersten drei Lösungen vor der Zugabe der letzten drei Reagenzien einige Minuten in einem Ehrlenmeyerkolben im Hausvakuum entgasen. Molekularer Sauerstoff hemmt die Polymerisation durch Reaktion mit dem freien Radikal SO4- Ionen, was eigentlich der Grund ist, warum PAGE-Gele in Röhrchen oder zwischen Platten gegossen werden und nicht wie bei Agarose in offene horizontale Apparate. Es ist auch eine gute Idee, etwas Isopropanol auf das Gel zu schichten, da dies das Eindringen von Sauerstoff und die Hemmung der Polymerisation verhindert.

Sauerstoff kann auch zur Oxidation von Proteinprodukten führen, was entscheidend sein kann, wenn Sie die Produkte dann extrahieren und für etwas anderes verwenden möchten (z. B. Sun & Anderson, 2004).

Schließlich können Blasen in Ihrem Gel die Ergebnisse verfälschen und sie weniger reproduzierbar machen, da sich die Blasen nicht bei jeder Wiederholung gleichmäßig bilden und das physikalische Medium des Polyacrylamids stören. Ein weiterer Zweck der Entgasung besteht also darin, die Wiederholbarkeit zu gewährleisten.

Das Bio-Rad Acrylamid-Polymerisations-Infoblatt enthält die besten Informationen, die ich finden konnte:

Die Bildung von Polyacrylamidgelen erfolgt über eine radikalische Polymerisation. Die Reaktion wird daher durch alle Elemente oder Verbindungen gehemmt, die als Radikalfänger dienen (Chrambach 1985). Sauerstoff ist ein solcher Inhibitor. Sauerstoff, der in der Luft vorhanden, in Gellösungen gelöst oder an den Oberflächen von Kunststoff, Gummi usw. adsorbiert ist, hemmt und verhindert im Extremfall die Acrylamid-Polymerisation. Die richtige Entgasung ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit. Daher ist einer der wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Polyacrylamidgelen das Evakuieren oder „Entgasen“ von Gellösungen unmittelbar vor dem Gießen des Gels. Dies geschieht, indem der Kolben mit der Gellösung in eine Vakuumkammer oder unter einen starken Aspirator gestellt wird. In einigen Fällen kann eine Vakuumpumpe erforderlich sein.

Pufferstammlösungen und Monomerstammlösungen werden normalerweise bei 4°C gelagert. Kalte Lösungen haben eine größere Kapazität für gelösten Sauerstoff. Der Entgasungsprozess ist schneller und vollständiger, wenn die Gellösung vor Beginn der Entgasung auf Raumtemperatur (23-25°C) gebracht wird. Wenn außerdem eine kalte Gellösung unter Vakuum gesetzt wird, neigt der Evakuierungsvorgang dazu, die Lösung kalt zu halten. Das Gießen eines Gels mit einer kalten Lösung hat einen erheblichen negativen Einfluss auf die Polymerisationsgeschwindigkeit und die Qualität des resultierenden Gels.

Eine Polymerisation, bei der Riboflavin als einer der Initiatoren verwendet wird, erfordert eine Entgasung. Die Umwandlung von Riboflavin von der Flavo- in die Leuco-Form (die bei der Initiation aktive Spezies) erfordert tatsächlich eine geringe Menge Sauerstoff (Gordon 1973).

Dies erklärt, warum die primär durch Riboflavin initiierte Polymerisation durch erschöpfendes Entgasen vollständig blockiert werden kann. Überschüssiger Sauerstoff, der zur Umwandlung von Riboflavin in die aktive Form benötigt wird, hemmt jedoch die Polymerkettenverlängerung, wie dies bei Reaktionen der Fall ist, die nur durch Ammoniumpersulfat und TEMED initiiert werden. Somit ist die Entgasung zwar noch wichtig, um die Hemmung zu begrenzen, sie darf jedoch nicht so umfangreich sein, dass sie die Umwandlung von Riboflavin in die aktive Form verhindert. Bei einer durch Riboflavin/TEMED- oder Riboflavin/TEMED/Ammoniumpersulfat-Systeme initiierten Polymerisation sollte die Entgasung 5 min nicht überschreiten.

Eine Folge der Wechselwirkung von Riboflavin mit Sauerstoff ist, dass Riboflavin als Sauerstofffänger zu wirken scheint. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Zugabe von Riboflavin (5 µg/ml) zu Stapelgellösungen, die Ammoniumpersulfat/TEMED-Initiatoren enthalten, zu einer saubereren, gleichmäßigeren Polymerisation an sauerstoffexponierten Geloberflächen (wie Kämmen) führt. Der gleiche Effekt könnte wahrscheinlich durch eine gründlichere Entgasung von Lösungen ohne Riboflavin erreicht werden.

Ob chemische Polymerisation (Ammoniumpersulfat/TEMED) oder photochemische Polymerisation (Riboflavin/TEMED oder Riboflavin/TEMED/Ammoniumpersulfat-Initiatoren), reproduzierbare Gelqualität und Trenneigenschaften erfordern eine sorgfältige Beachtung der Gellösungstemperatur vor dem Entgasen und der Entgasungszeit, Temperatur, und Vakuum. Diese Parameter sollten bei jeder Gelherstellung konstant gehalten werden.

Entschuldigung für die langen Zitate, aber sie werden hier eingefügt, falls die Originalquellen verschwinden.

Verweise:


Ich habe in letzter Zeit Gele mit unterschiedlichen Acrylamid/Bisacrylamid-Verhältnissen verwendet. Menschen arbeiten normalerweise mit 1:37,5, 1:29-Verhältnissen, die üblicherweise für DNA- und Protein-Gele verwendet werden. Mir ist aufgefallen, dass bei niedrigeren Verhältnissen von 1:200 - 1:500 die Entgasung grundlegend wird, um eine reproduzierbare Auflösung meiner Proteine ​​zu gewährleisten. Wenn ich die Mischung in einem dieser Gele nicht entgase, trennen sich einige der Proteine, die ich auflöse (die sehr nahe beieinander wandern), nicht gut genug. Außerdem kann die Polymerisationszeit des Gels zwischen 20 und 45 Minuten betragen, wenn ich die Lösung nicht vorher entgase. Das Entgasen von Lösungen mit normalen Vernetzerverhältnissen von 1:29, 1:37,5 scheint meiner Erfahrung nach keine großen Auswirkungen zu haben, außer auf schnellere Polymerisationszeiten. Vielleicht macht es bei Gelen mit niedrigerer Konzentration (8-5%) einen Unterschied, aber ich würde mir ehrlich gesagt nicht allzu viele Sorgen machen, wenn ich routinemäßig 10-15% Gele laufen würde und die reproduzierbare Auflösung kein Problem wäre.


Was könnte dazu führen, dass das Gel nicht polymerisiert (fest wird)? - Gelherstellung (23. Juni 2008 )

Verpasse ich etwas? Müssen die oben genannten Reagenzien vor der Verwendung bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden? Warum verfestigen sich meine Gele nicht mehr wie früher?

Hallo allerseits. Meine Laufgele härten nicht aus. Ich habe hinzugefügt

6 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid,
3,75 ml pH 8,8 3 M Tris-HCl,
100 uL 20% SDB
5 ml Wasser

Verpasse ich etwas? Müssen die oben genannten Reagenzien vor der Verwendung bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden? Warum verfestigen sich meine Gele nicht mehr wie früher?

Ich werde es versuchen und melde mich wieder. Du bist möglicherweise mein Tagspar-Zellenzähler!

Hallo allerseits. Meine Laufgele härten nicht aus. Ich habe hinzugefügt

6 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid,
3,75 ml pH 8,8 3 M Tris-HCl,
100 uL 20% SDB
5 ml Wasser

Verpasse ich etwas? Müssen die oben genannten Reagenzien vor der Verwendung bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden? Warum verfestigen sich meine Gele nicht mehr wie früher?

Cellcounter hat recht. APS ist der Hauptschuldige. Es ist sehr wichtig, dass Sie Ihr trockenes APS in einem Exsikkator aufbewahren. Es wird mit der Zeit schlecht, wenn du es nicht tust (mir ist es passiert!)
Klara

Ihr hattet recht mit dem Geld. Sobald ich APS neu gemacht habe, habe ich frisches APS verwendet und was weißt du? Mein Gel war innerhalb von 30 Minuten steinhart (übertrieben).

Ihr hattet recht mit dem Geld. Sobald ich APS neu gemacht habe, habe ich frisches APS verwendet und was weißt du? Mein Gel war innerhalb von 30 Minuten steinhart (übertrieben).

Hallo allerseits. Meine Laufgele härten nicht aus. Ich habe hinzugefügt

6 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid,
3,75 ml pH 8,8 3 M Tris-HCl,
100 uL 20 % SDB
5 ml Wasser

Verpasse ich etwas? Müssen die oben genannten Reagenzien vor der Verwendung bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden? Warum verfestigen sich meine Gele nicht mehr wie früher?

Ich habe irgendwo gelesen, dass ein zu starkes Mischen der Gelmischung zu einer Sauerstoffsättigung führen kann, die dann die Gelpolymerisation behindert. ist daran wahr?

Hallo allerseits. Meine Laufgele härten nicht aus. Ich habe hinzugefügt

6 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid,
3,75 ml pH 8,8 3 M Tris-HCl,
100 uL 20 % SDB
5 ml Wasser

Verpasse ich etwas? Müssen die oben genannten Reagenzien vor der Verwendung bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden? Warum verfestigen sich meine Gele nicht mehr wie früher?

Ich habe irgendwo gelesen, dass ein zu starkes Mischen der Gelmischung zu einer Sauerstoffsättigung führen kann, die dann die Gelpolymerisation behindert. ist daran wahr?

Das ist wahr. Aber wenn Sie es nicht wie eine Nuss mischen, sollte es schließlich polymerisieren.

Luftsauerstoff ist ein Radikalfänger, der SO 4 – -Ionen fängt, die von dem inhärent instabilen APS, das für die Polymerisation notwendig ist, produziert werden.

In der guten alten Zeit entlüftete man auch Acrylamidmischungen, um Gele polymerisieren zu lassen.

Ich habe letztes Jahr noch die Acrylamidmischung entlüftet, um den Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen (nur für den Fall). Aber jetzt habe ich herausgefunden, dass es nicht mehr nötig ist. Sie können auch ohne Entlüftung noch polymerisieren!


Warum polymerisiert mein SDS-PAGE Stapelgel nicht? 23. Oktober 2012 18:34 Abonnieren

Mein Laborleiter hat beschlossen, dass wir jetzt unsere eigenen SDS-PAGE-Gele gießen. Ich holte die jahrelange Ausrüstung heraus und stellte mir die Aufgabe, herauszufinden, wie das geht. Das auflösende Gel polymerisiert gut, aber das Stapelgel kommt nicht weiter als klebrig (und manchmal nicht einmal so weit).

Ich verwende 12% auflösendes Gel, 5% stapelndes Gel. Rezepte unten:

Auflösendes Gel (12 %, 1 ml Lösung) - tut polymerisieren:
334ul DI H2O
250ul 1,5M Tris, pH 8,8
400ul 30% Acrylamid/0,8% Bis-Acrylamid
5ul 20% SDB
10ul 10% APS
1ul TEMED

Stapelgel (5%, 1 ml insgesamt) - Tut nicht polymerisieren
549ul DI H2O
260 ul 0,5 M Tris, pH 6,8
170ul 30% Acrylamid/0,8% Bis-Acrylamid
5ul 20% SDB
10ul 10% APS
1ul TEMED

Jetzt habe ich versucht, die Menge von APS und TEMED zu verdoppeln und zu verdreifachen (das Wasser entsprechend zu verringern). Ich habe sogar eine Testreihe aufgebaut, bei der ich 5x, 10x und 20x APS und TEMED gemacht habe. Immer noch keine Polymerisation.

Lösungen haben Raumtemperatur. APS ist aus einer frischen Flasche und wird bei jedem Versuch frisch hergestellt. TEMED ist frisch. Das einzige, was nicht frisch ist, sind die trockenen Tris-, Acrylamid- und Bisacrylamid-Reagenzien. Die Lösungen selbst sind frisch. Könnten die Acrylamide schlecht geworden sein? Aber wie gesagt, das 12% auflösende Gel polymerisiert.

Lösungen werden in einem Gelblichtraum hergestellt, aber wenn sie in Weißlicht ausgegeben werden, ist die Polymerisation immer noch nicht erfolgreich.

Haben erfahrene Gelhersteller Ideen?

Sauerstoff hemmt die Acrylamid-Polymerisation, daher müssen Sie Ihre Lösungen möglicherweise entgasen. Oder, wenn die Volumina unpraktisch klein sind, entgasen Sie das Wasser, das Sie für die Herstellung verwenden.

Wie halten Sie die Luft von Ihrem Stapler fern? Deckt der Kamm die Oberseite der Acrylamidlösung vollständig ab? Wenn etwas davon der Luft ausgesetzt ist, können Sie mit einer Pasteurpipette vorsichtig wassergesättigtes Butanol darüber schichten, es schwimmt und bildet eine Barriere, während das Acrylamid polymerisiert Puffer, bevor Sie Ihre Samples laden.
gepostet von Quietgal um 19:45 Uhr am 23. Oktober 2012 [1 Favorit]

Bitten Sie den Laborleiter, die Kosteneinsparungen mit der Menge an Geld zu vergleichen, die Sie dafür verschwendet haben, dies zum Laufen zu bringen, und die durch die Verzögerungen verlorene Arbeit. Die Einsparungen sind wohl schon mehr als ausgeglichen.

Ich mache immer noch viele meiner eigenen Lösungen usw., aber wenn es um solche Dinge geht, kauft meine Laborgruppe vorgefertigte Gele. Keine Sicherheitssorgen wegen unpolymerisiertem Acrylamid, keine Zeitverschwendung, bessere Konsistenz und Reproduzierbarkeit.
Gepostet von Vorsicht Live-Frösche um 06:52 Uhr am 24. Oktober 2012 [1 Favorit]

Antwort des Posters: Der Kauf ist keine Option, der Manager würde es vorziehen, dass wir die Zeit damit verbringen, die Gele zu kaufen.

Ich habe nicht wassergesättigtes Butanol darüber geschichtet, aber es hat keinen Unterschied gemacht. Sollte ich es zuerst mit Wasser sättigen?
gepostet von Schroedinger am 24. Oktober 2012 um 07:44 Uhr

Eine Mischung aus Kommentaren und Fragen, die hilfreich sein können oder nicht:

-Mischen Sie die Gellösungen? Ich drehe meine Falcon-Röhrchen um, um das APS und TEMED ein wenig zu vermischen, aber Sie möchten die Gelmischung nicht beispielsweise durch Vortexen belüften.
-Sie sagen "APS-Flasche" - ich nehme an, Sie meinen einen Behälter mit trockenem APS, nicht wahr, keine Lösung? (Weil es total schlecht wird, wenn es wässrig ist, und ich es jedes Mal frisch aus Pulver mache, weil das Leben zu kurz ist, um dumme Gele wieder einzugießen.)
-Wie lange warten Sie, bis das Stapelgel polymerisiert? Ein bisschen länger tut nicht unbedingt weh (verdammt, die Polymerisation über Nacht ist in gewisser Weise sogar vorzuziehen, obwohl dies umständlich sein kann und für Standard-SDS-PAGE-Setups nicht erforderlich ist.) Und ein Stapelgel ist immer klebriger als ein auflösendes Gel - Sie können dies beobachten, wenn Sie nach einem Lauf die Dinge auseinandernehmen, damit Sie das Gel anfärben können.
-Sie sagen "Lösungen haben Raumtemperatur". Haben Sie Ihre Acrylamidlösung bei Raumtemperatur gelagert? Die Lösung sollte bei 2-8°C gelagert werden. (Am besten im Dunkeln, es sei denn, Sie gehen schnell durch.)
-Wurden Ihre Acrylamidpulver im Dunkeln gelagert (für reines Acrylamid)? Bei 2-8°C (für das N,N'-Methylenbis(acrylamid))?
-Ihre Volumina scheinen ziemlich klein zu sein und haben ein hohes Verhältnis von Stapeln zu Auflösungsgel. Wenn Sie etwas anderes als Minigele in mehr oder weniger Standardgröße verwenden (z. B. die, die Sie für ein Bio-Rad Mini-Protean-Rig herstellen würden), könnte das relevant sein?

Während ja, Sie können Ihre Puffer entgasen, aber ich musste dies nie tun, außer bei DNA-Sequenzierungsgelen, und ich musste nie die Oberseiten meiner schichten Stapeln geliert mit Butanol oder Isopropanol. Für Standardprotein SDS-PAGE sollten Sie nicht zu extremen Maßnahmen greifen müssen. Wenn ich wetten müsste, würde ich darauf wetten, dass Ihr Acrylamid zweifelhaft ist (entweder aufgrund der Lagerbedingungen / des Alters der Pulver oder der Lösung) und dass das Problem beim Stapelgel schlimmer ist, da weniger Acrylamid darin enthalten ist. Können Sie ein paar ml vorgemischte Acrylamidlösung von einem nahe gelegenen Labor, das regelmäßig Gele herstellt, stehlen oder 100 ml von Sigma oder jemand anderem kaufen (da es so aussieht, als würden Sie ziemlich Standardgele gießen, keine Schägger-Gele mit hohem C% oder was auch immer)? Das würde die Möglichkeit, dass Ihr Acrylamid schuld ist, zumindest bestätigen oder widerlegen. Dito für die Tris, wenn Sie sich paranoid fühlen.
gepostet von ubersturm am 24. Oktober 2012 um 9:36 Uhr

Beste Antwort: Ich mache eigentlich nicht nur 1ml Gele, das sind nur die Rezepte für 1ml, um den Vergleich der Komponenten zu erleichtern. Das Sammelgel wurde über Nacht polymerisieren gelassen und war zu klebrig, als dass sich irgendwelche Vertiefungen bilden konnten.

denke ich habe das hier gelöst. Die Acrylamidpulver wurden nicht im Dunkeln gelagert und sind etwa sieben Jahre alt. Ich habe mir eine frische, vorgefertigte Acrylamid / Bis-Acrylamid-Lösung ausgeliehen und alles hat gut polymerisiert. Alle Informationen, die ich mir online angesehen habe, beziehen sich auf alte APS und TEMED, aber es sieht so aus, als ob Acrylamid auch schlecht werden kann. Danke an alle!
gepostet von Schroedinger am 24. Oktober 2012 um 14:15 Uhr


Wie funktioniert es?

Es gibt verschiedene Arten von PAGE-Techniken, die verwendet werden, aber die gebräuchlichste wird als SDS-PAGE bezeichnet. In SDS-PAGE wird das Detergens Natriumdodecylsulfat verwendet, um die Proteine ​​zu denaturieren und ihr Masse-zu-Ladungs-Verhältnis zu normalisieren. Ohne SDS würden sowohl das Molekulargewicht als auch die Ladung des Proteins seine Trennung im Gel beeinflussen. Bei SDS beeinflusst nur das Molekulargewicht die Migrationsgeschwindigkeit und dementsprechend trennen sich die Proben. PAGE ohne SDS wird als native PAGE bezeichnet, da die Proteine ​​in ihrer nativen Konformation bleiben.

Die Gelmatrix

Wie bei der Agarosegelelektrophorese werden die Proben mit einem elektrischen Feld getrennt und passieren eine Gelmatrix, die die Migration der Proteine ​​beeinflusst. In PAGE verwenden wir anstelle von Agarose eine Chemikalie namens Polyacrylamid. Durch Variieren des Polyacrylamid-Prozentsatzes im Gel können wir die Größe der Poren im Gel ändern, was bedeutet, dass wir verschiedene Proteingrößen in Gels mit unterschiedlichem Prozentsatz trennen können. Typische Gel-Prozentsätze sind in der Tabelle unten gezeigt.

Acrylamid-AnteilTrennauflösung
5 %60 – 220 Kd
7.5 %30 – 120 Kd
10 %20 – 75 Kd
12%17 – 65 Kd
15 %15 -45 Kd
17.5%12 – 30 Kd

Acrylamid wird normalerweise in flüssiger Form verkauft, da die Pulverform neurotoxisch und gefährlich in der Handhabung ist. Die Polymerisation wird durch Mischen von Acrylamid mit Bisacrylamid erreicht, wodurch sich Vernetzungen zwischen den Acrylamidmolekülen bilden können. Zur Initiierung der Polymerisation werden zusätzliche Chemikalien zugesetzt, in der Regel Ammoniumpersulfat als Quelle für freie Radikale und TEMED als Stabilisator. Sobald die Polymerisation beginnt, wird das Gel zwischen 2 Glasplatten gegossen und vollständig polymerisieren gelassen.

Die Gelmischung wird nicht in Wasser, sondern in Elektrophoresepuffer (Tris-HCl) hergestellt, der die Ionen für die Elektrophorese bereitstellt. Oft wird das Gel in 2 Teilen gegossen. Der erste Teil ist ein sich auflösendes Gel mit einem pH-Wert von etwa 8,8, das die Migration der Proteine ​​verlangsamt. Über das Trenngel wird ein Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 und einer größeren Porengröße gegossen. Dieses Sammelgel dient dazu, die Proteinproben zu einer dünnen Migrationsfront zu komprimieren, sodass alle Proteine ​​in der Probe gleichzeitig am Auflösungsgel ankommen, was zu einer genauen relativen Migration führt.

Laufen mit dem Gel

Anders als bei der Agarosegelelektrophorese, bei der die Gele in Schalen gegossen werden, werden sie horizontal gegossen, SDS-PAGE-Gele werden vertikal unter Verwendung einer Gießvorrichtung gegossen. Wir gießen die Gele auf diese Weise, so dass die Stapel- und Auflösegele ein kontinuierliches Gel bilden, was bei einem horizontalen Gel viel schwieriger wäre. Es ermöglicht auch, dass eine viel größere Proteinmenge auf das Gel geladen wird. Der Geltank ist ebenfalls in 2 Abschnitte unterteilt. Je nach Hersteller hat der Tank eine innere (oder obere) Pufferkammer und eine äußere (oder untere) Pufferkammer. Diese beiden Kammern sind durch das Gel verbunden, um einen kontinuierlichen Kreislauf zu bilden. Jede Kammer enthält eine Elektrode, negativ in der inneren Kammer und positiv in der äußeren Kammer. Die innere Kammer berührt die Oberseite des Gels, und wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, bewegen sich die Proteine ​​aufgrund der negativen Ladungen der SDS-Moleküle in Richtung der positiven Elektrode in der äußeren Pufferkammer. Typische Puffer für SDS-PAGE sind Tris-Glycin für die Pufferkammern und Tris-HCl für das Gel.

Die Bewegungsgeschwindigkeit durch das Gel wird dann durch den Spannungsgradienten, d. h. die Spannung zwischen den Elektroden, bestimmt. Die erforderliche Feldstärke hängt von der Größe des verwendeten Geltanks ab und die erforderliche Spannung kann mit der einfachen Gleichung E = V/d berechnet werden, wobei E die Feldstärke, V die Spannung und d der Abstand in cm zwischen den Elektroden ist. Vertikale Geltanks werden im Allgemeinen mit 5 – 10 V / cm betrieben. Wenn Ihr Tank also einen Elektrodenabstand von 10 cm hat, würden Sie das Gel mit 50 – 100 V betreiben. Der genaue Wert hängt von Ihren Proben ab und sollte empirisch ermittelt werden.

Um dieses elektrische Feld anzulegen, verwenden wir eine Gleichstromversorgung. Die meisten Elektrophorese-Stromversorgungen können so eingestellt werden, dass sie entweder einen konstanten Strom oder eine konstante Spannung liefern, wobei jedes Vor- und Nachteile hat. Ein potenzielles Problem ist die Wärmeentwicklung aufgrund des Stromflusses durch das System, der bei größeren Tanks, die eine höhere Spannung erfordern, besonders hoch sein kann. Aus diesem Grund ist es ratsam, bei größeren Elektrophoresesystemen eine Form der Kühlung einzusetzen, entweder passiv in Form eines Kühlblocks oder aktiv wie ein Umlaufkühler.

Visualisierung des Proteins

Nach der Migration müssen Proteine ​​sichtbar gemacht werden, um ihre Länge und Häufigkeit zu bestimmen. Es gibt verschiedene Methoden, die häufig verwendet werden, um Proteine ​​sichtbar zu machen, die entweder spezifisch oder nicht spezifisch sind. Die unspezifische Proteinvisualisierung zielt auf alle Proteine ​​ab, wobei Farbstoffe verwendet werden, die an gemeinsame Regionen der Proteine ​​wie die Aminogruppen binden. Beispiele für unspezifische Proteinfärbungen umfassen Coomassie Brilliant Blue und Ruby Pro. Diese Flecken sind oft nicht reversibel und können (aber nicht immer) nachgelagerte Anwendungen stören. Eine unspezifische Färbung kann nützlich sein, um Proben in einem Gel schnell zu quantifizieren oder um sicherzustellen, dass eine interessierende Probe vorhanden ist.

Um bestimmte Proteine ​​spezifisch sichtbar zu machen, benötigen wir Antikörper. Antikörper erkennen einzigartige dreidimensionale Strukturen im Protein, um sie von anderen zu unterscheiden. Durch Konjugieren des Antikörpers mit einem Farbstoff oder Enzym können wir nur das Protein sichtbar machen, das er erkennt. Der Vorgang, Proteine ​​von einem Gel zu einer Membran zu bewegen, die mit Antikörpern untersucht werden kann, wird als Western-Blotting bezeichnet. Um mehr über Western Blotting zu erfahren, können Sie in Kürze unseren entsprechenden Artikel lesen. Unabhängig davon, ob Sie Western-Blotting oder nur unspezifische Färbung verwenden, müssen Sie die Proteine ​​mit dem Geldokumentationssystem visualisieren. Die Art des verwendeten Systems hängt davon ab, ob Sie einen sichtbaren Farbstoff wie Coomassie oder einen fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Farbstoff verwenden, der an einen Antikörper gebunden ist. Wie bei Agarosegel-Dokumentationssystemen können Geldokumentationssysteme für Proteine ​​je nach Anforderung in verschiedenen Spezifikationen vorliegen. Weitere Ratschläge zu Gel-Dokumenten finden Sie in unserem speziellen Artikel.


Kann mir jemand etwas über die Extraktion von DNA aus Polyacrylamidgel sagen? - (16. November 2006)

Hallo zusammen, ich freue mich sehr, diesem Forum beizutreten. Ich bin Student im letzten Jahr und muss einige Experimente mit dem SSR-Indikator (Simple Sequence Repeat) durchführen. Jetzt bereite ich mich darauf vor, einige Gene zu klonen, und ich habe einige Probleme. Es ist die Phase der DNA-Extraktion, aber aus 6% silbergefärbtem Polyacrylamidgel (normalerweise wird in meinem Labor nur aus Agarosegel extrahiert). Ich brauche einige Ratschläge zum Protokoll und zum Unterschied zwischen dem Ethidiumbromid-Färbungs-Polyacrylamidgel und dem Silber-Färbungsgel, das ich beachten muss, bevor ich DNA extrahiere.
Die interessierte Bande ist etwa 300 bp groß und ich muss PCR-Produkte auf Polyacrylamidgel elektrophoretieren, da es viele Banden gibt, deren Größe in der Nähe der von mir benötigten Bande liegt (z. B. 350 bp, 270 bp..). Kann ich zu diesem Zweck das QIAEX II Gel Extraction Kit von QIAgen verwenden? Gibt es außer diesem Kit ein Verfahren, das ich verwenden kann? (Dieses Kit ist zu teuer, wenn es also einen billigeren Weg gibt, ist es besser)
Bitte helft mir, danke für eure Hilfe!!!

Wenn Ihre DNA-Bande schwach war und weniger DNA enthält, die nur durch eine silbergefärbte Bande auf der PAGE erkannt werden kann, können Sie die Bande abschneiden und zur Elution in kochendes Wasser geben und dann zur Reinigung erneut amplifizieren.
wenn Ihre Bande stark ist und durch EB erkannt werden kann, die weniger empfindlich ist als die Silberfärbung. Sie könnten die Anweisungen des QiaexII-Kits befolgen.

Haben Sie jemals Polyacrylamid-Gel-Scheiben in Wasser gekocht, glaube ich nicht, dass die Wiederherstellungs-DNA ausreicht, um die Reamplifikation durchzuführen, da in heißem Wasser das meiste Material in diesen Scheiben denaturiert wird.
Wie kann man Gel mit EB färben oder ist es mit Agarosegel genauso?

Jawohl
Überprüfen Sie, wie die Leute das DD-RT-Band von PAGE-Gel erholen, sie kochen sogar die Gelscheibe 15 Minuten lang, ich habe nur gekochtes Wasser in ein Röhrchen mit geschnittenem Band gegeben.

färben PAGE mit EB ist das gleiche wie Agarosegel, Gel in EB-Lösung geben (es ist besser, den gleichen Puffer für die Elektroporese zu verwenden)
Übrigens ist SBRY green empfindlicher für die DNA-Färbung im PAGE-Gel.

, vielen Dank für Ihre Antworten "Aber meine Gelgröße beträgt ungefähr 33 x 35 cm, daher ist es zu schwierig und unsicher, wenn Sie versuchen, es in EB-Lösung zu färben. Kennen Sie ein anderes Verfahren, bei dem der Gelschnitt in 2% Agarose durchgeführt wird und DNA auf der DEAE-Membran gewonnen wird, die unter den Wells eingebettet ist? Ich habe es gefunden, als ich nach weiteren Informationen suchte, aber ich weiß nicht, wie ich diese Membran kaufen kann.

mini size PAGE sollte für Produkte dieser Größe funktionieren (wie das bei BioRad mini II verwendete Gel)
alternativ könnte Agrose mit niedriger Schmelztemperatur in Betracht gezogen werden

Ich habe vorher darüber nachgedacht und als ich meine Lehrerin gefragt habe, sagte sie, dass die Mini-Größe PAGE nicht geeignet ist, weil die Länge nicht ausreicht, um zwischen dieser Band und einigen anderen Bands zu unterscheiden, die daran herangehen. Ich habe den Elektrophorese-Apparat angedeutet, der für Protein verwendet wird (ca. 10 X 13 cm ?), es wäre einfacher für mich, damit zu arbeiten

10 % nicht denaturierende PAGE mit besserer Auflösung für 300bp DNA um

Du bist ein freundlicher Mann, ich werde mehr über alle deine Ratschläge nachdenken. Hoffentlich werde ich mit meinen Experimenten erfolgreich sein, aber ich denke, dass es noch mehr Probleme geben wird, also werde ich alle unklaren Dinge mit mir posten und freue mich über mehr Hilfe!


Acrylamidgelpräparation - für SDS-PAGE (17. Mai 2007)

Hallo, ich habe einige grundlegende Fragen zur Acrylamidgel-Zubereitung:

1. Ich würde gerne ein 10 ml/50 ml Einwegröhrchen für die Zubereitung der Gellösung verwenden, habe aber Bedenken, dass die Oberfläche zum Entgasen zu klein ist. Muss ich einen Erlenmeyerkolben verwenden?

2. Ich kaufe Acrylamidlösung, aber die Lösung, TEMED und APS scheinen immer noch gefährlich zu sein. Muss ich das Gel in einem Abzug vorbereiten und gießen? Muss ich beim Reinigen der Platten usw. auf Monomere achten und andere Vorsichtsmaßnahmen treffen, die über das Tragen von Handschuhen hinausgehen?

3. Kann ich das polymerisierte Gel im normalen Hausmüll entsorgen oder handelt es sich um Sondermüll?

Wenn es um TEMED oder DTT geht, ja, tun Sie es im Abzug. Und beim Reinigen der Teller natürlich Handschuhe verwenden. Nun, sie behaupteten, dass polymerisiertes Gel überhaupt nichts sein wird. Sie können also grundsätzlich in einen Mülleimer werfen.

Hallo, ich habe einige grundlegende Fragen zur Acrylamidgel-Zubereitung:

1. Ich würde gerne ein 10 ml/50 ml Einwegröhrchen für die Zubereitung der Gellösung verwenden, habe aber Bedenken, dass die Oberfläche zum Entgasen zu klein ist. Muss ich einen Erlenmeyerkolben verwenden?

2. Ich kaufe Acrylamidlösung, aber die Lösung, TEMED und APS scheinen immer noch gefährlich zu sein. Muss ich das Gel in einem Abzug vorbereiten und gießen? Muss ich beim Reinigen der Platten usw. auf Monomere achten und andere Vorsichtsmaßnahmen treffen, die über das Tragen von Handschuhen hinausgehen?

3. Kann ich das polymerisierte Gel im normalen Hausmüll entsorgen oder handelt es sich um Sondermüll?

Normalerweise mache ich es in einem 50-ml-Zentrifugationsröhrchen. Es ist in Ordnung. Sie können die Tube auch mehrmals verwenden. Versuchen Sie, keinen Schaum auf der Oberfläche der Flüssigkeit zu haben, es sei denn, Sie saugen viel unter Vakuum. sehr vorsichtig mischen. Für die meisten Zwecke entgase ich nicht. Ich mische sehr sehr sanft.

Sie können das polymerisierte Gel im normalen Müll entsorgen, aber nur das polymerisierte Gel. Irgendwann polymerisiert das im 50-ml-Röhrchen verbleibende Gel nicht so gut, also gebe ich etwas APS zum Acrylamid, das nach dem Poolen des Gels übrig bleibt, damit es perfekt polymerisiert und ich es wegwerfen kann.

Hallo, ich habe einige grundlegende Fragen zur Acrylamidgel-Zubereitung:

1. Ich würde gerne ein 10 ml/50 ml Einwegröhrchen für die Zubereitung der Gellösung verwenden, habe aber Bedenken, dass die Oberfläche zum Entgasen zu klein ist. Muss ich einen Erlenmeyerkolben verwenden?

2. Ich kaufe Acrylamidlösung, aber die Lösung, TEMED und APS scheinen immer noch gefährlich zu sein. Muss ich das Gel in einem Abzug vorbereiten und gießen? Muss ich beim Reinigen der Platten usw. auf Monomere achten und andere Vorsichtsmaßnahmen treffen, die über das Tragen von Handschuhen hinausgehen?

3. Kann ich das polymerisierte Gel im normalen Hausmüll entsorgen oder handelt es sich um Sondermüll?

Hier einige Anregungen aus meiner Erfahrung

Ich bevorzuge es, die Gellösung zu entgasen (auflösen), um die Bandenauflösung zu verbessern (denken Sie daran, dass viele andere Faktoren die Auflösung beeinflussen, wie die Probenvorbereitung, und dies ist nur einer, aber wichtig). Nur vor Zugabe von SDS entgasen, um eine intensive Schaumbildung zu vermeiden. Machen Sie sich keine Sorgen um 10-50ml-Röhren - ich entgase normalerweise in diesen Röhrchen. Für eine schnelle Entgasung den Magnetrührer in Lösung bringen, da die Viskosität variiert, abhängig von % Acrylamid in der Arbeitslösung und die Entgasungsrate verringert. Ich empfehle Ihnen nur nicht, Arbeitslösungen zu entgasen, wenn Sie Gradientengele herstellen. Da eine der Mischlösungen normalerweise einen hohen Prozentsatz an Acrylamid (nahe 20%) enthält und wenn Sie Luftblasen entfernen, entfernen Sie den Sauerstoff des Hauptpolymerisationsinhibitors und die Polymerisationsrate, und die Mischkammer kann verstopfen (vor einigen Jahren hatte ich dieses Problem).

Bezüglich des Kaufs von Acrylamidlösung. Ich bereite am liebsten jeden Monat frische Brühe aus festem Acrylamid zu. Denn während der Lagerung der Acrylamidlösung steigt die Acrylsäurekonzentration. Es verringert auch die Auflösung Ihres PAAG. Sie können dieses Problem jedoch lösen, indem Sie Ihre Acrylamidlösung mit Amberlite MB 150 Harz (Supelco oder analog bei Merck oder Fluka) inkubieren. Lagern Sie Ihren Vorrat mit diesem Harz (der Boden der Vorratsflasche bedeckt) in einer dunklen Flasche bei 4 ° C.

Bezüglich gefährlich von APS . Machen Sie sich darüber keine Sorgen (APS) und arbeiten Sie im Labor ohne Haube. Über Temed - es ist nur ein Amin mit starkem Geruch und lassen Sie es daher nur nach der Verwendung offen (aliquotieren Sie es in Eppendorf-Röhrchen unter der Haube, wenn Sie eine 1-Liter-Flasche kaufen und dann bei 4 ° C aufbewahren und einfach arbeiten).

VIEL GLÜCK! und mach dir keine Sorgen darüber!

Danke für die Vorschläge an alle, das ist hilfreich. Ich werde heute mein erstes SDS-PAGE-Gel ausprobieren.


Wie sieht das physikalische Erscheinungsbild von CHAPS-Waschmittel aus?

Dieses Biodetergens wird als weißes kristallines Pulver geliefert.

Wie hoch ist die kritische Micellenkonzentration (CMC) des CHAPS-Detergens?

Der CMC-Wert beträgt 6-10 mM. Waschmittel mit hohen CMC-Werten sind in der Regel leicht durch Verdünnung zu entfernen Waschmittel mit niedrigen CMC-Werten sind für Trennungen nach Molekulargewicht vorteilhaft. Als allgemeine Regel sollten Detergenzien mit ihrer CMC und einem Detergens-zu-Protein-Gewichtsverhältnis von ungefähr zehn verwendet werden.

Wie lautet die Aggregationszahl in 0-0,1 M Na+?

Die Aggregationsnummer auf dieser Ebene ist 4-14.

Was ist die Übergangstemperatur?

Der Trübungspunkt ist größer als 100°C

Was ist die DC von CHAPS (Kieselgel: Methanol/NH4OH = 95/5)?

Ist CHAPS-Waschmittel wasserlöslich?

Ja, dieses Waschmittel löst sich in Wasser klar und farblos bis leicht gelblich auf. Die Löslichkeit beträgt 50 mg/ml bei 20 °C. Bei der Herstellung von CHAPS-Lösungen ist es vorzuziehen, das Schütteln und Rühren von Mischungen zu vermeiden.

Wie kann ich eine CHAPS 10%-Lösung herstellen?

Für eine 10%ige Lösung (d. h. 1 g CHAPS-Feststoff in Becherglas, gefolgt von 9 g Wasser), bedecken Sie das Becherglas mit einem Uhrglas und lassen Sie es 30-60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Auf diese Weise können Lösungen bis zu 1 M (60%) hergestellt werden.

Wie stabil ist dieses Waschmittel?

CHAPS Biodetergent ist feuchtigkeitsempfindlich und hygroskopisch.

Kann CHAPS-Detergens durch Dialyse aus Proben entfernt werden?

Ja, das geringe mizellare Molekulargewicht dieses Detergens und die hohe kritische Micellenkonzentration (6-10 mM) ermöglichen die Entfernung aus Proben durch Dialyse.

Was ist der Unterschied zwischen CHAPS- und CHAPSO-Waschmitteln?

Ein verwandtes Detergens namens CHAPSO hat die gleiche chemische Grundstruktur mit einer zusätzlichen funktionellen Hydroxylgruppe.

Beide Detergenzien haben eine geringe Lichtabsorption im ultravioletten Bereich des elektromagnetischen Spektrums, was für Labormitarbeiter nützlich ist, die laufende chemische Reaktionen oder Protein-Protein-Bindung mit UV/Vis-Spektroskopie überwachen.

Welche CHAPS-Konzentration wird zur Herstellung von IEF-Gel verwendet?

Konzentrationen zwischen 2-4 % werden typischerweise in einem IEF-Gel verwendet. CHAPS is commonly used for non-denaturing IEF (without urea) and has been shown to give excellent resolution of some subcellular preparations and plant proteins.

What is the difference between CHAPS and Triton X100?

Triton X100 is non-ionic. It has both hydrophilic and hydrophobic regions, but no net charges. CHAPS detergent is zwitterionic. It has hydrophobic regions but also a head group with a negative charge (in normal saline). In addition, Triton X100 forms large (greater than 90,000 MW) aggregates when concentration rises above 0.25 mM. CHAPS on the other hand forms smaller aggregates (6,000 MW) when concentration rises above 10 mM.


FAQ: Why are there extra bands visible on polyacrylamide gels?

For the 100bp DNA Ladder, the 500 and 517bp fragments, which run as a close doublet on agarose, separate very clearly on acrylamide, with the 517bp band running around midway between the 500 and 600bp fragments. This &ldquoanomalous&rdquo migration is an inherent characteristic of acrylamide gel electrophoresis and does not indicate any error in the stated size of the DNA fragments in our ladder.

For the 50bp DNA Ladder and the Low Molecular Weight Ladder, two or more of the bands comprising the 200bp reference band tend to run differently, resulting in one or more extra bands detectable around the 200bp range. As with the 100bp DNA Ladder, this is attributed more to the limitations of acrylamide gel technology than to a problem with the ladder composition. As defined in most molecular biology lab manuals (Maniatis&rsquo Cold Springs Harbor Molecular Cloning Manual, 2nd edition) and as acknowledged by the manufacturers of acrylamide gels, applications requiring precise sizing of DNA fragments should be performed using agarose gels whenever possible.


SDS-PAGE "Hall of Shame"

You may very well have prepared a nearly perfect gel, and would have a difficult time improving upon the product. If that is so, then by all means gloat about it! If you didn't do such a hot job don't despair. All good scientists learn from their mistakes, in fact, without making mistakes most of us wouldn't learn much at all!

The "Hall of Shame" presents examples of some of the worst gels students (and instructor) have run in past labs, with an example or two from a research lab. They represent many of the ways one can mess up a gel (but not all of them - we're still finding new ways!). See what features of your own gel(s) were unsatisfactory - or at least less than perfect - and use the illustrations to figure out what you might do to improve your technique.


Produktbeschreibung

GelRed® is an ultra sensitive, extremely stable and environmentally safe fluorescent nucleic acid dye designed to replace the highly toxic ethidium bromide (EtBr) for staining dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels or polyacrylamide gels.

  • Safer than EtBr: non-mutagenic and non-hazardous for disposal
  • Much more sensitive than EtBr and SYBR® Safe
  • Stable at room temperature and microwavable
  • Simple precast or post-electrophoresis gel staining, no destaining
  • Replaces EtBr with no change to equipment or optical settings
  • Compatible with downstream gel purification, restriction digest, sequencing, and cloning

GelRed®: A Superior Alternative to EtBr

GelRed® is much more sensitive than EtBr, and can be used to stain dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels via either precast or post gel staining without destaining. GelRed® can also be used to stain polyacrylamide gels via post gel staining. GelRed® is also compatible with downstream DNA manipulations such as restriction digest, sequencing, and cloning. GelRed® and EtBr have virtually the same spectra, so you can directly replace EtBr with GelRed® without changing your existing imaging system. For detailed protocols for use, please download the GelRed® Product Information Sheet. Also see our GelRed® and GelGreen® Frequently Asked Questions (FAQs).

Non-Mutagenic and Safer for the Environment

A series of safety tests have confirmed that GelRed® is noncytotoxic, nonmutagenic and nonhazardous at concentrations well above the working concentrations used in gel staining. As a result, working strength GelRed® can be safely disposed of down the drain or in regular trash, providing convenience and reducing cost in waste disposal. For detailed test results, you may download the GelRed®/GelGreen® Safety Report.

How Safe is Your Gel Stain?

Many so-called “safe” DNA dyes like SYBR® Safe, Midori Green, GreenSafe, SafeView™, and RedSafe™ not only have low sensitivity, but also readily penetrate living cells to bind DNA, and some are cytotoxic. Unlike these dyes, GelRed® is cell membrane-impermeant, so it cannot enter living cells to interact with their DNA. See our Gel Stains Comparison Flyer or Gel Stains Comparison White Paper for details.

Choose the Right Stain for Your Application

GelRed® 3X in water (catalog no. 41001) is ready-to-use for post-electrophoresis gel staining, and is supplied in a 4L Cubitainer®. Biotium also offers GelRed® 10,000X in water (catalog no. 41003) and GelRed® 10,000X in DMSO (catalog no. 41002). GelRed® in water is a newer, safer formulation and our recommended format. We continue to offer GelRed® in DMSO for established users who do not wish to alter their protocols. We also offer GelRed® Agarose and GelRed® Prestain Plus 6X Loading Dye.

Also see GelGreen® Nucleic Acid Gel Stain, a safer replacement for SYBR® gel stains, which is compatible with visible light excitation.


Schau das Video: Chromatographie - Die Theorie (Kann 2022).