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Enzyme, die aus unterschiedlichem Gewebe extrahiert wurden, können unter den gleichen Bedingungen unterschiedliche $K_m$-Werte haben?

Enzyme, die aus unterschiedlichem Gewebe extrahiert wurden, können unter den gleichen Bedingungen unterschiedliche $K_m$-Werte haben?


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Mein Laborteam wurde eingesetzt Succinat-Dehydrogenase (1.3.5.1) von Gallus gallus domesticus Brust (der fleischigste Teil des Huhns, wo Sie Nuggets erhalten) zu bestimmen $K_{m}$ und $V_{max}$ unter 3 Linearisierungsmethoden.

Aber auf der BRENDA-Seite habe ich verschiedene Werte für viele Organismen gefunden, wie zum Beispiel Bos Stier, und sie wählen andere Gewebe wie Lebergewebe aus.

Warum der Unterschied?

PD. Jeder Hinweis, wo diese Werte zu finden sind Gallus gallus mesticus wird sehr geschätzt.

BEARBEITEN: Die Reaktion besteht aus der Dehydrierung von Succinat zu Fumarat im Tricarborxilsäure-Zyklus. Schließen Sie die Schaffung einer trans-Doppelbindung ein.

Um meine Laborpraxis zu beschreiben, mazerieren wir das Fleisch mit Glassand und teilen diese Mischung in 2 Sorten auf: eine mit Methylenblau und Trichloressigsäure (TCA) und eine ohne TCA. Jetzt weiß ich, dass TCA ein Protein-Fällungsmittel ist und Methylenblau ein Indikator ist; je weniger blau, desto weniger Succinat. Mit Absorptionstests können wir also aufklären [Succinat] vs. Zeitdiagramm, und approximieren Sie das Verhältnis $V_{max}/K_m$ aus der Michaelschen Gleichung für den Abfall der Substratkonzentration: $$S(t)=S_0 e^{-frac{V_{max}}{K_m}t}$$ Außerdem denke ich, dass es möglich sein wird, die Momentangeschwindigkeit mit seinem Derivat zu modellieren und die Linearisierungsdiagramme zu erstellen, aber ich bin mir nicht sehr sicher.

EDIT2: Danke für die Hilfe mit meinem Praxisbericht (ich weiß es wirklich zu schätzen), aber ich möchte trotzdem wissen, ob es möglich ist, anders zu sein $K_m$ Werte auf demselben Enzym, nur das Gewebe für die Reaktion verändert.


Sie würden nicht erwarten, dass das gleiche Enzym aus verschiedenen Geweben unterschiedliche Km-Werte hat, wenn die Enzyme wirklich identisch sind.

Außerdem würden Sie nicht erwarten, dass sich der Km-Wert während der Reinigung ändert: Die Michaelis-Konstante für das gereinigte Enzym sollte derjenigen entsprechen, die mit einer Rohprobe bestimmt wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, kann dies bedeuten, dass das Enzym während der Reinigung modifiziert wurde, möglicherweise durch Proteolyse (was Sie nicht möchten, dass Ihr Untersucher darauf hinweist oder vorschlägt!).

Ein Vorteil der Michaelis-Konstante besteht darin, dass sie unabhängig von der Enzymkonzentration (und damit unabhängig vom Reinheitsgrad) ist.

Trotzdem denke ich, dass es nicht allzu ungewöhnlich ist, dass Enzyme, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden, unterschiedliche Km-Werte aufweisen.

Mögliche Gründe sind:

  • Die Testbedingungen sind nicht wirklich die gleichen. pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur und Pufferzusammensetzung können alle Km beeinflussen. Die Michaelis-Konstante bestimmt bei pH 7 in 100 mM Phosphat bei 37ÖC kann stark von der in 50 mM Tris pH 7 und 25 . bestimmten abweichenÖC
  • Die Modifikation nach der Übersetzung kann wichtig sein. Das Enzym aus einem Gewebe kann beispielsweise phosphoryliert sein. Ein Labor kann die modifizierten Stoffe isoliert haben, während ein anderes Labor routinemäßig Phosphatase-Inhibitoren einschließen kann.
  • In der rohen Gewebepräparation vorhandene Proteasen können das Enzym modifiziert haben.

Im Fall der Succinat-Dehydrogenase gibt es zwei weitere wichtige Überlegungen.

  • Succinatdehydrogenase ist ein membrangebundenes Enzym (das ein kovalent gebundenes Flavin enthält) und die Extraktionsmethode wird von entscheidender Bedeutung sein, und ein Schlüsselbereich ist zu untersuchen, ob Extraktionsbedingungen für den Unterschied in Km verantwortlich sind.
  • Schließlich, und das ist wichtig, denke ich. SDH ist ein Zwei-Substrat-Enzym und der Km für Substrat A hängt von der Konzentration des Substrats B . ab ! Um die „wahre“ Michaelis-Konstante für ein Zwei-Substrat-Enzym zu bestimmen (keine Substrathemmung vorausgesetzt), müssen wir auf „unendliche“ Konzentrationen des Co-Substrats extrapolieren. Ansonsten haben wir es zu tun ersichtlich km-Werte.

Ich wette, der letzte Punkt ist wichtig. Ist das Problem, dass zumindest einige der gemeldeten Kms sind? ersichtlich Werte, dh die Konzentration des Co-Substrats ist unter den verschiedenen Versuchsbedingungen unterschiedlich?


Enzymassays

Spektroskopische Methoden

Absorptionsspektroskopie. Für einige Enzymassays ist es möglich, den Reaktanten oder das Produkt direkt basierend auf seinen Absorptionseigenschaften zu messen Fersht (1999) . Bei der durch Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) katalysierten Reaktion absorbiert ein Produkt (NADH) Licht bei 340 nm, wodurch es möglich ist, die Reaktion durch Verfolgen des Absorptionsanstiegs bei dieser Wellenlänge zu verfolgen.

Glucose-6-phosphat + NAD + → 6-Phosphogluconat + NADH + H +

In anderen Fällen wird ein Edukt oder Produkt indirekt gemessen. Bei der Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) wird beispielsweise Acetylthiocholin als Substrat verwendet, das bei Einwirkung des Enzyms Thiocholin freisetzt. Das Thiocholin reagiert mit dem Reagenz von Ellman zu einem farbigen Produkt, das es ermöglicht, die Reaktion durch Verfolgen des Absorptionsanstiegs zu verfolgen.

Acetylthiocholin + H2O → Acetat + H + + Thiocholin

Thiocholin + Ellman's Reagenz → farbiges Derivat

Gekoppelte Assays werden manchmal verwendet, um die Enzymaktivität zu überwachen. In diesem Fall wird die interessierende enzymatische Reaktion mit einer zweiten Reaktion gepaart, die für eine bequeme Messung gekoppelt ist. Ein Beispiel hierfür ist der Assay für Hexokinase (EC 2.7.1.1). In diesem Fall wird ein Überschuss an Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und NAD + in das Assay-Gemisch aufgenommen und die Extinktion bei 340 nm überwacht.

Reaktion I: Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat + ADP

Reaktion II: Glucose-6-phosphat + NAD + → 6-Phosphogluconat + NADH + H +

In diesem Beispiel sollte Reaktion I geschwindigkeitsbestimmend sein und die Konzentration von Glucose-6-phosphat sollte nach einer Verzögerungszeit einen stationären Zustand erreichen. Cleland Cleland (1979) formulierte ein Verfahren, um sicherzustellen, dass der gekoppelte Assay eine genaue Messung der Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms liefert. Wenn möglich ist es bevorzugt, eine Reaktion kontinuierlich zu überwachen. Mit den oben beschriebenen Assays kann das Spektrophotometer so programmiert werden, dass es eine kontinuierliche Anzeige als Funktion der Zeit liefert. Bei Trenntechniken, die die Verwendung von Radioaktivität, Elektrophorese oder Chromatographie umfassen können, werden diskontinuierliche oder Endpunktassays verwendet. Nachdem ein linearer Zeitraum für einen Assay festgelegt wurde, wird ein Parameter zu einem einzigen Zeitpunkt innerhalb des linearen Zeitraums gemessen (am bevorzugtesten ein Zeitpunkt nahe der Mitte der linearen Phase). Die Geschwindigkeit wird dann aus der Signaldifferenz zu diesem Zeitpunkt und zu Beginn der Reaktion bestimmt. Bei Endpunkt-Assays ist Vorsicht geboten und Zeitverläufe sollten überprüft werden, um die Linearität zu bestätigen. Änderungen der Inkubationsbedingungen, wie Temperatur, pH oder Substratkonzentration, können die Linearität eines Assays verändern. Für routinemäßige Enzymassays enthält das Reaktionsgefäß alle Komponenten bis auf eine, und die Reaktion wird durch Zugabe der fehlenden Komponente (das Enzym oder eines der Substrate) gestartet. Die anderen Komponenten sollten hinsichtlich pH, ​​Temperatur und Ionenstärke äquilibriert sein. Die Reaktion wird üblicherweise durch Zugabe eines kleinen Volumens einer konzentrierten Stammlösung der fehlenden Komponente gestartet. Ein kleines Volumen stellt sicher, dass diese Zugabe die bereits eingestellten Gleichgewichtsbedingungen nicht stört. Wenn es nicht möglich ist, eine kleine Komponente zuzugeben, sollten die getrennten Komponenten die gleiche Temperatur, Ionenstärke und den gleichen pH-Wert haben. Obwohl die beiden Komponenten vollständig vermischt werden müssen, sollte starkes Schütteln vermieden werden, da dies denaturieren kann Enzymprotein. Das Mischen kann durch Umdrehen eines Röhrchens mit angebrachtem Stopfen oder einer Küvette unter Verwendung einer Parafilm-Versiegelung erfolgen. Verdünnte Proteine ​​sind oft weniger stabil als konzentriertere, und Tests werden oft in Gegenwart eines inerten Proteins wie Rinderserumalbumin (0,25 mg/ml) durchgeführt, um das gereinigte Enzym zu stabilisieren. Es sollten Experimente durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Protein inert ist. Da Albumin beispielsweise an hydrophobe Substrate binden kann, ist es für diesen Zweck möglicherweise nicht immer geeignet. Für diskontinuierliche Assays kann der Timer eingestellt und die Proben in bestimmten Zeitintervallen nach dem Mischen angesaugt werden. Bei den meisten Spektralfotometern wird die Erkennung manuell über ein Instrumentenbrett oder eine Computertastatur eingeleitet. Um einer Küvette eine Komponente hinzuzufügen, dauert es etwa 20 Sekunden, die Küvette in ein Spektralphotometer zu stellen und die Detektion durch Drücken einer Computertaste zu starten. Diese Zeit ist normalerweise nicht von großer Bedeutung, da der Assay für die meisten Reaktionen 10 bis 30 Minuten dauert. Kontrollmessungen umfassen einen nicht-enzymhaltigen Leerwert und einen nicht-substrathaltigen Leerwert. Solche Kontrollen stellen sicher, dass keine zufälligen Reaktionen auftreten. Die Kontrollrate (ohne Enzymleerwert) wird von dem durch das Experiment generierten Datum subtrahiert, um die tatsächliche Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion bereitzustellen. Für viele Assays ist es notwendig, die Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt abzuschrecken oder zu stoppen, um eine weitere Produktproduktion zu verhindern. Zum Beispiel können Proben in 5-Minuten-Intervallen über einen vorbestimmten Zeitraum entnommen und das Produkt durch HPLC gemessen werden.

Jede chromatographische Analyse kann 30 Minuten dauern. Verfahren zum Beenden der Reaktion beinhalten gewöhnlich die Denaturierung des Enzyms durch Zugabe von Säure oder das Eintauchen in ein siedendes Wasserbad. Die Aktivität einiger Metalloenzyme kann mit EDTA oder einem anderen Metallionenchelator gequencht werden. Die meisten Enzymassays basieren auf spektroskopischen Techniken, wobei die beiden am häufigsten verwendeten sind Absorption und Fluoreszenz Fersht (1999) . Die zur Verfolgung der Reaktionsgeschwindigkeit verwendete Wellenlänge sollte diejenige sein, die den größten Unterschied in der Absorption zwischen dem Substrat und dem Produkt ergibt. Absorptionsmessungen werden mit einem Standard-Spektrophotometer durchgeführt, wobei die Proben in spezialisierten Zellen oder Küvetten enthalten sind. Im Handel sind Einwegküvetten aus Kunststoff für 1 oder 3 ml Proben erhältlich. Ihr Einsatz ist auf den sichtbaren Wellenlängenbereich (350-800 nm) beschränkt. Für Messungen bei Wellenlängen kleiner 350 nm müssen Quarzküvetten verwendet werden (Glas und Kunststoff absorbieren Licht im UV-Bereich). Die Schichtdicken für Küvetten werden vom Hersteller angegeben. Beliebte Pfadlängen sind 1,00 cm, 0,40 cm und 0,20 cm. Immer mehr Assays werden mit 96-Well-Mikrotiterplatten mit Kunststoff- oder Quarzboden durchgeführt. Die Konzentration einer Substanz, die Licht bei bestimmten Wellenlängen absorbiert, kann aus dem Beerschen Gesetz bestimmt werden:

wobei A die Extinktion der Probe bei einer bestimmten Wellenlänge ist, c die Konzentration der Probe ist, l die Weglänge ist und ε der Extinktionskoeffizient oder das molare Absorptionsvermögen ist. ε hat die Einheiten M –1 cm –1 oder mM –1 cm –1 . Wenn der Wert von ε für eine bestimmte Substanz bekannt ist, ist es möglich, die Konzentration dieser Substanz in einer Lösung zu berechnen, indem ihre Absorption in dieser Lösung gemessen wird. Mit dem Beerschen Gesetz lässt sich die Geschwindigkeit der Konzentrationsänderung im Verlauf einer Reaktion berechnen. Ein potenzieller Fehler bei Absorptionsmessungen resultiert aus einer Abweichung vom Beerschen Gesetz, da es nur für einen endlichen Bereich von Absorptionswerten gilt. Da es bei Absorptionen von mehr als 1 möglicherweise nicht anwendbar ist, sollten Assays daher so gestaltet werden, dass experimentelle Werte darunter gehalten werden. Einige dieser Probleme lassen sich möglicherweise umgehen, indem Küvetten mit kürzeren Weglängen verwendet werden. Eine Probe mit einer Extinktion von 1,00 in einer Küvette mit einer Weglänge von 1,00 cm hat eine Extinktion von 0,20 in einer Küvette mit einer Weglänge von 0,20 cm. Im Allgemeinen stellt das Arbeiten mit einer Extinktion von etwa 0,5 einen Kompromiss dar zwischen der Minimierung des optischen Rauschens, das einem Spektralfotometer inhärent ist, und einem vernünftigen Messsignal. Die Trübung in einer Lösung kann Licht streuen und eine scheinbare Absorption erzeugen. Filtration oder Zentrifugation können verwendet werden, um diese Partikel zu entfernen. Obwohl Änderungen der Weglänge einige Abweichungen von der Linearität umgehen (d. h. wenn die Extinktion so hoch ist, dass das Spektrophotometer keine genaue Messung durchführen kann), sind die Abweichungen häufig auf intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den absorbierenden Spezies zurückzuführen. Dimerisierung (oder Bildung von Eximeren höherer Ordnung) tritt bei höheren Konzentrationen der absorbierenden Spezies auf. In diesen Fällen wird das Biergesetz befolgt, wenn die Konzentration des Produkts verringert wird. Dies kann entweder durch eine Verlangsamung der Reaktion (durch Verringerung der Enzymkonzentration) oder durch Messungen über einen kürzeren Zeitraum (bevor Abweichungen vom Beerschen Gesetz auftreten) erreicht werden.


Hintergrund

Thymidylat (dTMP) ist ein wesentlicher Baustein der DNA und wird durch den Salvage- und den De-novo-Weg synthetisiert (Abb. 1). Im Salvage-Weg wird dTMP durch Thymidin (dT)-Phosphorylierung, katalysiert durch Thymidinkinasen (TK1 und TK2) und im de novo-Weg durch Desoxyuridylat (dUMP)-Methylierung, katalysiert durch Thymidylatsynthase (TS) produziert. TK1 ist ein zytosolisches Enzym, das hauptsächlich in proliferierenden Geweben exprimiert wird [1, 2]. Mitochondriale TK2 hingegen wird konstitutiv exprimiert [3, 4]. Die Bestimmung der TK1- und TK2-Aktivität in Gewebe- oder Zellextrakten ist aufgrund der überlappenden Substratspezifität beider Enzyme kompliziert [5,6,7]. Cytosolische Desoxycytidin-Kinase (dCK), die hauptsächlich in lymphoiden Geweben exprimiert wird, katalysiert die Phosphorylierung von Desoxycytidin (dC) zu dCMP, das weiter zu dCTP phosphoryliert oder zu dUMP desaminiert und für die dTMP-Synthese verwendet werden kann (Abb. 1) [8, 9] . In postmitotischen Geweben ist die Aktivität der Ribonukleotidreduktase (RNR) minimal, da die Expression der kleinen Untereinheit S-phasenspezifisch ist [10, 11]. Die Anwesenheit einer p53-induzierbaren kleinen RNR-Untereinheit (p53R2) ermöglicht es dem de novo-Weg jedoch, dNTPs auch für nicht-zyklische Zellen bereitzustellen [12]. Darüber hinaus ist die TS-Aktivität eine Voraussetzung für die de novo-Synthese von dTMP. Bei Nagetieren werden sowohl die TK1- als auch die TS-Aktivität entwicklungsbedingt herunterreguliert und innerhalb von 2 Wochen nach der Geburt auf ein Minimum reduziert [13, 14]. Unseres Wissens wurden die Konzentrationen von TS und p53R2 und die Verteilung von zytosolischen Desoxynukleosid-Kinasen in adulten tierischen Geweben nicht berichtet.

Schematische Darstellung der dTMP-Synthesewege. TK1

Ein Mangel an TK2 oder p53R2 führt beim Menschen zu einer tödlichen Myopathie und/oder Enzephalomyopathie [15, 16]. Gewebespezifische mtDNA-Depletion wurde auch bei TK2 H126N-Knock-in- und TK2-Knock-out-Mäusen sowie bei p53R2-Knock-out-Mäusen beobachtet [16,17,18]. Defekte im Nukleotidstoffwechsel wurden auch mit der Instabilität des Kerngenoms und vorzeitiger Alterung in Verbindung gebracht [19,20,21].

Um zu verstehen, warum ein TK2- und p53R2-Mangel zu mtDNA-Depletionssyndromen (MDS) führte, untersuchten wir die Konzentrationen und die Verteilung von Enzymen bei der dTMP-Synthese in den wichtigsten Geweben der erwachsenen Ratte. Neben der mitochondrialen TK2 wurde eine zytosolische Isoform von TK2 partiell gereinigt und charakterisiert. Die TS-Aktivität und die Spiegel des TS-Proteins sowie die Spiegel des p53R2-Proteins wurden bestimmt.


Ergebnisse

Wir stellten das menschliche Stoffwechselnetzwerk als gerichteten Reaktionsgraphen dar, wobei Knoten enzymatische Reaktionen darstellen und folglich mit den Genen assoziiert sind, die für die Enzyme kodieren, die diese Reaktion ausführen (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1 und Zusatzdatei 2: Tabelle S1) . Knoten sind durch gemeinsame Metaboliten verbunden: Wenn das Produkt einer enzymatischen Reaktion das Substrat einer anderen ist, wird eine gerichtete Verbindung zwischen den Knoten erzeugt, die die Reaktionen repräsentieren. Die Anzahl der Verbindungen oder Links einer enzymatischen Reaktion wird unterteilt in: eingehende Links (in-Grad), die die Anzahl der Reaktionen darstellen, die die Metaboliten produzieren, die unsere Reaktion als Substrate akzeptiert, und ausgehende Links (out-degree), die die Zahl darstellen von Reaktionen, die die Produkte unserer Reaktion als Substrate verwenden. Diese Reaktionsgraphen-Darstellung wurde auf zwei Datensätze angewendet: auf die neueste Netzwerkrekonstruktion des menschlichen Stoffwechsels auf genomischer Ebene, Recon3D [16], und auf einzelne Stoffwechselwege aus der HumanCyc Pathway/Genom-Datenbank [5, 17]. Die Wahl dieser beiden Quellen wurde durch das Problem motiviert, einen Stoffwechselweg und seine Grenzen zu definieren. Ein großräumiges Netzwerk wird es uns ermöglichen, globale Muster abzuleiten und Crosstalk-Effekte zwischen biologischen Prozessen zu berücksichtigen, mit dem Nachteil, dass die Wechselwirkungen weniger zuverlässig sein können, da beträchtliche Informationen rechnergesteuert und für die metabolische Modellierung konform waren. Daher werden metabolische Reaktionen ohne genetischen Nachweis, aber mit physiologischem Nachweis oder für die Modellierung erforderlich, mit unterschiedlichen Konfidenzwerten eingeschlossen [18]. Auf der anderen Seite könnte uns der Vergleich von Hunderten von kleinen Netzwerken ermöglichen, lokale gemeinsame Muster mit einer einfacheren biologischen Interpretation aufzudecken. Eine in der vorliegenden Studie nicht behandelte Dimension sind die Unterschiede aufgrund der gewebespezifischen Expression oder eines bestimmten Entwicklungsstadiums. Da wir ein allgemeines Stoffwechselmodell und kein zellspezifisches Modell verwenden, wird die Dynamik des Systems hier nicht berücksichtigt, auch wenn bekannt ist, dass Gene, die Enzyme mit hohem Stoffwechselfluss kodieren, in ihrer Evolution stärker eingeschränkt waren [19 ]. Unser Ansatz zeigt die gesamten, geschichteten Effekte von Selektionskräften, die möglicherweise zu unterschiedlichen Zeiten oder Geweben wirken. Aus diesem Grund ist es nicht in der Lage, gewebe- oder entwicklungsstadienspezifische Evolutionsmuster aufzudecken und kann die Interpretation der Ergebnisse und die Identifizierung der spezifischen biologischen Funktion bei der Selektion erschweren.

Die reinigende Selektion bei Säugetieren ist in stark verbundenen Knoten stärker

Die Stärke der reinigenden Selektion im globalen metabolischen Netzwerk wurde als Verhältnis zwischen der Rate der nicht-synonymen Substitutionen (dN) und der Rate der synonymen Substitutionen (dS) gemessen, wobei niedrigere Werte von dN/dS eine stärkere reinigende Selektion anzeigen. Die meisten enzymkodierenden Gene haben einen dN/dS-Wert von weniger als 0,5, was auf die weit verbreitete Wirkung der reinigenden Selektion in metabolischen Genen hinweist (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Der mögliche Effekt verfälschender genomischer Variablen wurde berücksichtigt (siehe Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3), indem eine lineare Regression auf die evolutionären Schätzungen angewendet wurde, die die Länge der Protein-kodierenden Sequenz (CDS), den GC-Gehalt und den Codon-Bias kontrollieren, und die Residuen verwendet Werte statt der Originalwerte.Nachdem wir den Effekt der Störvariablen entfernt haben, stellen wir fest, dass die reinigende Selektion in Knoten mit mehr Verbindungen stärker ist (Abb. 1 und Zusätzliche Datei 1: Abbildung S4a). Interessanterweise sind Knoten mit extrem hohem Out-Grad aufgrund abnehmender Werte von dS weniger eingeschränkt (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S4b-c). Ähnlich wie bei einzelnen Stoffwechselwegen [5] werden Gene, die für Enzyme kodieren, die die ersten Schritte im Stoffwechselnetzwerk katalysieren, einer schwächeren reinigenden Selektion unterzogen als solche, die Reaktionen in Zwischen- und Endschritten katalysieren (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S5a).

Stärke der reinigenden Selektion bei Säugetieren im Vergleich zur Genkonnektivität im menschlichen Stoffwechselnetzwerk. Die Knoten wurden unter Verwendung des 25., 50. und 75. Perzentils unterteilt und der Mittelwert ± Standardfehler der Residuen einer linearen Regression von dN/dS kontrolliert für genomische Variablen (CDS-Länge, Codon-Bias und GC-Gehalt) wird für jede Gruppe aufgetragen. Globale Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Kruskal-Wallis-Rangsummentest bewertet. Hochgradig verbundene Gene unterliegen einer stärkeren reinigenden Selektion

Die Knotenkonnektivität beeinflusst die Wirkung der positiven Selektion

Im globalen metabolischen Netzwerk fanden wir 67 Gene (3,79% der metabolischen Gene) unter positiver Selektion bei Säugetieren, indem wir das Standortmodell M8 in PAML (M7/M8) anwandten, um Selektionsereignisse in einer der Linien zu erkennen. Durch Anwendung des Branch-Site-Tests der positiven Selektion (Test 2 in PAML) haben wir neun Gene (0,51%) unter positiver Selektion in der menschlichen Abstammungslinie nachgewiesen (siehe Zusatzdatei 2: Tabelle S2). Gene unter positiver Selektion bei Säugetieren zeigen eine andere Konnektivität als der Rest der metabolischen Gene: Sie kodieren Enzyme mit geringer Konnektivität, sowohl mit niedrigerem In- als auch Out-Grad als die metabolischen Gene ohne Anzeichen einer positiven Selektion (Tabelle 1). In ähnlicher Weise zeigen nur in der menschlichen Abstammungslinie ausgewählte Gene einen niedrigeren Out-Grad als die neutralen Gene. Auch basierend auf ihrer Konnektivität haben wir die Position der Knoten innerhalb des Netzwerks klassifiziert: Gene unter positiver Selektion bei Säugetieren werden bevorzugt an Spitzenpositionen (in-Grad = 0) gefunden (Pearson’s Chi-Quadrat-Test, Χ 2 = 1200, P-Wert = 0,0005 Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5d). Somit hat die langfristige positive Selektion bevorzugt auf schlecht verbundene oder periphere Gene gewirkt, die mit den ersten Schritten von Stoffwechselprozessen assoziiert sind.

Um kürzlich positive Selektion in menschlichen Populationen zu erkennen, haben wir das Hierarchical Boosting (HB) [20] verwendet, um Gene unter vollständigen (Complete HB) und unvollständigen selektiven Sweeps (Incomplete HB) zu erkennen. In menschlichen Populationen fanden wir unter den 1769 Genen, die Enzyme im globalen metabolischen Netzwerk kodieren, bei positiver Selektion bei Europäern (CEU) 13 Gene mit einem vollständigen selektiven Sweep (0,73 % der metabolischen Gene) und 19 Gene mit einem unvollständigen Sweep (1,07 .). %), und bei Asiaten (CHB) 22 Gene mit vollständigem (1,24 %) und 15 Gene mit unvollständigem selektivem Sweep (0,85 %) (siehe Zusatzdatei 2: Tabelle S2). In metabolischen Genen in der afrikanischen Bevölkerung südlich der Sahara (YRI) wurde kein Signal für eine positive Selektion gefunden, dies ist jedoch angesichts der geringen Anzahl von Signalen zu erwarten, die durch das Hierarchical Boosting in YRI detektiert werden [20]. Metabolische Gene unter positiver Selektion beim Menschen (sowohl in CEU als auch in CHB) zeigen eine andere Konnektivität als die übrigen enzymkodierenden Gene (Tabelle 1). Gene unter einem vollständigen selektiven Sweep kodieren für schlecht verbundene Enzyme, mit sowohl einem niedrigeren In- als auch Out-Grad als der Rest der metabolischen Gene. Gene unter einem unvollständigen selektiven Sweep zeigen jedoch ein anderes Konnektivitätsmuster: Obwohl sie immer noch für Enzyme mit niedrigerem In-Grad kodieren, haben sie einen höheren Out-Grad als das durchschnittliche metabolische Gen. So verhalten sich Gene unter einem vollständigen selektiven Sweep ähnlich wie diejenigen, die unter langfristiger positiver Selektion nachgewiesen wurden, während diejenigen unter einem unvollständigen Sweep stark durch ausgehende Links verbunden sind. Die Wirkung der kürzlich erfolgten positiven Selektion unter menschlichen Populationen variiert in Abhängigkeit von der endgültigen Häufigkeit der ausgewählten Variante.

Betrachtet man die Stärke der jüngsten positiven Selektion in Bezug auf die Konnektivität, ist das Muster komplex (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S4d-g). Gene mit geringer Konnektivität neigen dazu, kleinere HB-Werte aufzuweisen als Gene mit höherer Konnektivität, außer im kompletten HB in der CEU, wo Gene mit hohem Out-Grad sehr niedrige HB-Werte aufweisen. Bezüglich der Position des Knotens innerhalb des Netzwerks zeigt sich in CEU ein klarer linearer Trend. Gene, die an den ersten Schritten des metabolischen Netzwerks beteiligt sind, haben niedrigere HB-Werte (komplett und unvollständig) als Gene, die an Zwischen- und unteren Schritten beteiligt sind, wobei Gene, die mit den letzten Schritten assoziiert sind, die höchsten Werte haben. Bei CHB beobachten wir diesen Trend nicht. Gene, die an Zwischen- und letzten Schritten teilnehmen, haben höhere HB Complete-Werte als Gene, die die ersten Schritte ausführen, aber es gibt keinen Unterschied zwischen der Zwischen- und der unteren Kategorie. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Werten von HB Incomplete in CHB in Abhängigkeit von der Position des Gens innerhalb des Signalwegs (siehe Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5b). Dementsprechend finden wir nur Unterschiede in der Anzahl der Gene unter neuer positiver Selektion nach Knotenposition in der CEU: Sowohl Gene unter vollständigen oder unvollständigen selektiven Sweeps kodieren für Enzyme, die in den letzten Schritten des Stoffwechselnetzwerks wirken (Pearsons Chi-Quadrat-Test , P-Wert < 0,05, siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S5d).

Im kleineren Datensatz der einzelnen Stoffwechselwege haben wir in CEU drei Gene mit einem vollständigen selektiven Sweep (0,32 % der Stoffwechselgene in einzelnen Stoffwechselwegen) und 10 Gene mit einem unvollständigen Sweep (1,06 %) nachgewiesen. Bei CHB fanden wir 11 Gene mit einem vollständigen (1,16 %) und neun Gene mit einem unvollständigen selektiven Sweep (0,95 %) (siehe Zusatzdatei 2: Tabelle S3). Nur Gene mit einem unvollständigen selektiven Sweep bei CHB zeigen einen niedrigeren In-Grad-Wert als die übrigen metabolischen Gene (siehe Zusatzdatei 2: Tabelle S4). Einen ähnlichen Trend sehen wir bei CEU sowohl bei den einzelnen Stoffwechselwegen als auch im globalen Netzwerk: Gene an oberster Position haben kleinere Werte des kompletten HB als Gene an mittlerer oder unterer Position (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S5c). Wir finden jedoch keine Unterschiede in der Anzahl der Gene bei positiver Selektion nach Knotenposition.

Nicht alle Stoffwechselfunktionen stehen unter dem gleichen Selektionsdruck

Auf der Grundlage einer globalen Betrachtung des Stoffwechsels als dreischichtiges System können einzelne Stoffwechselwege nach ihrer Hauptstoffwechselfunktion gruppiert werden [5]: i) Innerer Kern (Glykolyse / Tricarbonsäurezyklus / Pentosephosphat und Polysaccharide), ii) Zwischenprodukte (Membranlipide, Nukleotid, Fettsäure/Triacylglycerid, Cofaktor, Fettsäure/Hormon und Aminosäure) und iii) Äußeres (Steroid, Sekundärstoffwechsel und Entgiftung). Wir verglichen Unterschiede in den evolutionären Maßen zwischen den Gruppen (Abb. 2). Pfade, die zum inneren Kern gehören, weisen höhere HB-Werte auf als die anderen Schichten, mit einem stärkeren Trend beim vollständigen HB. Wir finden jedoch nur Unterschiede in der Anzahl der Gene bei positiver Selektion zwischen den Kategorien bei CHB, wo mehr Gene als bei einem unvollständigen selektiven Sweep in den Zwischen- und Außenschichten erwartet werden (Pearson’s Chi-Quadrat-Test, Χ 2 = 6,6, P-Wert = 0,04).

Zusammenhang zwischen neuer Selektion beim Menschen und Stoffwechselfunktionen. Die einzelnen Stoffwechselwege wurden basierend auf einer globalen Betrachtung des Stoffwechsels als Dreischichtsystem klassifiziert, wie in [5] beschrieben. Der Mittelwert ± Standardfehler der Residuen einer linearen Regression der Hierarchical Boosting (HB)-Scores, die für genomische Variablen (CDS-Länge, Codon-Bias und GC-Gehalt) kontrolliert werden, wird für jede Kategorie aufgetragen. ein) Vollständige HB-Ergebnisse in CEU, B) Unvollständige HB-Werte in CEU, C) Vollständige HB-Ergebnisse in CHB und D) Unvollständige HB-Werte in CHB. Innerer Kern: Glykolyse / Tricarbonsäurezyklus / Pentosephosphat und Polysaccharide Zwischenprodukt: Membranlipide, Nukleotid, Fettsäuren / Triacylglyceride, Cofaktor, Fettsäuren / Hormone und Aminosäuren Äußeres: Steroid, Sekundärstoffwechsel und Entgiftung. Paarweise P-Werte werden von FDR angepasst (ns: P > 0,05 *: P < = 0,05 **: P < = 0,01 ***: P < = 0,001 ****: P < = 0,0001)

Ähnlich wie bei einzelnen Signalwegen haben wir berechnet, ob es innerhalb des globalen Netzwerks einen funktionellen Signalweg gibt, der bei positiver Selektion an Genen angereichert ist. Stoffwechselfunktionen des Fettstoffwechsels (Fettsäureoxidation, Glycerophospholipidstoffwechsel, Cholesterin- und Gallensäurestoffwechsel) und des Membrantransports werden mit positiv selektierten Genen angereichert (Chi-Quadrat-Test nach Pearson, p-Wert < 0,05 in allen Tests, siehe Zusatzdatei 1 : Abbildung S6). Alle diese Prozesse sind funktionell miteinander verbunden, da sie an Lipidtransport und -nutzung sowie an Membranfluidität und -permeabilität beteiligt sind.

Erwartungsgemäß gibt es keine Eins-zu-Eins-Zuordnung zwischen Genen und enzymatischen Reaktionen im Stoffwechselnetzwerk: 61,60% der Gene kodieren für Enzyme, die an mehr als einer Reaktion beteiligt sind, und im Durchschnitt ist ein Gen an 7,44 Reaktionen beteiligt (siehe Zusätzliche Datei 1: Abbildung S7). Die Anzahl der Funktionen eines Gens oder die Anzahl der enzymatischen Reaktionen, die von dem/den von dem Gen kodierten Enzym(en) durchgeführt werden, ist ein Maß für die molekulare Gen-Pleiotropie [21]. Beim Vergleich der Gene unter positiver Selektion mit den übrigen metabolischen Genen finden wir keine Unterschiede in der Anzahl der enzymatischen Reaktionen, die von Enzymen durchgeführt werden, die von positiv selektierten Genen kodiert werden, weder auf inter- noch intraspezifischer Ebene (Permutationstest, P-Wert > 0,05 in allen Vergleichen).


Diskussion

Mitglieder einer Genfamilie können unterschiedliche gewebe-, entwicklungs- oder umweltspezifische Expressionsmuster aufweisen. Verwendung der GLO Genfamilie, die im Reisgenom vorhanden ist [15, 24] zeigen wir, dass die vier Reis GLO Gene werden in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien der Reispflanze (Abb. 1a und b) sowie als Reaktion auf Stress (Abb. 1c) unterschiedlich exprimiert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die physiologische Rolle dieser GLO Gene sind nicht redundant, aber die genaue biologische Bedeutung des Reis GLO Genfamilie muss weiter untersucht werden.

Im Allgemeinen würden Mitglieder der Genfamilie mit unterschiedlichen Expressionsmustern verschiedene Isozyme mit unterschiedlichen enzymatischen Eigenschaften und physiologischen Rollen kodieren [21, 28]. In Pflanzen wurde GLO zuerst aus Spinat aufgereinigt [29, 30], die Primärstruktur von Spinat-GLO (SpGLO) wurde durch Peptidsequenzierung identifiziert, die nur ein einheitliches Peptid enthält [31], und seine K m für Glykolat wurde mit 0,38 mM nachgewiesen [32]. GLO wurde auch isoliert von Partheniumhysterophorus und Pisum sativum, die beide aus zwei verschiedenen Peptiden bestanden. Die K m(Glykolat) des Partheniumhysterophorus GLO ist 0,2 mM und das der Pisum sativum GLO beträgt 0,3 mM [33]. Die enzymatischen Eigenschaften jedes GLO-Isozyms in Pflanzen werden jedoch selten vergleichend analysiert. Arabidopsis enthält fünf GLO-Mitglieder, d. e. GOX1, GOX2, GOX3, HAOX1 und HAOX2 [4, 34], nur GOX1, GOX2 und GOX3 wurden heterolog exprimiert und gereinigt in E coli, bzw. Enzymatische Assays dieser gereinigten Enzyme zeigten, dass sie alle eine hohe Affinität für Glykolat aufwiesen, jedoch mit deutlichem K m Werte. Darüber hinaus besitzt GOX3 eine hohe katalytische Effizienz für L-Lactat [22]. In dieser Studie haben wir die enzymatischen Eigenschaften aller Reis-GLO-Isozyme vergleichend untersucht. GLO1 + 4 zeigte die höchste katalytische Effizienz bei Verwendung von Glykolat als Substrat, gefolgt von GLO1 bzw. GLO4 (Abb. 2b Tabelle 1 und zusätzliche Datei 3). Tatsächlich zeigten die transgenen Reispflanzen, die GLO1 oder GLO4 hochreguliert oder ausgeschaltet hatten, eine viel höhere bzw. niedrigere GLO-Aktivität. Unsere früheren Studien haben auch beobachtet, dass die Phänotypen in den GLO1 und GLO4 hochregulierten oder herunterregulierten transgenen Linien verändert waren [4, 5]. Im Gegensatz dazu gab es keine Veränderungen der GLO-Aktivität und des Phänotyps in GLO3- und GLO5-hochregulierten oder RNAi-Reislinien (Fig. 3a Fig. 4). Darüber hinaus unterstützte die Analyse des GLO-Isozyme-Zymogramms weiter, dass die GLO-Isozyme in Reisblättern aus GLO1- und GLO4-Untereinheiten bestanden (Fig. 3b und c) und GLO1 in Reisblättern häufiger vorkam als GLO4 (Fig. 3b). In Kombination mit unseren früheren Ergebnissen [24] kann geschlossen werden, dass GLO1, GLO4 und GLO1 + 4 die GLO-Isozyme für die Photorespiration in Reis sind. Darüber hinaus zeigte diese Studie, dass GLO1 + 4 und GLO1 eine höhere katalytische Effizienz bei der Glykolatoxidation aufweisen als GLO4 (Abb. 2a und b Tabelle 1). Daher kann weiter impliziert werden, dass GLO1 den Hauptbeitrag zur GLO-Aktivität und folglich zur Photorespiration und dem damit verbundenen H . leisten könnte2Ö2 Produktion.

GLO3 ist das Reishomolog von Arabidopsis GOX3. Kürzlich wurde berichtet, dass GOX3 in Arabidopsis fungiert als L-Lactat-Oxidase, die die Umwandlung von L-Lactat in Pyruvat katalysiert, um unter normoxischen Bedingungen niedrige L-Lactat-Spiegel in den Wurzeln aufrechtzuerhalten [22]. Wir beobachteten, dass das Reis-GLO3 auch die Oxidation von L-Lactat zu Pyruvat effizient katalysieren konnte (Abb. 2b Tabelle 1). Unsere bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass GLO3 wird überwiegend in Wurzeln exprimiert [15, 24], unerwartet konnten jedoch keine GLO-Aktivitäten in Wildtyp-Reiswurzeln nachgewiesen werden (Zusatzdatei 7). Wir stellten ferner fest, dass die GLO3-Überexpressions-Reispflanzen keine verbesserte Resistenz gegenüber L-Lactat-Toxizität verliehen (Zusatzdatei 6). Dies entsprach nicht der Arabidopsis GOX3-Überexpressionspflanzen, von denen gezeigt wurde, dass sie gegenüber L-Lactat-Toxizität toleranter sind [22]. Als semiaquatische Pflanze produziert Reis im Vergleich zu Weizen, Kartoffeln und . wenig Laktat Arabidopsis [35,36,37,38], was erklären könnte, warum GLO3 nicht mit einer Laktattoxizität in Reis in Verbindung gebracht wird, wie für berichtet Arabidopsis [22].

Während die primäre metabolische Rolle von GLO gut bekannt ist, ist die physiologische Funktion noch nicht gut verstanden. Rojaset al. (2012) schlugen vor, dass jedes GLO-Isozym unterschiedliche Rollen bei der Resistenz gegen Nicht-Wirtskrankheiten in Arabidopsis [16]. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass die Arabidopsis GOX1 und GOX2 spielten unterschiedliche Rollen beim oxidativen Stress-bedingten Zelltod [23]. Es wurde auch berichtet, dass GLO an einigen anderen biologischen Prozessen wie Proteinreparaturreaktionen und dem Salicylsäure-Signalweg beteiligt ist [39, 40]. Interessanterweise fanden neuere Studien heraus, dass es ein Übersprechen zwischen photorespiratorischem H2Ö2 und Auxin [41, 42]. Wir fanden heraus, dass die GLO-Aktivität eng mit H . zusammenhängt2Ö2 Spiegel in Reisblättern (Zusatzdatei 5) und als solcher könnte der Zwergwuchs-Phänotyp der GLO-herunterregulierten Reislinien eine morphologische Abweichung im Zusammenhang mit der Auxin-Signalgebung sein [43, 44]. Nichtsdestotrotz haben unsere früheren Arbeiten gezeigt, dass die Unterdrückung von GLO eine Akkumulation von Glyoxylat verursachen kann, das die Photosynthese hemmt [5], so dass es auch möglich ist, dass der Zwergwuchs-Phänotyp aus einer gehemmten Photosynthese resultiert. Daher kann jedes GLO-Isozym unterschiedliche physiologische Funktionen in diesen verschiedenen biologischen Prozessen in Reis aufweisen, aber es sind direktere experimentelle Beweise erforderlich, um die potenziellen Mechanismen aufzuklären.


CH450 und CH451: Biochemie - Das Leben auf molekularer Ebene definieren

6.1 Die Natur und Klassifizierung von Enzymen

6.2 Enzymnamen und Klassifikation

6.3 Enzymstruktur und Substratbindung

6.4 Enzyme und Reaktionsgleichgewicht

6.5 Eigenschaften und Mechanismen der Enzymwirkung

6.6 Enzyme werden von pH und Temperatur beeinflusst

6.7 Enzyme sind empfindlich gegenüber Inhibitoren

6.8 Allosterische Regulatoren und die Kontrolle der Enzymaktivität

6.9 Herkunft, Reinigung und Verwendung von Enzymen

6.10 Industrielle Enzymologie

6.11 Referenzen

6.1 Die Natur und Klassifizierung von Enzymen

Enzyme sind biologische Katalysatoren (auch Biokatalysatoren genannt), die biochemische Reaktionen in lebenden Organismen beschleunigen. Sie können auch aus Zellen extrahiert und dann verwendet werden, um eine Vielzahl von kommerziell wichtigen Prozessen zu katalysieren. Sie spielen beispielsweise eine wichtige Rolle bei der Herstellung von Süßstoffen und der Modifikation von Antibiotika, sie werden in Waschpulvern und verschiedenen Reinigungsmitteln verwendet und spielen eine Schlüsselrolle in Analysegeräten und Assays mit klinischen, forensischen und umweltbezogenen Anwendungen. Das Wort "Enzym" wurde erstmals 1878 von dem deutschen Physiologen Wilhelm Kühne verwendet, als er die Fähigkeit der Hefe beschrieb, aus Zucker Alkohol herzustellen, und es leitet sich von den griechischen Wörtern en (bedeutet 'innerhalb') und zume (bedeutet 'Hefe').

Ende des 19. und Anfang des 20. Jahrhunderts wurden bei der Extraktion, Charakterisierung und kommerziellen Nutzung vieler Enzyme bedeutende Fortschritte erzielt, aber erst in den 1920er Jahren wurden Enzyme kristallisiert und zeigten, dass katalytische Aktivität mit Proteinmolekülen verbunden ist. Während der nächsten 60 Jahre glaubte man, dass alle Enzyme Proteine ​​sind, aber in den 1980er Jahren wurde festgestellt, dass einige Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle auch katalytische Wirkungen ausüben können. Diese RNAs, die als Ribozyme bezeichnet werden, spielen eine wichtige Rolle bei der Genexpression. Im selben Jahrzehnt entwickelten Biochemiker auch die Technologie zur Herstellung von Antikörpern mit katalytischen Eigenschaften. Diese sogenannten „Abzyme“ haben sowohl als neuartige industrielle Katalysatoren als auch in der Therapeutik ein erhebliches Potenzial. Ungeachtet dieser bemerkenswerten Ausnahmen konzentriert sich ein Großteil der klassischen Enzymologie und der Rest dieses Aufsatzes auf Proteine ​​mit katalytischer Aktivität.

Enzyme werden als Katalysatoren nur in sehr geringen Konzentrationen benötigt und beschleunigen Reaktionen, ohne dabei selbst verbraucht zu werden. Normalerweise beschreiben wir Enzyme als fähig, die Umwandlung von Substratmolekülen in Produktmoleküle wie folgt zu katalysieren:

Enzyme sind potente Katalysatoren.

Die enorme katalytische Aktivität von Enzymen lässt sich vielleicht am besten durch eine konstante, kKatze, das wird verschiedentlich als bezeichnet Fluktuationsrate, Fluktuationshäufigkeit oder Umsatzzahlen. Diese Konstante stellt die Anzahl der Substratmoleküle dar, die von einem einzelnen Enzymmolekül pro Zeiteinheit (normalerweise pro Minute oder pro Sekunde) in Produkt umgewandelt werden können. Beispiele für Fluktuationsratenwerte sind in Tabelle 6.1 aufgeführt. Beispielsweise kann ein einzelnes Molekül Carboanhydrase die Umwandlung von über einer halben Million Molekülen seines Substrats Kohlendioxid (CO .) katalysieren2) und Wasser (H2O), in das Produkt, Bicarbonat (HCO3 − ), jede Sekunde – eine wirklich bemerkenswerte Leistung.

Enzyme sind spezifische Katalysatoren

Enzyme sind nicht nur hochwirksame Katalysatoren, sondern besitzen auch eine bemerkenswerte Spezifität, da sie im Allgemeinen die Umwandlung nur eines Typs (oder höchstens einer Reihe ähnlicher Typen) von Substratmolekülen in Produktmoleküle katalysieren. Einige Enzyme weisen eine Gruppenspezifität auf. Beispielsweise kann alkalische Phosphatase (ein Enzym, das häufig in Laborsitzungen im ersten Jahr zur Enzymkinetik vorkommt) eine Phosphatgruppe von einer Vielzahl von Substraten entfernen.

Andere Enzyme zeigen eine viel höhere Spezifität, die als absolute Spezifität bezeichnet wird. Zum Beispiel zeigt Glucoseoxidase fast vollständige Spezifität für ihr Substrat β-D-Glucose und praktisch keine Aktivität mit anderen Monosacchariden. Wie wir später sehen werden, ist diese Spezifität in vielen analytischen Assays und Geräten (Biosensoren) von größter Bedeutung, die ein bestimmtes Substrat (z. B. Glucose) in einem komplexen Gemisch (z. B. einer Blut- oder Urinprobe) messen.

Tabelle 6.1 Umsatzrate einiger gängiger Enzyme mit großen Schwankungen

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6.2 Enzymnamen und Klassifikation

Enzyme haben normalerweise gebräuchliche Namen (oft als "Trivialnamen" bezeichnet), die sich auf die Reaktion beziehen, die sie katalysieren, mit dem Suffix ‘-ase’ (z. B. Oxidase, Dehydrogenase, Carboxylase), obwohl einzelne proteolytische Enzyme im Allgemeinen das Suffix & #8216-in’ (zB Trypsin, Chymotrypsin, Papain). Oft weist der Trivialname auch auf das Substrat hin, auf das das Enzym wirkt (z. B. Glucoseoxidase, Alkoholdehydrogenase, Pyruvatdecarboxylase). Einige Trivialnamen (z. B. Invertase, Diastase, Katalase) geben jedoch wenig Auskunft über das Substrat, das Produkt oder die beteiligte Reaktion.

Aufgrund der zunehmenden Komplexität und Inkonsistenz bei der Benennung von Enzymen hat die International Union of Biochemistry die Enzyme Commission eingerichtet, um sich mit diesem Thema zu befassen. Der erste Bericht der Enzymkommission wurde 1961 veröffentlicht und bot einen systematischen Ansatz zur Benennung von Enzymen. Die sechste Ausgabe, die 1992 veröffentlicht wurde, enthielt Details zu fast 3.200 verschiedenen Enzymen, und jährlich erscheinende Ergänzungen haben diese Zahl auf über 5.000 erweitert.

Innerhalb dieses Systems werden alle Enzyme durch eine vierteilige Enzyme Commission (EC)-Nummer beschrieben. Das Enzym mit dem Trivialnamen Lactat-Dehydrogenase hat beispielsweise die EC-Nummer 1.1.1.27 und wird korrekter als L-Lactat bezeichnet: NAD + Oxidoreduktase. Der erste Teil der EC-Nummer bezieht sich auf die Reaktion, die das Enzym katalysiert (Tabelle 6.2). Die restlichen Ziffern haben je nach Art der Reaktion, die durch die erste Ziffer identifiziert wird, unterschiedliche Bedeutungen. Innerhalb der Oxidoreduktase-Kategorie beispielsweise bezeichnet die zweite Ziffer den Wasserstoffdonor (Tabelle 6.3) und die dritte Ziffer den Wasserstoffakzeptor (Tabelle 6.4). So ist die Laktatdehydrogenase mit der EC-Nummer 1.1.1.27 eine Oxidoreduktase (angezeigt durch die erste Ziffer) mit der Alkoholgruppe des Laktatmoleküls als Wasserstoffdonor (zweite Ziffer) und NAD + als Wasserstoffakzeptor (dritte Ziffer) und ist das 27. Enzym, das in diese Gruppe einzuordnen ist (vierte Ziffer).

Tabelle 6.2 Enzymklassifizierung: Hauptklassen von Enzymen im EG-System

Tabelle 6.3 Enzymklassifizierung: Sekundäre Klassen von Oxidoreduktasen im EG-System

Tabelle 6.4 Enzymklassifikationen: Tertiäre Klassen von Oxidoreduktasen im EG-System

Glücklicherweise ist es jetzt sehr einfach, diese Informationen für jedes einzelne Enzym mithilfe der Enzyme Nomenclature Database (verfügbar unter http://enzyme.expasy.org) zu finden.

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6.3 Enzymstruktur und Substratbindung

Enzyme auf Aminosäurebasis sind kugelförmige Proteine, deren Größe von weniger als 100 bis zu mehr als 2.000 Aminosäureresten reicht. Diese Aminosäuren können als eine oder mehrere Polypeptidketten angeordnet werden, die gefaltet und gebogen werden, um eine spezifische dreidimensionale Struktur zu bilden, die einen kleinen Bereich einschließt, der als aktives Zentrum bekannt ist (Abbildung 6.1), an dem das Substrat tatsächlich bindet. Das aktive Zentrum kann durchaus nur eine kleine Anzahl (weniger als 10) der konstituierenden Aminosäuren umfassen. Es sind die Form- und Ladungseigenschaften des aktiven Zentrums, die es ihm ermöglichen, an eine einzige Art von Substratmolekülen zu binden, so dass das Enzym in der Lage ist, eine beträchtliche Spezifität in seiner katalytischen Aktivität zu zeigen.

Die Hypothese, dass die Enzymspezifität aus der komplementären Natur des Substrats und seines aktiven Zentrums resultiert, wurde erstmals 1894 von dem deutschen Chemiker Emil Fischer aufgestellt und wurde als Fischers „Schloss-und-Schlüssel-Hypothese“ bekannt, bei der nur ein Schlüssel der richtigen Größe und Form (das Substrat) passt in das Schlüsselloch (das aktive Zentrum) des Schlosses (des Enzyms). Es ist erstaunlich, dass diese Theorie zu einer Zeit aufgestellt wurde, als noch nicht einmal festgestellt wurde, dass Enzyme Proteine ​​sind.

Abbildung 6.1 Darstellung der Substratbindung an das aktive Zentrum eines Enzymmoleküls.

Als durch Techniken wie der Röntgenkristallographie mehr über die Enzymstruktur gelernt wurde, wurde klar, dass Enzyme keine starren Strukturen sind, sondern tatsächlich eine recht flexible Form haben. Vor diesem Hintergrund erweiterte Daniel Koshland 1958 die Ideen von Fischer und präsentierte das „induzierte Anpassungsmodell“ der Substrat- und Enzymbindung, bei dem das Enzymmolekül seine Form leicht ändert, um die Bindung des Substrats aufzunehmen. Die häufig verwendete Analogie ist das „Hand-in-Handschuh-Modell“, bei dem Hand und Handschuh sich in der Form weitgehend ergänzen, der Handschuh jedoch beim Einführen um die Hand geformt wird, um eine perfekte Übereinstimmung zu erzielen.

Da allein das aktive Zentrum an das Substrat bindet, ist es logisch zu fragen, welche Rolle der Rest des Proteinmoleküls spielt. Die einfache Antwort ist, dass es das aktive Zentrum stabilisiert und eine geeignete Umgebung für die Wechselwirkung des Zentrums mit dem Substratmolekül bereitstellt. Daher kann das aktive Zentrum nicht ohne Verlust der katalytischen Aktivität vom Rest des Proteins getrennt werden, obwohl Laborstudien mit gerichteter (oder erzwungener) Evolution gezeigt haben, dass es manchmal möglich ist, kleinere Enzyme zu erzeugen, die ihre Aktivität beibehalten. Auch andere Regionen des Enzyms können an der Regulation der Enzymaktivität beteiligt sein, worauf in Kapitel 8 näher eingegangen wird.

Es ist zu beachten, dass viele Enzyme zwar ausschließlich aus Protein bestehen, viele jedoch auch eine Nicht-Protein-Komponente enthalten, die als a . bekannt ist Cofaktor, die für die katalytische Aktivität des Enzyms notwendig ist. Ein Cofaktor kann ein anderes organisches Molekül sein, in diesem Fall heißt es a Coenzym, oder es kann ein anorganisches Molekül sein, typischerweise ein Metallion wie Eisen, Mangan, Kobalt, Kupfer oder Zink. Ein Coenzym, das fest und dauerhaft an das Protein bindet, wird im Allgemeinen als das prothetische Gruppe des Enzyms. Wenn ein Enzym für seine Aktivität einen Cofaktor benötigt, wird die inaktive Proteinkomponente im Allgemeinen als an . bezeichnet Apoenzym, und das Apoenzym plus Cofaktor (d. h. das aktive Enzym) heißt a Holoenzym(Abbildung 6.2). Der Bedarf an Mineralstoffen und Vitaminen in der menschlichen Ernährung ist zum Teil auf ihre Funktionen im Stoffwechsel als Cofaktoren und Coenzyme zurückzuführen.

Abbildung 6.2 Die Komponenten eines Holoenzyms

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6.4 Enzyme und Reaktionsgleichgewicht

Enzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit

Wie funktionieren Enzyme? Die allgemeine Antwort auf diese Frage ist, dass sie NICHT das Gleichgewicht (d. h. die Thermodynamik) einer Reaktion ändern. Denn Enzyme verändern Struktur und Energetik der Produkte und Reagenzien nicht grundlegend, sondern ermöglichen lediglich eine schnellere Einstellung des Reaktionsgleichgewichts. Lassen Sie uns daher zunächst den Begriff des chemischen Gleichgewichts klären. In vielen Fällen liegt das Gleichgewicht einer Reaktion weit „rechts“ – das heißt, praktisch das gesamte Substrat (S) wird in Produkt (P) umgewandelt. Aus diesem Grund werden Reaktionen oft geschrieben als

Dies ist eine Vereinfachung, da es in allen Fällen richtiger ist, diese Reaktion wie folgt zu schreiben:

Dies weist auf das Vorhandensein eines Gleichgewichts hin. Um dieses Konzept zu verstehen, ist es vielleicht am hilfreichsten, eine Reaktion zu betrachten, bei der der Gleichgewichtspunkt ziemlich zentral ist. Zum Beispiel:

Wenn wir bei dieser Reaktion mit einer Lösung von 1 M Glucose beginnen und das Enzym hinzufügen, erhalten wir nach Abschluss eine Mischung von ungefähr 0,5 M Glucose und 0,5 M Fructose. Dies ist der Gleichgewichtspunkt dieser speziellen Reaktion. Obwohl es bei Anwesenheit des Enzyms nur ein paar Sekunden dauern kann, um diesen Endpunkt zu erreichen, würden wir tatsächlich zum gleichen Punkt kommen, wenn wir Glukose in Lösung bringen und viele Monate warten, bis die Reaktion in Abwesenheit des Enzyms abläuft . Interessanterweise hätten wir diese Reaktion auch mit einer 1 M Fructoselösung starten können, und sie wäre in die entgegengesetzte Richtung verlaufen, bis der gleiche Gleichgewichtspunkt erreicht war.

Der Gleichgewichtspunkt für diese Reaktion wird durch die Gleichgewichtskonstante ausgedrückt, Keq, wie folgt:

Für eine Reaktion mit zentralem Gleichgewicht gilt also Keq = 1, für ein Gleichgewicht „nach rechts“, Keq ist >1, und für ein Gleichgewicht „nach links“ Keqist < 1. Wenn also eine Reaktion a Keq Wert von 10 6 , liegt das Gleichgewicht sehr weit rechts und kann vereinfacht werden, indem es als einzelner Pfeil bezeichnet wird. Wir können diese Art von Reaktion oft als „zur Vollendung gehen“ bezeichnen. Umgekehrt hat eine Reaktion a Keq Bei einem Wert von 10 −6 liegt das Gleichgewicht sehr weit links, und für alle praktischen Zwecke würde es nicht wirklich in Betracht gezogen werden, überhaupt fortzufahren.

Es sollte beachtet werden, dass, obwohl die Konzentration der Reaktanten keinen Einfluss auf den Gleichgewichtspunkt hat, Umgebungsfaktoren wie pH und Temperatur die Position des Gleichgewichts beeinflussen können und dies tun. Es sollte auch beachtet werden, dass jede biochemische Reaktion, die auftritt, in vivo, in einem lebenden System erfolgt nicht isoliert, sondern als Teil eines Stoffwechselweges, was die Vorstellung der Beziehung zwischen Reaktanten und Reaktionen erschwert. In vivo, Reaktionen dürfen nicht in ihre Gleichgewichtslage ablaufen. Wenn dies der Fall wäre, würde die Reaktion im Wesentlichen stoppen (d. h. die Hin- und Rückreaktion würden sich gegenseitig ausgleichen), und es würde keinen Nettofluss durch den Weg geben. Bei vielen komplexen biochemischen Reaktionswegen befinden sich jedoch einige der einzelnen Reaktionsschritte nahe am Gleichgewicht, während andere weit vom Gleichgewicht entfernt sind, wobei letztere (durch regulatorische Enzyme katalysiert) die größte Fähigkeit haben, den gesamten Materialfluss durch den Reaktionsweg zu kontrollieren.

Enzyme bilden mit ihren Substraten Komplexe

Wir beschreiben eine enzymkatalysierte Reaktion oft als drei Stufen wie folgt:

Der ES-Komplex stellt eine Position dar, an der das Substrat (S) an das Enzym (E) gebunden ist, so dass die Reaktion (was auch immer es sein mag) begünstigt wird. Sobald die Reaktion erfolgt ist, dissoziiert das Produktmolekül (P) vom Enzym, das dann frei an ein anderes Substratmolekül binden kann. Irgendwann während dieses Prozesses wird das Substrat in eine Zwischenform (oft als Übergangszustand bezeichnet) und dann in das Produkt umgewandelt. Der genaue Mechanismus, durch den das Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht, unterscheidet sich von einem System zum anderen und ist Thema von Kapitel 7. Das allgemeine Prinzip ist jedoch, dass durch die Bindung des Substrats an das Enzym die Reaktion unter Beteiligung des Substrats wird durch die Senkung der Aktivierungsenergie der Reaktion begünstigt.

In energetischer Hinsicht können Reaktionen entweder exergonisch (Energie freisetzen) oder endergonisch (Energie verbrauchen) sein. Aber selbst bei einer exergonischen Reaktion wird eine kleine Energiemenge, die als Aktivierungsenergie bezeichnet wird, benötigt, um der Reaktion einen „Kickstart“ zu geben Chemikalien (Phosphorsesquisulfid und Kaliumchlorat). Wenn ein Streichholz brennt, setzt es erhebliche Mengen an Licht- und Wärmeenergie frei (reagiert exergonisch mit O2 in der Luft). Jedoch, und vielleicht zum Glück, wird ein Streichholz nicht spontan entzünden, sondern es ist ein kleiner Energieeintrag in Form von Wärme, die durch Reibung erzeugt wird (d. Natürlich ist nach dem Anzünden des Streichholzes die freigesetzte Energiemenge beträchtlich und übersteigt bei weitem den geringen Energieeintrag beim Anzünden.

Wie in Abbildung 6.3 gezeigt, wird angenommen, dass Enzyme die Aktivierungsenergie eines Systems senken, indem sie die Bildung des Übergangszustands energetisch erleichtern. In Gegenwart eines Enzymkatalysators ist die Bildung des Übergangszustandes energetisch günstiger (dh er benötigt weniger Energie für den „Kickstart“), wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit beschleunigt wird, die Energieniveaus jedoch nicht grundlegend verändert werden entweder des Reaktanten oder des Produkts.

Abbildung 6.3 Wirkung eines Enzyms auf die Reduzierung der Aktivierungsenergie, die erforderlich ist, um eine Reaktion zu starten, bei der (a) unkatalysiert ist und (b) eine enzymkatalysierte Reaktion ist.

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6.5 Eigenschaften und Mechanismen der Enzymwirkung

Enzymkinetik

Enzymkinetik ist die Untersuchung von Faktoren, die die Geschwindigkeit von enzymkatalysierten Reaktionen bestimmen. Es verwendet einige mathematische Gleichungen, die für Schüler verwirrend sein können, wenn sie ihnen zum ersten Mal begegnen. Die Theorie der Kinetik ist jedoch sowohl logisch als auch einfach, und es ist unerlässlich, dieses Thema zu verstehen, um die Rolle von Enzymen sowohl im Stoffwechsel als auch in der Biotechnologie einschätzen zu können.

Assays (Messungen) der Enzymaktivität können entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Diskontinuierliche Verfahren beinhalten das Zusammenmischen des Substrats und des Enzyms und das Messen des gebildeten Produkts nach einem festgelegten Zeitraum, so dass diese Verfahren im Allgemeinen einfach und schnell durchzuführen sind. Im Allgemeinen würden wir solche diskontinuierlichen Assays verwenden, wenn wir wenig über das System wissen (und Voruntersuchungen durchführen) oder alternativ wenn wir viel über das System wissen und sicher sind, dass das von uns gewählte Zeitintervall angemessen ist.

Bei kontinuierlichen Enzymassays würden wir im Allgemeinen die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion untersuchen, indem wir das Enzym mit dem Substrat mischen und das Erscheinungsbild des Produkts über die Zeit kontinuierlich messen. Natürlich könnten wir die Reaktionsgeschwindigkeit ebenso gut messen, indem wir das Verschwinden des Substrats im Laufe der Zeit messen. Abgesehen von der tatsächlichen Richtung (einer steigend und einer fallend) wären die beiden Werte identisch. In enzymkinetischen Experimenten verwenden wir der Einfachheit halber sehr oft ein künstliches Substrat namens a Chromogen Dies ergibt ein hell gefärbtes Produkt, wodurch die Reaktion mit einem Kolorimeter oder einem Spektrophotometer leicht zu verfolgen ist. Tatsächlich könnten wir jedoch jedes verfügbare Analysegerät verwenden, das in der Lage ist, die Konzentration des Produkts oder des Substrats zu messen.

In fast allen Fällen würden wir der Mischung auch eine Pufferlösung hinzufügen. Wie wir sehen werden, wird die Enzymaktivität stark vom pH-Wert beeinflusst, daher ist es wichtig, den pH-Wert auf einen bestimmten Wert einzustellen und ihn während des gesamten Experiments konstant zu halten. Unser erstes enzymkinetisches Experiment könnte daher darin bestehen, eine Substratlösung (Chromogen) mit einer Pufferlösung zu mischen und das Enzym zuzugeben. Diese Mischung würde dann in ein Spektrophotometer gegeben und das Aussehen des gefärbten Produkts gemessen. Dies würde es uns ermöglichen, eine schnelle Reaktion zu verfolgen, die sich nach einigen Sekunden oder Minuten möglicherweise verlangsamt, wie in Abbildung 6.4 gezeigt.

Abbildung 6.4 Produktbildung in einer enzymkatalysierten Reaktion, aufgetragen gegen die Zeit.

Ein häufiger Grund für diese Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit (Geschwindigkeit) ist, dass das Substrat innerhalb der Mischung aufgebraucht wird und dadurch limitierend wird. Alternativ kann es sein, dass das Enzym instabil ist und im Laufe des Experiments denaturiert, oder es könnte sein, dass sich der pH-Wert der Mischung ändert, da viele Reaktionen Protonen entweder verbrauchen oder freisetzen. Aus diesen Gründen tun wir, wenn wir aufgefordert werden, die Geschwindigkeit einer Reaktion anzugeben, dies frühzeitig, sobald das Enzym hinzugefügt wurde und keine der oben genannten Einschränkungen zutrifft. Wir bezeichnen diese anfängliche schnelle Geschwindigkeit als die Anfangsgeschwindigkeit (v0). Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit in diesem frühen Stadium ist ebenfalls recht einfach, da die Geschwindigkeit effektiv linear ist. Wir können also einfach eine gerade Linie ziehen und den Gradienten messen (indem wir die Konzentrationsänderung durch das Zeitintervall dividieren), um die Reaktion zu bewerten Rate über diesen Zeitraum.

Wir können nun eine Reihe ähnlicher Enzymassays durchführen, um zu bewerten, wie sich die Anfangsgeschwindigkeit ändert, wenn die Substrat- oder Enzymkonzentration oder der pH-Wert geändert wird. Diese Studien werden uns helfen, die Eigenschaften des untersuchten Enzyms zu charakterisieren.

Die Beziehung zwischen Enzymkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit ist normalerweise einfach. Wenn wir das gerade beschriebene Experiment wiederholen, aber 10 % mehr Enzym hinzufügen, wird die Reaktion 10 % schneller sein, und wenn wir die Enzymkonzentration verdoppeln, läuft die Reaktion doppelt so schnell ab. Somit besteht eine einfache lineare Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Menge an Enzym, die zur Katalyse der Reaktion zur Verfügung steht (Abbildung 6.5). Diese Beziehung gilt sowohl für Enzyme in vivo als auch für solche, die in biotechnologischen Anwendungen verwendet werden, wo die Regulierung der vorhandenen Enzymmenge die Reaktionsgeschwindigkeiten steuern kann.

Abbildung 6.5 Beziehung zwischen Enzymkonzentration und Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion.

Wenn wir eine Reihe von Enzymassays mit derselben Enzymkonzentration, aber mit einer Reihe unterschiedlicher Substratkonzentrationen durchführen, ergibt sich eine etwas komplexere Beziehung, wie in Abbildung 6 gezeigt. Wenn die Substratkonzentration erhöht wird, steigt zunächst die Reaktionsgeschwindigkeit wesentlich. Wenn jedoch die Substratkonzentration weiter erhöht wird, beginnen die Auswirkungen auf die Reaktionsgeschwindigkeit abzunehmen, bis ein Stadium erreicht wird, in dem eine Erhöhung der Substratkonzentration kaum mehr Auswirkungen auf die Reaktionsgeschwindigkeit hat. An diesem Punkt wird angenommen, dass sich das Enzym der Sättigung mit Substrat nähert und seine maximale Geschwindigkeit demonstriert (Vmax). Beachten Sie, dass diese maximale Geschwindigkeit tatsächlich eine theoretische Grenze ist, die in keinem Experiment wirklich erreicht wird, obwohl wir ihr sehr nahe kommen könnten.

Abbildung 6.6 Beziehung zwischen Substratkonzentration und Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion.

Die hier beschriebene Beziehung ist eine ziemlich häufige, die ein Mathematiker sofort als rechteckige Hyperbel identifizieren würde. Die Gleichung, die eine solche Beziehung beschreibt, lautet wie folgt:

Die beiden Konstanten a und b erlauben uns also, diesen hyperbolischen Zusammenhang ebenso wie mit einem linearen Zusammenhang zu beschreiben (y = mx + c), die durch die beiden Konstanten ausgedrückt werden kann m (die Steigung) und C (der Abfang). Tatsächlich haben wir die Konstante . bereits definiert ein - es ist Vmax. Die Konstante B ist etwas komplexer, da der Wert auf der x-Achse die Hälfte des maximalen Wertes von y angibt. In der Enzymologie bezeichnen wir dies als Michaelis-Konstante (Km), die als die Substratkonzentration definiert ist, die die halbmaximale Geschwindigkeit ergibt.

Unsere letzte Gleichung, die normalerweise als bezeichnet wird Michaelis-Menten-Gleichung, wird also:

1913 zeigten Leonor Michaelis und Maud Menten erstmals, dass es tatsächlich möglich ist, diese Gleichung mathematisch aus ersten Prinzipien abzuleiten, mit einigen einfachen Annahmen darüber, wie ein Enzym mit einem Substrat zu einem Produkt reagiert. Zentral für ihre Ableitung ist das Konzept, dass die Reaktion über die Bildung eines ES-Komplexes erfolgt, der nach seiner Bildung entweder (produktiv) zur Produktfreisetzung dissoziieren oder in umgekehrter Richtung ohne Produktbildung dissoziieren kann. Damit lässt sich die Reaktion wie folgt darstellen, mit k1, k−1und k2 sind die Geschwindigkeitskonstanten der drei einzelnen Reaktionsschritte:

Die Michaelis-Menten-Ableitung erfordert zwei wichtige Annahmen. Die erste Annahme ist, dass wir die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion betrachten (v0), wenn die Produktkonzentration vernachlässigbar klein ist (d. h. [S] ≫ [P]), sodass wir die Möglichkeit ignorieren können, dass ein Produkt zum Substrat zurückkehrt. Die zweite Annahme ist, dass die Substratkonzentration die Enzymkonzentration bei weitem übersteigt (d. h. [S] ≫ [E]).

Die Herleitung beginnt mit einer Gleichung für den Ausdruck der Anfangsgeschwindigkeit, der Produktbildungsgeschwindigkeit, als Geschwindigkeit, mit der der ES-Komplex zum Produkt dissoziiert. Dies basiert auf der Geschwindigkeitskonstanten k2und die Konzentration des ES-Komplexes wie folgt:

Da ES ein Zwischenprodukt ist, ist seine Konzentration unbekannt, aber wir können es durch bekannte Werte ausdrücken. In stationärer Näherung können wir annehmen, dass die Konzentration des ES-Komplexes selbst konstant bleibt, obwohl sich die Konzentration von Substrat und Produkt ändert.

Die Bildungsgeschwindigkeit des ES-Komplexes und die Geschwindigkeit seines Abbaus müssen daher ausgeglichen sein, wobei:

Rate der ES-Komplexbildung = Rate des ES-Komplexabbaus

Die Gleichung kann wie folgt umgestellt werden, um [ES] zu erhalten:

Die Michaelis-Konstante Km kann wie folgt definiert werden:

Die Gleichung [ES] kann dann vereinfacht werden zu:

Da die Konzentration des Substrats die Konzentration des Enzyms bei weitem übersteigt (d. h. [S] ≫ [E]), ist die Konzentration des nicht kombinierten Substrats [S] fast gleich der Gesamtkonzentration des Substrats. Die Konzentration des nicht kombinierten Enzyms [E] ist gleich der Gesamtenzymkonzentration [E]Tminus dem kombiniert mit Substrat [ES]. Wenn wir diese Terme in die obige Gleichung einführen und nach ES auflösen, erhalten wir Folgendes:

Wir können dann diesen Term für [ES] in die obige Anfangsgeschwindigkeitsgleichung einführen, um zu erhalten:

Der Begriff k2[E]T tatsächlich repräsentiert Vmax, die maximale Geschwindigkeit. So konnten Michaelis und Menten ihre endgültige Gleichung herleiten als:

Michaelis-Konstanten wurden für viele häufig verwendete Enzyme bestimmt und liegen typischerweise im unteren millimolaren Bereich (Tabelle 6.5). Dabei ist zu beachten, dass Enzyme, die dieselbe Reaktion katalysieren, aber von unterschiedlichen Organismen stammen, sehr unterschiedliche Km Werte. Darüber hinaus kann ein Enzym mit mehreren Substraten ganz unterschiedliche Km Werte für jedes Substrat.

Tabelle 6.5 Typische Wertebereiche der Michaelis-Konstante

Ein niedriger Km Wert zeigt an, dass das Enzym nur eine geringe Menge an Substrat benötigt, um gesättigt zu werden. Daher wird die maximale Geschwindigkeit bei relativ niedrigen Substratkonzentrationen erreicht. Ein hoch Km Wert zeigt die Notwendigkeit hoher Substratkonzentrationen an, um eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen. Somit beziehen wir uns im Allgemeinen auf Km als Maß für die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat—tatsächlich ist es ein inverses Maß, wobei ein hoch Km zeigt an eine geringe Affinität und umgekehrt.

Die Km Wert sagt uns mehrere wichtige Dinge über ein bestimmtes Enzym:

  1. Ein Enzym mit niedrigem KmWert relativ zur physiologischen Substratkonzentration wird wahrscheinlich immer mit Substrat gesättigt sein und wird daher unabhängig von Schwankungen der Substratkonzentration innerhalb des physiologischen Bereichs mit einer konstanten Geschwindigkeit wirken.
  2. Ein Enzym mit hohem KmDer Wert relativ zur physiologischen Substratkonzentration wird nicht mit Substrat gesättigt, und seine Aktivität variiert daher entsprechend der Substratkonzentration, so dass die Geschwindigkeit der Produktbildung von der Verfügbarkeit des Substrats abhängt.
  3. Wirkt ein Enzym auf mehrere Substrate, ist das Substrat mit der niedrigsten KmWert wird häufig als „natürliches“ Substrat dieses Enzyms angenommen, obwohl dies möglicherweise nicht in allen Fällen zutrifft.
  4. Wenn zwei Enzyme (mit ähnlichen Vmax) in verschiedenen Stoffwechselwegen um das gleiche Substrat konkurrieren, dann, wenn wir die Km Werte für die beiden Enzyme können wir die relative Aktivität der beiden Wege vorhersagen. Im Wesentlichen der Weg, der das Enzym mit dem niedrigeren KmWert ist wahrscheinlich der „bevorzugte Weg“, und unter den meisten Bedingungen fließt mehr Substrat durch diesen Weg. Phosphofructokinase (PFK) ist beispielsweise das Enzym, das den ersten festgelegten Schritt im glykolytischen Stoffwechselweg katalysiert, der Energie in Form von ATP für die Zelle erzeugt, während Glucose-1-Phosphat-Uridylyltransferase (GUT) ein Enzym zu Beginn des Stoffwechselweges ist führt zur Synthese von Glykogen (einem Energiespeichermolekül). Beide Enzyme verwenden Hexosemonophosphate als Substrate, aber die Kmvon PFK für sein Substrat ist niedriger als von GUT für sein Substrat. Somit ist bei niedrigeren zellulären Hexosephosphatkonzentrationen PFK aktiv und GUT weitgehend inaktiv. Bei höheren Hexosephosphatkonzentrationen sind beide Wege aktiv. Dies bedeutet, dass die Zellen Glykogen nur in Zeiten des Überflusses speichern und immer dem Weg der ATP-Produktion den Vorzug geben, der die essentiellere Funktion ist.

Sehr oft ist eine Schätzung nicht möglich Km Werte aus einer direkten Auftragung der Geschwindigkeit gegen die Substratkonzentration (wie in Abbildung 6.6) gezeigt, da wir keine ausreichend hohen Substratkonzentrationen verwendet haben, um auch nur annähernd die maximale Geschwindigkeit abzuschätzen, und wir daher die halbmaximale Geschwindigkeit nicht auswerten können und somit Km. Glücklicherweise können wir unsere experimentellen Daten etwas anders darstellen, um diese Werte zu erhalten. Die am häufigsten verwendete Alternative ist das Lineweaver-Burk-Diagramm (oft als doppelt-reziprokes Diagramm bezeichnet). Dieses Diagramm linearisiert die hyperbolische Kurvenbeziehung, und die erzeugte Linie ist leicht zu extrapolieren, was die Auswertung von . ermöglicht Vmaxund Km.

Wenn wir zum Beispiel nur die ersten sieben Datenpunkte in Abbildung 6.6 erhalten hätten, hätten wir Schwierigkeiten mit der Schätzung Vmax aus einem direkten Plot, wie in Abbildung 6.7a gezeigt. Wie in Abbildung 6.7b gezeigt, werden die Daten jedoch linearisiert, wenn diese sieben Punkte in einem Diagramm von 1/Geschwindigkeit gegen 1/Substratkonzentration (dh ein doppelt-reziprokes Diagramm) aufgetragen werden, und die Linie kann leicht auf die extrapoliert werden links, um Achsenabschnitte sowohl auf der y-Achse als auch auf der bereitzustellen
x-Achse, von der Vmax und Km, bzw. ausgewertet werden.

Abbildung 6.7 Michaelis-Menton-Kinetik. (a) Direktes Diagramm der Daten (b) Lineweaver-Burk-Diagramm der gleichen kinetischen Daten.

Ein wesentlicher praktischer Nachteil der Verwendung des Lineweaver-Burk-Plots ist der übermäßige Einfluss, den es auf Messungen bei den niedrigsten Substratkonzentrationen hat. Diese Konzentrationen sind möglicherweise am fehleranfälligsten (aufgrund von Schwierigkeiten bei der Herstellung mehrerer Verdünnungen) und führen zu Reaktionsgeschwindigkeiten, die, weil sie langsam sind, auch am anfälligsten für Messfehler sein können. Wie in Abbildung 8 gezeigt, haben solche Punkte bei der Transformation im Lineweaver-Burk-Diagramm häufig einen signifikanten Einfluss auf die aus den Daten geschätzte Linie der besten Anpassung und damit auf die extrapolierten Werte von beiden Vmax und Km. Die beiden in Abbildung 8 gezeigten Punktesätze sind bis auf den einzigen Punkt oben rechts identisch, der (aufgrund der doppelten Reziprozität des Diagramms) einen einzelnen Punkt widerspiegelt, der von einer sehr niedrigen Substratkonzentration und einer niedrigen Reaktionsgeschwindigkeit abgeleitet wird. Dieser einzelne Punkt kann jedoch einen enormen Einfluss auf die Linie der besten Anpassung und die dazugehörigen Schätzungen der kinetischen Konstanten haben.

Abbildung 6.8 Lineweaver-Burk-Plot ähnlicher kinetischer Daten, die sich nur in einem einzigen Datenpunkt unterscheiden (Endgültiger Datenpunkt (a) 1/v 0,03 bei 1/S von 0,2 und (b) 1/v 0,031 bei 1/S von 0,18).

Tatsächlich gibt es andere kinetische Diagramme, die verwendet werden können, einschließlich des Eadie-Hofstee-Diagramms, des Hanes-Diagramms und des Eisenthal-Cornish-Bowden-Diagramms, die weniger anfällig für solche Probleme sind. In der Hausaufgabe zur Enzymkinetik experimentieren Sie mit diesen anderen Arten von Linearisierungstechniken.

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6.6 Enzyme werden von pH und Temperatur beeinflusst

Verschiedene Umweltfaktoren können die Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen durch reversible oder irreversible Veränderungen der Proteinstruktur beeinflussen. Die Auswirkungen von pH und Temperatur sind im Allgemeinen gut verstanden.
Die meisten Enzyme haben ein charakteristisches pH-Optimum, bei dem die Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion maximal ist und oberhalb und unterhalb dessen die Geschwindigkeit abnimmt (Abbildung 6.9).

Abbildung 6.9 Das pH-Profil von β-Glucosidase.

Das pH-Profil hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Wenn sich der pH-Wert ändert, kann sich die Ionisierung von Gruppen sowohl am aktiven Zentrum des Enzyms als auch auf dem Substrat ändern, was die Bindungsgeschwindigkeit des Substrats an das aktive Zentrum beeinflusst. Diese Effekte sind oft reversibel. Nehmen wir zum Beispiel ein Enzym mit einem optimalen pH-Wert (pHopt) von 7,0 und bringen es in eine Umgebung mit pH 6,0 oder 8,0, können die Ladungseigenschaften des Enzyms und des Substrats suboptimal sein, so dass die Bindung und damit die Reaktionsgeschwindigkeit verringert werden. Stellt man dann den pH-Wert wieder auf 7,0 ein, werden die optimalen Ladungseigenschaften und damit die maximale Aktivität des Enzyms oft wiederhergestellt.

Wenn wir das Enzym jedoch in eine extremere saure oder alkalische Umgebung bringen (z ), können sie durchaus Veränderungen in der Konformation (Form) des Proteins hervorrufen, so dass bei einer Rückkehr auf pH 7,0 die ursprüngliche Konformation und damit die volle katalytische Aktivität des Enzyms nicht wiederhergestellt wird. Es sollte beachtet werden, dass der optimale pH-Wert eines Enzyms möglicherweise nicht mit dem seiner normalen intrazellulären Umgebung identisch ist. Dies deutet darauf hin, dass der lokale pH-Wert einen kontrollierenden Einfluss auf die Enzymaktivität ausüben kann.

Die Auswirkungen der Temperatur auf die Enzymaktivität sind recht komplex und können als zwei gleichzeitig, aber in entgegengesetzte Richtungen wirkende Kräfte betrachtet werden. Mit steigender Temperatur nimmt die Geschwindigkeit der Molekülbewegung und damit die Reaktionsgeschwindigkeit zu, gleichzeitig kommt es jedoch zu einer fortschreitenden Inaktivierung durch Denaturierung des Enzymproteins. Diese wird mit steigender Temperatur stärker ausgeprägt, so dass ein scheinbares Temperaturoptimum (Topt) beobachtet wird (Abbildung 6.10).

Abbildung 6.10 Der Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität.

Die thermische Denaturierung ist zeitabhängig, und für ein Enzym hat der Begriff „optimale Temperatur“ nur eine geringe Bedeutung, es sei denn, die Dauer der Einwirkung dieser Temperatur wird aufgezeichnet. Die thermische Stabilität eines Enzyms kann bestimmt werden, indem man das Protein zunächst für einen festgelegten Zeitraum einem Temperaturbereich aussetzt und anschließend seine Aktivität bei einer günstigen Temperatur (z. B. 25°C) misst.

Die Temperatur, bei der die Denaturierung wichtig wird, variiert von Enzym zu Enzym. Normalerweise ist sie unter 30°C vernachlässigbar und beginnt oberhalb von 40°C spürbar zu werden. Typischerweise zeigen Enzyme aus mikrobiellen Quellen eine viel höhere thermische Stabilität als solche aus Säugetierquellen, und Enzyme aus extrem thermophilen Mikroorganismen wie Thermolysin (eine Protease aus Bacillus thermoproteolyticus) und Taq-Polymerase (eine DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus), könnte bei 70 °C vollständig thermostabil sein und sogar bei 100 °C noch ein beträchtliches Aktivitätsniveau beibehalten.

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6.7 Enzyme sind empfindlich gegenüber Inhibitoren

Als Inhibitoren werden Substanzen bezeichnet, die die Aktivität einer enzymkatalysierten Reaktion herabsetzen. Sie wirken, indem sie entweder direkt oder indirekt die katalytischen Eigenschaften des aktiven Zentrums beeinflussen. Inhibitoren können der Zelle oder ihren natürlichen Bestandteilen fremd sein. Solche der letzteren Kategorie können ein wichtiges Element der Regulation des Zellstoffwechsels darstellen. Viele Toxine und auch viele pharmakologisch aktive Wirkstoffe (sowohl illegale Medikamente als auch verschreibungspflichtige und rezeptfreie Medikamente) wirken, indem sie bestimmte enzymkatalysierte Prozesse hemmen.

Reversible Hemmung

Inhibitoren werden als reversible Inhibitoren klassifiziert, wenn sie reversibel an ein Enzym binden. Ein Molekül, das dem normalen Substrat strukturell ähnlich ist, kann in der Lage sein, reversibel an das aktive Zentrum des Enzyms zu binden und daher als kompetitiver Inhibitor. (Abbildung 6.11) Malonat ist beispielsweise ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms Succinat-Dehydrogenase, da es aufgrund seiner engen strukturellen Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Enzyms, Succinat (siehe unten), an das aktive Zentrum des Enzyms binden kann. Wenn Malonat das aktive Zentrum der Succinatdehydrogenase besetzt, verhindert es die Bindung des natürlichen Substrats Succinat, wodurch die Oxidationsrate von Succinat zu Fumarat verlangsamt (d. h. die Reaktion inhibiert wird).

Eine der Eigenschaften kompetitiver Inhibitoren besteht darin, dass sie bei Verwendung hoher Substratkonzentrationen vom aktiven Zentrum verdrängt werden können, wodurch die Enzymaktivität wiederhergestellt wird. So erhöhen kompetitive Inhibitoren die Km einer Reaktion, weil sie die zur Sättigung des Enzyms erforderliche Substratkonzentration erhöhen. Sie ändern sich jedoch nicht Vmax selbst.

Bei bestimmten Enzymen können hohe Konzentrationen des Substrats oder des Produkts hemmend wirken. Beispielsweise wird die Invertase-Aktivität in Gegenwart hoher Konzentrationen von Saccharose (ihrem Substrat) erheblich reduziert, während die β-Galactosidase von Aspergillus niger wird durch Galaktose (sein Produkt) stark gehemmt. Produkte einer Enzymreaktion sind einige der am häufigsten anzutreffenden kompetitiven Inhibitoren.

Abbildung 6.11 Konkurrenzhemmung. Eine kompetitive Hemmung tritt auf, wenn Substrat (S) und Inhibitor (I) beide an dieselbe Stelle des Enzyms binden. Tatsächlich konkurrieren sie um das aktive Zentrum und binden sich gegenseitig aus.

Es gibt auch andere Arten von reversiblen Inhibitoren. Nicht-kompetitive Inhibitoren reagieren mit dem Enzym an einer anderen Stelle als dem aktiven Zentrum. Daher blockiert die Bindung des Inhibitors die Substratbindungsstelle nicht physikalisch, verhindert jedoch eine nachfolgende Reaktion. Die meisten nicht-kompetitiven Inhibitoren sind chemisch nicht mit dem Substrat verwandt und ihre Hemmung kann nicht durch Erhöhung der Substratkonzentration überwunden werden. Solche Inhibitoren reduzieren in der Tat die Konzentration des aktiven Enzyms in Lösung, wodurch die Vmaxder Reaktion. Sie ändern jedoch nicht den Wert von Km.

Abbildung 6.12 Nichtkompetitive Hemmung. Eine nicht-kompetitive Hemmung tritt auf, wenn der Inhibitor (I) an einer Stelle, die von der des Substrats entfernt ist, an das Enzym bindet. Tatsächlich verändert der nicht-kompetitive Inhibitor die Konformation des Enzyms, so dass es eine reduzierte oder eingeschränkte Funktion als Katalysator hat.

Unkompetitive Hemmung ist eher selten und tritt auf, wenn der Inhibitor erst dann an das Enzym binden kann, wenn ein Substratmolekül selbst gebunden ist. Daher ist die Hemmung bei hohen Substratkonzentrationen am signifikantesten und führt zu einer Verringerung der Vmax der Reaktion. Eine nicht kompetitive Hemmung bewirkt auch eine Verringerung der Km, was etwas kontraintuitiv erscheint, da dies bedeutet, dass die Affinität des Enzyms für sein Substrat tatsächlich erhöht wird, wenn der Inhibitor vorhanden ist. Dieser Effekt tritt auf, weil die Bindung des Inhibitors an den ES-Komplex den ES-Komplex effektiv entfernt und dadurch das Gesamtgleichgewicht der Reaktion beeinflusst, was die ES-Komplexbildung begünstigt. Bemerkenswert ist jedoch, dass da beide Vmax und Km verringert werden, sind die beobachteten Reaktionsraten mit vorhandenem Inhibitor immer niedriger als ohne den nicht kompetitiven Inhibitor.

Abbildung 6.13 Nichtkompetitive Hemmung. Bei der nichtkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor an den ES-Komplex der Reaktion und blockiert die Fähigkeit des Enzyms, die Reaktion abzuschließen.

Die Wirkungen reversibler Inhibitoren können anhand des Lineweaver-Burk-Diagramms, wie in Abbildung 6.14 dargestellt, leicht identifiziert werden.

Abbildung 6.14 Lineweaver-Burk-Diagramme von reversiblen Inhibitoren. Ungehemmte Enzymprofile sind in Rot dargestellt, wohingegen Reaktionen, bei denen schrittweise Inhibitoren vorhanden sind, in Grün dargestellt sind. (A) kompetitive Hemmung, (B) nicht-kompetitive Hemmung und (C) nicht-kompetitive Hemmung.

Irreversible Hemmstoffe und Gifte

Bindet ein Inhibitor dauerhaft an ein Enzym, spricht man von einem irreversibler Inhibitor. Viele irreversible Inhibitoren binden kovalent an die Enzyme, die sie hemmen, wodurch ihre Struktur dauerhaft verändert wird. Somit sind viele irreversible Inhibitoren daher potente Toxine.

Organophosphorverbindungen wie Diisopropylfluorphosphat (DFP) hemmen die Aktivität der Acetylcholinesterase, indem sie kovalent mit einem wichtigen Serinrest reagieren, der sich im aktiven Zentrum des Enzyms befindet. Der physiologische Effekt dieser Inaktivierung ist eine Störung der Neurotransmitter-Inaktivierung an den Synapsen von Nerven, was zur ständigen Ausbreitung von Nervenimpulsen führt, die Muskelkrämpfe verursachen und zum Tod führen können. DFP wurde ursprünglich während des Zweiten Weltkriegs von den Briten als chemischer Kampfstoff bewertet, und modifizierte Versionen dieser Verbindung werden heute häufig als Organophosphat-Pestizide verwendet, darunter Parathion und Malathion (Abbildung 6.15). Bemerkenswerterweise ist DFP auch ein potenter Inhibitor des Proteaseenzyms des Herpes Simplex Virus und wurde verwendet, um die Dynamik des aktiven Zentrums dieses Proteins zu untersuchen (Abbildung 6.15). Viele Medikamente wirken auch als irreversible Inhibitoren, einschließlich der β-Lactam-Antibiotika wie Penicillin.

Abbildung 6.15 Organophosphate sind irreversible Inhibitoren. (A) Struktur von Diisopropylfluorophosphat (DFP), Malathion und Parathion, (B) Irreversible Hemmung von Enzymen durch DFP durch die kovalente Modifikation eines Serinrestes im aktiven Zentrum und (C) Kristallstruktur von Herpes Simplex Virus Protease/Inhibitor (DFP .) ) komplex. Das Serin des aktiven Zentrums (gelb) wurde phosphonyliert, was zu einer irreversiblen Hemmung führte. Aus PDB 1AT3 gerendert.

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6.8 Allosterische Regulatoren und die Kontrolle der Enzymaktivität

Nachdem man viel Zeit damit verbracht hat, sich mit der Enzymkinetik und der Michaelis-Menten-Beziehung zu befassen, ist es oft ziemlich beunruhigend festzustellen, dass einige der wichtigsten Enzyme tatsächlich solche Eigenschaften nicht aufweisen. Allosterische Enzyme sind wichtige regulatorische Enzyme, die die Aktivitäten von Stoffwechselwegen kontrollieren, indem sie auf Inhibitoren und Aktivatoren reagieren. Diese Enzyme zeigen tatsächlich eine sigmoidale (S-förmige) Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration (Abbildung 6.16), anstatt der üblichen hyperbolischen Beziehung. So gibt es für allosterische Enzyme einen Bereich, in dem die Aktivität niedriger ist als die eines äquivalenten „normalen“ Enzyms, und auch einen Bereich, in dem die Aktivität höher ist als der eines äquivalenten „normalen“ Enzyms, mit einem schnellen Übergang zwischen diesen beiden Phasen. Dies ist eher wie ein Schalter, der schnell von „aus“ (geringe Aktivität) auf „ein“ (volle Aktivität) umgestellt werden kann.

Abbildung 6.16 Aktivitäts-/Substrat-Profile von allosterischen (offene Kreise) und nicht-allosterischen (ausgefüllten Kreisen) Enzymen mit derselben Affinität und Maximalgeschwindigkeit.

Die meisten allosterischen Enzyme sind polymer, das heißt, sie bestehen aus mindestens zwei (und oft viel mehr) einzelnen Polypeptidketten. Sie haben auch mehrere aktive Stellen, an denen das Substrat binden kann. Ein Großteil unseres Verständnisses der Funktion allosterischer Enzyme stammt aus Studien mit Hämoglobin (Hb), das zwar kein Enzym ist, aber ähnlich kooperativ Sauerstoff bindet und damit auch diesen sigmoidalen Zusammenhang zeigt. Allosterische Enzyme haben anfangs eine geringe Affinität für das Substrat, aber wenn ein einzelnes Substratmolekül bindet, kann dies einige Bindungen innerhalb des Enzyms aufbrechen und dadurch die Form des Proteins ändern, so dass die verbleibenden aktiven Zentren mit einer höheren Affinität binden können. Daher werden allosterische Enzyme oft so beschrieben, dass sie sich von a angespannter Zustand oder T-Zustand (geringe Affinität), bei der kein Substrat gebunden ist, an a entspannter Zustand oder R-Zustand (hohe Affinität) als Substrat bindet. Andere Moleküle können auch an allosterischen Enzymen an zusätzlichen regulatorischen Stellen (d. h. nicht an der aktiven Stelle) binden. Moleküle, die das Protein in seinem T-Zustand stabilisieren, wirken daher als allosterische Inhibitoren, während Moleküle, die das Protein in seinen R-Zustand bringen, als allosterische Aktivatoren oder Promotoren wirken.

Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, das aus zwei Alpha-Untereinheiten und zwei Beta-Untereinheiten besteht. Es ist homolog mit dem monomeren sauerstoffbindenden Protein Myoglobin. Wie in Abbildung 6.17 zu sehen ist, ergibt die Sauerstoffbindung an Myoglobin ein hyperbolisches Standardprofil, während Hämoglobin eine sigmoidale Sauerstoffbindung zeigt. Das sigmoidale kinetische Profil von Hämoglobin weist darauf hin, dass die Sauerstoffbindung Kooperative oder dass die Bindung eines Sauerstoffs an eine Untereinheit die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass Sauerstoff an eine andere Untereinheit bindet.

Abbildung 6.17 Vergleich von Myoglobin (A) und Hämoglobin (B) Strukturen und (C) Bindungskinetik mit Sauerstoff.

Die Konzertiertes Modell, auch bekannt als die Symmetriemodell, von Hämoglobin wird verwendet, um die Kooperationbei der Sauerstoffbindung sowie den Übergängen von Proteinen, die aus identischen Untereinheiten bestehen. Es konzentriert sich auf die beiden Zustände des Hämoglobins, die T- und R-Zustände. Der T-Zustand des Hämoglobins ist angespannter, da er in der Desoxyhämoglobin-Form vorliegt, während der R-Zustand des Hämoglobins entspannter ist als in der Oxyhämoglobin-Form. Der T-Zustand ist aufgrund der Untereinheit-Untereinheit-Wechselwirkungen eingeschränkt, während der R-Zustand aufgrund der Fähigkeit zur Sauerstoffbindung flexibler ist. Der Unterschied zwischen Desoxyhämoglobin und Oxyhämoglobin besteht darin, dass die “Deoxy”-Form keinen Sauerstoff enthält und die “oxy”-Form stark an Sauerstoff gebunden ist. Die Bindung von Sauerstoff an einer Stelle erhöht oder erleichtert die Bindungsaffinität an anderen aktiven Stellen. Somit wird eine sigmoidale Kurve für die Sauerstoffbindungskinetik von Hämoglobin beobachtet. Wie in Abbildung 6.18 zu sehen ist, zeigt das konzertierte Modell des Hämoglobins, dass die Bindung eines Sauerstoffs an ein aktives Zentrum die Wahrscheinlichkeit einer anderen Sauerstoffbindung an die anderen aktiven Zentren im Hämoglobin erhöht. Diese Fähigkeit ist bekannt als Kooperativität oder kooperative Bindung. Insgesamt verschiebt die Sauerstoffbindung das Gleichgewicht in Richtung R-Zustand. Dies bedeutet, dass bei hohen Sauerstoffkonzentrationen die R-Form vorherrscht und bei niedrigeren Sauerstoffkonzentrationen die T-Form vorherrscht. Allosterische Effektoren von Hämoglobin, wie 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG), wirken, indem sie das Gleichgewicht in Richtung oder weg vom T-Zustand verschieben, je nachdem, ob es sich um einen allosterischen Inhibitor oder einen allosterischen Promotor handelt. Dieses Modell zeigt die Extremfälle von R- und T-Übergängen. In einem realen System werden die Eigenschaften beider Modelle benötigt, um das Verhalten von Hämoglobin zu erklären.

Abbildung 6.18 Dynamik der Sauerstoffbindung in Hämoglobin. Wie in (A) oben gezeigt, wird der angespannte Zustand (T-Zustand) von Hämoglobin begünstigt, wenn die Sauerstoffbindung gering ist. Das Tetramer wechselt unter Sauerstoffbindung vom T-Zustand in den entspannten Zustand (R-Zustand). Tatsächlich erhöht die Bindung eines Sauerstoffs an eine Untereinheit die Wahrscheinlichkeit einer Sauerstoffbindung an andere Untereinheiten, bekannt als Kooperation. (B) zeigt die grafische Darstellung der Bindung von Hämoglobin (Hb) an Sauerstoff, der zwischen dem T-Zustand und dem R-Zustand übergeht.

Der Bohr-Effekt

Der Bohr-Effekt ist ein physiologisches Phänomen, das erstmals 1904 vom dänischen Physiologen Christian Bohr beschrieben wurde: Die Sauerstoffbindungsaffinität des Hämoglobins steht in umgekehrter Beziehung sowohl zum Säuregehalt als auch zur Kohlendioxidkonzentration. Das Diagramm unten zeigt die Wirkung des pH-Werts auf O2 Bindung an Hb. Die experimentelle Beobachtung ist, dass bei pH 7,2 und 20 Torr mehr O2 unbelastet ist als bei pH 7,6 (Abbildung 6.19).

Abbildung 6.19 Hämoglobin-Sauerstoffbindung ist pH-abhängig.

Um über die Grundlage dieses pH-Effekts nachzudenken, erinnern Sie sich an drei wichtige Faktoren: (1) CO2/HCO3 – existieren im Gleichgewicht innerhalb biologischer Systeme und können den Gesamt-pH-Wert beeinflussen, (2) DesoxyHb ist eine stärkere Base als O2•Hb und (3) in den roten Blutkörperchen (RBCs) gibt es ein Enzym namens Carboanhydrase, das die Hydratation von CO . katalysiert2 durch Wasser zu HCO3 – .


Die obigen Gleichungen können verwendet werden, um zu beschreiben, wie Hämoglobin die Entladung von O . maximiert2 im Gewebe und Entladung von CO2 in der Lunge.

Erstes Beispiel:Im Muskel wird während des Trainings Glukose in CO . umgewandelt2. Das CO2 diffundiert dann zu den Kapillaren und Erythrozyten und äquilibriert zu H + und HCO3 –. Einige der Seitenketten von Hb wirken als Puffer. Die H + s binden an DesoxyHb und verschieben so das Gleichgewicht nach rechts, wodurch mehr O . freigesetzt wird2.

Zweites Beispiel: Das DesoxyHb wird durch das Kreislaufsystem zurück in die Lunge transportiert, wo es O . aufnimmt2. Ö2 verschiebt das Gleichgewicht nach links und erzeugt H + . Die Protonen reagieren dann mit HCO3 – um CO . zu erzeugen2 und H2O. Das CO2 ausgeatmet wird.

Insgesamt zeigt die Analyse der biologischen Aktivität von Hämoglobin, dass die Regulierung der Aktivität eines einzelnen Proteins komplex ist und an verschiedenen Stellen im Körper oder bei Exposition gegenüber allosterischen Effektoren unterschiedlich sein kann.

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6.9 Herkunft, Reinigung und Verwendung von Enzymen

Enzyme sind allgegenwärtig

Enzyme sind essentielle Bestandteile von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, da sie die komplexen Reaktionen des Zellstoffwechsels katalysieren und koordinieren. Bis in die 1970er Jahre betrafen die meisten kommerziellen Anwendungen von Enzymen tierische und pflanzliche Quellen. Zu dieser Zeit wurden Bulk-Enzyme im Allgemeinen nur in der Lebensmittelindustrie verwendet, und Enzyme aus Tieren und Pflanzen wurden bevorzugt, da sie als frei von Toxizitäts- und Kontaminationsproblemen angesehen wurden, die mit Enzymen von
mikrobielle Herkunft. Als die Nachfrage jedoch wuchs und sich die Fermentationstechnologie entwickelte, wurden die wettbewerbsfähigen Kosten mikrobieller Enzyme erkannt und sie wurden immer häufiger verwendet. Mikrobielle Enzyme haben gegenüber Enzymen aus pflanzlichen und tierischen Quellen wirtschaftliche, technische und ethische Vorteile, die nun skizziert werden.

Wirtschaftliche Vorteile

Die schiere Menge an Enzym, die in kurzer Zeit und in einer kleinen Produktionsanlage hergestellt werden kann, begünstigt den Einsatz von Mikroorganismen sehr. Bei der Herstellung von Rennin (einem Milchgerinnungsenzym, das bei der Käseherstellung verwendet wird) wird beispielsweise traditionell das Enzym verwendet, das aus dem Magen eines Kalbes (einer jungen Kuh, die noch von der Muttermilch ernährt) gewonnen wird. Die durchschnittliche Labmenge, die aus dem Magen eines Kalbes gewonnen wird, beträgt 10 kg, und es dauert mehrere Monate intensiver Landwirtschaft, um ein Kalb zu produzieren. Im Vergleich dazu kann ein 1000-Liter-Fermenter von rekombinantem Bacillus subtilis innerhalb von 12 Stunden 20 kg Enzym produzieren. Somit ist das mikrobielle Produkt wirtschaftlich eindeutig vorzuziehen und frei von ethischen Problemen, die mit der Verwendung von Tieren verbunden sind. Tatsächlich wird der meiste Käse, der heute in Supermärkten verkauft wird, aus geronnener Milch hergestellt
mit mikrobiellen Enzymen (also für Vegetarier geeignet).

Ein weiterer Vorteil der Verwendung mikrobieller Enzyme ist ihre leichte Extraktion. Viele der in biotechnologischen Prozessen verwendeten mikrobiellen Enzyme werden extrazellulär sezerniert, was ihre Extraktion und Reinigung stark vereinfacht. Mikrobielle intrazelluläre Enzyme sind auch oft leichter zu erhalten als die entsprechenden tierischen oder pflanzlichen Enzyme, da sie im Allgemeinen weniger Extraktions- und Reinigungsschritte erfordern.

Tierische und pflanzliche Quellen müssen in der Regel zur Extraktionsanlage transportiert werden, wohingegen bei Verwendung von Mikroorganismen in der Regel dieselbe Anlage für Produktion und Extraktion genutzt werden kann. Darüber hinaus befinden sich kommerziell wichtige tierische und pflanzliche Enzyme oft nur innerhalb eines Organs oder Gewebes, so dass das verbleibende Material im Wesentlichen ein Abfallprodukt ist, das entsorgt werden muss.

Schließlich zeigen Enzyme aus pflanzlichen und tierischen Quellen große Ertragsschwankungen und sind möglicherweise nur zu bestimmten Jahreszeiten verfügbar, während keines dieser Probleme mit mikrobiellen Enzymen verbunden ist.

Technische Vorteile

Mikrobielle Enzyme haben oft Eigenschaften, die sie für eine kommerzielle Nutzung besser geeignet machen. Im Vergleich zu Enzymen aus tierischen und pflanzlichen Quellen ist die Stabilität mikrobieller Enzyme meist hoch. Beispielsweise ist die Hochtemperaturstabilität von Enzymen aus thermophilen Mikroorganismen oft nützlich, wenn der Prozess bei hohen Temperaturen betrieben werden muss (z. B. während der Stärkeverarbeitung).

Mikroorganismen sind auch einer genetischen Modifikation sehr zugänglich, um neue oder veränderte Enzyme zu produzieren, wobei relativ einfache Verfahren wie die Plasmidinsertion verwendet werden. Die genetische Manipulation von Tieren und Pflanzen ist technisch viel schwieriger, teurer und nach wie vor Gegenstand erheblicher ethischer Bedenken.

Enzyme können intrazellulär oder extrazellulär sein

Obwohl viele Enzyme in der Zelle zurückgehalten werden und sich in bestimmten subzellulären Kompartimenten befinden können, werden andere in die Umgebung freigesetzt. Die meisten Enzyme im industriellen Einsatz sind extrazelluläre Proteine ​​aus Pilzquellen (z. Aspergillus Spezies) oder bakterielle Quellen (z.B. Bazillus Spezies). Beispiele hierfür umfassen &agr;-Amylase, Cellulase, Dextranase, Proteasen und Amyloglucosidase. Viele andere Enzyme für den nicht-industriellen Gebrauch sind intrazellulär und werden in viel kleineren Mengen von der Zelle produziert. Beispiele hierfür umfassen Asparaginase, Katalase, Cholesterinoxidase, Glucoseoxidase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.

Enzymreinigung

Die Aktivität des Enzyms in Bezug auf das gesamte vorhandene Protein (d. h. die spezifische Aktivität) kann bestimmt und als Maß für die Enzymreinheit verwendet werden. Um das Enzym zu reinigen, können verschiedene Methoden zur Entfernung von kontaminierendem Material verwendet werden (die ausführlich in Kapitel 3 diskutiert werden). Enzyme, die als diagnostische Reagenzien und in der klinischen Therapeutik verwendet werden, werden normalerweise in einem hohen Reinheitsgrad hergestellt, da großer Wert auf die Spezifität der katalysierten Reaktion gelegt wird. Je höher der Reinigungsgrad,
desto höher sind die Kosten der Enzymproduktion. Im Fall vieler industrieller Massenenzyme ist der Reinigungsgrad weniger wichtig, und solche Enzyme können oft als sehr rohe Zubereitungen von Kulturbrühen verkauft werden, die das Wachstumsmedium, Organismen (ganz oder fragmentiert) und interessierende Enzyme enthalten. Selbst wenn die billigsten Massenenzyme verwendet werden (z. B. Proteasen zur Verwendung in Waschpulvern), können die Enzymkosten jedoch etwa 5–10 % des Endproduktwerts ausmachen.

Vorbehandlung

Am Ende einer Fermentation, bei der ein an dem erforderlichen Enzym reicher Mikroorganismus kultiviert wurde, kann die Brühe schnell auf 5°C abgekühlt werden, um weiteres mikrobielles Wachstum zu verhindern und das Enzymprodukt zu stabilisieren. Der pH kann auch eingestellt werden, um die Enzymstabilität zu optimieren. Wenn der enzymproduzierende Organismus ein Pilz ist, kann dieser durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt werden. Wenn die Enzymquelle bakteriell ist, werden die Bakterien oft mit Aluminiumsulfat oder Calciumchlorid ausgeflockt, wodurch die Ladung auf den Bakterienmembranen aufgehoben wird, wodurch sie verklumpen und somit aus der Suspension kommen.

Behandlung

Extrazelluläre Enzyme finden sich in der flüssigen Komponente des Vorbehandlungsprozesses. Intrazelluläre Enzyme erfordern jedoch eine umfassendere Behandlung. Die Biomasse kann durch Zentrifugation konzentriert und gewaschen werden, um Mediumkomponenten zu entfernen. Die zelluläre Komponente muss dann aufgebrochen werden, um den Enzymgehalt freizusetzen. Dies kann mit einem oder mehreren der folgenden Verfahren erfolgen:
• Kugelmahlen (mit Glasperlen)
• enzymatische Entfernung der Zellwand
• Gefrier-Auftau-Zyklen
• Flüssigkeitsscherung durch eine kleine Öffnung bei hohem Druck (z. B. in einer French Press)
• osmotischer Schock
• Beschallung.

Die Abtrennung von Enzymen aus der resultierenden Lösung kann dann eine Vielzahl von Trennungen beinhalten
Prozesse, die oft sequentiell eingesetzt werden, wie in Kapitel 3 beschrieben.

Veredelung von Enzymen

Enzyme sind antigen, und da in den späten 1960er Jahren Probleme auftraten, als Arbeiter in der Fertigung nach dem Einatmen von Enzymstäuben schwere allergische Reaktionen zeigten, wurden nun Verfahren zur Verringerung der Staubbildung eingeführt. Dabei werden Enzyme nach Möglichkeit flüssig zugeführt oder die Partikelgröße von Trockenpulvern von 10 µm auf 200–500 µm erhöht, entweder um prillen (Mischen des Enzyms mit Polyethylenglykol und Herstellen von kleinen Kügelchen durch Zerstäubung) oder marumerisierend (Enzym mit Bindemittel und Wasser mischen, lange Filamente extrudieren, in einem Marumerizer zu Kugeln umwandeln, trocknen und mit
eine Wachsschicht).

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6.10 Industrielle Enzymologie

Obwohl viele industrielle Prozesse, wie die Käseherstellung, traditionell unreine Enzymquellen verwendet haben, oft von Tieren oder Pflanzen, ging die Entwicklung eines Großteils der modernen industriellen Enzymologie Hand in Hand mit der kommerziellen Nutzung mikrobieller Enzyme. Diese wurden um 1890 in den Westen eingeführt, als sich der japanische Wissenschaftler Jokichi Takamine in den USA niederließ und eine auf japanischer Technologie basierende Enzymfabrik gründete. Das Hauptprodukt war Takadiastase, eine Mischung aus amylolytischen und proteolytischen
Enzyme, die durch Kultivierung des Pilzes hergestellt werden Aspergillus oryzae auf Reis oder Weizenkleie. Takadiastase wurde in den USA erfolgreich als Verdauungshilfe zur Behandlung von Dyspepsie vermarktet, von der damals angenommen wurde, dass sie aus der unvollständigen Verdauung von Stärke resultiert.

Bakterielle Enzyme wurden in Frankreich von August Boidin und Jean Effront entwickelt, die 1913 herausfanden, dass Bacillus subtilis erzeugten eine hitzestabile α-Amylase, wenn sie in einem flüssigen Medium gezüchtet wurden, das durch Extraktion von Malz oder Getreide hergestellt wurde. Das Enzym wurde vor allem in der Textilindustrie zur Entfernung der kettenschützenden Stärke bei der Baumwollherstellung eingesetzt.

Um 1930 wurde festgestellt, dass Pilzpektinasen bei der Herstellung von Fruchtprodukten verwendet werden können. In den Folgejahren wurden mehrere andere Hydrolasen entwickelt und kommerziell vertrieben (z. B. Pectosanase, Cellulase, Lipase), aber die Technologie war noch relativ rudimentär.

Nach dem Zweiten Weltkrieg erlebte die Fermentationsindustrie eine rasante Entwicklung, als Methoden zur Herstellung von Antibiotika entwickelt wurden. Diese Methoden wurden bald für die Produktion von Enzymen adaptiert. In den 1960er Jahren wurde Glucoamylase als Mittel zur Hydrolyse von Stärke eingeführt und ersetzte die saure Hydrolyse. Anschließend wurden in den 1960er und 1970er Jahren Proteasen in Waschmittel eingebaut und dann Glucoseisomerase eingeführt, um Süßstoffe in Form von High-Fructosesirups herzustellen. Seit den 1990er Jahren wurden Lipasen in Waschpulver eingebaut und eine Vielzahl von immobilisierten Enzymverfahren entwickelt (siehe Abschnitt zur Enzymimmobilisierung), von denen viele intrazelluläre Enzyme verwenden.

Derzeit werden Enzyme in vier verschiedenen Bereichen des Handels und der Technologie verwendet (Tabelle 6):


Aktivitäten

Der Einsatz von Lebensmittelenzymen wird vom Gremium für Lebensmittelkontaktmaterialien, Enzyme, Aromen und Verarbeitungshilfsstoffe (CEF) der EFSA durchgeführt. Im Jahr 2009 veröffentlichte das CEF-Gremium Leitlinien für Antragsteller zu den Daten, die für die Sicherheitsbewertung von Lebensmittelenzymen benötigt werden. Darin werden das Format eines förmlichen Antrags auf die Sicherheitsbewertung eines Lebensmittels, die erforderlichen administrativen und technischen Daten sowie der Umfang der im Allgemeinen erforderlichen toxikologischen Prüfungen erläutert. Unter den erforderlichen Daten müssen die Antragsteller Informationen zur Identität der Ausgangsmaterialien, zum Herstellungsverfahren, eine Bewertung und toxikologische Daten (außer in den oben genannten Fällen) einreichen. Im Jahr 2011 veröffentlichte die EFSA eine ergänzende Erläuterung, die weitere Erläuterungen und praktische Beispiele für Datenanforderungen enthält.

In Bezug auf die Liste der qualifizierten Sicherheitsvermutungen () der EFSA möchte die Behörde zum frühestmöglichen Zeitpunkt Informationen über Mikroorganismen erhalten, die entweder bereits auf der Liste stehen oder möglicherweise in die Liste aufgenommen werden und voraussichtlich ebenfalls eingereicht werden als Teil einer Lebensmittelenzymanwendung. Informationen, einschließlich der für die Enzymproduktion verwendeten Mikroben und der beabsichtigten Verwendung, sind zu senden an: FIP [at] efsa.europa.eu .

Hauptarbeiten in Arbeit

Die EFSA hat in Bezug auf Lebensmittelenzyme zwei Hauptfunktionen:

  • Bewertung aller Enzyme, die derzeit in der Europäischen Union (EU) während einer durch die EU-Gesetzgebung festgelegten Einreichungsfrist vermarktet werden oder vermarktet werden sollen.
  • Bewertung von Anträgen auf Zulassung neuer Enzyme, nachdem eine EU-Liste zugelassener Enzyme erstellt wurde.

Materialen und Methoden

Pflanzenmaterialien

27 Pflanzenproben wurden vor Ort von Pflanzensamenlieferanten in Ägypten gekauft (Tabelle 1). Sie wurden für diese Studie ausgewählt, weil sie unterschiedliche Mengen an Polysacchariden, Proteinen und Polyphenolen aufweisen und zu sieben verschiedenen Ordnungen gehören. Diese Pflanzenproben wurden hauptsächlich aus verschiedenen Ländern in Europa, Amerika und Asien importiert. Zusätzlich wurden vier Tierfutterproben (D1, D2, D3 und D4) von verschiedenen Lieferanten bezogen. Diese vier Diätproben enthalten Mischungen aus Sojabohnen und Mais.

Reagenzien

3× Extraktionspuffer mit: 3% CTAB (w/v), 1,4 M NaCl, 0,8 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M EDTA pH 8,0 (autoklaviert)

Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 v/v).

Eiskalt 100 % Isopropylalkohol

1 × TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA, pH 8,0, autoklaviert).

Modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll

3× Extraktionspuffer im Wasserbad bei 65 °C vorheizen. Fügen Sie dem 3× CTAB-Extraktionspuffer unmittelbar vor der Verwendung 0,3% 2-β-Mercaptoethanol hinzu.

Mahlen Sie 50 mg Pflanzenproben in flüssigem Stickstoff mit vorgekühltem Mörser und Pistill zu Pulver. Noch im Mörser 800 µl des vorgewärmten 3× CTAB-Extraktionspuffers zu den gemahlenen Pflanzenproben geben und mit dem Stößel vorsichtig schwenken.

Die Probenmischung in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, 1 h bei 60–65 °C im Wasserbad inkubieren, alle 20 min vorsichtig mischen, indem das Röhrchen jeweils 20 Mal umgedreht wird, dann auf Raumtemperatur abkühlen.

Fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 v/v) und durch leichte Umkehr mischen.

Zentrifugieren Sie bei 13.000 U/min für 15 min bei Raumtemperatur (RT).

Überführen Sie die obere wässrige Phase, die die DNA enthält, mit einer Wide Bore Pipette vorsichtig in ein neues 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen.

Wiederholen Sie die Extraktionsschritte (iv–vi), falls erforderlich, bis die obere wässrige Phase klar ist.

Schätzen Sie das Volumen der wässrigen Phase (ca. 700 ul) und fügen Sie dann die Hälfte dieses Volumens (350 ul) 6 M NaCl hinzu und mischen Sie gut. Nacheinander 1/10 des Volumens (70 µl) 3 M Kaliumacetat zugeben und gleichzeitig mit 500 µl eiskaltem 100 % Isopropylalkohol (etwa zwei Drittel des Volumens der wässrigen Phase) mischen. Vorsichtig umdrehen, um DNA auszufällen, bis sich DNA-Fäden bilden.

Inkubieren bei − 20 °C für 30 min.

Zentrifugieren Sie bei 13.000 U/min für 5 min, verwerfen Sie den Überstand.

Drehen Sie das Röhrchen mit dem DNA-Pellet auf Seidenpapier um, um das Abtropfen des Überstands abzuschließen.

DNA-Pellet mit 500 μl 70%igem Ethanol waschen und einmal umdrehen (um restliche Salze aufzulösen und die Reinheit der DNA zu erhöhen).

Zentrifugieren Sie bei 13.000 U/min für 5 Minuten.

Entsorgen Sie 70 % Alkohol aus den Röhrchen. Drehen Sie das auf Filterpapier um und lassen Sie die Röhrchen mit Pellet bei Raumtemperatur 15 min lang an der Luft trocknen.

Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 50 μl 1 × TE-Puffer. Inkubieren Sie die DNA bei 50 ° C für 1 bis 2 h, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten.

Bis zur weiteren Verwendung bei − 20 °C lagern.

Quantitative und qualitative Analyse von DNA, die mit etablierter CTAB-Methode und modifiziertem Protokoll extrahiert wurde

DNA-Konzentration, Reinheit und Qualität

Die DNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 260 nm (A260) Absorption mit NanoDrop1000 (Thermo Scientific). Die Reinheit der DNA aus Protein- und Polysaccharid-Kontamination (Wilson und Walker 2005) wurde durch Schätzung des Absorptionsverhältnisses bei A . bewertet260/EIN280 und ein260/EIN230 bzw. Die Qualität der extrahierten DNA mit beiden Protokollen wurde auch durch Elektrophorese-Trennung für alle DNA-Proben auf 0,8% Agarosegel, gefärbt mit Ethidiumbromid (1 &mgr;g/ml), bewertet.

DNA-Verdau-Analyse

Das HindIII-Restriktionsenzym wurde verwendet, um die DNA-Proben gemäß dem Verfahren von Fang und Kollegen (1992) zu verdauen. Ungefähr 20 &mgr;g genomische DNA wurden separat 1 h lang bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym HindIII (Amersham Pharmacia Biotech. UK Ltd) verdaut. Alle gefärbten Elektrophorese-Trennmatrices für die PCR-Amplifikation und sowohl extrahierte als auch verdaute DNA-Proben wurden mit dem SYNGENE Bio Imaging Gel Documentation System (UK) aufgelöst.

Zufällige amplifizierte polymorphe DNA-Analyse

Die PCR-Amplifikation von genomischer DNA, die aus verschiedenen Pflanzensamen unter Anwendung der beiden verwendeten Protokolle extrahiert wurde, wurde unter Verwendung von zufällig amplifizierten polymorphen DNA (RAPD)-Decamer-Primern (OPZ-09) durchgeführt, die von Operon Primer Kits (Operon, USA) synthetisiert wurden. Die Primersequenz ist 5'-CAGCACTGAC-3'. Für alle Proben wurde eine PCR nach der von Devi und Kollegen (2013) beschriebenen Methode durchgeführt.

Nachweis von gentechnisch veränderten (GV) Pflanzen

Die Wirksamkeit des vorliegenden Protokolls zur Herstellung qualitativ hochwertiger DNA, die zum Nachweis genetisch veränderter Nutzpflanzen geeignet ist, wurde ebenfalls bewertet. Die isolierte genomische DNA aus verschiedenen Pflanzenproben mittels des vorliegenden Protokolls und der konventionellen Methode wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation des Neomycin-Phosphotransferase-Gens (nptII) verwendet, das als selektierbares Markergen in den Transformationsprozessen verwendet wird. Die Existenz von NPTII (173 bp Target) wurde in den in die vorliegende Arbeit aufgenommenen Pflanzensamen untersucht, wobei spezifische Primer für dieses Gen verwendet wurden (F: 5'-GGATCTCCTGTCATCT-3' und R: 5'-GGATCTCCTGTCATCT-3'). Die PCR-Amplifikation wurde in einem 25-µl-Reaktionsgemisch mit 12,75 µl DNase-freiem Wasser, 100 ng Template-DNA (2 µl), 200 µM von jedem dNTP (2,5 µl), 2,5 pmol von jedem Primer (2,5 µl), und 2,5 Einheiten taq DNA-Polymerase (0,25 µl) in einem Reaktionspuffer (2,5 µl) enthaltend 75 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 20 mM (NH4)2SO4und 0,001% BSA.

PCR-Amplifikationen wurden in einem TM Thermal Cycler (MJ Research PTC-100 Thermocycler) durchgeführt, der so programmiert war, dass er einen anfänglichen Denaturierungsschritt von 98 °C für 2 min durchführte, gefolgt von 40 Zyklen, bestehend aus 30 s bei 95 °C zur Denaturierung, 45 s at Glühtemperatur (50 °C) und 30 s bei 72 °C zur Verlängerung. Ein abschließender Extensionsschritt von 7 min bei 72 °C wurde durchgeführt. Nach Beendigung der Zyklenreaktion wurden 2 µl eines Beladungsfarbstoffs (Bromphenolblau) zu 10 µl jedes Reaktionsprodukts gegeben und durch 2% Agarosegelelektrophorese, gefärbt mit 1 µg/ml Ethidiumbromid, getrennt. PCR-Produkte wurden unter Verwendung des SYNGENE Bio Imaging Gel Documentation Systems auf das Vorhandensein einer fluoreszierenden Bande der erwarteten Basenpaar-(bp)-Größe (173 bp) analysiert.


Ethikerklärungen

Konkurrierende Interessen

Den Autoren sind keine direkten Konflikte mit dem Thema der Arbeit bekannt, M.G.V.H. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Agios Pharmaceuticals, Aeglea Biotherapetics, iTeos Therapeutics, Faeth Therapeutics und Auron Therapeutics. F. M. ist Berater für folgende Unternehmen: Amgen, Daiichi, Ideaya Biosciences, Kura Oncology, Leidos Biomedical Research, PellePharm, Pfizer, PMV Pharma und Quanta Therapeutics. F. M. ist Berater und Mitgründer für folgende Unternehmen (mit Beteiligungen einschließlich Aktienoptionen): BridgeBio, DNAtrix, Olema Pharmaceuticals und Quartz. F. M. ist wissenschaftlicher Direktor der NCI RAS Initiative am Frederick National Laboratory for Cancer Research/Leidos Biomedical Research. Keine dieser Zugehörigkeiten stellt einen Interessenkonflikt in Bezug auf dieses Papier dar.


Eigenschaften und Probleme mit Housekeeping-Genen

Die Gruppe der Housekeeping-Gene vereint einzigartige genomische und evolutionäre Merkmale. Sie haben beispielsweise kürzere Introns und Exons, einfachere Sequenzwiederholungen und ein geringeres Potential zur Nukleosomenbildung im 5'-Bereich 2 . Dennoch kämpft die Sammlung neuer Daten über mögliche Housekeeping-Gene mit denselben Zuverlässigkeitsproblemen, die sie zu kompensieren gewohnt sind. Mehrere Spleißvarianten, duplizierte Regionen, und der allgemeine unterer Ausdruck von vorgelagerte Exons verursacht durch Reverse-Transkriptase-Fehler erschweren die Interpretation der RT-PCR-Ergebnisse (Abb. 1).

Ein weiteres Problem ist die Definition der Housekeeping-Gene selbst 3 . Genügt es, nach Genen zu suchen? in allen Geweben exprimiert, oder sollen die Gene auch sein auf konstantem Niveau ausgedrückt über Gewebe? Frühe Studien übernahmen im Allgemeinen die erste Definition, und tatsächlich wurde festgestellt, dass GAPDH und andere beliebte Housekeeping-Gene für experimentelle Kontrollen erheblich von Gewebe zu Gewebe variieren. Aus diesem Grund ist es ratsam, vor Beginn eines neuen Experiments die Literatur und technische Informationen in Ihrem Fachgebiet zu überprüfen, um festzustellen, welches Gen/welche Gene andere Forscher häufig verwenden. Es wird empfohlen, für jedes Genexpressionsexperiment mehrere Housekeeping-Gene zu verwenden, um alle Auswirkungen zu berücksichtigen, die eine experimentelle Bedingung auf die Expression eines einzelnen Housekeeping-Gens haben kann.

Abbildung 1: Probleme bei der Erkennung von Housekeeping-Genen. (I) Gene mit mehreren Spleißvarianten können unterschiedliche Expressionsniveaus für verschiedene Teile des Gens aufweisen. (II) Duplikative Regionen können die Expressionsspiegelmessung verzerren. (III) Geringere Expression (im Durchschnitt) der stromaufwärts gelegenen Exons aufgrund einer unvollkommenen reversen Transkription, was zu partiellen cDNA-Molekülen führt.


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