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Warum ist es gut, Glycerin als Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Zwischenprodukte in Arzneimitteln herzustellen?

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Warum ist es gut, Glycerin als Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Zwischenprodukte in Arzneimitteln herzustellen?

Meine beste Vermutung wäre, dass es viel ATP pro Kohlenstoff produziert. Aber ich habe nichts gefunden, was meine Vermutung bestätigt.


Zum einen ist Glycerin als Substrat wirtschaftlich und ökologisch interessant. Es ist ein Nebenprodukt der Biodieselproduktion der ersten Generation, die in den letzten Jahren stark zugenommen hat. Es werden also große Mengen an Glycerin angesammelt, während wir davon wenig Gebrauch machen. Daher ist es eine Notwendigkeit geworden, Glycerin-verwendende Industrien zu entwickeln. Eine weitere Folge ist, dass Glycerin heute ein billiges und reichlich vorhandenes Substrat ist.

Der Metabolismus von Glycerin ist recht komplex und hat viele industriell relevante Endprodukte. 1,3-Propandiol und Bernsteinsäure haben beispielsweise kommerzielle Anwendungen und können von einigen Mikroorganismen direkt aus Glycerin hergestellt werden. Je nach Sorte, die Sie verwenden, benötigen Sie also möglicherweise kein schweres Stoffwechsel-Engineering.

Hier ist ein Artikel, der Ihnen helfen könnte.


Prozesscharakterisierung und Einfluss alternativer Kohlenstoffquellen und des Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnisses auf die Produktion organischer Säuren durch Aspergillus oryzae DSM1863

l -Äpfelsäure und Fumarsäure sind C4 Dicarbonsäuren und gelten als vielversprechende chemische Bausteine. Sie können als Konservierungs- und Säuerungsmittel für Lebensmittel bei der Entrostung und als Polymerisationsstarter eingesetzt werden. Formen der Gattung Aspergillus sind in der Lage, Apfelsäure in großen Mengen aus Glucose und anderen Kohlenstoffquellen herzustellen. Um das Produktionspotenzial von Aspergillus oryzae DSM 1863 wurden Produktions- und Verbrauchsraten in einem etablierten Bioreaktor-Batch-Prozess auf Basis von Glucose bestimmt. Bei 35 °C wurden in einem 168-h-Batchprozess mit Fumarsäure als Nebenprodukt bis zu 42 g/L Apfelsäure hergestellt. In längeren Schüttelkolbenexperimenten (353 h) wurde die Eignung der alternativen Kohlenstoffquellen Xylose und Glycerin bei einem Kohlenstoff-Stickstoff (C/N)-Verhältnis von 200:1 und der Einfluss unterschiedlicher C/N-Verhältnisse bei Glucosekultivierungen geprüft. Bei Verwendung von Glucose wurden 58,2 g/L Apfelsäure und 4,2 g/L Fumarsäure produziert. Bei der Anwendung von Xylose oder Glycerin werden beide organische Säuren produziert, aber die Bildung von Äpfelsäure verringerte sich auf 45,4 bzw. 39,4 g/L. Während die Fumarsäurekonzentration bei der Kultivierung mit Xylose (4,5 g/L) nicht signifikant verändert wurde, wird sie durch die Verwendung von Glycerin (9,3 g/L) deutlich erhöht. Bei Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle hatte eine Erhöhung oder Verringerung des C/N-Verhältnisses keinen Einfluss auf die Apfelsäureproduktion, aber einen enormen Einfluss auf die Fumarsäureproduktion. Die höchsten Fumarsäurekonzentrationen wurden beim höchsten C/N-Verhältnis (300:1, 8,44 g/L) und die niedrigsten beim niedrigsten C/N-Verhältnis (100:1, 0,7 g/L) bestimmt.

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Hintergrund

Glycerin ist eine traditionell wertvolle Verbindung, die in einer Vielzahl von Bereichen wie Nahrungsmitteln und Getränken, Pharmazeutika und Kosmetika verwendet wird. In den letzten Jahren hat die schnelle Entwicklung der Biokraftstoffindustrie eine große Menge an Rohglycerin als Nebenprodukt erzeugt [1]. Pro 100 kg produziertem Biodiesel werden ca. 10 kg Rohglycerin erzeugt [2]. Der Bioethanolprozess erzeugt außerdem bis zu 10 % des Gesamtzuckerverbrauchs an Glycerin. Der Überschuss an Rohglycerin, das in der Biokraftstoffindustrie produziert wird, führt zu einem dramatischen Rückgang des Glycerinpreises, was ihn zu einem Abfall mit Entsorgungskosten für viele Biodieselanlagen macht. Die Umwandlung von Rohglycerin in wertschöpfende Produkte ist dringend erforderlich und bietet auch eine gute Gelegenheit, die Wirtschaftlichkeit der Biokraftstoffwirtschaft zu verbessern. Bisher wurden sowohl chemische als auch biologische Ansätze untersucht, um Glycerin in wertvollere Produkte umzuwandeln [3–5]. Im Vergleich zur chemischen Transformation bieten biologische Wege mehrere Vorteile, wie z. B. höhere Spezifität, höhere Toleranz gegenüber Verunreinigungen, umweltfreundlicher (z. B. niedrige Temperatur/niedriger Druck) [6]. Im Vergleich zu anderen Kohlenstoffquellen (z. B. Glukose und Xylose) weist Glycerin einen höheren Reduktionsgrad auf und kann daher mehr Reduktionsäquivalente erzeugen, was die Fähigkeit zur Herstellung von Kraftstoffen und reduzierten Chemikalien mit höheren Ausbeuten verleiht [7]. Hohe Abundanz, niedriger Preis und hoher Reduktionsgrad machen Glycerin zu einem attraktiven Rohstoff für die Bioraffinerie [8].

Es gibt eine Reihe von Mikroorganismen, die Glycerin verstoffwechseln können. Die direkte Nutzung natürlicher Organismen auf industrieller Ebene wird jedoch oft durch die geringen Produktionsraten, Titer oder Ausbeuten eingeschränkt. Daher ist häufig Metabolic Engineering erforderlich, um die Stammleistung zu verbessern, einschließlich: (a) Eliminierung der Transkriptionsrepression und Enzym-Feedback-Hemmung (b) Reduzierung unerwünschter Nebenprodukte (c) Verbesserung von Bausteinen, Reduzierung der Leistungs- oder Energiezufuhr (d) Erweiterung des Substrat- und Produktportfolios und (e) Verbesserung der Belastungstoleranz gegenüber Inhibitoren und Umweltstress [9–14]. In jüngerer Zeit hat die Integration von Protein-Engineering, Systembiologie und Synthetischer Biologie in das Metabolic Engineering das Stamm-Engineering von der lokalen Modifikation zur systemweiten Optimierung erweitert. Leistungsstarke Omics-Technologien wie Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Fluxomik wurden kombiniert, um ein tiefgreifendes Verständnis des Glycerinstoffwechsels und der Regulation von Mikroorganismen auf Systemebene zu ermöglichen [15-18].

Im Allgemeinen wird Glycerin über zwei Stoffwechselwege in die Glykolyse geleitet (Abb. 1) [7]. Auf einem Weg wird Glycerin durch die NAD-abhängige Glycerin-Dehydrogenase dehydriert (gldA oder dhaD) zu Dihydroxyaceton (DHA), das dann durch Phosphoenolpyruvat (PEP)- oder ATP-abhängige Dihydroxyaceton-Kinasen (DHAK, dhaKLM) zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP). Beim anderen Weg wird Glycerin zunächst durch die ATP-abhängige Glycerinkinase phosphoryliert (glpK) zu Glycerin-3-phosphat, und letzteres wird durch die NAD-abhängige Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase weiter reduziert (glpD) zu DHAP. Der Katabolismus von Glycerin leidet unter verschiedenen genetischen und enzymatischen Regulationen. Metabolische Kontrollanalysen zeigten, dass der glykolytische Fluss während der anaeroben Glycerin-Fermentation fast ausschließlich durch Glycerin-Dehydrogenase und Dihydroxyaceton-Kinase kontrolliert wurde Escherichia coli [19]. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um den Glycerinkatabolismus und nachgelagerte Stoffwechselwege zur Herstellung verschiedener wertvoller Produkte, einschließlich Kraftstoffen, Chemikalien und Biomaterialien, zu entwickeln (Tabelle 1). In dieser Übersicht werden die jüngsten Bemühungen des Metabolic Engineering zur Entwicklung industrieller Stämme für die Glycerin-Bioraffinerie beschrieben. Insbesondere fassen und diskutieren wir systematisch verschiedene Strategien des Metabolic Engineering zur Herstellung von Diolen, organischen Säuren und Biokraftstoffen, die die wichtigsten Kategorien von Massenchemikalien in der aktuellen Biotechnologie-Industrie darstellen.

Stoffwechselwege von Glycerin zur Herstellung verschiedener Produkte. Die Produktion von Diolen, Aminosäuren, organischen Säuren und Biokraftstoffen über den Abbauweg von Glycerin wird mit verschiedenen Farben dargestellt: Diole, Blau Aminosäuren, Grün organische Säuren, Gelb Biokraftstoffe, Orange. In einigen Mikroorganismen kann Glycerin durch Glycerin-Dehydratase zu 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HPA) dehydratisiert werden. 3-HPA kann durch Alkoholdehydrogenase in 1,3-Propandiol oder durch Aldehyddehydrogenase zu 3-Hydroxypropionsäure umgewandelt werden. Glycerin kann auch auf zwei Wegen in den zentralen Stoffwechselweg gelangen: (1) Glycerinkinase und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (2) Glycerindehydrogenase und Dihydroxyacetonkinase

Metabolic Engineering zur Herstellung von Diolen aus Glycerin

Diole sind Verbindungen mit zwei Hydroxylgruppen, die ein breites Spektrum wichtiger Anwendungen als Chemikalien und Kraftstoffe haben. Die C2-C4-Diole sind die wichtigsten und werden als Monomere in der Polymerindustrie häufig verwendet. In den letzten Jahren wurde die mikrobielle Produktion von 1,3-Propandiol (1,3-PDO), 1,2-Propandiol (1,2-PDO) und 2,3-Butandiol (2,3-BDO) aus Glycerin umfassend untersucht (Abb. 1). Die Produktion von 1,3-PDO und 2,3-BDO hat kommerziellen Maßstab erreicht.

1,3-Propandiol

1,3-PDO ist ein wichtiges Diol, das in den letzten Jahren auf breites Interesse gestoßen ist [20, 21]. Von besonderem Interesse ist seine Verwendung als Monomer für die Synthese von Polyethern, Polyurethanen und Polyestern wie Polytrimethylenterephthalat (PTT). Mehrere Arten von Mikroorganismen, einschließlich Klebsiella (K. pneumoniae und K. oxytoca), Clostridien (C. butyricum und C. pasteurianum), Enterobakterien (E. agglomerans), Citrobacter (C. freundii) und Lactobazillen (L. brevis und L. buchneri), besitzen die Fähigkeit, Glycerin in 1,3-PDO umzuwandeln [22–25]. Unter den natürlichen Produzenten, K. pneumoniae und C. butyricum sind aufgrund ihrer hohen Toleranz gegenüber Glycerinhemmung und der hohen Produktion von 1,3-PDO die vielversprechendsten Arten. DuPont hat ein rekombinantes E coli die Glucose direkt für die 1,3-PDO-Produktion mit hohem Titer und hoher Ausbeute nutzen können [21]. Dieser Prozess wurde kommerzialisiert und gilt als Meilenstein des Metabolic Engineering. Mit dem dramatischen Rückgang des Glycerinpreises in den letzten Jahren wird die direkte Umwandlung von Glycerin zu 1,3-PDO wirtschaftlich konkurrenzfähig gegenüber dem auf Glucose basierenden Verfahren.

Die Herstellung von 1,3-PDO aus Glycerin ist ein Reduktionsprozess, der 1 mol NADH pro mol 1,3-PDO verbraucht. Im reduktiven Weg wird Glycerin zunächst durch B12-abhängige oder B12-unabhängige Glycerin-Dehydratase zu 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HPA) dehydratisiert und letzteres durch Alkohol-Dehydrogenase zu 1,3-PDO reduziert (Abb. 1). Die Regeneration des Reduktionsäquivalents sollte über einen oxidativen Glycerin-Weg erreicht werden. Glycerin kann in verschiedene Oxidationsprodukte mit unterschiedlichen Ausbeuten an Reduktionsäquivalenten umgewandelt werden. Unter anaeroben Bedingungen ist die Oxidation von Glycerin zu Acetat (mit Formiat) der effektivste Weg zur NADH-Erzeugung mit einer Ausbeute von 2 mol NADH/mol Glycerin. Die Oxidation von Glycerin zu 2,3-BDO und Lactat erzeugt ebenfalls Reduktionsäquivalente mit Ausbeuten von 1,5 mol NADH/mol Glycerin bzw. 1 mol NADH/mol Glycerin. Die Umwandlung von Glycerin in Succinat oder Ethanol erzeugt jedoch kein NADH. Somit würde die Koproduktion von Acetat mit 1,3-PDO die höchste Ausbeute an 1,3-PDO unter anaeroben Bedingungen (0,67 mol/mol) ergeben. Zu diesem Zweck könnte die Reduzierung der Succinat- und Ethanolsynthese der erste Schritt sein, um den Stoffwechselfluss auf effizientere NADH-Erzeugungswege zu lenken. Dies wird von Zhang et al. die die Produktion von 1,3-PDO erfolgreich um 32,8 % steigerten, nur indem sie die aldA Gen, um die Synthese von Ethanol zu blockieren, K. pneumoniae [26]. Xuet al. versucht, die 1,3-PDO-Produktion um K. pneumoniae durch Reduzierung der Laktatakkumulation mit der einzelnen Deletion des d-Lactatdehydrogenase-Gens ldhA [27]. Obwohl die Laktatbildung um 95 % verringert wurde, wurde der größte Teil des reduzierten Flusses im Laktatweg nicht auf 1,3-PDO, sondern auf den Zweig von 2,3-BDO geleitet, was darauf hindeutet, dass die Flussverteilung im Pyruvatknoten flexibler als im Glycerinknoten. Da 2,3-BDO weniger giftig ist für K. pneumoniae und die Synthese von 2,3-BDO eine höhere Ausbeute an NADH als Laktat ergibt, begünstigten die veränderten Flüsse im oxidativen Weg auch die 1,3-PDO-Synthese, was zu einer Steigerung der 1,3-PDO-Produktion um 7 % führte [27]. Überraschenderweise wurde berichtet, dass die Verringerung sowohl der Laktat- als auch der 2,3-BDO-Bildung schädlich für den Glycerinverbrauch und die 1,3-PDO-Produktion ist [28, 29]. Der metabolische Fluss wurde nicht zum 1,3-PDO- oder Acetat-Weg kanalisiert, während eine hohe Akkumulation von Pyruvat im Doppelmutantenstamm (ΔldhAΔknospeO), was auf ein metabolisches Ungleichgewicht am Pyruvatknoten hinweist [28]. Es wurde postuliert, dass eine hohe Akkumulation von Glycerinaldehyd-3-phosphat und Pyruvat für die 1,3-PDO-Produktion schädlich ist, da Glycerinaldehyd-3-phosphat die Glycerindehydratase stark hemmt [28]. Eine mögliche Strategie zur Beseitigung des metabolischen Ungleichgewichts am PEP/Pyruvat-Knoten ist die Feinabstimmung nachgeschalteter Enzyme. Zum Beispiel eine Überexpression von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (ppc) und Löschung von arcA Gen, ein Transkriptionsregulator, der den Fluss des Tricarbonsäure(TCA)-Zyklus vermittelt, wurden von Dupont erfolgreich implementiert, um den Fluss von PEP/Pyruvat zum TCA-Zyklus für die Reduktion von Nebenprodukten und die NADH-Regeneration für die 1,3-PDO-Überproduktion zu kanalisieren [21]. Die Analyse des Stoffwechselwegs deutete auf eine maximale Ausbeute von 0,84 mol 1,3-PDO/mol Glycerin hin, bei der nur der TCA-Zyklus für die NADH-Erzeugung unter mikroaeroben Bedingungen aktiviert wurde [30]. In diesem Fall wäre die Inaktivierung der NADH-Dehydrogenase zur Blockierung des Elektronentransfers von NADH zum Chinonpool wichtig, um den NADH-Pool für die 1,3-PDO-Produktion zu erhöhen.

Die Minimierung der Akkumulation toxischer Zwischenprodukte ist ein weiteres wichtiges Thema für die hohe Produktion von 1,3-PDO. 3-HPA ist ein toxisches Zwischenprodukt während der 1,3-PDO-Synthese, das Zelltod und Fermentationsstopp verursachen kann. Eine Verringerung der 3-HPA-Akkumulation kann erreicht werden, indem die Umwandlung von 3-HPA in 1,3-PDO beschleunigt wird, entweder durch Überexpression der 1,3-PDO-Dehydrogenase (NADH-abhängiges Enzym kodiert von dhaT Gen oder NADPH-abhängiges Enzym, kodiert durch yqhD Gen) oder durch Erhöhung des NADH-Pools über die Modifizierung von Flüssen im Oxidationsweg wie zuvor diskutiert oder über die Einführung von Formiat-Dehydrogenase (fdh) [31–33]. Formiat-Dehydrogenase katalysiert die Oxidation von Formiat zu Kohlendioxid und liefert zusätzliches NADH für die 3-HPA-Reduktion.

Nicht-natürliche Produzenten wurden auch so konstruiert, dass sie 1,3-PDO aus Glycerin herstellen. Tanget al. berichteten über die Einführung der B12-unabhängigen Glycerindehydratase und ihres Aktivators aus C. butyricum hinein E coli zusätzlich zur Überexpression der nativen Alkoholdehydrogenase YqhD [34]. Basierend auf der zweistufigen Fermentation (aerobe Wachstumsphase und anaerobe Produktionsphase) erreichte die Gesamtausbeute an 1,3-PDO und die Produktivität 104,4 g/l und 2,61 g/l/h in der Produktionsphase. Ebenso ein rekombinantes C. acetobutylicum wurde durch Überexpression von B12-unabhängiger Glycerin-Dehydratase und 1,3-PDO-Dehydrogenase aus C. butyricum, das 84 g/L 1,3-PDO mit einer Ausbeute von 0,65 mol/mol produzieren kann [24]. Die Verwendung von B12-unabhängiger Glycerin-Dehydratase erhöht die Wirtschaftlichkeit der entworfenen Prozesse, da während der Fermentation kein teures B12 benötigt wird.

1,2-Propandiol

1,2-PDO ist ein weiteres wichtiges Diol mit einem Weltmarkt von etwa 1,5 Millionen Tonnen/Jahr. Es wird in einem breiten Spektrum von Bereichen eingesetzt, wie zum Beispiel: (a) Herstellung von Polyesterharzen (b) Frostschutzmittel (c) Waschmittel und (d) Kosmetik [35]. Es wurden mehrere Versuche unternommen, die 1,2-PDO-Produktion aus Glycerin zu optimieren [36, 37]. Ähnlich wie bei 1,3-PDO ist die Umwandlung von Glycerin zu 1,2-PDO ein Reduktionsprozess, der 1 mol NADH pro mol 1,2-PDO verbraucht (Abb. 2). Im 1,2-PDO-Syntheseweg wird DHAP zunächst über die Methylglyoxal-Synthase (mgsA). Die Umwandlung von MG in 1,2-PDO erfolgt auf zwei alternativen Wegen, einer mit Acetol als Zwischenprodukt durch die Wirkung der Alkoholdehydrogenase (yqhD) und Glycerindehydrogenase (gldA), und das andere mit Lactaldehyd als Zwischenprodukt, vermittelt durch Glycerindehydrogenase (gldA) und 1,2-PDO-Reduktase (fucO). Die Überexpression beider Wege ist für die 1,2-PDO-Produktion technologisch machbar [36]. Um jedoch 1,2-PDO zu überproduzieren, sollten mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Erstens ist die Glycerinassimilation mit der PEP-Synthese gekoppelt in E coli da DHAK PEP als Phosphatdonor bei der Phosphorylierung von DHA verwendet. Somit ist während der Glycerinassimilation ein hoher Fluss von DHAP zu PEP erforderlich, was die Verfügbarkeit der Vorläufer für die 1,2-PDO-Synthese signifikant reduziert. Dieses Problem könnte durch Substitution von PEP-abhängiger DHAK durch ATP-abhängige DHAK überwunden werden. Dies erwies sich als hocheffizient zur Verbesserung der 1,2-PDO-Ausbeute und des Glycerinverbrauchs in E coli [36]. Zweitens, da die 1,2-PDO-Synthese sowohl Redox- als auch ATP-verbrauchend ist (mit ATP-abhängigem DHAK), ist die Koproduktion eines anderen Oxidationsprodukts unter anaeroben Bedingungen notwendig. Wie in der vorherigen Sitzung besprochen, erzeugt die Umwandlung von Glycerin in Acetat oder Laktat NADH, während die Umwandlung von Glycerin in Ethanol (mit Formiat) oder Succinat redoxneutral ist. Die Kopplung der Acetatproduktion mit 1,2-PDO sollte die höchste Ausbeute an 1,2-PDO ergeben. Diese maximale Ausbeute wird jedoch nie ganz erreicht, da es keinen Nettogewinn an ATP für das Zellwachstum und die Zellerhaltung gibt. Daher wird die Koproduktion von Ethanol zur Bereitstellung von ATP als notwendig für die 1,2-PDO-Produktion unter anaeroben Bedingungen angesehen [36]. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Blockierung der Acetatsynthese (ΔackA-pta) und/oder Laktat (ΔldhA) erhöhte die Produktion von 1,2-PDO und unterbrach gleichzeitig die Synthese von Ethanol (ΔadhE) oder Succinat (ΔfrdA) reduzierte sowohl den Glycerinverbrauch als auch die 1,2-PDO-Produktion um E coli unter anaeroben Bedingungen [36]. Die Deletion von Ethanol oder Succinat leitete den größten Teil des Flusses in Richtung Acetat- oder Lactatbildung, was zu einem signifikanten Redox-Ungleichgewicht und Wachstumsmangel führen würde. Andererseits wurde bei den Mutanten eine Zunahme der Ethanolproduktion mit Unterbrechung der Acetat- und/oder Laktatproduktionswege beobachtet [36]. Die Umwandlung von Glycerin zu Ethanol (und Formiat) ist ein redoxneutraler Prozess unter Erzeugung von 1 mol ATP. Somit könnte die gesteigerte Ethanolproduktion mehr ATP für das Zellwachstum bereitstellen, ohne das Redoxgleichgewicht zu beeinträchtigen. Da der Ethanol- (und Formiat-) Weg jedoch kein NADH erzeugt, waren die Akkumulation von Pyruvat als oxidiertes Produkt und die Aktivierung der Pyruvatdehydrogenase und/oder Formiathydrogenlyase (FHL) für das Redoxgleichgewicht im Acetat- (ΔackA-pta) und/oder Laktatmangel (ΔldhA) Mutanten [36]. Mit der Löschung von ackA-pta, ldhA, und PEP-abhängig dhaK zusätzlich zur Überexpression von gldA, mgsA, yqhD, und ATP-abhängiger DHAK (C. freundii dhaKL), die Mutante E coli kann 5,6 g/l 1,2-PDO mit einer Ausbeute von 0,213 g/g Glycerin produzieren. Ähnlich, S. cerevisiae Stämme wurden so konstruiert, dass sie 1,2-PDO produzieren, indem sowohl die Glycerindissimilation als auch die 1,2-PDO-Synthesewege modifiziert werden [37]. Überexpression von Glycerinkinase (GUT1), Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GUT2), Glycerin-Dehydrogenase (gdh) und ein Glycerintransportergen (GUP1) erhöhten die Glycerinverwertung und die Zellwachstumsrate. Weitere Einführung von mgsA und gldA von E coli ermöglichte die Produktion von 2,19 g/l 1,2-PDO durch das metabolisch veränderte S. cerevisiae.

Der Stoffwechselweg zur Produktion von 1,2-Propandiol (1,2-PDO). Glycerin wird über zwei alternative Wege in 1,2-PDO umgewandelt: einer mit Acetol als Zwischenprodukt und der andere mit Lactaldehyd als Zwischenprodukt. ackA Acetatkinase adhE Acetaldehyd/Alkohol-Dehydrogenase dhaKLM Dihydroxyacetonkinase FHL Fomat-Hydrogen-Lyase-Komplex frdABCD Fumaratreduktase fucO 1,2-PDO-Reduktase gldA Glycerin-Dehydrogenase ldhA Lactatdehydrogenase mgsA Methylglyoxal-Synthase PDH Pyruvatdehydrogenase PFL Pyruvatformiat-Lyase pta Phosphatacetyltransferase yqhD Alkoholdehydrogenase

Die Umwandlung von Glycerin zu 1,2-PDO erzeugt mehrere toxische Zwischenprodukte wie MG und Lactaldehyd. Um die Ansammlung toxischer Zwischenprodukte zu minimieren, wurde versucht, Enzyme des Stoffwechselwegs durch DNA-Gerüste und bakterielle Mikrokompartimente (BMC) aufzubauen. Conradoet al. nutzten fusionierte Zinkfingerdomänen, die das DNA-Gerüst spezifisch binden können, um Methylglyoxal-Synthase, 2,5-Diketo-d-Gluconsäure-Reduktase und Glycerin-Dehydrogenase aufzubauen E coli [38]. Unter optimiertem Enzym/Gerüstverhältnis wurde die Produktion von 1,2-PDO um . verbessert

3,5 mal. In einem weiteren Versuch, künstliches BMC für die 1,2-PDO-Synthese zu konstruieren, wurden von Pdu-BMC abgeleitete N-terminale Targeting-Sequenzen an Glycerin-Dehydrogenase, Dihydroxyaceton-Kinase, Methylglyoxal-Synthase und 1,2-PDO-Oxidoreduktase angefügt, was zur Bildung von Proteineinschlüssen führte innerhalb der rekombinanten E coli Zelle [39]. Interessanterweise zeigte ein Stamm, der die fusionierten Enzyme enthielt, unabhängig von der Anwesenheit von BMCs eine 245-prozentige Steigerung der 1,2-PDO-Produktion im Vergleich zu einem Stamm mit freien Enzymen. Es wurde beobachtet, dass die Enzyme mit Targeting-Peptiden dichte Proteinaggregate bildeten, was aufgrund von Proximity-Effekten zu einer verstärkten Kanalisierung von Substraten und Produkten zwischen Proteinen führen kann.

2,3-Butandiol

2,3-BDO ist eine potenzielle Plattformchemikalie, die sowohl als Biokraftstoff als auch als Bausteine ​​für die Synthese von 2-Butanon [40], 2-Butanol [41] und 1,3-Butadien [42] verwendet werden kann. Wie bereits erwähnt, ist die Umwandlung von Glycerin zu 2,3-BDO ein Oxidationsprozess mit einer theoretischen Ausbeute von 0,5 mol/mol. Das bei der Produktion von 2,3-BDO erzeugte NADH sollte verbraucht werden, indem es mit der Bildung eines reduzierten Produkts oder mit einer oxidativen Phosphorylierung gekoppelt wird. Daher werden für die 2,3-BDO-Produktion häufig aerobe Bedingungen verwendet, bei denen Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwendet werden kann. Ein gut untersuchter Fall ist K. oxytoca die sowohl 1,3-PDO als auch 2,3-BDO effizient aus Glycerin synthetisieren können. Belüftung und pH-Wert sind zwei kritische Faktoren, die die Verteilung zwischen 1,3-PDO und 2,3-BDO beeinflussen [43–45]. Eine hohe Belüftung und ein niedriger pH-Wert (pH6) sind für die 2,3-BDO-Produktion von Vorteil, während eine niedrige Belüftung und ein höherer pH-Wert (pH7) die Ansammlung von 1,3-PDO fördern. Bei optimalem pH-Wert und Belüftung ist eine Mutante K. oxytoca Stamm, der die Synthese von 1,3-PDO und Laktat blockiert (ΔpduCΔldhA) kann 131,5 g/l 2,3-BDO aus Rohglycerin akkumulieren, mit einer Produktivität und einer Ausbeute von 0,84 g/l/h und 0,44 g/g. In einer anderen Studie wurde die Überexpression von Glycerin-Dehydrogenase, Acetoin-Reduktase und einem Transkriptionsregulator ALsR kombiniert, um den metabolischen Fluss zur 2,3-BDO-Synthese in zu erhöhen Bacillus amyloliquefaciens. Der gentechnisch veränderte Stamm zeigte eine reduzierte Akkumulation von Acetoin und anderen Nebenprodukten. Ebenso eine Kombination aus einer dreistufigen Regelstrategie für gelösten Sauerstoff (350 U/min für die ersten 5 Stunden 400 U/min von 5 bis 22 Stunden und 350 U/min danach) und einer zweistufigen pH-Regelstrategie (ohne pH-Regelung für die ersten 16 Stunden und mit konstanter pH-Wert von 6,5 danach) wurde für diese Mutante während der Fermentation angewendet, was einen hohen Titer (102,3 g/l) und eine Ausbeute (0,44 g/g) der 2,3-BDO-Produktion ermöglichte [45]. Der hohe Titer und die hohe Ausbeute in diesen Beispielen zeigten, dass die biologische Produktion von 2,3-BDO sowohl technologisch als auch wirtschaftlich wettbewerbsfähig sein könnte.

Metabolic Engineering zur Herstellung organischer Säuren aus Glycerin

Über die traditionellen Verwendungen in der Futter- und Lebensmittelindustrie hinaus hat das jüngste Interesse an Biokunststoffen und Massenchemikalien die biologische Produktion organischer Säuren aus nachwachsenden Rohstoffen vorangetrieben. Glycerin wurde verwendet, um verschiedene organische Säuren herzustellen, einschließlich Lactat, Succinat, Fumarat, 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) und Aminosäuren (Abb. 1).

Laktat

Lactat ist eine wichtige organische Säure mit vielen Anwendungen in der Lebensmittel-, Pharma- und Chemieindustrie. Insbesondere die Synthese von biologisch abbaubarem Polylactat (PLA) aus d- oder l-Lactat birgt ein großes Potenzial, die synthetischen Kunststoffe der petrochemischen Industrie zu substituieren. Die biologische Herstellung von Laktat aus Glycerin ist ein vielversprechender Prozess mit einer theoretischen Ausbeute von 1,0 mol/mol. Ähnlich wie bei 2,3-BDO ist die biologische Produktion von Laktat aus Glycerin ein Oxidationsprozess, der Netto-NADH und ATP erzeugt. Somit werden mikroaerobe Bedingungen für die Laktatproduktion aus Glycerin bevorzugt, während anaerobe Fermentation bevorzugt wird, wenn Glucose als Substrat verwendet wird. Mehrere Stämme können unter anaeroben und mikroaeroben Bedingungen nativ eine große Menge Laktat produzieren. Als Hauptnebenprodukt entsteht beispielsweise d-Lactat K. pneumoniae und E coli während der Glycerinassimilation. Mit der Löschung von dhaT und yqhD Gen, um die Synthese von 1,3-PDO und die Überexpression des nativen d-Lactat-Dehydrogenase-Gens zu blockieren ldhA, K. pneumoniae konnte unter mikroaeroben Bedingungen bis zu 142,1 g/L d-Lactat mit einer Ausbeute von 0,82 g/g Glycerin akkumulieren [46]. Es wurden auch systematischere Strategien angewendet auf E coli zur d-Lactat-Produktion [47–49]. Ein homolaktischer Stamm für die d-Lactat-Produktion aus Glycerin wurde durch systematische Eliminierung aller Nebenprodukte der Synthesewege, einschließlich Acetat (ΔackA-ptaΔPockenB), Ethanol (ΔadhE), Succinat (ΔppsΔfrdA), Formiat (ΔpflB) und d-Laktat-Assimilation (Δdld). Die Ausbeute an d-Lactat wurde durch Überexpression von d-Lactat-Dehydrogenase aus einem Low-Copy-Plasmid von 0,67 auf 0,75 g/g weiter verbessert [47]. Ähnliche Strategien können für die l-Lactat-Produktion angewendet werden [50, 51]. Mazumdaret al. entwickelten einen hocheffizienten l-Lactat-Produzenten durch vier Schritte: (1) Ersetzen der nativen d-Lactat-Dehydrogenase (ΔldhA) mit l-Lactat-Dehydrogenase aus Streptococcus bovis (2) Inaktivierung der Methylglyoxalwege (ΔmgsA), um die Synthese einer racemischen Lactatmischung zu vermeiden (3), die den l-Lactat-Assimilationsweg inaktiviert (ΔlldD) und (4) Blockierung der Acetatsynthese (Δpta), Ethanol (ΔadhE) und Succinat (ΔfrdA) [50]. Das resultierende E coli Stamm produzierte l-Lactat aus Rohglycerin mit hoher Ausbeute (0,89 g/g) und optischer Reinheit (99,9 %). Somit ist es im Vergleich zu den auf Glucose basierenden Wegen in hohem Maße wettbewerbsfähig, sowohl d-Lactat als auch l-Lactat aus billigem Rohglycerin herzustellen.

Succinat

Succinat gilt als eine der Top-12-Bausteinchemikalien [52, 53]. Es kann als Lösungsmittel, pharmazeutisches Produkt oder Monomer für die Synthese von biologisch abbaubaren Kunststoffen verwendet werden. Die Umwandlung von Glycerin zu Succinat ist ein redoxneutraler Prozess. Theoretisch kann Glycerin in Succinat mit einer Ausbeute von 1 mol/mol unter Zugabe von zusätzlichem Bicarbonat in das Medium für eine anaplerotische Reaktion umgewandelt werden [52]. Diese Ausbeute ist viel höher als diejenige, die bei Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle beobachtet wird. Die Verbesserung des anaplerotischen Flusses wird als der wichtigste Faktor für die Produktion von Succinat mit hoher Ausbeute angesehen. An anaplerotischen Reaktionen sind drei Enzyme beteiligt: ​​Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC), Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und Pyruvat-Carboxylase (PYC). Die Überexpression von sowohl PEPC als auch PYC hat sich als vorteilhaft für die Succinatproduktion erwiesen. In den meisten Bakterien katalysieren PEPC und PYC die Carboxylierungsreaktionen, während PEPCK die Decarboxylierungsreaktion katalysiert. Eine Umkehr der Richtung der glukoneogenen PEPCK-Reaktion könnte während CO . Netto-ATP erzeugen2 Fixierung und kann somit ein effizienter Weg sein, die Succinatproduktion unter anaeroben Bedingungen zu steigern. Die Überexpression von PEPCK zusammen mit der Erhöhung des PEP-Pools ist wichtig, um die Richtung von PEPCK umzukehren. Beispielsweise wurde die Überexpression des nativen PEPCK mit der Deletion der Pyruvat-Formiat-Lyase (ΔpflB) zur Steigerung der Ausbeute und Produktion von Succinat in E coli. Ebenso die Überexpression von PEPCK aus Actinobacillus succinogenes, das wichtigste CO2-fixierendes Enzym in A. succinogenes, erhöhte die Succinatproduktion um das 6,5-fache E coli Mutante in Kombination mit der Deletion von PEPC [54]. Überexpression von PEPCK in E coli, zusammen mit der Unterbrechung der Pyruvat-Formiat-Lyase (ΔpflB) und Phosphotransferase-System (ΔptsI), um den PEP-Pool zu erhöhen, ermöglichte die Umwandlung von Glycerin in Succinat mit einer Ausbeute von 0,80 mol/mol unter anaeroben Bedingungen [55]. Diese Ausbeute ist viel höher als bei dem Stamm, der PYC überexprimierte und alle Nebenproduktsynthesen (Acetat, Ethanol und Laktat) unterdrückte [53]. Die aerobe Bernsteinsäureproduktion aus Glycerin wurde realisiert in C. glutamicum durch Unterbrechung des TCA-Zyklus stromabwärts von Succinat (ΔsdhCAB) und Unterdrückung der Acetatbildung (ΔackA-ptaΔGesetzΔpqo) zusätzlich zur Überexpression von PYC, PEPC und glp-Regulon zur Glycerinassimilation (glpFKD) [56]. Unter optimierten Fermentationsbedingungen zeigte der Stamm eine Ausbeute von 0,21 mol/mol und einen Titer von 9,3 g/L [56]. Aus praktischer Sicht ist die aerobe Herstellung von Succinat wirtschaftlich nicht sinnvoll, da sie im Vergleich zu anaeroben Bedingungen eine geringere theoretische Ausbeute und einen höheren Energiebedarf aufweist.

3-Hydroxypropionsäure

3-Hydroxypropionsäure (3-HP) ist eine vielseitige Plattformchemikalie, die zur Herstellung von Acrylsäure, Acrylnitril, Malonsäure und 1,3-PDO verwendet werden kann [57]. Für die Produktion von 3-HP aus mehreren Zwischenprodukten, darunter Glycerin, Lactat, Malonyl-CoA und β-Alanin, wurden verschiedene Stoffwechselwege vorhergesagt und erprobt [57]. Die direkte Umwandlung von Glycerin zu 3-HP gilt als einer der vielversprechendsten Wege für die 3-HP-Produktion. Im Gegensatz zur Herstellung von 1,3-PDO ist die Bildung von 3-HP aus Glycerin ein Oxidationsprozess, der Netto-NADH erzeugt. Somit ist es möglich, 3-HP mit 1,3-PDO gemeinsam zu produzieren, um das reduzierende Äquivalent zu recyceln. Dieses Konzept wurde in rekombinanter K. pneumoniae die 48,9 g/L 3-HP und 25,3 g/L 1,3-PDO durch Überexpression von an E coli Aldehyddehydrogenase (aldH) [58]. Andererseits kann 3-HP als einziges Produkt hergestellt werden, wenn ein Elektronenakzeptor bereitgestellt wird [59]. Unter anaeroben Bedingungen wurde Nitrat als Elektronenakzeptor für die 3-HP-Produktion durch eine Mutante verwendet K. pneumoniae mit doppelter Streichung von dhaT und glpK um den Fluss zur 1,3-PDO-Synthese und den Glycerin-Oxidationsweg zu reduzieren [60]. Unter aeroben Bedingungen kann Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwendet werden. Die Kontrolle der Belüftung ist jedoch für die Produktion von 3-HP wichtig. Die Erhöhung des gelösten Sauerstoffs ist für das NAD-Recycling von Vorteil, jedoch hemmt eine hohe Sauerstoffkonzentration auch die Synthese von Coenzym B12 und verringert die Aktivität der Glycerin-Dehydratase. Daher ist es wichtig, sowohl das Metabolic Engineering (Reduktion von 1,3-PDO und die Bildung anderer Nebenprodukte) als auch die Prozessoptimierung für die hohe Produktion von 3-HP durch K. pneumoniae.

Escherichia coli als heterologer Wirt wurde auch so konstruiert, dass er 3-HP aus Glycerin produziert. Ebenso die Reduktion der 1,3-PDO-Synthese um yqhD Deletion ist wichtig, um die Produktion von 3-HP zu steigern [61]. Knockout von glpK um den Glycerinoxidationsweg zu blockieren, reduzierte jedoch das Zellwachstum und den Glycerinverbrauch signifikant [62]. Daher wurde der L-Arabinose-induzierbare Promotor zur Feinabstimmung der Expression von . verwendet glpK, und Löschung von glpR, ein Unterdrücker von glp Regulon, wurde auch kombiniert, um den Glycerinstoffwechsel zu verbessern [62]. Eine andere intelligente Strategie, die einen Kippschalter verwendet, um die Genexpression bedingt zu unterdrücken, wurde ebenfalls versucht. Durch die Steuerung der Zugabezeit von IPTG könnte ein Kippschalter zur gleichzeitigen Induktion des 3-HP-Synthesewegs (Glycerin-Dehydratase und Aldehyd-Dehydrogenase) und zur Unterdrückung der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase die 3-HP-Produktion im Vergleich zum Kontrollstamm erhöhen [63]. In silico metabolische Simulation wurde verwendet, um neue Ziele zur Steigerung der Ausbeute an 3-HP zu identifizieren. Eine Genom-Scale-Modellierung identifizierte Triosephosphat-Isomerase (tpiA) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (zwf) als Kandidaten zur Verbesserung der 3HP-Produktion [64]. Die 3-PS-Ausbeute eines Triple E coli Mutant (ΔtpiAΔzwfΔyqhD) war im Vergleich zum Elternstamm um das 7,4-Fache erhöht. Im Vergleich zu K. pneumoniae, die größte Herausforderung bei der Verwendung E coli als Wirt für die 3-HP-Produktion ist die Notwendigkeit der Zugabe von teurem Coenzym B12 während der Fermentation.

Das metabolische Gleichgewicht zwischen Glycerin-Dehydratase und Aldehyd-Dehydrogenase zur Verringerung der 3-HPA-Akkumulation ist auch für die 3-HP-Produktion wichtig. Dies könnte durch eine aktivere Aldehyd-Dehydrogenase oder die Kontrolle der Expression der Glycerin-Dehydratase erreicht werden [65, 66]. Chuet al. eine hochaktive Aldehyd-Dehydrogenase aus Cupriavidus necator und verwendeten ortsgerichtete Mutagenese, um seine Aktivität zu verbessern [65]. Die aktivste Mutante trägt zwei Punktmutationen: E209Q/E269Q. Escherichia coli transformiert mit dieser Mutante produzierten bis zu 71,9 g/l 3-HP mit einer Produktivität von 1,8 g/l/h. Limet al. verwendeten UTR-Engineering (untranslated region), um die Expression der Glycerindehydrogenase (dhaB1) für ein optimales Stoffwechselgleichgewicht [67]. Es wurde beobachtet, dass eine hohe Expression von Glycerindehydrogenase zu einem geringen Zellwachstum und einer hohen Akkumulation von 3-HPA führte. Unter optimalem Expressionsniveau von Glycerin-Dehydratase produzierte der beste Stamm 40,51 g/l 3-HP mit einer Ausbeute von 0,97 g/g Glycerin (unter Verwendung von Glycerin und Glucose als Co-Substrate).

Da es bei der 3-HP-Produktion notwendig ist, das teure Coenzym B12 zuzugeben, E coli, Pseudomonas denitrificans das Coenzym B12 unter aeroben Bedingungen natürlich produzieren kann, wurde so konstruiert, dass es 3-HP produziert. Wenn Glycerin-Dehydratase und ihr Aktivator und eine Aldehyd-Dehydrogenase aus K. pneumoniae (puuC) überexprimiert wurden, konnte der rekombinante Stamm mit Glycerin und Glucose als Co-Substrate 4,9 g/L 3-HP produzieren [68]. Jedoch, P. denitrificans kann 3-HP abbauen und als Kohlenstoffquelle nutzen. Daher sollte der 3-HP-Abbauweg identifiziert und gelöscht werden [69].

Aminosäuren

l-Aminosäuren sind sehr wichtige Fermentationsprodukte, die in der Industrie weit verbreitet sind. Aufgrund des hohen Reduktionsgrades von Glycerin ist es sehr vielversprechend, Glycerin als Substrat für die Aminosäureproduktion zu verwenden, die oft eine große Menge an reduzierenden Äquivalenten verbraucht. Die dominante Sorte für die Produktion von l-Aminosäuren, C. glutamicum, wurde entwickelt, um verschiedene Substrate einschließlich Glycerin zu verwenden. Obwohl C. glutamicum besitzt mutmaßliche Homologe der Glycerinkinase (glpK) und Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (glpD), Wildtyp C. glutamicum kann nicht mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Die Glutamatproduktion aus Glycerin wurde durch die Plasmid-getragene Expression von . ermöglicht E. coli glpF, glpK, und glpD in C. glutamicum mit einem Titer von 2,2 g/L [70]. Einführung von glpFKD hinein C. glutamicum Stämme, die andere Aminosäuren produzieren, führten zur Synthese von Lysin, Ornithin, Arginin, Phenylalanin und Putrescin aus Rohglycerin (Tabelle 1) [71, 72]. Die Titer (0,4–3,8 g/L) und Ausbeuten (0,02–0,2 g/g) sind jedoch im Vergleich zu Kulturen mit Glucose als Kohlenstoffquelle deutlich geringer. Einer der möglichen Gründe ist die geringe NADPH-Ausbeute während des Glycerinabbaus. Eine weitere Verbesserung könnte durch die Einführung neuer Wege der NADPH-Erzeugung wie Transhydrogenase, NADPH-abhängige Glycerin-Dehydrogenase oder NADPH-abhängige Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase erreicht werden [73].

Metabolic Engineering zur Herstellung von Biokraftstoffen aus Glycerin

Aufgrund seines niedrigen Preises und des hohen Reduktionsgrades ist Glycerin im Vergleich zu Glucose und anderen Zuckern ein vielversprechender Rohstoff für die Biokraftstoffproduktion. Die Herstellung von Ethanol aus Glycerin wurde intensiv untersucht, während die Forschung zur Umwandlung von Glycerin zu Butanol und Lipiden/Fettsäuren erst in den letzten Jahren begonnen hat.

Ethanol

Wie bereits erwähnt, ist die Umwandlung von Glycerin zu Ethanol (mit Formiat) ein redoxneutraler Prozess mit Netto-ATP-Erzeugung, daher ist es möglich, die meisten Nebenproduktbildung unter anaeroben Bedingungen zu eliminieren. Insbesondere kann die Co-Produktion von Ethanol-Wasserstoff oder Ethanol-Formiat mit einer Ausbeute nahe 1,0 mol/mol erreicht werden [74]. Zum Beispiel Doppelmutation der Fumarat-Reduktase (ΔfrdA) und Phosphotransacetylase (Δpta), um die Succinat- und Acetatsynthese zu eliminieren, reicht aus, um eine E coli Stamm produziert Ethanol und Wasserstoff bei maximaler theoretischer Ausbeute (1,0 mol/mol) bei pH 6,3 unter anaeroben Bedingungen [75]. Der Endtiter und die Produktivität waren jedoch relativ niedrig, obwohl der Glycerinverbrauch durch Überexpression der Glycerindehydrogenase teilweise verstärkt werden konnte (gldA) und Dihydroxyacetonkinase (dhaKLM). Wonget al. konstruierten kürzlich ein induktor- und antibiotikafreies System, um den Titer, die Ausbeute und die spezifische Produktivität von Ethanol unter mikroaeroben Bedingungen zu erhöhen [76]. Um ein solches Ziel zu erreichen, wurden zunächst die Wege zu den Nebenprodukten (Succinat, Acetat und Lactat) inaktiviert (ΔfrdABCDΔackA-ptaΔPockenBΔldhA). Die Glycerinaufnahmegene dhaKLM, gldA, und glpK und das Gen für den Ethanolweg adhE wurden dann unter nativen überexprimiert E coli Promotoren in einem Plasmid. Das chromosomale gldA und glpK wurden deletiert, um den nativen Glycerinverbrauchsweg zu inaktivieren. Somit sind nur die Stämme mit einem Plasmid-getragenen gldA kann Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Diese Strategie macht Antibiotika überflüssig, um das Plasmid während der Fermentation zurückzuhalten. Der endgültige gentechnisch veränderte Stamm kann Ethanol mit hohem Titer und hoher Ausbeute (40,8 g/l und 0,44 g/g) produzieren, ohne teure Induktoren und Antibiotika zu verwenden. Dieses Verfahren ist sehr vielversprechend für die industrielle Ethanolproduktion.

Butanol

Butanol hat in letzter Zeit erneutes Interesse als potenzieller grüner Biokraftstoff geweckt [77]. Im Vergleich zu Ethanol hat Butanol eine höhere Energiedichte und eine geringere Hygroskopizität und kann direkt mit Benzin gemischt werden, ohne dass das aktuelle Fahrzeugsystem modifiziert werden muss. Die Herstellung von Butanol ist ein reduzierendes Äquivalent-intensives Verfahren. Somit kann Glycerin als gutes Substrat für die Butanolherstellung verwendet werden. Drei Isoformen von Butanol (n-Butanol, 2-Butanol und Isobutanol) können als Biokraftstoff verwendet und direkt aus Glycerin hergestellt werden. Clostridium pasteurianum kann rohes Glycerin zur Herstellung verwenden n-Butanol und 1,3-PDO. Um die Produktion von zu verbessern n-Butanol, das dhaT Gen wurde ausgeschaltet, was zu einer 83 %igen Reduktion der 1,3-PDO-Produktion führte [78]. Die Ausbeute und Selektivität (angegeben als g n-Butanol, das pro g Gesamtlösungsmittel produziert wird) von Butanol wurde um 24 bzw. 63 % erhöht. Die n-Butanol-Syntheseweg wurde auch heterogen exprimiert in E coli und K. pneumoniae (Abb. 3) [79, 80]. Allerdings waren die aktuell berichteten Titer im Vergleich zu denen mit Glucose als Substrat deutlich niedriger [77]. Es sollten systematischere Strategien zur Optimierung heterologer Wege und zur Reduzierung der Nebenproduktbildung angewendet werden, um sowohl den Titer als auch die Ausbeute zu erhöhen. Die Isobutanolproduktion aus Glycerin wurde auch durch die Expression von Acetolactatsynthase erreicht (ilvIH), Ketosäure-Reduktoisomerase (ilvC), α-Ketoisovalerat-Decarboxylase (kivd) und Alkoholdehydrogenase (adhA) in K. pneumoniae (Abb. 3) [81]. Durch Eliminierung des Lactat- und 2,3-Butandiol-Wegs (ΔldhAΔadc) kann der resultierende Stamm etwa 320 mg/l Isobutanol produzieren. Die 2-Butanol-Produktion aus Glycerin könnte durch die Erweiterung des 2,3-BDO-Synthesewegs mit Diol-Dehydratase erreicht werden (pduCDE) und Alkoholdehydrogenase (adha) (Abb. 3) [41]. Die Aktivität der Diol-Dehydratase gegenüber meso-2,3-BDO-Dehydratisierung sollte durch Protein-Engineering signifikant verbessert werden, um einen höheren Titer an 2-Butanol zu erhalten.

Stoffwechselweg zur Produktion von n-Butanol, 2-Butanol und Isobutanol. adc Acetolactat-Decarboxylase adhA Alkoholdehydrogenase ilvC Ketosäure-Reduktoisomerase ilvIH Acetolactatsynthase kivd α-Ketoisovalerat-Decarboxylase ldhA Lactatdehydrogenase pduCDE: Diol-Dehydratase

Lipide und Fettsäuren

Mikrobielle Lipide und freie Fettsäuren (FFAs) sind wichtige Quellen für die Herstellung von Biodiesel und anderen Chemikalien. Ein breites Spektrum an Mikroben, darunter Mikroalgen, Hefen und Pilze, kann Rohglycerin effizient für die Lipidproduktion nutzen [82–84]. Es hat sich gezeigt, dass eine Überexpression des Glycerin-Verwertungswegs wie Glycerin-Kinase und Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase wichtig für die Steigerung der Lipidproduktivität ist Fistuliera solaris [85] und Synechozystis sp. [86]. Die theoretische Ausbeute an FFAs auf Glycerin ist aufgrund des höheren Reduktionsgrades von Glycerin höher als die auf Glucose [87]. Um FFAs zu produzieren, sollte effektive Acyl-Acyl-Carrier-Protein (ACP)-Thioesterase (TE) eingeführt werden, um FFAs aus Acyl-ACP freizusetzen, das im Fettsäureelongationszyklus gebildet wird. Andere wichtige Faktoren zur Steigerung der FFA-Ausbeute sind (1) die Verbesserung der Vorläuferversorgung (Malonyl-CoA) durch Überexpression der Acetyl-CoA-Carboxylase (2) die Unterdrückung des FFA-Verbrauchs durch die Deletion der Acyl-CoA-Synthetase (ΔfadD) (3) Steigerung des Fettsäure-Elongationszyklus (4) Steigerung der NADPH-Erzeugung (Fig. 4). Die ersten beiden Strategien wurden mit der Überexpression eines TE aus Cinnamomum camphora von Lu et al. wer hat eine mutante konstruiert E coli Stamm, der FFAs bis zu 2,5 g/L aus Glycerin akkumulieren kann [88]. Ähnliche Strategien wurden von Lenne et al. die die Kopienzahl von TE weiter optimiert haben Umbellularia californica [89]. Es wurde gezeigt, dass eine niedrigere Kopie von TE für die Produktion von FFAs vorteilhafter ist. Um die Versorgung mit NADPH für die Produktion von FFAs zu verbessern, wird die Überexpression sowohl der NAD-Kinase (nadK) und membrangebundene Transhydrogenase (pntAB) erwies sich als wirksame Strategie zur Steigerung der Produktion und Ausbeute von FFA (4,82 g/l und 0,3 g/g) [90]. Es wurde auch über die Produktion von FFAs mit unterschiedlicher Kettenlänge aus Glycerin durch die manipulierte Umkehr des β-Oxidationszyklus berichtet [91]. Das System enthielt Thiolase (fadA), 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (fadB), Enoyl-CoA-Hydratase (fadB), Enoyl-CoA-Reduktase (yidO) und Thioesterasen (TE) (Fig. 4). Thioesterasen könnten verwendet werden, um die Kettenlänge von FFAs zu kontrollieren.

Stoffwechselweg für die Produktion von freien Fettsäuren (FFAs) über den Fettsäureelongationszyklus und den umgekehrten β-Oxidationszyklus. Zu den Strategien, die verwendet werden, um die Ausbeute von FFAs zu erhöhen, gehören (1) Verbesserung der Vorläuferversorgung durch Überexpression der Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) (2) Unterdrückung des Verbrauchs von FFAs durch die Deletion der Acyl-CoA-Synthetase (fadD) (3) Verbesserung des Fettsäure-Elongationszyklus durch die Überexpression von (3R)-Hydroxymyristoyl-ACP-Dehydrase (fabZ) (4) Verstärkung der NADPH-Erzeugung durch die Überexpression der NAD-Kinase (nadK) und membrangebundene Transhydrogenase (pntAB). ACC Acetyl-CoA-Carboxylase fabZ: (3R)-Hydroxymyristoyl-ACP-Dehydrase fadA, Thiolase fadB, funktionelle Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase und Enoyl-CoA-Hydratase fadD: Acyl-CoA-Synthetase nadK NAD-Kinase pntAB membrangebundene Transhydrogenase TE Thioesterase ydiO, Enoyl-CoA-Reduktase

Herausforderungen und Zukunftsperspektiven

Bioraffinerien basieren auf der Integration verschiedener Umwandlungsprozesse zur vollständigen Nutzung von Biomasse für die Produktion von Energie, Kraftstoffen und Chemikalien. In diesem Zusammenhang bietet die Nutzung des bei der Biodiesel- und Bioethanolproduktion anfallenden Rohglycerins zur Herstellung wertvoller Chemikalien und Kraftstoffe eine hervorragende Möglichkeit, die Ressourceneffizienz und Wirtschaftlichkeit der Biokraftstoffindustrie zu verbessern. Bisher basieren die meisten Glycerin-Umwandlungsprozesse auf der Fermentation von raffiniertem Glycerin. Die Leistung der gentechnisch veränderten Stämme auf Rohglycerin sollte weiter untersucht werden. Die Zusammensetzung des Rohglycerins variiert je nach Rohstoff, Verfahren zur Biodieselherstellung und Nachbehandlungsverfahren erheblich. Zu den Verunreinigungen von Rohglycerin gehören Wasser, Methanol, Salze, Seife, Fettsäuren und andere unbekannte Substanzen [2, 8]. Einige der Verunreinigungen können die Leistung von Mikroorganismen erheblich beeinträchtigen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass nur drei der sieben getesteten Proben von einem stoffwechseltechnischen Verfahren verwendet werden können C. glutamicum zur Aminosäureproduktion [71]. Daher ist es wichtig, den Inhibitionsmechanismus aufzuklären und die Toleranz von gentechnisch veränderten Stämmen gegenüber inhibitorischen Substanzen zu erhöhen. Zu diesem Zweck können metabolisch veränderte Stämme weiterentwickelt werden, um sich durch adaptive Laborevolution an verschiedene Glycerinchargen anzupassen, und die Systembiologie kann verwendet werden, um zu verstehen, wie spezifische Mutationen den Zellstoffwechsel beeinflussen. Darüber hinaus kann die Systembiologie genutzt werden, um neue Targets zu identifizieren, die durch rationale Analyse nicht gefunden werden können, um effizientere Stämme zu entwickeln [15, 17, 18].

Die jüngste Entwicklung der synthetischen Biologie kann auch genutzt werden, um Stämme zur Herstellung von natürlichen und nicht-natürlichen Produkten aus Glycerin zu entwickeln. Beispielsweise wurden kürzlich neue Stoffwechselwege entwickelt, um Ethylenglykol [13] und 1,4-Butandiol [92] herzustellen, zwei in der Polymerindustrie am häufigsten verwendete Diole. Die Produktion von hochwertvollen Pharmazeutika wie Artemisinin kann auch im Glycerin-Stoffwechselweg implementiert werden, was neue Potenziale für die Glycerin-Bioraffinerie eröffnet [5, 93].


Zusammenfassung

  • Lipide sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen, die in Lösungsmitteln wie Alkohol und Benzol löslich sind, aber Unlöslich in Wasser
  • Sie sind die große Energiequelle im Körper
  • Sie sind die Bausteine ​​vieler Verbindungen mit höherem Molekulargewicht
  • Lipide werden mit bestimmten Erkrankungen wie Arteriosklerose und Fettleibigkeit in Verbindung gebracht
  • Ein Molekül Glycerin und drei Moleküle Fettsäure verbinden sich durch eine Kondensationsreaktion zu einem Triglycerid
  • Triglyceride und Phospholipide sind zwei Gruppen von Lipiden
  • Eine Kondensationsreaktion (Entfernung von Wasser) zwischen einem Glycerinmolekül und einer Fettsäure bildet eine Esterbindung
  • Hydrolyse, Addition eines Wassermoleküls, eines Triglycerids bilden Fettsäuren und Glycerin.
  • Eine Fettsäure mit mehr als einer Doppelbindung (=) heißt a mehrfach ungesättigte Fettsäuren und wenn eine Doppelbindung vorhanden ist, heißen sie einfach ungesättigte Fettsäuren
  • Eine Phospholipoid-Struktur ist, wenn eine Fettsäuregruppe eines Triglycerids durch eine phosphathaltige Gruppe ersetzt ist
  • Phospholipide sind polare Moleküle, bei denen sie einen hydrophilen Phosphat-„Kopf“ und einen hydrophoben „Schwanz“ aus zwei Fettsäuren haben
  • In wässriger Lösung sind Phospholipidmoleküle der Hauptbestandteil der Zellmembran in tierischen und pflanzlichen Zellen und bilden eine Lipiddoppelschicht der Zelloberflächenmembranen

Was sind Lipide?

Lipide sind die Klasse der organischen Verbindungen, was bedeutet, dass es sich um kohlenstoffhaltige Verbindungen handelt. Sie sind von Natur aus hydrophob (wasserscheu). Sie sind meist in Lösungsmitteln wie Alkohol, Ethern und Chloroform löslich, aber in Wasser unlöslich. Lipide sind die vielfältige Gruppe von Verbindungen, die aus Fettsäuren und ihren Derivaten bestehen. Dazu gehören meist Fette, Öle, Wachse, Hormone und bestimmte Bestandteile der Zellmembran.

Bildung eines basischen Lipids

Die Grundstruktur eines Lipids besteht aus einem Glycerin und drei Fettsäuren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wenn sich ein Molekül aus einem Glycerinmolekül und drei Fettsäuremolekülen (R-COOH) zusammenfügt, findet eine Kondensationsreaktion (Esterbindungsbildung) statt, wobei drei Wassermoleküle werden entfernt und es entsteht ein basisches Lipid, das als bezeichnet wird Triglycerid. Die Bildung eines Triglycerids ist in Abbildung 1 dargestellt. In Triglyceriden ist das Glycerinmolekül (Abbildung 2) gleich, es gibt jedoch unterschiedliche Formen von Ölen und Fetten, die auf die unterschiedlichen Arten angelagerter Fettsäuren zurückzuführen sind. Die R-Gruppe der Fettsäuregruppe kann entweder mehrfach ungesättigt oder gesättigt sein.

Abbildung 1 veranschaulicht die Bildung eines Triglycerids

Glycerins sind Alkohole mit drei Kohlenstoffen und drei Hydroxyl (OH)-Molekülen, die mit fünf Wasserstoffmolekülen verbunden sind (chemische Struktur unten gezeigt). In einer Triglyceridstruktur sind Glycerole das Rückgrat, das mit drei Fettsäuren verbunden ist. Die Bindung zwischen Fettsäure und Glycerin wird als Esterbindung bezeichnet.

Abbildung 2 zeigt die chemische Struktur von Glycerin

Funktionen von Lipiden

Lipide umfassen hauptsächlich Fette, Öle, bestimmte Hormone, Steroide und einige komplexe Moleküle, wodurch sie eine Vielzahl von Funktionen haben, von denen einige wie folgt sind:

  • Sie sind die Energiequelle
  • Sie können leicht im Körper aufbewahrt werden
  • Die isolieren die Körpertemperatur
  • Sie schützen als Polstermittel viele innere Organe
  • Sie sind ein wichtiger Bestandteil lebender Zellen, da die Zellmembran aus einer Phospholipid-Doppelschicht besteht
  • Einige Lipide wie Steroide und Hormone dienen als chemische Botenstoffe zwischen Zellgewebe und Organen

Test auf Lipide

Der Test auf Lipide wird als Emulsionstest bezeichnet. Der Prozess folgt:

  • Fügen Sie 2 cm3 Tropfen der zu testenden Probe mit 5 cm3 Ethanol hinzu
  • kräftig schütteln, um die Lösung aufzulösen
  • Fügen Sie eine gleiche Menge Wasser hinzu
  • Ethanol emulgiert Fette
  • Wenn Wasser hinzugefügt wird, bricht eine Emulsion aus winzigen Tröpfchen das Licht, um das Erscheinungsbild trüb aussehen zu lassen

Klassifizierung von Lipiden

Es gibt kein international anerkanntes System zur Klassifikation von Lipiden. Die folgende Abbildung ist eines der anerkannteren Klassifikationsschemata für Lipide (Abbildung 3):

Abbildung 3 Schema der Klassifikation von Lipiden

Klassifizierung von Lipiden

Lipide werden grundsätzlich in drei Gruppen eingeteilt

Einfache Lipide

Dies sind die Ester von Fettsäuren mit Glycerin
Fettsäuren + Glycerins ——- Lipide

Sie werden weiter in zwei Gruppen unterteilt
a) Triglycerid b) Wachse

a) Triglyceride

Triglyceride sind die Kombinationen von Fettsäuren mit Glycerinen (Abbildung 1)
Öle sind die flüssigen Triglyceride bei Raumtemperatur
Fette sind bei Raumtemperatur feste Triglyceride
Öle und Fette sind die am häufigsten vorkommenden Lipide in der Natur. Es ist die beste Art der Nahrungsreserve des Menschen und Energiequelle. Sie wirken auch als Isolator für die Körperwärme und schützen auch innere Organe des Körpers als Polstermaterial
Ein Triglyceridmolekül wird gebildet, indem ein Molekül Glycerin mit drei Fettsäuren kombiniert mit Glycerin verbunden wird. Jede Fettsäure wird verbunden und mit dem Glycerin kombiniert, wodurch eine Esterbindung in drei Kondensationsreaktionen gebildet wird.
Hydrolyse bewirkt den Abbau des Triglycerids und produziert Glycerin und drei Fettsäuren.
Triglyceride spielen aufgrund ihrer Unlöslichkeit und ihres hohen Kohlenstoff-Wasserstoff-Verhältnisses eine Schlüsselrolle bei der Atmung und Energiespeicherung
Triglyceride haben ein niedriges Masse-zu-Volumen-Verhältnis, was sie zu guten Molekülen für die Lagerung macht
Sie beeinflussen das Wasserpotential der Zellen nicht, da sie von Natur aus groß und in Wasser unlöslich sind

Dies sind die Ester von Fettsäuren mit Alkohol (mit höherem Molekulargewicht) außer Glycerin. Wachse sind überall in der Natur vorhanden. Viele Pflanzenblätter haben eine wachsartige Beschichtung, die sie vor Austrocknung schützt. Diese werden ebenfalls aus tierischen Quellen gewonnen, von denen am häufigsten Bienenwachs und Walrat sind. Spermaceti wird aus dem Sperma von Walen gewonnen und wird hauptsächlich in Kosmetika und Pharmazeutika verwendet.

Zusammengesetzte Lipide

Dies sind die Ester von Fettsäuren mit Alkohol und einige andere zusätzliche Gruppen, aufgrund derer sie viele Arten haben, die am häufigsten sind:

a) Phospholipid

  • Sie finden sich in tierischen Geweben, Plasmamembranen von tierischen und pflanzlichen Zellen
  • Phospholipide sind die Klasse von Lipiden, die aus Estern von Fettsäure und Glycerinen mit Phosphorsäure und Stickstoffbase bestehen
  • Sie bilden den größten Teil der Zellmembran
  • Sie bilden aufgrund ihres amphiphilen Charakters die Lipiddoppelschicht. Die Phospholipidmoleküle bestehen aus zwei („wasserabweisenden“) hydrophoben Fettsäure-„Schwanzen“ und der hydrophilen („wasserliebenden“) Phosphatgruppe „Kopf“ (Abbildung 4)
  • Phospholipide sind Lipiden ähnlich, bei denen ein Fettsäuremolekül durch ein Phosphatmolekül ersetzt wird. Die Fettsäuren sind hydrophob und stoßen Wasser ab, während Phosphatmoleküle Wasser anziehen und als hydrophil bekannt sind
Abbildung 4 schematisch die Struktur eines Phospholipids

b) Plasmogene

Sie kommen in den Herz- und Gehirnmuskeln vor

c) Lipositol

Diese sind in Kombination mit Phytinsäure in Gehirn, Herz, Nieren und Pflanzengewebe vorhanden

d) Sphingomyelin

Diese sind die Quelle von Phosphorsäure im Körpergewebe, die auch im Nervensystem und in den roten Blutkörperchen vorhanden ist

Abgeleitete Lipide – Fettsäuren

Fettsäuren bestehen aus Kohlenwasserstoffketten, die mit einer Carboxylgruppe (-COOH) enden. Es gibt etwa 70 Fettsäuren. Diese werden aus der Hydrolyse natürlicher Fette und Öle gewonnen. Die Kohlenwasserstoffkette in Fettsäure kann eine Einfach- oder Doppelbindung enthalten.

Diejenigen Fettsäuren, die eine Einfachbindung zwischen Kohlenstoff-Wasserstoff und keine Doppelbindungen haben, werden sie genannt gesättigte Fettsäuren da alle Kohlenstoffatome mit der maximal möglichen Anzahl von Wasserstoffatomen verbunden sind. Diejenigen Fettsäuren, die eine Doppelbindung (C=C) zwischen Kohlenstoff-Wasserstoff aufweisen, werden als . bezeichnet ungesättigten Fettsäuren (Abbildung 5).

  • Dies sind die hydrolytischen Produkte von zusammengesetzten Lipiden
  • Diese sind in tierischen und pflanzlichen Lebensmitteln enthalten
  • Sie werden durch Hydrolyse von Fetten gewonnen
  • Sie sind Kohlenwasserstoffderivate
Physikalische Eigenschaften von Lipiden
  • Meistens sind Fette und Öle farblos, geruchlos, wenn eine Farbe vorhanden ist, aufgrund einer externen Gruppe
  • Sie haben weniger als ein spezifisches Gewicht
  • Sie haben niedrige Schmelzpunkte
  • Sie sind schlechte Wärme- und Stromleiter
  • Beim Rühren mit Wasser in Gegenwart von Seife bilden sie Emulsionen

Chemische Eigenschaften von Lipiden

Dies geschieht durch Erhitzen eines Triglycerids mit Wasser bei höherer Temperatur und Druck in Gegenwart eines Enzyms namens Lipase, das zur Bildung von Fettsäure und Glycerin führt.

Sponifizierung

Wenn Fette mit einer starken alkalischen Lösung gekocht werden, zerfallen sie in Glycerin und Salz von Fettsäuren, wie in der folgenden Abbildung gezeigt:

Es ist der unangenehme Geruch und Geschmack, der von Fetten beim Altern aufgrund der Hydrolyse von Bestandteilen der Glyceride von Fetten zu Fettsäure und Glycerin entwickelt wird.

Zellmembran

Phospholipide bilden aufgrund der Anordnung des hydrophilen Phosphatgruppenkopfes und des hydrophoben Fettsäureschwanzes Zellmembranen. Die Phospholipide reihen sich aneinander mit Schwänzen nach innen und Kopf nach außen, wodurch eine Doppelschicht gebildet wird, die als bezeichnet wird lipiddoppelschicht.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Phospholipid-Doppelschicht

Krebs-Zyklus-Säuren

Alpha-Ketoglutarsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Brenztraubensäure, Pantothensäure

Diese Säuren sind Zwischenverbindungen, die im Krebs-Zyklus vorkommen und notwendig sind, um Zellenergie für den Gewebebrennstoff zu erzeugen. Die Ergänzung dieser essentiellen Säuren des Krebs-Zyklus in Gegenwart von Nährstoff-Cofaktoren kann dazu führen, dass ein teilweise abgeschlossener Krebs-Zyklus abgeschlossen wird. Sie können die schädlichen Nebenprodukte, die durch eine abnormale Energieproduktion in den Mitochondrien erzeugt werden, verhindern und entfernen. Und sie können eine hohe Ausbeute an ATP aus den Mitochondrien zur Gewebeenergie stimulieren.

Die Ergänzung dieser Kraftstoffquellen des Krebs-Zyklus kann für verschiedene Zwecke ratsam sein. Sie können helfen, bestimmte Stoffwechselstörungen zu korrigieren, die aus einer abnormalen Energieproduktion der Mitochondrien resultieren. Sie können einen ergogenen Vorteil bei der sportlichen Leistung bieten, indem sie Muskelenergie erzeugen, die aerobe Kapazität erhöhen und Ermüdung verhindern.Sie können bei der Verbesserung der sportlichen Leistung sogar noch hilfreicher sein, wenn sie in Verbindung mit Alkalisierern verwendet werden, die den Aufbau von Milchsäure im Muskelgewebe puffern und die Sauerstoffversorgung des Gewebes verbessern.

Alpha-Ketoglutarsäure (AKG)

Alpha-Ketoglutarsäure spielt eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion des Krebs-Zyklus. Als Vorläufer der Aminosäure Glutaminsäure stabilisiert AKG den Blutzuckerspiegel während des Trainings. Alpha-Ketoglutarsäure kommt dem Sportler zugute, indem sie die Proteinsynthese unterstützt, längere, intensivere Trainingseinheiten ermöglicht und eine gesunde Stickstoffbilanz fördert.

Studien an Patienten, die nach einer Operation zusätzlich Alpha-Keto-Glutarat erhielten, fanden eine stickstoffsparende Wirkung und eine Verringerung des Verlusts an fettfreier Körpermasse. Alpha-Ketoglutarsäure hilft, den Ammoniumspiegel zu senken, der die Trainingsleistung beeinträchtigen kann. Studien haben gezeigt, dass sich in Muskeln, Niere und Gehirn gebildetes Ammoniak mit Alpha-Ketoglutarat und L-Glutamat kombiniert, um die Ammoniaktoxizität zu reduzieren. (31-33), (16-18)

Äpfelsäure

Apfelsäure wirkt als Katalysator im Krebs-Zyklus, um die Energieproduktion aus der Verbrennung von Brenztraubensäure zu erhöhen. Apfelsäure hilft auch bei der Erholung des Trainings, indem sie der Ansammlung von Milchsäure entgegenwirkt. Es wurde berichtet, dass die Supplementierung von Apfelsäure beim Chronischen Erschöpfungssyndrom von Vorteil ist, indem sie die Symptome von anhaltender Müdigkeit, Muskelmyalgie und arthritischen Schmerzen reduziert.

Fumarsäure

Fumarsäure ist das trans-Isomer der Apfelsäure, das in den Zitronensäurezyklus eintritt. Es ist ein Nebenprodukt in bestimmten Stadien des Arginin-Harnstoff-Zyklus und der Purin-Biosynthese. Bei gesunden Menschen wird Fumarsäure durch Sonneneinstrahlung in der Haut gebildet. Ein Mangel an Fumarsäure führt zur Ansammlung von Stoffwechselhalbprodukten, die für die Entstehung der Hautläsionen der Psoriasis verantwortlich sein können. Psoriasis-Kranke haben einen biochemischen Defekt, bei dem sie nicht genug Fumarsäure produzieren, was eine längere Sonneneinstrahlung erfordert. Die Verabreichung von Fumarsäure an Personen, die an Psoriasis leiden, hat zu einer allmählichen Beseitigung der Symptome geführt. (40-47), (25-32)

Bernsteinsäure

Bernsteinsäure ist, wie andere Zwischenprodukte des Krebs-Zyklus, ein Eintrittsweg für andere Metaboliten in den Zyklus und an einer Vielzahl wichtiger biologischer Wirkungen beteiligt. Zusätzlich zu seiner Enzymaktivität kombiniert es sich mit Protein, um Muskelfasern und Nervenenden wieder aufzubauen und hilft bei der Bekämpfung von Infektionen. Personen mit Chronic Fatigue Syndrome haben einen niedrigen Bernsteinsäurespiegel im Urin.
Mehrere Aminosäuren werden zu Bernsteinsäure metabolisiert, die eine Quelle für anaerobe und aerobe Energie liefert. Aminosäuren, die zu Bernsteinsäure metabolisiert werden, haben sich als wichtig für die Versorgung des Herzens mit Brennstoff für Myokardkontraktionen unter Bedingungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt erwiesen. Die Aminosäure GABA kann je nach Stoffwechselbedarf des Körpers entweder zu Bernsteinsäure zur zellulären Energiegewinnung oxidiert oder zu GHB reduziert werden. (48-50), (33-35)

Zitronensäure

Zitronensäure, eine natürliche organische Säure, die in gewissem Maße in allen pflanzlichen und tierischen Geweben vorhanden ist, nimmt einen zentralen Platz im Krebs-Zyklus ein. Nachdem Proteine, Fette, Kohlenhydrate und Aminosäuren zu Acetyl-Coenzym A oxidiert wurden, wird die Essigsäure-Untereinheit von Acetyl-CoA mit Oxalacetat zu einem Citrat-Molekül kombiniert. Das Acetyl-Coenzym A fungiert als Transporter von Essigsäure von einem Enzym zum anderen.

Erstmals 1784 vom deutschen Biochemiker Karl Wilhelm Steele isoliert, ist Zitronensäure heute weithin bekannt für die Linderung von Müdigkeit, schlechter Verdauung, Erkältungs- und Grippeinfektionen, Asthma, Bluthochdruck und Cholesterinablagerungen in Blutgefäßen.

Brenztraubensäure

Brenztraubensäure ist eine Drei-Kohlenstoff-Ketosäure, die in den Endstadien der Glykolyse produziert wird. In den Mitochondrien wird Brenztraubensäure im Zytoplasma entweder zu Laktat reduziert oder zu Acetyl-CoA oxidiert.

Untersuchungen haben gezeigt, dass die Einnahme von Pyruvat (dem Salz der Brenztraubensäure) die Muskelausdauer erhöhen und den Fettabbau fördern kann. Brenztraubensäure scheint auch die Menge an Glukose zu erhöhen, die aus dem zirkulierenden Blut in die Muskelzellen gelangt. Diese Fähigkeit von Brenztraubensäure führt zu einer Erhöhung der sofort verfügbaren Energie sowie zu einer Erhöhung des gespeicherten Muskelglykogenspiegels für zukünftige Energie. Untersuchungen haben gezeigt, dass Brenztraubensäure die Muskelausdauer erhöht und die Herzleistung verbessert.

In einer Studie wurde festgestellt, dass Brenztraubensäure die Glukoseextraktion um fast 300 % und das Muskelglykogen um 50 % nach einer Stunde Training erhöht. Die Forscher fanden heraus, dass die Armausdauer um 150% und die Beinausdauer um 60% zunahm. Eine weitere Studie, die an der University of Pittsburgh School of Medicine durchgeführt wurde, ergab, dass Brenztraubensäure bei übergewichtigen Frauen mit einer kalorienarmen Flüssigdiät zu einem signifikanten Gewichtsverlust und Fettabbau führte. Zwei potenzielle Mechanismen, durch die Brenztraubensäure sowohl den Fett- als auch den Gewichtsverlust verbessert, sind die Erhöhung sowohl der Stoffwechselrate im Ruhezustand als auch der Fettverwertung. (51-56), (36-41)

Pantothensäure

Vitamin B5 wird für die Synthese von Coenzym A benötigt. Die Supplementation von Panthenin (an Cysteamin gebundenes Pantothenat) reduziert nachweislich erhöhte Blutfettwerte beim Menschen. Es wird postuliert, dass diese Wirkung auf die beschleunigte Synthese von Coenzym A zurückzuführen ist. Es hat auch eine antiarrhythmische Wirkung in Tierherzen durch Erhöhung der ATP-Synthese erzeugt. Eine Studie an Elite-Langstreckenläufern, die zwei Wochen lang täglich zwei Gramm Pantothensäure erhielten, ergab eine 17-prozentige Reduzierung der Milchsäurebildung und eine siebenprozentige Reduzierung des Sauerstoffverbrauchs bei längerem, anstrengendem Training. (57-61), (42-46)

Zusammenfassung

Der Krebs-Zyklus ist ein beredtes und essentielles System, das entwickelt wurde, um große Mengen an zellulärer Energie zu erzeugen, die für das Leben erforderlich ist. Eine Störung des Krebs-Zyklus, sei es durch Mangel an Energiesubstraten, erworbene oder vererbte Krankheitszustände oder körperlichen Stress, führt zu einer Hemmung der normalen Energieproduktion und trägt zu einer Vielzahl von Stoffwechselstörungen und Symptomen bei.

Die Verwendung von ergänzenden Krebs-Zyklussäuren und Anti-Müdigkeitspuffern kann das Management der mitochondrialen Energiesubstrate unterstützen und die zelluläre Energieproduktion steigern. Ein solches Ernährungskonzept kann Sportlern, Menschen im Alter sowie Menschen mit Stoffwechselstörungen durch erbliche mitochondriale Erkrankungen oder erworbene Erkrankungen wie Alzheimer und Chronic Fatigue Syndrom (CFS) zugute kommen.


Materialen und Methoden

Stämme und Plasmide

Die meisten Experimente in dieser Studie wurden mit NCM3722 (und seinen Derivaten) durchgeführt. Andere Experimente wurden mit einer Sammlung von E coli aus verschiedenen Wirtsorganismen isoliert 27 (SI Abschnitt 1). Für Promotoraktivitätsmessungen verwendeten wir Reporterplasmide aus unserer umfassenden Bibliothek von Reporterstämmen 58 . In dieser Bibliothek kontrollieren interessierende Promotoren ein schnell faltendes grün fluoreszierendes Protein-Gen, das für Bakterien optimiert ist (GFPmut2) auf einem Low-Copy-Plasmid (pSC101-Ursprung). Für die aktuelle Studie transformierten wir ausgewählte Reporterplasmide in NCM3722. Zur Messung der CRP-cAMP-Aktivität haben wir einen synthetischen Reporter verwendet, der auf dem lacZ Promotor mit neu gemischten LacI-Bindungsstellen, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie ein zuverlässiger Reporter für die CRP-cAMP-Aktivität sind 23,24. In einem Kontrollexperiment fanden wir, dass dieser Reporter eine Michaelis-Menten-ähnliche Reaktion auf externes cAMP zeigt (SI Abb. S14). Wir stellen fest, dass eine aktuelle Studie zeigt, dass die Messung der CRP-cAMP-Aktivität mit der cAMP-Ausscheidungsrate korreliert – ein Proxy für die interne cAMP-Konzentration 18 . ΔcyaA, ΔcpdA, ΔMalz ΔptsG Stämme wurden konstruiert, indem die entsprechende Deletion in NCM3722 aus der Keio-Knockout-Sammlung (abgeleitet vom BW25113-Stamm 59) durch P1-Transduktion transduziert wurde.

Wachstumsraten- und Promotoraktivitätsmessungen

Die Zellen wurden über Nacht in M9-Minimalmedium (42 mM Na&spplus;2HPO4, 22 mM KH2Bestellung4, 8,5 mM NaCl, 18,5 mM NH4Cl, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl) mit 11 mM Glucose und 0,05 % Casaminosäuren bei 37 °C, um nicht einschränkende Bedingungen für die Vorkultur zu gewährleisten. Unter Verwendung eines robotischen Liquid-Handlers (FreedomEvo, Tecan) wurden 96-Well-Platten mit 150 μl M9-Minimalmedium (ohne NH4Cl) mit den angegebenen Stickstoff- und Kohlenstoffquellen. cAMP wurde in den angegebenen Konzentrationen in das Medium eingeschlossen. Die Wells wurden mit Bakterien in einer Verdünnung von 1:500 aus der Übernachtkultur beimpft. Diese hohe Verdünnung minimiert Nährstoffreste aus der Übernachtkultur. Die Wells wurden mit 100 μl Mineralöl (Sigma) bedeckt, um eine Verdunstung zu verhindern, ein Schritt, von dem wir zuvor festgestellt hatten, dass er das Wachstum nicht signifikant beeinflusste 58 und in einen automatischen Inkubator überführt. Jedes Experiment umfasste 6 Platten, jede Platte mit zwei unterschiedlichen Bedingungen oder Stämmen. Experimente zur Sammlung von Wildstämmen wurden in einem anderen Format durchgeführt: Jede Platte enthielt ein Medium (spezifische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen) und 96 verschiedene Stämme (94 aus der Wildsammlung, NCM3722 und MG1655). Die Zellen wurden in einem automatisierten Inkubator unter Schütteln (6 Hz) bei 37 °C für etwa 20 Stunden gezüchtet. Alle 8 Minuten wurde die Platte von einem Roboterarm in ein Multi-Well-Fluorimeter (Infinite F200, Tecan) überführt, das die optische Dichte (OD, 600 nm) und die GFP-Fluoreszenz (535 nm) abliest.

Berechnung der Promoteraktivität und Wachstumsrate

Die Wachstumsrate wurde als zeitliche Ableitung des natürlichen Logarithmus der OD-Kurven berechnet, μ = dln(OD)/dt. Die exponentielle Wachstumsrate ist der Mittelwert über eine Region von mindestens 2 Generationen mit einer nahezu konstanten Wachstumsrate. Für Berechnungen der Promotoraktivität wurde die Hintergrundfluoreszenz von GFP-Messungen unter Verwendung eines Reporterstamms, der den promotorlosen Vektor pUA66 trägt, wie beschrieben 58 subtrahiert. Die Promotoraktivität wurde dann unter Verwendung des zeitlichen Derivats von GFP dividiert durch OD wie beschrieben 23 berechnet.

Metabolitenmessungen

Die Zellen wurden in M9-Minimalmedien (ohne NH&sub2;4Cl) mit Glucose oder Glycerin (0,4% w/v) als Kohlenstoffquelle und Arginin (4,6 mM) als Stickstoffquelle. Eine andere Kultur wurde in markiertem Gutnick minimal (0,4% w/v [U- 13 C6] Glucose und 10 mM NH4Cl). Exponentiell wachsende Zellen wurden schnell durch Vakuumfiltrieren der Kultur auf Nylonmembranfiltern gequencht und schnell auf Platten mit vorgekühltem (–20 °C) 40:40:20 Methanol/Acetonitril/Wasser-Lösungsmittel übertragen. Die OD (600 nm) wurde zum Zeitpunkt des Quenchens gemessen. Die Zellen auf den gequenchten Filtern wurden 20 min bei -20 °C extrahiert und anschließend bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände von einer der unmarkierten M9-Kulturen und der markierten Gutnick-Kultur wurden gemischt und die Mischungen wurden unter Stickstoffgas getrocknet und in Wasser von HPLC-Qualität rekonstituiert. Diese Proben wurden durch Umkehrphasen-Ionenpaarchromatographie, gekoppelt an ein Exactive-Orbitrap-Massenspektrometer (ThermoFisher) durch Elektrospray-Ionisation im Negativ-Ionen-Modus 60 analysiert. Die Metaboliten wurden anhand des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses und der Retentionszeit identifiziert, die mit authentifizierten Standards übereinstimmten. Die absoluten Metabolitenkonzentrationen wurden bestimmt, indem das Verhältnis von unmarkierten Metaboliten aus M9-Kulturen zu 13 C-markierten Metaboliten bekannter Konzentrationen in Gutnick-Medienkulturen 61 nach Korrektur der natürlichen Häufigkeit von 13 C, unvollständiger Markierung aufgrund von Verunreinigungen und Kohlenstoff (CO2) Fixierung, die OD600 der beiden Kulturen und die Volumenverhältnisse des Überstands.

Überlebenstest

Die Zellen wurden in den entsprechenden Wachstumsmedien in hoher Verdünnung (1:1000–1:5000) inokuliert und bei 37 °C bis OD . gezüchtet

0,1. Die Kulturen wurden mit 30 mM H . behandelt2Ö2 für 45 min, seriell verdünnt und auf LB-Platten zur Zählung lebensfähiger Zellen (koloniebildende Einheiten – CFU) ausplattiert. Die vorbehandelten Kulturen wurden auch ausplattiert, um die anfängliche Zellzahl zu bestimmen und den Überlebensprozentsatz zu berechnen.


Regulierung der Kohlenstoffquelle der Sekundärstoffwechselbiosynthese in Pilzen

Wie bei Actinomyceten beobachtet, synthetisieren Pilze auch Antibiotika als Reaktion auf physiologische Belastungen, wie Nährstofflimitierung (Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphatquellen). Das Nährmedium beeinflusst die Produktion von Antibiotika deutlich. 161 Darüber hinaus kann die Kohlenstoffquelle eine komplexe Regulation der Genexpression und der Enzymaktivitäten für die Polyketidsynthese ausüben. 162

Tabelle 2 zeigt einige Beispiele von Antibiotika, die von Pilzen produziert werden, die durch verschiedene Kohlenstoffquellen unterdrückt werden, und ihre Zielenzyme.

Penicilline und Cephalosporine sind β-Lactam-Antibiotika. Die Bildung hydrophober Penicilline wurde nur bei Pilzen beschrieben, insbesondere Penicillium chrysogenum und A. nidulans, während die hydrophilen Cephalosporine von beiden Pilzen produziert werden, z. Acremonium chrysogenum (Cephalosporin C) und Bakterien. 163

In P. chrysogenum, Glukose unterdrückt die Transkription von Penicillin-Biosynthesegenen pcbAB, pcbC und penDE 164, die für δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-Cysteinyl-D-Valinsynthetase (ACVS) kodieren, Isopenicillin n-Synthase bzw. IPN-Acyltransferase. Während sich Glukose negativ auswirkt pcbAB, pcbC und penDE Genpromotoren, übt ein alkalischer pH-Wert einen kleinen positiven Effekt auf diese Promotoren aus. 164 Die P. chrysogenum pcbC Gen wurde stromabwärts des starken, induzierbaren Hansenula polymorpha Alkoholoxidase-Promotor (PAOX) und wurde am P . integriertAOX Ort in der H. polymorpha Genom und kultiviert auf Methanol-Medium, um die P . zu induzierenAOX und dann zur mittleren exponentiellen Wachstumsphase. Wenn Glukose (0,5 %) zu den Kulturen hinzugefügt wurde, führte eine Behandlung zu einer vollständigen Unterdrückung des PAOX (30 min nach Glukosezugabe), das Isopenicillin n-Synthaseprotein-Spiegel in den Zellen um >50% verringert. 165

Auf die gleiche Weise sind Gene aatA und ipnA aber nicht acvA (homologe zu penDE, pcbC und pcbAB, bzw.) werden durch Glukose in A. nidulans. 166, 167 Eine Cre-Konsensussequenz 5′-SYGGRG-3′, befindet sich in der Upstream-Region des ipnA Gen und die Bindung von CreA (CCR) wurde bestätigt in vitro. 168 Es hat sich jedoch gezeigt, dass A. nidulans creA Mutanten, die in Glucose kultiviert wurden, zeigen immer noch eine Repression von ipnA Transkription. 169

CreA ist das wichtigste Repressorprotein, das die CCR von Genen reguliert, die am Kohlenstoffmetabolismus beteiligt sind A. nidulans. 170 Es bindet an die Konsensus-DNA-Sequenz 5'-SYGGRG-3' (wobei S C oder GY sein könnte C oder T sein und R könnte A oder G sein) in Promotoren von Glucose-reprimierbaren Genen und schaltet deren Expression aus. Cre-Bindungsstellen finden sich in den Promotoren von cre Gene verschiedener filamentöser Pilze. 171

Die Promotoren vieler Glucose-reprimierbarer Zielgene haben Cre-bindende Konsensussequenzen. 172 Das Cre1-Protein (aus dem cre1 Gen) zeigt eine hohe Ähnlichkeit mit anderen Glucose-Repressor-Proteinen aus Fadenpilzen, was auf eine ähnliche Regulation und eine verwandte Rolle bei der CCR hindeutet. Janus et al. 171 identifizierte einen 114-bp-Minimalpromotor mit zwei Cre1-Bindungsstellen, die erste minimale regulatorische Promotorsequenz für den β-Lactam-Antibiotikum-produzierenden Pilz. Die Identifizierung von 114-bp-CT-reichen Sequenzen im nicht transkribierten cre1 Die stromaufwärts gelegene Region legt nahe, dass sie erforderlich ist, um die glukoseabhängige Genexpression auszulösen. 171

Mutationen in creB und creC haben eine geringe Wirkung auf die Kohlenstoffregulation der Penicillin-Biosynthese gezeigt. Alle diese Ergebnisse weisen auf einen zweiten Mechanismus der Kohlenstoffrepression hin, der creA unabhängig. 173

In A. chrysogenum, Glukose unterdrückt die Bildung von Cephalosporin C. Da dieser Organismus enthält cre1- und cre1-Bindungsstellen vor dem Isopenicillin n-Synthese (pcbC) und die DAOC/Deacetylcephalosporin-C-Synthase (cefEF) Gene, wird angenommen, dass cre1 könnte an der Unterdrückung der Antibiotikabildung beteiligt sein. Tatsächlich erhöhte Glukose im Wildtyp-Stamm den Spiegel von cre1 Transkripte sechsfach. Wie erwartet, in einem kommerziellen hochproduzierenden A. chrysogenum Belastung, Glukose hatte keinen Einfluss auf die cre1 Transkriptionsebenen. Daher ist es möglich, dass cre1 an der Glukoserepression der Cephalosporin-C-Produktion beteiligt sein könnte und dass dieser Kontrollmechanismus während des Programms zur Stammverbesserung dereguliert worden sein könnte. 171, 174 CT-reiche Regionen sind mutmaßliche Aktivatorsequenzen in unmittelbarer Nähe zu Transkriptionsstartstellen. 175 Zoll A. chrysogenumenthält die CT-reiche Region zwei eng beabstandete Bindungsstellen (nämlich BS14 und BS15), die kooperativ an Cre1 binden. Die cre1 Promoter von A. chrysogenum zeigt eine positive Autoregulation bei Glucoseinduktion. Dieser 114-bp-Minimalpromotor mit zwei Cre1-Konsensus-Bindungsstellen ist ein Beispiel für eine minimale regulatorische Promotorsequenz für diesen β-Lactam-Antibiotikum-produzierenden Pilz. 171

Eine direkte Hemmung (ein Mechanismus, der die Synthese auf der Ebene der Enzymaktivität hemmt, daher ist die Wirkung unmittelbar) der Wirkung von sekundären Stoffwechselenzymen kann auch an der Kontrolle der Kohlenstoffquelle beteiligt sein. So hemmen Glucose und eine Reihe ihrer phosphorylierten Metaboliten ACVS, das erste Enzym der Cephalosporin-Synthese, in Rohextrakten von A. chrysogenum und S. clavuligerus. 176 Da mit dem gereinigten Enzym keine Hemmung beobachtet wird, scheint dieses Phänomen durch die Konkurrenz um ATP zwischen Primär- (Embden-Meyerhof-Weg) und Sekundärmetabolismus verursacht zu sein. Dementsprechend wurde gefunden, dass die Hemmung von ACVS durch Zucker durch Zugabe von mehr ATP verhindert werden kann. Umgekehrt werden sowohl die rohe als auch die gereinigte Form von ACVS durch Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) gehemmt. Dieser Effekt scheint auf die Fähigkeit von G3P zurückzuführen zu sein, Cystein, ein Substrat von ACVS, chemisch zu komplexieren und zu entfernen. Die in vivo Die Bedeutung solcher inhibitorischen Phänomene muss noch bestimmt werden.

In Bezug auf den Mechanismus von CCR in A. nidulans, Kohlenstoffkatabolismus ist ein streng regulierter Prozess, wobei die energetisch günstigsten Kohlenstoffquellen bevorzugt gegenüber weniger leicht metabolisierbaren Kohlenstoffquellen verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass eine Glk (GlkA4) und eine Hexokinase (Hxk) gleichermaßen an der Zuckersignalisierung beteiligt sind. Einzel glkA4 und hxkA-Mutanten konnten sich in ihrer Funktion in der Katalyse und in der CCR gegenseitig ersetzen. Doppelmutanten in glkA4 und hxkA Gene zeigten eine Derepression in Genen, wie z facA für Acetatkatabolismus, xlnA zum Xylanabbau und alcA und alcR zur Ethanolverwertung. 177 Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Glucosephosphorylierung das relevante Signal für die Glucoserepression bei A. nidulans. 177 Außerdem ist die creA, creB, creC und cre1 Gene 178 wurden als Codierung für regulatorische Proteine ​​identifiziert, die an CCR in . beteiligt sind A. nidulans. CreA und Cre1 enthalten zwei Cys2Seine2 DNA-bindende Zinkfinger ähnlich den Saccharomyces cerevisiae Glukose-Repressor-Protein Mig1. 170, 179, 180 creB kodiert ein deubiquitinierendes Enzym, und creC kodiert ein WD40-Protein, das fünf WD40-Wiederholungen und eine prolinreiche Region enthält. CreC bildet mit CreB einen Komplex. 181, 182 Das vorgeschlagene Modell für CCR durch CreA-Modifikation oder -Stabilität beinhaltet, dass das CreB-Deubiquitinierungsenzym mit dem CreC-Protein komplexiert, um CreA unter kohlenstoffreprimierenden Bedingungen zu modifizieren oder zu stabilisieren. 183

Ein zusätzliches Gen, das am Mechanismus von beteiligt ist A. nidulans CCR ist creD. Mutationen in diesem Gen unterdrücken die creB15 und creC27 mutierte Phänotypen, die eine Derepression von zeigen facA und alcA Gene. Die creD Gen kodiert für ein Protein, das Arresting-Domänen und PY-Motive enthält und mit der HECT-Ubiquitinligase (homologe zum E6-assoziierten Protein-Carboxylterminus) interagiert. 184 Obwohl die Elemente von Ubiquitinierungs- und Deubiquitinierungsnetzwerken bekannt sind, müssen ihre direkten Ziele noch aufgeklärt werden. 170 Kürzlich wurde festgestellt, dass der Wirkungsmechanismus von CreA bei CCR weder seinen Abbau noch seine zelluläre Lokalisierung erfordert, sondern eine gewisse Modifikation oder Wechselwirkung mit einem anderen Protein zu beinhalten scheint, um als Repressor zu wirken. 170 In einer Studie zur Aufklärung der Kinetik der Glukoseaufnahme in A. nidulanswurden zwei energieerfordernde Glukosetransportsysteme identifiziert: ein Glukose-reprimierbares System mit hoher Affinität und ein Glukose-induzierbares System mit niedriger Affinität (MstE). Neben Glukose, mstE die Expression wird in Gegenwart anderer reprimierender Kohlenstoffquellen induziert und hängt von der Funktion des Transkriptionsrepressors CreA ab. 185

Pleuromutilin ist ein diterpenoides Antibiotikum, das von Pleurotus mutilis-04. Pleuromutilin wird derzeit als Zwischenprodukt zur Herstellung von Tiamulin und Valnemulin für die Veterinärmedizin verwendet. Darüber hinaus ist Retapamulin ein vielversprechendes Antibiotikum mit Potenzial für den Einsatz beim Menschen zur Behandlung von grampositiven bakteriellen Infektionen. 186 Verglichen mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle war Sojabohnenöl für die Pleuromutilin-Produktion in Schüttelkolbenkulturen von Vorteil. 187 Dieses Ergebnis deutet auf eine unterdrückende Wirkung von Glucose auf die Antibiotikaproduktion hin.

Fusarium fujikuroi produziert das rote Pigment Bikaverin, das antibiotische Aktivität gegen einige Protozoen und phytopathogene Pilze zeigt. 188 Die Antibiotikaproduktion erfolgt während der stationären Wachstumsphase, nach Erschöpfung der Stickstoffquelle. Nach 12 Tagen Inkubation wurde die Antibiotikaproduktion durch Saccharose stimuliert, jedoch in Gegenwart äquivalenter Kohlenstoffkonzentrationen, bis zu 8% Glucose, durch Glucose, Galactose, Fructose, Maltose, Xylose und Glycerin stark unterdrückt. 189 Saccharose wird durch Invertase-Aktivität in Glucose und Fructose umgewandelt, jedoch reproduzierten weder Fructose noch eine Mischung aus Glucose und Fructose die in F. fujikuroi, was darauf hindeutet, dass das induzierende Signal Saccharose selbst ist und kein von Saccharose abgeleiteter Metabolit.


Lipidkatabolismus

Triglyceride sind eine Form der langfristigen Energiespeicherung bei Tieren. Sie bestehen aus Glycerin und drei Fettsäuren (siehe Abbildung 1 in Lipide). Phospholipide bilden die Zell- und Organellenmembranen aller Organismen mit Ausnahme der Archaeen. Die Phospholipidstruktur ist ähnlich wie Triglyceride außer dass eine der Fettsäuren durch eine phosphorylierte Kopfgruppe ersetzt ist (siehe Abbildung 2 in Lipide). Triglyceride und Phospholipide werden zuerst durch Freisetzung von Fettsäureketten (und/oder der phosphorylierten Kopfgruppe im Fall von Phospholipiden) aus dem Drei-Kohlenstoff-Glycerin-Rückgrat abgebaut. Die Reaktionen zum Abbau von Triglyceriden werden katalysiert durch Lipasen und solche mit Phospholipiden werden katalysiert durch Phospholipasen. Diese Enzyme tragen zur Virulenz bestimmter Mikroben bei, wie zum Beispiel des Bakteriums Staphylococcus aureus und der Pilz Cryptococcus neoformans. Diese Mikroben verwenden Phospholipasen, um Lipide und Phospholipide in Wirtszellen zu zerstören und verwenden dann die katabolen Produkte zur Energiegewinnung (siehe Virulenzfaktoren von bakteriellen und viralen Krankheitserregern).

Die resultierenden Produkte des Lipidkatabolismus, Glycerin und Fettsäuren, können weiter abgebaut werden. Glycerin kann zu Glycerin-3-phosphat phosphoryliert und leicht in Glycerinaldehyd-3-phosphat umgewandelt werden, das durch die Glykolyse weitergeführt wird. Die freigesetzten Fettsäuren werden in einem Prozess namens . abgebaut β-Oxidation, das nacheinander Acetylgruppen mit zwei Kohlenstoffatomen von den Enden der Fettsäureketten entfernt und NAD + und FAD reduziert, um NADH und FADH . zu produzieren2, deren Elektronen zur Herstellung von ATP durch oxidative Phosphorylierung verwendet werden können. Die während der β-Oxidation produzierten Acetylgruppen werden von Coenzym A in den Krebs-Zyklus transportiert und ihre Bewegung durch diesen Zyklus führt zu ihrem Abbau zu CO .2, produziert ATP durch Phosphorylierung auf Substratebene und zusätzliches NADH und FADH2 Moleküle (siehe Stoffwechselwege für eine detaillierte Darstellung der β-Oxidation).

Andere Arten von Lipiden können auch von bestimmten Mikroben abgebaut werden. Zum Beispiel die Fähigkeit bestimmter Krankheitserreger, wie Mycobacterium tuberculosis, um Cholesterin abzubauen, trägt zu ihrer Virulenz bei. Die Seitenketten des Cholesterins können leicht enzymatisch entfernt werden, aber der Abbau der verbleibenden kondensierten Ringe ist problematischer. Die vier verschmolzenen Ringe werden nacheinander in einem mehrstufigen Prozess aufgebrochen, der durch spezifische Enzyme erleichtert wird, und die resultierenden Produkte, einschließlich Pyruvat, können im Krebs-Zyklus weiter abgebaut werden.

Denk darüber nach


Warum ist es gut, Glycerin als Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Zwischenprodukte in Arzneimitteln herzustellen? - Biologie

(mit eingebetteten Fragen und Antworten)
Lec. 8. Biol C2005/F2401 2010 L. Chasin
30. September 2010 Zuletzt aktualisiert: Donnerstag, 30. September 2010 00:35
Copyright 2010 Lawrence Chasin und Deborah Mowshowitz Department of Biological Sciences Columbia University New York, NY

Enzymhemmung:
Konkurrenzhemmung
nicht kompetitive Hemmung
allosterische Hemmung
Rückkopplungshemmung von Stoffwechselwegen

Freie Energie, Delta G und Delta G Ö
Gleichgewicht
Zusammenfassung der Änderungen der freien Energie
ATP-Hydrolyse
"Hochenergetische" Anleihen
Gekoppelte Reaktionen
Gykolyse
NAD und NADH2
Anaerobiose
Fermentation
Energiegewinn

Welche Funktion haben diese Enzyme in der Zelle? Die Enzyme sind zentral auf das ganze Problem, aus einer alten zwei neue E. coli-Zellen zu bauen. Erinnern Sie sich an den Fluss von Glukose-Kohlenstoffatomen in die 50 verschiedenen kleinen Moleküle, die dann die 5000 verschiedenen Makromoleküle bilden? Jeder Pfeil in diesen Biosynthesewegen stellt ein Enzym dar, ein bestimmtes Protein mit einer bestimmten Aminosäuresequenz, mit einer bestimmten 3-D-Struktur, das bestimmte Substrate binden und die chemische Umwandlung in bestimmte Produkte katalysieren kann (und mit bestimmten Km und Tonnen S). (Zeichnen Sie Pfeile und Buchstaben, die von Glukose ausgehen).

(Enzymhemmung)
Lassen Sie uns die Diskussion über Enzyme fortsetzen, indem wir die Modulation der Enzymaktivität durch 3 Arten der Hemmung der katalytischen Wirkung eines Enzyms.

Die 3 Arten von Inhibitoren, die ich diskutieren möchte, sind:

  • kompetitiv (z. B. zur Veranschaulichung der Wirkung von Medikamenten)
  • nicht wettbewerbsfähig (z. B. Gifte)
  • allosterisch (z. B. charakteristisch für natürliche Feedback-Regulatoren)

(Wettbewerbshemmung)
Ein kompetitiver Inhibitor ist ein Molekül, das mit dem natürlichen Substrat um die Substratbindungsstelle des Enzyms konkurriert. In Anwesenheit von a WETTBEWERBSHEMMER:

Bei niedrigem [S] können Sie eine gute wirksame Hemmung erzielen, solange die Substratkonzentration niedrig ist.
aber bei hohem [S] wird die comp. Hemmstoff (I) wird überschwemmt.

Schauen wir uns diese Situation in unserem Vo vs. S-Plot an.

Bei einer gegebenen Konzentration von I führt die Zugabe von mehr und mehr S schließlich zu Vmax zurück, da der Inhibitor (I) ausgeschwemmt wird.

Die ERSICHTLICH km in Gegenwart des Inhibitors, erhöht, was die Schwierigkeit widerspiegelt, die das Substrat hat, angesichts all dieser Konkurrenz durch den Inhibitor an das Enzym zu binden.

Daraus folgt, dass, da der kompetitive Inhibitor an dieselbe Stelle wie das Substrat binden muss, er eine dem SUBSTRAT SEHR ähnliche Struktur aufweisen sollte. Siehe [Purves 6.21].

Warum ist kompetitive Hemmung wichtig? Denn da wir die Struktur des Substrats kennen, können wir mit Hilfe organischer Chemiker organische Kandidatenmoleküle als spezifische Enzyminhibitoren entwerfen und synthetisieren, die in der Medizin nützlich sein können.

Zum Beispiel habe ich heute Morgen, wie jeden Morgen, 100 mg des Medikaments Allopurinol eingenommen, das die 2-Ring-Struktur hat, wie auf dem Handout zu sehen ist.

Ich habe es eingenommen, weil mein Harnsäurespiegel (siehe Harnsäurestruktur im Handout) zu hoch ist. . Harnsäure ist nicht sehr löslich. Wenn die Konzentration im Blut zu hoch ist, kann sie ausfallen und sich absetzen, sich in den Kapillaren Ihrer Füße ansammeln und Sie haben Gicht, eine schmerzhafte Erkrankung. Oder es kann bei seiner Bildung im Urin ausfallen (daher der Name) und zu Nierensteinen führen.

Harnsäure wird durch die Wirkung des Enzyms Xanthinoxidase produziert, das die Reaktion katalysiert:

Hypoxanthin (aus Nukleinsäuren, die wir essen) --------> Harnsäure (die ausgeschieden wird) (siehe Handout)

Aus einem unbekannten Grund wird dieses Enzym bei manchen Menschen überaktiv, so dass sie Harnsäure überproduzieren.

Das Allopurinol kann an die Xanthinoxidase binden, aber es kann nicht oxidiert werden (beachten Sie die Unterschiede im 5-gliedrigen Ring und wo die OHs eingeführt werden). Die Bindung von Allopurinol verhindert die Bindung des echten Substrats.

Zocor (Simvastin) ist ein weiterer beliebter kompetitiver Hemmstoff. Das Enzym hemmt ein frühes Enzym im Weg der Cholesterinbiosynthese. Es ähnelt HMG-CoA, dem Substrat dieses Enzyms, und kann den Cholesterinspiegel im Blut bei Personen senken, die zu viel von diesem Lipid produzieren. Viele der Anti-HIV-Medikamente [z. B. AZT, ddC] sind kompetitive Inhibitoren der Enzyme, die die virale Nukleinsäure polymerisieren. Daher sind kompetitive Inhibitoren für pharmazeutische Anwendungen wichtig. Und sie sind für den Biochemiker wichtig, da er oder er verschiedene Analoga des echten Substrats verwenden kann, um die Natur des aktiven Zentrums zu untersuchen, um zu bestimmen, welche Gruppen auf dem Substrat im aktiven Zentrum erkannt werden.

(nicht kompetitive Hemmung)
Nicht-kompetitiver Inhibitor, NCI :

Aber eine chemische Verbindung muss nicht immer wie das Substrat aussehen, um als Inhibitor zu wirken. Ein nicht-kompetitiver Inhibitor kann an eine andere Stelle als die Substratbindungsstelle binden und die Aktivität hemmen. Diese Inhibitoren binden an oder nahe der aktiven Stelle, jedoch NICHT an der Substratbindungsstelle. Diese Inhibitoren stören normalerweise die katalytische Reaktion selbst (die Bildung eines Übergangszustandskomplexes auf der Oberfläche), sodass das Substrat immer noch an das Enzym bindet, aber dann kann das Enzym nichts damit anfangen. Nehmen Sie zum Beispiel Quecksilber (Hg), das im Gegensatz zu Allopurinol eher ein Gift als ein therapeutisches Mittel ist. Hg++-Ionen können an freie Sulfhydrylgruppen binden, was in Proteinen die Seitenkette von Cystein bedeutet. Sulfhydryle nehmen oft am katalytischen Prozess teil, aber wenn Hg gebunden ist, kann das Sulfhydryl seine Aufgabe nicht erfüllen. In diesem Fall wird die Wirkung des Inhibitors NICHT durch Zugabe eines Überschusses an Substrat rückgängig gemacht. Die Vmax der Reaktion wird durch den nicht-kompetitiven Inhibitor beeinflusst, jedoch nicht die Km.

Wie beeinflusst ein nicht-kompetitiver Inhibitor die Messung der Enzymkinetik?

Grafisch: Wir können in der Grafik sehen, dass wir bei einer gegebenen Inhibitorkonzentration eine niedrigere Vmax erhalten, und je höher die Konzentration des nicht-kompetitiven Inhibitors ist, desto niedriger ist die erreichbare Vmax.

Denken Sie an einen Becher mit Enzym. Wenn wir einen Überschuss an nicht-kompetitiven Inhibitoren hinzufügen, können wir keine Aktivität messen, also können wir keine Wirkung untersuchen. Fügen wir also eine untersättigende Menge eines nicht-kompetitiven Inhibitors hinzu. Zu jedem Zeitpunkt wird ein konstanter Anteil der Enzymmoleküle außer Funktion gesetzt, weil sie den nicht-kompetitiven Inhibitor binden. Nehmen wir an, 2/3 sind zu jedem Zeitpunkt inaktiv (aber in einem dynamischen Gleichgewicht):

Die restlichen 1/3 sind in Ordnung und verhalten sich in Bezug auf ihre Abhängigkeit von S vollkommen normal. Sie tragen dazu bei, dass V im Graphen gemessen wird.

Damit die Km-Messung nicht beeinflusst wird, erreicht dieser ungehemmte Anteil der Enzympopulation die Hälfte der neuen (niedrigeren) Vmax, die bei der üblichen S-Konzentration erreicht werden kann. Aber die Vmax, die sie erreichen, beträgt nur 1/3 der Vmax, die ohne den nicht-kompetitiven Inhibitor erreicht wird. Hier ist also die scheinbare Vmax erniedrigt und die Km nicht beeinflusst, genau das Gegenteil von dem, was wir bei einem kompetitiven Inhibitor gesehen haben.

Um Ihr Verständnis von kompetitiven vs. nicht-kompetitiven Inhibitoren zu testen, versuchen Sie Problem 3-1 Teil B und Problem 3-13.

(allosterische Hemmung)
Der dritte Inhibitortyp heißt an ALLOSTERISCHER INHIBITOR . Dies ist die wichtigste natürliche Enzymhemmung. Lebende Zellen verwenden Enzymhemmer, um die Aktivität vieler Enzyme zu regulieren. Diese Art der Hemmung ähnelt dem nicht-kompetitiven Inhibitor, da der Inhibitor an eine andere Stelle als die Substratbindungsstelle bindet. In diesem Fall bindet es an seine ganz eigene spezielle Stelle, eine für diesen Zweck entwickelte Stelle, die von der Substratbindungsstelle entfernt liegt. Der Inhibitor wirkt, indem er das Enzym so verformt, dass es sein Substrat entweder nicht mehr binden oder seine Reaktion nicht katalysieren kann. Enzyme, die durch allosterische Hemmung reguliert werden, sind normalerweise Heteromultimere, die aus regulatorischen Untereinheiten und katalytischen Untereinheiten bestehen. Der allosterische Inhibitor bindet reversibel an die regulatorischen Untereinheiten und ändert deren Konformation. Das katalytische Zentrum einer anderen Untereinheit wird abhängig von der Konformation der regulatorischen Untereinheiten ein- oder ausgeschaltet. Die quantitative Behandlung dieser Hemmung liegt hier außerhalb unseres Rahmens. Aber siehe Purves6ed 6.23 für ein Bild.

SO: Allosterische Inhibitoren (schwarze Kugel im Diagramm) können den scheinbaren Km, Vmax oder beide beeinflussen.

Wie nutzt die Zelle diese allosterische Hemmung?

(Rückkopplungshemmung)
Die offensichtlichste Rolle für die allosterische Hemmung in der E. coli-Zelle sind diejenigen Enzyme, die die Reaktionen eines Biosynthesewegs katalysieren.

E. coli, das auf Glukose als einziger Kohlenstoffquelle wächst, muss alle seine kleinen Moleküle durch eine Reihe chemischer Reaktionen synthetisieren, die von Glukose ausgehen. Im Allgemeinen wird Glukose zuerst von ihrem 6-Kohlenstoff-Zustand zu kleineren Molekülen mit 3, 2 oder 1 Kohlenstoffatomen abgebaut, und dann werden diese kleineren Moleküle verwendet, um alle notwendigen Monomere und Co-Faktoren in der Zelle aufzubauen.

Alle Monomere, die 20 Aminosäuren, die prothetischen Gruppen wie Häm, praktisch jedes Molekül in der Zelle hat einen Weg, der auf Glukose zurückgeführt werden kann. Diese Pfade verlaufen nicht einfach mit gleichen und konstanten Geschwindigkeiten, sondern werden streng kontrolliert und koordiniert. Ein Großteil dieser Koordination wird durch den umsichtigen Einsatz der allosterischen Hemmung der Zelle bewirkt. Die gerade synthetisierten Moleküle (die Endprodukte des Stoffwechselwegs) werden oft als Vermittler dieser Hemmung verwendet. Sie sind die allosterischen Inhibitoren, wie wir gleich sehen werden.

(Ein Weg, der von einem Endprodukt zu Glukose zurückverfolgt wird, kann normalerweise in zwei Teile unterteilt werden, den Abbauteil, genannt Katabolismus , und dann der Aufbauteil, genannt Anabolismus .

Oder katabolische Wege vs. anabole Wege (die anabolen Wege werden häufiger als Biosyntheseweg oder Biosynthese bezeichnet).

Jeder Pfeil im Diagramm repräsentiert eine spezifische chemische Umwandlung, wie die Reduktion von Fumarat durch Bernsteinsäuredehydrogenase oder die Oxidation von Hypoxanthin durch Xanthinoxidase.

Um all diese Aktivitäten zu koordinieren, hat E. coli eine ausgeklügelte und sinnvolle Methode entwickelt, um den Fluss von Glucose-Kohlenstoff durch seine Biosynthesewege zu steuern. Dies wird als Endprodukthemmung bezeichnet und funktioniert normalerweise, indem das Endprodukt eines Biosynthesewegs als allosterischer Inhibitor des ersten Schritts des Stoffwechselwegs, d. h engagiert zur Biosynthese dieses Moleküls (z. B. rxn. 5 für G, rxn 10 für N, rxn. 9 für J im obigen Diagramm). Das heißt, das erste Enzym in einem Stoffwechselweg hat sich so entwickelt, dass es in seine Struktur eingebaut, eine Stelle für das endgültige Endprodukt des Pfades, den es beginnt. Da das Endprodukt normalerweise viele Schritte auf dem Weg chemischer Umwandlungen ist, hat es keine große Ähnlichkeit mit dem Substrat oder dem Produkt der Reaktion, die es inhibiert. Siehe [Purves6ed 6.24].

Beispielsweise kann der Weg zur Aminosäure Isoleucin als Verzweigung nach der Synthese des aa-Threonins betrachtet werden:

Thr-Deaminase
Glukose. --> --> Threonin -----------------> Alpha-Ketobuttersäure --> A --> B --> C --> Isoleucin (und kein anderes aa )

Isoleucin erweist sich als allosterischer Inhibitor des Enzyms Threonin-Desaminase

Auf diese Weise wird der Weg zu Isoleucin unterbrochen, wenn genügend Isoleucin vorhanden ist - die Zellen haben Feedback-Informationen über die Menge des synthetisierten Endprodukts. Dieser Mechanismus der Rückkopplungshemmung oder Endprodukthemmung wird in E. coli ausgiebig verwendet, um die Verschwendung eines Weges zu vermeiden, wenn er nicht benötigt wird.

Darüber hinaus funktioniert diese Endprodukthemmung unabhängig davon, ob das Endprodukt (z. B. Isoleucin) selbst angebaut wurde (das Produkt des Biosynthesewegs von E. coli) oder einfach im Medium oder in der natürlichen Umgebung von E. coli bereitgestellt wurde . Bedeutet dies, dass sich E. coli etwas schneller teilen könnte, wenn wir ihm zusätzlich zu Glukose Isoleucin in Minimalmedium geben? Könnte es seine Verdopplungszeit von 60 Minuten auf 55 Minuten verkürzen, indem es diesen Pfad abschaltet? Wenn wir schon dabei sind, warum nicht alle 20 Aminosäuren und ein paar Vitamine, einige Fettsäuren, einige DNA- und RNA-Vorläufer hinzufügen. Würden E. coli jetzt schneller wachsen? Tatsächlich verdoppeln sie sich in einem so reichhaltigen Medium alle 20 Minuten statt einmal pro Stunde. Eine ganz neue E. coli-Zelle in 20 Minuten. Nun ist die Rückkopplungshemmung nicht der einzige Grund für diese Effizienzsteigerung, aber sie spielt eine große Rolle. Und Sie können sich vorstellen, dass diese Fähigkeit, Biosynthesewege ab- und wieder einzuschalten, zum Lebensstil von E. coli passt, der in Ihrem Darm auf den nächsten Big Mac wartet.Die effizienteren Verdoppler werden bald die Bevölkerung übernehmen, daher gab es wahrscheinlich einen großen Selektionsdruck für die Entwicklung von Kontrollmechanismen, die auf diese Weise auf die Umwelt reagieren.

Man kann sehen, warum man die oben erwähnte allosterische ("unterschiedliche im Raum") Hemmung für die Rückkopplungsregulation dieses Biosynthesewegs benötigt. Beachten Sie, dass der Inhibitor, Isoleucin, wenig Ähnlichkeit mit dem Substrat (Threonin) für die Reaktion hat, die es hemmt. Isoleucin bindet nicht an das katalytische Zentrum (aktives Zentrum), sondern an ein allosterisches Zentrum, ein spezielles regulatorisches Zentrum, das vom katalytischen Zentrum entfernt liegt. Tatsächlich befindet sich an der regulatorischen Stelle ein separates Polypeptid in Threonin-Deaminase, einem Protein mit Quartärstruktur.

Für Probleme mit allosterischer Hemmung und Regulation von Signalwegen siehe Probleme 3-8 und 3-10.

(Freie Energie, Delta G und Delta G Ö )
Wir haben jetzt eine Vorstellung davon, wie die Bewertung der chemischen Reaktionen in der Zelle werden beschleunigt, sodass sie in Zeitrahmen ablaufen können, die mit dem Zellwachstum vereinbar sind. Aber was ist mit diesem Problem von RICHTUNG , ein Problem, das die Katalysatoren nicht lösen können. Sind alle chemischen Umwandlungen in diesen Biosynthesewegen zum Beispiel exergonisch, so dass die Richtung des Kohlenstoffflusses aus Glukose eine spontane Reaktion ist? Die Antwort ist nein, ganz im Gegenteil. Die meisten der chemischen Umwandlungen, die in einem Biosyntheseweg benötigt werden, erfolgen von selbst endergonic , und wird nicht von links nach rechts gehen, es sei denn, es wird etwas dagegen unternommen. Daher muss sich der Bau einer neuen E. coli-Zelle mit diesem Energieproblem befassen, und ein Großteil der Zellmaschinerie wurde tatsächlich der Lösung gewidmet. Um das Problem zu verstehen, müssen wir es noch etwas mehr quantitativ erörtern. und zu diesem Zweck ist die Verwendung des Konzepts des FREIEN ENERGIEWECHSELS in Verbindung mit einer chemischen Reaktion sehr nützlich.

Wir können eine Energieeinheit so definieren, dass sie an die Richtung einer chemischen Reaktion wie folgt gebunden ist:

Für die Modellreaktion A + B <--> C + D, von links nach rechts geschrieben:

WENN Delta G <0 ist, neigen A UND B dazu, C und D zu produzieren.

WENN Delta G >0 ist, neigen C und D dazu, A und B zu produzieren.

WENN Delta G 0 ist, IST DIE REAKTION IM GLEICHGEWICHT: NICHT NETTO IN KEINE RICHTUNG ZU GEHEN.

Beachten Sie, dass Delta G unabhängig von der Route zwischen den Ausgangsreaktanten und den Endprodukten ist (z. B. 3 kcal/Mol, für alle 4 hier gezeigten Routen).

Freie Energie ist der Teil der Energieänderung, der mit einer chemischen Reaktion verbunden ist und der genutzt werden kann, um Arbeit zu verrichten.

Wir können Delta G nach der folgenden Gleichung messen [muss das hier glaubhaft annehmen]:

Delta G = Delta G Ö + RTln([C][D]/[A][B])

wobei A, B, C und D die Konzentrationen der Reaktanten und der Produkte AT THE . sind MOMENT BERÜCKSICHTIGT WERDEN.

Dieses CD/AB-Verhältnis wird manchmal Q für Quotienten genannt (also Delta G = Delta G Ö + RTlnQ).. Q ist NICHT die Gleichgewichtskonstante, obwohl sie sieht aus mag ich.

R = UNIVERSELLE GASKONSTANTE = 1,98 CAL / DEG K MOLE ( oder

2)
T = ABSOLUTE TEMP. (0 Ö C = 273 Ö K Raumtemperatur = 25 Ö C = 298 Ö K) (oder

300)
ln = NATÜRLICHES LOG
Delta G Ö = Eine Konstante, eine MENGE BEZOGEN AUF DIE EIGENSCHAFTEN VON A, B, C UND D.

Der erste Term, Delta G Ö , bezieht sich auf die QUALITÄT der Reaktanten und Produkte, und der zweite Term, RTlnQ, bezieht sich auf die MENGE der Reaktanten und Produkte, wie viel von jedem vorhanden ist.

Was ist dieses Delta G Ö ? Es heißt: STANDARD KOSTENLOSE ENERGIEWECHSEL einer Reaktion.

Eine nützliche Methode zur Definition besteht darin, den Sonderfall zu betrachten, bei dem alle Reaktanten und alle Produkte in einer Konzentration von 1 Einheit vorhanden sind. Die Änderung der freien Energie dieser Reaktion ist:

Delta G = Delta G Ö + RTln(1) oder Delta G = Delta G Ö +RT x 0,

oder Delta G = Delta G Ö (ein Sonderfall, wenn alle Teilnehmer eine Konzentration von 1 haben)

Also Delta G Ö ist die Änderung der freien Energie, die auftritt, wenn alle Teilnehmer an der chemischen Reaktion in Einheitskonzentration sind. Was ist Einheitskonzentration? 1 M, für die meisten Reaktanten und Produkte (Wasser und Wasserstoffionen werden unterschiedlich behandelt, wie wir sehen werden.)

Eine Möglichkeit, an dieses Delta G zu denken Ö ist 1000 Mol A, B, C und D in 1000 Liter Lösung darzustellen. Alle Komponenten sind also bei 1M. Ein Mol A + B wird nun in C + D umgewandelt. Die absorbierte Energie ist die Standardänderung der freien Energie. Beachten Sie, dass sich die Konzentration der Reaktanten unter dieser hypothetischen Bedingung nicht merklich geändert hat.

Warum eine so fantasievolle und willkürliche Situation machen? Durch die Definition der Bedingungen für eine STANDARD-Freie-Energie-Änderung können alle Reaktionen miteinander verglichen werden, unabhängig von den besonderen Bedingungen, die sie alle gleichstellen. Das Delta G Ö spiegelt die Natur der Edukte und Produkte ohne Rücksicht auf ihre Konzentration. Beachten Sie, dass die tatsächliche Änderung der freien Energie einer Reaktion tut hängen von diesen Konzentrationen ab, und der ZWEITE TERM der Gleichung für Delta G berücksichtigt diese.

Bitte beachten Sie aus obiger Erläuterung, dass Delta G und Delta G Ö sind nicht dasselbe. Diese Unterscheidung ist wichtig.

(Gleichgewicht)
Delta G Ö kann, wenn auch nicht genau, aus Tabellen der freien Bildungsenergien einfacher Atome oder Moleküle berechnet werden, indem diese Werte für die Reaktanten und die Produkte verglichen werden. Am einfachsten und genauesten lässt sie sich jedoch experimentell bestimmen, indem man die Konzentration der Reaktanten und Produkte im Gleichgewicht misst. Denn im Gleichgewicht ist

Delta G = 0
und
Q = Keq, (ein Sonderfall). Also: Delta G Ö = -RTlnKeq.

Wenn wir A, B, C und D im Gleichgewicht messen, sagen wir, wir erhalten: [C]eq[D]eq/[EIN]eq[B]eq= 2,5 x 10 -3 . Beachten Sie, dass in diesem Fall nur sehr wenig C und D aus A und B gebildet werden.

Dann Delta G Ö = -2 x 300 x ln (0,0025) = -600 x -6 = 3600

Das berechnete Delta G Ö ist +3600 cal/Mol oder +3,6 kcal/Mol. 3,6 kcal werden also absorbiert, wenn 1 Mol A + B zu C + D geht. Energie wird eher absorbiert als freigesetzt, was die fehlende Tendenz von C und D bestätigt, aus A und B gebildet zu werden.

Das heißt, da die Standardänderung der freien Energie positiv, tendiert diese Reaktion nicht nach rechts, sondern eher nach links. Das heißt, wenn wir mit 1M A, B, C und D beginnen, dann C + D --> A + B. Also bauen sich A und B auf Kosten von C + D auf.

Hinweis: Wenn wir A + B schreiben --> C + D, Delta G Ö = +3,6 kcal/mol, dann können wir auch schreiben:
C + D --> A + B , Delta G Ö = -3,6 kcal/mol (die Gleichgewichtskonstante für diese C+D --> A+B-Reaktion beträgt nur 1/2,5 x 10 -3 , oder 400)

Beachten Sie auch, dass wir schreiben können, wenn sich die Reaktanten in anderen Verhältnissen als 1:1 kombinieren:
aA + bB <--> cC + dD, Delta G = Delta G Ö + RT ln [C] C [D] D /[EIN] ein [B] B

(Zusammenfassung der freien Energieänderungen)
Und um es noch einmal zu wiederholen: Die Änderung der freien Energie einer Gesamtreaktion ist unabhängig von der Route der Reaktanten, sie kann direkt oder indirekt sein [siehe Energiediagramm mit Routen, die zu Zwischenstufen nach oben oder unten führen].

Die Reaktion geht nach rechts, wenn Delta G <0 ist, und nach links, wenn Delta G >0 ist. Bei Delta G = 0 befindet sich die Reaktion unter dieser speziellen Bedingung im Gleichgewicht (Delta G=0) Q ist gleich der Gleichgewichtskonstante Keq.

Wir haben festgestellt, dass Delta G Ö wird als STANDARD-Änderung der freien Energie bezeichnet und stellt die Änderung der freien Energie dar, wenn beobachtet wird, dass diese Reaktanten und Produkte mit jedem Wesen in einer Konzentration von 1 M reagieren, was per Definition die Standardbedingung ist. Biochemiker machen jedoch 2 Ausnahmen von der Definition dieser STANDARDBEDINGUNGEN im Falle der Wasser- und Wasserstoffionenkonzentration. Da diese beiden Komponenten in einer Reaktion in einer biologischen Reaktion normalerweise konstant sind, sind sie definiert gleich 1 für Delta G Ö Berechnung, wenn [H2O]=55M (reines Wasser) und [H+] = 10 -7 M (d. h. pH7 oder Neutralität). Streng genommen sollte man diese Verwendung dieser 2 Ausnahmen anerkennen, indem man die freie Energieänderung als Delta G . bezeichnet Ö ' statt Delta G Ö , aber das machen wir hier nicht.

Alle chemischen Reaktionen haben ein Delta G Ö mit ihnen verbunden, ein Wert, der in ein Buch geschrieben werden kann. Somit können zwei beliebige Reaktionen unter der Standardbedingung der Einheitskonzentration verglichen werden.

Die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion kann leicht gemessen werden, indem die Konzentration aller Reaktanten und Produkte gemessen wird, nachdem die Reaktion das Gleichgewicht erreicht hat. Aus der Gleichgewichtskonstante kann man das Delta G . berechnen Ö der Reaktion, da im Gleichgewicht Delta G = 0 und so Delta G o = -RTlnKeq.

Während der erste Term in der Gleichung für Delta G die Art der Reaktanden berücksichtigt, befasst sich der zweite Term mit den Mengen der Reaktanten und Produkte in der betrachteten Situation. Wenn Sie also wissen, was Sie haben und wie viel davon, können Sie vorhersagen, in welche Richtung die Nettoreaktion gehen wird.

[Um Delta G zu überprüfen, Delta G Ö , und Keq, mach die Aufgaben 4-1 und 4-2]

(ATP-Hydrolyse)
Um unsere Betrachtung der mit biochemischen Reaktionen verbundenen Änderungen der freien Energie zu beginnen, betrachten wir eine der wichtigsten und grundlegendsten energiebezogenen biochemischen Reaktionen, die Hydrolyse von Adenosintriphosphat oder ATP. Hydrolyse bedeutet das Aufbrechen von Bindungen durch Zugabe von Wasser. Hier:

wobei A = Adenin (eine etwas basische 2-Ring-Struktur, hier als "Base" bezeichnet) R = Ribose, ein 5C-Zucker verbunden mit 3 Phosphatgruppen, die selbst miteinander verbunden sind. Siehe [Purves-Bild]. Die Bindung zwischen den Phosphaten wird als Säureanhydridbindung bezeichnet, die durch die Extraktion von Wassermolekülen zwischen 2 Säuren gebildet wird.
Das Delta G Ö dieser Reaktion beträgt etwa -7 kcal/Mol.

"))
Die meisten HYDROLYSE-Reaktionen in der Zelle setzen freie Energie frei, aber normalerweise weniger als 7 kcal/Mol. Die wenigen, wie die ATP-Hydrolyse, die mindestens 7 kcal/Mol freisetzen, sind wichtig, da diese Energiemenge für nützliche Arbeit genutzt werden kann, wie wir sehen werden. Die Anleihen, deren HYDROLYSE 7 KCAL/MOL ODER MEHR FREISETZT, WERDEN aus diesem Grund "HOCHENERGIE-BONDS" GENANNT. Diese Anleihen sind nicht stärker als andere Anleihen, daher ist dies eine falsche Bezeichnung, aber es stellt sich heraus, dass es sich um einen bequemen Begriff handelt. Es wird mit einem SQUIGGLE bezeichnet, wenn wir darüber sprechen: AR-P-P

Schüler: Wenn wir die Struktur von ATP betrachten, können wir die hohe Energiefreisetzung erklären, indem wir sehen, dass die Zugabe von Wasser die elektrische Abstoßung zwischen den negativ geladenen (sauren) Phosphatgruppen lindert. Aufgrund dieser Argumentation würden wir vorhersagen, dass die Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten Phosphat ebenfalls eine hochenergetische Bindung sein sollte, und tatsächlich ist es so:

P. Das heißt, die Hydrolyse zwischen den P-Atomen 1 und 2 setzt auch etwa 7 kcal/Mol frei (d. h. Delta G Ö = -7 kcal/mol)

Andererseits ist die Bindung zwischen der Ribose und dem ersten Phosphat keine hochenergetische Bindung.

Angesichts des Delta G Ö , kann man die Gleichgewichtskonstante berechnen, die etwa 10 . beträgt +5 .

(–7 = –RT × 2,3 log K = –0,6 × 2,3 log K K = 10 (–7/–1,4) = 10 5 ).

Sie sollten diese Art von Berechnungen üben, indem Sie die Aufgaben in Aufgabe 4 lösen.

(Beachten Sie bei diesen Problemen, dass die universelle Gaskonstante normalerweise mit 1,98 cal/deg-mol angegeben wird, während Delta G Ö und Delta G werden normalerweise in Kilokalorien ausgedrückt, sodass Sie normalerweise den RT-Term durch 1000 teilen müssen, um eine Antwort in kcal zu erhalten.)

Ich möchte nur noch einmal anmerken, dass die Konzentration von WASSER nicht berücksichtigt wird, da es in wässriger Lösung bei 55 M vorhanden ist und sich in wässrigen Reaktionen nicht VERÄNDERT und vereinbarungsgemäß als 1 definiert ist. (Wir können solche willkürlichen Definitionen treffen, weil wir überlegen nur Änderungen hier [Konzentrationsänderungen, Änderungen der freien Energie], keine absoluten Werte.)

Wenn wir also mit 1 Mio. ATP beginnen, haben wir am Ende nur noch etwa 10 –5 Mio. ATP im Gleichgewicht.

Noch 1 ml. Lösung von ATP hält auf dieser Tischplatte tagelang. Wir müssen noch einen Katalysator hinzufügen, um diese Reaktion in einer angemessenen Zeit zum Laufen zu bringen.

Also fügen wir ein Enzym hinzu, sagen wir eine reine Zubereitung von ATP-ase (Beachten Sie die Nomenklatur).

Jetzt ist das gesamte ATP in wenigen Minuten hydrolysiert. Die Reaktion hat ihr Gleichgewicht erreicht und ist wegen des sehr günstigen (großen und negativen) Delta G weit nach rechts gegangen.

Dabei werden 7 kcal/Mol Energie, freie Energie, freigesetzt. Freie Energie, damit sie für nützliche Arbeit genutzt werden konnte, aber welche Arbeit hat sie hier geleistet? Nichts? Energie musste irgendwo hin. Es wird als HEAT freigegeben. Die Reagenzglaslösung erwärmte sich um ca. 7 Ö C, nach meiner Berechnung

[da 1 ml Lösung hier bei 1 M, also 0,001 Mol oder 1 Millimol 7 kcal / Mol = 7 cal / mmol 1 cal, die Temperatur erhöhen. von 1 Gramm (ml) Wasser 1 Grad C oder K].

Diese Hydrolyse von ATP ist in der Tat die häufigste Reaktion, die die Zelle verwendet, um nutzbare Energie zu erzeugen. Der Trick besteht darin, diese Energie chemisch nutzbar zu machen, um sie einer nützlichen chemischen Arbeit zuzuführen. Denken Sie an das Gesamtproblem, eine neue E. coli-Zelle herzustellen, die viele endergonische Transformationen erfordert.

Siehe Problem 4-1 für mehr über die Hydrolyse von ATP.

(Gekoppelte Reaktionen)
Nehmen wir also ein Beispiel für eine dieser endergonischen energieverbrauchenden Reaktionen: Eine solche Reaktion ist die allererste Umwandlung, die ein Glukosemolekül beim Eintritt in eine E. coli-Zelle durchläuft:

+ Pich --> Glukose-6-P + H2O Delta G Ö = +3,6 kcal/Mol.
(Beachten Sie, dass Pi als Abkürzung für PO . verwendet wird4 ---)

Also das Delta G Ö ist in der allerersten Reaktion bei der Verwertung von Glukose in der Zelle ungünstig.

0,01M (typisch) und Keq (von Delta G Ö von +3,6) = 2,5 X 10 -3 dann wäre [G6P] im Gleichgewicht 2,5 x 10 -7 , was sogar unter den Kms der meisten Enzyme liegt (zum Beispiel für die nächste Reaktion, die G6P weiterführt). Lassen Sie uns nun in Betracht ziehen, die beiden Reaktionen, über die wir gesprochen haben, zusammenzufassen:

ATP + H2O --> ADP + Pich Delta G Ö = -7 kcal/mol
Glukose + Pich --> G6P + H2O Delta G Ö = +3,6 kcal/mol
-----------------------------------------------------------------------------
Glukose + ATP --> G6P + ADP Delta G Ö = -3,4 kcal/mol gesamt = Nettosumme der beiden betrachteten Reaktionen

Mischen wir also die Reaktanten zusammen und hoffen das Beste. Ich denke, wir sollten ein paar Enzyme hinzufügen, um diese 2 Reaktionen zu katalysieren: sagen wir: "Glukose-Phosphorylase" und "Phosphatase". Aber unter diesen Bedingungen gehen die 7 kcal/Mol, die bei der Hydrolyse von ATP entstehen, hauptsächlich durch die Erwärmung der Umgebung verloren (H2Ö). Außerdem wird bei Säugetieren, in denen E. coli lebt, die Temperatur konstant gehalten, sodass wir Reaktionen durch Hitze nicht beeinflussen können. Das Problem wird durch ein Enzym gelöst, Hexokinase. Dieses Enzym bindet sowohl ATP UND Glucose. Die sehr Phosphat aus dem ATP wird auf das Glucosemolekül übertragen. Die hier unter dem Strich geschriebene Gesamtreaktion ist also nicht nur die Nettosumme der beiden darüber geschriebenen Reaktionen, sondern es IST die durch Hexokinase katalysierte Reaktion. Die Phosphorylierung von Glucose wurde GEKOPPELT zur Hydrolyse von ATP.
Weitere Informationen zu diesen Reaktionen finden Sie in den Aufgaben 4-4 und 4-5. (Delta G o -Werte sind dort etwas anders, da sie aus einer anderen Quelle stammen.)

Was ist mit dem produzierten G6P? Enthält es jetzt die hochenergetische Phosphatbindung? Nun, was ist das Delta G Ö für G6P-Hydrolyse? Einfach: -3,6 kcal/mol, da die Rückreaktion (zweite Zeile) +3,6 beträgt. Aber -3,6 liegt unter dem

-7 erforderlich, um sich für eine Hochenergiebindung zu qualifizieren, also kein Kringeln hier in G6P. Denken Sie daran, wenn Sie eine Reaktion rückwärts schreiben, kehren Sie einfach das Vorzeichen des Delta G . um Ö .

Dies Kupplung Die ATP-Hydrolyse ist ein sehr üblicher Weg, den die Zelle verwendet, um ansonsten endergonische Reaktionen anzutreiben. [ Purves picture] Da das ATP so oft verwendet wird, um die Energiekosten dieser chemischen Umwandlungen zu "bezahlen", wird ATP als Energie "WÄHRUNG" der Zelle. Die Kopplung an ATP ist einer von zwei Wegen, mit denen die Zelle endergonische Reaktionen ablaufen kann. Wir werden den zweiten Weg etwas später besprechen.
Ist dies also die Lösung für E. coli, die auf Minimalmedium wachsen? Weit gefehlt, wir haben gerade den Bock überschritten. Woher kommt dieses ATP? Nicht aus dem Medium, wo Glucose die einzige Kohlenstoffquelle ist. ATP muss wie alle anderen kleinen Moleküle aus Glucose synthetisiert werden. Und das kostet selbst Energie. Aber sobald wir etwas ATP haben, kann der größte Teil des Moleküls immer wieder verwendet werden, um Energie für gekoppelte Reaktionen bereitzustellen, solange wir ADP wieder zu ATP phosphorylieren können. Das Problem hat sich also auf diese Reaktion verlagert: ADP + Pi --> ATP (Delta G Ö = +7 kcal/Mol). Wenn wir einen Weg dazu finden könnten, hätten wir unser Energieproblem gelöst.

Hier gibt es einige Unterschiede in der Einheit der Biochemie: Die Welt ist hauptsächlich in zwei Arten von Organismen unterteilt, diejenigen, die diese Reaktion mit der aus Sonnenlicht gewonnenen Energie ausführen können, die photosynthetischen Organismen wie Pflanzen und der Rest von uns, E . coli, Menschen, Schmetterlinge, die ATP aus ADP herstellen, indem sie die aus dem Abbau gewonnene Energie nutzen ( Katabolismus ) von Kohlenstoffverbindungen wie Glucose. Auch Pflanzen gehören zu dieser letzteren Kategorie, da sie bei Dunkelheit Energie aus dem Glukoseabbau gewinnen, wie der Rest von uns. Wir werden diesen Prozess des glukosebasierten Energiestoffwechsels im Detail betrachten und aus Zeitmangel nicht wirklich auf die PHOTOSYNTHESE eingehen. Offensichtlich ist die Photosynthese der grundlegendere und essentiellere Prozess für den Planeten, denn ohne die Pflanzen und ihre Fähigkeit, Sonnenenergie zu nutzen, gäbe es keine Glukose. Die Photosynthese ist jedoch etwas komplexer, daher ist sie kein guter Anfang.

Also, ATP über Glukose: Der Gesamtplan ist (für E. coli, die in Luft wachsen [gelöster Sauerstoff]): Glukose + O2 --> CO2 + H2O, und: ADP + Pi --> ATP

Zuerst ein Überblick: 3 Teile: In jedem dieser 3 Teile werden wir uns mit unserem Ziel befassen: ATP's für den Einsatz in energieverbrauchenden Reaktionen herzustellen.

1) GLYKOLYSE: bei der die 6C-Glukose in eine 3C-Verbindung, Brenztraubensäure [Glukose (6C) --> Pyruvat (3C)] zerlegt wird.

2) DER KREBS-ZYKLUS, in dem das Pyruvat zu CO . abgebaut wird2 [Pyruvat --> CO2]

3) Die ELEKTRONENTRANSPORTKETTE, in der in einer separaten Reaktionsreihe Sauerstoff aufgenommen und Wasser erzeugt wird [Verwendung von O2]

Ich werde jetzt diskutieren GLYKOLYSE im Detail aus zwei Gründen:

1) Es werden die Probleme und Lösungen des Energiebedarfs aufgezeigt, ein Ziel ist es also, den Energiestoffwechsel zu verstehen.

2) Es ist ein detailliertes Beispiel aus dem wirklichen Leben für einen typischen Stoffwechselweg, auf den wir mit all diesen Pfeilen angespielt haben, die zu A's, B's und C's führen. (Der Weg wird durch eine Reihe kleiner Änderungen zwischen Substrat und Produkt bei jedem Schritt gekennzeichnet)

Ich werde die ersten Reaktionen mit dem Zucker in offenkettiger Form zeigen, weil ich denke, dass es einfacher ist, zu sehen, was vor sich geht.

1. eine Phosphorylierung (Kinase-Enzym)

3. erneut Phosphorylierung. Beachten Sie, dass wir jetzt 2 ATPs verwendet haben: Anstatt Energie zu erzeugen, verbrauchen wir sie bisher.

4. Hydrolyse (Für mehr über diese Reaktion siehe Aufgabe 4-16)

5. Isomerisierung von Dihydroxyacetonphosphat (wie wir in Schritt 2 gesehen haben, aber umgekehrt, das Keton in das Aldehyd umwandeln und es auf den Kopf stellen, wenn Sie fertig sind: Sie haben ein weiteres Molekül Glyceraldehyd-3-phosphat): Beachten Sie, dass wir jetzt 2 von . haben alles für jedes Glukosemolekül, das in den Weg eingetreten ist, wird dies von diesem Punkt an wahr sein.

Bis jetzt haben wir also bis rxn 5 2 Moleküle Glyceraldehyd-3-phosphat (GAL-3-P) für jedes verwendete Glukosemolekül produziert. UND es hat uns bisher 2 ATP's KOSTEN Diese ATP-Schuld ist a loses Ende mit denen wir uns früher oder später auseinandersetzen müssen.

6. Schritt 6 ist eine Oxidation, GAL-3P plus ein weiteres Phosphat, um 1,3-Diphosphoglycerinsäure (oder 1,3-diPGA) zu bilden.

OXIDATION, der Verlust von ELEKTRONEN. Wir haben es vorher bei der Bildung der Disulfidbrücke gesehen - dort war der Verlust von zwei Elektronen in den beiden Wasserstoffatomen, die weggenommen wurden. Hier, in Reaktion 6, müssen wir 2 Elektronen von den Reaktanten GAL-3-P und Phosphat verlieren:

(NAD)
Zwei Elektronen sind verloren gegangen. Die Protonen sind bei der Oxidation nicht wichtig, sie sind manchmal mit den Elektronen da und manchmal nicht. Diese Elektronen müssen irgendwo hin. Sie werden vom OXIDIZING AGENT aufgenommen, das selbst reduziert wird. Wie Sie dem NAD-Handout entnehmen können, handelt es sich um eine Verbindung namens NAD oder NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE [Purves Bild]:

Der Nicotinamid-Anteil ist auch das Vitamin Niacin. Niacin klingt weniger bedrohlich.

Bei der Reduktion kann NAD zwei Elektronen aufnehmen, aber nur ein Proton. Das andere Proton geht als Wasserstoffion in Lösung. Aber es sind die Elektronen, die bei Oxidationen wichtig sind.

Anstatt die Reduktion von NAD als NAD+ --> NADH + H+ zu schreiben, schreiben wir einfach: NAD --> NADH2, bezogen auf die beiden Hs, die von Glyceraldehyd-3-phosphat stammten, obwohl beide Protonen nicht auf NAD landeten.

Diese rxn. 6 ist ziemlich kompliziert und beinhaltet sowohl eine Phosphorylierung als auch eine Oxidation. Die Phosphorylierung erforderte kein ATP, jedoch ein NAD. Also haben wir jetzt ein neues loses Ende analog zur ATP/ADP-Situation, wir müssen uns um die Wiederherstellung von NADs von NADH2 sowie von ATPs von ADPs kümmern.

Aber zumindest haben wir hier etwas Wertvolles, ein energiereiches Phosphat, wie Sie die Kringel oben auf 1,3-di-PGA auf Ihrem Glykolyse-Handout sehen können. Das bedeutet, dass aus der Hydrolyse dieses Phosphats genug Energie freigesetzt werden kann, um sogar die Phosphorylierung von ADP in einer gekoppelten Reaktion voranzutreiben.

Nehmen wir das Geld und rennen. diese hochenergetische Bindung wird in der nächsten Reaktion, rxn 7, eingelöst. Beachten Sie, dass das oberste Kohlenstoffatom in 3-PGA jetzt eine Carbonsäure ist, während es in GAL-3-P ein Aldehyd war. Diese Änderung ist das Ergebnis der Oxidation, die in Reaktion 6 stattfand.

Also haben wir jetzt eine der 2 ATPs die Schulden, die wir zu Beginn gemacht haben, abbezahlt . .
Moment mal, eigentlich sind wir alle bezahlt (seit wir haben zwei di-PGAs für jedes Mol Glukose, das den glykolytischen Weg begonnen hat).

8. Isomerisierung von 3-PGA zu 2-PGA.

9. Dehydration, Wasser entfernt. Das Ergebnis ist eine instabile Verbindung, Phospho-Enolbrenztraubensäure (PEP), eine, deren Hydrolyse zur Freisetzung eines großen Pakets freier Energie führen kann.

[2-PGA, ebenso wie PEP, hat ein höheres Energieniveau als Pyruvat, aber die Verschiebung der Atome ermöglicht unterwegs die Einnahme von ATP, da die Phosphatbindung eine hochenergetische Bindung in PEP ist.]

10. Übertragung des Phosphats auf ADP (X2), was zu PYRUVINSÄURE (Pyruvat) führt, die als Endpunkt der Glykolyse angesehen werden kann. [Purves-Bild], [ein weiteres Purves-Bild], [noch ein weiteres Purves-Bild]

Nach den 10 Schritten der Glykolyse haben wir also 4 ATPs produziert und 2 investiert, für einen Nettogewinn von 2 ATPs, die aus ADP produziert werden. Die Glykolyse produziert also Energie in Form von ATP. Und die Gesamtreaktion wird weit nach rechts laufen, da der Delta G Ö von Glucose zu 2 Pyruvaten beträgt -18 kcal/Mol (auch unter Berücksichtigung gekoppelter Reaktionen, die 2 Netto-ATP erzeugen). Das ist,

1 Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD <--> 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH2

Das Diagramm unten zeigt Delta G Ö 's für die einzelnen Schritte der Glykolyse.

(Für eine andere Betrachtungsweise siehe die von Purves gezeichnete Delta-G-Tabelle [Purves-Bild])

Obwohl der Reaktionsweg insgesamt recht günstig ist, sind einige einzelne Reaktionen ziemlich ungünstig, die extremste ist die Reaktion Nr. 4. Die energieaufwendigen Reaktionen werden in diesem Fall durch den Aufbau von Reaktanten durch die günstigeren Reaktionen vor ihnen gedrängt und durch den Produktentzug durch die stärker exergonischen Reaktionen weiter stromabwärts gezogen. Die tatsächlichen Delta G's werden durch den Produktabfluss beeinflusst, so dass hier der zweite Term in der Gleichung für Delta G ins Spiel kommt.

Delta G = Delta G Ö + RTln([Produkte]/[Reaktanten]), wobei RT

0,6 (Zoll) kKal/Mol)

Wenn die Produkte beispielsweise so abgelassen werden, dass das Verhältnis von P/R bis 0,00001 reicht, ergibt dies

7 kcal/Mol negatives Delta G , genug, um das ungünstige Delta G auszugleichenÖ von +6,8 für rxn. 4.

Dieser indirekte Einfluss auf das Delta G ist die zweite Methode, mit der die Zelle eine individuelle Reaktion mit einem ungünstigen Delta G . ausführt Ö .

1.) DIREKTE KUPPLUNG der ungünstigen Reaktion mit einer energetisch günstigen zu einer neuen gekoppelten Reaktion mit einem netto negativen (günstigen) Delta G Ö (wie in der Hexokinase-Reaktion #1).

2.) INDIREKT, durch RÜCKNAHME VON PRODUKTEN oder Aufbau von Substraten

SO, wir haben unser insgesamt negatives Delta G Ö , und wir haben Netto-ATP generiert, also sollten wir uns ziemlich gut fühlen, bis auf eines: Wir haben ein wichtiges offenes Ende zu binden. Wir haben uns ein NAD geliehen, um Gal-3-PO . zu oxidieren4. Dies war eine Schlüsselreaktion auf diesem Weg, da Oxidationen normalerweise von großen Änderungen der freien Energie begleitet werden. Wir konnten eine PO bekommen4 zu unserer 3-Kohlenstoff-Verbindung hinzugefügt, und dieses Phosphat wurde verwendet, um ADP im nächsten Schritt (#7) zu phosphorylieren. Wir haben NAD verwendet und es wurde auf NADH2 reduziert. Jetzt müssen wir also überlegen, wie wir diese Schulden zurückzahlen wollen. Andernfalls würden die kleinen NAD-Vorräte in der Zelle sehr bald alle in NADH . umgewandelt2 und die Glykolyse würde schnell zum Erliegen kommen.

Wir brauchen ein Oxidationsmittel, um NADH . zu oxidieren2. Ein großer ist im Überfluss vorhanden: O2.

Es nimmt leicht Elektronen auf, zum Beispiel von Fe++, um es zu Fe+++ zu machen, wenn Stahl rostet.

(Anaerobiose)
Hat E. coli Zugang zu Sauerstoff? Im Labor, ja. Wir schütteln die E. coli-Kulturen kräftig und konstant auf mechanischen Schüttlern, um die Luft im Kulturmedium zu lösen und eine konstante Sauerstoffquelle bereitzustellen, die als AEROBIC-Zustand bezeichnet wird. Im Darm mal ja, mal nein (überfüllt). Haben unsere eigenen Zellen Zugang zu Sauerstoff? Klar, durch die Lunge über die Blutgefäße in alle Gewebe. Aber wenn Sie über den Campus zum Unterricht laufen, um hier nicht die ersten goldenen Worte zu verpassen, benötigen Ihre Muskeln möglicherweise schneller ATP, als Sie ihnen Sauerstoff für NADH . liefern können2 Oxidation, Ihre Muskeln befinden sich in einem AN-AEROBISCHEN Zustand. Und viele Organismen, die in natürlich anaeroben Umgebungen leben, im Schlamm am Grund von Flüssen, z.B. Betrachten wir also zunächst den anaeroben Fall, bei dem kein Sauerstoff für die Oxidation von NADH . zur Verfügung steht2. Unter diesen Umständen muss die Zelle mit dem auskommen, was ihr zur Verfügung steht, das sind hauptsächlich: 2 Pyruvate. Glücklicherweise kann Pyruvat selbst als Oxidationsmittel fungieren, wie in rxn #11 gezeigt, wo es Elektronen in seine C=O-Bindung aufnimmt und auch zwei Wasserstoffe hinzufügt, um Lactat zu bilden, oder MILCHSÄURE . Es bekommt die Elektronen von unserem NADH2 Molekül, das in Wirklichkeit NADH und H+ ist, also ein Proton (ein H+-Ion) aus dem wässrigen Pool zurückfängt. Sogar das Delta Go ist günstig, und wir bekommen unser NAD aus NADH . regeneriert2. Das NAD pendelt dann hin und her, wird in rxn 6 reduziert und in rxn 11 immer und immer wieder reoxidiert, während Glukose zu Laktat abläuft und ADPs in ATPs umgewandelt werden, um die Zellteilung für E. coli anzutreiben oder Treppen hochzulaufen für den Menschen auch bei Sauerstoffmangel.

Es wird angenommen, dass es der Säureaufbau durch Milchsäure ist, der Ihre Muskeln schmerzt, wenn sie zu lange anaerobe Glykolyse durchführen (Säure, die von Neuronen im Muskel als Schmerz wahrgenommen wird).

(Fermentation)
Pyruvat ist also ein Scheideweg: Wenn kein Sauerstoff, dann, wenn Sie E. coli oder der Mensch sind, führen Sie eine Milchsäuregärung durch. [Purves-Bild], [ein weiteres Purves-Bild]

Wenn Sie Hefe sind, gibt es eine Variation zu diesem Thema, Sie bauen Pyruvat zuerst zu Acetaldehyd und CO . ab2, die keine Oxidation ist, aber dann den Acetaldehyd als Oxidationsmittel für NADH . verwenden2, wobei das Produkt hier der 2-Kohlenstoff-Alkohol Ethanol (rxns 12 und 13) ist. Biertrinker wissen diese Variante zu schätzen, da Milchsäurebier ziemlich schlecht wäre und wahrscheinlich nicht einmal die psychopharmakologischen Wirkungen hervorruft, für die Ethanol berühmt ist.

Genau wie bei ATP ist das NAD - NADH2 Fall ist einer der Wieder-Generation, nicht der Generation. Sobald ein wenig NAD hergestellt ist, kann es millionenfach hin und her pendeln, wobei es abwechselnd reduziert und oxidiert wird. [

Betrachten wir zur Abwechslung eine alternative Kohlenstoff- und Energiequelle für E. coli, Glycerin. Denken Sie daran, dass Glycerin der Trialkohol ist, der als Rückgrat für Triglyceride (Fett) und Phospholipide dient.

Siehe Handzettel zur Glykolyse. Aus der PowerPoint-Grafik ist ersichtlich, dass Glycerin wie folgt metabolisiert wird:

Glycerin + ATP --> Glycerin-1-P

Glycerin-1-P + NAD --> DHAP (= Dihydroxyacetonphosphat) + NADH2

DHAP --> setzt sich in der Glykolyse fort (rxn 5). Siehe Rezitationsprobleme #3, Problem 2.

Unter aeroben Bedingungen kein Problem, das NADH2Die produzierten Produkte werden durch Sauerstoff wieder oxidiert, wie wir sehen werden. Und so wachsen E. coli in einem Glycerin-Minimalmedium mit Glycerin anstelle von Glukose gut.

Wie wäre es unter ANAEROBISCHEN Bedingungen?

Wir verwendeten zwei NADs, um aus Glycerin zu Pyruvat zu gelangen, aber wir kommen nur zurück einer beim Laktat gehen. Wenn wir versuchen, die Laktatfermentation mit Glycerin als unserer einzigen Kohlenstoff- und Energiequelle durchzuführen, werden wir zum Stillstand kommen, da unser gesamtes NAD als NADH . endet2. (Sie werden einen Zustand erreichen, in dem das gesamte NAD in Form von NADH . vorliegt2, und es ist kein Pyruvat mehr übrig, nur DHAP wartet auf ein NAD, das nicht vorhanden ist.) Obwohl E. coli also in Gegenwart von Luft (Sauerstoff) auf Glycerin gut wachsen wird, wächst es tatsächlich NICHT auf Glycerin unter Luftabschluss (anaerob). Also: Diese Schulden mit losem Ende sind echt, es gibt keine Magie, wir müssen uns an die Regeln halten.

Siehe Problem 4-15 – warum wurde er gefeuert?]

Bedenke die Effizienz der Glukosefermentation:

Für: Glukose--> 2 Laktate, ohne Berücksichtigung der Kopplungen zur Bildung von ATPs (keine Energiegewinnung):
Delta G Ö = -45 kcal/Mol. .

Daraus entstehen 2 ATPs mit einem Wert von 14 kcal/mol. Der Wirkungsgrad liegt also bei etwa 14/45 = 30%, was nicht schlecht ist, was ein Benziner leisten kann.

Wo sind die anderen 31 kcal hingekommen? Sie werden als Wärme freigesetzt, weshalb Sie nach dem schnellen Lauf zur Klasse neben den Milchsäure-Schmerzen in den Beinen auch SCHWITZEN.

Unter Berücksichtigung der ATPs beträgt das Gesamt-Delta G o etwa -45 + 14 = -31 kcal/Mol, so dass die Milchsäuregärung im Wesentlichen vollständig nach rechts (oder im Uhrzeigersinn) verläuft, wie geschrieben.

(Energiegewinn)
Die Effizienz ist ziemlich gut, aber auf der anderen Seite die ERTRAG ist arm. Was meine ich mit ERTRAG? Nun, Glukose enthält viel mehr chemische Energie, als wir hier anzapfen. Wenn wir zum Beispiel Glukose VERBRENNEN (d.h. mit Sauerstoff reagieren) und die Kalorien der abgegebenen Wärme messen, erhalten wir nicht weniger als 686 kcal/Mol. Vergleichen Sie das mit den mickrigen 45 kcal/Mol, die wir durch die Umwandlung von Glukose in zwei Laktate erhalten haben. Die Milchsäure, die wir am Ende wegwerfen, könnte für mehr Energie verwendet werden, aber ohne Sauerstoff gibt es keine Möglichkeit, sie zu verwenden.

Bei Sauerstoff ist das eine andere Geschichte. und unser nächstes Kapitel.

[Um Glykolyse und Fermentation zu überprüfen, versuchen Sie Probleme 4-11 und dann 4-13.]

(Krebs-Zyklus (TCA-Zyklus, Zitronensäure-Zyklus) )
Wenden wir uns nun dem Fall zu, wenn Sauerstoff ist gegenwärtig. In diesem Fall steuern wir auf die vollständige Oxidation von Glucose zu 6 Molekülen CO . zu2 und 6 Wassermoleküle:

C6h12Ö6 + 6 O2 ---> 6 CO2 + 6 H2O (hoch schreiben und nicht löschen)

Das Delta G Ö für diese Reaktion beträgt -686 kcal/mol, und wir hoffen, viel mehr ADP --> ATP-Umwandlungen daraus zu erzielen.

In Gegenwart von Sauerstoff verläuft die Glykolyse bis hinunter zum Pyruvat gleich. Aber das Schicksal von Pyruvat ist jetzt ein anderes.

Urheberrecht 2010 Lawrence Chasin und Deborah Mowshowitz Department of Biological Sciences Columbia University New York, NY 10027


HC hat die Experimente durchgeführt. KX arbeitete bei der Isolierung und Reinigung von Bakterienstämmen zusammen. Alle Autoren haben Manuskriptideen und -redaktionen gemacht.

BW dank der finanziellen Unterstützung durch das National Key Rɭ Program of China (Grant No. 2020YFA0907400), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 22008252) und das CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering Biology, Shenzhen Institute of Synthetic Biology , Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften.


Mikrobielle Produktion flüchtiger Fettsäuren: Aktueller Stand und Zukunftsperspektiven

Flüchtige Fettsäuren (VFAs) werden als Bausteine ​​zur Synthese einer Vielzahl von kommerziell wichtigen Chemikalien verwendet. Mikrobiell hergestellte VFAs (Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure und Isovaleriansäure) können aufgrund ihrer Erneuerbarkeit, Abbaubarkeit und Nachhaltigkeit als Ersatz für erdölbasierte VFAs angesehen werden. Das Hauptziel dieser Übersichtsarbeit ist es, die Forschung und Entwicklung von VFA-Produktionsmethoden über mikrobielle Wege, ihre nachgelagerten Prozesse, aktuelle Anwendungen und Hauptherausforderungen zusammenzufassen. Es wurden verschiedene Fermentationsverfahren entwickelt, um VFAs ausgehend von kommerziell erhältlichen Zuckern und anderen Rohstoffen wie Lignocellulose, Molke und Abfallschlamm herzustellen. Nur wenige Mikroben wurden auf ihr Potenzial zur Produktion von VFAs untersucht, und derzeit sind nur sehr wenige genomische Informationsdaten verfügbar. Es besteht ein Bedarf an Metabolic Engineering, systematischer Biologie, Evolutionary Engineering und Bioinformatik, um VFA-Biosynthesewege zu entdecken, da die Wege für Isobuttersäure und Isovaleriansäuren noch nicht gut verstanden sind.

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