Information

Fragen zum Western-Blotting?

Fragen zum Western-Blotting?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

jedermann. Ich wurde gerade durch meine Lektüre in das Verfahren des Western Blotting eingeführt, obwohl ich mir in einigen Punkten nicht ganz sicher bin. Ich würde mich freuen, wenn mir jemand dabei helfen könnte.

Was genau ist die Funktion des Sperrpuffers?

Warum braucht man einen sekundären Antikörper?

Worauf bezieht sich 5m bei der Diskussion von Nitrozellulosemembranen, sagen wir mit einer Porengröße von 0,45 5 m?


Sperrpuffer

Nachdem die Proteine ​​im Gel auf die Nitrozellulosemembran übertragen wurden, ist es notwendig, den Rest der Oberfläche der Membran mit einem nicht verwandten Protein zu beschichten. Dies ist notwendig, da alle Proteine ​​unspezifisch an die Nitrocellulose binden. Sobald die Membran blockiert ist, können die Antikörper (die Sonde) nur über die übertragenen Proteine, die sie erkennen, an die Membran binden. Die übliche Quelle eines blockierenden Proteins ist entfettetes Milchpulver, d. h. Casein, obwohl einige Leute Rinderserumalbumin verwenden (oder früher verwendet haben).

Sekundärantikörper

In einem typischen Blotting-Experiment belichtest du zuerst mit a primärer Antikörper gegen das interessierende Protein gerichtet ist, könnte dies zum Beispiel ein IgG sein, das in einem Kaninchen gezüchtet wurde. Dann fügst du in einem zweiten Schritt a . hinzu sekundärer Antikörper welches sich an das erste bindet - in diesem Fall könnte dies Ziegen-Ameisen-Kaninchen-IgG sein (d. h. Anti-Kaninchen-IgG, das in einer Ziege gezüchtet wurde). Warum wird das gemacht? Der sekundäre Antikörper liegt in Form eines Antikörper-Enzym-Konjugats vor, typischerweise mit Meerrettich-Peoxidase, und die abschließende Entwicklung des Blots weist die Anwesenheit des konjugierten Enzyms nach.

Warum einen sekundären Antikörper verwenden? Zwei Gründe: - erstens gibt es manchmal einen gewissen Grad an Amplifikation, wenn mehr als ein sekundäres Antikörpermolekül an jedes primäre Antikörpermolekül bindet; Aber noch wichtiger ist, dass es nicht notwendig ist, von jedem Primärantikörper eine enzymkonjugierte Form herzustellen, was zeitaufwendig und ziemlich knifflig ist. In Ihrer Arbeit können Sie also mehrere verschiedene Proteine ​​mit Western untersuchen, aber Sie können denselben sekundären Antikörper verwenden, um alle zu erkennen.

Porengröße

Das sollte 0,45 - 0,5 µm betragen. Porengrößen werden in Mikrometern gemessen.


15: Westernblots

  • Beigetragen von Clare M. O&rsquoConnor
  • Außerordentlicher Professor Emeritus (Biologie) am Boston College

Western Blots sind eine der am weitesten verbreiteten Techniken in der Zellbiologie. In einem Western Blot nutzen Forscher die hervorragende Empfindlichkeit von Antikörpern, um in komplexen Proben interessierende Proteine ​​zu identifizieren. In diesem Lab lernen Sie die verschiedenen Arten von Antikörpern kennen, die in Western Blots verwendet werden. Sie werden Western Blots verwenden, um die Met- und LacZ-Proteinexpression in Ihren transformierten Hefestämmen zu analysieren.

Am Ende dieses Labs sind die Studierenden in der Lage:

  • Erklären Sie, wie monoklonale und polyklonale Antikörper hergestellt werden.
  • Identifizieren Sie die verschiedenen funktionellen Regionen von Antikörpern und erklären Sie, wie sie in Western Blots verwendet werden
  • Entwerfen Sie eine Strategie, die Antikörper verwendet, um mit Epitopen markierte Proteine ​​zu erkennen.
  • Bereiten Sie einen Western Blot vor, um die Proteinexpression in Zellextrakten zu analysieren.

Western Blots bieten eine Methode, um die sprichwörtliche &ldquoneedle im Heuhaufen zu finden.&rdquo Eine typische Zelle exprimiert Tausende verschiedener Proteine, und es ist oft schwierig, Veränderungen in der Expression Ihres Lieblingsproteins (Yfp) ohne eine Sonde zu erkennen, die in der Lage ist, die Yfp vor einem großen Hintergrund nicht verwandter zellulärer Proteine. Glücklicherweise bieten Antikörper hochspezifische molekulare Sonden, mit denen die Expression von Proteinen auf Western-Blots nachgewiesen werden kann. Um die Sensitivität von Western Blots einzuschätzen, ist es hilfreich, ein gewisses Verständnis der Antikörperstruktur und der Antikörperproduktion während der Immunantwort zu haben. (Haftungsausschluss: Die folgenden Abschnitte geben einen stark verkürzten Überblick über Antikörper und einen Abschnitt des komplexen Immunsystems der Wirbeltiere. Die Abteilung bietet einen Immunologiekurs an, der Sie in die Feinheiten dieses faszinierenden Systems einführt.)


Western Blot: Technik, Theorie und Fehlersuche

Western Blotting ist eine wichtige Technik in der Zell- und Molekularbiologie. Mithilfe eines Western Blots sind Forscher in der Lage, spezifische Proteine ​​aus einer komplexen Mischung von Proteinen zu identifizieren, die aus Zellen extrahiert wurden. Die Technik verwendet drei Elemente, um diese Aufgabe zu erfüllen: (1) Trennung nach Größe, (2) Übertragung auf einen festen Träger und (3) Markierung des Zielproteins unter Verwendung eines geeigneten primären und sekundären Antikörpers zur Visualisierung. In diesem Artikel wird versucht, die Technik und Theorie hinter dem Western Blot zu erklären und einige Möglichkeiten zur Fehlerbehebung aufzuzeigen.

Schlüsselwörter: Western Blot für biomedizinisches Forschungsprotein.

Interessenkonflikt-Erklärung

Interessenkonflikt: Keiner angegeben.

Figuren

Montiertes Gestell zur Gelverfestigung

Montiertes Gestell zur Gelverfestigung

Gellösung mit einer Transferpipette zugeben

Laufpuffer zum…

Laufpuffer in den Elektrophorator geben

Proben und molekularen Marker hinzufügen…

Fügen Sie dem Gel Proben und molekularen Marker hinzu, nachdem Sie die Kämme entfernt haben

(a) Proben, die durch die…

(a) Proben, die durch das Sammelgel laufen (niedrigere Spannung). (b): Proben, die durch…


Primärantikörper, Sekundärantikörper und Kontrollen für Western Blotting

Der primäre Antikörper erkennt normalerweise ein spezifisches Protein oder Epitop und wird an einen Fluoreszenzfarbstoff oder ein Enzym konjugiert oder markiert, um einen anschließenden Nachweis zu ermöglichen. Der Nachweis der markierten Antikörper erfolgt direkt (direktes Western-Blotting) oder mittels Sekundärantikörper (indirektes Western-Blotting). Der Sekundärnachweis erfolgt je nach Methode mit an Enzymen oder Fluorophoren konjugierten Antikörpern. Meerrettichperoxidase (HRP) ist das am häufigsten verwendete Enzym zur Markierung.

Diese Fluorophor-konjugierten Antikörper nutzen die Eigenschaft von Fluorophoren, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und bei einer anderen Wellenlänge zu emittieren. Durch die Verwendung verschiedener Filterkombinationen können bestimmte Lichtwellenlängen gemessen werden. Da Fluorophore mit Absorptions- und Emissionsmaxima über das gesamte Lichtspektrum verfügbar sind, können Kombinationen von Antikörpern, die an Fluorophore verschiedener Wellenlängen konjugiert sind, verwendet werden, um mehrere Proteine ​​​​nachzuweisen.

Markierte Antikörper gegen mehrere wichtige biologische Zielproteine ​​sind im Handel erhältlich.


Traditioneller Immunnachweis

Materialien

  • Primäre und sekundäre Antikörper
  • Orbitalschüttler* (Artikelnr. Z768499)
  • Tröge 2-3 mm tief, etwas größer als die Größe Ihres Blots
  • Nachweissubstrate (zur Verwendung mit Peroxidase- oder Phosphatase-Antikörper-Konjugaten)
    - Chemilumineszenz-Substrate
    - Chromogene Substrate

*Schüttler und Tröge nur für die traditionelle Immundetektion erforderlich für die schnelle, vakuumgetriebene Immundetektion mit dem
SNAP i.d. ® System finden Sie in der SNAP i.d. ® Immundetektionsprotokoll.

  1. Legen Sie den Blot in die Blockierungslösung und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang unter Rühren.
  2. Legen Sie den Blot in die primäre Antikörperlösung, zum Beispiel monoklonaler Anti-Beta-Actin-Antikörper, und inkubieren Sie unter Rühren 1 Stunde lang. Die Lösung sollte sich frei über die Oberfläche der Membran bewegen.
  3. Legen Sie den Blot in PBS und waschen Sie ihn 10 Minuten lang. Zweimal mit frischem Puffer wiederholen.
  4. Legen Sie den Blot in die sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie unter Rühren für 1 Stunde bei RT oder 37 ° C.
  5. Legen Sie den Blot in PBS und waschen Sie ihn 10 Minuten lang. Zweimal mit frischem Puffer wiederholen.
  6. Fahren Sie mit der chromogenen, chemilumineszenten oder fluoreszierenden Detektion fort. Sehen Sie sich auch verwandte Ressourcen zum Proteinnachweis an:
    Chromogener und chemilumineszenter Nachweis von Proteinen
    Immundetektion mit BCIP/NBT-Substrat

Wissen Sie, wer den Western Blot erfunden hat?

1979 war sicherlich ein arbeitsreiches Jahr in der Entwicklung des Western-Blottings (auch "Protein-Blotting" oder "Protein-Immunoblot" genannt). Sie arbeiteten alle hart und versuchten zu veröffentlichen.

Aber wer verdient den wahren Kredit?

Die meisten Forscher wissen, dass sich Western Blotting aus dem Southern Blotting (Ref 1) entwickelt hat, das 1975 von Edwin Southern an der University of Edinburgh erfunden wurde, und dann aus dem Northern Blotting (Ref 2), das 1977 von George Starks Stanford-Gruppe erfunden wurde.

Alle 3 Forschergruppen in Seattle, Stanford und Basel scheinen von 1977 bis 1979 unabhängig voneinander an einer besseren Methode zum Nachweis von Proteinen mit Antikörpern gearbeitet zu haben. Sie alle versuchten 1979 zu veröffentlichen und verdienen sicherlich alle Anerkennung für die Entwicklung des Western Blots. Aber wen sollen wir als den wahren Erfinder nennen? Diese Frage ist nicht so einfach zu beantworten, aber es ist eine sehr interessante Geschichte.

George Starks Gruppe an der Stanford University, darunter Jaime Renart & Jakob Reiser, veröffentlichte zuerst (Ref 3), reichte im April 1979 ein und veröffentlichte im Juli 1979. Sie verwendeten den passiven Transfer der Proteine, dann 125-I-markiertes Protein A zum Nachweis.

Harry Towbins Gruppe in Basel, Schweiz, einschließlich Towbin & Julian Gordon (am Friedrich Miescher Institut) und Theophil Staehelin (bei Hoffmann-La Roche), eingereicht im Juni 1979 und wurde im September 1979 veröffentlicht (Ref 4). Sie entwickelten die Methode des elektrophoretischen Transfers von Proteinen auf Membranen (anstelle des passiven Transfers wie bei Stark) und das mittlerweile allgegenwärtige Immunoblotting-Sandwich, das elektrischen Strom verwendet, um Proteine ​​vom SDS-PAGE-Gel auf die Membran zu übertragen (Ref 5). Ihr Verfahren verwendet auch sekundäre Antikörper zum Nachweis, dies scheint also die eigentliche Methode zu sein, die im Allgemeinen für Western verwendet wird.

W. Neal Burnette, der in Robert Nowinskis Labor am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle arbeitet, reichte 1979 ein, wurde jedoch abgelehnt und schließlich 1981 veröffentlicht (Ref 6). Burnette gab der Technik definitiv den Namen "Western Blotting" als Anspielung auf das Southern Blotting und weil ihr Labor an der Westküste lag. Er entwickelte seine Technik unabhängig, einschließlich des elektrophoretischen Transferschritts, wurde jedoch auf Starks und Towbins Veröffentlichungen aufmerksam, bevor er seine im Jahr 1979 einreichte. Er glaubte immer noch, dass seine Version einfacher und universeller war und daher eine Veröffentlichung wert war (Ref 7). Als Vorteile nennt er die Verwendung von "unmodifizierter Nitrocellulose, radioaktiv markiertem Protein A-Nachweis und 2-D-Trennungen" (Ref 7). Er sagte auch, seine Methode "vereinfachte Antigentransfer, Antikörpernachweis und komplexe Visualisierung" (Ref 8). Interessanterweise berichtet Burnette, dass seine Einreichung 1979 „abgewiesen wurde – nicht auf der Grundlage der Towbin-Veröffentlichung, sondern weil die Technik transparent offensichtlich war, keinen grundlegenden Beitrag zur wissenschaftlichen Literatur leistete und, was am vernichtendsten ist, den schnippischen Namen erhielt 'Western Blotting' natürlich zu Ehren von Edwin Southern und dem Ort seiner Erfindung an der Westküste." (Bez. 8). Sein Verfahren wurde schließlich 1981 veröffentlicht, nachdem es bereits durch die Verteilung von Vorabdrucken an Freunde bekannt geworden war, die das Verfahren wiederholten (Ref 9). „Ziemlich bald veranstaltete ich ein tägliches Seminar zum Thema Blotting per Telefon. Ich sprach mit allen, weil sie die Xeroxed-Kopie, die sie hatten, nicht lesen konnten. [Western Blotting] kostete meine ganze Zeit am Telefon.“ (Ref. 9).

Also, wer hat eigentlich den Western Blot erfunden und sollte man ihm das zuschreiben?

Starks Gruppe wurde zuerst veröffentlicht. Towbins Gruppe entwickelte die anscheinend gebräuchlichste Methode, einschließlich der elektrophoretischen Transfermethode und Puffer sowie die Verwendung von Sekundärantikörpern. Burnette gab der Technik neben anderen Modifikationen den Namen und war sehr maßgeblich an der Popularisierung des Western Blotting beteiligt. In einem 2005 Naturmethoden Classic Protocol (Ref 10) schrieb Michael Eisenstein: „Es ist fraglich, dass Burnettes bedeutendster Beitrag zum Immunblotting kam, als er die Technik ‚Western Blotting‘ taufte“. Wenn viele Forscher Western Blotting zitieren, beziehen sie sich oft sowohl auf Burnettes als auch auf Towbins Papiere, daher ist die vielleicht genaueste Antwort, dass beide Anerkennung erhalten sollten, aber wir überlassen es Ihnen, die Frage selbst zu beantworten.

Wir hoffen, Ihnen hat diese Geschichte und der Hintergrund einer Technik gefallen, die viele von Ihnen täglich in Ihrem Labor anwenden. Wir finden es immer wieder faszinierend, mehr über die Geschichte von Techniken zu erfahren, die für aufregende und lebensrettende Entdeckungen auf der ganzen Welt so wichtig geworden sind. Für zusätzliche Hintergrundinformationen und weitere interessante Geschichten und Einblicke in die Entwicklung dieses Verfahrens empfehlen wir die folgenden Referenzen.

Die hier präsentierten Informationen sind nach unserem besten Wissen korrekt, aber wir freuen uns über jedes Feedback, das Sie zu Ihren Gedanken zu diesem Thema, Ihren Erfahrungen/persönlichen Kenntnissen oder anderen Erkenntnissen haben könnten - hinter der Geschichte steckt immer mehr als das, was man bekommt im öffentlichen Bereich veröffentlicht. Sie erreichen uns per E-Mail unter [email protected].


GenHunter hat mehrere beliebte Produktlinien für Western-Blotting, alles mit dem Ziel, Ihnen Geld zu sparen und Western Blots einfach zu machen:

  • Unsere PerfectWestern Container sind in 38 verschiedenen Größen erhältlich und verfügen über ultraglatte, flache Oberflächen, Deckel und 90-Grad-Kanten, um Western Blots aller Größen perfekt aufzunehmen, wodurch die benötigte Antikörpermenge erheblich reduziert wird (oft um 75%), während gleichzeitig schöne Blots erzielt werden. Du kannst Laden Sie hier unseren PerfectWestern-Katalog herunter.
  • Die perfekteMembran ist in 3 verschiedenen Standardgelgrößen, in 4 Materialien (3 Arten von PVDF und Nitrozellulose) erhältlich und kostet im Allgemeinen etwa die Hälfte der Kosten anderer vorgeschnittener Membranen.
  • Unsere Perfekter Film ist ein hochwertiger, besonders empfindlicher blauer Autoradiographiefilm, der sich ideal für die meisten Anwendungen eignet, einschließlich Western Blots mit ECL-Substraten für HRP oder AP!
  • Die PerfectRocker bietet die standardmäßige Hin- und Her-Schaukelbewegung, die von vielen Labors für Western-Blots bevorzugt wird. Es umfasst auch eine einstellbare Geschwindigkeit (2 bis 30 U/min) und eine einstellbare Neigung (0 bis 30 Grad Neigungswinkel).
  • Die neuer PerfectWaver, Bauchtänzerin und Bauchnabel-Orbitalschüttler haben eine einzigartige wellenförmige 3D-Orbitalbewegung, die ideal für Western Blots ist, aber auch für viele andere Anwendungen geeignet ist. Diese Shaker sind extrem langlebig und ermöglichen eine perfekte Membranbewegung.

Verweise:
1) Southern, EM: Nachweis spezifischer Sequenzen zwischen DNA-Fragmenten, die durch Gelelektrophorese getrennt wurden. (1975) Zeitschrift für Molekularbiologie 98:503-517.
Klicken Sie hier, um die ursprüngliche Southern-Blotting-Referenz anzuzeigen

2) Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR: Verfahren zum Nachweis spezifischer RNAs in Agarosegelen durch Übertragung auf Diazobenzyloxymethyl-Papier und Hybridisierung mit DNA-Sonden. (1977) PNAS 74:5350-5354.
Klicken Sie hier, um die Original-Northern-Blotting-Referenz zu sehen

3) Renart J, Reiser J, Stark GR: Transfer von Proteinen von Gelen auf Diazobenzyloxymethyl-Papier und Nachweis mit Antiseren: eine Methode zur Untersuchung der Antikörperspezifität und Antigenstruktur. (1979) PNAS 76:3116-3120.
Klicken Sie hier, um die Western-Veröffentlichung von George Stark zu sehen

4) Towbin H, Staehelin T, Gordon J: Elektrophoretischer Transfer von Proteinen von Polyacrylamidgelen auf Nitrocellulosefolien: Verfahren und einige Anwendungen. (1979) PNAS 76:4350-4354.
Klicken Sie hier, um die Western-Veröffentlichung von Harry Towbin zu sehen

5) Towbin H: Ursprünge des Protein-Blottings. (2009) Protein-Blotting und -Detektion: Methoden und Protokolle, Biji T. Kurien und R. Hal Scofield (Hrsg.) Methods in Molecular Biology. 536:1-3. Humana Press/Springer, New York, NY.
Klicken Sie hier, um Towbins Buchkapitel von 2009 zu sehen

6) Burnette WN: "Western Blotting": Elektrophoretischer Transfer von Proteinen aus Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen auf unmodifizierte Nitrocellulose und radiologischer Nachweis mit Antikörper und radioiodiertem Protein A. (1981) Analytische Biochemie 112:195-203.
Klicken Sie hier, um die Western-Veröffentlichung von Neal Burnette zu sehen

7) Burnette WN: Western Blotting: Erinnerung an vergangene Dinge. (2009) Protein-Blotting und -Detektion: Methoden und Protokolle, Biji T. Kurien und R. Hal Scofield (Hrsg.) Methods in Molecular Biology. 536:5-8. Humana Press/Springer, New York, NY.
Klicken Sie hier, um das Buchkapitel von Burnette aus dem Jahr 2009 anzuzeigen

8) Burnette WN: Western-Blotting. Klinische Chemie (2011) 57:132-133.
Klicken Sie hier, um den Kommentar zu „Citation Classic“ von 2011 zu sehen

9) Mukhopadhyay, R: W. Neal Burnette: Der Mann hinter dem Western Blot. ASBMB heute. (Januar 2012) S. 17-19. Die Amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie, Rockville, MD.
Klicken Sie hier, um die ASBMB-Geschichte von 2012 über Dr. Burnette zu sehen

10) Eisenstein, M: Rückblick: Expansion nach Westen. Naturmethoden. (2005) 2:796.
Klicken Sie hier, um die Geschichte des „Klassischen Protokolls“ von Eisenstein aus dem Jahr 2005 zu sehen


Bitte kontaktiere uns wenn Sie Fragen oder Anmerkungen haben.


Anwendungen und Technologien

Western Blotting-Techniken

Erfahren Sie mehr über Western-Blotting-Techniken. Hier finden Sie Schritt-für-Schritt-Protokolle und hilfreiche Tipps zu Geräten, Membranen, Transferbedingungen und Nachweismethoden.

Proteintrennung und -analyse

Der V3-Western-Workflow von Bio-Rad erleichtert die Geschwindigkeit und Validierung bei jedem Schritt eines Western-Blotting-Experiments – vom Laufen von Gelen bis zur Quantifizierung von Proteinen.

Proteinelektrophorese

Hier finden Sie Protokolle, Video-Tutorials und Auswahlanleitungen, die Sie bei jedem Schritt Ihrer Elektrophorese-Experimente unterstützen.

Bildgebung und Analyse

Hier finden Sie Informationen zu Proteinvisualisierungs- und -quantifizierungsmethoden, Gel- und Blot-Imaging-Instrumenten und Bildanalysesoftware.


Western-Blotting

Western Blotting ist eine etablierte Analysetechnik zum Nachweis, zur Analyse und zur Quantifizierung von Proteinen. Dieses Verfahren wird häufig verwendet, um spezifische Proteinmoleküle in komplexen Proben wie Gewebehomogenaten und Zelllysaten nachzuweisen. Western-Blotting beinhaltet typischerweise eine Proteintrennung durch Gelelektrophorese, gefolgt von einer Übertragung auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)- oder Nitrozellulosemembran. Nachdem Proteine ​​übertragen wurden, können sie zur Visualisierung gefärbt und direkt durch N-terminale Sequenzierung, Massenspektrometrie oder Immundetektion identifiziert werden.

Bei der Western-Blotting-Immundetektion werden Proteine ​​durch ihre Bindung an spezifische Antikörper identifiziert. Typischerweise wird ein primärer Antikörper in Kombination mit einem HRP- oder AP-konjugierten sekundären Antikörper für den chemilumineszenten oder kolorimetrischen Nachweis unter Verwendung eines geeigneten Substrats verwendet. Alternativ kann ein fluoreszenzmarkierter primärer oder sekundärer Antikörper zur direkten Visualisierung verwendet werden.

Western-Blotting wird in der Biochemie umfassend eingesetzt, um das Vorhandensein spezifischer Proteine ​​nachzuweisen, das Ausmaß posttranslationaler Modifikationen zu bestimmen, die Proteinexpression bei Klonierungsanwendungen zu verifizieren, die Expressionsniveaus von Proteinen und Biomarkern zu analysieren, bei der Antikörper-Epitop-Kartierung und zum Testen auf Krankheitsmarker im klinischen Umfeld.

Die Notwendigkeit, gleichzeitig mehr Proteine ​​in begrenzten Proben zu analysieren, hat die laufende Forschung zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit von Blotting-Techniken vorangetrieben. Double Blotting eliminiert falsch positive Ergebnisse, die durch unspezifische Interaktionen verursacht werden. Far-Western-Blotting ermöglicht den Nachweis spezifischer Protein-Protein-Interaktionen. Southwestern Blotting wird verwendet, um Proteine ​​zu identifizieren, die mit spezifischen DNA-Sequenzen interagieren. Multistrip-Blotting erhöht den Durchsatz und minimiert gleichzeitig die Inter-Blot-Variabilität. Neue Technologien werden entwickelt, um die zur Erzeugung eines Signals erforderlichen Proteinmengen zu reduzieren und die quantitativen Möglichkeiten des Western Blotting zu verbessern.


Die Zeitschrift für biologische Chemie

Erfordert die Veröffentlichung statistischer Analysen experimenteller Ergebnisse

„Statistische Variations- und Präzisionsanalysen zur Feststellung von Unterschieden zwischen experimentellen Gruppen sollten vorzugsweise unter Verwendung der Standardabweichung (SD) oder des Konfidenzintervalls (KI) berichtet werden. 2,3 ”

Statistische Analysen sind nützlich, um Ergebnisse zu interpretieren und zu validieren

Die Verwendung von Mittelwert ± SEM-Balkendiagrammen kann irreführend sein und die Interpretation der Daten verändern.

LI-COR kann Ihnen helfen, statistisch signifikante Daten für die quantitative Western-Blot-Analyse zu generieren

Detaillierte Informationen zur Dateninterpretation und Berechnung des Variationskoeffizienten (% CV), des arithmetischen Mittels (Durchschnitt) und der Standardabweichung für die Normalisierung und quantitative Werte finden Sie in den Analyseabschnitten unserer Protokolle.

Mit diesen Produkten, Protokollen und Tools – und der über 17-jährigen Western-Blotting-Erfahrung von LI-COR – können wir Ihnen helfen, erfolgreich zu sein, unabhängig davon, wo Sie Ihre Daten veröffentlichen möchten.

Notiz: Diese Ressourcen sollten Sie auch bei den Anforderungen anderer Zeitschriften unterstützen, aber überprüfen Sie unbedingt die Richtlinien für die Zeitschrift, bei der Sie Ihre Publikation einreichen.

Erfahren Sie mehr darüber, wie sich Veröffentlichungspflichten auf Sie auswirken können.

Verweise

    Natur. Macmillan Publishers Limited, 2016. Web. 31. Juli 2017. Die Zeitschrift für biologische Chemie. Amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Netz. 31. Juli 2017. Die Zeitschrift für biologische Chemie. Amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Netz. 9. Mai 2018. Zelle. CellPress. Webb. 31. Juli 2017. Die Zeitschrift für Zellbiologie. Die Rockefeller University Press. Netz. 31. Juli 2017. Wissenschaft. Amerikanische Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften. Netz. 31. Juli 2017.

Vergleichen Sie die Proteinexpression genau und reduzieren Sie die Variabilität, wo immer dies möglich ist.

Proteinvergleich bedeutet, die Definition von Quantität etwas weiter zu fassen. Es ist möglich, zwei quantitative Western Blots zu erhalten und diese ungenau zu vergleichen&hellip


Fragen zum Western-Blotting? - Biologie

Die Western Fleck (alternativ Protein-Immunoblot) ist eine analytische Technik. Einige Formen der Lyme-Borreliose-Tests verwenden Western beflecken. .
Ganzer Artikel >>>

Informationen über die Western Fleck Technik. Lerne das Western beflecken Protokoll und Methode, um Westernblot-Probleme zu beheben.
Ganzer Artikel >>>

Western Fleck n.pr Ein Bestätigungstest für HIV-Exposition, der Antikörper gegen HIV-Proteine ​​und . Die Western Fleck (alternativ Protein-Immunoblot).
Ganzer Artikel >>>

. Techniken - Beispiele für Western beflecken Anwendungen umfassen die Analyse von . Ein komplexeres Verfahren, Western beflecken, beinhaltet die Trennung eines Proteins .
Ganzer Artikel >>>

Western beflecken (auch Immunob. Western. beflecken kann qualitative und semiquantitative Daten über. dieses Protein. Der erste Schritt in a Western .
Ganzer Artikel >>>

In Western beflecken (oder Immunblotting), vor der Proteinimmobilisierung auf der . Western beflecken“: Elektrophoretischer Transfer von Proteinen aus Natriumdodecyl.
Ganzer Artikel >>>

EIN Western Fleck ist eine molekularbiologische Methode zum Nachweis eines bestimmten Proteins in einer . Einige monoklonale Antikörper mit hoher Affinität können auch verwendet werden für Western Flecken. .
Ganzer Artikel >>>

Norden und dann Western Flecken wurden analog benannt. Blotting Techniken entwickeln zuerst ein primäres Gel: Protein auf Acrylamid oder DNA/RNA auf Agarose. .
Ganzer Artikel >>>

Western beflecken sagt Ihnen, wie viel Protein sich in den Zellen angesammelt hat. . ein Protein wird schnell abgebaut, Western beflecken wird es nicht gut erkennen, müssen Sie.
Ganzer Artikel >>>

Pall Corporation produziert Western beflecken Membranen aus . Teil 1 - Western Blotting Membranbindungsinteraktion, Methode von .
Ganzer Artikel >>>

Western Blotting Chemilumineszenz-Luminol-Reagenz. Vorgefärbte Molekulargewichtsstandards . Isotyp-spezifische Sekundärantikörper für Western Blotting .
Ganzer Artikel >>>

Wenn du denkst, du weißt alles über Western beflecken, weiter lesen. . "Western beflecken ist eine von Natur aus qualitative Technik, die den .
Ganzer Artikel >>>

Western Fleck Verfahren . wie a Western Fleck (formell als . Western Flecken erlauben Forschern, das Molekulargewicht eines Proteins zu bestimmen.
Ganzer Artikel >>>

Für zweifarbig Western Fleck Anwendungen. . das Signal auf a . verstärken Western Fleck . Bei der Anpassung Ihres Western beflecken Protokolle für die Odyssey-Erkennung .
Ganzer Artikel >>>

Home>Technische Informationen>Zusätzlicher technischer Support>Leitfaden zur Fehlerbehebung>Western Fleck . 2% fettfreie Trockenmilch in Blotting Puffer als Ausgangspunkt für .
Ganzer Artikel >>>

Zum Western Flecken, Membran mit verdünntem Antikörper in 5% w/v BSA, 1X TBS, inkubieren. Phototope®-HRP Western Fleck Erkennungssystem: (#7071 Anti-Kaninchen) oder (#7072 Anti .
Ganzer Artikel >>>

Western Blotting mit monoklonalen Antikörpern, BD Biosciences - Ein detaillierter Schritt von . Protokoll für Western Blotting von Gewebekulturzellen.
Ganzer Artikel >>>


Fragen zum Western-Blotting? - Biologie

Western-Blot-Analyse

TBS-Puffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5
150 mM NaCl TBS-T Puffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5
150 mM NaCl
0,05 % Tween 20 Probenpuffer 1 % (w/v) Triton X
4 M Harnstoff
50 mM Tris-HCl, pH 6,8
150 mM NaCl
2% (w/v) SDB
10 % (w/v) Glycerin
2% (w/v) Mercaptoethanol-Blockierungslösung 5% fettfreies Trockenmiik (im Nachweiskit enthalten, Bio-Rad, Kat.#170-6404) in TBS-T
TBS-T-Puffer

Fertiggele (7,5% Fertiggel Fertiggele, Bio-Rad, Kat.-Nr. 161-1118)

Mini Trans-Blot-Zelle (Bio-Rad, Kat.# 170-3930)

Immun-Blot PVDF (Bio-Rad, Kat.# 162-0174)

Immun-Star TM Ziegen-Anti-Maus-HRP-Nachweiskit (Bio-Rad, Kat.-Nr. 170-5044)

Primärer Antikörper Anti-Renilla-Luciferase (Klon 5B11.2, Chemicon International, )
Die Verdünnung für den Primärantikörper beträgt 1:2.000 aus einer Stammlösung Sekundärantikörper Immun-Star TM Ziege Anti-Maus-HRP-Konjugat (Bio-Rad, Kat.#170-5047)
Die Verdünnung für den sekundären Antikörper beträgt 1:30.000 Verdünnung

    Sammeln Sie Protoplastensuspensionen aus 4 Wells in einer 96-Well-Platte (insgesamt