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Wie kann ich die Nutzlast eines Bakteriophagen ändern, der zur Transformation von E. coli verwendet wird?

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Ich habe mir Bakteriophagen angeschaut und wie sie zur Transformation von E.coli verwendet werden. Während der ganze Vorgang, wie ein Bakteriophage funktioniert, theoretisch sinnvoll ist, wollte ich wissen, wie man die Standardnutzlast eines Bakteriophagen mit dem Nutzlast der Zinsen (Engineered Plasmid) in der Praxis?

Klärung:

Nutzlast - Genetisches Material, das der Phagen in die Bakterien einfügt

Standardnutzlast - Welches genetische Material auch immer der Phagen auf natürliche Weise in die Bakterien einfügt

Nutzlast der Zinsen - Generiertes Plasmid, das ich in die Bakterien einfügen möchte


Ich verwende derzeit ein 'Phagen-Integrase'-System, um mein interessierendes Gen in einzufügen P. putida und es ist definitiv ein nahtloser Prozess mit hoher Effizienz, daher kann ich ihn nur empfehlen!

Was Ihre Frage angeht, die Methode, mit der wir das interessierende Gen mit dem Phagen-Integrase-System integrieren, ist einfacher als Sie denken. Wir ändern die Nutzlast eines Bakteriophagen nicht. Wir elektroporieren einfach mit zwei Plasmiden, einem, das die BxB1-Integrase exprimiert, und einem anderen Plasmid, das unser interessierendes Gen enthält, das wir in das Genom von integrieren wollen P. putida. Diese Integration ist höchst effizient und funktioniert über eine Serin-Rekombinase, die spezifische attP und attB Sequenzen in dem Plasmid, das mein interessierendes Gen und das native Genom meines gentechnisch veränderten Stamms enthält. Diese Methode ist wesentlich effizienter, um bestimmte Stämme (typischerweise Nicht-Modellorganismen) für Genomintegrationszwecke zu entwickeln.

Referenzen für zusätzliche Informationen zum System für Ihre Überprüfung:

Hier ist ein Artikel, der beschreibt, wie wir das Phagen-Integrase-System verwenden, um das Genom effektiv zu bearbeiten. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214030116300438

Hier ist das Papier, das den Mechanismus entdeckt und charakterisiert, durch den dieses System funktioniert. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202310003142?via%3Dihub


Bakteriophagen-Gene, die das bakterielle CRISPR/Cas-Immunsystem inaktivieren

Ein weit verbreitetes System, das Bakterien zum Schutz vor potenziell gefährlichen fremden DNA-Molekülen verwenden, besteht aus den geclusterten, regelmäßig angeordneten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR) gekoppelt mit ca (CRISPR-assoziierte) Gene 1 . Ähnlich der RNA-Interferenz in Eukaryoten 2 verwenden diese CRISPR/Cas-Systeme kleine RNAs zum sequenzspezifischen Nachweis und zur Neutralisierung eindringender Genome 3 . Hier beschreiben wir die ersten Beispiele von Genen, die die Hemmung eines CRISPR/Cas-Systems vermitteln. In den Genomen von Bakteriophagen, die sich infizieren, wurden fünf verschiedene „Anti-CRISPR“-Gene gefunden Pseudomonas aeruginosa. Durch die Mutation des Anti-CRISPR-Gens eines Phagen war dieser nicht in der Lage, Bakterien mit einem funktionsfähigen CRISPR/Cas-System zu infizieren, und das Hinzufügen desselben Gens zum Genom eines auf CRISPR/Cas gerichteten Phagen ermöglichte es ihm, das CRISPR/Cas . zu umgehen System. Phagen-kodierte Anti-CRISPR-Gene könnten einen weit verbreiteten Mechanismus für Phagen darstellen, um die weit verbreiteten CRISPR/Cas-Systeme zu überwinden. Die Existenz von Anti-CRISPR-Genen eröffnet neue Wege zur Aufklärung der CRISPR/Cas-Funktionsmechanismen und liefert neue Einblicke in die Koevolution von Phagen und Bakterien.


Einführung

Bakteriophagen (Phagen) sind virale Parasiten von Bakterien und sind die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten auf der Erde mit einer geschätzten globalen Population von über 10 30 , 10-mal mehr als ihre bakteriellen Wirte (Wommack und Colwell, 2000 Dy et al., 2014). Phagen sind nahezu allgegenwärtig, da sie aus Boden, Wasser, Pflanzen und Tieren isoliert wurden (Elbreki et al., 2014). Globale Phageninfektionen wurden auf ungefähr 10 25 pro Sekunde geschätzt und sind von grundlegender biologischer, ökologischer und evolutionärer Bedeutung (Wommack und Colwell, 2000). Die Phagen-Wirt-Interaktion beginnt mit der Adsorption, bei der sich das Phagenrezeptor-bindende Protein an den spezifischen Rezeptor auf der Wirtszelloberfläche anlagert (Lindbergl, 1973). In Gram-negativen Bakterien kann eine Vielzahl von oberflächenexponierten Komponenten als Phagenrezeptoren genutzt werden, darunter Proteine ​​der äußeren Membran (OMPs), Lipopolysaccharide (LPS), Exopolysaccharide, Kapselpolysaccharide, Flagellen und Pili (Bertozzi Silva et al., 2016). Phagen zielen mit einer ausgezeichneten molekularen Spezifität auf diese Rezeptoren ab, und dies kann ein wichtiger Parameter sein, der zu dem engen Wirtsspektrum vieler Phagen (Nobrega et al., 2018). Die Kenntnis der molekularen Mechanismen und der zeitlichen Dynamik dieses Targeting-Systems liefert nicht nur neue Einblicke in die Phagenbiologie, sondern verbessert auch den Nutzen von Phagen-abgeleiteten Anwendungen (Bertozzi Silva et al., 2016). Nichtsdestotrotz wurden in den letzten Jahrzehnten die meisten Grundlagenforschungen zu dieser anfänglichen Phagen-Wirt-Interaktion an einer sehr begrenzten Gruppe gut charakterisierter Phagen und deren Rezeptoren in verwandten Wirten durchgeführt (Chatterjee und Rothenberg, 2012). Angesichts der schieren globalen Fülle von Phagen bleiben daher die grundlegenden Grundlagen des bakteriellen Wirtsspektrums und seine ökologische Plastizität weitgehend unklar.

Die Schwierigkeit, Phagen auf bestimmten Bakterienarten zu isolieren, und die wiederholte Isolierung ähnlicher Phagen, die auf denselben bakteriellen Rezeptor abzielen, haben trotz der Fülle und Vielfalt von Umweltphagen eine breitere Analyse der Phagen-Rezeptor-Wechselwirkungen eingeschränkt (Hyman, 2019). Die Isolierung einer Vielzahl von Phagen, die auf verschiedene Rezeptoren eines bestimmten bakteriellen Wirts abzielen, ist wünschenswert für (i) Studien der grundlegenden Phagenbiologie, Ökologie und Molekularbiologie und (ii) Phagentherapie, wo eine Sammlung von Phagen, die auf verschiedene Rezeptoren von a Wirtsbakterien sind in Phagencocktails nützlich, um die Entwicklung einer potentiellen bakteriellen Resistenz zu umgehen (Chan et al., 2013). Einige Phagenrezeptoren, wie z. B. OMPs, können einfache Strukturen aufweisen und können auch eine Rolle bei der Antibiotikaresistenz oder Virulenz spielen (Seed et al., 2014). Die Phagen-resistenten Mutanten solcher Bakterien können weniger virulent und anfälliger für Antibiotika sein. Folglich wäre es aus verschiedenen Gründen nützlich, ein einfaches Verfahren zu haben, um eine Sammlung von Phagen zu isolieren, die auf einen spezifischen Rezeptor eines bestimmten Bakteriums abzielen.

Der konventionelle Weg zur Phagenisolierung besteht darin, Phagen gegen einen spezifischen bakteriellen Wirt anzureichern, dann kann die Natur des Rezeptors unter Verwendung von Mutanten-Screenings aufgeklärt werden (Charbit und Hofnung, 1985 Li et al., 2019). Um dann Phagen zu isolieren, die auf einen „neuen“ Rezeptor abzielen, können zunächst bakterielle Mutanten, denen der oder die „alten“ Rezeptoren fehlen, zur Anreicherung verwendet werden (Beher und Pugsley, 1981). Diese Verfahren sind jedoch insofern vergleichsweise ineffizient, als die Isolierung von Phagen, die auf einen bestimmten Rezeptor abzielen, das Screening einer sehr großen Anzahl von Phagen erfordern kann (Beher und Pugsley, 1981, Charbit und Hofnung, 1985). In dieser Studie entschieden wir uns, einfache Anreicherungsmethoden zu verwenden, um die Auswirkungen der heterologen Oberflächenrezeptorexpression auf die Phagenisolierung zu untersuchen. Ziel war es, die Hypothese zu testen, dass die Manipulation der Natur des auf der bakteriellen Zelloberfläche exprimierten Rezeptors leichte Anreicherungen beeinflussen würde, was zur Isolierung und Entdeckung neuer, in der Umgebung adsorbierender Phagen auf vorhersagbare Weise führen würde.

Die Studie konzentrierte sich auf einen gut charakterisierten bakteriellen Rezeptor für einen gut untersuchten Phagen. In den letzten Jahrzehnten wurde Phagen λ intensiv als wichtiges Forschungswerkzeug zur Untersuchung grundlegender molekularer Mikrobiologieprozesse untersucht und weil es für verschiedene molekulare Werkzeuge genutzt werden kann, unter anderem als Vehikel für die Transposonabgabe und für die Cosmidklonierung und -technik (Palva et al., 1987 Ellard et al., 1989). Phagen λ ist a Siphoviridae Familienmitglied Phagen mit einem langen, nicht kontraktilen Schwanz (Ackermann, 2003). Das gpJ-Protein am Ende des Phagenschwanzes erkennt und interagiert mit dem verwandten Rezeptor, dem Escherichia coli Lamm (EcLamB) Protein, bei dem es sich um ein trimeres OMP handelt, das in die äußere Membran (OM) mit oberflächenexponierten Domänen eingebettet ist (Schirmer et al., 1995 Chatterjee und Rothenberg, 2012). Die natürliche physiologische Rolle von LamB in E. coli ist als Porin permissiv für den Transport von Maltose und Maltodextrinen aus der Umgebung in die Bakterienzellen (Ishii et al., 1981). Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die C-terminale Region des trimeren gpJ-Proteins des Phagenschwanzes die Wirtsspezifität bestimmt, indem sie direkt mit EcLamB, wenn Phagen λ an die Oberfläche der Wirtszelle bindet (Wang et al., 2000). Darüber hinaus sind 12 Reste von EcLamB, das an der Erkennung von Phagen beteiligt ist, wurde durch Screening identifiziert E. coli K12-Stämme mit Missense-Mutationen in Lamm Gen (Gehring et al., 1987 Charbit et al., 1994). Angesichts der Topologie des Proteins im OM liegen die meisten Schlüsselreste erwartungsgemäß auf der extrazellulären Oberfläche des EcLamB-Porin und sind daher für den Phagen zugänglich (Charbit et al., 1994). Neben Phagen λ, die EcDas LamB-Protein wird auch von einer kleinen Auswahl anderer Phagen erkannt, wie K10, TP1, SS1 und AB48 (Wandersman und Schwartz, 1978 Roa, 1979 Beher und Pugsley, 1981 Charbit und Hofnung, 1985). Die meisten dieser Phagen sind -ähnlich Siphoviridae Familienmitglieder in Bezug auf die Morphologie. Andere Informationen zu diesen EcLamB-zielende Phagen sind in der Literatur, die bis ins letzte Jahrhundert zurückreicht, sehr begrenzt. Folglich ist wenig über die Häufigkeit, Verteilung oder Vielfalt von Umweltphagen bekannt, die angreifen können EcLambB als ihr Rezeptor.

In dieser Studie haben wir eine einfache Methode entwickelt, um eine Gruppe neuartiger Umweltphagen zu isolieren, die auf die EcLamB-Protein als ihr Rezeptor. Drei Enterobakterien, nämlich Citrobacter rodentium (Citrobacter), Yersinia enterocolitica (Yersinien) und Serratia ATCC 39006 (Serratia) wurden zuvor mit einem Plasmid (pMUT13) transformiert, das die E. coli lamB Gen. Mehrere Phagen, die zielen EcLamB wurden durch Anreicherung mit einem dieser pMUT13-haltigen Stämme isoliert. Obwohl diese neu isolierten Phagen auf denselben Rezeptor wie Phagen abzielen, haben sie keine Ähnlichkeit mit Phagen λ in Bezug auf Morphologie oder genomische DNA. Darüber hinaus ist neben dem EcLamB-Protein haben wir festgestellt, dass diese neuen Phagen auch die Fähigkeit besitzen, einen alternativen Rezeptor als Weg zur viralen Invasion ihrer jeweiligen bakteriellen Wirtszellen anzugreifen. Unsere Ergebnisse legen einen möglicherweise einfachen Anreicherungsansatz nahe, um die Isolierung von Phagen zu beeinflussen, die auf jeden definierten Rezeptor abzielen, der auf der bakteriellen Zelloberfläche exponiert ist. Dieser Ansatz ermöglicht zukünftige Studien über die molekulare Natur und Evolution von Phagen sowie die Grundlagen der Spezifität des Wirtsspektrums. Es liegt auch auf der Hand, dass diese Strategie biotechnologischen Nutzen haben könnte.


Metallbiologie im Zusammenhang mit der Huntington-Krankheit

Terry Jo V. Bichell , . Aaron B. Bowman, in Biometalle bei neurodegenerativen Erkrankungen, 2017

MRE-11 – Meiotische Rekombination 11 und FAN1 – Fanconis assoziierte Nuklease 1

Wie ATM sind MRE-11 und FAN1 Teil des DNA-Reparaturwegs, und beide sind Mn-abhängige Enzyme, die mit DNA-Schäden bei der Huntington-Krankheit verbunden sind. MRE-11 assoziiert mit ATM und komplexiert mit Ras-Proximate 1 (RAP1), um die Telomerlänge aufrechtzuerhalten, 269 während FAN1 dazu dient, die DNA-Quervernetzungen zwischen den Strängen zu entfernen, die die doppelsträngige Reparatur behindern. 270.271 Pathologische doppelsträngige DNA-Reparatur wird bei der Huntington-Krankheit und bei anderen polyQ-Expansionskrankheiten gefunden. 272 Kürzlich ergab eine genomweite Assoziationsstudie an 1462 Patienten mit Huntington-Krankheit und anderen spinozerebellären PolyQ-Ataxien (SCAs), dass ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) von FAN1 ein genetischer Modifikator für das Erkrankungsalter war. 273 Sowohl Mn als auch Mg können als Cofaktoren für FAN1 dienen 271 aber MRE-11 ist nicht aktiv, wenn Mn durch Mg ersetzt wird. 274

Alle zuvor erwähnten Beweise, die Anomalien in Mn-abhängigen Enzymen mit der Huntington-Krankheit in Verbindung bringen, unterstützen nachdrücklich die Daten, die zeigen, dass eine verringerte Mn-Bioverfügbarkeit zu den bei der Krankheit beobachteten Pathologien beiträgt.


Geschichte verändern

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Ch 6 Bakterienwachstum, Ernährung und Differenzierung

Stationäre Phase – wenn die Zahl der lebensfähigen Zellen aufgrund eines Mangels an wichtigen Nährstoffen oder der Ansammlung von Abfallprodukten aufhört zu steigen. Das Wachstum einzelner Zellen verlangsamt sich und die Zahl der sich teilenden Zellen entspricht ungefähr der Zahl der sterbenden Zellen. Während dieser Zeit entwickeln sich Resistenzen gegen Antibiotika und Wirtsabwehr.

Ein Chemostat ist ein kontinuierliches Kultursystem, in dem das Verdünnungsmedium eine das Wachstum begrenzende Menge eines essentiellen Nährstoffs enthält.

Strenge Anaerobier - sterben im geringsten Sauerstoff. Sie verwenden keinen Sauerstoff als Elektronenakzeptor und sterben, weil sie anfällig für die hochgiftigen, chemisch reaktiven Sauerstoffspezies sind, die von ihrem eigenen Stoffwechsel produziert werden, wenn sie Sauerstoff ausgesetzt werden. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind Sauerstoffmoleküle oder -ionen mit einem zu wenig oder zu vielen Elektronen.

Enthält auch einfallsreiche Enzymsysteme, die durch Oxidation beschädigte Makromoleküle erkennen und reparieren.

Aerotolerante Anaerobier verwenden nur Fermentation, um Energie bereitzustellen, enthalten jedoch Superoxiddismutase und Katalase oder Peroxidase, um sie vor ROS zu schützen. Aerotolerante Anaerobier wachsen sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Sauerstoff – obwohl sie ohne Sauerstoff besser wachsen

Sporen können mindestens 50-100 Jahre im Boden existieren und einige über Tausende und sogar Millionen von Jahren.

Antisepsis – ähnlich der Desinfektion, aber zur Entfernung von Krankheitserregern von der Oberfläche von LEBENDEM Gewebe, wie z. B. der Haut

Desinfektion – das Abtöten oder Entfernen von KRANKHEITSPRODUZIERENDEN Organismen von unbelebten Oberflächen führt nicht unbedingt zu einer Sterilisation

Abtötende Wirkstoffe: töten Mikroben
---- Bakterizid, algizid, fungizid, viruzid, je nachdem welche Mikrobenart abgetötet wird

Heute wird bei der Pasteurisierung ein bestimmtes Lebensmittel (wie Milch) auf eine mäßig hohe Temperatur erhitzt, die lang genug ist, um Coxiella burnetii abzutöten, den Erreger des Q-Fiebers und den hitzebeständigsten bekannten sporenbildenden Krankheitserreger

- Beim LTLT-Verfahren (niedrige Temperatur, lange Zeit) wird die Temperatur für 30 Minuten auf 63 ° C (146 ° F) gebracht. Dies ist die ursprüngliche Art und Weise, wie es gemacht wurde.

-HTST-Prozess (High Temperature, Short Time) (auch Flash-Pasteurisierung genannt) bringt die Temperatur für nur 15 Sekunden auf 72 ° C (162 F). Dies ist STANDARDVERFAHREN.

-Die Langzeitlagerung von Bakterien erfordert normalerweise das Einbringen von Lösungen in Glycerin bei sehr niedrigen Temperaturen (-70 ° C oder -94 ° F)
- dieses Tiefkühlen unterbricht das Wachstum vollständig und verhindert das Absterben von Zellen.

Die Gefriertrocknung (Gefriertrocknung) ist eine weitere Methode zur Langzeitlagerung. Die Kulturen werden bei sehr niedrigen Temperaturen schnell eingefroren und unter Vakuum gesetzt, wodurch das Wasser sublimiert und das gesamte Wasser aus den Zellen entfernt wird

Kälte tötet nicht gut. Wir verwenden kalte Temperaturen, um Mikroben zu konservieren. WAS SIE tötet, ist, wenn sich Eis in den Zellen bildet, das Glycerin schützt sie davor – und die Gefriertrocknung entfernt das Wasser und verhindert so, dass es abtötet.

Biologische Sicherheitswerkbänke mit Laminarströmung – aufwendige und effektiv belüftete Werkbänke, in denen Luft durch hocheffiziente Partikelluftfilter (HEPA-Filter) gepresst wird, um mehr als 99,9 % luftgetragenes Partikelmaterial von 0,3 Mikrometer oder mehr zu entfernen.

Normalerweise werden Gammastrahlen für Lebensmittel oder Kunststoffe verwendet, die nicht sterilisiert oder auf andere Weise desinfiziert werden können.

Gammastrahlen, Elektronenstrahlen, Röntgenstrahlen – Die Strahlungsdosis wird in einer Einheit namens Gray (Gy) gemessen, die die Energiemenge ist, die auf das Lebensmittel, die Mikrobe oder eine andere bestrahlte Substanz übertragen wird.

Eine Röntgenaufnahme des Brustkorbs liefert etwa ein halbes MiliGray.
Um Salmonellen abzutöten, kann ein frisch geschlachtetes Huhn mit bis zu 4,5 KiloGray (kGy) bestrahlt werden

Es braucht mehr Strahlung, um Bakterien abzutöten und noch mehr, um eine Bakterienspore abzutöten. Virale Krankheitserreger haben die geringste Nukleinsäuremenge und sind damit resistent gegen für Lebensmittel zugelassene Bestrahlungsdosen.

Prionenpartikel enthalten keine Nukleinsäure und werden durch Bestrahlung mit extrem hohen Dosen inaktiviert

Bei der Bestrahlung ist die Größe des Targets und der Zellstruktur wichtig

****CDC-Desinfektionsgrade basierend auf dem Bereich der betroffenen Mikroben.

-ETHANOL, IOD, CHLOR
hochreaktive Verbindungen, die Proteine, Lipide und DNA schädigen

-Tenside (WIE WASCHMITTEL)
helfen bei der mechanischen Entfernung von Mikroben von Oberflächen

-kein einzelnes Chemotherapeutikum wirkt auf alle Mikroben.
- antimikrobielle Arzneimittel werden nach der Art des Organismus, auf den sie wirken, klassifiziert (z. B.: antibakteriell, antimykotisch usw.)
- Auch innerhalb einer Gruppe kann ein Wirkstoff ein enges Wirkungsspektrum aufweisen, während ein anderer viele Arten betreffen kann.

-Penicillin hat ein relativ schmales Spektrum, während Ampicillin aufgrund seiner etwas anderen Struktur ein viel breiteres Spektrum hat.

-Viele Medikamente töten den Organismus nicht, sondern verhindern lediglich sein Wachstum, während das körpereigene Immunsystem sich um den Eindringling kümmern muss

-Die In-vitro-Wirksamkeit eines Wirkstoffs wird dadurch bestimmt, wie wenig davon benötigt wird, um das Wachstum zu stoppen.
-dies wird in Bezug auf die minimale Hemmkonzentration (MHK) des Antibiotikums gemessen
-Die MHK ist definiert als die niedrigste Konzentration des Arzneimittels, die das Wachstum eines Organismus verhindert.

die Zeit kann durch einen Streifentest (Etest) verkürzt werden, der Verdünnungen vermeidet.

- Damit ein Antibiotikum das Bakterienwachstum beim Patienten stoppen kann, muss die Konzentration des Arzneimittels im Gewebe jederzeit höher als die MHK bleiben.
-Der Gewebespiegel eines Arzneimittels im Laufe der Zeit (Halbwertszeit) hängt davon ab, wie schnell das Antibiotikum aus dem Körper durch Sekretion durch die Niere oder Zerstörung in der Leber entfernt wird.
- Die Nützlichkeit hängt auch davon ab, ob Nebenwirkungen bei Gewebekonzentrationen auftreten, die erforderlich sind, um den Erreger zu beeinflussen.

-Die therapeutische Dosis ist die Mindestdosis pro kg Körpergewicht, die das Wachstum des Erregers stoppt.

-die toxische Dosis ist die vom Patienten maximal tolerierte Dosis

-Kombinationen von Antibiotika können entweder synergistisch oder antagonistisch sein

-SYNERGISTISCHE Arzneimittel können bei Einzelgabe schlecht wirken, aber in Kombination sehr gut (Kombinationswirkung ist größer als additive Wirkung) Bsp: Aminoglykosid + Vancomycin

-die Wirkungsmechanismen von ANTAGONISTIC-Medikamenten interferieren sich und verringern ihre Wirksamkeit z. B.: Penicillin + Makrolide

SYNERGISMUS – Aminoglykoside und Vancomycin wirken allein bei einigen Arten von Infektionen (wie Enterokokken) schlecht. In Kombination schwächt das Vancomycin, ein Inhibitor der Zellwandsynthese, die Zellwand des Organismus und erleichtert den Transport des Aminoglykosids in die Zelle.

-Mechanismen umfassen:
Zellwandsynthese
DNA-Synthese
RNA-Synthese
Proteinsynthese
Stoffwechsel
Zellmembranintegrität

ZELLMEMBRAN-INHIBITOREN:
-Polymyxine

Inhibitoren der Proteinsynthese:
505 Ribosomen-Untereinheit:
-Chloramphenicol
- Makrolide (Erythromycin)
-Clindamycin
-Oxazolidinone (Linezolid)
-Streptogramine (Synercid)
305 RIBOSOMEN-UNTEREINHEIT:
-Aminoglykoside (Gentamicin)
-Tetracycline (Doxycyclin)

RNA-POLYMERASE-INHIBITOREN:
-Rifampin
-Pyronine

DNA-REPLIKATIONSHEMMER:
-Chinolone

1) Disaccharid-Einheiten von NAG und NAM werden zuerst im Zytoplasma hergestellt und von einem Lipid-Trägermolekül durch die Membran transportiert.

2) die Disaccharideinheiten werden dann an der Zellmembran zu langen Peptidoglykansträngen zusammengesetzt.

3) benachbarte Stränge werden dann durch ein kurzes Peptid verbunden, das von NAM-Molekülen stammt

Synthese der Zellwand (Peptidoglycan).
NAG und NAM werden als Einheiten im Zytoplasma hergestellt und verbunden (Schritte 1-3). Jede Einheit wird dann von einem spezialisierten Lipidträgermolekül namens Bactoprenol durch die Zellmembran transportiert (Schritt 4). Enzyme verbinden dann die neue Einheit mit einer bereits bestehenden Peptidoglycankette und katalysieren eine Vernetzung zwischen Peptidketten, die aus NAM-Molekülen an parallelen Ketten herausragen.
Penicillin, Vancomycin und Cephalosporine hemmen die Aktivität dieser Enzyme.

Sulfonamid-(Sulfa)-Medikamente hemmen die Synthese von Nukleinsäuren, indem sie die Synthese von Folsäure verhindern, einem wichtigen Cofaktor bei der Synthese von Nukleinsäure-Vorläufern

alle Organismen verwenden Folsäure, um Nukleinsäuren zu synthetisieren. Bakterien produzieren Folsäure aus der Kombination von PABA, Glutaminsäure und Pteridin. Säugetiere synthetisieren keine Folsäure und müssen sie über die Nahrung oder Mikroben aufnehmen.

PABA, Pteridin und Glutaminsäure bilden zusammen das Vitamin Folsäure.

Die normale Synthese von Folsäure erfordert, dass alle drei Komponenten in das aktive Zentrum des biosynthetischen Enzyms eingreifen. Die Sulfonamide ersetzen PABA am aktiven Zentrum. Die Schwefelgruppe bildet jedoch keine Peptidbindung mit Glutaminsäure, und die Größe von Sulfanilamid behindert sterisch die Bindung von Pteridin, so dass keine Folsäure hergestellt werden kann.

DNA-Gyrase, die an ein Chinolon gebunden und durch dieses inaktiviert wird, blockiert das Fortschreiten einer DNA-Replikationsgabel

Da sich bakterielle DNA-Gyrasen strukturell von ihren Säugetier-Gegenstücken unterscheiden, beeinflussen Chinolon-Antibiotika die DNA-Replikation von Säugetieren nicht.

Ciprofloxacin und Levofloxacin

Rifampin ist das bekannteste Mitglied der Rifamycin-Familie von Antibiotika, das selektiv an bakterielle RNA-Polymerase bindet und die Transkription verhindert.

Rifampin wird auch zur Behandlung von Tuberkulose und Meningokokken-Meningitis eingesetzt

Medikamente, die die ribosomale Untereinheit 30S beeinflussen:

Aminoglykoside: (Streptomycin, Gentamicin, Tobramycin)
---verursacht ein Fehllesen der mRNA und hemmt die Peptidyl-tRNA-Translokation

Tetracycline (Doxycyclin)
-- bindet an die 30S-Untereinheit und verhindert, dass tRNAs, die Aminosäuren tragen, in die A-Stelle gelangen

Das S steht für eine Svedberg-Einheit, die ein Maß für Größe und Dichte ist, so dass Untereinheiten kleiner werden, wenn sie sich kombinieren.

-Chloramphenicol- verhindert die Bildung von Peptidbindungen durch Hemmung der Peptidyltransferase in der 50S-Untereinheit

Makrolide (Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin) – binden an die 50S-Untereinheit und hemmen die Translokation von tRNA von der A-Stelle zur P-Stelle.

Lincosamide (Clindamycin) – binden an Peptidyltransferase und verhindern die Bildung von Peptidbindungen

Oxazolidinone – binden an die 50S-Untereinheit und verhindern den Zusammenbau der 70S-Ribosomen

-Modifizieren Sie das Ziel-, so dass es das Antibiotikum nicht mehr bindet. Bsp.: veränderte DNA-Gyrase bindet nicht mehr an Chinolone
(Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie dies geschehen ist – veränderte DNA-Gyrase, verändertes Penicillin-Bindungsprotein oder verändertes Ribosom.)

-Zerstören Sie das Antibiotikum- bevor es in die Zelle gelangt. Bsp.: das Enzym Beta-Lactamase (Penicillinase)
(Beta-Lactamase zerstört Penicillin und Cephalosporin)

Fügen Sie modifizierende Gruppen hinzu, die das Antibiotikum inaktivieren. Bsp.: Enzyme, die Aminoglykoside modifizieren und inaktivieren.
(Bakterien haben Enzyme, die Dinge wie Methylgruppen, Acetylgruppen oder andere hinzufügen, damit das Antibiotikum nicht mehr an seiner Zielstelle binden kann.)

Pumpen Sie das Antibiotikum mithilfe spezifischer oder unspezifischer Transportproteine ​​aus der Zelle. Bsp.: Die Tetracyclin-Resistenz ist auf eine Efflux-Pumpe zurückzuführen.
(Eine Effluxpumpe schickt das Antibiotikum aus der Zelle, bevor es seine Aufgabe erfüllen kann.)

Resistenz kann spontan durch Mutation oder Genduplikation entstehen, gefolgt von zufälligen Mutationen, die das oder die deplizierten Gene "wiederverwenden".
--MDR-Effluxpumpen haben sich aus Genen entwickelt, die für andere Transportmechanismen kodieren.

Sobald ein Resistenzmechanismus entwickelt ist, können Gentransfermechanismen wie die Konjugation das Gen von einem Organismus zum anderen und von einer Spezies zur anderen transportieren.
-- der Transfer ist besonders einfach, wenn das Gen in ein Plasmid eingebaut wurde

dummy target compounds that inactivate resistance enzymes have been developed.
EX: Clavulanic acid binds and ties up beta-lactamases secreted from penicillin resistant bacteria.

Individuals can take the following actions to help:
-frequent hand washing
-vaccinations
-avoiding use of antibiotics for viral infections
-refusing leftover antibiotics
- take full course of antibiotics prescribed.

Drug resistance has spread due to a number of reasons and now we have to try to combat those reasons mainly through education. Much of it developed because in the beginning we didn't understand the differences between bacteria and viruses, so doctors prescribed them for everything. In many countries, antibiotics are not regulated so anyone can go in and buy them, we've used them in food animals because they made the animals grow faster and bigger, people not taking them as prescribed, etc.


Ergebnisse

The colony-to-lawn transformation method for changing hosts of plasmids is illustrated in Fig. 1a. The first step is preparation of plasmid-containing cell lysate. A single colony from plasmid donor strain is suspended in 75% ethanol followed by centrifugation to get pellet, and then the cells are resuspended in CaCl2 solution and lysed by freeze–thaw cycles to obtain plasmid-containing cell lysate. The second step is preparation of recipient cells for transformation. Cells of E coli recipient strain are scraped carefully from fresh lawn without gouging the agar and then suspended in ice-cold water. The third step is transformation. An aliquot of recipient cells and plasmid-containing cell lysate are mixed gently and we performed transformation by heat shock method. Then, transformed bacteria are grown and selected by standard methods. The colony-to-lawn transformation method is more convenient and rapid than current methods, because no plasmid extraction and competent cell preparation steps are needed (Fig. 1b). Using pETM11-P450-BM3 as a sample, we changed its hosts from E coli JM109 to BL21(DE3) either by colony-to-lawn transformation or by chemical transformation. After IPTG induction, the similar expression levels of P450-BM3 protein were obtained (Fig. 1c), indicating that there is no fundamental difference between these transformants. We tested the colony-to-lawn transformation method by using it to change the hosts of various plasmids, including the low-copy-number plasmid pLysS. As a result, no less than 60 transformants were available after each transformation with a single colony of plasmid-containing donor strain (Fig. 1d). Additionally, the method is very convenient, because the LB agar plates with colonies of donor strains and recipient strain can be stocked at 4°C for at least 7 days without affecting the transformation obviously (data not shown). As a control, plasmids from the randomly selected transformants were successfully re-transformed into E coli BL21(DE3) by chemical transformation, indicating that the antibiotic-resistant colonies after colony-based transformation were real transformants but not E coli mutants or contaminants. In addition, no colony was found on the antibiotic-containing agar plates spread with the plasmid-containing cell lysate, indicating that 75% ethanol incubation and freeze–thaw cycles were efficient for sterilization, and no transformants obtained after transformation were mutants or contaminants.

The colony-to-lawn transformation method used for changing hosts of plasmid. (a) Outline of the colony-to-lawn transformation method. A single colony from plasmid donor strain is washed with 75% ethanol and air-dried, and then cells are suspended in CaCl2 solution and lysed by freeze–thaw cycles to obtain plasmid-containing cell lysate. At the same time, cells of plasmid recipient strain are scraped carefully from fresh lawn and suspended in ice-cold water. Then, the recipient cells and plasmid-containing cell lysate are mixed gently and performed transformation by heat shock method. The transformed bacteria are grown and selected by standard methods. (b) Comparison of the colony-to-lawn transformation method and the chemical transformation method. Plasmid extraction and competent cell preparation are essential steps for chemical transformation, but not necessary for colony-to-lawn transformation. (c) SDS-PAGE gel shows protein expression of P450-BM3 before and after changing hosts of pETM11-P450-BM3 either by colony-to-lawn transformation or by chemical transformation. Lane M: protein molecular weight marker lane 1, after host changing of pETM11-P450-BM3 with the chemical transformation method lanes 2, after host changing of pETM11-P450-BM3 with the colony-to-lawn transformation method lanes 3, before host changing of pETM11-P450-BM3 (i.e. protein expressed in Escherichia coli JM109). (d) The numbers of transformants obtained by changing hosts of various plasmids with the colony-to-lawn transformation method. Each value represents the mean of five independent experiments.

A process based on colony-to-lawn transformation and protein expression was designed and conveniently used to remove frameshift mutations during the construction of mutant library (Fig. 2a). Recombinant plasmids are constructed and transformed into E coli cloning strain, followed by changing the hosts of plasmids from cloning strain to expression strain with the colony-to-lawn transformation method. Then, randomly selected transformants are cultured in auto-inducing media overnight. An aliquot of each culture is used to check protein expression by SDS-PAGE, and only the positive clones having expected protein expression are used to extract plasmids from their remaining cultures, and DNA sequencing or another round of mutagenesis was performed Although the current transformation methods can be used for the same purpose, the process should be less convenient, because more time and an additional experimental step (competent cell preparation) are needed (Fig. 2b). Additionally, more plasmids should to be extracted, because the clones used for plasmid extraction are before protein expression screening. In this work, the recombinant plasmids with random mutations of P450-BM3 gene introduced by error-prone PCR were used to test this method. The recombinant plasmids were changed hosts from cloning strain JM109 to expression strain BL21(DE3) with the colony-to-lawn transformation method. Then, ten randomly selected transformants were used to check protein expression levels, five of them were found to have expected protein expression. The plasmids were extracted and DNA sequencing was performed, and as a result, all the DNA sequences of positive clones were found to be in the correct open reading frames.

Protein expression in combination with the colony-to-lawn transformation method to screen in-frame clones from mutant library. (a) Outline of the experimental strategy. Plasmids from mutant library construction were changed hosts from cloning strain to expression strain with the colony-to-lawn transformation method. Then, the randomly selected transformants are checked for protein expression by SDS-PAGE. Plasmids are extracted for positive clones, and DNA sequencing or next round of mutagenesis was performed (shown as dotted line). (b) The chemical transformation method used for the same purpose. Plasmids are extracted from randomly selected clones after mutant library construction and transformed into competent cells of expression strain for protein expression and SDS-PAGE analysis. The plasmids extracted from the clones which have expected protein expression are used for DNA sequencing or next round of mutagenesis (shown as dotted line).


Hintergrund

Recent studies have revealed that epigenetic genome methylation is associated with many aspects of life processes through effects on gene expression and other steps [1–3]. Especially, epigenetic methylation is involved in silencing of selfish genetic elements and other aspects of intragenomic conflicts. Experimental alteration of epigenetic DNA methylation systems can cause a wide variety of changes [4–8] for example, in Prokaryota, DNA methyltransferase action can change the transcriptome [7]. Horizontal gene transfer contributes considerably to the building up of prokaryotic genomes [9, 10]. In particular, the DNA methyltransferase genes frequently move between genomes [11–15] and could, therefore, present potential threats to prokaryotic genomes, although they can also be beneficial to bacteria in many ways, including in cell cycle regulation and cell differentiation [3, 8].

Prokaryotic DNA methyltransferases often form a restriction-modification (RM) system together with a restriction enzyme [16, 17]. Some RM systems behave as mobile elements, as suggested by their amplification, mobility, and involvement in genome rearrangements, as well as their mutual competition and regulation of gene expression [13–15, 18–21]. Some type II RM systems cleave chromosomes of their host cells when their genes are eliminated by a competitor genetic element [20, 22, 23], as illustrated in Figure 1a. Such host killing, called 'post-segregational killing' or 'genetic addiction', has been recognized to be involved in stable maintenance in many plasmids [24]. The RM systems have evolved regulatory systems to suppress their potential to kill the host. When they enter a new host, they prevent host cell killing by expressing their methyltransferase first and delaying expression of their restriction enzyme [19, 25–27].

Host killing by RM systems and by methyl-specific DNases (McrBC) in competition. (ein) When a resident RM gene complex is replaced by a competitor genetic element, a decrease in the modification enzyme level results in exposure of newly replicated chromosomal restriction sites to lethal cleavage by the remaining restriction enzyme molecules. The intact genome copies will survive in uninfected neighboring clonal cells. (b) When a DNA methylation system enters a cell and begins to methylate chromosomal recognition sites, McrBC senses the change and triggers cell death by chromosomal cleavage. The intact genome copies will survive in uninfected neighboring clonal cells.

Host chromosome cleavage by RM systems is not trivial. In general, cleavage of chromosomes by cellular DNases is prevented in various ways: inhibitor binding, compartmentalization, proteolysis, DNA modification and DNA structure specificity. Indeed, host killing by RM systems after loss of their genes is not always obvious because hosts have apparently adapted to counteract it in various ways. Recombination repair of chromosomal breakage can reduce the lethal effects of chromosome cleavage [28]. Host killing by an RM gene complex is suppressed by a solitary methyltransferase recognizing the same sequence [29, 30]. Proteolytic digestion of restriction enzymes suppresses chromosome cleavage by ÖkoKI, a type I RM system, even in the absence of the cognate methyltransferase [31]. These host defense systems against RM systems cannot, however, avoid host genome methylation and its potentially deleterious effects.

In the present work, we provide evidence for the existence of a group of genetic elements that compete with epigenetic DNA methylation systems (for example, with DNA methyltransferases from RM systems) through host cell killing. These anti-methylation elements are methyl-specific endodeoxyribonuclease McrBC of Escherichia coli [32] and its homologs. McrBC cleaves DNA between two separate R m C (R = A or G, m C = m4 C or m5 C) sites in vitro [33], which are modified by many DNA methyltransferases from different RM systems [16, 17]. This activity was first recognized for restriction of incoming bacteriophage genomes carrying hydroxymethylcytosine instead of cytosine [34, 35]. McrBC may also protect cells against infection by methylated DNA elements, such as viral genomes and plasmids, through such direct cleavage. However, such methylated DNAs are not usually strongly restricted by McrBC [36, 37] therefore, we hypothesized that McrBC may mediate suicidal defense in response to epigenetic genome methylation systems, such as RM systems, as illustrated in Figure 1b. When such a system enters the cell and begins to methylate the host genome, McrBC would sense these epigenetic changes and trigger cell death through chromosomal cleavage. Intact (unmethylated) genomes with mcrBC genes would survive in the neighboring clonal cells.

Defense against invasion of genetic elements through cell death, as illustrated in Figure 1a,b, has been reported for multicellular eukaryotic cells, such as virus-infected mammalian cells and plant cells [38]. Similar phenomena against virus infection have been known for bacteria under the name of 'phage exclusion' or 'phage abortion' [39]. Bacteriophage reproduction is aborted by the action of a cell death gene. As a result, this gene would survive within the clonal cells that would, otherwise, all die by secondary infection. Zum Beispiel die prr gene in some Escherichia coli strains senses bacteriophage T4 infection and triggers cell death by cleaving host tRNA Lys [40].

We first asked whether McrBC-mediated cell death through cleavage of methylated chromosomes takes place upon entry/induction of a methyltransferase gene and aborts its establishment/activation. After obtaining positive experimental results, we asked how important this role has been in the spread and maintenance of McrBC genes. Our analyses of their molecular evolution and genomic contexts support the hypothesis that, during evolution, they have behaved as mobile elements. Taken together, these results support our hypothesis that McrBCs have evolved as mobile elements that compete with specific genome methylation systems through host killing.


DISKUSSION

The most important conclusions from our results can be summarized as follows: (i) two new, small, early T4 proteins, RepEA and RepEB, encoded in the oriE region, are important for T4 DNA replication (ii) RepEB is specifically important for the priming of leading-strand DNA synthesis at oriE, whereas RepEA appears to have an auxiliary function, but neither protein is required for transcription from the early promoter (iii) neither expression of repEA oder repEB nor initiation of DNA replication at oriE requires the activator of middle promoters, MotA protein (iv) the early transcripts encoding RepEA and RepEB, which can also serve as primers for leading-strand DNA synthesis, are short-lived.

These results suggested to us the following working hypothesis for initiation of DNA replication from oriE: we propose that one or both of the new repE proteins facilitates loading of helicases to oriE DNA (e.g., to the iteron DNA) and that tracking of these helicases modulates the status of some oriE transcripts (i.e., whether they are terminated or processed and whether they are base paired to DNA, as required for priming, or displaced from the DNA, as required for translation). Experimental tests of this working hypothesis will undoubtedly demand modifications and extensions.

OriE-specific transcripts and proteins are synthesized only briefly after infection.

T4 uses transcripts to prime leading-strand DNA synthesis at origins (4, 35, 39, 44, 48). Formation of primers must include steps by which the nascent RNA is kept base paired or is reinserted into the DNA duplex. Partial digestion of transcripts may occur, and it may or may not be obligatory for priming. Within the framework of our working hypothesis, one or both of the two new RepE proteins synthesized from oriE transcripts facilitates the access of helicases, which in turn facilitates the base pairing of a sister transcript with the DNA template, the priming of DNA synthesis, and perhaps transcription termination, at a distance.

Database searches provided no clue for the functions of RepEA and RepEB proteins. Moreover, RepEA and RepEB proteins, with or without His tags, turned out to be largely insoluble. However, RepEA and RepEB, when fused to maltose-binding protein, are soluble. They bind to single-stranded DNA, preferentially to the iterons marked in Fig. ​ Fig.1 1 and ​ and2 2 (70), suggesting that they might facilitate the opening of double-stranded DNA, like origin proteins of other replicons (32, 37). In contrast to origins of other replicons, in T4 DNA the primary targets of such proteins, the iterons, are far away from the major priming sites for leading-strand DNA synthesis (Fig. ​ (Fig.1 1 ).

The presence of iterons in T4 oriE (Fig. ​ (Fig.2) 2 ) was unexpected at first. Based on bacteria, phage, and plasmid paradigms (15, 17, 32), it is generally assumed that iterons are hallmarks of origins in which primers for leading-strand DNA synthesis are synthesized by primases, which require single-stranded segments for binding to DNA. As mentioned earlier, primers for T4 origin of initiation of leading DNA strands are, however, synthesized by RNA polymerase (4, 39, 48).

Within the framework of our working hypothesis, migration of helicases loaded at the iterons would modulate the status of oriE transcripts (i.e., whether the RNA is base paired to the DNA or to be displaced) far from their target sites. This might depend on competitions between several helicases, (e.g., replicative helicase gp41 孖, 57], the Rho RNA helicase 孥, 66], or the UvsW helicase which is, however, a late protein 嬐]).

Loading of the replicative T4 helicase gp41 by one or both of the RepE proteins can explain another puzzling observation. The gp41 protein, which associates with T4 primase, requires the helper protein gp59 in vitro (56). However, in vivo, gene 59 mutants are proficient in origin DNA replication, and they arrest DNA replication like recombination-deficient T4 mutants (47, 72), suggesting that other proteins load helicases at origins.

The early cessation of transcription through oriE must be a major reason for early cessation of origin-dependent DNA replication (39) at this origin. The small window of time when repEA und repEB are expressed is sufficient to allow a single or few initiations from oriE, but apparent lability of PE1-dependent transcripts and of the RepEB protein, as well as the synthesis of antisense RNA from the late promoters, are all bound to contribute to the apparent early demise of oriE function during phage T4 development.

The early cessation of transcription from PE1 is readily explained by the accumulation of the T4 AsiA protein. This protein sequesters the recognition motif for the � region of ς 70 , and, therefore, inhibits transcription from promoters containing consensus � sequences, such as PE1 (13, 64). Most other early T4 promoters have variant � sequences (71) and may not be subject to similarly strong asiA-dependent inhibition. The apparent lability of early oriE transcripts (Fig. ​ (Fig.3) 3 ) may be related, in part, to possible base pairing with the late antisense transcripts synthesized from the same region.

We do not know whether the DNA priming sites within oriE (examples are shown in Fig. ​ Fig.7A 7 A and B) correspond to transcription termination sites. nicht wie oriA (40) and oriF (21, 22, 48), oriE does not contain a classical factor-independent transcription terminator. Transcription termination factor Rho (66) may be required, and the anomalous priming sites of repEA mutant DNA (Fig. ​ (Fig.7B) 7 B) might suggest the possibility that the T4 RepEA protein may also be involved. Distinguishing features of rho-dependent transcription termination sites are largely unknown apparent 3′ transcript ends near palindromes have been attributed to posttranscriptional decay that stops at RNA hairpins (59, 61).

The untranslated RNA segment between repEA und repEB is unusually large for early T4 transcripts. It is intriguing to note that this untranslated RNA corresponds to a DNA segment encoding the lysozyme segment of the base plate protein gp5 (53). The amino acid sequence of this segment resembles that of the soluble T4 lysozyme gpe, suggesting that a copy of this or a related gene was inserted into an ancestor of the base plate gene 5 during evolution. Such an insertion would have increased the distance between the repEA und repEB genes on the complementary DNA strand (Fig. ​ (Fig.2 2 ).

RepEA und repEB mutants have different phenotypes.

The residual replication of the rep motA double mutants at late times after infection and the residual progeny production may be due to residual initiation of transcription from motA-dependent promoters (12, 22, 35), initiation from other origins (31, 67, 73), and/or, most likely, from recombinational intermediates. Recombinational intermediates can be formed in the absence of prior DNA replication, albeit with a much longer delay than when DNA replication is allowed (8, 14, 44).

However, the different phenotypes of the repEA motA und repEB motA double mutants at different growth temperatures (Fig. ​ (Fig.6) 6 ) require additional comments. One possible scenario to explain why the repEA1 mutant is more leaky at high temperatures than at low temperatures (Fig. ​ (Fig.6) 6 ) postulates a role for RepEA protein, predicted to be hydrophobic, in membrane attachment of T4 DNA. Such membrane association has been observed by many investigators in T4 (18, 19, 29, 30, 41, 43) and is well demonstrated in other organisms (38, 58). This association may be important but not essential (33), since membrane-free in vitro systems can synthesize DNA under optimal conditions with speed similar to that of in vivo systems (2, 32, 56, 57). Another, and possibly related, explanation for the leaky phenotype of the repEA1 mutant at 42ଌ (Fig. ​ (Fig.5B) 5 B) is that in this mutant T4 primase and/or topoisomerase activities are impaired, and that this deficiency is bypassed by a temperature-dependent recombinational mechanism (50, 52, 54) that requires, among others, T4 endonuclease VII. The T4 topoisomerase is one of several membrane-bound T4 proteins (29, 30).

Different replication origins of T4 have different sequences, different structures, and different requirements for functioning.

The functioning of RepE proteins, the presence of iterons, and the absence of a motA Voraussetzung für oriE distinguish this origin from oriA und oriF, suggesting that T4 origins use different initiation mechanisms, which may allow functioning under different conditions. Zum Beispiel, oriE is preferentially used when torsional stress in the replicating T4 DNA is reduced by mutations in T4 topoisomerase and host gyrase or by excessive damage due to 32 P decay or oxidation (reference 55 and unpublished observations). oriE is also preferred when T4 infects certain host mutants (nusD) altered in transcription termination factor Rho (67).

These differences, as well as comparisons with T4-related phages (44), support the hypothesis that the T4 genome was assembled during evolution from modular components from several sources (9) and that such processes can generate novel and redundant origins of DNA replication, redundant replication proteins, and complex overlapping transcription patterns (26, 44, 49, 51). The redundancies, in turn, can provide selective advantages under different developmental and environmental conditions because they facilitate coordination of essential viral processes and adjustments of DNA replication and gene expression to different growth conditions (44, 48). Moreover, timed transcription from complementary strands of the same DNA can help to adjust DNA replication and other DNA transactions to optimal growth and progeny production.

Such redundancies are bound to enhance the viability of any organism under different environmental or developmental conditions. The multiple T4 origins may serve as models for the complexities of multiple origins in metazoan chromosomes (16), which may differ in structure and function for reasons similar to those of T4.


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