Information

Was ist ein regulierbarer Promoter? Und wie regelt man das?

Was ist ein regulierbarer Promoter? Und wie regelt man das?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich lese ein Patent, in dem sie (im S. cerevisae YNP5-Stamm):

das ERG9-Gen herunterregulieren, indem der native ERG9-Promotor durch den regulierbaren MET3-Promotor ersetzt wird

Was ist ein regulierbarer Promoter und wie reguliert man ihn? Muss man der Brühe etwas hinzufügen, um den Ausdruck herunterzuregulieren?

Im Kulturmedium sehe ich nichts besonderes.


Regulierbarer Promotor bedeutet, dass die Expression des Gens stromabwärts dieses Promotors entweder induziert oder reprimiert werden kann. Met3 ist ein Beispiel für solche regulierbaren Promotoren und wird durch die Zugabe von Methionin zum Medium reguliert. In Hefe kodiert das Met3-Gen für ATP-Sulfurylase, ein Enzym im Methionin-Biosyntheseweg. Bei Zugabe von Methionin wird das vom Met3-Promotor gesteuerte Gen reprimiert, da sein Expressionsniveau umgekehrt mit der Konzentration von Methionin korreliert, das dem Medium zugesetzt wird (Abbildung aus diesem Artikel):


Was ist ein regulierbarer Promoter? Und wie regelt man das? - Biologie

In Bakterien und Archaeen werden Strukturproteine ​​mit verwandten Funktionen – wie die Gene, die die Enzyme kodieren, die die vielen Schritte in einem einzigen biochemischen Stoffwechselweg katalysieren – normalerweise zusammen innerhalb des Genoms in einem Block namens an . kodiert Operon und werden gemeinsam unter der Kontrolle einer einzigen Person transkribiert Promoter. Dies bildet ein polycistronisches Transkript (Abbildung 1). Der Promotor hat dann gleichzeitig die Kontrolle über die Regulation der Transkription dieser Strukturgene, da sie entweder alle gleichzeitig benötigt werden oder keine benötigt werden.

Abbildung 1. In Prokaryonten werden Strukturgene mit verwandter Funktion häufig gemeinsam im Genom organisiert und gemeinsam unter der Kontrolle eines einzigen Promotors transkribiert. Die regulatorische Region des Operons umfasst sowohl den Promotor als auch den Operator. Wenn ein Repressor an den Operator bindet, werden die Strukturgene nicht transkribiert. Alternativ können Aktivatoren an die regulatorische Region binden, wodurch die Transkription erhöht wird.

Französischer Wissenschaftler François Jakob (1920–2013) und Jacques Monod am Institut Pasteur waren die ersten, die die Organisation bakterieller Gene in Operons durch ihre Studien über die lac Operon von E coli. Sie fanden das in E coliliegen alle Strukturgene, die Enzyme codieren, die für die Nutzung von Laktose als Energiequelle benötigt werden, in der Laktose nebeneinander (oder lac) Operon unter der Kontrolle eines einzigen Promotors, dem lac Promoter. Für diese Arbeit erhielten sie 1965 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.

Obwohl eukaryotische Gene nicht in Operons organisiert sind, sind prokaryotische Operons ausgezeichnete Modelle, um allgemein über Genregulation zu lernen. Es gibt einige Gencluster in Eukaryoten, die ähnlich wie Operons funktionieren. Viele der Prinzipien können auf eukaryotische Systeme angewendet werden und tragen zu unserem Verständnis von Veränderungen der Genexpression in Eukaryoten bei, die zu pathologischen Veränderungen wie Krebs führen können.

Jedes Operon enthält DNA-Sequenzen, die seine eigene Transkription beeinflussen. Diese befinden sich in einer Region, die als regulatorische Region bezeichnet wird. Die regulatorische Region umfasst den Promotor und die den Promotor umgebende Region, zu der Transkriptionsfaktoren, Proteine, die von regulatorischen Genen kodiert werden, binden können. Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Bindung von RNA-Polymerase an den Promotor und ermöglichen dessen Fortschreiten, um Strukturgene zu transkribieren. EIN Unterdrücker ist ein Transkriptionsfaktor, der die Transkription eines Gens als Reaktion auf einen externen Stimulus unterdrückt, indem er an eine DNA-Sequenz innerhalb der regulatorischen Region namens bindet Operator, die sich zwischen der RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Promotors und der Transkriptionsstartstelle des ersten Strukturgens befindet. Die Repressorbindung blockiert physikalisch die RNA-Polymerase von der Transkription von Strukturgenen. Umgekehrt ein Aktivator ist ein Transkriptionsfaktor, der die Transkription eines Gens als Reaktion auf einen externen Stimulus erhöht, indem er die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor erleichtert. Ein Induktor, ein dritter Typ eines regulatorischen Moleküls, ist ein kleines Molekül, das die Transkription entweder aktiviert oder unterdrückt, indem es mit einem Repressor oder einem Aktivator interagiert.

In Prokaryonten gibt es Beispiele für Operons, deren Genprodukte ziemlich konsistent benötigt werden und deren Expression daher unreguliert ist. Solche Operons sind konstitutiv ausgedrückt, was bedeutet, dass sie kontinuierlich transkribiert und translatiert werden, um die Zelle mit konstanten Zwischenniveaus der Proteinprodukte zu versorgen. Solche Gene codieren Enzyme, die an Haushaltsfunktionen beteiligt sind, die für die Zellerhaltung erforderlich sind, einschließlich DNA-Replikation, -Reparatur und -Expression, sowie Enzyme, die am Kernstoffwechsel beteiligt sind. Im Gegensatz dazu gibt es andere prokaryontische Operons, die nur bei Bedarf exprimiert und durch Repressoren, Aktivatoren und Induktoren reguliert werden.


13.1: Regulation des GAL1-Promotors

  • Beigetragen von Clare M. O&rsquoConnor
  • Außerordentlicher Professor Emeritus (Biologie) am Boston College

In Hefe spielt die Glykolyse eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion, und Glukose ist bei weitem ihre bevorzugte Kohlenstoffquelle. Gene, die am Stoffwechsel anderer Kohlenstoffquellen beteiligt sind, werden normalerweise unterdrückt, wenn Glukose verfügbar ist. Wenn Glukose jedoch nicht verfügbar ist, aktiviert Hefe Gene, die andere verfügbare Energiequellen wie Galaktose verstoffwechseln. Galactose erhöht die Transkription mehrerer Gene für Enzyme, die Galactose in Zellen transportieren und schließlich in Glucose-6-Phosphat (G6P), einem Zwischenprodukt der Glykolyse, umwandeln. Das erste Gen in dem durch Galaktose induzierten Stoffwechselweg, GAL1, kodiert für Galaktokinase, die Galaktose zu Galaktose-1-Phosphat phosphoryliert. (Besuche die GAL1 Pfade Link in SGD.) Die GAL1 Der Promotor wurde sowohl in das pBG1805- als auch das pYES2.1-Plasmid stromaufwärts der ORF-Stelle eingebaut und kontrolliert daher die Transkription von Plasmid-kodierten MET/Met und lacZ Gene in transformierten Zellen.

Die Abbildung auf der gegenüberliegenden Seite gibt einen einfachen Überblick über die Genexpression aus demGAL1 Promotor in Gegenwart von Glucose, Raffinose und Galactose. Der Promotor enthält sowohl negative als auch positive regulatorische Stellen, die in seiner DNA-Sequenz kodiert sind. In Gegenwart von Glucose binden Repressorproteine ​​an die negativen regulatorischen Stellen und unterdrücken die Transkription. Der Gal4p-Transkriptionsaktivator bindet an positive regulatorische Stellen. Gal4p ist ein Transkriptionsfaktor, der als Dimer an DNA bindet. (Die Abbildung am Anfang dieses Kapitels zeigt die Kristallstruktur der DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomänen von Gal4p im Komplex mit DNA.) In Gegenwart von Glucose ist Gal4p inaktiv, da es an das Repressorprotein Gal80p gebunden ist.

Die Glucoserepression kann durch das Züchten von Zellen in einer schlechten Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Raffinose, gelindert werden. Raffinose ist ein Trisaccharid aus Galactose, Fructose und Glucose. Raffinose ist nicht in der Lage, hohe Konzentrationen von . zu induzieren GAL1 Expression, die Galaktose erfordert. In Gegenwart von Galactose, Expression des GAL1 Gen erhöht

1000-fach über dem in Gegenwart von Glucose beobachteten Spiegel. Diese Stimulation ist in erster Linie auf die Aktivität von Gal4p zurückzuführen, das nicht mehr an das inhibitorische Gal80p-Protein gebunden ist. Gal4p fungiert als Hauptregulator des Galactose-Stoffwechsels. Neben der Aktivierung GAL1 Transkription bindet Gal4p auch an die Promotoren der GAL7 und GAL10 Gene, die neben dem GAL1 Gen auf dem Hefechromosom 2. Like GAL1, das GAL7 und GAL10 Gene kodieren Proteine, die am Galactose-Stoffwechsel beteiligt sind.

Regulierung der GAL1Promoter. In Gegenwart von Glucose wird die Transkription unterdrückt, da Repressorproteine ​​an regulatorische Stellen binden
in der DNA und zum Gal4p-Transkriptionsaktivator. Die Glucoserepression wird in Gegenwart von Raffinose gelindert, Gal4p bleibt jedoch inaktiv.
Gal4p aktiviert die Transkription in Gegenwart von Galactose aufgrund der Entfernung des Gal80p-Proteins.


Expression mit dem T7-RNA-Polymerase/Promotor-System

Diese Einheit beschreibt die Expression von Genen, indem sie sie unter die Kontrolle der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase stellt. Die T7-RNA-Polymerase ist ein sehr aktives Enzym: Sie synthetisiert RNA mit einer Geschwindigkeit, die um ein Vielfaches höher ist als die von E. coli-RNA-Polymerase, und sie beendet die Transkription weniger häufig . Die T7-RNA-Polymerase ist auch für die Initiation an ihren eigenen Promotorsequenzen hochselektiv und resistent gegen Antibiotika wie Rifampicin, die die E. coli-RNA-Polymerase hemmen. Folglich führt die Zugabe von Rifampicin zu Zellen, die T7-RNA-Polymerase produzieren, zur ausschließlichen Expression von Genen unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerase-Promotors (p(T7)). Im Basisprotokoll werden zwei Plasmide in derselben E. coli-Zelle gehalten. Einer (der Expressionsvektor) enthält p(T7) stromaufwärts des zu exprimierenden Gens. Die zweite enthält das T7-RNA-Polymerase-Gen unter der Kontrolle eines hitzeinduzierbaren E. coli-Promotors. Bei Hitzeinduktion wird die T7-RNA-Polymerase produziert und initiiert die Transkription auf dem Expressionsvektor, was wiederum zur Expression des Gens bzw. der Gene unter der Kontrolle von p(T7) führt. Falls gewünscht, können die Genprodukte eindeutig markiert werden, indem das Verfahren in Minimalmedium durchgeführt wird, Rifampicin zugegeben wird, um die E. coli-RNA-Polymerase zu hemmen, und dann die Proteine ​​mit [35S]Methionin markiert werden.


Verweise

Graue WM: Hormonelle Regulierung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung. PLoS Biol. 2004, 2: E311-10.1371/journal.pbio.0020311.

Lumba S, Tsuchiro T, Delmas F, Hezky J, Provart N, Lu QSM, McCourt P, Gazzarrini S: Das embryonale Blattidentitätsgen FUSCA3 reguliert vegetative Phasenübergänge, indem es die ethylenregulierte Genexpression in Arabidopsis negativ moduliert. BMC Biol. 2012, 10: 8-10.1186/1741-7007-10-8.

Gazzarrini S, Tsuchiya Y, Lumba S, Okamoto M, McCourt P: Der Transkriptionsfaktor FUSCA3 steuert das Entwicklungstiming bei Arabidopsis durch die Hormone Gibberellin und Abscisinsäure. Entwicklerzelle. 2004, 7: 373-385. 10.1016/j.devcel.2004.06.017.

Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME: Ethylen in der Pflanzenbiologie. 1992, San Diego: Akademische Presse, 2

Chen YF, Etheridge N, Schaller GE: Ethylen-Signaltransduktion. Ann Bot (London). 2005, 95: 901-915. 10.1093/aob/mci100.

Zhu Z, An F, Feng Y, Li P, Xue L, AM, Jiang Z, Kim JM, An TK, Li W, Zhang X, Yu Q, Dong Z, Chen WQ, Seki M, Zhou JM, Guo H: Derepression von Ethylen-stabilisierten Transkriptionsfaktoren (EIN3/EIL1) vermittelt Jasmonat- und Ethylen-Signalsynergie bei Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108: 12539-12544. 10.1073/pnas.1103959108.

Lingam S, Mohrbacher J, Brumbarova T, Potuschak T, Fink-Straube C, Blondet E, Genschik P, Bauer P: Interaktion zwischen dem bHLH-Transkriptionsfaktor FIT und ETHYLENE INSENSITIVE3/ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 zeigt molekularen Zusammenhang zwischen der Regulation des Eisenerwerbs und Ethylensignalisierung in Arabidopsis. Pflanzenzelle. 2011, 23: 1815-1829. 10.1105/tSt.111.084715.

Zhong S, Zhao M, Shi T, Shi H, An F, Zhao Q, Guo H: EIN3/EIL1 kooperieren mit PIF1, um Photooxidation zu verhindern und das Ergrünen von Arabidopsis-Sämlingen zu fördern. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 21431-21436. 10.1073/pnas.0907670106.

Chen MK, Hsu WH, Lee PF, Thiruvengadam M, Chen HI, Yang CH: Das MADS-Box-Gen, FOREVER YOUNG FLOWER, wirkt als Repressor, der die Alterung und Abszission von Blütenorganen bei Arabidopsis kontrolliert. Plant J. 2011, 68: 168-185. 10.1111/j.1365-313X.2011.04677.x.

Chuck G, Hake S: Regulierung von Entwicklungsübergängen. Curr Opin Plant Biol. 2005, 8: 67-70. 10.1016/j.pbi.2004.11.002.


Was ist Promoter?

Der Promotor ist eines der wichtigsten regulatorischen Elemente des Gens, das die Transkription initiiert. Es befindet sich in der Nähe des Gens, stromaufwärts der Codonsequenz. Die Größe des Promotors kann 100-1000 bp betragen. Die spezifischen DNA-Sequenzen, die als Response-Elemente bezeichnet werden, stellen anfängliche Bindungsstellen sowohl für die RNA-Polymerase als auch für Transkriptionsfaktoren bereit, die die RNA-Polymerase rekrutieren. RNA-Polymerase ist das für die Transkription verantwortliche Enzym, das komplementäre RNA-Nukleotide polymerisiert, um ein mRNA-Molekül zu synthetisieren.

Abbildung 2: Promoter

Bakterielle RNA-Polymerase, die mit Sigmafaktor assoziiert ist, kann an den Promotor binden. Der Sigma-Faktor ist ein bakterieller Transkriptionsinitiationsfaktor. In Eukaryoten müssen etwa 7 verschiedene basale Transkriptionsfaktoren an den Promotor gebunden werden, um RNA-Polymerase zu rekrutieren.


Beziehung zwischen Promotorsequenz und ihrer Stärke in der Genexpression

Die Promotorstärke oder -aktivität ist in der Gentechnik und der synthetischen Biologie wichtig. Ein konstitutiver Promotor mit einer bestimmten Stärke für eine bestimmte RNA kann oft für andere RNAs wiederverwendet werden. Daher wird die Stärke eines Promotors hauptsächlich durch seine Nukleotidsequenz bestimmt. Eine der Hauptschwierigkeiten in der Gentechnik und der synthetischen Biologie besteht darin, die Expression eines bestimmten Proteins auf einem bestimmten Niveau zu kontrollieren. Ein üblicherweise verwendeter Weg, um dieses Ziel zu erreichen, besteht darin, einen Promotor mit einer geeigneten Stärke auszuwählen, der verwendet werden kann, um die Transkriptionsrate zu regulieren, die dann zu der erforderlichen Proteinexpression führt. Zu diesem Zweck wurden bisher viele Promotorbibliotheken experimentell aufgebaut. Theoretische Verfahren zur Vorhersage der Stärke eines Promotors aus seiner Nukleotidsequenz sind jedoch wünschenswert. Solche Verfahren sind nicht nur für das Design eines Promotors mit spezifizierter Stärke wertvoll, sondern auch sinnvoll, um den Mechanismus des Promotors bei der Gentranskription zu verstehen. In dieser Studie wird durch verschiedene Tests ein theoretisches Modell vorgestellt, um die Beziehung zwischen Promotorstärke und Nukleotidsequenz zu beschreiben. Unsere Analyse zeigt, dass die Promotorstärke stark von Nukleotidgruppen mit drei benachbarten Nukleotiden in ihren Sequenzen beeinflusst wird. Inzwischen haben Nukleotide in verschiedenen Regionen der Promotorsequenz unterschiedliche Wirkungen auf die Promotorstärke. Basierend auf experimentellen Daten für E coli Promotoren zeigen unsere Berechnungen, dass Nukleotide in der –10-Region, der –35-Region und der Diskriminatorregion einer Promotorsequenz für die Bestimmung der Promotorstärke wichtiger sind als diejenigen in der Abstandsregion. Mit Modellparameterwerten, die durch Anpassen an experimentelle Daten erhalten wurden, werden theoretisch vier Promotorbibliotheken für die entsprechenden experimentellen Umgebungen erstellt, unter denen zuvor Daten für die Promotorstärke in der Genexpression gemessen wurden.

Grafische Zusammenfassung

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Ergebnisse

Bedingte Erschöpfung von Lhx8 von Gdf9Cre verursacht eine massive Aktivierung des Primordialfollikels

Wir haben zuvor berichtet, dass der globale Knockout von Lhx8 führt zu Unfruchtbarkeit und Eizellenverlust am 7. postnatalen Tag (PD7) [14]. Im weltweiten Knockout von Lhx8, bilden sich primordialähnliche Follikel (Oozyten mit einem Durchmesser von weniger als 20 µm und umgeben von flachen Granulosazellen), aber Oozyten wachsen nicht. Schon seit Lhx8 sowohl in embryonalen als auch postnatalen weiblichen Keimzellen exprimiert wird, ist es möglich, dass ein globaler Knockout von Lhx8 stört die frühen embryonalen Bahnen, die zu einer postnatalen Oozytendepletion führen. Wir untersuchten daher die postnatalen Funktionen von Lhx8 durch Generieren einer bedingten Knockout-Maus mit einem floxed Lhx8 Allel (Lhx8 flx/flx ) [15] und a Gdf9Cre transgene Maus [16]. Die Gdf9Cre Transgen wird inaktiviert Lhx8 speziell in primordialen Oozyten. Gdf9Cre ist in Eizellen hocheffizient und, wenn in beiden vorhanden Lhx8 flx/flx oder Lhx8 flx/- Tiere, zeigten den gleichen ovariellen Phänotyp. Wir verwendeten Lhx8 flx/flx Gdf9Cre die Auswirkungen von Lhx8 Bedingter Mangel an Primordialfollikeln auf die Entwicklung der Eierstöcke.

Bei PD7 und PD14 war das LHX8-Protein in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre In den Primordialfollikeln kam es zu einer massiven Oozytenaktivierung, die sich darin manifestierte, dass Oozyten einen Durchmesser von mehr als 20 µm erreichten, ohne dass sich die umgebenden flachen Granulosazellen signifikant veränderten (Abb. 1a–f). Bei PD7, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse hatten 398 ± 53 aktivierte Primordialfollikel pro Ovar im Vergleich zu 16 ± 2 pro Ovar in Lhx8 flx/flx kontrolliert. Die Anzahl der Primordialfollikel betrug 1917 ± 23 pro Ovar in Lhx8 flx/flx Kontrollen und wurde signifikant auf 1043 ± 119 pro Ovar in . reduziert Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse (Abb. 1c). Wir haben einen Rückgang der Primärfollikel in festgestellt Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse, was auf eine Blockade des Übergangs von aktivierten Primordialfollikeln zu Primärfollikeln hindeutet. Es gab eine vernachlässigbare Anzahl fortgeschrittener Follikeltypen (Oozyten, umgeben von mehreren Schichten von Granulosazellen) bei PD7 Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstöcke, im Vergleich zu den Lhx8 flx/flx kontrolliert.

Postnatale Inaktivierung von Lhx8 verursacht eine vorzeitige Aktivierung der Primordialfollikel und Ovarialversagen. ein und B Anti-LHX8-Antikörper wurden verwendet, um Oozyten in Paraformaldehyd-fixierten und Hämatoxylin-gegengefärbten Ovarien nachzuweisen, die am 7. postnatalen Tag (PD7) entnommen wurden. Eierstöcke wurden aus der Kontrolle (Lhx8 flx/flx , A) und Lhx8 bedingter Knockout (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, B) Mäuse. Pfeilspitzen in dem Einsatz von Tafel A zeigen primordiale Follikel an, die sich mit Anti-LHX8-Antikörpern anfärben (braunes Signal). Pfeilspitzen in dem Einsatz in Tafel B zeigen aktivierte Primordialfollikel (Oozyten größer als 20 µm ohne quaderförmige Granulosazellen). D, e, g und h Periodsäure-Schiff (PAS)-Färbung von PD14 (D und E) und PD21 (G und H) Ovarien, abgeleitet von Kontrollen (D und G) und Lhx8 bedingte Knockout-Mäuse (E und H). Pfeilspitzen in dem Einsatz der Felder D und E zeigen primordial aktivierte primordiale Follikel an. C, F und ich Quantifizierung von Ovarialfollikeltypen in Lhx8 flx/flx und Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse. Fünf Ovarienpaare von PD7 (C), PD14 (F) und PD21 (I) wurden in Paraffin eingebettet und seriell auf 5 µm Dicke geschnitten und die Follikel gezählt. Anti-NOBOX-Antikörper färben Oozytenkerne während der Follikulogenese und wurden verwendet, um Oozyten in unseren Zählungen zu identifizieren. Jeder fünfte Abschnitt wurde gezählt. Wir bewerteten Primordialfollikel (PF), aktivierte Primordialfollikel (Act. PF, Oozytendurchmesser größer als 20 μm ohne quaderförmige Granulosazellen), primäre Follikel (PrF) und sekundäre/antrale Follikel (SF/AF). *P < 0,05, **P < 0,01. Maßstabsbalken: 100 μm (A, B, D, E, G und H) 20 μm (Einsatz in A, B, D und E)

Bei PD14, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Ovarien enthielten 847 ± 82 aktivierte Primordialfollikel pro Ovar, verglichen mit 15 ± 7 pro Ovar in Lhx8 flx/flx kontrolliert. Die Anzahl der Primordialfollikel nahm von 1753 ± 204 Zoll signifikant ab Lhx8 flx/flx steuert bis 353 ± 58 in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstöcke (Abb. 1f). Bis PD21 war die Gesamtzahl der Follikel von primordial bis sekundär in der stark reduziert Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstock (Abb. 1g-i). Bis PD35 wurden kaum noch Eizellen und Follikel im Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstock (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1C) und Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Weibchen waren steril (siehe Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2A). Unsere Studien zeigen, dass die postnatale Inaktivierung von Lhx8 innerhalb von Oozyten von Primordialfollikeln führt zu einer massiven Oozytenaktivierung, Entkopplung der Oozytenaktivierung von der somatischen Zelltransformation, Oozytentod und Unfruchtbarkeit.

LHX8 interagiert mit dem PI3K-AKT-Signalweg

Wir untersuchten die RNA-Expression von Genen, die wichtige Mitglieder der PI3K-AKT-mTOR-Signalwege in PD7 . kodieren Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eizellen. Die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigte keine signifikanten Veränderungen in der Expression von Pten, Akt, Foxo3, Pdk1, Mtor, Rps6, Abnehmer, Riktor, oder Tsc1/2 (einige davon sind in Abb. 2 dargestellt). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass LHX8 die Transkription einer Untergruppe von Genen, von denen bekannt ist, dass sie Proteine ​​in den PI3K-AKT-mTOR-Signalwegen kodieren, nicht direkt beeinflusst. Dann beurteilten wir, ob der PI3K-AKT-Signalweg auf Proteinebene in . aktiviert wurde Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eizellen. AKT ist eine Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase, die eine Schlüsselrolle bei Apoptose und PFA spielt. Phosphoryliertes AKT aktiviert mehrere nachgeschaltete Stoffwechselwege, einschließlich der FOXO3-Phosphorylierung, was zu einer Aktivierung der Eizelle führt [8]. Western-Blot-Analysen an Oozyten von PD7-Ovarien zeigten, dass die Phosphorylierung von AKT an zwei Stellen, S473 und T308, höher war in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Oozyten als bei Kontrollen (Abb. 2h). Interessanterweise wurde jedoch nur p-AKT (T308) in den aktivierten Primordialfollikeln nachgewiesen (siehe Zusatzdatei 3: Abbildung S3).

AKT wird aktiviert in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eizellen. eing Eizellen wurden aus der PD7-Kontrolle isoliert (Lhx8 flx/flx , Strg) und Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) Maus-Ovarien und RNA wurden für die cDNA-Konvertierung und die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) extrahiert. Daten wurden normalisiert auf Gapdh Ausdruck und werden als mittlere relative Größe (im Vergleich zur Kontrolle) angegeben, wobei Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwertes darstellen. Studenten T-Test wurde verwendet, um zu berechnen P Werte. Der einzige signifikante Unterschied wurde in der Expression von festgestellt Lhx8, wie erwartet. ** P < 0,01. h Oozyten wurden aus der PD7-Kontrolle isoliert und Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstöcken wurde Protein extrahiert und ein Western-Blot-Test wurde an drei unabhängigen Proben durchgeführt, wobei Antikörper gegen AKT und seine beiden phosphorylierten Formen (S473 und T308) verwendet wurden. Als Kontrolle wurde Histon H3-Immunreaktivität verwendet

Frühere Studien haben gezeigt, dass die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation und die rpS6-Phosphorylierung über die PI3K-AKT-mTOR-Wege mit PFA assoziiert sind [5, 6, 8]. Wir untersuchten die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation und die rpS6-Phosphorylierung in PD7 Pten und Lhx8 bedingte Knockouts (Abb. 3 und Zusatzdatei 4: Abbildung S4). Die nukleozytoplasmatische Translokation von FOXO3 war in Oozyten mit einer Größe von mehr als 30 μm auffällig, zeigte jedoch keine offensichtliche Translokation zwischen Oozyten zwischen 20 und 30 μm in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse (Abb. 3d–f, f', p). Eizellen von Primordialfollikeln in Pten und Lhx8 bedingte einzelne Knockouts sowie entsprechende Kontrollen zeigten keine nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation. Die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation wurde jedoch in den primordialen (<20 μm) Oozyten (Abb. 3j–1, l’, p) des PD7-Doppels signifikant induziert Lhx8/Pten bedingte Knockouts (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre). Diese Daten weisen auf eine synergistische Wirkung der LHX8- und PTEN-Proteine ​​auf die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation hin.

Lhx8 und Pten bedingte Knockout-Effekte auf die FOXO3-Lokalisierung. einC Bei Kontrollmäusen (Lhx8 flx/flx ) wird FOXO3 im Kern und im Zytoplasma von primordialen Oozyten (PF, Pfeile in C'). DF In Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäusen wird die ausgedehnte nukleozytoplasmatische Translokation in aktivierten Primordialfollikeln zwischen 20 und 30 µm nicht beobachtet (aPF, Pfeil in F'), wird aber in aktivierten Primordialfollikeln beobachtet, die größer als 30 µm sind (aPF, Pfeil in F'). Dich Ein ähnliches Expressionsmuster der FOXO3-Lokalisierung existiert in Pten bedingter Knockout (Pten flx/flx Gdf9Cre) Mäuse. Die Pfeile in ich' repräsentieren Primordialfollikel (PF) mit sowohl nuklearer als auch Zytoplasma-Expression von FOXO3 und Zytoplasma-Expression von FOXO3 in aktivierten Primordialfollikeln (aPF) unter 30 µm. Jl Bei Mäusen, denen beides jedoch bedingt mangelhaft ist Lhx8 und Pten (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre), ist die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation in primordialen, aktivierten und primären Oozyten vorhanden. Die Negativkontrolle ist Immunfluoreszenz in Gegenwart von sekundären Antikörpern und wird in gezeigt mÖ. Die eingerahmte Bereiche in C, F, I, L und O sind in C', F', I', L' und O' vergrößert dargestellt. P Grafische Darstellung der FOXO3-Verteilung (nur Zytoplasma oder Kern und Zytoplasma). Die Eizellen wurden nach Größe (Durchmesser) in Gruppen von weniger als 20 µm, zwischen 20 und 30 µm und mehr als 30 µm eingeteilt. Es wurden nur Eizellen mit klarer DAPI-Kernfärbung gezählt. Maßstabsbalken: 50 μm (A–C, D–F, G–I, J–L und M–O) 20 μm (C', F', I', L' und O')

Wir haben auch die Auswirkungen von Doppel Pten und Lhx8 Mangel an rpS6. mTORC1 fördert die Proteintranslation und das Zellwachstum, teilweise durch Aktivierung von S6K1 (durch Phosphorylierung seines Threonins 389) und durch Phosphorylierung und Inaktivierung von eIF4E-bindenden Proteinen. S6K1 ist für die Phosphorylierung und Aktivierung von rpS6 verantwortlich, was zu einer verbesserten Proteintranslation und Ribosomenbiogenese führt. Unter Kontrolle, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, und Pten flx/flx Gdf9Cre Eierstöcken wurde rpS6 nur in wachsenden Follikeln bei PD7 signifikant aktiviert (siehe Zusatzdatei 4: Abbildung S4). Allerdings ist die PD7 Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre Ovarien zeigten eine signifikante Aktivierung von rpS6 in primordialen (<20 μm) Oozyten (siehe Zusätzliche Datei 4: Abbildung S4D, D'). Diese Ergebnisse weisen weiter darauf hin, dass die Lhx8 und Pten Stoffwechselwege interagieren synergistisch, um zwei mit PFA assoziierte Ereignisse zu beschleunigen – die nukleozytoplasmatische FOXO3-Translokation und die Phosphorylierung von rpS6.

Lin28a RNA- und Proteinexpression werden in Lhx8flx/flxGdf9Cre-Oozyten hochreguliert

LHX8 ist ein Transkriptionsfaktor, und wir erwarten, dass seine Hauptwirkung auf der RNA-Ebene liegt. Wir analysierten daher das Transkriptom von Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstöcke über Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-seq). Wir haben 180 Millionen Tags in jeder Probe sequenziert und die relative Häufigkeit von RNA-Tags verglichen, die von Genen in den von PD7 . abgeleiteten PI3K-AKT-mTOR-Signalwegen kodiert werden Lhx8 flx/flx Gdf9Cre und Eierstöcke kontrollieren. Keine signifikanten Unterschiede in der RNA-Expression von PI3K-AKT-mTOR-Signalweg-Genen (Pik3r1, Pik3ca, Bausatz, Kitl, Gsk3b, Cdnd1, Wee1, Cdkn1a/B, Rhebe, Mlst8, Mapkap1, Prr5, und Eif4ebp1) waren im RNA-seq-Experiment ersichtlich (siehe Zusatzdatei 5: Tabelle S1).

Neben der Analyse der Expression bekannter PI3K-AKT-mTOR-Gene untersuchten wir globale Unterschiede im Transkriptom von Lhx8 flx/flx Gdf9Cre und Eierstöcke kontrollieren. Wir haben eine Versechsfachung von . festgestellt Lin28a RNA-Transkripte in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre im Vergleich zu Kontrollovarien (Abb. 4b und Zusatzdatei 5: Tabelle S1). Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analyse mit Anti-LIN28A-Antikörpern zeigten, dass das LIN28A-Protein in einem signifikant höheren Ausmaß exprimiert wurde Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Oozyten im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 4a, c).

Lhx8 unterdrückt Lin28a Ausdruck. ein Immunfluoreszenz mit Anti-LIN28A-Antikörpern zeigt, dass LIN28A bevorzugt in Eizellen innerhalb des Ovars exprimiert wird. Die Häufigkeit von LIN28A ist höher in Lhx8 bedingt defiziente Eizellen (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre) im Vergleich zu Kontrollen (Lhx8 flx/flx ). B und C Lin28a Transkripte und Protein werden signifikant stärker exprimiert in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eizellen (G9cKO) im Gegensatz zu Kontrollen (Strg). einF Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Assays mit Anti-LHX8-Affinitäts-gereinigten Antikörpern auf Oozyten. D Eine mutmaßliche LHX8-DNA-Bindungsstelle, TGATTG [22], die perfekt zur LHX8-Bindungskonsensussequenz passt, wurde an Position −536 bis −531 relativ Lin28a Transkriptionsinitiationsstelle. e Anti-LHX8-Antikörper präzipitieren genomische DNA, die die TGATTG-Bindungssequenz aus dem Lin28a Promotorregion, wie durch ChIP-quantitative PCR (qPCR) gezeigt. Als Kontrolle dienten Immunglobulin G (IgG) Antikörper. Die prozentuale Eingabemethode wird verwendet, um die qPCR-Daten zu analysieren. „Input“ ist das PCR-Produkt aus Chromatin-Pellets vor der Immunpräzipitation. Ein dreifacher Durchschnitt Ct für die Berechnung des prozentualen Inputs wurde normalisiert auf einen angepassten Input verwendet. Zwei Sätze von Primern (F1 und R1) und (F2 und R2) wurden verwendet, um ChIP-qPCR durchzuführen. F PCR-Amplifikation der Eizellen-Input-DNA sowie DNA, die durch normales Meerschweinchen-IgG und Anti-LHX8-Antikörper durch die F1/R1- und F2/R2-Primersätze präzipitiert wird. Maßstabsbalken: 50 μm (A)

LIN28A ist ein RNA-bindendes Protein, das die Biogenese von Lassen-7 microRNAs und ein bekannter Regulator der Körpergröße und des Stoffwechsels von Säugetieren, einschließlich des Beginns der Menarche [17, 18]. Lin28a wird bevorzugt in Eizellen und embryonalen Stammzellen exprimiert [19, 20]. Darüber hinaus können die PI3K-AKT-mTOR-Pfade durch LIN28A aktiviert werden [21]. LIN28A könnte daher eine Rolle bei der Aktivierung und dem Wachstum von Eizellen spielen.

LHX8 kann direkt an das LHX8-DNA-Bindungsmotiv im binden Lin28a Promoter

Wir haben getestet, ob LHX8 an die . binden kann Lin28a Promoter. LHX8 ist ein eizellenspezifischer Transkriptionsregulator der LIM-Homöodomäne, von dem vorhergesagt wird, dass er DNA bindet. Eine frühere Studie zeigte, dass die LHX8-Homöodomäne bevorzugt ein TGATTG-DNA-Motiv bindet [22]. Wir identifizierten ein einzelnes TGATTG-DNA-Motiv −531 bis −536 bp stromaufwärts der mutmaßlichen Transkriptionsinitiationsstelle im Lin28a Gen (Fig. 4d). Die Lin28a Das TGATTG-Motiv ist in anderen Säugetieren, einschließlich Menschen, konserviert. Wir führten ein Chromatin-Immunpräzipitations-(ChIP)-Experiment an Wildtyp-Oozyten durch, wobei wir unsere hochspezifischen und affinitätsgereinigten Anti-LHX8-Antikörper verwendeten [13]. Anti-LHX8-Antikörper immunpräzipitierten bevorzugt die Lin28a Promotor-DNA-Fragment, das das TGATTG-Motiv enthält (Fig. 4e, f). Diese Daten deuten ferner darauf hin, dass LHX8 Lin28a Ausdruck durch direkte Bindung an die Lin28a Promoter.

Lin28a Mangel rettet teilweise die Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Phänotyp

Unsere Daten zeigen, dass LHX8 unterdrückt Lin28a Ausdruck. Da LIN28A ein wachstumsfördernder Faktor ist [17, 23], der bevorzugt in Eizellen exprimiert wird, nahmen wir an, dass Lin28a Mangel wird retten Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-induzierte PFA. Wir haben gezüchtet Lin28a und Lhx8 gefloxte Mäuse mit Gdf9Cre generieren Lhx8/Lin28a doppelte bedingte Knockouts (Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre).

Wir führten morphometrische Ovarialanalysen durch, um die Auswirkungen des doppelten Knockouts auf PFA zu bestimmen. Es wurde kein morphometrischer Unterschied beobachtet zwischen Lin28a flx/flx Gdf9Cre und Kontrollweibchen bei PD7 (Fig. 5a, c, e). Erwartungsgemäß beobachteten wir signifikant weniger aktivierte Primordialfollikel in Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre im Vergleich zu Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Ovarien, aber sie waren im Vergleich zur Kontrolle nicht ganz normal (Abb. 5a, b, d, f).

Lin28a Mangel rettet Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-induzierte PFA. einD Repräsentative Histologie der Kontrolle (Lhx8 flx/flx ), Lhx8 bedingter Knockout (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre), Lin28a bedingter Knockout (Lin28 flx/flx Gdf9Cre) und doppelt Lhx8/Lin28a bedingter Knockout (Lhx8 flx/flx Lin28 flx/flx Gdf9Cre) Eierstöcke. Doppelt Lhx8/Lin28a bedingte Knockouts zeigen eine verminderte Anzahl aktivierter Primordialfollikel. Anti-Nobox-Antikörper wurden verwendet, um Eizellenkerne (dunkelbraun) zu markieren. PF: Urfollikel aPF: aktivierter Urfollikel. e Die Lin28 flx/flx Gdf9Cre (Lin28G9cKO)-Mäuse haben einen ähnlichen Phänotyp wie Kontroll-(Ctrl)-Mäuse und die Primordialfollikelzahl wird als Prozentsatz der Gesamtfollikel ausgedrückt. F Quantifizierung aktivierter Primordialfollikel in der Kontrolle, Lhx8 bedingt und doppelt Lhx8/Lin28a bedingte Knockouts. Der Prozentsatz der Primordialfollikel (PF) und der aktivierten Primordialfollikel (aPF) wird angezeigt. Drei Paar Eierstöcke aus Lhx8 bedingter Knockout und Double Lhx8/Lin28a bedingte Knockout-Mäuse wurden seriell geschnitten, und jeder fünfte Schnitt wurde gezählt. g Die AKT-Phosphorylierung ist doppelt vermindert Lhx8/Lin28a bedingte Knockouts. Wir quantifizierten durch Fluoreszenz-p-AKT (T308)-Expression in den primordialen und aktivierten primordialen Follikeln der Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) und Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre (G9dKO) Eierstöcke bei PD7. Es gab eine signifikante Abnahme der AKT-Phosphorylierung in Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre primordiale und aktivierte primordiale Follikel im Vergleich zu Lhx8 flx/flx Gdf9Cre. Studenten T-Test wurde verwendet, um zu berechnen P Werte. *P < 0,05, **P < 0,01. Maßstabsbalken: 50 μm (A–D)

Die teilweise Rettung von Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-induzierte PFA durch Lin28a Mangel spricht dafür, dass Lin28a ist ein Regulator des Eizellwachstums. Die verminderte Anzahl aktivierter Primordialfollikel in Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre Eierstöcke legen nahe, dass die Aktivierung des AKT-Signalwegs ebenfalls vermindert ist. Wir untersuchten das p-AKT (T308)-Signal in primordialen und aktivierten primordialen Follikeln von Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre und Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Eierstöcken (Abb. 5g) und stellte fest, dass seine Expression in der signifikant reduziert war Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre Eierstock im Vergleich zu den Eierstöcken von Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse.

Lhx8 reguliert den Übergang vom primären zum sekundären Follikel

Frühere Studien haben gezeigt, dass PTEN-regulierte Signalwege bei der primordialen Oozytenaktivierung wichtig sind, jedoch nicht in primären Oozyten [24]. Wir haben die Rolle von . studiert Lhx8 in primären Eizellen durch Generieren Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäuse. Zp3Cre wird spezifisch in primären Eizellen exprimiert, und Lhx8 flx/flx Zp3Cre Eierstöcke exprimieren weiterhin LHX8 in primordialen, aber nicht primären Oozyten. Morphometrische Analysen ergaben, dass die Lhx8 flx/flx Zp3Cre bedingte Knockout-Ovarien unterschieden sich nicht signifikant von Lhx8 flx/flx (Kontroll-)Mäuse bei PD0 und PD7 (Abb. 6a–f). Bei PD14 zählten wir jedoch 159 ± 23 primäre Follikel und 29 ± 7 sekundäre/antrale Follikel pro Ovar in der Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäuse, verglichen mit 79 ± 6 primären Follikeln und 108 ± 7 sekundären/antralen Follikeln pro Ovar bei den Kontrollmäusen (Abb. 6g–i). Die relative Zunahme der Primärfollikel bei PD14 und die relative Abnahme der mehrschichtigen Follikel im Lhx8 flx/flx Zp3Cre Eierstock zeigte, dass der Übergang von Primärfollikeln zu Sekundärfollikeln blockiert war, was mit der Beobachtung in übereinstimmt Lhx8 flx/flx Gdf9Cre Mäuse (Abb. 1f). Bei PD21 und PD30 beobachteten wir, dass viele primäre Follikel keine Eizellen enthielten (Abb. 6k, n). Wir färbten auf LIN28A in PD21-Ovarien und stellten fest, dass LIN28A stark in Lhx8 mangelhafte Eizellen der Lhx8 flx/flx Zp3Cre Eierstock, aber in den leeren Follikeln wurde keine Expression nachgewiesen (siehe Zusatzdatei 6: Abbildung S5). Ohne diese leeren Primärfollikel ist jedoch die Anzahl der Primärfollikel zwischen Kontrolle und Lhx8 flx/flx Zp3Cre Ovarien war bei PD21 oder PD30 nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 6l, o). Bei den sekundären/antralen Follikeln sank die Zahl stark auf 17 ± 3 bei PD21 und auf 2 ± 1 bei PD30 in Lhx8 flx/flx Zp3Cre Ovarien, verglichen mit 170 ± 2 bzw. 104 ± 4 bei Kontrollmäusen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der wachsende Follikelpool weiterhin aus dem Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäuse. Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäuse waren unfruchtbar (siehe Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2A) und Superovulationsbehandlung von Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäuse produzierten keine Eizellen (siehe Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2B). Dieses Ergebnis stand im Einklang mit dem starken Abfall der sekundären/antralen Follikel im Lhx8 flx/flx Zp3Cre Eierstock bei PD21. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Follikulogenese von Lhx8 flx/flx Zp3Cre Mäusen ist der Übergang vom primären zum sekundären Follikelstadium blockiert und führt zu primärem Eizelltod und Unfruchtbarkeit. The relative stability of the primordial follicle pool from PD14 to PD30 suggests that the PFA into primary follicles was not affected by the diminution in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries.

Lhx8 inactivation in primary follicles (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) abolishes follicle growth. Histomorphological analysis was done on control (Lhx8 flx/flx ) und Lhx8 deficient ovaries (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) at various stages of postnatal ovarian development ranging from newborn (PD0) to postnatal day 30 (PD30). einF Periodic acid–Schiff (PAS) staining and counting of different follicle types in the newborn and PD7 ovaries showed no significant differences between control and Lhx8 deficient ovaries. gÖ Anti-NOBOX antibodies were used to stain oocytes (brown immunoreactivity) in ovaries from PD14 (G and H), PD21 (J and K), and PD30 (M and N) mice. At PD14, the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries showed a significantly higher number of primary follicles (PrF) and significantly diminished number of secondary/preantral (SF/AF) follicles characterized by two or more layers of granulosa cells. At PD21 and PD30, the primary follicle pool did not differ significantly between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries however, there was a marked decrease in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in conditional knockouts including degenerating follicles without oocytes (marked by asterisks in insets in K and N). The primordial follicle (PF) pool remained relatively stable between PD14 and PD30, with no significant difference between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries. **P < 0,01. Scale bars: 100 μm (A, B, D, and E) 200 μm (G, H, J, K, M, and N) 50 μm (insets of K and N)


Tetracycline-inducible Empty Backbones

Find a construct that will allow you to insert and induce your gene of interest.

ICH WÜRDE Plasmid Beschreibung Co-expressed tTA, rtTA, or TetR On or Off PI
21916 Tet-pLKO-neo 3rd generation lentiviral plasmid for inducible expression of shRNA neomycin selection plasmid 21915 has puromycin selection TetR Auf Wiederschain
41393 pCW57.1 Lentiviral vector for inducible expression for Gateway cloning selection cassette in format: PGK-rtTA-2A-puro see article for tagged insert options rtTA Auf Wurzel
11651 pLVUT-tTR-KRAB Lentiviral vector for inducible expression of transgene or shRNA see article for detailed information about cloning and additional plasmids tetR-KRAB Auf Aebischer & Trono
16542 pBI-MCS-EGFP Expression of your gene of interest (MCS with a &beta-globin poly A) & EGFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Keiner Auf Vogelstein
25735 pSLIK-Neo Lentiviral vector for inducible expression of a miR-shRNA selection cassette in format: rtTA3+IRES+Neo see article for additional selection options third-generation rtTA Auf Fraser
44012 pInducer20 Lentiviral vector for shRNA expression see article for additional tookit plasmids third-generation rtTA Auf Elledge
19407 pTREtight2 Promoter contains a modified TRE that is silent in absence of binding tTA or rTA has high copy E. coli origin Keiner Entweder Ralser
64238 pTet-IRES-EGFP Lentiviral plasmid for inducible expression of transgene of interest and EGFP Keiner Entweder Lunge
11662 pPRIME-TET-GFP-FF3 Lentiviral, miRNA expression (PRIME) system for application in knockdown of gene expression at a single copy in mammalian cells Expresses firefly luciferase hairpin and GFP under pTREtight promoter Keiner Entweder Elledge
35625 pAAV-Ptet-RFP-shR-rtTA AAV shRNA cloning vector for evaluation of shRNA efficacy using fluorescence use with pGFPns-reporter for cDNA target rtTA Auf Gu
60495 pSBtet-GP Sleeping Beauty transposon system has luciferase in cloning site see article for additional selection and FP option rtTA Auf Kowarz
16623 pBI-GFP Expression of your gene of interest & GFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Keiner Entweder Vogelstein
100521 pCW57.1-MAT2A Lentiviral Tet-Off all in one plasmid derived from pCW57.1. rtTA was replaced with tTA, and Puromycin was replaced with Blasticidin selection. Please NOTE, this vector contains an insert (MAT2A) which would need to be replaced by the gene of interest. tTA aus Sabatini
92099 AAVS1_Puro_Tet3G_3xFLAG_Twin_Strep Bidirectional promoter controls expression of gene of interest with Strep-Tag and Tet-On 3G transactivator, creating an auto-regulated Tet-On 3G System. Contains homology arms for integration into AAVS1 Genomic Safe Harbor Locus. Tet-On 3G Auf Doyon
58245 pGLTR-X-GFP Single vector lentiviral Gateway RNAi system for conditional cell line generation contains expression cassette for TetR-P2A-GFP see article for additional constructs TetR Auf Geley


Beispiel 4

In experiments using S. aureus cells grown in culture, intracellularly expressed ssJT01ss bound to and inhibited a specific essential cellular target in a manner similar to that of an antimicrobial drug. Hence induction of expression of this peptide during an infection should have the effect of an antibiotic. An established animal infection model was used to test this concept (Onyegji, C. O. et al., Antimikrobielle Wirkstoffe und Chemotherapie 38:112-117, 1994).

Six groups of CD-1 female mice (5 mice per group, Charles River Laboratories, Wilmington, Ma.) weighing 20-24 grams were used in this experiment. The inoculum was prepared from CYL316tt/pC 3 883 (encoding a ssJT01ss peptide-GST fusion protein under the control of the tet operon) which was cultured at 37° C. for 17 hours in TS broth containing erythromycin and kanamycin. 1.6×10 10 cfu (colony-forming units) of S. aureus CYL316tt/pC 3 883 (OD 600 of 0.1=10 8 cfu/ml) from the overnight culture were diluted to 20 ml with 0.01 M PBS (Sigma P-0261) containing 8% hog gastric mucin (Sigma M-2378) as well as 50 μg/ml kanamycin and 10 μg/ml erythromycin. Each mouse of groups 1 through 4 was injected with 0.5 ml of the inoculum intraperitoneally (i.p.), equivalent to 4×10 8 cfu/mouse (lethal dose). Groups 5 and 6 served as vector controls. Each mouse of these two groups was injected with 4×10 8 cfu of CYL316tt/pC 3 875, which was cultured and processed the same way as CYL316tt/pC 3 883. One half hour and four hours after the inoculation, groups 1 and 5 received a saline injection i.p. at 10 ml/kg groups 2 and 6 received i.p. injections of tetracycline (Sigma T-3383) at 8 mg/kg group 3 received i.p. injections of tetracycline at 4 mg/kg group 4 received i.p. injections of ciprofloxacin (Bayer 851510, dissolved in water) at 50 mg/kg. The injection volume for all the animals was 10 ml/kg. Surviving mice were counted at 7 days post inoculation. Ciprofloxacin given at 50 mg/kg protected all infected animals from lethal infection.

The data summarized in Table 2 demonstrate that induction of intracellular expression of the ssJT01ss peptide can be achieved in an animal infection. Hemmung von S. aureus MetRS by the intracellularly expressed ssJT01ss peptide cured a lethal infection in a mouse model.

TABLE 2
Hemmung von S. aureus growth in mice by intracellular production
von S. aureus MetRS inhibitor
# of Mice# of Mice
Experimental ConditionTestedÜberleben
M1 Peptide
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C255
Expression Control
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C250

The relevant teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference herein in their entirety.

While this invention has been particularly shown and described with references to preferred embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

28 1 33 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 1 acgggtcgac tcatatcttt tattcaataa tcg 33 2 32 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 2 ccggaaagct tacttattaa ataatttata gc 32 3 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 3 taagtaagct taaggaggaa ttaatgatgt ctag 34 4 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 4 acgggtcgac ttaagaccca ctttcacatt taag 34 5 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 5 ctcggtaccg agctaaaatt cggaggcata tcaaatgagc tctgg 45 6 44 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 6 ggcatatcaa atgagctctg gaggtggagg catgtcccct atac 44 7 31 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 7 aggcctaggt taatccgatt ttggaggatg g 31 8 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 8 ctgatccgaa tacgtggcag ttgcggtggc ctatgcatag ct 42 9 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 9 atgcataggc caccgcaact gccacgtatt cggatcagag ct 42 10 48 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 10 tcgagttcat gaaaaactaa aaaaaatatt gacatcccta tcagtgat 48 11 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 11 agagataatt aaaataatcc ctatcagtga tagagagctt gcatg 45 12 29 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 12 caagctctct atcactgata gggattatt 29 13 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 13 ttaattatct ctatcactga tagggatgtc aatatttttt ttagtttttc atgaac 56 14 58 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 14 aataaaaaac tagtttgaca aataactcta tcaatgatag agtgtcacaa aaaggagg 58 15 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 15 gatagagtgt caacaaaaag gaggaattaa tgatgtcccc tatactaggt tattgg 56 16 36 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 16 ggattaaggt aaccttaatc cgattttgga ggatgg 36 17 12 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 17 Asp Pro Asn Thr Trp Gln Leu Arg Trp Pro Met His 1 5 10 18 6 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 18 Gly Gly Arg Gly Gly Met 1 5 19 54 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 19 gatcctaata catggcagtt gaggtggcct atgcatggcg gccgcggagg tatg 54 20 66 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 20 agctctgatc ctaatacatg gcagttgagg tggcctatgc attcttcagg cggccgcgga 60 ggtatg 66 21 21 PRT Artificial Sequence peptide 21 Ser Arg Trp Glu Lys Tyr Ile Asn Ser Phe Glu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 22 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 22 tctagatggg aaaaatatat taattctttt gaattagatt ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 23 21 PRT Artificial Sequence peptide 23 Ser Ser Gln Gly Thr Met Arg Trp Phe Asp Trp Tyr Arg Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 24 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 24 agctctcaag gtactatgag atggtttgat tggtatagat ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 25 49 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 25 agcaccttgg cggccgcgga ggtgctagca aaggagaaga actcttcac 49 26 37 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 26 aactgaggta acctcagttg tacagttcat ccatgcc 37 27 52 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 27 tttaccttgg cggccgcgga ggtaaactga agaaggtaaa ctggtaatct gg 52 28 40 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 28 acttagggta accttaagtc tgcgcgtctt tcagggcttc 40


Identification of the Omega4514 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus that is transcribed in vitro by the major vegetative RNA polymerase

Omega4514 is the site of a Tn5 lac insertion in the Myxococcus xanthus genome that fuses lacZ expression to a developmentally regulated promoter. DNA upstream of the insertion site was cloned, and the promoter was localized. The promoter resembles vegetative promoters in sequence, and sigma(A) RNA polymerase, the major form of RNA polymerase in growing M. xanthus, initiated transcription from this promoter in vitro. Two complete open reading frames were identified downstream of the promoter and before the Omega4514 insertion. The first gene product (ORF1) has a putative helix-turn-helix DNA-binding motif and shows sequence similarity to transcriptional regulators. ORF2 is most similar to subunit A of glutaconate coenzyme A (CoA) transferase, which is involved in glutamate fermentation. Tn5 lac Omega4514 is inserted in the third codon of ORF3, which is similar to subunit B of glutaconate CoA-transferase. An orf1 disruption mutant exhibited a mild sporulation defect, whereas neither a disruption of orf2 nor insertion Omega4514 in orf3 caused a defect. Based on DNA sequence analysis, the three genes are likely to be cotranscribed with a fourth gene whose product is similar to alcohol dehydrogenases. ORF1 delays and reduces expression of the operon during development, but relief from this negative autoregulation does not fully explain the regulation of the operon, because expression from a small promoter-containing fragment is strongly induced during development of an orf1 mutant. Also, multiple upstream DNA elements are necessary for full developmental expression. These results suggest that transcriptional activation also regulates the operon. Omega4514 is the first example of a developmentally regulated M. xanthus operon that is transcribed by the major vegetative RNA polymerase, and its regulation appears to involve both negative autoregulation by ORF1 and positive regulation by one or more transcriptional activators.

Figuren

Physical map of the Ω4514…

Physical map of the Ω4514 insertion region and summary of upstream segments tested…

Developmental expression of lacZ under…

Developmental expression of lacZ under the control of the Ω4514 promoter. Developmental β-galactosidase…

Localization of an mRNA 5′…

Localization of an mRNA 5′ end within the Ω4514 upstream region. Low-resolution S1…

Primer extension analysis of Ω4514…

Primer extension analysis of Ω4514 mRNA. RNA was isolated from wild-type DK1622 cells…

Developmental expression of lacZ from…

Developmental expression of lacZ from a small segment containing the Ω4514 promoter. Developmental…

In vitro transcription from the…

In vitro transcription from the Ω4514 promoter. DNA fragments containing the Ω4514 promoter…

Western blot analysis of σ…

Western blot analysis of σ A in growing and developing M. xanthus cells.…

Wirkung von orf1 und orf2…

Wirkung von orf1 und orf2 mutations on developmental lacZ expression under the control…

Level of ORF1 protein and…

Level of ORF1 protein and β-galactosidase specific activity during growth and development. (EIN)…

Sequences of promoters transcribed in…

Sequences of promoters transcribed in vitro by M. xanthus σ A RNAP. The…


Schau das Video: Regulation of Gene Expression: Operons, Epigenetics, and Transcription Factors (Kann 2022).