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35: Genome Editing - Biologie

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35: Genombearbeitung

Inhalt

Wie eine genetische Schere öffnet die Cas9-Nuklease beide Stränge der Ziel-DNA-Sequenz, um die Modifikation mit einer von zwei Methoden einzuführen. Knock-in-Mutationen, die durch Homology Directed Repair (HDR) ermöglicht werden, sind der traditionelle Weg gezielter genomischer Editierungsansätze. [8] Dies ermöglicht die Einführung gezielter DNA-Schäden und -Reparaturen. HDR verwendet die Verwendung ähnlicher DNA-Sequenzen, um die Reparatur des Bruchs durch den Einbau von exogener DNA voranzutreiben, um als Reparaturvorlage zu fungieren. [8] Diese Methode beruht auf dem periodischen und isolierten Auftreten von DNA-Schäden an der Zielstelle, damit die Reparatur beginnen kann. Knock-out-Mutationen, die durch CRISPR-Cas9 verursacht werden, führen zur Reparatur des Doppelstrangbruchs durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ). NHEJ kann häufig zu zufälligen Deletionen oder Insertionen an der Reparaturstelle führen, die die Genfunktionalität stören oder verändern können. Daher gibt das Genom-Engineering von CRISPR-Cas9 Forschern die Möglichkeit, gezielte zufällige Genunterbrechungen zu erzeugen. Aus diesem Grund ist die Präzision der Genom-Editierung ein großes Anliegen. Genomic Editing führt zu irreversiblen Veränderungen des Genoms.

Während das Genome Editing in eukaryontischen Zellen seit den 1980er Jahren mit verschiedenen Methoden möglich war, erwiesen sich die eingesetzten Methoden als ineffizient und nicht praktikabel im großen Maßstab. Mit der Entdeckung von CRISPR und insbesondere des Cas9-Nuklease-Moleküls ist eine effiziente und hochselektive Bearbeitung nun Realität. Cas9 stammt aus der Bakterienart Streptococcus pyogenes hat die gezielte genomische Modifikation in eukaryontischen Zellen erleichtert, indem es eine zuverlässige Methode zur Erzeugung eines gezielten Bruchs an einer bestimmten Stelle ermöglicht, die durch die crRNA- und tracrRNA-Führungsstränge bezeichnet wird. [9] Die Leichtigkeit, mit der Forscher Cas9 und Template-RNA einfügen können, um Punktmutationen an bestimmten Loci zum Schweigen zu bringen oder zu verursachen, hat sich für die schnelle und effiziente Kartierung von Genommodellen und biologischen Prozessen, die mit verschiedenen Genen in einer Vielzahl von Eukaryoten verbunden sind, als unschätzbar erwiesen. Es wurden neu konstruierte Varianten der Cas9-Nuklease entwickelt, die die Off-Target-Aktivität signifikant reduzieren. [10]

CRISPR-Cas9 Genome Editing Techniken haben viele potenzielle Anwendungen, unter anderem in der Medizin und Landwirtschaft. Die Verwendung des CRISPR-Cas9-gRNA-Komplexes zur Genom-Editierung [11] wurde von der AAAS zum Durchbruch des Jahres 2015 gewählt Embryonen. [13]

Andere Methoden Bearbeiten

Anfang der 2000er Jahre begannen deutsche Forscher mit der Entwicklung von Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs), synthetischen Proteinen, deren DNA-Bindungsdomänen es ihnen ermöglichen, an bestimmten Stellen doppelsträngige DNA-Brüche zu erzeugen. ZFNs haben eine höhere Präzision und den Vorteil, dass sie kleiner als Cas9 sind, aber ZFNs werden nicht so häufig verwendet wie CRISPR-basierte Methoden. Sangamo stellt ZFNs über Industrie- und akademische Partnerschaften bereit, besitzt jedoch die Module, das Fachwissen und die Patente, um sie zu erstellen. Im Jahr 2010 boten synthetische Nukleasen, die als Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) bezeichnet werden, eine einfachere Möglichkeit, einen Doppelstrangbruch an einer bestimmten Stelle des DNA-Strangs zu erreichen. Sowohl Zinkfinger-Nukleasen als auch TALENs erfordern das Design und die Herstellung eines benutzerdefinierten Proteins für jede gezielte DNA-Sequenz, was ein viel schwierigerer und zeitaufwändigerer Prozess ist als der Entwurf von Guide-RNAs. CRISPRs sind viel einfacher zu entwerfen, da der Prozess nur die Synthese einer kurzen RNA-Sequenz erfordert, ein Verfahren, das bereits für viele andere molekularbiologische Techniken (z. B. die Herstellung von Oligonukleotid-Primern) weit verbreitet ist. [14]

Während Methoden wie die RNA-Interferenz (RNAi) die Genfunktion nicht vollständig unterdrücken, bieten CRISPR, ZFNs und TALENs einen vollständigen irreversiblen Gen-Knockout. [15] CRISPR kann auch mehrere DNA-Stellen gleichzeitig angreifen, indem einfach verschiedene gRNAs eingeführt werden. Darüber hinaus sind die Kosten für den Einsatz von CRISPR relativ gering. [15] [16] [17]

Entdeckung Bearbeiten

Im Jahr 2012 veröffentlichten Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier ihre Entdeckung, dass CRISPR-Cas9 mit RNA programmiert werden könnte, um genomische DNA zu bearbeiten, die heute als eine der bedeutendsten Entdeckungen in der Geschichte der Biologie gilt. [18]

Patente und Kommerzialisierung Bearbeiten

Ab November 2013 [Update] hatte SAGE Labs (Teil der Horizon Discovery-Gruppe) von einem dieser Unternehmen exklusive Rechte zur Herstellung und zum Verkauf gentechnisch veränderter Ratten und nicht-exklusive Rechte für Maus- und Kaninchenmodelle. [19] Bis 2015 [Update] hatte Thermo Fisher Scientific geistiges Eigentum von ToolGen lizenziert, um CRISPR-Reagenzien-Kits zu entwickeln. [20]

Ab Dezember 2014 [Update] wurden Patentrechte an CRISPR angefochten. Mehrere Unternehmen wurden gegründet, um entsprechende Medikamente und Forschungsinstrumente zu entwickeln. [21] Als die Unternehmen die Finanzierung ankurbelten, kamen Zweifel auf, ob CRISPR schnell monetarisiert werden könnte. [22] Im Februar 2017 entschied das US-Patentamt über einen Patentinterferenzfall der University of California in Bezug auf an das Broad Institute erteilte Patente und stellte fest, dass die Broad-Patente mit Ansprüchen auf die Anwendung von CRISPR-Cas9 in eukaryotischen Zellen , unterschieden sich von den von der University of California beanspruchten Erfindungen. [23] [24] [25] Kurz darauf legte die University of California Berufung gegen dieses Urteil ein. [26] [27]

Letzte Ereignisse Bearbeiten

Im März 2017 kündigte das Europäische Patentamt (EPA) seine Absicht an, den Max-Planck-Instituten in Berlin, der University of California und der Universität Wien, [28] [29] und im August 2017, Ansprüche auf Bearbeitung aller Arten von Zellen zu gewähren , kündigte das EPA seine Absicht an, CRISPR-Ansprüche in einer von MilliporeSigma eingereichten Patentanmeldung zuzulassen. [28] Im August 2017 [Update] war die Patentsituation in Europa komplex, wobei MilliporeSigma, ToolGen, die Vilnius University und Harvard zusammen mit der University of California und Broad um Ansprüche kämpften. [30]

Im Juli 2018 hat der EuGH entschieden, dass die Gen-Editierung für Pflanzen eine Unterkategorie von GVO-Lebensmitteln ist und daher die CRISPR-Technik künftig in der Europäischen Union durch deren Regeln und Vorschriften für GVO geregelt wird. [31]

Im Februar 2020 zeigte eine US-Studie sicher die CRISPR-Gen-Editierung bei drei Krebspatienten. [32]

Im Oktober 2020 wurden die Forscher Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna für ihre Arbeiten auf diesem Gebiet mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. [33] [34] Sie schrieben Geschichte als die ersten beiden Frauen, die diese Auszeichnung ohne einen männlichen Beitragszahler teilten. [35]

CRISPR-Cas9 Genome Editing wird mit einem Typ II CRISPR System durchgeführt. Wenn es für die Genom-Editierung verwendet wird, umfasst dieses System Cas9, crRNA und tracrRNA zusammen mit einem optionalen Abschnitt der DNA-Reparatur-Matrize, die entweder bei der nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) oder der homologiegerichteten Reparatur (HDR) verwendet wird.

Hauptkomponenten Bearbeiten

Komponente Funktion
crRNA Enthält die Leit-RNA, die das richtige Segment der Wirts-DNA zusammen mit einer Region lokalisiert, die an tracrRNA (im Allgemeinen in Form einer Haarnadelschleife) bindet und einen aktiven Komplex bildet.
tracrRNA Bindet an crRNA und bildet einen aktiven Komplex.
sgRNA Single-Guide-RNAs sind eine kombinierte RNA, die aus einer tracrRNA und mindestens einer crRNA besteht.
Cas9 Ein Enzym, dessen aktive Form die DNA modifizieren kann. Aufgrund der DNA-Stellenerkennungsfunktion jedes Enzyms existieren viele Varianten mit unterschiedlichen Funktionen (d. h. Einzelstrang-Nicking, Doppelstrangbruch, DNA-Bindung).
Vorlage reparieren DNA-Molekül, das als Matrize im DNA-Reparaturprozess der Wirtszelle verwendet wird und die Insertion einer spezifischen DNA-Sequenz in das von Cas9 gebrochene Wirtssegment ermöglicht.

CRISPR-Cas9 verwendet häufig ein Plasmid, um die Zielzellen zu transfizieren. [36] Die Hauptkomponenten dieses Plasmids sind im Bild dargestellt und in der Tabelle aufgelistet. Die crRNA ist für jede Anwendung einzigartig, da dies die Sequenz ist, die Cas9 verwendet, um spezifische Sequenzen in der DNA der Wirtszelle zu identifizieren und direkt daran zu binden. Die crRNA darf nur dort binden, wo eine Bearbeitung erwünscht ist. Die Reparaturmatrize ist auch für jede Anwendung einzigartig gestaltet, da sie bis zu einem gewissen Grad die DNA-Sequenzen auf beiden Seiten des Schnitts ergänzen muss und auch jede beliebige Sequenz enthalten muss, die für die Insertion in das Wirtsgenom gewünscht wird.

Mehrere crRNAs und die tracrRNA können zusammen verpackt werden, um eine Single-Guide-RNA (sgRNA) zu bilden. [37] Diese sgRNA kann neben dem Gen, das für das Cas9-Protein kodiert, eingefügt und in ein Plasmid umgewandelt werden, um in Zellen transfiziert zu werden. Viele Online-Tools stehen zur Verfügung, um das Design effektiver sgRNA-Sequenzen zu unterstützen. [38] [39]

Struktur bearbeiten

CRISPR-Cas9 bietet ein hohes Maß an Wiedergabetreue und einen relativ einfachen Aufbau. Seine Spezifität hängt von zwei Faktoren ab: der Zielsequenz und der Protospacer-Nachbarmotiv-(PAM)-Sequenz. Die Zielsequenz ist als Teil jedes CRISPR-Locus im crRNA-Array 20 Basen lang. [36] Ein typisches crRNA-Array weist mehrere einzigartige Zielsequenzen auf. Cas9-Proteine ​​wählen die richtige Position im Genom des Wirts aus, indem sie die Sequenz verwenden, um sich an Basenpaare auf der Wirts-DNA zu binden. Die Sequenz ist nicht Teil des Cas9-Proteins und daher anpassbar und kann unabhängig synthetisiert werden. [40] [41]

Die PAM-Sequenz auf dem Wirtsgenom wird von Cas9 erkannt. Cas9 kann nicht leicht modifiziert werden, um eine andere PAM-Sequenz zu erkennen. Dies ist jedoch letztendlich nicht zu einschränkend, da es sich typischerweise um eine sehr kurze und unspezifische Sequenz handelt, die an vielen Stellen im Genom häufig vorkommt (z 8 bis 12 Basenpaare). [36]

Sind diese Sequenzen zu einem Plasmid zusammengesetzt und in Zellen transfiziert, findet das Cas9-Protein mit Hilfe der crRNA die richtige Sequenz in der DNA der Wirtszelle und erzeugt – je nach Cas9-Variante – einen Einzel- oder Doppelstrangbruch bei die passende Stelle in der DNA. [42]

Richtige beabstandete einzelsträngige Brüche in der Wirts-DNA können eine homologiegerichtete Reparatur auslösen, die weniger fehleranfällig ist als die nicht-homologe Endverbindung, die typischerweise auf einen doppelsträngigen Bruch folgt. Die Bereitstellung einer DNA-Reparatur-Matrize ermöglicht die Insertion einer spezifischen DNA-Sequenz an einer genauen Stelle innerhalb des Genoms. Die Reparaturmatrize sollte sich 40 bis 90 Basenpaare über den Cas9-induzierten DNA-Bruch hinaus erstrecken. [36] Ziel ist es, dass der native HDR-Prozess der Zelle die bereitgestellte Reparaturvorlage nutzt und dadurch die neue Sequenz in das Genom einbaut. Einmal eingebaut, ist diese neue Sequenz nun Teil des genetischen Materials der Zelle und geht in ihre Tochterzellen über.

Lieferung Bearbeiten

Die Zufuhr von Cas9, sgRNA und assoziierten Komplexen in Zellen kann über virale und nicht-virale Systeme erfolgen. Die Elektroporation von DNA, RNA oder Ribonukleokomplexen ist eine gängige Technik, die jedoch schädliche Auswirkungen auf die Zielzellen haben kann. [43] Chemische Transfektionstechniken unter Verwendung von Lipiden und Peptiden wurden auch verwendet, um sgRNAs im Komplex mit Cas9 in Zellen einzuführen. [44] [45] Schwieriger zu transfizierende Zelltypen (z. B. Stammzellen, Neuronen und hämatopoetische Zellen) erfordern effizientere Transportsysteme, wie solche auf Basis von Lentivirus (LVs), Adenovirus (AdV) und Adeno- assoziiertes Virus (AAV). [46] [47] [48]

Kontrollierte Genom-Editierung Bearbeiten

Mehrere Varianten von CRISPR-Cas9 ermöglichen die Genaktivierung oder Genom-Editierung mit einem externen Auslöser wie Licht oder kleinen Molekülen. [49] [50] [51] Dazu gehören photoaktivierbare CRISPR-Systeme, die durch Fusion lichtresponsiver Proteinpartner mit einer Aktivatordomäne und einem dCas9 zur Genaktivierung [52] [53] oder durch Fusion ähnlicher lichtresponsiver Domänen mit zwei Konstrukten entwickelt wurden von Split-Cas9, [54] [55] oder durch Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren in Ca9 in Cas9, [56] oder durch Modifizieren der Leit-RNAs mit photospaltbaren Komplementen für die Genom-Editierung. [57]

Methoden zur Kontrolle der Genom-Editierung mit kleinen Molekülen umfassen ein allosterisches Cas9 ohne nachweisbare Hintergrund-Editierung, das die Bindung und Spaltung nach Zugabe von 4-Hydroxytamoxifen (4-HT) aktiviert, [49] 4-HT-responsives Intein-linked Cas9, [58] oder ein Cas9, das 4-HT-reaktiv ist, wenn es an vier ERT2-Domänen fusioniert ist. [59] Intein-induzierbares Split-Cas9 ermöglicht die Dimerisierung von Cas9-Fragmenten [60] und Rapamycin-induzierbares Split-Cas9-System, das durch Fusion zweier Konstrukte von Split-Cas9 mit FRB- und FKBP-Fragmenten entwickelt wurde. [61] Andere Studien konnten die Transkription von Cas9 mit einem kleinen Molekül, Doxycyclin, induzieren. [62] [63] Kleine Moleküle können auch verwendet werden, um die homologiegerichtete Reparatur zu verbessern, [64] oft durch Hemmung des nicht-homologen Endverbindungsweges. [65] Diese Systeme ermöglichen eine bedingte Kontrolle der CRISPR-Aktivität für verbesserte Präzision, Effizienz und raumzeitliche Kontrolle.

Das Clustered Regular Interspaced Short Palindrome Repeats (CRISPR)/Cas9-System ist eine Gen-Editing-Technologie, die Doppelstrangbrüche (DSBs) überall dort induzieren kann, wo Leit-Ribonukleinsäuren (gRNA) an die Protospacer-Advantage-Motiv-(PAM)-Sequenz binden können. [66] Einzelstrang-Nicks können auch durch Cas9-Mutanten im aktiven Zentrum induziert werden, [67] auch bekannt als Cas9-Nickasen. [68] Durch einfaches Ändern der gRNA-Sequenz kann die Cas9-Endonuklease einem interessierenden Gen zugeführt werden und DSBs induzieren. [69] Die Effizienz der Cas9-Endonuklease und die Leichtigkeit, mit der Gene gezielt angesteuert werden können, führten zur Entwicklung von CRISPR-Knockout-(KO)-Bibliotheken sowohl für Maus- als auch für menschliche Zellen, die entweder spezifische interessierende Gensets oder das gesamte Spektrum abdecken können. Genom. [70] [71] Das CRISPR-Screening hilft Wissenschaftlern, eine systematische genetische Störung mit hohem Durchsatz in lebenden Modellorganismen zu erzeugen. Diese genetische Störung ist notwendig, um die Genfunktion und die epigenetische Regulation vollständig zu verstehen. [72] Der Vorteil gepoolter CRISPR-Bibliotheken besteht darin, dass auf mehr Gene gleichzeitig abgezielt werden kann.

Knock-out-Bibliotheken werden so erstellt, dass sie über alle exprimierten gRNAs hinweg eine gleiche Darstellung und Leistung erzielen und einen antibiotischen oder fluoreszierenden Selektionsmarker tragen, der verwendet werden kann, um transduzierte Zellen zu gewinnen. [73] In CRISPR/Cas9-Bibliotheken gibt es zwei Plasmidsysteme. Erstens ist alles in einem Plasmid, wo sgRNA und Cas9 gleichzeitig in einer transfizierten Zelle produziert werden. Zweitens handelt es sich um ein Zwei-Vektor-System: sgRNA- und Cas9-Plasmide werden getrennt geliefert. [72] Es ist wichtig, Tausende von einzigartigen sgRNAs-enthaltenden Vektoren durch virale Transduktion bei geringer Infektionsmultiplizität (MOI, typischerweise bei 0,1-0,6) an ein einzelnes Zellgefäß zu liefern, es verhindert die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner Zellklon mehr bekommt als ein sgRNA-Typ, andernfalls kann es zu einer falschen Zuordnung von Genotyp zu Phänotyp kommen. [70]

Sobald die gepoolte Bibliothek hergestellt ist, ist es notwendig, eine Tiefensequenzierung (NGS, Next Generation Sequencing) von PCR-amplifizierter Plasmid-DNA durchzuführen, um die Fülle an sgRNAs aufzudecken. Interessierende Zellen können anschließend von der Bibliothek infiziert und dann gemäß dem Phänotyp ausgewählt werden. Es gibt 2 Arten der Auswahl: negativ und positiv. Durch negative Selektion werden tote oder langsam wachsende Zellen effizient nachgewiesen. Es kann überlebenswichtige Gene identifizieren, die weiter als Kandidaten für molekular zielgerichtete Medikamente dienen können. Andererseits ergibt eine positive Selektion eine Sammlung von Populationen, die durch Zufallsmutagenese mit Wachstumsvorteil erworben wurden. [73] Nach der Selektion wird genomische DNA gesammelt und durch NGS sequenziert. Die Erschöpfung oder Anreicherung von sgRNAs wird nachgewiesen und mit der ursprünglichen sgRNA-Bibliothek verglichen, die mit dem Zielgen, dem die sgRNA entspricht, annotiert ist. Statistische Analysen identifizieren dann Gene, die mit hoher Wahrscheinlichkeit für den interessierenden Phänotyp relevant sind. [70]

Neben Knock-out gibt es auch Knock-Down- (CRISPRi) und Aktivierungs- (CRISPRa) Bibliotheken, die die Fähigkeit von proteolytisch deaktivierten Cas9-Fusionsproteinen (dCas9) nutzen, Ziel-DNA zu binden, was bedeutet, dass das interessierende Gen nicht geschnitten wird, sondern wird überexprimiert oder verdrängt. Es machte das CRISPR/Cas9-System für die Genbearbeitung noch interessanter. Inaktives dCas9-Protein moduliert die Genexpression, indem es dCas9-Repressoren oder -Aktivatoren auf Promotor- oder Transkriptionsstartstellen von Zielgenen ausrichtet. Um Gene zu reprimieren, kann Cas9 an eine KRAB-Effektordomäne fusioniert werden, die einen Komplex mit gRNA bildet, während CRISPRa dCas9 verwendet, das an verschiedene Transkriptionsaktivierungsdomänen fusioniert ist, die weiter von gRNA zu Promotorregionen gelenkt werden, um die Expression hochzuregulieren. [75] [76] [77]

Krankheitsmodelle Bearbeiten

Die genomische Modifikation von Cas9 hat die schnelle und effiziente Generierung transgener Modelle im Bereich der Genetik ermöglicht. Cas9 lässt sich leicht zusammen mit sgRNA über Plasmidtransfektion in die Zielzellen einschleusen, um die Ausbreitung von Krankheiten sowie die Reaktion und Abwehr der Zelle gegen Infektionen zu modellieren. [78] Die Fähigkeit von Cas9 eingeführt zu werden in vivo ermöglicht die Erstellung genauerer Modelle der Genfunktion und der Mutationseffekte, während gleichzeitig die Off-Target-Mutationen vermieden werden, die typischerweise bei älteren Methoden der Gentechnik beobachtet werden.

Die Revolution von CRISPR und Cas9 in der Genommodellierung erstreckt sich nicht nur auf Säugetiere. Traditionelle genomische Modelle wie Drosophila melanogaster, einem der ersten Modellorganismen, wurde mit Cas9 in seiner Auflösung weiter verfeinert. [78] Cas9 verwendet zellspezifische Promotoren, die eine kontrollierte Verwendung des Cas9 ermöglichen. Cas9 ist eine genaue Methode zur Behandlung von Krankheiten, da das Cas9-Enzym gezielt auf bestimmte Zelltypen abzielt. Die der Cas9-Therapie unterzogenen Zellen können auch entfernt und wieder eingeführt werden, um eine verstärkte Wirkung der Therapie zu erzielen. [79]

CRISPR-Cas9 kann verwendet werden, um die DNA von Organismen zu bearbeiten in vivo und zu jedem Zeitpunkt seiner Entwicklung einzelne Gene oder sogar ganze Chromosomen aus einem Organismus zu eliminieren. Chromosomen, die erfolgreich gelöscht wurden in vivo CRISPR-Techniken verwenden das Y-Chromosom und das X-Chromosom von erwachsenen Labormäusen und die menschlichen Chromosomen 14 und 21 in embryonalen Stammzelllinien bzw. aneuploiden Mäusen. Diese Methode könnte zur Behandlung von genetischen Störungen nützlich sein, die durch eine abnormale Anzahl von Chromosomen verursacht werden, wie z. B. das Down-Syndrom und intersexuelle Störungen. [80]

Erfolgreich in vivo Genome Editing mit CRISPR-Cas9 wurde in zahlreichen Modellorganismen gezeigt, darunter Escherichia coli, [81] Saccharomyces cerevisiae, [82] Candida albicans, [83] Caenorhabditis elegans, [84] Arabidopsis spp., [85] Danio rerio, [86] und Muskulatur. [87] [88] Erfolge wurden im Studium der Grundlagenbiologie, in der Erstellung von Krankheitsmodellen [84] [89] und in der experimentellen Behandlung von Krankheitsmodellen erzielt. [90]

Es wurden Bedenken geäußert, dass Off-Target-Effekte (Bearbeitung von Genen außer den beabsichtigten) die Ergebnisse eines CRISPR-Gen-Editing-Experiments verfälschen könnten (d. CRISPR wurde modifiziert, um die Möglichkeit von Off-Target-Effekten zu minimieren. Orthogonale CRISPR-Experimente werden oft empfohlen, um die Ergebnisse eines Gen-Editing-Experiments zu bestätigen. [91] [92]

CRISPR vereinfacht die Herstellung genetisch veränderter Organismen für die Forschung, die Krankheiten nachahmen oder zeigen, was passiert, wenn ein Gen zerstört oder mutiert wird. CRISPR kann auf Keimbahnebene verwendet werden, um Organismen zu erzeugen, in denen das Zielgen überall (dh in allen Zellen/Geweben/Organen eines mehrzelligen Organismus) verändert wird, oder es kann in Nicht-Keimbahnzellen verwendet werden, um lokale Veränderungen zu erzeugen, die nur bestimmte Zellpopulationen im Organismus beeinflussen. [93] [94] [95]

CRISPR kann verwendet werden, um menschliche Zellmodelle von Krankheiten zu erstellen. [96] Beispielsweise wurde CRISPR bei der Anwendung auf humane pluripotente Stammzellen verwendet, um gezielte Mutationen in Genen einzuführen, die für die polyzystische Nierenerkrankung (PKD) und die fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) relevant sind. [97] Diese CRISPR-modifizierten pluripotenten Stammzellen wurden anschließend zu humanen Nierenorganoiden gezüchtet, die krankheitsspezifische Phänotypen aufwiesen. Nierenorganoide aus Stammzellen mit PKD-Mutationen bildeten große, durchscheinende Zystenstrukturen aus Nierentubuli. Die Zysten erreichten makroskopische Dimensionen von bis zu einem Zentimeter Durchmesser. [98] Nierenorganoide mit Mutationen in einem mit FSGS verbundenen Gen entwickelten Verbindungsdefekte zwischen Podozyten, den von dieser Krankheit betroffenen Filterzellen. Dies wurde auf die Unfähigkeit von Podozyten zurückgeführt, Mikrovilli zwischen benachbarten Zellen zu bilden. [99] Wichtig ist, dass diese Krankheitsphänotypen in Kontrollorganoiden mit identischem genetischen Hintergrund fehlten, aber die CRISPR-Modifikationen fehlten. [97]

Ein ähnlicher Ansatz wurde gewählt, um das Long-QT-Syndrom in Kardiomyozyten zu modellieren, die aus pluripotenten Stammzellen stammen. [100] Diese CRISPR-generierten Zellmodelle mit isogenen Kontrollen bieten eine neue Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu untersuchen und Medikamente zu testen.

Biomedizin Bearbeiten

Die CRISPR-Cas-Technologie wurde zur Behandlung mehrerer menschlicher Krankheiten vorgeschlagen, insbesondere solcher mit genetischer Ursache. [101] Seine Fähigkeit, spezifische DNA-Sequenzen zu modifizieren, macht es zu einem Werkzeug mit dem Potenzial, krankheitsverursachende Mutationen zu beheben. Frühe Forschungen in Tiermodellen legen nahe, dass Therapien auf Basis der CRISPR-Technologie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln, [102] einschließlich Krebs, [103] Progerie, [104] Beta-Thalassämie, [105] [106] Sichelzellanämie, [107] Hämophilie, [108] Mukoviszidose, [109] Muskeldystrophie Duchenne, [110] Morbus Huntington, [111] [112] und Herzerkrankungen. [113] CRISPR wurde auch verwendet, um Malaria bei Mücken zu heilen, was den Vektor und die Krankheit beim Menschen beseitigen könnte. [114] CRISPR könnte auch in der Gewebezüchtung und regenerativen Medizin Anwendung finden, beispielsweise durch die Schaffung menschlicher Blutgefäße, denen die Expression von MHC-Klasse-II-Proteinen fehlt, die häufig eine Transplantatabstoßung verursachen. [115]

Darüber hinaus haben klinische Studien zur Heilung von Beta-Thalassämie und Sichelzellanämie bei menschlichen Patienten mit der CRISPR-Cas9-Technologie vielversprechende Ergebnisse gezeigt. [116] [117]

CRISPR bei der Behandlung von Infektionen Bearbeiten

CRISPR-Cas-basierte "RNA-gesteuerte Nukleasen" können verwendet werden, um Virulenzfaktoren, Gene, die Antibiotikaresistenz kodieren, und andere medizinisch relevante Sequenzen von Interesse zu bekämpfen. Diese Technologie stellt somit eine neuartige Form der antimikrobiellen Therapie und eine Strategie dar, um Bakterienpopulationen zu manipulieren. [118] [119] Neuere Studien legen einen Zusammenhang zwischen der Störung des CRISPR-Cas-Locus und dem Erwerb einer Antibiotikaresistenz nahe. [120] Dieses System schützt Bakterien vor eindringender fremder DNA wie Transposons, Bakteriophagen und Plasmiden. Dieses System erwies sich als starker Selektionsdruck für den Erwerb von Antibiotikaresistenzen und Virulenzfaktoren bei bakteriellen Krankheitserregern. [120]

Therapien, die auf der CRISPR-Cas3-Gen-Editing-Technologie basieren, die von gentechnisch veränderten Bakteriophagen bereitgestellt werden, könnten verwendet werden, um gezielte DNA in Krankheitserregern zu zerstören. [121] Cas3 ist destruktiver als das bekanntere Cas9. [122] [123]

Die Forschung legt nahe, dass CRISPR ein wirksamer Weg ist, um die Replikation mehrerer Herpesviren zu begrenzen. Im Fall des Epstein-Barr-Virus (EBV) konnte es virale DNA ausrotten. Anti-Herpesvirus-CRISPRs haben vielversprechende Anwendungen wie die Entfernung von krebserregendem EBV aus Tumorzellen, die Befreiung von gespendeten Organen für immungeschwächte Patienten von viralen Eindringlingen oder die Vorbeugung von Fieberbläschen und wiederkehrenden Augeninfektionen durch Blockieren der HSV-1-Reaktivierung. Ab August 2016 [Update] warteten diese auf den Test. [124]

CRISPR könnte das Konzept der Transplantation tierischer Organe in Menschen wiederbeleben. In tierischen Genomen vorhandene Retroviren könnten Transplantatempfängern schaden. Im Jahr 2015 eliminierte ein Team 62 Kopien einer bestimmten retroviralen DNA-Sequenz aus dem Schweinegenom in einer Nierenepithelzelle. [125] Forscher haben kürzlich die Möglichkeit gezeigt, lebende Schweineproben zu gebären, nachdem diese Retroviren mit CRISPR zum ersten Mal aus ihrem Genom entfernt wurden. [126]

CRISPR und Krebs Bearbeiten

CRISPR hat auch viele Anwendungen bei der Entwicklung zellbasierter Immuntherapien gefunden. [127] Die erste klinische Studie mit CRISPR begann im Jahr 2016. Sie beinhaltete die Entfernung von Immunzellen von Menschen mit Lungenkrebs, wobei CRISPR verwendet wurde, um das exprimierte PD-1-Gen herauszuschneiden, und dann die veränderten Zellen wieder derselben Person zu verabreichen. 20 weitere Studien waren im Gange oder fast fertig, hauptsächlich in China, bis 2017 [Update] . [103]

Im Jahr 2016 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) eine klinische Studie, in der CRISPR verwendet werden sollte, um T-Zellen zu verändern, die von Menschen mit verschiedenen Krebsarten extrahiert wurden, und diese veränderten T-Zellen dann denselben Menschen wieder zu verabreichen. [128]

Im November 2020 wurde CRISPR wirksam zur Behandlung von Glioblastom (ein schnell wachsender Hirntumor) und metastasierendem Eierstockkrebs eingesetzt, da dies zwei Krebsarten mit einer der schlechtesten Prognosen sind und typischerweise in ihren späteren Stadien diagnostiziert werden. Die Behandlungen führten zu einer Hemmung des Tumorwachstums und einer um 80 % erhöhten Überlebensrate bei metastasierendem Eierstockkrebs und Tumorzell-Apoptose, zu einer Hemmung des Tumorwachstums um 50 % und zu einer um 30 % verbesserten Überlebensrate bei Glioblastomen. [129]

Knockdown/Aktivierung Bearbeiten

Die Verwendung von "toten" Versionen von Cas9 (dCas9) eliminiert die Fähigkeit von CRISPR, DNA zu schneiden, während seine Fähigkeit bewahrt wird, auf erwünschte Sequenzen abzuzielen. Mehrere Gruppen fügten dCas9s verschiedene regulatorische Faktoren hinzu, die es ihnen ermöglichten, fast jedes Gen ein- oder auszuschalten oder seine Aktivität anzupassen. [125] Wie RNAi schaltet die CRISPR-Interferenz (CRISPRi) Gene reversibel ab, indem eine Stelle gezielt, aber nicht durchtrennt wird. Die Zielstelle ist methyliert, wodurch das Gen epigenetisch modifiziert wird. Diese Modifikation hemmt die Transkription. Diese präzise platzierten Modifikationen können dann verwendet werden, um die Auswirkungen auf die Genexpression und die DNA-Dynamik nach der Hemmung bestimmter Genomsequenzen innerhalb der DNA zu regulieren. In den letzten Jahren wurden epigenetische Markierungen in verschiedenen menschlichen Zellen genau untersucht und es wurde festgestellt, dass bestimmte Muster innerhalb der Markierungen mit allem korrelieren, das vom Tumorwachstum bis zur Gehirnaktivität reicht. [11] Umgekehrt fördert die CRISPR-vermittelte Aktivierung (CRISPRa) die Gentranskription. [130] Cas9 ist ein effektiver Weg, um spezifische Gene auf DNA-Ebene anzuvisieren und zum Schweigen zu bringen. [131] In Bakterien reicht die Anwesenheit von Cas9 allein aus, um die Transkription zu blockieren. Für Säugeranwendungen wird ein Proteinabschnitt hinzugefügt. Seine Leit-RNA zielt auf regulatorische DNA-Sequenzen ab, die als Promotoren bezeichnet werden und dem Zielgen unmittelbar vorausgehen. [132]

Cas9 wurde verwendet, um synthetische Transkriptionsfaktoren zu tragen, die spezifische menschliche Gene aktivierten. Die Technik erzielte einen starken Effekt, indem sie mehrere CRISPR-Konstrukte auf leicht unterschiedliche Stellen auf dem Promotor des Gens abzielte. [132]

RNA-Bearbeitung Bearbeiten

Im Jahr 2016 zeigten Forscher, dass CRISPR aus einem gewöhnlichen Mundbakterium verwendet werden könnte, um RNA zu bearbeiten. Die Forscher durchsuchten Datenbanken mit Hunderten von Millionen genetischen Sequenzen nach solchen, die CRISPR-Genen ähnelten. Sie betrachteten die Fusobakterien Leptotrichia shahii. Es hatte eine Gruppe von Genen, die CRISPR-Genen ähnelten, aber mit wichtigen Unterschieden. Als die Forscher andere Bakterien mit diesen Genen ausstatteten, die sie C2c2 nannten, stellten sie fest, dass die Organismen eine neuartige Abwehr erlangten. [133] C2c2 wurde später in Cas13a umbenannt, um der Standardnomenklatur für Cas-Gene zu entsprechen. [134]

Viele Viren kodieren ihre genetischen Informationen in RNA und nicht in DNA, die sie wiederverwenden, um neue Viren herzustellen. HIV und Polioviren sind solche Viren. Bakterien mit Cas13 produzieren Moleküle, die RNA zerlegen und das Virus zerstören können. Die Anpassung dieser Gene öffnete jedes RNA-Molekül für die Bearbeitung. [133]

CRISPR-Cas-Systeme können auch zum Editieren von Mikro-RNA- und lang nicht kodierenden RNA-Genen in Pflanzen eingesetzt werden. [135]

Gene Drive Bearbeiten

Gene Drives können ein wirksames Instrument sein, um das Gleichgewicht von Ökosystemen wiederherzustellen, indem invasive Arten eliminiert werden. Bedenken hinsichtlich der Wirksamkeit und unbeabsichtigten Folgen bei der Zieltierart sowie bei Nichtzieltierarten wurden insbesondere im Hinblick auf die Möglichkeit einer unbeabsichtigten Freisetzung aus Laboratorien in die Wildnis geäußert. Wissenschaftler haben mehrere Sicherheitsvorkehrungen vorgeschlagen, um die Eindämmung experimenteller Gene Drives zu gewährleisten, einschließlich molekularer, reproduktiver und ökologischer. [136] Viele empfehlen, Immunisierungs- und Umkehrtriebe zusammen mit Gene Drives zu entwickeln, um deren Auswirkungen bei Bedarf zu überschreiben. [137] Es besteht nach wie vor Konsens darüber, dass Langzeiteffekte eingehender untersucht werden müssen, insbesondere hinsichtlich des Potenzials für ökologische Störungen, die nicht mit Umkehrantrieben korrigiert werden können. [138] Als solches wäre DNA-Computing erforderlich.

In vitro genetische Erschöpfung Bearbeiten

Nicht angereicherte Sequenzierungsbibliotheken weisen oft reichlich unerwünschte Sequenzen auf. Cas9 kann die unerwünschten Sequenzen mit Doppelstrangbruch mit einer Effizienz von bis zu 99% und ohne signifikante Off-Target-Effekte, wie sie bei Restriktionsenzymen beobachtet werden, spezifisch abbauen. Die Behandlung mit Cas9 kann reichlich rRNA abbauen und gleichzeitig die Pathogensensitivität in RNA-seq-Bibliotheken erhöhen. [139]

Erstbearbeitung Bearbeiten

Prime Editing [140] (oder Base Editing) ist eine CRISPR-Verfeinerung, um DNA-Abschnitte genau einzufügen oder zu löschen. Die CRISPR-Bearbeitungen sind nicht immer perfekt und die Schnitte können an der falschen Stelle landen. Beides ist ein Problem für den Einsatz der Technologie in der Medizin. [141] Prime Editing schneidet nicht die doppelsträngige DNA, sondern verwendet stattdessen den CRISPR-Targeting-Apparat, um ein zusätzliches Enzym zu einer gewünschten Sequenz zu transportieren, wo es ein einzelnes Nukleotid in ein anderes umwandelt. [142] Der neue Leitfaden, pegRNA genannt, enthält eine RNA-Matrize für eine neue DNA-Sequenz, die dem Genom am Zielort hinzugefügt wird. Dazu ist ein zweites Protein erforderlich, das an Cas9 angehängt ist: ein Reverse-Transkriptase-Enzym, das aus der RNA-Matrize einen neuen DNA-Strang herstellen und an der eingeschnittenen Stelle einfügen kann. [143] Diese drei unabhängigen Pairing-Ereignisse bieten jeweils die Möglichkeit, Off-Target-Sequenzen zu verhindern, was die Targeting-Flexibilität und Editierpräzision signifikant erhöht. [142] Prime Editing wurde von Forschern des Broad Institute of MIT und Harvard in Massachusetts entwickelt. [144] Zur Optimierung der Methoden sind weitere Arbeiten erforderlich. [144] [143]

Modifikation der menschlichen Keimbahn Bearbeiten

Bis März 2015 hatten mehrere Gruppen laufende Forschungsarbeiten angekündigt, um die Grundlagen für die Anwendung von CRISPR auf menschliche Embryonen für die menschliche Keimbahntechnik zu legen, darunter Labore in den USA, China und Großbritannien sowie das US-Biotechnologieunternehmen OvaScience. [145] Wissenschaftler, darunter ein Mitentdecker von CRISPR, forderten ein weltweites Moratorium für die Anwendung von CRISPR auf die menschliche Keimbahn, insbesondere für den klinischen Einsatz. Sie sagten, "Wissenschaftler sollten in laxen Rechtsordnungen auch den Versuch vermeiden, Keimbahngenommodifikationen für die klinische Anwendung beim Menschen zu versuchen", bis die vollständigen Auswirkungen "unter wissenschaftlichen und Regierungsorganisationen diskutiert werden". [146] [147] Diese Wissenschaftler unterstützen weitere Low-Level-Forschung zu CRISPR und sehen CRISPR nicht als ausreichend entwickelt für eine klinische Verwendung bei der Durchführung erblicher Veränderungen beim Menschen. [148]

Im April 2015 berichteten chinesische Wissenschaftler über die Ergebnisse eines Versuchs, die DNA nicht lebensfähiger menschlicher Embryonen mit CRISPR zu verändern, um eine Mutation zu korrigieren, die Beta-Thalassämie, eine tödliche Erbkrankheit, verursacht. [149] [150] Die Studie war zuvor von beiden abgelehnt worden Natur und Wissenschaft teilweise aus ethischen Bedenken. [151] Die Experimente führten dazu, dass nur einige der beabsichtigten Gene erfolgreich verändert wurden, und hatten Off-Target-Effekte auf andere Gene. Die Forscher stellten fest, dass CRISPR noch nicht für die klinische Anwendung in der Reproduktionsmedizin bereit ist. [151] Im April 2016 wurde berichtet, dass chinesische Wissenschaftler einen zweiten erfolglosen Versuch unternommen haben, die DNA nicht lebensfähiger menschlicher Embryonen mit CRISPR zu verändern – diesmal, um das CCR5-Gen zu verändern, um den Embryo resistent gegen eine HIV-Infektion zu machen. [152]

Im Dezember 2015 fand in Washington unter der Leitung von David Baltimore ein International Summit on Human Gene Editing statt. Mitglieder nationaler wissenschaftlicher Akademien der USA, Großbritanniens und Chinas diskutierten die Ethik der Keimbahnmodifikation. Sie vereinbarten, die Grundlagenforschung und die klinische Forschung im Rahmen bestimmter rechtlicher und ethischer Richtlinien zu unterstützen. Dabei wurde speziell zwischen somatischen Zellen, bei denen die Auswirkungen von Veränderungen auf ein einzelnes Individuum beschränkt sind, und Keimbahnzellen, bei denen Genomveränderungen von Nachkommen vererbt werden können, unterschieden. Erbliche Veränderungen könnten unbeabsichtigte und weitreichende Folgen für die menschliche Evolution haben, genetisch (z. B. Gen-Umwelt-Interaktionen) und kulturell (z. B. Sozialdarwinismus). Die Veränderung von Gametozyten und Embryonen, um beim Menschen erbliche Veränderungen hervorzurufen, wurde als unverantwortlich definiert. Die Gruppe vereinbarte, ein internationales Forum zu initiieren, um solche Bedenken auszuräumen und die Vorschriften länderübergreifend zu harmonisieren. [153]

Im Februar 2017 veröffentlichte der Ausschuss der National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine (NASEM) der Vereinigten Staaten für die Bearbeitung von menschlichen Genen einen Bericht, in dem ethische, rechtliche und wissenschaftliche Bedenken der Genom-Engineering-Technologie untersucht wurden. Die Schlussfolgerung des Berichts stellte fest, dass die heritable Genome Editing jetzt unzulässig ist, aber für bestimmte Erkrankungen gerechtfertigt sein könnte, jedoch nicht die Verwendung von CRISPR zur Verbesserung rechtfertigen. [154]

Im November 2018 gab Jiankui He bekannt, dass er zwei menschliche Embryonen bearbeitet hatte, um zu versuchen, das Gen für CCR5 zu deaktivieren, das für einen Rezeptor kodiert, mit dem HIV in Zellen eindringt. Er sagte, dass die Zwillinge Lulu und Nana vor einigen Wochen geboren worden seien. Er sagte, dass die Mädchen immer noch funktionelle Kopien von CCR5 zusammen mit behindertem CCR5 (Mosaik) trugen und immer noch anfällig für HIV seien. Die Arbeit wurde weithin als unethisch, gefährlich und verfrüht verurteilt. [155] Eine internationale Gruppe von Wissenschaftlern forderte ein weltweites Moratorium für die genetische Bearbeitung menschlicher Embryonen. [156]

Politische Hindernisse für Gentechnik Bearbeiten

Die Richtlinienbestimmungen für das CRISPR-Cas9-System variieren weltweit. Im Februar 2016 erhielten britische Wissenschaftler von den Aufsichtsbehörden die Erlaubnis, menschliche Embryonen mithilfe von CRISPR-Cas9 und verwandten Techniken genetisch zu verändern. Den Forschern wurde jedoch das Einpflanzen der Embryonen untersagt und die Embryonen sollten nach sieben Tagen vernichtet werden. [157]

Die USA verfügen über ein ausgeklügeltes, abteilungsübergreifendes Regulierungssystem zur Bewertung neuer gentechnisch veränderter Lebensmittel und Nutzpflanzen. Beispielsweise ermächtigt das Landwirtschaftsrisikoschutzgesetz von 2000 das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, die Erkennung, Kontrolle, Ausrottung, Unterdrückung, Vorbeugung oder Verzögerung der Ausbreitung von Pflanzenschädlingen oder schädlichen Unkräutern zu überwachen, um die Landwirtschaft, die Umwelt, und Wirtschaft der USA. Das Gesetz regelt alle gentechnisch veränderten Organismen, die das Genom eines vordefinierten "Pflanzenschädlings" oder einer zuvor nicht kategorisierten Pflanze verwenden. [158] Im Jahr 2015 deaktivierte Yinong Yang erfolgreich 16 spezifische Gene im weißen Champignon, um sie nicht bräunend zu machen. Da er seinem Organismus keine fremde (transgene) DNA zugesetzt hatte, konnte der Pilz nicht vom USDA nach § 340.2 reguliert werden. [159] Yangs weißer Champignon war der erste mit dem CRISPR-Cas9-Proteinsystem gentechnisch veränderte Organismus, der die US-Regulierung erfüllte. [160]

Im Jahr 2016 hat das USDA ein Komitee gesponsert, um die zukünftige Regulierungspolitik für kommende genetische Modifikationstechniken zu prüfen. Mit Unterstützung der US-amerikanischen National Academies of Sciences, Engineering and Medicine trafen sich am 15. April Sonderinteressengruppen, um über die möglichen Fortschritte in der Gentechnik in den nächsten fünf Jahren und die daraus resultierenden neuen Regelungen nachzudenken. [161] Im Jahr 2017 schlug die Food and Drug Administration eine Regel vor, die gentechnische Modifikationen an Tieren als "Tierdrogen" einstufen würde, sie einer strengen Regulierung unterwirft, wenn sie zum Verkauf angeboten wird, und die Möglichkeit für Einzelpersonen und kleine Unternehmen verringert, sie profitabel zu machen . [162] [163]

In China, wo sich die sozialen Bedingungen stark von denen des Westens unterscheiden, tragen genetische Krankheiten ein starkes Stigma. [164] Damit hat China weniger politische Hindernisse für den Einsatz dieser Technologie. [165] [166]

Anerkennung Bearbeiten

In den Jahren 2012 und 2013 war CRISPR Vizemeister in Wissenschaftsmagazin's Durchbruch des Jahres ausgezeichnet. 2015 war es der Gewinner dieser Auszeichnung. [125] CRISPR wurde als einer der MIT-Technologie-Überprüfung 's 10 bahnbrechende Technologien in den Jahren 2014 und 2016. [167] [168] 2016 gewannen Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier zusammen mit Rudolph Barrangou, Philippe Horvath und Feng Zhang den Gairdner International Award. 2017 wurden Doudna und Charpentier in Tokio, Japan, für ihre revolutionäre Erfindung von CRISPR-Cas9 mit dem Japan-Preis ausgezeichnet. 2016 gewannen Charpentier, Doudna und Zhang den Tang Prize in Biopharmaceutical Science. [169] Im Jahr 2020 erhielten Charpentier und Doudna den Nobelpreis für Chemie, den ersten solchen Preis für ein rein weibliches Team, „für die Entwicklung einer Methode zur Genom-Editierung“. [170]


Ergebnisse

Zur Beurteilung der Rekonstruktionsinstrumente führten wir sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung durch. In einem ersten Schritt haben wir eine Liste relevanter Merkmale für die Rekonstruktion auf Genomskala und die Softwarequalität erstellt und jedes Tool je nach Leistung bewertet (1: schlecht, 5: hervorragend).Diese Funktionen beziehen sich auf die Softwareleistung, Benutzerfreundlichkeit, Ähnlichkeit der Ausgabenetzwerke mit hochwertigen manuell kuratierten Modellen und die Einhaltung gemeinsamer Datenstandards. Darüber hinaus haben wir 18 spezifische Merkmale bewertet, die hauptsächlich mit der zweiten Stufe (Verfeinerung) des Protokolls zur Generierung hochwertiger metabolischer Rekonstruktionen auf Genomskala zusammenhängen [5]. Die Kriterien für die Zuweisung einer bestimmten Punktzahl in jedem Merkmal sind in Zusatzdatei 1: Tabelle S2 angegeben. Beachten Sie, dass nicht alle Tools für die zweite Stufe entwickelt wurden, sodass sie bei einigen Funktionen schlecht abgeschnitten haben. Viele dieser Merkmale wurden in früheren Übersichtsarbeiten nicht bewertet [8, 9].

Um zu beurteilen, wie ähnlich die generierten Entwurfsnetzwerke qualitativ hochwertigen Modellen sind, rekonstruierten wir anschließend mit verschiedenen Rekonstruktionswerkzeugen die metabolischen Netzwerke zweier Bakterien, für die bereits hochwertige, manuell kuratierte Modelle im Genommaßstab zur Verfügung standen. Wir haben uns entschieden, das metabolische Netzwerk von zu rekonstruieren Lactobacillus plantarum und Bordetella pertussis, Vertreter von grampositiven bzw. gramnegativen Bakterien. Diese Mikroorganismen wurden aus drei Gründen ausgewählt. Erstens werden die entsprechenden GSMMs nicht in der BIGG-Datenbank gespeichert, sodass Tools, die die BIGG-Datenbank (AuReMe, CarveME, MetaDraft, RAVEN) im Rekonstruktionsprozess verwenden können, die spezifischen Informationen für diese Mikroorganismen nicht verwenden können. Wenn Escherichia coli oder Bacillus subtilis gewählt worden wäre, hätten wir diese Werkzeuge bevorzugt, weil hochwertige Modelle für E coli oder B. subtilis bereits in der BIGG-Datenbank vorhanden sind und als Vorlagen oder Eingaben verwendet worden wären. Zweitens haben wir uns für diese Mikroorganismen entschieden, weil wir über die Qualität der Rekonstruktionen informiert waren, da wir sie selbst gebaut haben, und sie haben sich als in der Lage erwiesen, experimentelle Daten akkurat zu replizieren [11, 12, 42, 43], sogar von unabhängigen Forschern [44 , 45]. Drittens wurden diese Netzwerke fast vollständig manuell rekonstruiert, sodass wir keine Voreingenommenheit für ein bestimmtes Tool erwarten.

Zusätzlich zu den beiden vorherigen Arten haben wir auch mit allen Werkzeugen Netzentwürfe für rekonstruiert Pseudomonas putida, für die vier laborunabhängige Modelle im Genommaßstab rekonstruiert wurden. Wir verglichen die Rekonstruktionsentwürfe mit iJP962 [46], einem Modell, das nicht in der BiGG-Datenbank enthalten ist und nachweislich experimentelle Daten genau repliziert und keine Inkonsistenzen aufweist [47].

Die Netzwerke wurden mit sieben Tools erstellt: AuReMe, CarveMe, Merlin, MetaDraft, ModelSEED, Pathway Tools und RAVEN. Diese decken die meisten der frei verfügbaren Softwareplattformen ab. Die allgemeinen Funktionen dieser Tools sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Allgemeine Bewertungsübersicht

Keines der Tools hat für alle bewerteten Funktionen eine perfekte Punktzahl erreicht und normalerweise sind die Stärken einiger Tools Schwächen in anderen (Abb. 1, Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3, Tabellen S25 und S26, um eine detaillierte Bewertung zu sehen). Einerseits wurden ModelSEED und CarveMe als hervorragend bewertet, als wir überprüften, ob der gesamte Rekonstruktionsprozess automatisch abläuft. Merlin wurde als schlecht bewertet, da Benutzer mehr eingreifen sollten, um ein Netzwerk für die Durchführung von FBA vorzubereiten. Auf der anderen Seite halten wir Merlin hinsichtlich eines Arbeitsbereichs zur manuellen Verfeinerung und Informationen zur Unterstützung der Benutzer bei diesem Schritt für herausragend. CarveMe und ModelSEED stellen keine weiteren Informationen zur manuellen Verfeinerung und keinen Arbeitsbereich zur manuellen Kuration bereit, sodass sie als schlecht bewertet wurden in dieser Kategorie.

Qualitative Bewertung der untersuchten Werkzeuge zur metabolischen Rekonstruktion auf Genomskala. Wir haben jedes der Tools (AU: AuReMe. CA: CarveMe. MD: MetaDraft. ME: Merlin. MS: ModelSEED. PT: Pathway Tools. RA: RAVEN) von einer unbefriedigenden (rot) bis hin zu einer hervorragenden Leistung (dunkelgrün) bewertet. . In einigen Kategorien wie kontinuierliche Softwarewartung und ordnungsgemäßer Support erhielten oben in der Abbildung alle Tools die maximale Punktzahl, während in anderen wie der automatischen Verfeinerung anhand experimenteller Daten keines der Tools die maximale Punktzahl erreichte. In den meisten Fällen sind Stärken bei einigen Tools Schwächen bei anderen

In einigen Fällen haben alle Tools die maximal mögliche Punktzahl erreicht. So werden beispielsweise alle getesteten Tools von Spezialistenteams sachgerecht betreut und pflegen auch aktuelle Datenbanken. In anderen Fällen hat keines der Tools die maximale Punktzahl erreicht. Dies war bei der automatischen Verfeinerung von Netzwerken mit experimentellen Daten der Fall. Einige der Tools, wie ModelSEED und CarveMe, können die Medienzusammensetzung verwenden, um Lücken im Netzwerk zu schließen. AuReMe und Pathway Tools können neben der Medienzusammensetzung auch bekannte Stoffwechselprodukte verwenden, um das Netzwerk zu füllen. Trotzdem kann keines der Tools auch Biolog-Phänotyp-Arrays, Knockout-Experimente und verschiedene Arten von Omics-Daten (transcriptomic, proteomic, metabolomic usw.) verwenden, um das Netzwerk automatisch zu kuratieren. Obwohl in diesem Bereich einige Anstrengungen unternommen wurden [48,49,50,51], scheint dies eine große Herausforderung für die zukünftige Werkzeugentwicklung zu sein, die zu verbesserten metabolischen Rekonstruktionen führen sollte.

Die Einhaltung der neuesten SBML-Standards wurde als einer der kritischen Punkte für die gemeinsame Nutzung und Darstellung von Modellen genannt [52]. Daher haben wir evaluiert, ob die Tools die neuesten SBML-Funktionen beim Import (Eingaben) und Export (Ausgaben) von Netzwerken verwenden. Bei den Eingaben haben wir überprüft, ob die Tools Netzwerke in SBML Level 3 lesen können [22]. Wir haben zusätzlich überprüft, ob die Ausgabenetzwerke die folgenden drei Merkmale erfüllen: Verwendung von SBML Level 3 [22] mit FBC-Annotationen [23], SBML-Gruppen [24] und MIRIAM-konformen CV-Annotationen [22, 53]. Diese Funktionen werden beispielsweise für Modelle in der BIGG-Datenbank verwendet und sorgen für eine einheitliche Speicherung der Informationen. Bei Eingaben haben wir festgestellt, dass unter den Tools, die Netzwerke importieren und verwenden können (AuReMe, MetaDraft, RAVEN), alle SBML-Level 3 verwenden können, aber AuReMe bei Verwendung von SBML-Level 2 leicht unterschiedliche Netzwerke generiert. Für Ausgaben MetaDraft und Merlin und RAVEN waren die einzigen, die die Netzwerke mit allen drei Funktionen exportierten. Beachten Sie, dass mit RAVEN erstellte Netzwerke mit den spezifischen Funktionen von RAVEN nach SBML exportiert werden müssen (nicht COBRA-Funktionen, wie es ein normaler COBRA-Benutzer erwarten würde), da sonst keine MIRIAM-Anmerkungen in den SBML-Dateien vorhanden sind. Außerdem fehlen AuReMe und CarveMe MIRIAM-konforme CV-Annotationen und SBML-Gruppen, und Pathway Tools und ModelSEED exportierten die Netzwerke in SBML Level 2.

Netzwerkvergleich

Wir rekonstruierten Netzentwürfe für Lactobacillus plantarum WCFS1, Bordetella pertussis Tohama I und Pseudomonas putida KT2440 mit jedem Rekonstruktionswerkzeug. L. plantarum ist ein Milchsäurebakterium (LAB), das in der Lebensmittelfermentationsindustrie und als Probiotikum verwendet wird [54,55,56]. Sein GSMM umfasst 771 einzigartige Reaktionen, 662 Metaboliten und 728 Gene, und es wurde verwendet, um ein definiertes Medium für diese LAB zu entwerfen [43], um Wechselwirkungen mit anderen Bakterien zu erforschen [57] und als Referenz für die Rekonstruktion anderer LAB [58 ]. Im Gegensatz zu diesem LAB, B. Keuchhusten ist ein gramnegatives Bakterium und der Erreger des Keuchhustens, einer hochansteckenden Atemwegserkrankung [59]. Das metabolische Netzwerk dieses Pathogens wurde kürzlich rekonstruiert und umfasst 1672 einzigartige Reaktionen, 1255 Metaboliten und 770 Gene. Wie B. Keuchhusten, Pseudomonas putida ist ebenfalls ein gramnegatives Bakterium, aber das Interesse an dieser Spezies beruht auf ihrer Fähigkeit als Zellfabrik, eine Vielzahl von Massen- und Feinchemikalien von industrieller Bedeutung herzustellen [60]. Sein metabolisches Netzwerk umfasst 1069 einzigartige Reaktionen, 987 Metaboliten und 962 Gene. Während L. plantarum und B. Keuchhusten sind das Hauptthema in den Netzvergleichen, P. putida wurde als von uns unabhängig entwickeltes Modell verwendet, um die mit den beiden vorherigen Arten erhaltenen Tendenzen zu validieren.

Insgesamt wurden 29 Netzwerke für L. plantarum, 27 für B. Keuchhusten, und 27 für P. putida. Die spezifischen Eingaben und Parameter zum Erstellen jedes Netzwerks finden Sie in Zusatzdatei 1: Datei S1. Gene, Metaboliten und Reaktionen wurden aus den SBML-Dateien extrahiert und mit denen des manuell kuratierten Modells verglichen. Der Einfachheit halber ist das manuell kuratierte Modell von L. plantarum, B. Keuchhusten, und P. putida wird im Folgenden als iLP728, iBP1870 bzw. iJP962 bezeichnet.

Vergleich von Gensets

Gene sind die Grundlage, aus der das Genom-Scale-Modell rekonstruiert wird. Wenn ein Gen in eine metabolische Rekonstruktion einbezogen wird, gibt es mindestens eine biochemische Reaktion, die mit diesem Gen verbunden ist. Wenn ein Gen nicht in der Rekonstruktion enthalten ist, konnte das Rekonstruktionswerkzeug entweder kein orthologes Gen in der Referenzdatenbank finden oder es wurde ein orthologes Gen gefunden, aber mit diesem Gen ist keine biochemische Reaktion verbunden. Gensets sind interessant zu vergleichen, denn wenn ein im manuell kuratierten Modell vorhandenes Gen in einem Rekonstruktionsentwurf fehlt, könnte dies erklären, warum einige biochemische Reaktionen im Entwurf fehlen. Wenn alternativ ein Gen im manuell kuratierten Modell fehlt, aber in einem Rekonstruktionsentwurf vorhanden ist, könnte dies das Vorhandensein von Reaktionen erklären, die in der Rekonstruktion nicht enthalten sein sollten. Darüber hinaus sind Gensets zwischen Rekonstruktionen einfach zu vergleichen, da die Genidentifikatoren in allen Fällen gleich sind (das Locus-Tag in der Genom-Annotation) und somit im Gegensatz zu Metaboliten und Reaktionen kein kartierungsbezogener Bias im Vergleich besteht.

Um zu beurteilen, wie ähnlich die Entwurfsnetzwerke den entsprechenden manuell kuratierten Netzwerken waren, berechneten wir die Jaccard-Distanz (JD) sowie das Verhältnis zwischen dem Anteil abgedeckter Gene und dem Anteil zusätzlicher Gene (R) (Zusatzdatei 1: Tabellen S4–S7). Die JD wurde zuvor verwendet, um den Abstand zwischen metabolischen Rekonstruktionen auf Genomskala zu messen, basierend auf Reaktionssätzen [61] hier haben wir sie auch angewendet, um Rekonstruktionen in Bezug auf Gene und Metaboliten zu vergleichen. Wir riefen an JDg, JDR, und JDm zum JD zwischen zwei Rekonstruktionen, wenn sie in Bezug auf Gene, Reaktionen bzw. Metaboliten verglichen werden. Analog nannten wir Rg, RR, und Rm zum R wenn Rekonstruktionen in Bezug auf Gene, Reaktionen bzw. Metaboliten verglichen werden. Allgemein ausgedrückt ist ein Wert von 0 im JD bedeutet, dass die Netzwerke identisch sind und ein Wert von 1 bedeutet, dass die Netzwerke kein Element teilen. Für die R, höhere Werte spiegeln eine höhere Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Netzwerk wider und niedrigere Werte spiegeln eine geringere Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Netzwerk wider.

Die Werte im JDg reichte von 0,38 bis 0,60 in L. plantarum und von 0,43 bis 0,67 Zoll B. Keuchhusten (Zusatzdatei 1: Tabellen S4 und S5), während Werte in der Rg reichte von 1,18 bis 13,16 in L. plantarum und von 0,84 bis 3,52 Zoll B. Keuchhusten (Zusatzdatei 1: Tabellen S6 und S7). Obwohl die Ähnlichkeit der generierten Entwurfsnetzwerke für L. plantarum als für B. Keuchhusten, haben wir festgestellt, dass es davon abhängt, welche Metrik analysiert wird. Mit Ausnahme eines Netzwerks ist die Rg zeigte, dass alle Netzentwürfe von L. plantarum waren iLP728 ähnlicher als die Entwurfsnetzwerke von B. Keuchhusten auf iBP1870, unter Verwendung der analogen Parametereinstellungen. Im Gegensatz dazu ist die JDg zeigte, dass AuReMe, ModelSEED, RAVEN und Merlin Entwurfsnetzwerke von L. plantarum die iLP728 ähnlicher sind als die Entwurfsnetzwerke von B. Keuchhusten in Bezug auf iBP1870, und dass CarveMe, MetaDraft und Pathway Tools Entwurfsnetzwerke etwas ähnlicher für . erzeugten B. Keuchhusten. Im Allgemeinen sind ähnliche Werte von JDg und Rg wurden erhalten für P. putida (Zusätzliche Datei 1: Datei S3).

Außerdem haben wir beim Sortieren der Werte beider Metriken festgestellt, dass die JDg Bestellung entspricht nicht der mit der Rg. Das Niedrigste JDg unter den Entwürfen für Rekonstruktionen für L. plantarum wurde in dem mit AuReMe generierten Netzwerk erhalten, wenn der grampositive Satz von Schablonen verwendet wurde für B. Keuchhusten, es wurde mit MetaDraft erhalten. Im Gegensatz dazu ist der höchste Rg unter den Entwürfen für Rekonstruktionen für L. plantarum wurde in dem mit AuReMe generierten Netzwerk nur erhalten, wenn Lactococcus lactis wurde als Vorlage für verwendet B. Keuchhusten, es wurde mit MetaDraft erhalten, als Escherichia coli Vorlage verwendet wurde.

Obwohl die Ähnlichkeitsbewertungen für beide Metriken nicht ganz konsistent sind, wurden einige Trends beobachtet. Die Netzwerke, die in Bezug auf die Gene den manuell kuratierten Modellen ähnlicher sind, wurden von MetaDraft, AuReMe und RAVEN generiert (Abb. 2). Da Parametereinstellungen und Eingaben jedoch einen großen Einfluss auf die Ähnlichkeitsbewertungen haben, stellt die Verwendung dieser Tools nicht automatisch sicher, dass ein Netzwerkentwurf erhalten wird, der in Bezug auf die Gene einem manuell kuratierten Modell ähnelt. Dies gilt insbesondere für RAVEN, das auch einige Netzwerke mit hohen JDg und tief Rg punktet. Die gleichen Trends wurden für P. putida (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2).

Jaccard-Distanz versus Verhältnis zwischen Abdeckung und zusätzlichen Genen für Entwurfsrekonstruktionen. Wir haben die Jaccard-Distanz und das Verhältnis verwendet, um die Ähnlichkeit zwischen den Entwurfsrekonstruktionen und den entsprechenden manuell kuratierten Modellen zu messen, in diesem Fall bei der Analyse der Netzwerke in Bezug auf Gene. Entwurfsrekonstruktionen für Lactobacillus plantarum und Bordetella pertussis sind in Panels dargestellt ein und B, bzw. In beiden Fällen befinden sich die Netzwerke, die den manuell kuratierten Modellen ähnlicher sind, oben links in jedem Plot. Daher wurden die Entwurfsrekonstruktionen, die den manuell kuratierten Modellen ähnlicher sind, von AuReMe, MetaDraft und RAVEN erstellt

Wir analysierten außerdem den Prozentsatz der Gene, die in den manuell kuratierten Modellen abgedeckt sind, und den Prozentsatz der Gene, die nicht in den manuell kuratierten Modellen enthalten sind, um Unterschiede in zu erklären Rg. Für alle Arten beobachteten wir eine große Variation in beiden Variablen (Abb. 3, 4 und Zusatzdatei 1: Abbildung S7). Unter den fünf Netzwerken von L. plantarum mit der höchsten Abdeckung wurden zwei mit AuReMe und drei mit RAVEN for . erstellt B. Keuchhusten, vier wurden mit RAVEN und einer mit CarveMe erstellt. Die mit RAVEN erstellten Netzwerke, die den höchsten Prozentsatz an Genen wiedererlangten, fügten jedoch auch eine große Anzahl von Genen hinzu, die in den manuell kuratierten Modellen nicht vorhanden waren, wodurch die Werte in den Rg. Außerdem haben AuReMe und MetaDraft konservative Draft-Netzwerke mit der geringsten Anzahl zusätzlicher Gene erstellt, was die höheren Werte in den Rg. Schließlich erstellten Tools wie ModelSEED, Pathway Tools und Merlin konsequent Rekonstruktionen mit Genabdeckungen, die nicht die höchsten Werte erreichten (im Vergleich zu anderen Netzwerken) und fügten eine relativ große Anzahl von Genen hinzu, die in den manuell kuratierten Modellen nicht vorhanden sind, was erklärt, warum sie hatten niedrigere Werte in der Rg.

Überlappung von Genen in Entwurfsrekonstruktionen für Lactobacillus plantarum mit denen im manuell kuratierten Modell. Insgesamt wurden 29 Netzwerke mit 7 Tools rekonstruiert (CarveMe: CA MetaDraft: MD AuReMe: AU Pathway Tools: PT ModelSEED: MS RAVEN: RA Merlin: ME). Für jedes Werkzeug wurden mit unterschiedlichen Parametereinstellungen mehrere Rekonstruktionen generiert, die mit unterschiedlichen Subindizes dargestellt werden. Zahlen innerhalb der Balken stellen Prozentsätze in Bezug auf die Gesamtzahl der Gene in iLP728 dar. Die Abdeckung (blaue Balken) reichte von 49,7 bis 87,8%, während der Anteil zusätzlicher Gene (gelbe Balken) von 4,3 bis 65,0% reichte. Die meisten der nicht gewonnenen Gene (dunkelgrüne Balken) beziehen sich auf sehr spezifische Stoffwechselfunktionen, die bei der manuellen Kuration von iLP728 sorgfältig eingebaut wurden, wie Polysaccharid-Biosynthese und -Transport

Überlappung von Genen in Entwurfsrekonstruktionen für Bordetella pertussis mit denen im manuell kuratierten Modell. Insgesamt wurden 27 Netzwerke mit 7 Tools rekonstruiert (CarveMe: CA MetaDraft: MD AureME: AU Pathway Tools: PT RAVEN: RA Merlin: ME). Für jedes Werkzeug wurden mit unterschiedlichen Parametereinstellungen mehrere Rekonstruktionen generiert, die mit unterschiedlichen Subindizes dargestellt werden. Zahlen innerhalb der Balken stellen Prozentsätze in Bezug auf die Gesamtzahl der Gene in iBP1870 dar. Die Abdeckung (blaue Balken) reichte von 49,4 bis 83,0%, während der Anteil zusätzlicher Gene (gelbe Balken) von 18,6 bis 99,0% reichte. Die nicht gewonnenen Gene (dunkelgrüne Balken) stehen im Zusammenhang mit sehr spezifischen Stoffwechselfunktionen, die bei der manuellen Kuration von iBP1870 sorgfältig berücksichtigt wurden, wie z. B. Transport und Ferredoxin/Thioredoxin-bezogene Reaktionen

Zum L. plantarum Wir fanden mit allen Tools insgesamt 1613 verschiedene Gene, von denen 885 in iLP728 nicht vorhanden waren. Zum B. Keuchhusten, wurden 1888 verschiedene Gene gefunden, von denen 1118 in iBP1870 nicht vorhanden waren. Außerdem wurden in allen Entwurfsnetzwerken für iLP728 79 Gene korrekt vorhergesagt, für iBP1870 waren dies 131 Gene. Die Verteilung der mit diesen Genen assoziierten Stoffwechselwege ist bei beiden Spezies breit, wobei der Kohlenhydratstoffwechsel und der Aminosäurestoffwechsel mehr als 50 % der Stoffwechselprozesse ausmachen (Zusatzdatei 1: Tabellen S8 und S9). Außerdem wurden 35 und 39 Gene in keinem Netzwerk für iLP728 bzw. iBP1870 wiedergefunden. Die mit diesen Genen verbundenen Stoffwechselfunktionen waren sehr spezifisch, wobei die Polysaccharid-Biosynthese (63%) und der Transport (22%) ganz oben auf der Liste standen L. plantarum und mit Transport (41%) und Ferredoxin/Thioredoxin-bezogenen Reaktionen (30%) für B. Keuchhusten. Endlich ein Gen in L. plantarum, das mit der Riboflavin-Biosynthese assoziiert war, wurde von allen Netzwerken gefunden, war aber in iLP729 nicht vorhanden. Zum B. Keuchhusten, wurden drei solcher Gene gefunden. Diese Gene wurden mit dem alternativen Kohlenstoffmetabolismus und der Zellhüllenbiosynthese in Verbindung gebracht.

Vergleich der Reaktionssätze

Gene und biochemische Reaktionen sind innerhalb einer Rekonstruktion durch Gen-Protein-Reaktion (GPR)-Assoziationen verbunden. Gene und Reaktionsbeziehungen werden jedoch letztendlich in Rekonstruktionen als boolesche Regeln dargestellt, die als Gen-Reaktionsregeln bekannt sind. Mit Ausnahme von Austausch-, Senken-, Nachfrage-, Spontan- und einigen Transportreaktionen (z. B. solchen, die durch Diffusion gesteuert werden) hat jede Reaktion eine definierte Gen-Reaktions-Regel in der Referenzdatenbank, die von jedem Rekonstruktionswerkzeug verwendet wird. Wenn während des Rekonstruktionsprozesses orthologe Gene gefunden werden, die die Gen-Reaktions-Regel einer bestimmten Reaktion erfüllen, wird diese Reaktion in den Rekonstruktionsentwurf aufgenommen.Andere Reaktionen können dem Rekonstruktionsentwurf basierend auf anderen Kriterien hinzugefügt werden, wie etwa der Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Stoffwechselweg in dem untersuchten Mikroorganismus existiert oder der Notwendigkeit, bestimmte Lücken im Netzwerk zu schließen, um Biomasse zu produzieren. Dennoch erwarten wir, dass Netzwerke, die sich in Bezug auf die Gene ähnlicher sind, auch in Bezug auf die Reaktionen ähnlicher sein werden.

Im Gegensatz zu Genen werden Reaktionen jedoch in verschiedenen Datenbanken mit unterschiedlichen Identifikatoren gekennzeichnet. Somit kann dieselbe Reaktion mit zwei unterschiedlichen Identifikatoren in zwei unterschiedlichen Datenbanken gespeichert werden. Während des Rekonstruktionsprozesses werden Reaktionen aus der Referenzdatenbank zum Rekonstruktionsentwurf hinzugefügt, und Werkzeuge, die unterschiedliche Datenbanken verwenden, erzeugen Rekonstruktionen, die Reaktionen mit unterschiedlichen Identifikatoren umfassen. Wir haben daher MetaNetX [62] verwendet, um Reaktionen zwischen Rekonstruktionen abzubilden, die mit verschiedenen Datenbanken erstellt wurden. Bei diesem Ansatz wurden Reaktionen anhand ihrer Bezeichner verglichen (Groß-/Kleinschreibung beachtender String-Vergleich). Darüber hinaus haben wir Netzwerke mit Reaktionsgleichungen verglichen, d. h. wir haben Reaktionen mit ihren Attributen anstelle ihrer Identifikatoren verglichen. Bei diesem zweiten Ansatz gingen wir davon aus, dass zwei Reaktionen gleich sind, wenn sie dieselben Metaboliten mit denselben stöchiometrischen Koeffizienten aufweisen. Einige Ausnahmen wurden gemacht, um auch Reaktionen abzugleichen, die sich nur in der Protonenstöchiometrie unterscheiden (aufgrund unterschiedlicher Ladungen der Metaboliten) oder um Reaktionen abzufangen, die in die entgegengesetzte Richtung geschrieben sind (Reaktanten auf der Seite der Produkte). Wir haben uns entschieden, Austauschreaktionen der Vollständigkeit halber in den Netzwerkvergleich einzubeziehen, da CarveMe und ModelSEED sie automatisch generieren, da es sich um nicht genassoziierte Reaktionen handelt. Dies senkt automatisch die Werte für die anderen Tools, die keine Austauschreaktionen hinzufügen. Bei den meisten Netzwerken führte der Vergleich durch Reaktionsidentifikatoren zu einem geringeren Abdeckungsprozentsatz als durch den Vergleich der Reaktionsgleichungen (Zusatzdatei 1: Tabellen S10 und S11). Diese geringere Abdeckung war auf einige fehlende Beziehungen zwischen verschiedenen Datenbanken in MetaNetX zurückzuführen, die wir beim Vergleich mit den Reaktionsgleichungen entdeckten. Insgesamt wurden mit dem zweiten Ansatz automatisch 220 neue einzigartige Reaktionssynonympaare für beide Spezies entdeckt (Zusatzdatei 1: Tabelle S12). Um die fehlenden Beziehungen in MetaNetX weiter zu überwinden, wurde ein halbautomatischer Algorithmus entwickelt, um die Entdeckung neuer Metabolit-Synonyme zu unterstützen. Insgesamt wurden 187 neue Metabolitensynonyme entdeckt (Zusatzdatei 1: Tabelle S13), was zur Entdeckung von 282 zusätzlichen Reaktionssynonymen führte (Zusatzdatei 1: Tabelle S14).

Der Vergleich durch Reaktionsgleichungen zeigte eine große Variation in der Reaktionsabdeckung und dem Prozentsatz zusätzlicher Reaktionen für alle Spezies (Abb. 5 und 6 und Zusatzdatei 1: Abbildung S8). Darüber hinaus beobachteten wir bei den mit RAVEN (KEGG), ModelSEED und Merlin erstellten Netzwerken eine beträchtliche Anzahl von Reaktionen mit einer teilweisen Übereinstimmung mit dem manuell kuratierten Modell. Diese partiellen Übereinstimmungen ergeben sich aus Unterschieden in der Protonenstöchiometrie, was auf die Existenz von Metaboliten mit einer anderen Ladung als denen in den manuell kuratierten Modellen hinweist. Im Gegensatz zum Genset-Vergleich, bei dem die Abdeckung bei 88% und 83% lag, konnten wir nur eine maximale Abdeckung von 72% und 58% beobachten, für L. plantarum und B. Keuchhusten, auch wenn Teilübereinstimmungen berücksichtigt werden. Wir haben die Reaktionen, die nicht wiedergefunden wurden, in verschiedene Kategorien eingeteilt (Zusatzdatei 1: Abbildungen S3–S6) und fanden heraus, dass die geringe Reaktionsabdeckung hauptsächlich durch drei Gründe erklärt werden kann.

Überlappung der Reaktionen in Entwurfsrekonstruktionen für Lactobacillus plantarum mit denen im manuell kuratierten Modell. Insgesamt wurden 29 Netzwerke mit 7 Tools (CarveMe: C, MetaDraft: D, AuReMe: A, Pathway Tools: P, ModelSEED: S, RAVEN: R, Merlin: E) rekonstruiert. Für jedes Werkzeug wurden mit unterschiedlichen Parametereinstellungen mehrere Rekonstruktionen generiert, die mit unterschiedlichen Subindizes dargestellt werden. Zahlen innerhalb der Balken stellen Prozentsätze in Bezug auf die korrigierte Anzahl von Reaktionen in iLP728 dar, d. h. die Gesamtzahl der Reaktionen in iLP728 abzüglich der Biomasse-bezogenen Reaktionen (hellgrün). Wir beobachteten eine große Variation in der Abdeckung (blaue Balken) und dem Prozentsatz zusätzlicher Reaktionen (gelbe Balken). Darüber hinaus enthielt eine beträchtliche Anzahl von Reaktionen in den mit ModelSEED, RAVEN (KEGG) und Merlin aufgebauten Netzwerken eine andere Stöchiometrie für Protonen als die in iLP728 (dunkelgrüne Balken).

Überlappung der Reaktionen in Entwurfsrekonstruktionen für Bordetella pertussis mit denen im manuell kuratierten Modell. Insgesamt wurden 27 Netzwerke mit 7 Tools (CarveMe: C, MetaDraft: D, AuReMe: A, Pathway Tools: P, ModelSEED: S, RAVEN: R, Merlin: E) rekonstruiert. Für jedes Werkzeug wurden mit unterschiedlichen Parametereinstellungen mehrere Rekonstruktionen generiert, die mit unterschiedlichen Subindizes dargestellt werden. Die Zahlen innerhalb der Balken stellen Prozentsätze in Bezug auf die korrigierte Anzahl von Reaktionen in iBP1870 dar, d. h. die Gesamtzahl der Reaktionen abzüglich der Biomasse-bezogenen Reaktionen (hellgrün). Wir beobachteten eine große Variation in der Abdeckung (blaue Balken) und dem Prozentsatz zusätzlicher Reaktionen (gelbe Balken). Darüber hinaus enthielt eine beträchtliche Anzahl von Reaktionen in den mit MODELSEED, RAVEN (KEGG) und Merlin aufgebauten Netzwerken eine andere Stöchiometrie für Protonen als die in iBP1870 (grüne Balken im Entwurf).

Erstens enthalten beide manuell kuratierten Modelle eine beträchtliche Menge an Reaktionen ohne Genassoziationen, einschließlich spontaner, Transport-, Austauschreaktionen, Reaktionen, die während der manuellen Lückenfüllung hinzugefügt werden, und Biomasse-bezogene Reaktionen. Zum L. plantarum und B. pertussis gibt es 241 bzw. 657 solcher Reaktionen, die 31% bzw. 39% des Netzwerks darstellen. Mit Ausnahme von CarveMe und ModelSEED, die eine automatische Lückenfüllung durchführen können, sind alle anderen Tools nicht in der Lage, die meisten nicht-genassoziierten Reaktionen wiederherzustellen, hauptsächlich weil alle Tools Reaktionen basierend auf genomischen Beweisen vorhersagen. Somit weisen für beide Spezies etwa 50 % der Reaktionen, die nicht wiedergefunden wurden, im manuell kuratierten Modell keine Gen-Reaktionsassoziationen auf. Ohne Berücksichtigung von Wechselkursreaktionen erhöhte sich die Abdeckung ungefähr um 15% bzw. 12% für L. plantarum und B. Keuchhusten, mit Ausnahme von CarveMe und ModelSEED. Zweitens fehlen bei etwa 30 % der nicht gefundenen Reaktionen mindestens 50 % der zugehörigen Gene in den Rekonstruktionsentwürfen. Drittens ist die spezifische Substrat- und Cofaktor-Nutzung selbst dann schwer vorherzusagen, wenn alle Gene, die mit einer bestimmten Reaktion assoziiert sind, wiedergefunden werden. Oft sagen die Tools die richtige Stoffwechselaktivität voraus, aber sie versagen bei der Vorhersage des spezifischen Substrats, das in den manuell kuratierten Modellen verwendet wird. Wir haben eine Sammlung von Klartextdateien mit Hunderten von Beispielen erstellt, in denen die zugehörigen Gene vom Tool wiederhergestellt wurden, die Reaktion jedoch aufgrund unterschiedlicher Substrate nicht der im manuell kuratierten Modell entspricht (siehe Abschnitt Verfügbarkeit von Daten für Details).

Wir haben wieder berechnet, dass JDR und der RR um zu beurteilen, wie ähnlich die Netzwerke waren, in diesem Fall in Bezug auf die Reaktionen. Die erste Beobachtung, die wir gemacht haben, ist, dass jede Rekonstruktion unabhängig von der Metrik und für beide Arten weniger ähnlich in Bezug auf die Reaktionen als in Bezug auf die Gene war, was mit der Abnahme der Abdeckung vereinbar ist. Darüber hinaus ist, wie beim Genvergleich, die Reihenfolge der Punktzahlen für die Rg und der RR nach Größe war nicht dasselbe. Wenn wir die Ähnlichkeitsbewertungen für Reaktionssets mit denen für Gensets vergleichen, sehen wir fast den gleichen Trend, jedoch mit einem Unterschied. AuReMe und MetaDraft sind immer noch die Tools mit den besten Ähnlichkeitswerten, aber jetzt steigt CarveMe in der Liste der Scores auf und RAVEN geht zurück (Abb. 7, Zusätzliche Datei 1: Tabellen S4–S7). Dies galt insbesondere für B. Keuchhusten wo zwei mit CarveMe rekonstruierte Netzwerke die ersten beiden Plätze in der JDR aufführen. Fast der gleiche Trend wurde für P. putida (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2) sind die höheren Punktzahlen für RAVEN anstelle von CarveMe der Hauptunterschied.

Jaccard-Abstand versus Verhältnis zwischen Abdeckung und Prozentsatz zusätzlicher Reaktionen bei Entwurfsrekonstruktionen. Wir haben die Jaccard-Distanz und das Verhältnis verwendet, um die Ähnlichkeit zwischen den Entwurfsrekonstruktionen und dem entsprechenden manuell kuratierten Modell zu messen, in diesem Fall, wenn die Netzwerke in Bezug auf Reaktionen analysiert werden. Entwurfsrekonstruktionen für Lactobacillus plantarum und Bordetella pertussis sind in Panels dargestellt ein und B, bzw. In beiden Fällen befinden sich die Netzwerke, die den manuell kuratierten Modellen ähnlicher sind, auf der oberen linken Seite des Diagramms. Daher wurden die Rekonstruktionsentwürfe, die den manuell kuratierten Modellen in Bezug auf die Reaktionen ähnlicher sind, von AuReMe, MetaDraft und CarveMe erstellt

Obwohl RAVEN einige Rekonstruktionen mit hoher Ähnlichkeit zu den manuell kuratierten Modellen generierte, war dies nicht der Fall für die Ähnlichkeit der Reaktionssätze. Wir haben daher eines der mit RAVEN rekonstruierten Netzwerke genauer analysiert, das für beide Arten bei beiden Metriken durchweg in der Top-5-Liste war. Wir haben einen Hauptgrund für den Leistungsabfall gefunden. Das analysierte Netzwerk wurde basierend auf KEGG erstellt, sodass Metaboliten nicht als intrazellulär oder extrazellulär markiert wurden. Daher waren keine Transport- oder Austauschreaktionen vorhanden. Obwohl es Funktionen gibt, um diese Art von Reaktionen in RAVEN zu integrieren, wird dies als manuelle Kuration angesehen, da Benutzer angeben müssen, welche Verbindungen transportiert werden sollen, und wir hier nur getestet haben, wie viel Arbeit es kosten würde, diese Netzwerkentwürfe in hochwertige Rekonstruktionen zu verwandeln .

Wir analysierten weiterhin Reaktionen, die in allen Rekonstruktionen vorhanden waren und fehlten, um zu verstehen, mit welcher Art von Stoffwechselprozessen sie zusammenhängen. In allen Entwurfsnetzwerken wurden immer 66 Reaktionen in iLP728 und 98 in iBP1870 gefunden. In Übereinstimmung mit der Gensatzanalyse sind die damit verbundenen Stoffwechselprozesse hauptsächlich der Aminosäurestoffwechsel, der Nukleotidstoffwechsel und der Kohlenhydratstoffwechsel (Zusatzdatei 1: Tabellen S15 und S16). Darüber hinaus wurden 165 Reaktionen in iLP1870 und 598 in iBP1870 von keinem Tool gefunden. Bei beiden Arten waren etwa 10 % dieser Reaktionen Biomasse-bedingte Reaktionen und der Rest waren die meisten Austauschreaktionen, Transportreaktionen ohne Genassoziationen und Reaktionen in anderen Kategorien, die nicht in der BIGG-Datenbank enthalten waren (Zusätzliche Datei 1: Tabellen S17 und S18). In allen Netzwerkentwürfen von wurde nur eine Reaktion gefunden, die mit dem Aminosäurestoffwechsel verbunden ist L. plantarum aber nicht in iLP728 wurden in allen Entwurfsnetzwerken vier Reaktionen gefunden, die hauptsächlich mit dem Kohlenhydratstoffwechsel in Zusammenhang stehen, aber nicht in iBP1870.

Vergleich von Metaboliten-Sets

Andere wichtige Elemente in metabolischen Rekonstruktionen sind Metaboliten. Wenn während des Rekonstruktionsprozesses eine biochemische Reaktion zum Entwurfsnetzwerk hinzugefügt wird, werden auch alle Reaktanten und Produkte zum Netzwerk hinzugefügt. Da die Entwürfe metabolischer Netzwerke mit unterschiedlichen Tools erstellt wurden, von denen jedes seinen eigenen Satz von Datenbanken nutzte, hatten sie unterschiedliche Identifikatoren für denselben Metaboliten. Für diejenigen Netzwerke, deren Identifikatoren sich von BIGG unterscheiden, haben wir wieder MetaNetX und unser eigenes zusätzliches Wörterbuch verwendet, um Metaboliten zu kartieren.

Wir haben die berechnet JDm und der Rm um die Ähnlichkeit der Metabolitensätze zu beurteilen. Für fast alle Entwurfsnetze beider Arten sind die Werte in den JDm waren zwischen den JDg und der JDR wir fanden das gleiche für die Rm (Zusatzdatei 1: Tabellen S4–S7). Auch bei der Sortierung der Netzwerke nach ihren metrischen Scores fanden wir die gleichen Trends wie bei Reaktionssets. Den ersten Platz in den Listen belegten Netzwerke, die entweder mit MetaDraft, AureMe oder CarveMe rekonstruiert wurden. Darüber hinaus rekonstruierte MetaDraft unabhängig von Metrik und Art 40 % der Netzwerke unter den Top 5.

Zweihundertsechs Metaboliten in iLP728 und 271 in iBP1870 wurden in allen Entwurfsnetzwerken korrekt vorhergesagt. Diese Metaboliten waren in beiden Fällen hauptsächlich mit dem Kohlenhydratstoffwechsel und dem Aminosäurestoffwechsel verbunden (Zusatzdatei 1: Tabellen S19 und S20). 81 Metaboliten in iLP728 und 278 in iBP1870 wurden in keinem Netzwerk wiedergefunden. Davon bezogen sich 16 auf die Biomasse von L. plantarum und 16 weitere waren nicht in der BIGG-Datenbank. Für iBP1870 waren 44 Biomasse-bezogen und 47 weitere waren nicht in der BIGG-Datenbank enthalten. Schließlich wurden 9 und 11 Metaboliten in allen Netzwerken gefunden, aber sie waren nicht in iLP728 bzw. iBP1870 vorhanden. Hauptsächlich wurden sie mit dem Stoffwechsel von Cofaktoren und Vitaminen sowie dem Aminosäurestoffwechsel im Fall von in Verbindung gebracht L. plantarum und Kohlenhydratstoffwechsel und Glykanbiosynthese bei B. Keuchhusten (Zusätzliche Datei 1: Tabellen S21 und S22).

Topologische Analyse

Um die topologischen Merkmale jedes Netzwerks zu vergleichen, haben wir die Anzahl der Dead-End-Metaboliten, die Anzahl der Orphan-Reaktionen, die Anzahl der nicht verbundenen Reaktionen und andere Metriken berechnet (Zusatzdatei 1: Tabellen S23 und S24).

iLP728 hat 113 Dead-End-Metaboliten, während iBP1870 59 hat. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass viele Stoffwechselwege unterbrochen sind L. plantarum die zum Beispiel bei vielen Aminosäuren zu bekannten Auxotrophien führen [42, 43]. Mit Ausnahme von CarveMe generierten alle Tools Netzwerke mit einer hohen Anzahl von Dead-End-Metaboliten, die von 244 bis 999 und von 379 bis 976 reichten L. plantarum und B. Keuchhusten, bzw. Die geringe Anzahl von Dead-End-Metaboliten in CarveMe wird durch die Verwendung eines manuell kuratierten universellen Modells als Vorlage verursacht, dem keine Dead-End-Metaboliten fehlen.

Ohne Berücksichtigung von Austausch- und Nachfrage-/Senken-Reaktionen wurden in iLP728 bzw. iBP1870 127 und 449 Reaktionen ohne Genassoziationen (so genannte Orphan-Reaktionen) gefunden. Diese Reaktionen sind hauptsächlich mit dem Stoffwechsel von Transportaminosäuren und der Bildung von Biomasse verbunden. MetaDraft, AuReMe und RAVEN lieferten metabolische Netzwerke ohne verwaiste Reaktionen. Diese Tools umfassen nur Reaktionen mit genomischer Evidenz und andere, denen diese Unterstützung fehlt, sind nicht enthalten. ModelSEED lieferte Netzwerke mit einer geringen Anzahl von Orphan-Reaktionen, die mit Austauschreaktionen zusammenhängen. Im Gegensatz dazu lieferten CarveMe, Pathway Tools und Merlin Netzwerke mit einer deutlich größeren Anzahl verwaister Reaktionen (von 66 bis 491 in .). L. plantarum und von 115 bis 736 in B. Keuchhusten). Für CarveMe liegt dies an der Einbeziehung von Transport- und Spontanreaktionen sowie an Reaktionen, die zur Erzeugung von Biomasse (durch Lückenfüllung) für Pathway-Tools erforderlich sind, an der Addition von Reaktionen, um wahrscheinliche Pfade und Spontanreaktionen abzuschließen, und für Merlin , dies ist ausschließlich auf spontane Reaktionen zurückzuführen.


Genome Editing in der menschlichen Leber: Fortschritte und translationale Überlegungen

Die auf die Leber ausgerichtete Genom-Editierung bietet die Aussicht auf einen lebenslangen therapeutischen Nutzen nach einer einzigen Behandlung und wird konventionelle Ansätze zur Gen-Addition schnell verdrängen. Die Kombination von Fortschritten bei der lebergerichteten Genübertragung mit Genome Editing-Technologie macht dies nicht nur machbar, sondern in naher Zukunft realistisch. Es müssen jedoch noch wichtige Herausforderungen angegangen werden. Dazu gehören das Erreichen therapeutischer Ebenen der Editierung, insbesondere in vivo, die Vermeidung von Off-Target-Effekten auf das Genom und die potenziellen Auswirkungen einer bereits bestehenden Immunität gegen von Bakterien stammende Nukleasen, wenn sie zur Verbesserung der Editierungsraten verwendet werden. In diesem Kapitel skizzieren wir die einzigartigen Eigenschaften der Leber, die sie zu einem attraktiven Ziel für die Genom-Editierung machen, den Einfluss der Leberbiologie auf die therapeutische Wirksamkeit und krankheitsspezifische Herausforderungen, einschließlich der Frage, ob der Ansatz auf eine zellautonome oder nichtzellautonome Erkrankung abzielt . Wir diskutieren auch Strategien, die erfolgreich eingesetzt wurden, um Ergebnisse der Genom-Editierung in der Leber zu erzielen, und sprechen translationale Überlegungen an, wenn die Genome-Editing-Technologie in die Klinik Einzug hält.

Schlüsselwörter: AAV CRISPR/Cas9 Genkorrektur Genetische Lebererkrankung Genome Editing OTC-Mangel der Leber Benutzerdefinierte Nuklease.


Modellieren von PIDs mit Genome Editing

In vitro Modelle

Auch wenn das Gen-Targeting mit gentechnisch veränderten Endonukleasen noch nicht reif für die klinische Anwendung ist, bietet es bereits ein wertvolles Werkzeug, um Krankheiten auf zellulärer Ebene zu modellieren. CRISPR/Cas9 hat sich bei der Generierung von Knockout-Zelllinien wie oben beschrieben als besonders effizient erwiesen, nachdem ein DSB in die genomische Region eingeführt wurde, die der Protospacer-Sequenz der gRNA entspricht, verwendet die Zelle entweder HDR oder NHEJ, um den Defekt zu reparieren . NHEJ kann zu Indels führen, die wiederum Frameshifts und das Auftreten vorzeitiger Stoppcodons verursachen können. Eine so erzeugte Knockout-Zelle kann klonal zu einer Zelllinie expandiert werden, die für Modellstudien verwendet werden kann. Eine nützliche Eigenschaft des CRISPR/Cas9-Systems ist außerdem, dass mehrere Gene gleichzeitig ausgeknockt werden können, wenn mehrere gRNAs zusammen verwendet werden (Multiplexing). Ein besonderer Vorteil im Vergleich zur RNA-Interferenz besteht darin, dass CRISPR/Cas9 verwendet werden kann, um auf Regionen im nicht-kodierenden Genom abzuzielen [z. B. Promotor- und Enhancer-Regionen (98�)].

Das Aufkommen der Next-Generation-Sequenzierung hat eine neue Welle der Entdeckung neuer angeborener Immunitätsfehler ausgelöst (102). Die Fähigkeit, patientenspezifische iPSCs zu korrigieren oder umgekehrt patientenspezifische Mutationen in eine Wildtyp-iPSC-Linie mithilfe von Endonukleasen einzuführen, stellt ein unschätzbares Werkzeug dar, um die Pathogenität neu entdeckter Mutationen nachzuweisen und Einblicke in Krankheitsmechanismen in verschiedenen Zelltypen zu gewinnen , abhängig von den Phänotypen der Patienten. Dieser Ansatz ermöglicht es auch, den Beitrag des genetischen Hintergrunds zu den Phänotypen zu untersuchen, die sich aus bestimmten Mutationen ergeben, indem von Patienten abgeleitete iPSCs mit Wildtyp-iPSCs verglichen werden, in die die gleichen Mutationen eingeführt wurden (Abbildung 3). In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden iPSCs von Patienten mit Parkinson-Krankheit, die durch die G2019S-Mutation des LRRK2-Gens verursacht wurde, und von gesunden Kontrollpersonen erzeugt. Beim Vergleich der Genexpressionsmuster des gesamten Genoms fanden die Forscher ein hohes Maß an Heterogenität zwischen den verschiedenen iPSCs-Linien.Als sie jedoch ZFNs verwendeten, um die Mutation in drei der von Patienten stammenden iPSC-Linien zu korrigieren und diese Linien mit den Originallinien verglichen, und als sie die Mutation in eine gesunde Kontrolllinie einführten und diese Linie mit der Originallinie verglichen, waren in Bezug auf die Genexpression viel enger abgestimmt (83). Dies zeigt die Bedeutung des Vergleichs isogener Linien, da Verwechslungen aufgrund von Unterschieden im genetischen Hintergrund minimiert werden.

Figur 3. In vitro Modellieren. (EIN) Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) werden von einem/von Patienten(n) und von einer/von gesunden Kontrolle(n) reprogrammiert. Die iPSCs werden in einen interessierenden Zelltyp differenziert, und die Phänotypen der vom Patienten stammenden Zellen werden mit den Phänotypen der gesunden Kontrollzellen verglichen. Die verglichenen Zellen haben nicht genau den gleichen genetischen Hintergrund (genetisch und epigenetisch nicht übereinstimmend). Dies kann zu Verwechslungen führen. (B) Durch Genome Editing mit gentechnisch veränderten Nukleasen wie ZFNs, TALENs und CRISPR/Cas9 kann eine pathogenetische Mutation in Patientenzellen korrigiert oder in gesunde Kontrollzellen eingebracht und isogene Zelllinien (d. h. identischer genetischer Hintergrund) auf relevante . verglichen werden Phänotypen.

Tiermodelle

Traditionell wurden Tiermodelle durch homologe Rekombination erzeugt: Embryonale Stammzellen (ESCs) werden mit einer hochhomologen DNA-Matrize, die die einzufügende Sequenz enthält, elektroporiert, jedoch ohne Verwendung einer konstruierten Endonuklease, um ein DSB einzuführen. Dieser Ansatz führt zu einer sehr geringen Effizienz und erfordert die Aufnahme eines Antibiotikaresistenzgens in die eingefügte Sequenz zur Selektion von Zellen, in denen HDR aufgetreten ist. ESCs mit der gewünschten inserierten Sequenz werden dann expandiert, in Blastozysten injiziert und anschließend in pseudogestante Weibchen implantiert. Die resultierenden chimären Tiere müssen weiter gezüchtet werden, bis die eingeführte Mutation über die Keimbahn übertragen wird. Mit den derzeit verfügbaren Genom-Editing-Tools kann dieser Prozess stark vereinfacht werden. Durch die Einführung eines DSB an der gewünschten Zielstelle kann eine spezifische Sequenz effizient in ESCs eingeführt werden, ohne dass ein Antibiotikaresistenzgen benötigt wird. Um einen Gen-Knockout zu erzeugen, kann man sich außerdem einfach darauf verlassen, dass NHEJ Indels produziert, die zu Frameshifts und frühen Stop-Codons führen.

In den letzten Jahren wurden viele Tiermodelle erfolgreich mit ZFNs, TALENs oder CRISPR/Cas9 erstellt. TALENs und CRISPR/Cas9 wurden verwendet, um Knockout zu erzeugen Caenorhabditis elegans Modelle durch Injektion der Endonukleasen in die Gonaden (103�). In ähnlicher Weise können kompliziertere Tiermodelle erstellt werden, indem die Endonukleasen in mRNA-Form direkt in Zygoten injiziert werden (Abbildung 4). Im Fall von CRISPR/Cas9 bedeutet dies, dass sowohl Cas9 als auch gRNA in RNA-Form injiziert werden. Knock-in-Modelle können durch Hinzufügen einer DNA-Matrize zum Injektionsgemisch erzeugt werden, normalerweise in Form eines einzelsträngigen DNA-Oligonukleotids. Zebrafischmodelle wurden durch Injektion von ZFNs oder TALENs oder CRISPR/Cas9 direkt in die Zygote generiert (106�). Dies wurde in murinen Zygoten mit ZFNs (110�), TALENs (113, 114) und äußerst effizient mit CRISPR/Cas9 (115�) durchgeführt. Neue Mausmodelle können in wenigen Wochen generiert werden, statt wie bei der herkömmlichen Strategie 1𠄲 Jahre. Mit CRISPR/Cas9 kann die für die Injektionen benötigte spezifische gRNA in einem einfachen eintägigen Verfahren erzeugt werden (118). NSG-Mäuse wurden auf diese Weise effizient erzeugt (119). In anderen Studien wurde der IgM-Locus bei Ratten durch Injektion von ZFNs und TALENs direkt in die Zygoten erfolgreich ausgeschaltet (120, 121). In ähnlicher Weise wurde ein Rattenmodell von X-SCID unter Verwendung von ZFNs erzeugt (122). Die Multiplexing-Kapazität von CRISPR/Cas9 hat es ermöglicht, mehrere Gene gleichzeitig auszuschalten (123). Endonukleasen wurden verwendet, um Knockout-Modelle bei Tieren zu generieren, die zuvor keiner effizienten genetischen Veränderung zugänglich waren: Kaninchen mit IL2RG, RAG1, oder RAG2 Knockout (124�) Hamster mit STAT2 Knockout (128) mutierte Schweine (129�) und am beeindruckendsten Affen mit RAG1 Knockout (132). Diese Art von Tiermodellen werden Krankheitsstudien von beispielloser Komplexität ermöglichen.

Abbildung 4. Schematische Darstellung der Zygoteninjektion mit CRISPR/Cas9. (EIN) Die Injektion von gRNA und Cas9 führt zu Indels, die zu einem Frameshift und einem frühen Stoppcodon führen können, wodurch Knockout (KO)-Mäuse entstehen. (B) Die Zugabe einer hochhomologen DNA-Matrize, die eine spezifische Mutation enthält, führt durch den Prozess der homologiegerichteten Reparatur (HDR) zu Knock-in (KI)-Mäusen. Die Reagenzien werden in das Zytoplasma der Zygote injiziert. Alternativ können diese in den Vorkern der Zygote injiziert werden, aber die zytoplasmatische Mikroinjektion ist einfacher und weniger toxisch.


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Einführung

In den letzten zehn Jahren haben Entwicklungen in der DNA-Sequenzierungstechnologie zu einem Anstieg der Zahl der veröffentlichten eukaryotischen Genome geführt. Der Großteil dieser Genome gehört zu Tieren, Pflanzen und Pilzen, während einzellige Eukaryoten (Protisten) weitgehend fehlen 1 . Dies ist bedauerlich, da Protisten eine enorme Vielfalt an Zellmorphologien, Physiologie und Genetik aufweisen, möglicherweise sogar noch mehr als ihre vielzelligen Verwandten 2 . Obwohl die Zahl der verfügbaren Protistengenome, z.B. 3,4,5 , einigen Gruppen fehlen noch jegliche Genominformationen 6 .

Eine Protistengruppe, von der wir keine genomischen Informationen haben, ist die Grünalgenordnung Dasycladales, deren Arten eine sehr charakteristische Zellmorphologie aufweisen. Obwohl sie einzellig sind und nur einen einzigen Kern haben, können einige Arten eine Länge von mehr als 10 cm erreichen 7 . Acetabularia acetabulum ist die am besten untersuchte Art von Dasycladales. Dieser schirmartige Organismus ist in apikal-basaler Richtung verlängert mit dem wurzelartigen Rhizoide am basalen Ende und einer scheibenförmigen Kappe am apikalen Ende, getrennt durch einen langen Stiel 7,8 .

Die Größe und die hochkomplexe Zellmorphologie, zusammen mit einem großen und ausgeprägten Zellkern, machten Acetabularien ein attraktives Modellsystem für zellbiologische und genetische Studien. Bereits in den 1930er Jahren verwendete Joachim Hämmerling Acetabularien um zu beweisen, dass die zelluläre Morphogenese durch sogenannte „morphogenetische Substanzen“ (später bestätigt als RNA) beeinflusst wurde, die vom Zellkern produziert und an den Rest der Zelle verteilt wurden 9 . Durch Umpflanzen und Austauschen der apikalen und basalen Teile zwischen A. Hüftgelenkpfanne und A. crenulata, beobachtete er, dass sich die Kappe zur Morphologie des basalen Spenders entwickelte, was zeigte, dass das kernhaltige Rhizoide das morphogenetische Schicksal der Zelle kontrollierte 10,11 .

Trotz seiner Popularität und Bedeutung in der frühen Zellbiologie und Genetik ist das Interesse an A. Hüftgelenkpfanne und ihre Schwesterarten gingen gegen Ende der 1990er Jahre zurück. Bisher ist kein Versuch bekannt, das Genom von . zu sequenzieren und zusammenzusetzen A. Hüftgelenkpfanne, oder jede andere dasycladalea-Art. Das Fehlen von Dasycladalea-Genomen und von Protistengenomen im Allgemeinen kann zu einem großen Teil durch die Herausforderung erklärt werden, ausreichende Mengen an genomischer DNA zu erhalten, die für die Sequenzierung erforderlich sind. Die A. Hüftgelenkpfanne Zelle hat einen Lebenszyklus von 3 Monaten, wenn sie in einem sehr nahrhaften Medium kultiviert wird 12 und Kulturen können nicht dicht gezüchtet werden (maximal 25 Algen in 50 ml) 11 . Typische Protokolle zur Erstellung von Bibliotheken für die Sequenzierung des gesamten Genoms hängen von mehreren hundert Nanogramm der eingegebenen DNA ab, was Tausenden von . entspricht A. Hüftgelenkpfanne Individuen für eine einzelne Sequenzierungsprobe. Angesichts der potenziell enormen Größe der A. Hüftgelenkpfanne Genom, wobei das diploide Kerngenom auf Basis von Durchflusszytometriemessungen auf 1,85 pg (ca. 1,8 Gb) geschätzt wird 13 , erhöht dies den Bedarf an DNA-Input weiter.

Um die Herausforderungen des begrenzten DNA-Materials zu lösen, wurden mehrere Methoden zur Amplifikation genomischer DNA entwickelt. Die frühesten Verfahren zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) basierten auf Kurzlängen-PCR-Amplifikationen mit zufälligen oder degenerierten Primern 14,15. Diese Methoden gewannen oft nur kleine Fraktionen der Genome und wurden stark von Verzerrungen beeinflusst, die durch die PCR-Amplifikation 16,17 eingeführt wurden. Die vielversprechendste Entwicklung bei WGA war die Verwendung von Multiple Displacement Amplification (MDA). Dieses Verfahren verwendet die phi29-Polymerase, die DNA mit hoher Genauigkeit kopiert und mehr als 70.000 Nukleotide enthält, ohne von der Matrize abzufallen, was zu großen Abschnitten amplifizierter DNA führt 16,18. Mit der phi29-basierten MDA-Methode sind jedoch mehrere Herausforderungen verbunden. Erstens, da das MDA-Verfahren auf zufälligem Priming beruht, unterscheiden das Priming und die Amplifikation nicht zwischen Ziel- und möglicher kontaminierender DNA in der Probe. De novo Anordnungen können daher eine Herausforderung darstellen, wenn Datenbanken Zielgenome oder kontaminierende Sequenzen fehlen 19 . Zweitens, und wiederum wie PCR-basierte Amplifikationsverfahren, ist MDA auch anfällig für Amplifikationsfehler. Beobachtungen an bakteriellen Genomen, die durch MDA amplifiziert wurden, haben gezeigt, dass bestimmte Genomregionen leichter amplifiziert zu werden scheinen als andere, was zu einer sehr ungleichmäßigen Abdeckung des Genoms führt 19,20,21,22 . MDA-generierte Daten führen daher selten zu einer vollständigen Genomwiederherstellung. López-Escardó et al. 23 verwendet MDA, um das Genom von drei Zellen des Protisten zu amplifizieren Monosiga brevicollis und zeigten eine sehr ungleichmäßige Abdeckung und eine Genomwiederherstellung von 6–36 % aus jeder Zelle bei der Kartierung auf eine Referenzanordnung, und Mangot et al. 24 gewannen beim Zusammenbau von Zellen der Protistengruppe MAST-4 etwa 20% des Genoms. Beide Studien hoben jedoch die Bedeutung der Amplifikation der DNA aus mehreren Zellen hervor, da dies die Gewinnung stark erhöhte 23,24 .

Ein vielversprechendes Verfahren, um mit MDA verbundene Verzerrungen zu reduzieren und dadurch die genomische Abdeckung zu erhöhen, besteht darin, die Amplifikationsreaktion in Tröpfchen in Nanogröße aufzuteilen, ein Verfahren, das als Tröpfchen-MDA (dMDA) 25, 26, 27 bezeichnet wird. Die Idee hinter dMDA besteht darin, die Ziel-DNA-Fragmente in winzige Tröpfchen zu isolieren und dadurch die Konkurrenz beim Auftreffen auf eine Polymerase zu reduzieren, was zu einer gleichmäßigeren Amplifikation und insgesamt verbesserten Genomabdeckung führt. Marcyet al. 25 testeten die Wirkung von Tröpfchen-MDA durch den Nachweis von 10 Genloci aus 14 dMDA- und 12 Standard-MDA-Reaktionen von E coli Zellen und stellte fest, dass alle 10 Loci in allen 14 dMDA-Proben gefunden wurden, aber dass mehrere Loci in mehreren Standard-MDA-Proben fehlten. Außerdem zeigten mit dMDA erzeugte Proben eine viel einheitlichere Amplifikation (gemessen durch Kopien von Loci/ul) als die mit Standard-MDA erzeugten Proben. Ebenso die Genomgewinnung aus der Sequenzierung E coli Zellen wurde von 59% mit Standard-MDA auf 89% mit dMDA erhöht 28 .

Das Ziel der vorliegenden Studie war die Genomsequenzierung und de novo das Genom von zusammenbauen A. Hüftgelenkpfanne. Um ausreichend genomische DNA für die Sequenzierung zu erhalten, haben wir DNA aus einzelnen embryonalen Zellen unter Verwendung von dMDA amplifiziert. Wir präsentieren eine Bewertung der von Einzelzell-dMDA produzierten Sequenzierungsdaten und ihre Nützlichkeit für den Zusammenbau großer eukaryontischer Genome. Darüber hinaus vergleichen wir drei verschiedene Assemblierungsstrategien, bei denen jede Einzelzell-dMDA-Bibliothek separat zusammengebaut wird, diese einzelnen Assemblies zu einer Meta-Assembly zusammengefügt werden und alle Sequenzierungsbibliotheken kombiniert zusammengebaut werden (Co-Assembly). Diese Studie ist eine der ersten, die Einzelzell-dMDA für die Sequenzierung und de novo Aufbau eines eukaryotischen Genoms und sollte als nützliche Referenz für zukünftige Versuche dienen, Arten zu sequenzieren, die schwer zu kultivieren oder aus der Umwelt zu sammeln sind.


Genbearbeitung jetzt und in Zukunft

In den letzten zehn Jahrzehnten hat die Welt einige der beeindruckendsten und zum Nachdenken anregenden wissenschaftlichen und technologischen Fortschritte und Innovationen in verschiedenen Sektoren der Weltwirtschaft erlebt. Einer dieser technologischen Fortschritte ist CRISPR. Es ist eine Medizintechnik, die die Welt verändern wird. Vielleicht nicht sofort, aber in ein paar Jahren könnte das Konzept von CRISPR alltäglich sein.

CRISPR ist ein Akronym für Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats und eine Abkürzung für CRISPR-Cas9 und ist ein revolutionärer technologischer Fortschritt in der Medizin, der verwendet werden kann, um die Gene eines Organismus zu verändern oder zu modifizieren. Das Protein Cas9 ist einfach ein Enzym, das wie eine molekulare Schere funktioniert, mit der Fähigkeit, DNA-Stränge zu schneiden.

Wissenschaftler verwenden CRISPR als Medium, um ein bestimmtes DNA-Stück in einer bestimmten Zelle zu entdecken. Es hilft Forschern, DNA-Sequenzen einfach zu ändern und die Genfunktion zu verändern. Die faszinierende Technologie steckt voller Potenziale und wird auf verschiedene Weise für verschiedene Zwecke eingesetzt, darunter die Korrektur von Gendefekten, die Behandlung und Eindämmung der weit verbreiteten Infektionskrankheiten und die Verbesserung der Lebensentwicklung.

Kurz bevor die neuartige Technologie von Francis Mojica, einem spanischen Mikrobiologen, entdeckt und benannt wurde, hatten Wissenschaftler Möglichkeiten, die Gene von Pflanzen und Tieren sowie deren Funktionen zu verändern. Diese Methoden dauerten jedoch lange Jahre und erforderten viel Geld, um das Ziel zu erreichen. Aber mit der Erfindung von CRISPR wurde die Genom-Editierung viel billiger und einfacher. Derzeit wird CRISPR weltweit für verschiedene wissenschaftliche Forschungen eingesetzt und früher oder später könnte CRISPR ein Teil von praktisch allem sein, was wir sehen, von Tieren in landwirtschaftlichen Betrieben bis hin zu Gartenpflanzen.


Crispr-Cas9. Vom National Human Genome Research Institute (NHGRI) aus Bethesda, MD, USA - CRISPR-Cas9 Editing of the Genome, CC BY 2.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=52360100

ANWENDUNGEN VON CRISPR

CRISPR ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das von vielen Wissenschaftlern im Labor weit verbreitet ist. Einige gängige und ungewöhnliche Anwendungen dieses Tools, die verschiedene Branchen beeinflussen und verändern können, sind:

Genbearbeitung

Dies ist die beliebteste Anwendung von CRISPR. Es ist mehr oder weniger die Hauptanwendung von CRISPR. Die Gen-Editierung in der Medizin hat eine neue Wendung genommen, da die CRISPR-Technologie dabei ist, das Konzept der Genom-Editierung neu zu definieren. Die Technologie nimmt in der Medizinbranche schnell zu einem Höchststand der Akzeptanz zu. Die CRISPR-Technologie in der Gen-Editierung besitzt neben der Erforschung von Grunderkrankungen beim Menschen und der Entdeckung neuer Behandlungsmöglichkeiten enorme Potenziale, um Krankheiten zu erkennen, zu heilen und zu verhindern.

Grüne Kraftstoffe

In einigen Teilen der Welt wird CRISPR inzwischen außerhalb der medizinischen Forschung und Behandlung von Krankheiten angewendet. Es wurde entdeckt, dass die Gen-Editierung die Produktion umweltfreundlicherer Kraftstoffe erleichtern könnte – alternative Kraftstoffe (Biokraftstoffe) durch Algen. Bevor die CRISPR-Technologie erfunden wurde, produzierten Algen weniger Fett, das nicht ausreichte, um die Massenproduktion von Biodiesel für eine wirtschaftliche Nutzung zu unterstützen. Mit dem Gen-Editing-Tool können jedoch Genmodifikationen vorgenommen werden, damit Algen genau die richtige Fettmenge produzieren, die für die Produktion von genügend Biodiesel benötigt wird. In naher Zukunft könnten Ölkonzerne täglich etwa 25.000 alternative Kraftstoffe aus Algen produzieren.

Haustierzucht

Die CRISPR-Technologie könnte die nächste gefragteste technologische Innovation von Tierhaltern sein, die nach neuen Technologien suchen, um die Lebensqualität ihrer Heimtiere zu verbessern und zu verbessern. Zum Beispiel gelten Gen-Editing-Tools als vertrauenswürdige Methode zur Ausrottung genetischer Krankheiten, die typischerweise bei reinrassigen Hunden auftreten. Dalmatiner, eine Rasse von auffällig gefleckten Hunden, haben im Allgemeinen eine genetische Mutation, die sie anfällig für Nierensteine ​​macht. Die CRISPR-Technologie kann verwendet werden, um ihre Gene zu bearbeiten, um den Prozentsatz der Dalmatiner mit Nierensteinen zu reduzieren.

Allergiefreies Essen

Viele Menschen meiden bestimmte Lebensmittel nicht, weil sie sie nicht gerne haben würden, sondern wegen der Allergien, die sie durch das Essen oder Berühren dieser Lebensmittel bekommen. Eine Nahrungsmittelallergie betrifft einen erheblich größeren Prozentsatz der Weltbevölkerung und kann mit schwerwiegenden gesundheitlichen Komplikationen lebensbedrohlich sein. Interessant ist jedoch, dass mit der CRISPR-Technologie allergiefreie Lebensmittel hergestellt werden können. CRISPR wird beispielsweise von einer Forschungsgruppe in den Niederlanden verwendet, um die DNA von Weizen zu modifizieren, um das vorhandene Gluten zu entfernen. Dies, um glutenempfindlichen Personen zu ermöglichen – Zöliakie-Betroffene essen Weizen.

Schädlingsbekämpfung

Schädlinge können in einigen Ökosystemen eine große Rolle spielen. Sie könnten Infektionskrankheiten bei Pflanzen und Tieren verbreiten oder in eine bestimmte Population eindringen. Forscher der CRISPR-Technologie haben Wege entdeckt, wie die Gene invasiver Schädlinge verändert werden können, um sie zu kontrollieren. Zum Beispiel können Malaria-verursachende Mücken mit einer Gen-Modifikation eingedämmt werden, die verhindert, dass ein Träger Eier legt. Dies würde die Verbreitung des Parasiten drastisch reduzieren.

Auslöschung

Ist es nicht irrsinnig zu denken, dass bereits ausgestorbene Tiere durch die CRISPR-Technologie zurückgebracht werden können? Es gibt einige Tiere, die wir nur in Büchern und uralten Dokumentarfilmen gesehen haben. Wir haben sie nicht auf der Erde gesehen, wie sie lebten und vor Millionen von Jahren ausgestorben sind. Wissenschaftler entdecken jedoch immer wieder die atemberaubendsten und beeindruckendsten Technologien. Anscheinend hat CRISPR es Wissenschaftlern ermöglicht, Wege zu finden, ausgestorbene Tiere zurückzubringen. Mit der CRISPR-Technologie versuchen Wissenschaftler, die Gene ausgestorbener Tiere in lebende Verwandte einzubringen, wonach sie über Generationen gezüchtet werden, bis die Nachkommen mit der DNA ausgestorbener Arten übereinstimmen.

Therapeutische Anwendungen

Mehrere Pharmaunternehmen, sowohl die gerade neu gegründeten als auch die renommierten etablierten Unternehmen, bemühen sich schnell, die CRISPR-Technologie anzupassen und CRISPR-basierte Therapeutika zu entwickeln, einschließlich Geweberegeneration, Krebsimmuntherapie und Gentherapie. Im Gegensatz zu einer großen Anzahl von Genmodifikationstools, die die Industrie gesehen hat, stellt CRISPR ein weitaus kostengünstigeres, schnelleres und potenziell sichereres Gen-Editing-Tool dar. Es ist vielversprechend für die Behandlung von Krankheiten und die Entwicklung krankheitsresistenter Gene.



Quelle: flickr

LETZTE WORTE

Während die Wissenschaftler mit weiteren Forschungen fortfahren und tiefer in die Erforschung der endlosen Möglichkeiten von CRISPR und weniger Kritik seitens der medizinischen Fachwelt eintauchen, kann man mit Sicherheit glauben, dass die neuartige Technologie bereits eine bedeutende Rolle in der Zukunft der Genom-Editierung spielt. CRISPR hat die Neigung, die biologischen Mechanismen hinter Infektionskrankheiten und Gendefekten zu revolutionieren und vollständig zu verändern, daher neue Theorien zu postulieren und hilfreiche Therapien zu entwickeln, die die Entwicklung der Biowissenschaften im Allgemeinen fördern und verbessern.


Genomweite Identifizierung, Klassifizierung, evolutionäre Analyse und Genexpressionsmuster der Proteinkinase-Genfamilie in Weizen und Aegilops tauschii

In dieser Studie identifizierten und klassifizierten wir systematisch PKs in Triticum aestivum, Triticum urartu und Aegilops tauschii. Es wurden Domänenverteilungs- und Exon-Intron-Strukturanalysen von PKs durchgeführt, und wir fanden konservierte Exon-Intron-Strukturen innerhalb der Exon-Phasen in der Kinase-Domäne. Kollinearitätsereignisse wurden bestimmt und wir identifizierten verschiedene T. aestivum PKs aus Polyploidisierungen und Tandemduplikationsereignissen. Eine globale Expressionsmusteranalyse von T. aestivum PKs zeigte, dass einige PKs an den Signalwegen der Stressreaktion und Entwicklungsprozessen beteiligt sein könnten. QRT-PCR von 15 ausgewählten PKs wurden unter Trockenheitsbehandlung und mit Infektion von Fusarium graminearum durchgeführt, um die Vorhersage von Microarrays zu validieren. Die Proteinkinase (PK)-Gen-Superfamilie ist eine der größten Familien in Pflanzen und beteiligt sich an verschiedenen Pflanzenprozessen, einschließlich Wachstum, Entwicklung und Stressreaktion. Um Weizen-PKs besser zu verstehen, führten wir eine genomweite Identifizierung, Klassifizierung, Evolutionsanalyse und Expressionsprofile von Weizen und Ae durch. tauschii PKs. Wir identifizierten 3269, 1213 und 1448 typische PK-Gene in T. aestivum, T. urartu und Ae. tauschii bzw. und teilte sie in Hauptgruppen und Unterfamilien ein. Domänenverteilungen und Genstrukturen wurden analysiert und visualisiert. Einige konservierte Intron-Exon-Strukturen innerhalb der konservierten Kinasedomäne wurden in T. aestivum, T. urartu und Ae gefunden. tauschii sowie die primitiven Landpflanzen Selaginella moellendorffii und Physcomitrella patens, was die wichtige Rolle und die konservierte Evolutionsgeschichte dieser PKs aufzeigt. Wir analysierten die Kollinearitätsereignisse von T. aestivum-PKs und identifizierten PKs aus Polyploidisierungen und Tandem-Duplikationsereignissen. Die globale Expressionsmusteranalyse von T. aestivum-PKs ergab gewebespezifische und stressspezifische Expressionsprofile, was darauf hindeutet, dass einige Weizen-PKs abiotische und biotische Stressreaktions-Signalwege regulieren können. QRT-PCR von 15 ausgewählten PKs wurde unter Trockenheitsbehandlung und mit Infektion von F. graminearum durchgeführt, um die Vorhersage von Microarrays zu validieren. Unsere Ergebnisse werden die grundlegenden Informationen für weitere Studien zu den molekularen Funktionen von Weizen-PKs liefern.

Schlüsselwörter: Kollinearitätsereignisse, Konservierte Exon-Intron-Strukturen, Expressionsmuster Weizenproteinkinase-Familie,.