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A10. Hydrothermale Quellen oder Ursuppe? - Biologie

A10. Hydrothermale Quellen oder Ursuppe? - Biologie


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Die Argumente für den Ursprung des Lebens in hydrothermalen Quellen der Tiefsee und nicht in einer ursprünglichen "Campbell's"-Suppe wurden von Lane et al. (2010) überzeugend argumentiert. Was für das Leben benötigt wird, sind einigermaßen komplexe Moleküle und eine Energiequelle, um ungünstige Reaktionen anzutreiben. Auf Letzteres konzentrieren sich Lane et al. Dies lässt sich aus der geringen Energieausbeute (im Vergleich zur aeroben Atmung) vermuten, die in heutigen glykolytischen (fermentativen) Stoffwechselwegen aus allen wichtigen Lebensbereichen, Archaeen, Bakterien und Eukaryoten, erreicht wird.

Hintergrund: Basierend auf rRNA-Sequenzen entwickelte sich eine Urzelle in zwei verschiedene Zelltypen, eine, die zu Bakterien wurde, und eine andere, die sich weiter in Archaeen (einzelne Zellen, ähnlich den Bakterien) und eukaryotische Zellen (komplexe Zellen mit inneren Organellen, die sich schließlich bildeten) aufspaltete mehrzellige Organismen). Bakterien und Archaeen werden gesammelt, die als prokaroytische Zellen bezeichnet werden.

Darüber hinaus erforderten diese Wege die Entwicklung von bis zu einem Dutzend verschiedener Enzyme, um ihre relativ magere Energieausbeute zu erzeugen, die letztendlich von der Oxidation eines organischen Moleküls durch ein anderes organisches Molekül anstelle eines starken Oxidationsmittels wie Disauerstoff abhängt. Eine anisotrope Anordnung von Molekülen in einer konzentrierten Suppe könnte zu vorübergehenden chemischen Potentialschwankungen führen, aber diese wären ineffiziente und unbeständige Energiequellen. Tatsächlich wäre die Ursuppe im Gleichgewicht und kaum zu erwarten, dass sie die Energie für die Synthese von RNA-Enzymen und Replikatoren liefert. UV-Licht führt zu Photoschäden und Photolyse, nicht zur Replikation komplexer Moleküle. Was benötigt wird, ist ein Weg, um die Synthese von Molekülen mit hoher chemischer potentieller Energie (wie Schwefelester und Phosphoanhydride) im Vergleich zu ihren lytischen Produkten voranzutreiben. Diese könnten dann eine Energiequelle bereitstellen, um beispielsweise die ATP-Synthese anzutreiben.

Ein detaillierter Blick in die Biowelt zeigt, dass die frühesten Organismen Energie aus dem Kollaps des Protonengradienten nutzten (chemisomotisches Prinzip von Peter Mitchell erläutert). Alle gegenwärtigen Autotrophen (Organismen, die CO2 fixieren und komplexe organische Moleküle bilden können) und viele Heterotrophe (verwenden komplexe organische Moleküle anderer Organismen als Brennstoff) verwenden Redoxkomplexe in Membranen, die an Membrangradienten gekoppelt sind. Diese Komplexe würden reduzierte Moleküle aufnehmen und Elektronen von ihnen an Oxidationsmittel (Elektronenakzeptoren) weitergeben, einschließlich O2, CO2 und Fe3+, um H2O, CH4 und Fe2+ zu bilden. Fermenter verwenden auch ATPase-Membranenzyme, um Nährstoffe zu transportieren. Genomanalysen von Bakterien und Archaeen zeigen jedoch, dass sich die an der Fermentation beteiligten Enzyme erheblich unterscheiden, was darauf hindeutet, dass sie sich getrennt in Richtung einer konvergenten Funktion entwickelt haben. Die gemeinsame Struktur umfasst DNA, RNA, Ribosomen und Membran-ATPasen, die Lane et al. in einer Last Universal Common Cell (LUCA) vermuten.

Alle Autotrophen produzieren ihre Energiequelle, indem sie CO2 entweder direkt mit H2 oder indirekt mit H2O und H2S fixieren. Alle sind in nichthydrothermalen Tiefseeschloten verfügbar. Vulkanische Schlote sind jedoch extrem heiß (nicht optimal für die Synthese organischer Moleküle), sehr sauer und es fehlt Wasserstoffgas. Eine andere Art von nichtvulkanischem Schlot, ein alkalischer hydrothermaler, könnte als Ort des Ursprungs des Lebens förderlicher sein. In diesen Schloten reagiert Wasser chemisch mit Mineralien in der Kruste (wie Olivin), was zu deren Hydroxylierung und anschließendem Bruch führt, wodurch mehr Wasser in die Kruste eindringt. Es wurde berichtet, dass mehr Wasser als hydroxylierte Mineralien in der Kruste gefunden wird, dass es flüssiges Wasser in den Ozeanen gibt. Diese Prozesse führen zu Temperaturen von bis zu 200 Grad Celsius und die Freisetzung von Wasserstoffgas in mäßig alkalische Schlote in das Meerwasser bei Temperaturen, die der Entstehung des Lebens förderlicher (70 Grad C) sind.

Abbildung: Alkalische Entlüftung

Mitwirkende

  • Prof. Henry Jakubowski (College of St. Benedikt/St. John's University)

A10. Hydrothermale Quellen oder Ursuppe? - Biologie

Sajini, K K Karun, A Amamath, C H Engelmann, F

Die vorliegende Studie untersucht den Einfluss von Vorkulturbedingungen, Vitrifikations- und Entladelösungen auf das Überleben und die Regeneration von Kokosnuss-zygotischen Embryonen nach Kryokonservierung. Von den sieben getesteten Pflanzenvitrifizierungslösungen erwies sich PVS3 als die effektivste für die Regeneration kryokonservierter Embryonen. Das optimale Protokoll umfasste die Vorkultur von Embryonen für 3 Tage auf Medium mit 0,6 M Saccharose, PVS3-Behandlung für 16 h, schnelles Abkühlen und Wiedererwärmen und Entladen in 1,2 M Saccharose-Flüssigmedium für 1,5 h. Unter diesen Bedingungen wurde ein Überleben von 70–80 (entsprechend der Größenvergrößerung und Gewichtszunahme) mit kryokonservierten Embryonen beobachtet und 20–25% der Pflanzen, die aus kryokonservierten Embryonen regeneriert wurden (die normales Spross- und Wurzelwachstum zeigten), wurden in Töpfen etabliert.

Wakisaka, Keiko Tsuji Ichiyanagi, Kenji Ohno, Seiko Itoh, Masanobu

Die P-Element-Transposition im Genom verursacht eine P-M-Hybrid-Dysgenese bei Drosophila melanogaster. Mütterlich abgelagerte piRNAs unterdrücken die P-Element-Transposition in der Nachkommenschaft und verbinden sie mit P-M-Phänotypen. Die Rolle von zygotischen piRNAs, die von väterlichen P-Elementen abgeleitet sind, ist jedoch kaum verstanden. Um die molekularen Grundlagen der P-Element-Suppression durch zygotische Faktoren aufzuklären, untersuchten wir die genomische Konstitution und die P-Element-piRNA-Produktion, die von Vätern stammt. Als Ergebnis charakterisierten wir Männchen von natürlich abgeleiteten Q-, M'- und P-Stämmen, die unterschiedliche Kapazitäten für die P-Element-Mobilisierungen zeigen, die nach Hybridisierungen mit M-Stamm-Weibchen eingeführt wurden. Die in den Eierstöcken von F1-Hybriden produzierten Mengen an piRNAs variierten zwischen den Stämmen und wurden von den Eigenschaften der piRNA-Cluster beeinflusst, die die P-Elemente enthielten. Während sowohl die Q- als auch die M'-Stamm-Väter die P-Element-Mobilisierung in den Eierstöcken ihrer Töchter einschränken, unterstützten die Q-Stamm-Väter die Produktion der höchsten piRNA-Expression in den Eierstöcken ihrer Töchter, und der M'-Stamm trägt KP-Elemente in transkriptionell aktiven Regionen, die die höchste Expression von KP-Elementen in ihren Töchtern steuern. Interessanterweise trugen die zygotischen P-Element-piRNAs, aber nicht die KP-Element-mRNA zu den Variationen der P-Transpositionsimmunität bei den Enkelinnen bei. Die in piRNA-Cluster eingebetteten P-Elemente und die transkriptionell aktiven KP-Elemente aus dem väterlichen Genom sind beides wichtige Suppressoren der P-Element-Aktivitäten, die von den Nachkommen mitvererbt werden. Die Expressionsniveaus der P-Element-piRNA und KP-Element-mRNA variieren aufgrund der Konstitution des väterlichen Genoms zwischen den F1-Nachkommen und sind an der phänotypischen Variation in der nachfolgenden Generation beteiligt.

Blachon, Stephanie Khire, Atul Avidor-Reiss, Tomer

Zentrosomen bestehen aus zwei Zentriolen, die von perizentriolärem Material (PCM) umgeben sind. Allerdings verändern Spermien und Eizelle ihre Zentrosomen oder verlieren sie. Folglich ist ungewiss, wie die Zygote ihr erstes Zentrosom aufbaut und insbesondere der Ursprung des zweiten Zygoten-Zentriols. Spermatiden von Drosophila melanogaster enthalten ein einzelnes Zentriol, das Riesenzentriole (GC) genannt wird, und eine proximale Zentriol-ähnliche (PCL) Struktur, deren Funktion unbekannt ist. Wir fanden heraus, dass das PCL wie das Zentriol seine Proteinmarker am Ende der Spermiogenese verliert. Nach der Befruchtung werden die ersten beiden Zentriolen über die Rekrutierung der zygotischen PCM-Proteine ​​beobachtet und sind in asterlosen mutierten Embryonen zu sehen, die keine Zentriolen bilden können. Die Zentriolproteine ​​der Zygote markieren nur die Tochterzentriolen der ersten beiden Zentriolen. Diese Beobachtungen zeigen, dass PCL der Ursprung für das zweite Zentriol in der Drosophila-Zygote ist und dass ein väterlicher Zentriol-Vorläufer ohne Zentriolproteine ​​während der Befruchtung auf das Ei übertragen wird. PMID:24532732

Elbl, Paula De Souza, Amanda P. Jardim, Vinicius de Oliveira, Leandro F. Macedo, Amanda F. dos Santos, André L. W. Buckeridge, Marcos S. Floh, Eny I. S.

Drei zygotische Entwicklungsstadien und zwei somatische Araucaria angustifolia-Zelllinien mit kontrastierendem embryogenen Potenzial wurden analysiert, um die kohlenhydratvermittelten Reaktionen im Zusammenhang mit der Embryobildung zu identifizieren. Anhand eines Vergleichs zwischen zygotischen und somatischen Embryogenesesystemen wurden der nichtstrukturelle Kohlenhydratgehalt, die Zellwandzuckerzusammensetzung und die Expression von Genen, die an der Zuckersensorik beteiligt sind, analysiert und eine Netzwerkanalyse verwendet, um koordinierte Merkmale während der Embryogenese zu identifizieren. Wir beobachteten, dass kohlenhydratvermittelte Reaktionen hauptsächlich während der frühen Stadien der zygotischen Embryobildung auftreten und dass während der Samenentwicklung koordinierte Veränderungen auftreten, die die Entwicklung der verschiedenen Strukturen (Embryo und Megagametophyt) beeinflussen. Darüber hinaus wurden Saccharose- und Stärkeakkumulation mit der Reaktionsfähigkeit der Zelllinien in Verbindung gebracht. Diese Studie gibt Aufschluss darüber, wie der Kohlenhydratstoffwechsel während der zygotischen und somatischen Embryogenese der gefährdeten Nadelbaumart A. angustifolia beeinflusst wird. PMID:28678868

Dass die Seele einer menschlichen Person bei der Empfängnis durchdrungen wird, ist eine metaphysische Behauptung. Aufgrund ihrer traditionellen Artikulation hat sie jedoch die empirische Konsequenz, dass die Zygote eine substanzielle Kontinuität mit der erwachsenen Person aufweisen muss, eine Kontinuität, die bereits bei der Empfängnis festgelegt ist. Dieser empirischen Folgerung widerspricht die Tatsache, dass die Zygote ein Blasenmole oder mehrere Personen werden kann. Die metaphysische Behauptung wird durch die Tatsachen falsifiziert.

Larcombe, Matthew J Costa E Silva, João Tilyard, Paul Gore, Peter Potts, Brad M

Viele frühere Studien kommen zu dem Schluss, dass präzygote Barrieren wie die mechanische Isolation für die meisten reproduktiven Isolationen zwischen Taxapaaren verantwortlich sind. Die Vererbung und das Fortbestehen solcher Barrieren nach der ersten Hybridisierungsgeneration werden jedoch selten quantifiziert, obwohl dies eine wichtige Überlegung für das Verständnis des Genflusspotenzials ist. Zwischen Eucalyptus nitens und Eucalyptus globulus besteht eine asymmetrische präzygotische mechanische Hybridisierungsbarriere, die die Paarung von kleinblütigen E. nitens-Pollen mit großen E. globulus-Blüten vollständig verhindert, während die umgekehrte Kreuzung möglich ist. Unser Ziel war es, die relative Bedeutung prä- und postzygotischer Barrieren bei der Verhinderung des Genflusses nach sekundärem Kontakt zwischen E. nitens und E. globulus zu bestimmen, einschließlich der Vererbung von Barrieren bei Hybriden der fortgeschrittenen Generation. Experimentelle Kreuzungen wurden verwendet, um ausgekreuzte E. nitens, E. globulus und ihre F1-, F2-, BCg- und BCn-Hybride zu erzeugen. Die Stärke und Vererbung einer Reihe von prä- und postzygotischen Barrieren wurden bewertet, einschließlich 20-Jahres-Überleben, Wachstum und Reproduktionsfähigkeit. Die mechanische Barriere für die Hybridisierung ging im F1-Hybrid verloren oder wurde stark reduziert. Im Gegensatz dazu waren intrinsische postzygotische Barrieren stark und anhaltend. Die Linienkreuzanalyse zeigte, dass die Auszuchtdepression bei den Hybriden am besten durch den epistatischen Verlust erklärt werden konnte. Die Beseitigung starker mechanischer Barrieren zwischen E. nitens und E. globulus ermöglicht es F1-Hybriden, als Brücke für den bidirektionalen Genfluss zwischen diesen Arten zu fungieren. Es existieren jedoch starke und anhaltende postzygotische Barrieren, was bedeutet, dass überall dort, wo F1-Hybridisierung stattfindet, intrinsische postzygotische Barrieren für die meiste reproduktive Isolation in diesem System verantwortlich sind. Diese potenziell vorübergehende Natur mechanischer Barrieren für die Zygotenbildung aufgrund additiver Vererbung bei Hybriden wird unterschätzt und unterstreicht die oft wichtige Rolle, die intrinsische Barrieren nach der Paarung spielen

Ma, Xue-Shan Chao, Shi-Bin Huang, Xian-Ju Lin, Fei Qin, Ling Wang, Xu-Guang Meng, Tie-Gang Zhu, Cheng-Cheng Schatten, Heide Liu, Hong-Lin Sun, Qing-Yuan

Die H3K9-Methylierung ist eine wichtige Histonmodifikation, die mit der Gentranskriptionsrepression korreliert. Das asymmetrische H3K9-Dimethylierungsmuster (H3K9me2) zwischen väterlichem und mütterlichem Genom wird kurz nach der Befruchtung erzeugt. In der vorliegenden Studie haben wir die Dynamik von H3K9me2-Änderungen in Mauszygoten sorgfältig bestimmt und die Regulationsmechanismen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Histon-Methyltransferase G9a, aber nicht GLP, an der Regulation von asymmetrischem H3K9me2 beteiligt war, und G9a war die Methyltransferase, die das Auftreten von H3K9me2 im männlichen Vorkern der mit Cycloheximid behandelten Zygote induzierte. Wir fanden heraus, dass es zwei verschiedene Mechanismen gibt, die H3K9me2 im männlichen Vorkern regulieren. Vor 8 h der In-vitro-Fertilisation (IVF) existiert ein Mechanismus, der die Assoziation von G9a mit den H3K9-Stellen hemmt. Nach 10 h IVF hängt die Hemmung der G9a-Aktivität von noch unbekannter neuer Proteinsynthese ab. Die beiden Übertragungsmechanismen finden zwischen 8–10 h nach IVF statt, und das neue Protein konnte die G9a-Aktivität nicht rechtzeitig hemmen, was zum Auftreten eines niedrigen de novo-H3K9me2-Spiegels im männlichen Vorkern führte. PMID:26639638

Moriyama, Yohsuke Yamazaki, Tomokazu Nomura, Hideo Sasaki, Narie Kawano, Shigeyuki

Der aktive, selektive Verdau von mtDNA von einem Elternteil ist ein möglicher molekularer Mechanismus für die uniparentale Vererbung von mtDNA. In Physarum polycephalum wird mtDNA vom DNA-bindenden Protein Glom verpackt, das mtDNA in stäbchenförmige mt-Nukleoide verpackt. Nach der Paarung wird mtDNA von einem Elternteil selektiv verdaut und die Glom begann sich zu verteilen. Dispersed Glom wurde für mindestens 6 h nach mtDNA-Verdau aufbewahrt, verschwand jedoch nach etwa 12 h nach Mischen zweier Stämme vollständig. Wir identifizierten zwei neue Nukleasen mittels DNA-Zymographie mit nativer PAGE und SDS-PAGE. Einer ist ein Ca2+-abhängiger, hochmolekularer Nukleasekomplex (ca. 670 kDa), der andere ist ein Mn2+-abhängiger, hochmolekularer Nukleasekomplex (440-670 kDa), dessen Aktivität nachgewiesen wurde als eine Mn2+-abhängige 13-kDa-DNase-Bande auf SDS-PAGE. Alle aus Myxamoebae isolierten Mitochondrien hatten mt-Nukleoide, während die Hälfte der Mitochondrien, die 12 h nach dem Mischen aus den Zygoten isoliert wurden, die mt-Nukleoide verloren hatte. Die Aktivität der Mn2+-abhängigen Nuklease in den isolierten Mitochondrien wurde mindestens 8 h nach dem Mischen zweier Stämme nachgewiesen. Timing und Lokalisation der Mn2+-abhängigen DNase-Aktivität stimmten mit dem selektiven Verdau von mtDNA überein.

Winkelmann, Traud Ratjens, Svenja Bartsch, Melanie Rode, Christina Niehaus, Karsten Bednarz, Hanna

Die somatische Embryogenese hat sich als effizientes in vitro-Pflanzenregenerationssystem für viele Nutzpflanzen erwiesen, wie zum Beispiel die wichtige Zierpflanze Cyclamen persicum, für die dieser Regenerationsweg der somatischen Embryogenese für die vegetative Vermehrung von Elternlinien sowie Elitepflanzen von Interesse ist. Die somatische Embryogenese wird jedoch aufgrund mehrerer ungelöster Probleme, wie Fehlbildungen, asynchrone Entwicklung, Mängel bei der Reifung und Keimung somatischer Embryonen, in vielen Kulturpflanzen nicht kommerziell eingesetzt. Im Gegensatz dazu entwickeln und keimen zygotische Embryonen in Samen in den meisten Fällen ohne Anomalien. Anstelle von zeit- und arbeitsintensiven Experimenten mit Tests verschiedener In-vitro-Kulturbedingungen und Pflanzenwachstumsregulator-Ergänzungen verfolgen wir einen gezielteren Ansatz. Zygotische Embryonen dienten als Referenz und wurden in metabolomischen Analysen mit somatischen Embryonen verglichen, was die zukünftige Optimierung des in vitro-Systems ermöglichte. Das Ziel dieser Studie war es, Unterschiede in den Metabolitenprofilen von somatischen und zygotischen Embryonen von C. persicum im Torpedostadium zu erkennen. Darüber hinaus wurden Hauptmetaboliten in Endosperm und Testa identifiziert und quantifiziert. Zwei Sätze von Extrakten von jeweils zwei bis vier biologischen Replikaten wurden analysiert. Insgesamt wurden 52 Metaboliten in den verschiedenen Geweben identifiziert und quantifiziert. Einer der bedeutendsten Unterschiede zwischen somatischen und zygotischen Embryonen bestand darin, dass die Prolinkonzentration in den zygotischen Embryonen etwa 40-mal höher war als in somatischen Embryonen. Epicatechin, ein Fänger für reaktive Sauerstoffspezies, wurde in der Testa am häufigsten gefunden. Saccharose, der am häufigsten vorkommende Metabolit, wurde in signifikant höheren Konzentrationen in zygotischen Embryonen nachgewiesen. Auch ein noch unbekanntes Trisaccharid wurde in zygotischen Embryonen signifikant angereichert. PMID:26300898

Klein, Lawrence E. Dawes, Adriana T.

Die Etablierung der anterior-posterior-Polarität in der Zygote Caenorhabditis elegans erfordert zwei verschiedene Prozesse: die mechanische Aktivität des Aktin-Myosin-Kortex und die biochemische Aktivität von Partitioning-defective (PAR)-Proteinen. Hier analysieren wir, wie PARs das Verhalten des kortikalen Motorproteins Nicht-Muskel-Myosin (NMY-2) regulieren, um die jüngsten Bemühungen zu ergänzen, die untersuchen, wie PARs die Rho-GTPase CDC-42 regulieren, die wiederum den Aktin-Myosin-Kortex reguliert. Wir stellen fest, dass PAR-3 und PAR-6 CDC-42-abhängiges NMY-2 im vorderen Kortex konzentrieren, während PAR-2 ​​CDC-42-abhängiges NMY-2 in der posterioren Domäne hemmt, indem es PAR-3 und PAR-6 . hemmt . Darüber hinaus stellen wir fest, dass PAR-1 und PAR-3 notwendig sind, um die Bewegung von NMY-2 durch den Kortex zu hemmen. PAR-1 schützt NMY-2 davor, durch Kräfte, die wahrscheinlich ihren Ursprung im Zytoplasma haben, über den Kortex bewegt zu werden. Währenddessen stabilisiert PAR-3 NMY-2 gegen die Dynamik von PAR-2 ​​und PAR-6 im Kortex. Wir stellen fest, dass die PAR-Signalgebung zwei Rollen erfüllt: die Lokalisierung von NMY-2 im vorderen Kortex und die Verhinderung der Verschiebung des polarisierten kortikalen Aktin-Myosin-Netzwerks. PMID:28615321

Aten, Quentin T. Jensen, Brian D. Howell, Larry L.

Dieses Papier stellt einen oberflächenmikrobearbeiteten mikroelektromechanischen System-Nanoinjektor vor, der entwickelt wurde, um DNA in Mauszygoten mit einem Durchmesser von 90 μm zu injizieren. Das vorgeschlagene Injektionsverfahren erfordert, dass eine elektrisch geladene, DNA-beschichtete Lanze in die Mauszygote eingeführt wird. Die wichtigsten Designanforderungen des Nanoinjektors sind (1) er muss die Lanze in die Mauszygote eindringen, ohne die Zellmembranen zu zerreißen und (2) die elektrische Verbindung zwischen der Lanze und einem stationären Bondpad aufrechtzuerhalten. Diese Anforderungen werden durch einen zweiphasigen, sich selbst rekonfigurierenden metamorphen Mechanismus erfüllt. In der ersten Bewegungs-Subphase hebt ein Sechs-Stab-Mechanismus mit Wechselpunkt die Lanze auf ≈ 45 μm über das Substrat. In der zweiten Bewegungs-Subphase ermöglicht eine nachgiebige Faltbalkenaufhängung der Lanze, sich in der Ebene in konstanter Höhe zu bewegen, während sie die Zellmembranen durchdringt. Die Lebensfähigkeit von Embryonen nach einer Nanoinjektion wird als Metrik zur Quantifizierung präsentiert, wie gut der Nanoinjektormechanismus seine Designanforderungen erfüllt, die Zygote zu durchdringen, ohne die Membran zu beschädigen.Lebensfähigkeitsstudien mit fast 3000 Nanoinjektionen führten dazu, dass 71,9% der nanoinjizierten Zygoten das Zweizellstadium erreichten, verglichen mit 79,6% der unbehandelten Embryonen.« weniger

In Braunalgenzellen ist das Zentrosom, das aus einem Paar von Zentriolen und dem perizentriolären Material besteht, hauptsächlich an der Organisation von Mikrotubuli (MTs) während des gesamten Zellzyklus beteiligt. In beweglichen Zellen sind die Zentriolen als Flagellen-Basalkörper an der Bildung von Flagellen-Axonemen beteiligt, und in somatischen Zellen spielen sie als Teil des Zentrosoms eine entscheidende Rolle bei vielen zellulären Aktivitäten. In Bezug auf die Rolle des Zentrosoms als Mikrotubuli-Organisierungszentrum (MTOC) ähneln Braunalgenzellen tierischen Zellen. Bei den meisten Befruchtungsprozessen bei Tieren bringt die Samenzelle Zentriolen, den Kern des Zentrosoms, in das Zytoplasma der Eizelle ein. In dieser Studie wurde das Verhalten von Zentriolen von der Gametogenese und Befruchtung bis zur ersten Zellteilung der Zygote in den drei bei Braunalgen vorkommenden sexuellen Fortpflanzungsmustern, d. h. Oogamie, Anisogamie und Isogamie, elektronen- und immunfluoreszenzmikroskopisch untersucht. Es wurde gezeigt, dass das in somatischen Zellen enthaltene Zentriolenpaar unabhängig vom sexuellen Fortpflanzungsmuster von den männlichen Gameten stammt. Die väterlicherseits abgeleiteten Zentriolen wurden vor der Mitose dupliziert und waren an der Spindelpolbildung beteiligt. Darüber hinaus spielen MTs aus dem Zentrosom eine entscheidende Rolle im Prozess der Zytokinese, da die Position der Zentrosomen, die Tochterkerne begleiten, die zytokinetische Ebene zu bestimmen scheint. Ein neuer Ansatz zur Aufklärung des Zytokinese-Modus bei Braunalgen wird in dieser Studie vorgestellt.

Trotz umfangreicher Arbeiten zu den Mechanismen, die Plasmamembranfurchen erzeugen, ist das Verständnis, wie Zellen in der Lage sind, die Furchendimensionen dynamisch zu regulieren, eine ungelöste Frage. Hier präsentieren wir eine eingehende Charakterisierung des Furchenverhaltens und ihrer Regulation in vivo während der frühen Morphogenese von Drosophila. Wir zeigen, dass die Vertiefung der Furchendimensionen mit aufeinanderfolgenden Kernzyklen weitgehend auf die Einführung einer neuen, schnellen Ingressionsphase (Ingression II) zurückzuführen ist. Das Blockieren des Midblastula-Übergangs (MBT) durch die Unterdrückung der zygotischen Transkription durch pharmakologische oder genetische Mittel verursacht das Fehlen von Ingression II und reduziert folglich die Furchendimensionen. Die Analyse von zusammengesetzten Chromosomen, die chromosomale Aneuploidien produzieren, legt nahe, dass mehrere Loci auf den X-, II- und III-Chromosomen zur Bildung unterschiedlich dimensionierter Furchen beitragen, und wir verfolgen den Beitrag des X-Chromosoms zur Furchenverlängerung zum Nullo-Genprodukt. Wir zeigen weiterhin, dass Checkpoint-Proteine ​​für die Furchenverlängerung erforderlich sind, jedoch sind die mitotischen Phasen des Zellzyklus nicht streng deterministisch für die Furchendimensionen, da eine Entkopplung der mitotischen Phasen mit Perioden des aktiven Eindringens auftritt, wenn die syncytialen Furchenzyklen fortschreiten. Schließlich untersuchten wir den Umsatz mütterlicher Genprodukte und stellten fest, dass dieser einen geringen Beitrag zur Entwicklungsregulation von Furchenmorphologien leistet. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Zellularisierungsdynamik während des Zyklus 14 eine Fortsetzung der während der syncytialen Zyklen etablierten Dynamik ist und einen differenzierteren Blick auf die entwicklungs- und MBT-getriebene Morphogenese bietet. PMID:29337989

Tang, Lichun Zeng, Yanting Du, Hongzi Gong, Mengmeng Peng, Jin Zhang, Buxi Lei, Ming Zhao, Fang Wang, Weihua Li, Xiaowei Liu, Jianqiao

Frühere Arbeiten mit humanen dreikernigen Zygoten deuteten darauf hin, dass das geclusterte, regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9-System ein Werkzeug zur Korrektur krankheitsverursachender Mutationen sein könnte. Es war jedoch unklar, ob dieses System bei normalen menschlichen (dual pronuklearen, 2PN) Zygoten anwendbar war. Hier zeigen wir, dass CRISPR/Cas9 auch als Gen-Editing-Tool in menschlichen 2PN-Zygoten wirksam ist. Durch Injektion von Cas9-Protein komplexiert mit den entsprechenden sgRNAs und Homologie-Spendern in menschliche Einzell-Embryonen konnten wir eine effiziente homologe Rekombinations-vermittelte Korrektur von Punktmutationen in HBB und G6PD demonstrieren. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch auch Grenzen dieses Korrekturverfahrens auf und unterstreichen den Bedarf an weiterer Forschung.

Ciruna, Brian Weidinger, Gilbert Knaut, Holger Thisse, Bernard Thisse, Christine Raz, Erez Schier, Alexander F

Wir berichten über eine allgemein anwendbare Strategie zur Übertragung zygotischer Letalmutationen durch die Zebrafischkeimbahn. Durch die Verwendung eines Morpholino-Oligonukleotids, das die Entwicklung von Urkeimzellen (PGC) blockiert, erzeugen wir Embryonen ohne endogene PGCs, die als Wirte für die Transplantation von Keimzellen von homozygoten mutierten Spendern dienen. Erfolgreiche Transfers werden durch die Lokalisierung von spezifisch markierten Spender-PGCs in der Region der sich entwickelnden Gonade in chimären Embryonen identifiziert. Diese Strategie, die zum vollständigen Ersatz der Wirtskeimbahn durch Spender-PGCs führt, wurde durch die Generierung von maternalen und maternal-zygotischen Mutanten für den Meilen auseinander liegenden Locus validiert. Diese Keimbahn-Ersatztechnik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der maternalen Auswirkungen von zygotischen letalen Mutationen. Darüber hinaus wird die Fähigkeit, große Gelege rein mutierter Embryonen zu erzeugen, embryologische, genetische, genomische und biochemische Studien erheblich erleichtern.

Ciruna, Brian Weidinger, Gilbert Knaut, Holger Thisse, Bernard Thisse, Christine Raz, Erez Schier, Alexander F.

Wir berichten über eine allgemein anwendbare Strategie zur Übertragung zygotischer Letalmutationen durch die Zebrafischkeimbahn. Durch die Verwendung eines Morpholino-Oligonukleotids, das die Entwicklung von Urkeimzellen (PGC) blockiert, erzeugen wir Embryonen ohne endogene PGCs, die als Wirte für die Transplantation von Keimzellen von homozygoten mutierten Spendern dienen. Erfolgreiche Transfers werden durch die Lokalisierung von spezifisch markierten Spender-PGCs in der Region der sich entwickelnden Gonade in chimären Embryonen identifiziert. Diese Strategie, die zum vollständigen Ersatz der Wirtskeimbahn durch Spender-PGCs führt, wurde durch die Generierung von maternalen und maternal-zygotischen Mutanten für den Meilen auseinander liegenden Locus validiert. Diese Keimbahn-Ersatztechnik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der maternalen Auswirkungen von zygotischen letalen Mutationen. Darüber hinaus wird die Fähigkeit, große Gelege rein mutierter Embryonen zu erzeugen, embryologische, genetische, genomische und biochemische Studien erheblich erleichtern. PMID:12397179

HOSHINO, YOICHIRO MURATA, NAHO SHINODA, KOICHI

• Ziele Entwicklung eines Verfahrens zur Isolierung lebender Eizellen und Zygoten aus Alstroemeria-Eizellen. • Anwendungsbereich Es wurde versucht, Eizellen und Zygoten aus den Eizellen von Alstroemeria aurea zu isolieren. Die Eizellen wurden histologisch unter Verwendung eines Klärungsverfahrens beobachtet, das die Lokalisation und Größe der Embryobeutel und des Eiapparates innerhalb der Eizellen aufzeigte. Zur Isolierung von Eizellen wurden die Eizellen mit einer chirurgischen Klinge in Abschnitte geschnitten und mit einer Enzymlösung behandelt. Anschließend wurden diese Ovula-Schnitte mit einer Glasnadel unter einem inversen Mikroskop präpariert. Durch dieses Verfahren erfolgreich isolierte Eizellen wurden unter Verwendung von Mikrokapillaren gesammelt, die mit einer Mikropumpe verbunden waren. Zur Zygotenisolierung wurden die Eizellen 24 h nach der Selbstbestäubung aus den Eierstöcken herausgeschnitten. Durch Behandlung von ausgeschnittenen Eizellen mit einer Enzymlösung und anschließende Präparierung mit einer Glasnadel wurden erfolgreich Zygoten aus den Eizellen isoliert und mit einer Mikrokapillare gesammelt. Die isolierten Zygoten waren mit Pollenschläuchen und einem der Synergiden assoziiert. Eizellen und Zygoten waren bis zu 2 h nach der Isolierung lebensfähig, wie durch Fluoresceindiacetat-Färbung bestimmt. • Schlussfolgerungen Die Verfahren zur Isolierung von Eizellen und Zygoten in Alstroemeria wurden festgelegt, und jede Eizelle und Zygote wurde mit einer Mikrokapillare eingefangen. PMID:16621859

Die Befruchtung bezeichnet den Übergang von der Gametophyten- zur Sporophytengeneration in höheren Pflanzen. Nach der Befruchtung vollzieht sich in der sporophytischen Entwicklung ein genetischer Wechsel von der mütterlichen zur zygotischen Kontrolle: der Übergang von der Mutter zur zygotischen (MZT). Das MZT wird als kritisch für die frühe Embryogenese angesehen, jedoch ist wenig über den zeitlichen Verlauf oder die Entwicklungswirkung des MZT in höheren Pflanzen bekannt. Hier diskutieren wir, was auf diesem Gebiet bekannt ist und konzentrieren uns auf Techniken, die in relevanten Studien verwendet werden, und deren Grenzen. Einige wichtige Fragen und technische Voraussetzungen für weitere Untersuchungen werden ebenfalls erörtert. © 2015 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Noah, Alexandre Mboene Niemenak, Nicolas Sunderhaus, Stephanie Haase, Christin Omokolo, Denis Ndoumou Winkelmann, Traud Braun, Hans-Peter

Die somatische Embryogenese kann die Vermehrung von Theobroma cacao effizient fördern, aber die schlechte Qualität der resultierenden Pflänzchen behindert den Einsatz dieser Technik im kommerziellen Maßstab. Die aktuelle Studie wurde initiiert, um die physiologischen Mechanismen der somatischen und zygotischen Embryogenese bei T. cacao auf Proteomebene systematisch zu vergleichen. Etwa 1000 Proteinflecken pro Fraktion konnten durch zweidimensionale isoelektrische Fokussierung/SDS-PAGE getrennt werden. Mehr als 50 der Proteinspots unterschieden sich deutlich in der Häufigkeit zwischen zygotischen und somatischen Embryonen: 33 Proteinspots waren in zygotischen Embryonen und 20 in somatischen Embryonen mindestens 3-fach höher. Analysen dieser Proteinspots mit unterschiedlichem Volumen durch Massenspektrometrie führten zur Identifizierung von 68 verschiedenen Proteinen. Viele der identifizierten Proteine ​​sind an der genetischen Informationsverarbeitung (21 Proteine), dem Kohlenhydratstoffwechsel (11 Proteine) und der Stressreaktion (7 Proteine) beteiligt. Insbesondere somatische Embryonen zeigten viele stressbezogene Proteine, wenige Enzyme, die an der Synthese von Speicherverbindungen beteiligt sind, und eine außergewöhnlich hohe Menge an Endopeptidase-Inhibitoren. Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, die in zygotischen Embryonen mehr als 3-fach höher akkumuliert wurde, ist ein wichtiges Enzym im Speicherstoff-Stoffwechsel in Kakaosamen. Auswirkungen auf die Verbesserung der somatischen Embryogenese bei Kakao werden diskutiert. Copyright © 2012 Elsevier B.V. Alle Rechte vorbehalten.

Rover, Ticiane Simioni, Carmen Hable, Whitney Bouzon, Zenilda L

Diese Studie untersucht das Muster und die Leistung zellulärer Strukturen während der frühen Entwicklung von Zygoten und Embryonen von Sargassum cymosum. Die frühe Entwicklung der S. cymosum-Keimlinge wurde bereits charakterisiert und mit dem für alle Fucoidalgen etablierten Entwicklungsmuster verglichen, bei dem die Zygote während der Polaritätsbildung und frühen Zellteilung durch Schleim am Gefäß befestigt bleibt. Wie bei den Algen Fucus und Silvetia verläuft die erste Teilung quer zur Längsachse der Zygote von S. cymosum. Die Zelle, aus der die Rhizoide entstehen, wird jedoch nicht bei der ersten Teilung bestimmt, sondern die Bildung dieser Zelle erfolgt bei der zweiten Teilung und bildet eine kleine Zelle an der schattierten Stelle des Embryos. Die Stabilisierung der Polarität während des Prozesses der Bildung eines mehrzelligen Embryos erfolgt schnell. Während der Entwicklung finden signifikante zytoplasmatische Veränderungen statt. Anfänglich zeigt das Zytoplasma große Ansammlungen von phenolischen Verbindungen, die sich in bestimmten Teilen befinden, aber später, im Laufe der Entwicklung, werden diese Verbindungen im Zytoplasma dispergiert, obwohl ein erheblicher Teil auf den Zellkern beschränkt bleibt. Um mehr Zygoten und höhere Wachstumsraten für die Keimlinge zu produzieren, waren die besten Bedingungen für die Spezies S. cymosum 22 bzw. 26 °C.

Shimada, Atsuko Takeda, Hiroyuki

Unter Ausnutzung der Eigenschaften, die Hybriden zwischen japanischer und chinesischer Medaka ein gutes, wenn auch steriles Wachstum ermöglichen, haben wir eine Methode zum Keimbahnersatz entwickelt, bei der diese Hybriden als Wirte für die Produktion einer mütterlich-zygoten Mutante verwendet werden. Das Protokoll wird hier beschrieben.

Tereso, Susana Zoglauer, Kurt Milhinhos, Ana Miguel, Célia Oliveira, M. Margarida

Wir verglichen Morphogenese und Akkumulation von Speicherproteinen und Stärke in Pinus pinaster Ait. zygotische Embryonen mit denen in somatischen Embryonen, die mit verschiedenen Kohlenhydratquellen gezüchtet wurden. Das Reifungsmedium für somatische Embryonen enthielt 80 microM Abscisinsäure (ABA), 9 gl(-1) Gellamgummi und entweder Glucose, Saccharose oder Maltose mit 44, 88, 175 oder 263 mM in Gegenwart oder Abwesenheit von 6% (Gew./ v) Polyethylenglycol (PEG) 4000 MW. Reifungsmedium, das 44 oder 88 mM einer Kohlenhydratquelle enthielt, produzierte nur einen oder keine somatischen Keimblattembryonen pro 0,6 g Frischmasse der Kultur. Die Zugabe von PEG zum basalen Reifungsmedium führte zu einer geringen Ausbeute an somatischen Keimblattembryonen, die im Allgemeinen eine unvollständige Entwicklung und anatomische Anomalien wie große Interzellularräume und große Vakuolen zeigten. Hohe Maltosekonzentrationen induzierten auch große Interzellularräume in den somatischen embryonalen Zellen, und 263 mM Saccharose produzierten weniger und weniger entwickelte somatische Keimblattembryonen im Vergleich zu 175 mM Saccharose, was darauf hinweist, dass die Wirkung der Kohlenhydratquelle teilweise osmotisch ist. Zygotische Embryonen hatten im gleichen Entwicklungsstadium eine geringere Trockenmasse als somatische Embryonen. Stärkekörnchen folgten einem ähnlichen Akkumulationsmuster in zygotischen und somatischen Embryonen. Ein niedriger Stärkegehalt wurde in kotyledonären zygotischen Embryonen und in somatischen Embryonen gefunden, die in Gegenwart von 175 mM Maltose oder 263 mM Glucose entwickelt wurden. In zygotischen Embryonen und in PEG-behandelten somatischen Embryonen erschienen Proteinkörper später und waren kleiner und weniger als in gut entwickelten somatischen Embryonen, die ohne PEG gezüchtet wurden. Wir schlagen vor, dass die Konzentration des Speicherproteins ein Marker für die Embryoqualität sein könnte.

Fan, Yong Li, Rong Huang, Jin Yu, Yang Qiao, Jie

Humane embryonale Stammzellen haben ein enormes Potenzial in der regenerativen Medizin gezeigt, und die jüngsten Fortschritte bei haploiden embryonalen Stammzellen bieten neue Erkenntnisse für zukünftige Anwendungen embryonaler Stammzellen. Die Störung normaler befruchteter Embryonen bleibt umstritten, daher ist die Entwicklung einer neuen Quelle für menschliche embryonale Stammzellen wichtig für deren Nützlichkeit. Hier untersuchten wir die Machbarkeit der haploiden und diploiden Embryonenrekonstruktion und der embryonalen Stammzellableitung unter Verwendung mikrochirurgisch reparierter dreikerniger humaner Zygoten. Diploide und haploide Zygoten wurden erfolgreich rekonstruiert, aber ein Großteil von ihnen hatte noch eine tripolare Spindelanordnung. Die rekonstruierten Embryonen entwickelten sich bis zum Blastozystenstadium, obwohl in diesen Zygoten ein Chromosomenverlust beobachtet wurde. Schließlich wurden triploide und diploide humane embryonale Stammzellen aus dreikernigen und rekonstruierten Zygoten (von denen nur ein Vorkern entfernt wurde) gewonnen, aber haploide humane embryonale Stammzellen wurden nicht erfolgreich aus den rekonstruierten Zygoten gewonnen, wenn zwei Vorkerne entfernt wurden. Sowohl triploide als auch diploide humane embryonale Stammzellen zeigten die allgemeinen Eigenschaften humaner embryonaler Stammzellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die geringere Embryoqualität, die aus einer abnormalen Spindelanordnung resultiert, zum Scheitern der haploiden embryonalen Stammzellableitung beigetragen hat. Die erfolgreiche Gewinnung diploider embryonaler Stammzellen zeigte jedoch, dass mikrochirurgische tripronukleäre Zygoten eine alternative Quelle für humane embryonale Stammzellen sind. In Zukunft wird die Verbesserung der Spindelmontage die Anwendung von triploiden Zygoten auf dem Gebiet der haploiden embryonalen Stammzellen erleichtern. PMID:23255130

Amarnath, Dasari Wakayama, Sayaka Zhu, Jie Moawad, Adel R. Wakayama, Teruhiko Campbell, Keith H S

Eine hohe Kaliumkonzentration in Kulturmedien wird als schädlich für die In-vitro-Kultur von Mausembryonen angesehen. Hier zeigen wir, dass zygotisches Medium (PZM) von Schweinen, das eine höhere Kaliumkonzentration enthält und auf 0,2 mM Glukose und 0,01 mM EDTA modifiziert wurde, eine effiziente Entwicklung vor und nach der Implantation von Mauszygoten zu Blastozysten bzw. lebenden Jungtieren unterstützte. Zunächst wurde modifiziertes PZM (mPZM) mit anderen Kulturmedien wie M16, CZB und KSOM-AA hinsichtlich seiner Fähigkeit verglichen, die Entwicklung von in vivo Mauszygoten bis zum Blastozystenstadium zu unterstützen. Die Anteile der Zygoten, die in mPZM und anderen Medien das 2-Zell- (94-99 %) und Blastozystenstadium (90-96 %) erreichten, waren nicht unterschiedlich. Die Schlüpfraten der Blastozysten waren jedoch unterschiedlich (P-Zygoten entwickelten sich in mPZM und KSOM-AA zu Blastozysten. Der Anteil der Blastozysten, die sich zu lebenden Jungtieren entwickelten, war zwischen mPZM (49 %) und KSOM-AA (44 %) nicht unterschiedlich untersucht, ob mPZM auch als Befruchtungsmedium verwendet werden könnte Modifiziertes PZM mit 5,56 mM Glukose und 0,4% BSA unterstützte effizient die IVF von Maus-Gameten Der Prozentsatz der Zygoten, die in 2-Zellen (94-98%) und Blastozysten (91- 93%) unterschied sich nicht von Zygoten, die in humanem Eileiterflüssigkeitsmedium befruchtet wurden.Wir kamen zu dem Schluss, dass modifiziertes Schweinezygotenmedium mit einer höheren Kaliumkonzentration als jedes andere häufig verwendete Mausmedium nicht nur die Kultur von Mausembryonen, sondern auch eine effiziente IVF von Mausgameten unterstützte Copyright © 2011 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Yu, Xing-Jiang Yi, Zhaohong Gao, Zheng Qin, Dandan Zhai, Yanhua Chen, Xue Ou-Yang, Yingchun Wang, Zhen-Bo Zheng, Ping Zhu, Min-Sheng Wang, Haibin Sun, Qing-Yuan Dean, Jurrien Li , Lei

Maternale Effektgene spielen eine entscheidende Rolle in der frühen Embryogenese von Modellorganismen, wo sie intensiv untersucht wurden. Ihre molekulare Funktion bei Säugetieren ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor kurzem haben wir einen subkortikalen mütterlichen Komplex (SCMC) identifiziert, der vier Proteine ​​enthält, die von mütterlichen Effektgenen kodiert werden (Mater, Filia, Floped und Tle6). Hier berichten wir, dass TLE6, ähnlich wie FLOPED und MATER, die SCMC stabilisiert und für die Spaltung über das zweizellige Entwicklungsstadium hinaus notwendig ist. Wir dokumentieren, dass die SCMC für die Bildung des zytoplasmatischen F-Aktin-Netzwerks erforderlich ist, das die zentrale Position der Spindel kontrolliert und die symmetrische Teilung von Mauszygoten gewährleistet. Wir zeigen weiter, dass die SCMC die Bildung des Aktin-Zytoskeletts spezifisch über Cofilin, einen Schlüsselregulator der F-Aktin-Zusammensetzung, steuert. Unsere Ergebnisse liefern molekulare Einblicke in die physiologische Funktion von TLE6, seine Interaktion mit den SCMC und ihre Rolle bei der symmetrischen Teilung der Zygote in der frühen Mausentwicklung.

Charron, Guillaume Landry, Christian R

Obwohl Mikroorganismen den größten Anteil der Biodiversität der Erde ausmachen, wissen wir wenig darüber, wie sich ihre Fortpflanzungsbarrieren entwickeln. Sexuelle Mikroorganismen wie Saccharomyces-Hefen entwickeln schnell eine starke intrinsische postzygotische Isolierung, aber die Rolle der extrinsischen Isolierung im frühen Speziationsprozess muss noch untersucht werden. Wir haben das Wachstum von F 1 -Hybriden zwischen zwei beginnenden Arten von Saccharomyces paradoxus gemessen, um das Vorliegen einer extrinsischen postzygotischen Isolation in 32 Umgebungen zu beurteilen. Mehr als 80% der Hybriden zeigten entweder eine teilweise Dominanz des besten Elternteils oder eine Überdominanz beim Wachstum, was keine Fitnessmängel bei F 1 -Hybriden zeigte. Die extrinsische reproduktive Isolierung spielt daher wahrscheinlich eine geringe Rolle bei der Begrenzung des Genflusses zwischen beginnenden Hefearten und ist keine Voraussetzung für die Artbildung. © 2017 Der/die Autor(en).

Kurihara, Daisuke Kimata, Yusuke Higashiyama, Tetsuya Ueda, Minako

Bei den meisten Blütenpflanzen sind Zygote und Embryo tief im Muttergewebe versteckt, und so war es lange Zeit ein Rätsel, wie sie sich dynamisch entwickeln, zum Beispiel wie die Zygote polarisiert, um die Körperachse zu bestimmen und wie der Embryo verschiedene Zellschicksale bestimmt während der Organbildung. Dieses Manuskript beschreibt eine In-vitro-Eizellenkulturmethode zur Durchführung von Live-Cell-Imaging von sich entwickelnden Zygoten und Embryonen von Arabidopsis thaliana. Das optimierte Kultivierungsmedium lässt Zygoten oder frühe Embryonen zu fruchtbaren Pflanzen heranwachsen. Durch die Kombination mit einem Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Mikrosäulen-Array-Gerät wird die Eizelle in der gleichen Position im flüssigen Medium gehalten. Diese Fixierung ist entscheidend, um dieselbe Eizelle mehrere Tage von der Teilung bis zum späten Embryostadium unter dem Mikroskop zu beobachten. Die resultierende Live-Cell-Bildgebung kann verwendet werden, um die Echtzeit-Dynamik der Zygotenpolarisation zu überwachen, wie z. Darüber hinaus kann dieses Eizellenkultivierungssystem mit Inhibitorbehandlungen kombiniert werden, um die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Embryonalentwicklung zu analysieren, und mit optischen Manipulationen wie der Laserdisruption, um die Rolle der Zell-Zell-Kommunikation zu untersuchen.

Remy, Séverine Tesson, Laurent Menoret, Séverine Usal, Claire De Cian, Anne Thepenier, Virginie Thinard, Reynald Baron, Daniel Charpentier, Marine Renaud, Jean-Baptiste Buelow, Roland Cost, Gregory J. Giovannangeli, Carine Fraichard, Alexandre Concordet, Jean- Paul Anegon, Ignacio

Die Erzeugung gentechnisch veränderter Tiere ist sowohl für Forschungs- als auch für kommerzielle Zwecke wichtig. Die Ratte ist ein wichtiger Modellorganismus, dem bis vor kurzem effiziente gentechnische Werkzeuge fehlten. Sequenzspezifische Nukleasen wie ZFNs, TALE-Nukleasen und CRISPR/Cas9 haben die Erstellung von Ratten-Knockout-Modellen ermöglicht. Gentechnik durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) wird verwendet, um Tiere zu erzeugen, die auf kontrollierte Weise Transgene exprimieren, und um präzise genetische Modifikationen einzuführen. Wir haben TALE-Nukleasen und Spender-DNA-Mikroinjektion in Zygoten angewendet, um HDR-modifizierte Ratten mit großen neuen Sequenzen zu erzeugen, die mit hoher Effizienz in drei verschiedene Loci eingeführt wurden (0,62 %-5,13 % der mikroinjizierten Zygoten). Von zwei dieser Loci (Rosa26 und Hprt1) ist bekannt, dass sie eine robuste und reproduzierbare Transgenexpression ermöglichen und für die Integration einer GFP-Expressionskassette, die vom CAG-Promotor angetrieben wird, anvisiert wurden. GFP-exprimierende Embryonen und vier analysierte Rosa26-GFP-Rattenlinien zeigten eine starke und weit verbreitete GFP-Expression in den meisten Zellen aller analysierten Gewebe. Der dritte Zielort war Ighm, wo wir einen erfolgreichen Exon-Austausch von Ratten-Exon 2 gegen das menschliche durchgeführt haben. An allen drei Loci beobachteten wir HDR nur bei Verwendung von linearer und nicht zirkulärer Donor-DNA. Eine milde hypothermische (30°C) Zygotenkultur nach Mikroinjektion erhöhte die HDR-Effizienz für einige Loci. Unsere Studie zeigt, dass die Mikroinjektion von TALE-Nuklease und Spender-DNA in Rattenzygoten zu einer effizienten und reproduzierbaren zielgerichteten Spenderintegration durch HDR führt. Dies ermöglichte die Herstellung von genetisch veränderten Ratten in einer arbeits-, kosten- und zeiteffizienten Weise. © 2014 Remy et al. Herausgegeben von Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Remy, Séverine Tesson, Laurent Menoret, Séverine Usal, Claire De Cian, Anne Thepenier, Virginie Thinard, Reynald Baron, Daniel Charpentier, Marine Renaud, Jean-Baptiste Buelow, Roland Cost, Gregory J. Giovannangeli, Carine Fraichard, Alexandre Concordet, Jean -Paul Anegon, Ignacio

Die Erzeugung gentechnisch veränderter Tiere ist sowohl für Forschungs- als auch für kommerzielle Zwecke wichtig. Die Ratte ist ein wichtiger Modellorganismus, dem bis vor kurzem effiziente gentechnische Werkzeuge fehlten. Sequenzspezifische Nukleasen wie ZFNs, TALE-Nukleasen und CRISPR/Cas9 haben die Erstellung von Ratten-Knockout-Modellen ermöglicht. Gentechnik durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) wird verwendet, um Tiere zu erzeugen, die auf kontrollierte Weise Transgene exprimieren, und um präzise genetische Modifikationen einzuführen. Wir haben TALE-Nukleasen und Spender-DNA-Mikroinjektion in Zygoten angewendet, um HDR-modifizierte Ratten mit großen neuen Sequenzen zu erzeugen, die mit hoher Effizienz in drei verschiedene Loci eingeführt wurden (0,62 %–5,13 % der mikroinjizierten Zygoten). Von zwei dieser Loci (Rosa26 und Hprt1) ist bekannt, dass sie eine robuste und reproduzierbare Transgenexpression ermöglichen und für die Integration einer GFP-Expressionskassette, die vom CAG-Promotor angetrieben wird, anvisiert wurden. GFP-exprimierende Embryonen und vier analysierte Rosa26-GFP-Rattenlinien zeigten eine starke und weit verbreitete GFP-Expression in den meisten Zellen aller analysierten Gewebe. Der dritte Zielort war Ighm, wo wir einen erfolgreichen Exon-Austausch von Ratten-Exon 2 gegen das menschliche durchgeführt haben. An allen drei Loci beobachteten wir HDR nur bei Verwendung von linearer und nicht zirkulärer Donor-DNA. Eine milde hypothermische (30°C) Zygotenkultur nach Mikroinjektion erhöhte die HDR-Effizienz für einige Loci. Unsere Studie zeigt, dass die Mikroinjektion von TALE-Nuklease und Spender-DNA in Rattenzygoten zu einer effizienten und reproduzierbaren zielgerichteten Spenderintegration durch HDR führt. Dies ermöglichte die Herstellung von genetisch veränderten Ratten in einer arbeits-, kosten- und zeiteffizienten Weise. PMID:24989021

Zonies, Seth Motegi, Fumio Hao, Yingsong Seydoux, Geraldine

Die Polarisierung der Zygote von C. elegans wird durch ECT-2-abhängige kortikale Flüsse initiiert, die die anterioren PAR-Proteine ​​(PAR-3, PAR-6 und PKC-3) weg vom zukünftigen, durch die Spermien markierten hinteren Ende des Embryos mobilisieren Zentrosom. Hier zeigen wir die Existenz eines zweiten, parallelen und redundanten Weges, der die Zygote in Abwesenheit von ECT-2-abhängigen kortikalen Flüssen polarisieren kann. Dieser zweite Weg hängt vom Polaritätsprotein PAR-2 ​​ab. Wir zeigen, dass PAR-2 ​​auch in Abwesenheit von kortikalen Flüssen in der Kortex lokalisiert ist, die dem Spermienzentrosom am nächsten liegt. Im Kortex angekommen, antagonisiert PAR-2 ​​die PAR-3-abhängige Rekrutierung von Myosin und erzeugt Myosinflüsse, die den anterioren PAR-Komplex in einer positiven Rückkopplungsschleife von PAR-2 ​​wegtransportieren. Wir schlagen vor, dass die Polarität in der C. elegans-Zygote durch redundante ECT-2- und PAR-2-abhängige Mechanismen initiiert wird, die die PAR-3-Spiegel lokal senken und eine positive Rückkopplungsschleife auslösen, die den gesamten Kortex polarisiert.

Niemenak, Nicolas Kaiser, Edward Maximova, Siela N Laremore, Tatiana Guiltinan, Mark J

Zweidimensionale Elektrophorese und Nano-LC-MS wurden durchgeführt, um Veränderungen in der Proteinhäufigkeit zu identifizieren, die mit der Reifung von zygotischen und somatischen Embryonen von Kakao korrelieren. Während der Entwicklung wurde auch das Proteom der Kakaoschoten charakterisiert. Die kürzlich veröffentlichte Kakao-Genomsequenz wurde verwendet, um eine Datenbank für vorhergesagte proteolytische Fragmente zu erstellen. Bei jeder Gewebeanalyse wurden mehrere hundert Proteinspots aufgelöst, von denen 72 variable Spots einer MS-Analyse unterzogen wurden, was zu 49 Identifizierungen führte. Die identifizierten Proteine ​​repräsentieren eine Reihe von funktionellen Kategorien, einschließlich Samenspeicherung, Stressreaktion, Photosynthese und Translationsfaktoren. Das Samenspeicherprotein war in zygotischen Embryonen von Kakao im Vergleich zu ihrem somatischen Gegenstück stark akkumuliert. Die Behandlung mit Saccharose (60 g L(-1)) ermöglicht jedoch eine Hochregulierung des Speicherproteins in SE. Bei reifen zygotischen und somatischen Embryonen wurde eine hohe Ähnlichkeit in den Profilen saurer Proteine ​​beobachtet. Bei Proteinen mit hohem pI wurde eine unterschiedliche Expression in beiden Geweben beobachtet. Mehrere Proteine ​​wurden ausschließlich in Fruchtgeweben nachgewiesen, darunter eine Chitinase und ein 14-3-3 Protein. Wir identifizierten auch ein neues Kakaoprotein, das mit bekannten süßen Speicherproteinen vom Mabinlin-Typ verwandt ist. Darüber hinaus wurde das spezifische Vorhandensein von Thaumatin-ähnlichem Protein, einem weiteren süßen Protein, auch in Fruchtgewebe nachgewiesen. Wir diskutieren unsere beobachteten Korrelationen zwischen Proteinexpressionsprofilen, Entwicklungsstadium und Stressreaktionen. Copyright © 2015 Elsevier GmbH. Alle Rechte vorbehalten.

Liang, Puping Xu, Yanwen Zhang, Xiya Ding, Chenhui Huang, Rui Zhang, Zhen Lv, Jie Xie, Xiaowei Chen, Yuxi Li, Yujing Sun, Ying Bai, Yaofu Songyang, Zhou Ma, Wenbin Zhou, Canquan Huang, Junjiu

Genome-Editing-Tools wie das Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-assoziierte System (Cas) sind weit verbreitet, um Gene in Modellsystemen wie tierischen Zygoten und menschlichen Zellen zu modifizieren, und sind sowohl für die Grundlagenforschung als auch für klinische Anwendungen vielversprechend. Bis heute besteht eine gravierende Wissenslücke in unserem Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen in menschlichen frühen Embryonen sowie in der Effizienz und möglichen Off-Target-Effekten des Einsatzes von Technologien wie CRISPR/Cas9 in menschlichen Präimplantationsembryonen. In diesem Bericht verwendeten wir dreikernige (3PN) Zygoten, um die CRISPR/Cas9-vermittelte Gen-Editierung in menschlichen Zellen weiter zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass CRISPR/Cas9 das endogene β-Globin-Gen (HBB) effektiv spalten kann. Allerdings war die Effizienz der homologen Rekombination gerichteten Reparatur (HDR) von HBB gering und die bearbeiteten Embryonen waren mosaikartig. In diesen 3PN-Zygoten war auch eine Off-Target-Spaltung erkennbar, wie durch den T7E1-Assay und die Sequenzierung des gesamten Exoms gezeigt wurde. Darüber hinaus konkurrierte das endogene Delta-Globin-Gen (HBD), das zu HBB homolog ist, mit exogenen Donor-Oligos, um als Reparaturmatrize zu fungieren, was zu unerwünschten Mutationen führte. Unsere Daten zeigten auch, dass die Reparatur des HBB-Locus in diesen Embryonen bevorzugt über den HDR-Weg ohne Crossover erfolgte. Zusammengenommen unterstreicht unsere Arbeit die dringende Notwendigkeit, die Genauigkeit und Spezifität der CRISPR/Cas9-Plattform weiter zu verbessern, eine Voraussetzung für alle klinischen Anwendungen der CRSIPR/Cas9-vermittelten Bearbeitung.

Lete, Marta G. Byrne, Richard D. Alonso, Alicia Poccia, Dominic Larijani, Banafshé

Die Regulierung der Dynamik der Kernhülle ist ein wichtiges Beispiel für das universelle Phänomen der Membranfusion. Die an der Kernmembranfusion beteiligten Signalmoleküle könnten auch während der Bildung von sowohl vorkernigen als auch zygoten Kernhüllen in der befruchteten Eizelle konserviert werden. Hier stellen wir fest, dass Klasse-I-Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3Ks) für die In-vitro-Kernhüllenbildung benötigt werden. Wir zeigen, dass PtdIns(3,4,5)P 3 in vivo vorübergehend in Vesikel um den männlichen Vorkern zum Zeitpunkt der Bildung der Kernhülle und um männliche und weibliche Vorkerne vor der Membranfusion lokalisiert ist. Wir veranschaulichen, dass die Klasse-I-PI3K-Aktivität auch für die Fusion der weiblichen und männlichen Vorkernmembranen notwendig ist. Wir demonstrieren mit Koinzidenz-amplifiziertem Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET), der mit Fluoreszenzlebensdauer-Imaging-Mikroskopie (FLIM) überwacht wurde, eine Protein-Lipid-Wechselwirkung von Rab7 GTPase und PtdIns(3,4,5)P 3 , die während der Fusion der Vorkernmembran auftritt, um die Kernhülle der Zygote. Wir präsentieren ein Arbeitsmodell, das mehrere molekulare Schritte in den Reaktionswegen umfasst, die die Fusion von Kernhüllenmembranen steuern. © 2017. Herausgegeben von The Company of Biologists Ltd.

Ansari, Salim Troelenberg, Nicole Dao, Van Anh Richter, Tobias Klingler, Martin

Die Unterscheidung von anterior und posterior ist ein entscheidender erster Schritt in der Tierembryogenese. Bei der Fliege Drosophila wird diese Achse durch morphogenetische Gradienten etabliert, die von der Mutter beigesteuert werden, die zygotische Zielgene regulieren. Dieses Prinzip gilt allgemein für Insekten, unterscheidet sich jedoch grundlegend von Vertebraten, bei denen zygotische Gene und Wnt-Signale erforderlich sind. Wir untersuchten Symmetriebrechungen beim Käfer Tribolium castaneum, der unter den Insekten die eher angestammte Kurzkeim-Embryogenese darstellt. Wir fanden heraus, dass mütterliche Tc-Keimzellen ohne Zellen für die vordere Lokalisation von mütterlichem Tc-Axin erforderlich sind, das die Wnt-Signalübertragung unterdrückt und die Expression von anterioren zygotischen Genen fördert. Sowohl RNAi, die auf Tc-Keimzellen abzielen, als auch doppelte RNAi, die die zygotischen Gene Tc-Homeobrain und Tc-zen1 zerstören, führten zur Bildung einer zweiten Wachstumszone an der Vorderseite, die zu Doppelabdomen-Phänotypen führte. Umgekehrt führte die Störung von zwei posterioren Faktoren, Tc-caudal und Wnt, zu doppelt-anterioren Phänotypen. Diese Ergebnisse zeigen, dass mütterliche und zygotische Mechanismen, einschließlich der Wnt-Signalgebung, erforderlich sind, um die Embryopolarität herzustellen und die Segmentierungsuhr in einem kurzkeimigen Insekt zu induzieren. PMID:29432152

Sucar, Sofia Moore, Ginger L. Ard, Melissa E. Ring, Brian C.

Der Mangroven-Killerfisch, Kryptolebias marmoratus, ist aufgrund seiner selbstbefruchtenden Fortpflanzungsart mit einem Ovotestis einzigartig unter den Wirbeltieren. Als Ergebnis stellt es ein einfaches und wünschenswertes Wirbeltiermodell für die Entwicklungsgenetik dar, da es leicht zu pflegen ist, die Geschlechtsreife in etwa 100 Tagen erreicht und eine überschaubare Anzahl relativ klarer Embryonen liefert. Nach der Etablierung und Charakterisierung eines anfänglichen Mutagenese-Pilotscreens unter Verwendung von N-Ethyl-N-Nitrosoharnstoff wurde ein genetischer Screen über drei Generationen durchgeführt, um die Vererbbarkeit der zygotischen Allelmutanten zu bestätigen und gleichzeitig einen Score für homozygot rezessiv mutierte sterile F2-Fische zu erzielen. Von insgesamt 307 gescreenten F2-Fischen wurden 10 1° Männchen, 16 steril, 92 Wildtyp und die restlichen 189 Träger von zygotisch-rezessiven Allelen gefunden. Diese Träger produzierten wie erwartet 25 % Nachkommen, die mehrere zygotische Phänotypen zeigten, die denen ähnlich waren, die zuvor bei Zebrafischen und in dem oben erwähnten Pilotscreening beschrieben wurden. Interessanterweise wurden neue Phänotypen wie goldener Dotter, kein Stamm und kurzer Schwanz beobachtet. Die Geschwister steriler F2-Mutanten wurden verwendet, um eine F3-Generation zu erzeugen, um die familiäre Sterilität zu bestätigen. Von den 284 F3-Fischen, die zu 10 zuvor identifizierten sterilen Familien gehören, wurden 12 als 1°-Männchen, 69 als Wildtyp, 83 als steril und 120 als */+ (entweder Wildtyp oder Träger) mit undefiniert klassifiziert Genotypen. Dieser Screen liefert den prinzipiellen Beweis dafür, dass K. marmoratus ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für die Entwicklungsgenetik ist und verwendet werden kann, um Mutationen zu identifizieren, die die Fruchtbarkeit beeinträchtigen. PMID: 26801648

Asmarinah Syauqy, Ahmad Umar, Liya Agustin Lestari, Silvia Werdhy Mansyur, Eliza Hestiantoro, Andon Paradowszka-Dogan, Agnieszka

Diese Studie zielte darauf ab, die Chromatinreife und -integrität der Spermien zu bewerten, die in qualitativ hochwertige Eizellen im Rahmen eines In-vitro-Fertilisation-intrazytoplasmatische Spermieninjektionsprogramms (IVF-ICSI) injiziert wurden. Als Funktion ihrer Korrelation zur Zygotenentwicklung, d. h. Embryobildung und Spaltungsrate, wurde ein Cut-off-Wert der Spermienchromatinreife und -integrität entwickelt. In der Studie wurde die Chromatinreife der Spermien mit Anilinblau (AB)-Färbung beurteilt, während Toluidinblau (TB)-Färbung zur Beurteilung der Chromatinintegrität der Spermien verwendet wurde. In dieser Studie wurden Ejakulate von 59 ICSI-Patienten und 46 fruchtbaren normozoospermischen Spendern zur Bestimmung der Normalwerte des Spermienchromatinstatus verwendet. Die Embryobildungs- und -spaltungsraten wurden für den Zeitraum von 3 Tagen nach ICSI beobachtet. Es gab einen signifikanten Unterschied im Prozentsatz von Spermien mit reifem Chromatin zwischen Ejakulat von ICSI-Patienten und fruchtbaren Spendern (p=0,020), während es keinen signifikanten Unterschied in der Spermienchromatin-Integrität beider Proben gab (p=0,120). Es gab keine signifikante Korrelation zwischen der Spermienchromatinreife und der Embryobildungs- oder -spaltungsrate sowie der Spermienchromatinintegrität zu beiden Parametern der Zygotenentwicklung (p>0,05). Darüber hinaus fanden wir, dass der Cut-Off-Wert der Spermienchromatinreife und -integrität der fruchtbaren normozoospermischen Ejakulate 87,2% bzw. 80,2% betrug. Unter Verwendung der Cut-offs fanden wir eine niedrige Spermienchromatinreife auf der Ebene der Zygote (p=0,022 r=0,371), während die Spermienchromatinintegrität auf der Ebene der Zygotenentwicklung nach ICSI schlecht war. AB: Anilinblau CMA3: Chromomycin A3 ICSI: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion IVF: In-vitro-Fertilisation PBS: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung SPSS

Aghaz, Faranak Hajarian, Hadi KaramiShabankareh, Hamed

Diese Studie wurde durchgeführt, um die Auswirkungen einer Supplementation von Kalium-Simplex-optimiertem Medium (KSOM-aa) mit verschiedenen Sericinkonzentrationen (0, 0,1, 0,5, 1 und 2,5 %) auf Schafzygoten zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ergänzung von Oozyten-in-vitro-Kulturmedium mit einer optimalen Sericin-Konzentration (0,1 und 0,5%) positive Auswirkungen auf die Entwicklungskompetenz von in vitro-abgeleiteten Schafembryonen haben kann. Copyright © 2015 Gesellschaft für Fortpflanzungsbiologie & Institut für Tierreproduktion und Lebensmittelforschung der Polnischen Akademie der Wissenschaften in Olsztyn. Herausgegeben von Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. Alle Rechte vorbehalten.

Die Befruchtung löst den Aufbau einer Zellwand um die Eizelle von drei Braunalgen, Fucus vesiculosus, F. distichus und F. inflatus, aus. Während der ersten 24 Stunden der synchronen Embryonalentwicklung werden der Zellwand ständig neue Polysaccharid-Polymere hinzugefügt. Dieser Wandaufbau beinhaltet die extrazelluläre Ablagerung von fibrillärem Material durch zytoplasmatische Vesikel, die mit der Plasmamembran verschmelzen. Eine Stunde nach der Befruchtung kann eine zytoplasmafreie fragmentierte Wand isoliert werden, die gleiche Mengen an Cellulose und Alginsäure enthält, ohne dass fucosehaltige Polymere (Fucane) vorhanden sind. Eine durch orientierte Zellulosemikrofibrillen verursachte Doppelbrechung der Wand wird in allen Zygoten erst nach 4 Stunden nachgewiesen, wonach intakte Zellwände isoliert werden können, die die Form der Zygote beibehalten. Diese Wände haben ein relativ niedriges Verhältnis von Fucose zu Xylose und wenig Sulfat im Vergleich zu Wänden von älteren Embryonen. Wenn Wandextrakte von 4-Stunden-Zygoten einer Celluloseacetat-Elektrophorese bei pH 7 unterzogen werden, kann ein einzelnes Fucan (F(1)) nachgewiesen werden. Nach 12 Stunden bestehen gereinigte Zellwände aus Fucanen, die ein relativ hohes Verhältnis von Fucose zu Xylose und hohe Sulfatkonzentrationen enthalten, und enthalten ein zweites Fucan (F(2)), das sich elektrophoretisch von F(1) unterscheidet. F(2) scheint nur in einem lokalisierten Bereich der Wand abgelagert zu werden, der sich verlängert, um die Rhizoidenzelle zu bilden. Während des gesamten Wandaufbaus veränderte das Polyuronid-Blockcopolymer Alginsäure sein Verhältnis von Mannuronsäure (M) zu Guluronsäure (G) (0,33-0,55) oder seine Blockverteilung (MG, 54 % GG, 30 % MM, 16 % ). Von 6 bis 24 Stunden Embryoentwicklung ist der Anteil der wichtigsten Polysaccharidkomponenten, die in gereinigten Wänden gefunden werden, stabil. Alginsäure ist das Hauptpolymer und macht etwa 60 % der Gesamtwand aus, während Cellulose und die Fucane jeweils etwa 20 % des Rests ausmachen. Während des extrazellulären Aufbaus dieser Wand werden die intrazellulären Spiegel des Speicherglucans

Wir demonstrieren hier die Möglichkeit, phänotypisch normale, fruchtbare Maispflanzen durch in vitro-Fertilisation von isolierten, einzelnen Spermien und Eizellen mittels Elektrofusion zu regenerieren. Die Technik führt zur hocheffizienten Bildung von polaren Zygoten, globulären Strukturen, Proembryonen und Embryonen in der Übergangsphase und zur Bildung von Pflanzen aus individuell kultivierten Fusionsprodukten. Die Regeneration von Pflanzen erfolgt durch Embryogenese und gelegentlich durch Polyembryonie und Organogenese. Blühende Pflanzen können innerhalb von 100 Tagen nach der Gametenfusion erhalten werden. Regenerierte Pflanzen wurden durch karyologische und morphologische Analysen untersucht und die Segregation der Kernfarbe wurde bestimmt. Die Hybridnatur der Pflanzen wurde bestätigt. PMID:12271084

Dilkes, Brian P. Dante, Ricardo A. Coelho, Cintia Larkins, Brian A

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Variabilität der Endoreduplikation in Endospermen von Mais-Inzuchtlinien zu beurteilen. Zwischen den Dellenarten des Mittleren Westens wurden nur geringe Unterschiede festgestellt, und bei Popcorn wurden hohe Endoreduplikationsraten beobachtet. Die Endoreduplikation unterscheidet sich zwischen den Inzuchtlinien 13-18 Tage nach der Bestäubung, und die durchflusszytometrische Analyse des Ploidieniveaus war bis 20 DAP möglich. Um die genetische Regulation der Endoreduplikation zu untersuchen, wurden vier Inzuchten mit B73 gekreuzt und sich entwickelnde Endospermen von beiden elterlichen, reziproken F(1)- und Rückkreuzungsgenerationen einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Aus diesen Daten wurden drei Messungen der Endoreduplikation berechnet und als quantitative genetische Merkmale analysiert. Es wurden mehrere Modelle der Merkmalsvererbung berücksichtigt, darunter triploide, diploide, sporophytische mütterliche und mütterliche und väterliche zygotische Kernvererbung. Es wurden mütterliche zygotische Wirkungen, die oft als eine Form der elterlichen Prägung angesehen werden, und mütterliche sporophytische Wirkungen festgestellt. Um die Durchführbarkeit der Introgression eines Phänotyps mit hoher Endoreduplikation in eine Dent-Inzuchtlinie des Mittleren Westens zu testen, wurde eine Rückkreuzungspopulation aus B73 x Sg18 erzeugt. Endoreduplikationsniveaus von Eltern und Nachkommen wurden verglichen und die Heritabilität bewertet. Die aus diesen Daten berechneten Heritabilitäten stimmen im Allgemeinen mit den in den größeren Kreuzungsexperimenten berechneten Werten überein.

Pultz, M A Zimmerman, K K Alto, N M Kaeberlein, M Lange, S K Pitt, J N Reeves, N L Zehrung, D L

Wir haben auf zygotische embryonale letale Mutationen untersucht, die die Kutikularmorphologie bei Nasonia vitripennis (Hymenoptera Chalcidoidea) beeinflussen. Unser allgemeines Ziel war es, die Verwendung von Nasonia zur genetischen Untersuchung der Erhaltung und Veränderung regulatorischer Gensysteme zu untersuchen, um die Vielfalt der im Laufe der Evolution entstandenen Entwicklungsstrategien zu verstehen. Unser Ziel ist es insbesondere, die anteroposterioren Musterbildungs-Genfunktionen in zwei langen Keimbandinsekten, Nasonia und Drosophila, zu vergleichen. In Nasonia entwickeln sich unbefruchtete Eier als haploide Männchen, während sich befruchtete Eier als diploide Weibchen entwickeln, sodass das gesamte Genom auf rezessive zygotische Mutationen untersucht werden kann, indem die Nachkommen von F1-Weibchen untersucht werden. Wir beschreiben 74 von >100 Linien mit embryonalen kutikulären Mutanten-Phänotypen, einschließlich Vertretern von Koordinaten-, Lücken-, Paarregel-, Segmentpolaritäts-, Homöotik- und Polycomb-Gruppenfunktionen, sowie Mutanten mit neuartigen Phänotypen, die nicht direkt mit denen bekannter Drosophila-Gene vergleichbar sind . Wir schließen daraus, dass Nasonia ein kontrollierbarer experimenteller Organismus für vergleichende entwicklungsgenetische Studien ist. Die hier isolierten Mutanten haben begonnen, das Ausmaß der Konservierung und Veränderung der genetischen Programme zu skizzieren, die die Embryonalmusterung in Nasonia und Drosophila kontrollieren. PMID:10866651

Redel, Bethany K. Beaton, Benjamin P. Spate, Lee D. Benne, Joshua A. Murphy, Stephanie L.O'Gorman, Chad W. Spate, Anna M. Prather, Randall S. Wells, Kevin D

Die Produktion von Cas9-mRNA in vitro erfordert typischerweise die Zugabe einer 5´-Kappe und einer 3´-Polyadenylierung. Es wurde ein Plasmid konstruiert, das den T7-Promotor, gefolgt von EMCV IRES und einer Cas9-Kodierungsregion enthielt. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verwendung der Metastasen-assoziierten Lungen-Adenokarzinom-Transkript 1 (Malat1) Triplex-Struktur stromabwärts einer IRES/Cas9-Expressionskassette eine Polyadenylierung von in vitro produzierter mRNA unnötig machen würde. Eine Sequenz aus dem mMalat1-Gen wurde stromabwärts der oben beschriebenen IRES/Cas9-Kassette kloniert. Eine mRNA-Konzentrationskurve wurde entweder mit kommerziell erhältlicher Cas9-mRNA oder dem IRES/Cas9/Triplex durch Injektion in Schweinezygoten erstellt. Blastozysten wurden genotypisiert, um zu bestimmen, ob Unterschiede im Prozentsatz der modifizierten Embryonen bestanden. Die Konzentrationskurve identifizierte Unterschiede aufgrund der Konzentration und des injizierten RNA-Typs. Die einstufige Produktion von Cas9-mRNA bietet eine alternative Quelle für Cas9 zur Verwendung bei Zygoteninjektionen.

de Vega-Bartol, José J Simões, Marta Lorenz, W Walter Rodrigues, Andreia S Alba, Rob Dean, Jeffrey F D Miguel, Célia M

Während der Embryogenese wird der Pflanzenkörperplan erstellt und die Meristeme festgelegt, die für das gesamte postembryonale Wachstum verantwortlich sind. Die molekularen Mechanismen der Embryogenese von Nadelbäumen sind noch weitgehend unbekannt. Ihre Aufklärung kann wertvolle Informationen liefern, um zu klären, ob die unterschiedlichen Merkmale der Embryonalentwicklung bei Angiospermen und Gymnospermen aus einer unterschiedlichen Genregulation resultieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir die erste transkriptomische Analyse der zygotischen Embryonalentwicklung bei einer Nadelbaumart (Pinus pinaster) durchgeführt, wobei wir unsere Studie insbesondere auf regulatorische Gene konzentrierten, die während der Entwicklung von Pflanzenembryonen eine wichtige Rolle spielen, nämlich epigenetische Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Die Mikroarray-Analyse der zygotischen Embryogenese von P. pinaster wurde in fünf Phasen der Embryonalentwicklung von der frühen Entwicklung bis zum reifen Embryo durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die meisten Veränderungen in den Transkriptspiegeln im ersten und letzten Embryo-Stadium-zu-Stadium-Übergang auftraten, nämlich vom frühen zum präkotyledonären Embryo und vom kotyledonären zum reifen Embryo. Eine Analyse der funktionellen Kategorien von Genen, die durch Embryogenese unterschiedlich exprimiert wurden, zeigte mehrere epigenetische Regulationsmechanismen auf. Während mutmaßliche Orthologe von Transkripten, die mit Mechanismen assoziiert sind, die auf transponierbare Elemente und repetitive Sequenzen abzielen, in der frühen Embryogenese stark exprimiert wurden, schien die PRC2-vermittelte Repression von Genen während der späten Embryogenese relevanter zu sein. Auf der anderen Seite schienen Funktionen im Zusammenhang mit sRNA-Signalwegen in allen Stadien der Embryonalentwicklung unterschiedlich reguliert zu sein, mit einer Prävalenz von miRNA-Funktionen in der mittleren bis späten Embryogenese. Die Identifizierung von mutmaßlichen Transkriptionsfaktor-Genen, die zwischen aufeinanderfolgenden Embryostadien unterschiedlich reguliert werden, war ein starker Hinweis auf die Relevanz von Auxin-Antworten und der Regulation von Auxin-Trägern während der frühen Embryogenese. Solche Reaktionen könnten an der Etablierung von Embryomustern beteiligt sein. Später im

Hintergrund Während der Embryogenese wird der Pflanzenkörperplan erstellt und die Meristeme, die für das gesamte postembryonale Wachstum verantwortlich sind, festgelegt. Die molekularen Mechanismen der Embryogenese von Nadelbäumen sind noch weitgehend unbekannt. Ihre Aufklärung kann wertvolle Informationen liefern, um zu klären, ob die unterschiedlichen Merkmale der Embryonalentwicklung bei Angiospermen und Gymnospermen aus einer unterschiedlichen Genregulation resultieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir die erste transkriptomische Analyse der zygotischen Embryoentwicklung in einer Nadelbaumart (Pinus pinaster) durchgeführt, wobei wir unsere Studie insbesondere auf regulatorische Gene konzentrierten, die während der Entwicklung von Pflanzenembryonen eine wichtige Rolle spielen, nämlich epigenetische Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Ergebnisse Microarray-Analyse der zygotischen Embryogenese von P. pinaster wurde in fünf Phasen der Embryonalentwicklung von der frühen Entwicklung bis zum reifen Embryo durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die meisten Veränderungen in den Transkriptspiegeln im ersten und letzten Embryo-Stadium-zu-Stadium-Übergang auftraten, nämlich vom frühen zum präkotyledonären Embryo und vom kotyledonären zum reifen Embryo. Eine Analyse der funktionellen Kategorien von Genen, die durch Embryogenese unterschiedlich exprimiert wurden, zeigte mehrere epigenetische Regulationsmechanismen auf. Während mutmaßliche Orthologe von Transkripten, die mit Mechanismen assoziiert sind, die auf transponierbare Elemente und repetitive Sequenzen abzielen, in der frühen Embryogenese stark exprimiert wurden, schien die PRC2-vermittelte Repression von Genen während der späten Embryogenese relevanter zu sein. Auf der anderen Seite schienen Funktionen im Zusammenhang mit sRNA-Signalwegen in allen Stadien der Embryonalentwicklung unterschiedlich reguliert zu sein, wobei miRNA-Funktionen in der mittleren bis späten Embryogenese vorherrschen. Die Identifizierung von mutmaßlichen Transkriptionsfaktor-Genen, die zwischen aufeinanderfolgenden Embryostadien unterschiedlich reguliert werden, war ein starker Hinweis auf die Relevanz von Auxin-Antworten und der Regulation von Auxin-Trägern während der frühen Embryogenese. Solche Reaktionen könnten an der Etablierung von Embryomustern beteiligt sein

Jin, Bo Seki, Shinsuke Paredes, Estefania Qiu, Juan Shi, Yanbin Zhang, Zhenqiang Ma, Chao Jiang, Shuyan Li, Jiaqi Yuan, Feng Wang, Shu Shao, Xiaoguang Mazur, Peter

In dieser Studie wurden reife weibliche Mäuse des ICR-Stammes zur Superovultation induziert, gepaart und entweder im Zygoten- oder frühen Morula-Stadium gesammelt. Embryonen, suspendiert in 1 M Ethylenglycol in PBS mit 10 mg/L Snomax für 15 min, dann in einen Probenhalter in eine Linkam-Kryostage überführt, auf 7 °C abgekühlt und beimpft und dann beobachtet und fotografiert, während sie auf -70 °C gekühlt wurden bei 0,5-20 °C/min. Die intrazelluläre Eisbildung (IIF) wurde als abruptes „Flashen“ beobachtet. In dieser Studie wurden zwei Arten von Flashing oder IIF beobachtet. Extrazelluläres Einfrieren trat im Mittel bei -7,7 °C auf. Bei Morulae wurden etwa 25% innerhalb von ±1 °C der extrazellulären Eisbildung (EIF) dunkel. Diese bezeichnen wir als „Hochtemperatur-Flasher“. In Zygoten gab es keine Hochtemperatur-Flasher. Alle Zygoten blitzten bei Temperaturen deutlich unter der Temperatur für EIF auf. Vermutlich waren Hochtemperatur-Flasher eine Folge von Membranschäden vor EIF oder Schäden von EIF. Wir werden sie nicht weiter besprechen. In den meisten Fällen trat IIF deutlich unter -7,7 °C auf, die wir als "Niedrigtemperatur"-Flasher bezeichnen. Keine Flasher mit einer Kühlrate (CR) von 0,5 °C/min in entweder Zygoten oder Morulae Fast alle blitzten mit CR von 4 °C/min oder höher auf, aber die Temperaturverteilung ist bei Morulae viel breiter als bei Zygoten Außerdem ist die mittlere Blitztemperatur bei Morulae viel höher (-20,9 °C) als bei Zygoten (-40,3 ° C). Wir berechneten die Kinetik des Wasserverlusts in Bezug auf CR und Temperatur sowohl in Mauszygoten als auch in Morulae basierend auf veröffentlichten Schätzungen von Lp und Ea. Die resultierenden Dehydrationskurven kombiniert mit Kenntnissen der Keimbildungstemperatur des Embryos erlaubt eine Schätzung der Wahrscheinlichkeit von IIF als Funktion von CR und der Minustemperatur. Die Übereinstimmung zwischen diesen berechneten Wahrscheinlichkeiten und den beobachteten Werten ist gut. Copyright © 2016 Die Autoren. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Sershen Varghese, B Naidoo, C Pammenter, N W

Zygotische Embryonen aus widerspenstigen Samen sind empfindlich gegenüber Austrocknung. Trotz ihrer Empfindlichkeit ist für ihre erfolgreiche Kryokonservierung eine schnelle partielle Dehydration erforderlich. Dehydration zu Wasserinhaltsstoffen (WCs), die eine tödliche Eiskristallbildung während des Abkühlens und Wiedererwärmens verhindern, führt jedoch im Allgemeinen zu Austrocknungsschäden. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen einer schnellen Dehydration auf ausgewählte Stress-Biomarker (Elektrolytleckage, Atemkompetenz, Proteinsyntheserate, Superoxidproduktion, Lipidperoxidation, antioxidative Aktivität und Grad der zellulären Vakuolisierung) in zygotischen Embryonen von vier widerspenstigen ausgesäten Arten. Die meisten Biomarker zeigten Unterschiede im Stress-/Schadensniveau von Embryonen an, die zu 0,4 g·g (-1) getrocknet wurden, innerhalb der Spezies standen diese Veränderungen jedoch oft nicht in Zusammenhang mit der Lebensfähigkeit und dem prozentualen Wasserverlust, wenn die Daten für die vier Spezies gepoolt wurden Regressionsanalysen. Dehydration-induzierter Elektrolytverlust war jedoch positiv mit dem prozentualen Wasserverlust verbunden, während Biomarker der zellulären Vakuolisierung sowohl mit dem prozentualen Wasserverlust als auch mit der Lebensfähigkeit positiv verbunden waren. Dies legt nahe, dass Elektrolytverlust und der Grad der zellulären Vakuolisierung verwendet werden können, um durch Dehydration induzierten Stress/Schäden zu quantifizieren. Biomarker wie die Superoxidproduktion sind zwar nützlich, um die Art des auftretenden Dehydrationsstresses zu bestimmen, können jedoch die Auswirkungen verschiedener WCs/Trocknungszeiten möglicherweise nicht unterscheiden. Unabhängig davon, welcher Biomarker verwendet wird, deuten die Daten darauf hin, dass das Verständnis der Unterschiede in der Austrocknungsempfindlichkeit zwischen widerspenstig gesäten Arten eine Herausforderung bleiben wird, es sei denn, diese Biomarker werden mit einem generischen Austrocknungsstressindex in Verbindung gebracht, der die Auswirkungen des prozentualen Wasserverlusts und der Trocknungszeit integriert. © 2016 Deutsche Botanische Gesellschaft und Königliche Botanische Gesellschaft der Niederlande.

Chaigne, Agathe Campillo, Clément Voituriez, Raphaël Gov, Nir S. Sykes, Cécile Verlhac, Marie-Hélène Terret, Marie-Emilie

Die Position der mitotischen Spindel beruht auf Wechselwirkungen zwischen astralen Mikrotubuli, die von Zentrosomen nukleiert werden, und einem starren Kortex. Einige Zellen, wie beispielsweise Maus-Oozyten, besitzen keine Zentrosomen und astralen Mikrotubuli. Diese Zellen verlassen sich nur auf Aktin und auf einen weichen Kortex, um ihre Spindel außermittig zu positionieren und asymmetrischen Teilungen zu unterziehen. Während die erste embryonale Teilung der Maus auch ohne Zentrosomen stattfindet, ist sie symmetrisch und es ist nicht viel darüber bekannt, wie die Spindel genau im Zellzentrum positioniert ist. Mit interdisziplinären Ansätzen zeigen wir, dass die Positionierung der zygotischen Spindel einem dreistufigen Prozess folgt: (1) Grobzentrierung der Vorkerne basierend auf der Dynamik eines F-Aktin/Myosin-Vb-Geflechts (2) Feinzentrierung der Metaphaseplatte in Abhängigkeit von a hohe kortikale Spannung (3) passive Aufrechterhaltung im Zellzentrum. Insgesamt zeigen wir, dass die F-Aktin-abhängige Mechanik den Wechsel zwischen asymmetrischer und symmetrischer Teilung bewirkt, der beim Übergang von der Eizelle zum Embryo erforderlich ist.

Friberg, Urban Rice, William R.

Schwestern und Brüder sind in Bezug auf die Geschlechtschromosomen, die sie von ihrem heterogametischen Elternteil erben, völlig unabhängig. Dies kann zu einer bisher nicht anerkannten Form eines genetischen Konflikts zwischen den Geschlechtschromosomen führen, der als sexuell antagonistischer zygotischer Antrieb (SA-ZD) bezeichnet wird. SA-ZD kann auftreten, wenn Brüder und Schwestern um begrenzte Ressourcen konkurrieren oder es eine Bruder-Schwester-Paarung in Verbindung mit Inzuchtdepression gibt. Obwohl die Theorie voraussagt, dass SA-ZD weit verbreitet sein und wichtige evolutionäre Prozesse beeinflussen sollte, gibt es wenig empirische Beweise für seine Existenz. Hier diskutieren wir das aktuelle Verständnis von SA-ZD, warum erwartet wird, dass es sich empirischer Entdeckung entzieht, wenn es vorhanden ist, und wie es mit anderen Formen genetischer Konflikte zusammenhängt. PMID:25573714

Aida, Tomomi Nakade, Shota Sakuma, Tetsushi Izu, Yayoi Oishi, Ayu Mochida, Keiji Ishikubo, Harumi Usami, Takako Aizawa, Hidenori Yamamoto, Takashi Tanaka, Kohichi

Obwohl CRISPR/Cas einen einstufigen Knock-in von Genkassetten ermöglicht, ist der Zusammenbau von Targeting-Vektoren mit langen Homologiearmen ein mühsamer Prozess für den Hochdurchsatz-Knock-in. Wir haben kürzlich die CRISPR/Cas-basierte präzise Integration in das Zielchromosomensystem (PITCh) für einen Genkassetten-Knock-in ohne lange Homologiearme entwickelt, der durch Mikrohomologie-vermitteltes End-Joining vermittelt wird. Hier identifizierten wir Exonuklease 1 (Exo1) als Enhancer für PITCh in menschlichen Zellen. Durch die Kombination der Exo1- und PITCh-gerichteten Donorvektoren erreichten wir ein bequemes Knock-in von Genkassetten und floxed Allel in einem Schritt sowohl in menschlichen Zellen als auch in Mauszygoten. Unsere Ergebnisse bieten eine technische Plattform für Hochdurchsatz-Knock-in.

Ballesteros, Daniel Sershen Varghese, Boby Berjak, Patricia Pammenter, Norman W

Die Kryokonservierung ist die vielversprechendste Option für die langfristige Konservierung von Keimplasma von Arten mit widerspenstigen Samen. Der variable Post-Kryo-Erfolg, der mit exzidierten zygotischen Explantaten, die traditionell zur Kryokonservierung verwendet werden, erzielt wird, gibt jedoch seit einiger Zeit Anlass zur Sorge. Unterschiedliche Trocknungsraten zwischen Explantaten verschiedener Spezies, ungleichmäßige Trocknung zwischen Explantaten innerhalb einer Samencharge und ungleichmäßige Trocknung über Gewebe innerhalb einzelner Embryonen könnten zu diesem variablen Erfolg beitragen und diese Phänomene bilden den Schwerpunkt der vorliegenden Studie. Unter Verwendung von zygotischen Explantaten aus einer Reihe widerspenstiger Samenarten, zu denen subtropische zweikeimblättrige Bäume und subtropische einkeimblättrige Geophyten gehörten, zeigte die Studie, dass die Morphologie und Anatomie des Embryos entscheidende Determinanten für die Trocknungseigenschaften der verschiedenen Gewebe sind, aus denen das Explantat besteht , Überleben nach dem Kryo. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Trocknungsraten von Explantaten auf Wassergehalte (WCs) im theoretisch optimalen Bereich für eine erfolgreiche Kryokonservierung speziesspezifisch sind und dass schnellere Trocknungsraten das Überleben nach der Kryokonservierung fördern können. Die große Schwankung des WC zwischen einzelnen Explantaten in Massenproben stellt jedoch eine Herausforderung an die Auswahl des theoretisch optimalen WC für die Kryokonservierung. Als Folge der unterschiedlichen Trocknungsgeschwindigkeiten in den verschiedenen Geweben, aus denen die Explantate bestehen, kann es manchmal wahrscheinlich sein, dass in Geweben, die für die weitere Entwicklung des Embryos verantwortlich sind, entweder tödliche Eiskristallschäden oder Schäden durch Austrocknung auftreten. Die Trocknungszeiten für die Kryokonservierung solcher Explantate sollten daher eher auf der Grundlage des WC von Segmenten, die Wurzel- oder Sprossmeristem enthalten, als auf dem WC der Embryonenmasse ausgewählt werden. Die Trocknungsintensität und -dauer interagieren auch mit der Explantatmorphologie und der Embryo-/Achsengröße und -anatomie, um ein Überleben nach dem Kryo zu bewirken oder auszuschließen. Copyright © 2014 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Grenier, Lisanne Robaire, Bernard Hales, Barbara F.

Die Exposition des Vaters gegenüber Krebschemotherapeutika oder Umweltchemikalien kann nachteilige Auswirkungen auf die Nachkommenschaft haben, die sich im Präimplantationsembryo manifestieren. Die Ziele dieser Studie bestanden darin, die Auswirkungen einer väterlichen Exposition gegenüber Cyclophosphamid, einem Alkylierungsmittel gegen Krebs, auf die Bildung, den Chromatinursprung und die Funktion von Mikronuklei in Rattenembryonen im Spaltungsstadium zu bestimmen. Männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurde 4 Wochen lang Kochsalzlösung oder Cyclophosphamid (6 mg/kg/Tag) verabreicht und mit natürlich zyklischen Weibchen gepaart, um vorkernige Zygoten und 2 bis 8 Zellembryonen zu sammeln. Die mikronukleare Chromatinstruktur wurde mit konfokaler Mikroskopie charakterisiert, um Immunreaktivitäten für H3K9me3, einen Marker für mütterliches Chromatin, und Lamin B, einen Kernmembranmarker, nachzuweisen. Die DNA-Synthese wurde unter Verwendung von EdU (5-Ethinyl-2'-desoxyuridin)-Einbau überwacht. Die Befruchtung durch Cyclophosphamid-exponierte Spermatozoen führte zu einer dramatischen Erhöhung der Mikronuklei in Embryonen im Spaltungsstadium (Kontrollembryonen: 1% bis 5% Embryonen, die von behandelten Männchen gezeugt wurden: 70%). Die Bildung von Mikronuklei erfolgte während der ersten zygotischen Teilung und war mit einer nachfolgenden Entwicklungsverzögerung verbunden. Das Fehlen von H3K9me3 zeigte an, dass diese Mikronuklei väterlichen Ursprungs waren. Die Mikronuklei wiesen eine unvollständige perinukleäre und perinukleoläre Lamin-B1-Membranbildung auf, bauten jedoch EdU im gleichen Ausmaß wie der Hauptnukleus in die DNA ein. Die Bildung von Mikronuklei als Reaktion auf das Vorhandensein eines beschädigten väterlichen Genoms kann eine Rolle bei der Erhöhung der Embryoverlustrate spielen, die mit dem Einsatz von assistierten Reproduktionstechnologien, der Elternschaft bei Krebsüberlebenden und dem Altern des Vaters verbunden ist. PMID:22110683

Wong, Ming-Kin Guan, Daogang Ng, Kaoru Hon Chun Ho, Vincy Wing Sze An, Xiaomeng Li, Runsheng Ren, Xiaoliang

Die Entwicklung von Metazoen erfordert nicht nur eine präzise Differenzierung des Zellschicksals, sondern auch ein genaues Timing der Zellteilung, um eine ordnungsgemäße Entwicklung sicherzustellen. Wie Zellteilungen während der Entwicklung zeitlich koordiniert werden, ist wenig verstanden. Die Embryogenese von Caenorhabditis elegans bietet aufgrund ihrer invarianten Entwicklung und weit verbreiteten Teilungsasynchronitäten eine hervorragende Möglichkeit, diese Koordination zu untersuchen.Eine der am stärksten ausgeprägten Asynchronitäten ist eine signifikante Verzögerung der Zellteilung in zwei Endoderm-Vorläuferzellen, Ea und Ep, im Folgenden als E2 bezeichnet, im Vergleich zu ihren Cousins, die sich hauptsächlich zu Mesoderm-Organen und -Geweben entwickeln. Um die genetische Kontrolle über den endodermspezifischen E2-Teilungszeitpunkt zu entschlüsseln, wurden insgesamt 822 essentielle und konservierte Gene mit RNAi zerstört, gefolgt von einer Quantifizierung der Zellzykluslängen unter Verwendung von Gesamtbildgebung der Embryogenese von C. elegans und automatisierter Abstammung. Interessanterweise führt der Knockdown zahlreicher Gene, die für die Komponenten des allgemeinen Transkriptionswegs oder seiner regulatorischen Faktoren kodieren, zu einer signifikanten Verkürzung der E2-Zellzykluslänge, aber zu einer Zunahme der Zellzykluslänge der verbleibenden Zellen, was auf einen unterschiedlichen Transkriptionsbedarf für den Teilungszeitpunkt zwischen hinweist die Zwei. Die Analyse linienspezifischer RNA-seq-Daten zeigt einen früheren Beginn der Transkription im Endoderm als in anderen Keimblättern, deren Zeitpunkt mit der Geburt von E2 zusammenfällt, was die Annahme stützt, dass die endodermspezifische Verzögerung des E2-Teilungstimings robuste Zygoten erfordert Transkription. Die Verkürzung der E2-Zellzykluslänge ist häufig mit einem Zellmigrationsdefekt und einem Versagen der Gastrulation verbunden. Die Ergebnisse legen nahe, dass eine gewebespezifische Transkriptionsaktivierung erforderlich ist, um die Schicksalsdifferenzierung, den Teilungszeitpunkt und die Zellmigration zu koordinieren, um eine ordnungsgemäße Entwicklung sicherzustellen. PMID:27056332

Monteiro, Joana Aires, Rita Becker, Jörg D. Jacinto, António Certal, Ana C. Rodríguez-León, Joaquín

Die Aktivität von Ionenkanälen und Transportern erzeugt ionenspezifische Flüsse, die elektrische und/oder chemische Signale mit biologischer Bedeutung kodieren. Obwohl seit langem bekannt ist, dass einige dieser Signale entscheidend für die Regeneration sind, wurden erst in den letzten Jahren die entsprechenden molekularen Quellen anhand von hauptsächlich wirbellosen oder larvalen Wirbeltiermodellen identifiziert. Wir haben die Schwanzflosse von erwachsenen Zebrafischen als Modell verwendet, um zu untersuchen, welche und wie Ionentransporter die Regeneration in einem erwachsenen Wirbeltiermodell beeinflussen. Durch die kombinierte Anwendung biophysikalischer und molekularer Ansätze zeigen wir, dass die V-ATPase-Aktivität zu einem regenerationsspezifischen H+-Ef`flux beiträgt. Der Beginn und die Intensität sowohl der V-ATPase-Expression als auch des H+-Efflux korrelieren mit der unterschiedlichen Regenerationsrate entlang der proximal-distalen Achse. Darüber hinaus zeigen wir, dass die V-ATPase-Hemmung die Regeneration bei erwachsenen Wirbeltieren beeinträchtigt. Insbesondere ist die Aktivität dieser H+-Pumpe für die Expression von aldh 1 a 2 und mkp3, die Proliferation von Blastemzellen und die Innervation der Flossen notwendig. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht über die Rolle der V-ATPase während der Regeneration von adulten Wirbeltieren.

Monteiro, Joana Aires, Rita Becker, Jörg D. Jacinto, António Certal, Ana C. Rodríguez-León, Joaquín

Die Aktivität von Ionenkanälen und Transportern erzeugt ionenspezifische Flüsse, die elektrische und/oder chemische Signale mit biologischer Bedeutung kodieren. Obwohl seit langem bekannt ist, dass einige dieser Signale für die Regeneration entscheidend sind, wurden die entsprechenden molekularen Quellen erst in den letzten Jahren mit hauptsächlich wirbellosen oder larvalen Wirbeltiermodellen identifiziert. Wir haben die Schwanzflosse von erwachsenen Zebrafischen als Modell verwendet, um zu untersuchen, welche und wie Ionentransporter die Regeneration in einem erwachsenen Wirbeltiermodell beeinflussen. Durch den kombinierten Einsatz von biophysikalischen und molekularen Ansätzen zeigen wir, dass die V-ATPase-Aktivität zu einem regenerationsspezifischen H+-Ef`flux beiträgt. Der Beginn und die Intensität sowohl der V-ATPase-Expression als auch des H+-Efflux korrelieren mit der unterschiedlichen Regenerationsrate entlang der proximal-distalen Achse. Darüber hinaus zeigen wir, dass die V-ATPase-Hemmung die Regeneration bei erwachsenen Wirbeltieren beeinträchtigt. Insbesondere ist die Aktivität dieser H+-Pumpe für die Expression von aldh 1 a 2 und mkp3, die Proliferation von Blastemzellen und die Innervation der Flossen notwendig. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht über die Rolle der V-ATPase während der Regeneration von adulten Wirbeltieren. PMID:24671205

Die Entwicklung der Rhizoidenzellen der Grünalge Ulva mutabilis wurde auf ultrastruktureller Ebene untersucht, wobei besonderes Augenmerk auf den Befestigungsmechanismus der Pflanze gelegt wurde. Zytochemische Daten bezüglich der anfänglichen Besiedlung der frühen Zygote werden ebenfalls angegeben. Auf der Grundlage der histochemischen Färbung und Enzymbehandlung wird gefolgert, dass sich das von den Rhizoiden sezernierte adhäsive Material chemisch von dem unterscheidet, das von der Zygote während der anfänglichen Besiedlung der Alge sezerniert wird.

Katoh, M Cacheiro, N L Cornett, C V Cain, K T Rutledge, J C Generoso, W M

Frühere Studien in diesem Labor zeigten, dass Ethylenoxid (EtO) oder Ethylmethansulfonat (EMS) bei einigen der überlebenden Föten zu einer hohen Häufigkeit von Midgestation und späten fetalen Todesfällen sowie von Missbildungen führten, wenn weibliche Mäuse zum Zeitpunkt der Befruchtung ihrer Eier oder während des frühen Vorkernstadiums der Zygote. Die Wirkungen der beiden Mutagene sind praktisch identisch. Daher wurden bei der Untersuchung der Mechanismen, die für die dramatischen Effekte in den frühen vorkernigen Zygoten verantwortlich sind, die beiden Verbindungen in den Experimenten austauschbar verwendet. Zunächst wurde eine reziproke Zygoten-Transfer-Studie durchgeführt, um festzustellen, ob die Wirkung direkt auf die Zygoten oder indirekt über maternale Toxizität erfolgt. Und zweitens wurden zytogenetische Analysen von pronuklearen Metaphasen, Embryonen mit früher Spaltung und Föten in der Mitte der Schwangerschaft durchgeführt. Das Zygotentransplantationsexperiment schließt die maternale Toxizität als Faktor der fetalen Fehlentwicklung aus. Zusammen mit der in den früheren Studien beobachteten strengen Stadienspezifität weist dieses Ergebnis auf eine genetische Ursache für die Auffälligkeiten hin. Die zytogenetischen Studien zeigten jedoch keine strukturellen oder numerischen Chromosomenaberrationen. Da auch intragene Basenveränderungen und -deletionen ausgeschlossen werden können, scheint es, dass die fraglichen Läsionen, die in Zygoten durch die beiden Mutagene induziert werden, sich von herkömmlichen unterscheiden und daher in der experimentellen Säugetiermutagenese neu sein könnten. Alternativ könnte der Mechanismus einen nicht-mutativen „Imprinting“-Prozess beinhalten, der Veränderungen in der Genexpression verursacht.

Bevacqua, RJ Fernandez-Martin, R. Canel, NG Gibbons, A. Texeira, D. Lange, F. Vans Landschoot, G. Savy, V. Briski, O. Hiriart, MI Grueso, E. Ivics, Z. Taboga, O. Kues, WA Ferraris, S.

Transgene Haustiere stellen eine Alternative zu Bioreaktoren für die großtechnische Produktion von Biopharmazeutika dar und könnten auch genauere biomedizinische Modelle liefern als Nagetiere. Ihre Erzeugung bleibt jedoch ineffizient. Kürzlich ermöglichten DNA-Transposons verbesserte Transgeneseeffizienzen bei Mäusen und Schweinen. In dieser Arbeit wurden Tn5- und Dornröschen(SB)-Transposonsysteme auf Transgenese durch einfache zytoplasmatische Injektion in Nutztierzygoten untersucht. Im Fall von Tn5 wurde der Transposomenkomplex aus Transposon-Nukleinsäure und Tn5-Protein injiziert. Im Fall von SB wurden die supercoiled-Plasmide, die ein Transposon kodieren, und die SB-Transposase gemeinsam injiziert. In vitro hergestellte Rinderzygoten wurden verwendet, um die zytoplasmatischen Injektionsbedingungen zu bestimmen. Die in vitro kultivierten Blastozysten wurden auf Reportergenexpression untersucht und genotypisiert. Anschließend wurden beide Transposonsysteme in saisonal verfügbare Schafzygoten injiziert, wobei Transposons verwendet wurden, die den rekombinanten humanen Faktor IX trugen, der durch den Beta-Lactoglobulin-Promotor angetrieben wurde. Der Tn5-Ansatz führte nicht zu transgenen Lämmern. Im Gegensatz dazu führte die Dornröschen-Injektion dazu, dass 2 Lämmer (29%) das Transgen trugen. Beide Tiere zeigten einen zellulären Mosaikismus des Transgens. Das extraembryonale Gewebe (Plazenta oder Nabelschnur) von drei weiteren Tieren war ebenfalls transgen. Diese Ergebnisse zeigen, dass transpositionale Transgenese durch zytoplasmatische Injektion von SB-Transposon-Komponenten für die Produktion von transgenen Lämmern von pharmazeutischem Interesse angewendet werden kann. PMID:28301581

Chu, Van Trung Weber, Timm Graf, Robin Sommermann, Thomas Petsch, Kerstin Sack, Ulrike Volchkov, Pavel Rajewsky, Klaus Kühn, Ralf

Das CRISPR/Cas9-System wird zunehmend zur Geninaktivierung in Mauszygoten verwendet, aber die homologiegerichtete Mutagenese und die Verwendung von Inzuchtembryonen sind weniger etabliert. Insbesondere wurden keine Rosa26-Knock-in-Allele für die Insertion von Transgenen in eine genomische „Safe Harbor“-Stelle hergestellt. Hier haben wir CRISPR/Cas9 für den Knock-in von 8-11 kb Inserts in Rosa26 von C57BL/6 Zygoten angewendet. Wir fanden heraus, dass 10-20 % der lebenden Welpen, die aus mikroinjizierten Zygoten stammten, Gründermutanten waren, ohne offensichtliche Off-Target-Effekte, und bis zu 50 % Knock-in-Embryonen wurden nach Koinjektion von Cas9-mRNA und -Protein gewonnen. Mit diesem Ansatz haben wir eine neue Mauslinie für die Cre/loxP-abhängige Expression von Cas9 etabliert. Insgesamt unterstützen unsere Protokolle und Ressourcen die schnelle und direkte Erzeugung neuer Rosa26-Knock-in-Allele und der Cas9-vermittelten In-vivo-Gen-Editierung im weit verbreiteten Inzuchtstamm C57BL/6.

Del Carmen Rodríguez-Gacio, María Nicolás, Carlos Matilla, Angel Jesús

In einem früheren Bericht der vorliegenden Autoren wurde gezeigt, dass die Oxidation von 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC) eine entscheidende Rolle bei der zygotischen Embryogenese von Rübenspitzensamen spielen kann. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um den Beitrag der Kieselwand und der Keime bei der Ethylenproduktion während dieses Entwicklungsprozesses aufzuklären. Der ACC-Gehalt in der Silicawand ist nur während der mittleren Phasen der zygotischen Embryogenese höher als in Samen. Die ACC-Oxidase (ACO)-Aktivität erreicht während des Einsetzens der Embryogenese in der Seidenwand und in den Samen ein Maximum, nimmt danach allmählich ab und ist während der Trocknungsphase nicht nachweisbar. Unter Verwendung der reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion wurde ein cDNA-Klon, der für ein ACO kodiert und BrACO1 genannt wird, isoliert. Das abgeleitete Protein für BrACO1 hat ein Molekulargewicht von 36,8 kDa und eine hohe Homologie mit anderen Kreuzblütler-ACOs. Die heterologe Expression dieser cDNA bestätigte, dass BrACO1 ein ACO ist. Die Expression dieses Gens war während der ersten Phasen der Schuppenwandentwicklung hoch, während der mittleren Phasen niedrig und während der Austrocknung nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde das BrACO1-Transkript nur in den frühesten Phasen der Samenembryogenese akkumuliert und kann an der höchsten ACO-Aktivität und Ethylenproduktion durch Samen zu Beginn der Embryogenese beteiligt sein. Schließlich wird in dieser Arbeit eine Korrelation zwischen der Heterogenität von Brassica rapa L. cv. Rapa-Keime und die Fähigkeit, ACC zu Ethylen zu oxidieren, wurden demonstriert.

Mateo, Silvia Vidal, Francesca Coll, Lluc Veiga, Anna Boada, Montserrat

Diese Studie zielt darauf ab, das Wissen über monopronukleierte ICSI-abgeleitete Blastozysten zu erweitern, indem Trophektodermbiopsien durch aCGH und FISH analysiert werden, um ihre Chromosomenkonstitution zu bewerten. Fünfzehn monopronukleierte ICSI-abgeleitete Blastozysten wurden untersucht. Eine doppelte Trophektodermbiopsie wurde durchgeführt und durch FISH und aCGH analysiert. Die Blastozysten wurden nach der Chromosomenkonstitution klassifiziert. Unstimmigkeiten zwischen den beiden Techniken wurden bewertet. Die nach FISH- und aCGH-Analysen erhaltenen Ergebnisse zeigten Folgendes: 20 % (3/15) und 60 % (9/15) diploide Frauen bzw. 26,7 % (4/15) bzw. 26,7 % (4/15) diploide Männer und 53,3% (8/15) bzw. 13,3% (2/15) Mosaiken. Bei Verwendung von FISH oder aCGH wurden keine mosaikartigen männlichen Embryonen gefunden. In 40% (6/15) der Fälle gab es Meinungsverschiedenheiten aufgrund der höheren Erkennung von Mosaik durch FISH im Vergleich zu aCGH. Die Kombination von FISH und aCGH hat sich als geeigneter Ansatz erwiesen, um das Wissen über monopronukleäre ICSI-abgeleitete Embryonen zu erweitern. Die FISH-Analyse von Blastozysten, die aus einkernigen ICSI-Zygoten stammen, ermöglichte uns den Schluss, dass aCGH die Haploidie unterschätzt. Einige diploide Embryonen, bei denen aCGH diagnostiziert wurde, sind tatsächlich Mosaik. In Fällen, in denen diese Embryonen zu Fortpflanzungszwecken verwendet werden, wird eine zusätzliche Analyse des Ursprungs des elterlichen Genoms empfohlen.

Zhang, John Zhuang, Guanglun Zeng, Yong Grifo, Jamie Acosta, Carlo Shu, Yimin Liu, Hui

Der Kerntransfer einer Eizelle in das Zytoplasma einer anderen entkernten Eizelle hat gezeigt, dass Embryogenese und Implantation durch zytoplasmatische Faktoren beeinflusst werden. Wir berichten über einen Fall einer 30-jährigen Nulligravida-Frau, die zwei fehlgeschlagene IVF-Zyklen hatte, die dadurch gekennzeichnet waren, dass alle ihre Embryonen im Zweizellstadium verharrten und schließlich einen Vorkerntransfer mit Spendereizellen erhielten. Nach ihrem dritten IVF-Zyklus wurden acht von 12 Patienten-Oozyten und 12 von 15 Spender-Oozyten befruchtet. Die Vorkerne des Patienten wurden subzonal in ein entkerntes Spenderzytoplasma transferiert, was zu sieben rekonstruierten Zygoten führte. Fünf lebensfähige rekonstruierte Embryonen wurden in die Gebärmutter der Patientin transferiert, was zu einer Drillingsschwangerschaft mit fötalen Herzschlägen, normalen Karyotypen und nuklearen genetischen Fingerabdrücken, die mit dem genetischen Fingerabdruck der Mutter übereinstimmten, führte. Die Profile der fetalen mitochondrialen DNA waren mit denen aus dem Spenderzytoplasma identisch, ohne dass die mitochondriale DNA des Patienten nachgewiesen wurde. Dieser Bericht legt nahe, dass eine potenziell lebensfähige Schwangerschaft mit normalem Karyotyp durch einen Vorkerntransfer erreicht werden kann. Laufende Arbeiten zur Feststellung der Wirksamkeit und Sicherheit des pronuklearen Transfers werden zu seiner Verwendung als Hilfsmittel für die menschliche Fortpflanzung führen. Copyright © 2016 Reproductive Healthcare Ltd. Herausgegeben von Elsevier Ltd. Alle Rechte vorbehalten.

Motegi, Fumio Zonies, Seth Hao, Yingsong Cuenca, Adrian A. Griffin, Erik Seydoux, Geraldine

Ein Kennzeichen polarisierter Zellen ist die Aufteilung der PAR-Polaritätsregulatoren in asymmetrische Domänen im Zellkortex1, 2. Antagonistische Wechselwirkungen zwischen zwei konservierten Kinasen, der atypischen Proteinkinase C (aPKC) und PAR-1, wurden mit der Polaritätserhaltung in Verbindung gebracht1, 2 , aber die Mechanismen, die die Bildung von asymmetrischen PAR-Domänen initiieren, sind nicht verstanden. Hier beschreiben wir einen Weg, den das Sperma-gespendete Zentrosom verwendet, um die PAR-Proteine ​​in Caenorhabditis elegans-Zygoten zu polarisieren. Vor der Polarisation schließt die kortikale aPKC die PAR-1-Kinase und ihren Bindungspartner PAR-2 ​​durch Phosphorylierung aus. Während der Symmetriebrechung schützen Mikrotubuli, die vom Zentrosom nukleiert werden, PAR-2 ​​lokal vor der Phosphorylierung durch aPKC, wodurch PAR-2 ​​und PAR-1 den Zugang zum Kortex am nächsten zum Zentrosom ermöglichen. Kortikales PAR-1 phosphoryliert PAR-3, wodurch der PAR-3/aPKC-Komplex den Kortex verlässt. Unsere Ergebnisse veranschaulichen, wie Mikrotubuli unabhängig von der Aktindynamik die Selbstorganisation von PAR-Proteinen stimulieren, indem sie lokalen Schutz gegen eine globale Barriere bieten, die durch aPKC auferlegt wird. PMID:21983565

Cook, Jonathan M. Charlesworth, Amanda

Entwicklungsrelevante Proteine, die für die Befruchtung und Embryogenese entscheidend sind, werden durch hochregulierte Translation mütterlicher mRNA synthetisiert. Die Arrestproteine ​​von Zygote, Zar1 und Zar2, sind für die Embryogenese von entscheidender Bedeutung und wurden an der Bindung von mRNA und der Unterdrückung der mRNA-Translation beteiligt. Um Zar1 und Zar2 zu untersuchen, wurden die Volllängenproteine ​​mit Glutathion-S-Transferase (GST) oder MS2-Protein-Tags mit minimalen Interdomänen-Linkern fusioniert, die von mehreren Klonierungsstellen abgeleitet wurden, jedoch exprimierten diese Fusionsproteine ​​schlecht und/oder waren nicht robust Funktion. Hier haben wir die Wirkung des Einfügens zusätzlicher Linker zwischen die Fusionsdomänen getestet. Getestet wurden drei Linker mit jeweils 17 Aminosäuren Länge und unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften: flexibel hydrophil, starr verlängert oder starr helixförmig. In Gegenwart eines der drei Linker wiesen GST-Zar1 und GST-Zar2 weniger Abbauprodukte auf. Darüber hinaus wurde MS2-Zar1 in Gegenwart eines der Linker in höheren Konzentrationen exprimiert, und in dualen Luciferase-Tethered-Assays unterdrückten sowohl MS2-Zar1 als auch MS2-Zar2 die Luciferase-Translation in größerem Ausmaß. Diese Daten legen nahe, dass für Zar-Fusionsproteine ​​eine Erhöhung der Länge der Linker, ungeachtet ihrer physikalischen oder chemischen Eigenschaften, die Stabilität, Expression und Bioaktivität verbessert. © Der Autor 2017. Veröffentlicht von Oxford University Press. Alle Rechte vorbehalten. Für Berechtigungen senden Sie bitte eine E-Mail an: [email protected]

Gassler, Johanna Flyamer, Ilya M Tachibana, Kikuë

Die 3D-Faltung des Genoms ist mit essentiellen Kernprozessen verbunden, darunter Genexpression, DNA-Reparatur und Replikation. Chromatin-Konformations-Capture-Assays wie Hi-C liefern beispiellose Einblicke in die Chromatinstruktur höherer Ordnung. Bulk Hi-C von Millionen von Zellen ermöglicht den Nachweis durchschnittlicher Chromatinmerkmale mit hoher Auflösung, ist jedoch schwierig auf seltene Zelltypen anzuwenden. Dieses Kapitel beschreibt unseren kürzlich entwickelten Single-Nucleus Hi-C (snHi-C) Ansatz zum Nachweis von Chromatinkontakten in Einzelkernen von Maus-Oozyten und einzelligen Embryonen (Zygoten). Das schrittweise Protokoll umfasst die Isolierung dieser Zellen, die Extraktion von Kernen, die Fixierung, den Restriktionsverdau, die Ligation und die Amplifikation des gesamten Genoms. Durch snHi-C erhaltene Kontakte ermöglichen den Nachweis von Chromatinmerkmalen, einschließlich Schleifen, topologisch assoziierenden Domänen und Kompartimenten, wenn über das Genom gemittelt. Die Kombination von snHi-C mit anderen Einzelzelltechniken in diesen und anderen seltenen Zelltypen wird wahrscheinlich ein umfassendes Bild davon liefern, wie die Chromatinarchitektur die Zellidentität prägt. © 2018 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Nomali, Z Ngobese Sershen Berjak, P Pammenter, N W

Die Kryokonservierung, die vielversprechendste Methode zur langfristigen Konservierung von widerspenstigem (austrocknungsempfindlichem) Samenkeimplasma, ist oft mit hohen Verlusten der Lebensfähigkeit verbunden. Kryoverfahren beinhalten eine Abfolge von Schritten, die optimiert werden müssen, um die Auswirkungen der Spannungen zu reduzieren. Diese Studie berichtet über die Auswirkungen einiger Schritte der Kryokonservierung auf die widerspenstigen zygotischen Embryonen der Amaryllide Ammocharis coranica. Embryonen wurden einer Kryoprotektion mit Glycerin und/oder DMSO, einer schnellen (Flash-)Trocknung und einer schnellen (> 100°C s(-1)) oder langsamen (1°C s(-1)) Abkühlung unterzogen. Schnelle Dehydratisierung (von ca. 2,7 bis 0,9 g g(-1) über 60 min) und Abkühlen wirkten sich nachteilig auf die Lebensfähigkeit der Embryonen aus, die noch verschlimmert wurden, wenn diese Schritte nacheinander durchgeführt wurden. Nach dem Abkühlen wurde die Keimlingsproduktion (30 %) nur von Embryonen erhalten, die vor dem Trocknen und schnellen Abkühlen mit Glycerin kryogeschützt wurden, während 30 % der unbehandelten Embryonen und 70 % der Embryonen, die während der Blitztrocknung einem kathodischen Schutz unterzogen wurden, Kallus produzierten . Da zuvor kein Post-Cryo-Überleben von A. coranica-Embryonen erreicht worden war, identifizierte diese Studie die Kryoprotektion mit Glycerin und den Einbau eines kathodischen Schutzes während der Blitztrocknung als vielversprechende Interventionspunkte für zukünftige Studien.

Rutledge, J. C. Generoso, W. M

Die Exposition weiblicher Mäuse gegenüber Ethylenoxid durch Inhalation 1 oder 6 Stunden nach der Paarung führte nicht nur zum multitemporalen Tod von Konzeptussen, sondern auch zu hohen Anomalienraten bei überlebenden Föten. Im Gegensatz dazu wurden nur marginale Effekte beobachtet, wenn die Weibchen 9 oder 25 Stunden nach der Paarung exponiert wurden. Die bei den 17-Tage-Gestationstagen festgestellten Anomalien wurden von Hydrops und Augendefekten dominiert, die zusammen 54% aller Anomalien ausmachen. Die meisten der verbleibenden Anomalien verteilten sich auf 5 andere Typen: geringe Größe, Gaumenspalte und Herz-, Bauchwand- oder Extremitäten- und/oder Schwanzdefekte.In einer Folgestudie wurden die Feten von Weibchen, die 6 h nach der Verpaarung behandelt wurden, im 11.-15. Trächtigkeitstag untersucht und das Fortschreiten des fetalen Todes und der Missbildungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression der meisten fetalen Anomalien erst in der späten Schwangerschaft sichtbar wird. Mehrere dieser induzierten Anomalien ähneln häufigen sporadischen Geburtsfehlern beim Menschen. Diese neue Klasse experimentell induzierter fetaler Anomalien bietet einen neuen Weg zur Erforschung der Zygotenbiologie und ein System zur Untersuchung des Fortschreitens einer abweichenden Entwicklung.

Wang, Bangmei Li, Kunyu Wang, Amy Reiser, Michelle Saunders, Thom Lockey, Richard F. Wang, Jia-Wang

Die Gen-Editing-Technik mit Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR), die auf dem nicht-homologen End-Joining (NHEJ)-Reparaturweg basiert, wurde verwendet, um Gen-Knockouts mit variabler Größe kleiner Insertionen/Deletionen mit hoher Effizienz zu erzeugen. Eine genauere Genom-Editierung, entweder die Insertion oder Deletion eines gewünschten Fragments, kann durch die Kombination des Homology-Directed-Repair (HDR)-Wegs mit CRISPR-Spaltung erfolgen. Allerdings sind HDR-vermittelte Gen-Knock-In-Experimente typischerweise ineffizient, und es gibt keine Berichte über erfolgreiches Gen-Knock-In mit DNA-Fragmenten, die größer als 4 kb sind. Hier beschreiben wir die gezielte Insertion von großen DNA-Fragmenten (7,4 und 5,8 kb) in die Genome von embryonalen Stammzellen (ES) der Maus bzw. Zygoten unter Verwendung der CRISPR/HDR-Technik ohne NHEJ-Inhibitoren. Unsere Daten zeigen, dass CRISPR/HDR ohne NHEJ-Inhibitoren zu einem hocheffizienten Gen-Knock-in führen kann, äquivalent zu CRISPR/HDR mit NHEJ-Inhibitoren. Obwohl NHEJ der dominante Reparaturweg im Zusammenhang mit CRISPR-vermittelten Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist und biallelische Gen-Knock-ins häufig vorkommen, wurden NHEJ- und biallelische Gen-Knock-ins nicht nachgewiesen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine effiziente gezielte Insertion großer DNA-Fragmente ohne NHEJ-Inhibitoren möglich ist, ein Ergebnis, das das Interesse am Verständnis der Mechanismen des hocheffizienten CRISPR-Targetings im Allgemeinen wecken sollte.

Carroll, Michael Levasseur, Mark Wood, Chris Whitaker, Michael Jones, Keith T. McDougall, Alex

Bei Aszidien wie bei Säugetieren lösen Spermien repetitive Ca2+-Wellen aus, die von kortikalen Schrittmachern stammen, die sich in der vegetativen Hemisphäre der Zygoten befinden. Bei Ascidien fungiert ein als Kontraktionspol (CP) bezeichneter vegetaler Vorsprung als Ca2+-Wellen-Schrittmacher, aber der Mechanismus, der der Erzeugung eines Ca2+-Wellen-Schrittmachers zugrunde liegt, ist nicht bekannt. Hier haben wir vier Hypothesen getestet, um zu bestimmen, welche Faktoren am CP an der Einstellung des Tempos des Ascidian-Ca2+-Wellen-Schrittmachers beteiligt sind: (1) lokalisierter Ca2+-Einstrom (2) Akkumulation von Phosphatidylinositol (4,5)bisphosphat [PtdIns(4, 5)P2] (3) Akkumulation des kortikalen endoplasmatischen Retikulums (cER) und (4) Anreicherung des Sperma aktivierenden Faktors. Wir entwickelten eine Methode zur dynamischen Überwachung der Position des CP während der Befruchtung unter Verwendung einer Plekstrinhomologie (PH)-Domäne aus der Phospholipase Cdelta1, die an das grün fluoreszierende Protein (GFP) gekoppelt ist, das PtdIns(4,5)P2 bindet. Wir fanden heraus, dass Eier in Ca2+-freiem Meerwasser Ca2+-Wellen zeigten, die vom CP stammten, was zeigt, dass ein erhöhter CP-Ca2+-Einstrom nicht den Ursprung des Herzschrittmachers bestimmt. Auch die Unterbrechung des PH::GFP-markierten CP, sobald es sich gebildet hatte, löste den Ca2+-Wellen-Schrittmacher nicht von dieser Stelle. Als wir als nächstes die Akkumulation von cER am CP verhinderten, kamen alle Ca2+-Wellen von der Stelle der Spermien-Ei-Fusion und die Frequenz der Ca2+-Oszillationen blieb unverändert. Diese Daten zeigen, dass ein lokaler Ca2+-Einstrom, die Akkumulation von PtdIns(4,5)P2 und cER am CP für die Ca2+-Wellen-Schrittmacherfunktion nicht erforderlich sind und legen stattdessen nahe, dass ein mit den Spermien assoziierter Faktor den Ort der Ca2+-Welle bestimmt Schrittmacher. Als wir schließlich Ascidian-Spermienextrakt in das Zentrum von unbefruchteten Aszidien-Eiern injizierten, die mit Mikrofilament- und Mikrotubuli-störenden Medikamenten behandelt worden waren, stammten alle Ca2+-Wellen immer noch von der Nähe der Plasmamembran, was zeigt, dass der Spermienfaktor keine intakte Kortex, wenn es in der Nähe der Plasmamembran (PM) angereichert ist. Wir

Bonetti, Keila A P Quoirin, Marguerite Quisen, Regina C Lima, Suelen C S

Der interspezifische Ölpalmhybrid BRS Manicoré (E. guineensis x E. oleifera) hat überlegene agronomische Eigenschaften. Die Keimrate ist jedoch gering (30 %) und der Prozess ist langsam, wenn die Samen in konventioneller Form ausgesät werden. Der Zweck dieser Studie war es, die In-vitro-Keimung von zygotischen Embryonen dieses Hybrids im Vergleich zu Samenchargen zu optimieren. Die Lebensfähigkeit von zygotischen Embryonen wurde durch den Tetrazolium-Test (0,075 %) für 4 Stunden bewertet. Die Embryonen wurden auf MS- und Y3-Kulturmedien mit und ohne Zugabe von NaH2PO4 sowie auf MS-, MS1/2- und N6-Medium kultiviert. In MS-Medium mit NaH2PO4 wurde die Keimungsrate von 40 auf 70 % im Vergleich zum Medium ohne Natriumphosphat erhöht. Der Vergleich zwischen den Kulturmedien MS, MS 1/2, N6 und Y3 zeigte, dass 75 % der im Y3-Medium kultivierten zygotischen Embryonen ganze Pflanzen bildeten (mit definierten Wurzeln und Trieben), ein höherer Prozentsatz als auf MS, MS 1 . kultivierte Embryonen /2- und N6-Medien (46, 35 bzw. 17%). Im gleichen Y3-Kulturmedium waren die Embryonen größer (36% 2 cm und 30% ≥ 5 cm) als in den anderen Medien. Die Ergebnisse des Tetrazolium-Tests waren denen der Keimung ähnlich und zeigten die Wirkung des Genotyps jeder Saatgutpartie. Für die Keimung und Entwicklung von Pflänzchen ist die Zugabe von NaH2PO4 in ein phosphatfreies oder phosphatarmes Nährmedium unerlässlich.

Tenenhaus, Christina Subramaniam, Kuppuswamy Dunn, Melanie A. Seydoux, Geraldine

Das CCCH-Zinkfingerprotein PIE-1 ist ein wesentlicher Regulator des Keimzellschicksals, das sich während der ersten Spaltungen des Caenorhabditis elegans-Embryos mit der Keimlinie segregiert. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine Funktion von PIE-1 darin besteht, die mRNA-Transkription zu hemmen. Hier zeigen wir, dass PIE-1 eine zweite Funktion in Keimzellen hat, die für die effiziente Expression des mütterlich kodierten Nanos-Homologs NOS-2 erforderlich ist. Diese zweite Funktion ist genetisch von der hemmenden Wirkung von PIE-1 auf die Transkription trennbar. Eine Mutation im zweiten CCCH-Finger von PIE-1 reduziert die NOS-2-Expression, ohne die transkriptionelle Repression zu beeinträchtigen, und bewirkt, dass sich primordiale Keimzellen von der somatischen Gonade entfernen und gelegentlich den Embryo vollständig verlassen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PIE-1 das Schicksal von Keimzellen durch zwei unabhängige Mechanismen wie folgt fördert: (1) Hemmung der Transkription, die zygotische Programme blockiert, die die somatische Entwicklung vorantreiben, und (2) Aktivierung der Proteinexpression von Nos-2 und möglicherweise anderen mütterlichen RNAs, die die Entwicklung von Urkeimzellen fördern. PMID:11316796

Liu, Wei Wu, Haiyi Liu, Mengxia Duan, Delin

Die künstliche Sämlingsproduktion von Sargassum thunbergii ist ein wirksames Mittel, um die natürlichen Ressourcen zu entlasten. Um die Zygotenverwertung zu verbessern und den Keimlingsverlust zu reduzieren, wurden Untersuchungen zur Charakteristik der Zygotenfreisetzung, zur Rhizoidenentwicklung, zur Keimlingsanhaftung und zum Einfluss von Jetwashing durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass der Prozentsatz der freigesetzten Zygoten mit der Zeit in den ersten 60 Stunden zugenommen hat. Die Aufnahmefähigkeit der Keimlinge am Substrat wurde deutlich erhöht, insbesondere zeitgleich mit der Entstehung und Verlängerung der neuen Rhizoide. Die Ablöserate der Keimlinge nahm mit der Verzögerung des Startzeitpunkts des Strahlwaschens oder der Verringerung der Strahlwaschgeschwindigkeit signifikant ab. Jedoch kann das Strahlwaschen bei jeder im Experiment angewandten Stärke innerhalb der 20 Tage nach der Befestigung einen erheblichen Keimverlust verursachen. Unsere Studie lieferte einige Parameter, um den Betrieb in der frühen Phase der Setzlingsproduktion zu optimieren.

Superina, Simone Borovina, Antonia Ciruna, Brian

Wachstumsfaktoren und Morphogene regulieren die embryonale Musterbildung, die Bestimmung des Zellschicksals, die Zellmigration und die Morphogenese. Aktivität und Verhalten dieser Signalmoleküle werden im extrazellulären Raum durch Interaktionen mit Proteoglykanen reguliert (Bernfield et al., 1999 Perrimon und Bernfield 2000 Lander und Selleck 2000 Selleck 2000). Proteoglykane sind Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht, die aus einem Kernprotein mit kovalent verknüpften Glykosaminoglykan(GAG)-Seitenketten bestehen, von denen angenommen wird, dass sie die Ligandeninteraktion vermitteln. Mutierte Drosophila-Embryonen, denen die UDP-Glucose-Dehydrogenase-Aktivität (Ugdh, erforderlich für die GAG-Synthese) fehlt, zeigen abnormale Fgf-, Wnt- und TGFß-Signale und sterben während der Gastrulation, was auf eine breite und kritische Rolle für Proteoglykane während der frühen Embryonalentwicklung hinweist (Lin et al., 1999 Lin und Perrimon 2000) (Hacker et al., 1997). Maus-Ugdh-Mutanten sterben auch bei der Gastrulation, jedoch scheint nur die Fgf-Signalgebung gestört zu sein (Garcia-Garcia und Anderson, 2003). Diese Ergebnisse legten eine mögliche Divergenz im Bedarf an Proteoglykanen während der Embryogenese von Drosophila und Maus nahe, und dass Säugetiere möglicherweise alternative Mittel zur Regulierung der Wnt- und TGFß-Aktivität entwickelt haben. Um die Funktion von Proteoglykanen in der Wirbeltierentwicklung weiter zu untersuchen, haben wir Zebrafischmutanten ohne mütterliche und zygotische Ugdh/Jekyll-Aktivität (MZjekyll) charakterisiert. Wir zeigen, dass MZjekyll-Mutantenembryonen abnorme Fgf-, Shh- und Wnt-Signalisierungsaktivitäten aufweisen, mit begleitenden Defekten in der Musterung des zentralen Nervensystems, der kardialen ventrikulären Schicksalsspezifikation und der axialen Morphogenese. Darüber hinaus entdecken wir eine neue Rolle von Proteoglykanen bei der Links-Rechts-Musterbildung. Unsere Ergebnisse lösen seit langem bestehende Fragen zur evolutionären Erhaltung der Ugdh-Funktion und liefern neue mechanistische Einblicke in die Initiierung der Links-Rechts-Asymmetrie. Copyright © 2014 Die Autoren. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Wu, Xuemei Wang, Pei Brown, Christopher A. Zilinski, Carolyn A. Matzuk, Martin M

Zygotenarrest 1 (ZAR1) ist ein ovarialspezifischer mütterlicher Faktor, der während des Übergangs von der Eizelle zum Embryo eine wesentliche Rolle spielt. Bei Mäusen wird die Zar1-mRNA als 1,4-Kilobase (kb)-Transkript nachgewiesen, das ausschließlich in wachsenden Eizellen synthetisiert wird. Um die Funktionen von ZAR1 weiter zu verstehen, haben wir die orthologe Zar1-cDNA und/oder Gene für Maus, Ratte, Mensch, Frosch, Zebrafisch und Kugelfisch kloniert. Das gesamte Maus-ZAR1-Gen und ein verwandtes Pseudogen umfassen ungefähr 4,0 kb, enthalten vier Exons und werden auf benachbarte Loci auf dem Mauschromosom 5 abgebildet Maus-Zar1-Chromosomenlokus. Die Zar1-Gene von Ratten (Rattus norvegicus) und Kugelfischen (Fugu rubripes) wurden durch Datenbank-Mining erkannt und eine Protein-Alignment-Analyse abgeleitet. Das Ratten-Zar1-Gen kartiert auch auf eine Region, die mit dem Maus-Zar1-Gen-Locus auf dem Ratten-Chromosom 14 syntenisch ist beendet die Analyse der Eierstock-mRNA. Im Gegensatz zu Maus und Mensch wird der Frosch Zar1 in mehreren Geweben nachgewiesen, einschließlich Lunge, Muskeln und Eierstöcken. Die Zar1-mRNA erscheint im Zytoplasma von Eizellen und bleibt während der Froschembryogenese bis zum Schwanzknospenstadium bestehen. Maus-, Ratten-, Mensch-, Frosch-, Zebrafisch- und Kugelfisch-Zar1-Gene kodieren Proteine ​​mit 361, 361, 424, 295, 329 bzw. 320 Aminosäuren und teilen eine Aminosäureidentität von 50,8%-88,1%. Regionen der N-Termini dieser ZAR1-Orthologe zeigen eine hohe Sequenzidentität zwischen diesen verschiedenen Proteinen. Die C-terminalen 103 Aminosäuren dieser Proteine, die von den Exons 2-4 kodiert werden, enthalten jedoch ein atypisches 8-Cystein-Pflanzen-Homeo-Domänen-Motiv und sind hoch konserviert, wobei sie eine Identität von 80,6%-98,1% unter diesen Arten teilen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Carboxyl-Termini dieser ZAR1-Proteine ​​eine wichtige funktionelle Domäne enthalten, die

Ausgeschnittene zygotische Embryonen, Merikarpen ("Samen") und Hypokotyle von Sämlingen der kultivierten Karotte Daucus carota cv. Scarlet Nantes wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, somatische Embryonen auf einem halbfesten hormonfreien Nährmedium zu erzeugen. Weder intakte zygotische Embryonen noch Hypokotyle produzierten jemals somatische Embryonen. Allerdings waren Merikarps und gebrochene zygotische Embryonen ausgezeichnete Quellen für die Produktion somatischer Embryonen (Antwortwerte bis zu 86%). Die somatische Embryobildung war am höchsten von Keimblättern, wurde aber auch an isolierten Hypokotylen und Wurzelspitzen von reifen zygotischen Embryonen beobachtet. Auf Medien, die nicht reduzierten Stickstoff enthielten, führte die Bildung somatischer Embryonen zur Erzeugung kräftiger Kulturen, die vollständig aus somatischen Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien bestanden, die wiederum weitere somatische Embryonen vermehrten. Es wurde jedoch ein Medium entwickelt, das, wenn 1-5 mM NH4+ die einzige Stickstoffquelle war, nur zu einer Proliferation von globulären Proembryonen führte. Eine anhaltende Subkultivierung dieser Proembryonen in Intervallen von 2-3 Wochen ermöglichte die Etablierung sehr einheitlicher Kulturen, in denen keine weitere Entwicklung in reifere Stadien der Embryonalentwicklung stattfand. Diese wurden ohne Rückgang als morphogenetisch kompetente proembryonale Globuli über 10 Monate aufrechterhalten. Ein basales Medium, das 1-5 mM NH4+ als einzige Stickstoffquelle enthält, scheint die Bildung von somatischen Proembryonen nicht zu induzieren. Stattdessen wird ein solches Medium am besten als permissiv für die Expression von embryogen bestimmten Zellen in zygotischen Embryonen angesehen. Durch Herausschneiden und Brechen oder Verwundung von zygotischen Embryonen werden die konstituierenden Zellen wahrscheinlich von Positions- oder chemischen Beschränkungen befreit und können so ihr angeborenes embryogenes Potenzial zum Ausdruck bringen. Sobald eine proembryonale Kultur etabliert ist, bietet dieses Medium, das 1-5 mM NH4+ als einzige Stickstoffquelle enthält, eine nicht-permissive Umgebung für die Entwicklung und das Wachstum späterer embryonaler Stadien, erlaubt jedoch die fortgesetzte Bildung und

Ausgeschnittene zygotische Embryonen, Merikarpen ("Samen") und Hypokotyle von Sämlingen der kultivierten Karotte Daucus carota cv. Scarlet Nantes wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, somatische Embryonen auf einem halbfesten hormonfreien Nährmedium zu erzeugen. Weder intakte zygotische Embryonen noch Hypokotyle produzierten jemals somatische Embryonen. Allerdings waren Merikarps und gebrochene zygotische Embryonen ausgezeichnete Quellen für die Produktion somatischer Embryonen (Antwortwerte bis zu 86%). Die somatische Embryobildung war am höchsten von Keimblättern, wurde aber auch an isolierten Hypokotylen und Wurzelspitzen von reifen zygotischen Embryonen beobachtet. Auf Medien, die nicht reduzierten Stickstoff enthielten, führte die Bildung somatischer Embryonen zur Erzeugung kräftiger Kulturen, die vollständig aus somatischen Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien bestanden, die wiederum weitere somatische Embryonen vermehrten. Es wurde jedoch ein Medium entwickelt, das, wenn 1-5 mM NH4+ die einzige Stickstoffquelle war, nur zu einer Proliferation von globulären Proembryonen führte. Die anhaltende Subkultivierung dieser Proembryonen in Intervallen von 2-3 Wochen ermöglichte die Etablierung sehr einheitlicher Kulturen, in denen keine weitere Entwicklung zu reiferen Stadien der Embryonalentwicklung stattfand. Diese wurden ohne Rückgang als morphogenetisch kompetente proembryonale Globuli über 10 Monate aufrechterhalten. Ein basales Medium, das 1-5 mM NH4+ als einzige Stickstoffquelle enthält, scheint die Bildung von somatischen Proembryonen nicht zu induzieren. Stattdessen wird ein solches Medium am besten als permissiv für die Expression von embryogen bestimmten Zellen in zygotischen Embryonen angesehen. Durch Herausschneiden und Brechen oder Verwundung zygotischer Embryonen werden die konstituierenden Zellen wahrscheinlich von Positions- oder chemischen Beschränkungen befreit und können so ihr angeborenes embryogenes Potenzial zum Ausdruck bringen. Sobald eine proembryonale Kultur etabliert ist, bietet dieses Medium, das 1-5 mM NH4+ als einzige Stickstoffquelle enthält, eine nicht-permissive Umgebung für die Entwicklung und das Wachstum späterer embryonaler Stadien, erlaubt jedoch die fortgesetzte Bildung und

Meyer, E. Butler, A. Dubrana, K. Duharcourt, S. Caron, F

Bei Ciliaten wird das Keimbahngenom während der Entwicklung des somatischen Makronukleus aus einem mitotischen Produkt des Zygotenkerns weitgehend neu geordnet. Keimbahnchromosomen werden in bestimmten Regionen fragmentiert und eine Vielzahl interner Sequenzelemente eliminiert. Es wurde zuvor gezeigt, dass die Transformation des vegetativen Makronukleus von Paramecium primaurelia mit einem Plasmid, das ein subtelomeres Oberflächenantigen-Gen enthält, die Verarbeitung der homologen genomischen Region der Keimbahn während der Entwicklung eines neuen Makronukleus in der sexuellen Nachkommenschaft transformierter Klone beeinflussen kann. Das Gen und die telomer-proximal flankierenden Sequenzen werden aus dem neuen makronukleären Genom deletiert, obwohl das Keimbahngenom Wildtyp bleibt. Hier zeigen wir, dass Plasmide, die nicht überlappende Segmente der gleichen genomischen Region enthalten, in der Lage sind, ähnliche terminale Deletionen zu induzieren, wobei die Orte der Deletionsendpunkte von der speziellen verwendeten Sequenz abhängen. Die Transformation des maternalen Makronukleus mit einer internen Sequenz eines makronuklearen Chromosoms verursacht auch das Auftreten interner Deletionen zwischen kurzen direkten Wiederholungen, die aus alternierenden Thyminen und Adeninen bestehen. Der epigenetische Einfluss maternaler makronukleärer Sequenzen auf entwicklungsbedingte Neuanordnungen des zygotischen Genoms scheint somit sowohl sequenzspezifisch als auch allgemein zu sein, was darauf hindeutet, dass dieser transnukleäre Effekt durch die Paarung homologer Sequenzen vermittelt wird. PMID:9199294

Reddy, B A Kloc, M Etkin, L D

Wir haben eine cDNA (xlan4) aus einer Xenopus laevis-Oozyten-cDNA-Bibliothek kloniert, deren verwandte mRNA in der Tierpolregion von ausgewachsenen Oozyten lokalisiert ist. Die cDNA kann in vitro translatiert werden, um ein Protein mit vorhergesagter Größe von 35 kDa zu produzieren, und wird auch in E. coli als Fusionsprotein exprimiert. Das konzeptionelle Protein, das von der xlan4-cDNA kodiert wird, ist 17,5% prolinreich und besitzt mehrere PEST-Sequenzen, die in Proteinen mit kurzen Halbwertszeiten gefunden werden. Die xlan4-mRNA hat eine Größe von 2,6 kb und während der frühen Entwicklung nimmt ihr Titer bis zum Neurula-Stadium ab, wonach sie wieder zu akkumulieren beginnt. Northern Blots an sezierten Embryonen und in situ Hybridisierung zeigten, dass die zygotische Expression auf die dorsalen axialen Strukturen beschränkt ist, die hauptsächlich aus dem ZNS bestehen. Die UV-Bestrahlung der vegetativen Polregion unmittelbar nach der Befruchtung, die ventralisierte Embryonen hervorbringt, führt zu einem Verlust der zygotischen xlan4-Expression. Beim Erwachsenen ist xlan4-mRNA hauptsächlich auf das Gehirn beschränkt. Die Anwesenheit dieser mRNA in der Tierpolregion, die zu den zukünftigen neuralen Zelllinien beiträgt, legt nahe, dass dieses Genprodukt entweder bei der Spezifikation neuraler Zelltypen oder bei einer neuralen spezifischen Funktion funktionieren kann.

Abdelnour-Esquivel, Ana Engelmann, Florent

Dieser Artikel präsentiert die Entwicklung von Kryokonservierungsprotokollen für zygotische Embryonen und Spitzen von Chayote (Sechium edule Jacq. Sw.), einer tropischen Pflanzenart mit widerspenstigen Samen. Zygotische Embryonen von zwei Sorten, Ccocro negro (CN) und Claudio (Cl) konnten der Kryokonservierung standhalten, mit Überlebensprozentsätzen von 10 bzw. 30 %, nach Trocknung auf 23 bzw. 19 % Feuchtigkeitsgehalt (auf Frischgewichtsbasis). Wurzelspitzen, die von in vitro-Pflänzchen der Sorten Cl, 13 und JM entnommen wurden, wurden mit einer Vitrifikationstechnik erfolgreich kryokonserviert.Optimale Bedingungen umfassten die Kultur von Mutterpflanzen für 22 Tage auf Medium, das 0,3 M Saccharose enthielt, Kultivierung von herausgeschnittenen Spitzen auf demselben Medium für 1 Tag, Beladen der Spitzen für 20 Minuten mit 2 M Glycerin + 0,4 M Glycerin, Behandlung mit einer Reihe von verdünnte PVS2-Lösung (60 % PVS2 gefolgt von 80 % PVS2-Lösung für 15 min (Sorte Cocoro Blanco [CB]) oder 30 min (Sorte CN und Cl) bei jeder Konzentration), schnelles Einfrieren und Auftauen, Waschen der Triebspitzen mit a 1,2 M Saccharoselösung, gefolgt von Gewinnung auf Medien mit fortschreitend abnehmenden Saccharosekonzentrationen, bis die Standardkonzentration von 0,1 M erreicht war. Die höchsten erreichten Überlebensraten lagen je nach Sorte zwischen 17 und 38 %.

Cebrian-Serrano, Alberto Zha, Shijun Hanssen, Lars Biggs, Daniel Preece, Christopher

Genommanipulation in der Maus durch Mikroinjektion von CRISPR/Cas9 ortsspezifischen Nukleasen hat es ermöglicht, die Produktionszeit für genetisch veränderte Mausmodelle signifikant zu verkürzen. Es wurde bereits über eine erfolgreiche Genommanipulation in der Maus berichtet, bei der Cas9 durch Mikroinjektion eines DNA-Konstrukts, in vitro transkribierter mRNA und rekombinantem Protein bereitgestellt wurde. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Verwendung von transgenen Mäusestämmen, die Cas9 überexprimieren, die ortsspezifische Mutagenese über die maternale Zufuhr an Zygoten erleichtert, und dieser Weg könnte eine Alternative zur exogenen Zufuhr darstellen. Wir haben die Möglichkeit einer genetischen Versorgung mit Cas9 genauer untersucht und berichten zu diesem Zweck über die Generierung einer transgenen Maus, die Cas9 ubiquitär überexprimiert, über ein CAG-Cas9-Transgen, das auf den Gt(ROSA26)Sor-Locus gerichtet ist. Wir zeigen, dass Zygoten, die aus weiblichen Mäusen, die dieses Transgen beherbergen, hergestellt wurden, ausreichend mit mütterlicherseits beigetragenem Cas9 beladen sind, um eine effiziente Produktion von Embryonen und Mäusen mit Indel, genomischer Deletion und Knock-in-Allelen durch Mikroinjektion von Guide-RNAs und Templates allein zu ermöglichen. Wir vergleichen die Mutageneseraten und die Wirksamkeit der Mutagenese unter Verwendung dieser genetischen Versorgung mit der exogenen Cas9-Versorgung entweder durch mRNA- oder Protein-Mikroinjektion. Im Allgemeinen berichten wir über erhöhte Generationsraten von Knock-in-Allelen und zeigen, dass die Mutagenese an bestimmten Zielstellen des Genoms signifikant höher und konsistenter ist, wenn Cas9 im Vergleich zu exogener genetisch zugeführt wird. PMID:28081254

Almoguera, C. Coca, M. A. Jordano, J.

Wir haben Ha UbiS isoliert und sequenziert, eine cDNA für eine in Trockensaatgut gespeicherte mRNA, die Tetraubiquitin kodiert. Wir haben eine unterschiedliche Akkumulation von Tetraubiquitin-mRNAs während der zygotischen Embryogenese von Sonnenblumen (Helianthus annuus L.) beobachtet. Diese mRNAs wurden während der späten Embryogenese hochreguliert und erreichten eine höhere Prävalenz im trockenen Samen, wo sie hauptsächlich mit provaskulärem Gewebe assoziiert waren. UbiS-mRNA akkumulierte, wie durch Rnase-A-Schutzexperimente bestätigt, auch als Reaktion auf einen Hitzeschock, jedoch nur in Blättern und später während der postkeimalen Entwicklung. Diese neuen Beobachtungen zeigen die Expression von spezifischen Pflanzen-Polyubiquitin-Transkripten während der Samenreifung und die Entwicklungsregulation ihrer Hitzeschockreaktion. Mit Ubiquitin-Antikörpern konnten wir auch diskrete, samenspezifische Proteine ​​mit unterschiedlichen zeitlichen Expressionsmustern während der zygotischen Embryogenese nachweisen. Einige dieser Muster waren gleichzeitig mit der Akkumulation von UbiS-mRNA in Samen. Die am häufigsten vorkommenden Ubiquitin-reagierenden Proteine, die in reifen Samen gefunden wurden, waren klein (16–22 kD) und sauer (isoelektrische Punkte von 6,1–7,4). Mögliche funktionelle Implikationen für die UbiS-Expression, die sich aus diesen Beobachtungen ergeben, werden diskutiert. PMID:12228401

Ein vollfaktorielles Kreuzungsexperiment mit fünf Weibchen und fünf Männchen von jeweils zwei Coregonidenarten aus dem oberen Bodensee wurde verwendet, um auf intrinsische postzygote Inkompatibilitäten während der frühen Ontogenese zu testen. Bis kurz vor dem Schlüpfen gab es keinen Unterschied in der Embryomortalität zwischen homo- und heterologen Kreuzungen. Ein maternaler Effekt auf die Sterblichkeit wurde bei beiden Spezies festgestellt, jedoch fehlten väterliche Effekte und Weibchen-Männchen-Interaktionen. Somit scheint eine genetische Inkompatibilität während der frühen Ontogenese eine introgressive Hybridisierung nicht zu verhindern, was darauf hindeutet, dass die genetische Divergenz zwischen diesen Arten hauptsächlich durch präzygote Barrieren aufrechterhalten wird. Die jüngste genetische Homogenisierung von Herden von coregoniden Arten in europäischen Alpenseen könnte durch eine Abflachung adaptiver Landschaften durch Eutrophierung verursacht worden sein, aber auch eine intensive Besatzung mit Larven, die in Brütereien aus künstlich befruchteten Eiern gewonnen werden, dürfte ein Faktor sein. Um die Diversität sympatrischer Coregoniden zu sichern, ist es wichtig, ökologische Bedingungen wiederherzustellen, die der Artendivergenz förderlich sind, und traditionelle Managementstrategien zu überarbeiten. © 2015 Die Fischereigesellschaft der Britischen Inseln.

Crispo, M Mulet, A P Tesson, L Barrera, N Cuadro, F dos Santos-Neto, P C Nguyen, T H Crénéguy, A Brusselle, L Anegón, I Menchaca, A

Während sich die CRISPR/Cas9-Technologie als wertvolles System zur Generierung von gentechnisch veränderten Tieren bei mehreren Arten erwiesen hat, wurde dieses Werkzeug bei Nutztieren kaum beschrieben. Myostatin wird vom MSTN-Gen kodiert, das an der Hemmung der Muskeldifferenzierung und des Muskelwachstums beteiligt ist. Wir haben die Effizienz des CRISPR/Cas9-Systems bestimmt, um MSTN bei Schafen zu bearbeiten und Knock-out (KO)-Tiere zu erzeugen, mit dem Ziel, die Muskelentwicklung und das Körperwachstum zu fördern. Wir erzeugten CRISPR/Cas9-mRNAs, die für Schaf-MSTN spezifisch sind, und mikroinjizierten sie in das Zytoplasma von Schaf-Zygoten. Beim Vergleich der Embryoentwicklung von CRISPR/Cas9-mikroinjizierten Zygoten (n = 216) mit pufferinjizierten Embryonen (n = 183) und nicht mikroinjizierten Embryonen (n = 173) war die Spaltungsrate für beide mikroinjizierten Gruppen niedriger (P-Zygote CRISPR/Cas9-Mikroinjektion wurden auf 29 Empfänger-Weibchen übertragen, was 65,5% (19/29) der trächtigen Mutterschafe und 41,5% (22/53) der Neugeborenen ergab.Von 22 geborenen Lämmern, die durch T7EI- und Sanger-Sequenzierung analysiert wurden, wiesen zehn Indel-Mutationen am MSTN-Gen auf Mutationen in beiden Allelen und fünf von ihnen waren homozygot für Indels, die Mutationen außerhalb des Rahmens erzeugten, die zu vorzeitigen Stop-Codons führten.Western-Blot-Analyse von homozygoten KO-Gründern bestätigte die Abwesenheit von Myostatin, was ein höheres Körpergewicht als Wildtyp-Gegenstücke zeigte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das CRISPR/Cas9-System ein sehr effizientes Werkzeug zur Generierung von Gen-KO-Schafen war.Diese Technologie ist schnell und einfach durchzuführen und kostengünstiger als frühere Techniken und kann auf obt ain genetisch veränderten Tiermodellen von Interesse für die Biomedizin und

Crispo, M. Mulet, A. P. Tesson, L. Barrera, N. Cuadro, F. dos Santos-Neto, P. C. Nguyen, T. H. Crénéguy, A. Brusselle, L. Anegón, I. Menchaca, A.

Während sich die CRISPR/Cas9-Technologie als wertvolles System zur Generierung von gentechnisch veränderten Tieren bei mehreren Arten erwiesen hat, wurde dieses Werkzeug bei Nutztieren kaum beschrieben. Myostatin wird vom MSTN-Gen kodiert, das an der Hemmung der Muskeldifferenzierung und des Muskelwachstums beteiligt ist. Wir haben die Effizienz des CRISPR/Cas9-Systems bestimmt, um MSTN bei Schafen zu bearbeiten und Knock-out (KO)-Tiere zu erzeugen, mit dem Ziel, die Muskelentwicklung und das Körperwachstum zu fördern. Wir generierten CRISPR/Cas9-mRNAs, die für Schaf-MSTN spezifisch sind, und mikroinjizierten sie in das Zytoplasma von Schafzygoten. Beim Vergleich der Embryoentwicklung von CRISPR/Cas9-mikroinjizierten Zygoten (n = 216) mit pufferinjizierten Embryonen (n = 183) und nicht mikroinjizierten Embryonen (n = 173) war die Spaltungsrate für beide mikroinjizierten Gruppen niedriger (P-Zygote CRISPR/Cas9-Mikroinjektion wurden auf 29 Empfänger-Weibchen übertragen, was 65,5% (19/29) der trächtigen Mutterschafe und 41,5% (22/53) der Neugeborenen ergab.Von 22 geborenen Lämmern, die durch T7EI- und Sanger-Sequenzierung analysiert wurden, zeigten zehn Indel-Mutationen am MSTN-Gen Mutationen in beiden Allelen und fünf von ihnen waren homozygot für Indels, die Mutationen außerhalb des Rahmens erzeugten, die zu vorzeitigen Stop-Codons führten.Western-Blot-Analyse von homozygoten KO-Gründern bestätigte die Abwesenheit von Myostatin, was ein höheres Körpergewicht als Wildtyp-Gegenstücke zeigte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das CRISPR/Cas9-System ein sehr effizientes Werkzeug zur Generierung von Gen-KO-Schafen war.Diese Technologie ist schnell und einfach durchzuführen und kostengünstiger als frühere Techniken und kann auf obt ain genetisch veränderten Tiermodellen von Interesse für die Biomedizin und

Jusof, Wan-Hafizah Wan Khan, Nor-Ashikin Mohamed Noor Rajikin, Mohd Hamim Satar, Nuraliza Abdul Mustafa, Mohd-Fazirul Jusoh, Norhazlin Dasiman, Razif

Die evolutionäre Bedeutung der Interaktion zwischen väterlichen und mütterlichen Genomen in befruchteten Zygoten ist eine sehr interessante und herausfordernde Frage. Wanget al. entwickelten das Konzept der epigenetischen Spieltheorie und versuchen mit diesem Konzept die Interaktion zwischen väterlichen und mütterlichen Genomen in befruchteten Zygoten zu erklären [1]. Sie betonen, dass die Embryogenese als ein ökologisches System betrachtet werden kann, in dem sich zwei sehr unterschiedliche und spezialisierte Gameten entweder durch Kooperation oder Konkurrenz oder beides koordinieren, um die Fitness der Embryonen unter der Darwinschen Selektion zu maximieren. Genauer gesagt integrieren sie die Spieltheorie, um das Koordinationsmuster des väterlichen Genoms und des mütterlichen Genoms zu modellieren, das durch die DNA-Methylierungsdynamik vermittelt wird, und nannten dies epigenetische Spieltheorie.

Inoue, Daigo Wittbrodt, Joachim Gruss, Oliver J

Zentrosomen sind die wichtigsten Organisierungszentren von Mikrotubuli in tierischen Zellen. Insbesondere während der Embryogenese sorgen sie für eine treue Spindelbildung und richtige Zellteilungen. Da Metazoen-Zentrosomen während der Oogenese eliminiert werden, müssen sie bei der Befruchtung wieder zusammengesetzt werden. Die meisten Metazoen verwenden die Spermienzentriolen als Template für die neue Zentrosom-Biogenese, während das Zytoplasma der Eizelle alle Komponenten für die laufende Zentrosom-Duplikation in sich schnell teilenden embryonalen Zellen neu vorbereitet. Wir diskutieren unser Wissen und die experimentellen Herausforderungen bei der Analyse der zygotischen Zentrosomenreformation, die genetische Experimente erfordert, um die jeweiligen männlichen und weiblichen Beiträge untersuchen zu können. Männliche und weibliche Knockout-Tiere und mRNA-Injektionen zur Nachahmung der mütterlichen Expression zentrosomaler Proteine ​​könnten einen Weg zur systematischen molekularen Aufgliederung des Prozesses aufzeigen. Die neuesten Daten legen nahe, dass die rechtzeitige Expression von Zentrosomenkomponenten in Oozyten der Schlüssel zur zygotischen Zentrosomenneubildung ist, die männliche Spermien als Koordinatoren für die De-novo-Zentrosomenproduktion verwendet. © 2018 WILEY Periodicals, Inc.

Rawe, V Y Olmedo, S Brugo Nodar, F N Ponzio, R Sutovsky, P

Der Zusammenbau von Kernporenkomplexen (NPC) und ihren zytoplasmatischen Stapeln, annulierten Lamellen (AL), fördert den normalen nukleozytoplasmatischen Verkehr und begleitet die pronukleare Entwicklung innerhalb der Säugetierzygote. Frühere Studien zeigten, dass ein Prozentsatz der in vitro befruchteten menschlichen Eizellen keine normalen Vorkerne entwickeln und sich innerhalb von 40-48 Stunden nach der Insemination nicht spalten konnten. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine anomale Rekrutierung von NPC-Proteinen, Nukleoporinen und/oder NPC, die in AL vormontiert sind, den menschlichen Befruchtungsstillstand begleiten könnte. Wir untersuchten den Zusammenbau von NPC und AL in unbefruchteten menschlichen Oozyten und befruchteten und arretierten Zygoten durch Immunfluoreszenz mit einem NPC- und AL-spezifischen Antikörper, mAb 414, und durch Transmissionselektronenmikroskopie. In den unbefruchteten menschlichen Oozyten wurde keine größere NPC- oder AL-Assemblierung beobachtet. Nach der Befruchtung wurde die Bildung von AL im gesamten Zytoplasma und in der Nähe der sich entwickelnden Vorkerne mit NPC beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde die NPC-Assemblierung in den arretierten Zygoten unterbrochen, während AL zu großen Hüllen gruppiert war. Dies ging einher mit dem Fehlen des Einbaus von NPC in die Kernhüllen. Wir schließen daraus, dass die anomale Anordnung von NPC und AL mit einem frühen Entwicklungsversagen beim Menschen zusammenfällt.

Morel, Alexandre Trontin, Jean-François Corbineau, Françoise Lomenech, Anne-Marie Beaufour, Martine Reymond, Isabelle Le Metté, Claire Ader, Kevin Harvengt, Luc Cadene, Martine Label, Philippe Teyssier, Caroline Lelu-Walter, Marie-Anne

Kotyledonäre somatische Embryonen (SEs) der Seekiefer werden routinemäßig 12 Wochen lang gereift, bevor sie keimen und in Pflänzchen umgewandelt werden. Obwohl der Regenerationserfolg stark von der Qualität der SEs abhängt, wird der Zeitpunkt der Ernte derzeit hauptsächlich auf der Grundlage morphologischer Merkmale bestimmt. Diese empirische Methode liefert keine genauen Aussagen über die Embryoqualität in Bezug auf Speicherstoffe (Proteine, Kohlenhydrate). Wir analysierten zunächst SEs, die 10, 12 und 14 Wochen gereift waren, durch biologische (Trockengewicht, Wassergehalt) und biochemische Messungen (Gesamtprotein- und Kohlenhydratgehalt). Es konnte kein Unterschied zwischen den Sammelterminen festgestellt werden, was darauf hindeutet, dass die Ernte von SEs nach 12 Wochen angemessen ist. Keimblatt-SEs wurden dann mit verschiedenen Stadien, von frisch bis vollständig ausgetrocknet, in der Entwicklung von Keimblatt-zygotischen Embryonen (ZEs) verglichen. Wir identifizierten Profile, die ähnlich waren, indem wir die hierarchische Aszendent-Cluster-Analyse (HCA) verwendeten. Frische und dehydrierte ZEs konnten unterschieden werden, und SEs gruppierten mit frischen ZEs. Beide Embryotypen wiesen ähnliche Kohlenhydrat- und Proteingehalte und -signaturen auf. Diese hohe Ähnlichkeit (94,5 %) wurde durch das Proteom-Profiling weiter unterstützt. Zu den stark exprimierten Proteinen gehörten Speicherproteine, stressbedingte, späte Embryogenese reichlich und Energiestoffwechselproteine. Durch den Vergleich überexprimierter Proteine ​​in sich entwickelnden und kotyledonären SEs oder ZEs konnten einige (23 Proteine) als Biomarker-Kandidaten für das späte Keimblattstadium identifiziert werden. Dies ist der erste Bericht über nützliche generische Proteinmarker zur Überwachung der Embryonalentwicklung bei Seekiefer. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Verbesserungen der SE-Qualität erreicht werden können, wenn die aktuellen Reifungsbedingungen verfeinert werden.

Yu, Hong-Hao Zhao, Heng Qing, Yu-Bo Pan, Wei-Rong Jia, Bao-Yu Zhao, Hong-Ye Huang, Xing-Xu Wei, Hong-Jiang

Dystrophinopathie, einschließlich Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und Becker-Muskeldystrophie (BMD) ist eine unheilbare X-chromosomale hereditäre Muskeldystrophie, die durch eine Mutation im DMD-Gen bei der Kodierung von Dystrophin verursacht wird. Fortschritte beim weiteren Verständnis von DMD/BMD für die Therapie werden erwartet. Studien an mdx-Mäusen und Hunden mit Muskeldystrophie bieten aufgrund der unterschiedlichen pathologischen Manifestationen nur begrenzte Einblicke in die DMD-Krankheitsmechanismen und therapeutische Tests. Miniaturschweine haben eine ähnliche Physiologie und Anatomie wie der Mensch und sind daher ein hervorragendes Tiermodell für menschliche Krankheiten. Hier haben wir erfolgreich ein präzises DMD-Targeting bei chinesischen Diannan-Miniaturschweinen erreicht, indem wir Zygoten mit Cas9-mRNA und sgRNA-Targeting DMD co-injiziert haben. Zwei Ferkel wurden nach Embryotransfer erhalten, eines der Ferkel wurde durch traditionelle Klonierung, Sequenzierung und T7EN1-Spaltungsassay als DMD-modifiziertes Individuum identifiziert. Eine Untersuchung der Targeting-Raten bei DMD-modifizierten Ferkeln ergab, dass sgRNA:Cas9-vermittelte On-Target-Mosaikmutationen 70 % bzw. 60 % der Dystrophin-Allele in der Skelettmuskulatur und in der glatten Muskulatur ausmachten. In der Zwischenzeit wurden keine nachweisbaren Off-Target-Mutationen gefunden, was die hohe Spezifität der genetischen Veränderung mit CRISPR/Cas9 unterstreicht. Das DMD-modifizierte Ferkel zeigte degenerative und gestörte Phänotypen im Skelett- und Herzmuskel und eine abnehmende Dicke der glatten Muskulatur im Magen und Darm. Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein Myopathie-Tiermodell generiert, indem wir die DMD über das CRISPR/Cas9-System in einem Miniaturschwein modifiziert haben.

Garrels, Wiebke Mátés, Lajos Holler, Stephanie Dalda, Anna Taylor, Ulrike Petersen, Björn Niemann, Heiner Izsvák, Zsuzsanna Ivics, Zoltán Kues, Wilfried A.

Gentechnik kann den Nutzen von Schweinen für die Modellierung menschlicher Krankheiten und für die Entwicklung fortschrittlicher therapeutischer Ansätze erweitern. Die ineffiziente Produktion von transgenen Schweinen stellt jedoch einen technologischen Engpass dar. Hier haben wir das hyperaktive Transposonsystem Sleeping Beauty (SB100X) für die enzymkatalysierte Transgenintegration in das embryonale Schweinegenom untersucht. Die Komponenten des Transposon-Vektorsystems wurden als zirkuläre Plasmide in das Zytoplasma von Schweinezygoten mikroinjiziert, was zu einer hohen Häufigkeit von transgenen Föten und Ferkeln führte. Die transgenen Tiere zeigten eine normale Entwicklung und eine anhaltende Reportergen-Expression für >12 Monate. Molekulare Kennzeichen der Transposition wurden durch Analyse von 25 genomischen Insertionsstellen bestätigt. Wir zeigen Keimbahnübertragung, Segregation einzelner Transposons und fortgesetzte, kopienzahlabhängige Transgenexpression bei F1-Nachkommen. Darüber hinaus demonstrieren wir die zielselektierte Geninsertion in Transposon-markierte genomische Loci durch Cre-loxP-basierten Kassettenaustausch in somatischen Zellen gefolgt von einem Kerntransfer. Transposase-katalysierte Transgenese bei einer großen Säugetierart erweitert das Arsenal an transgenen Technologien zur Verwendung bei Haustieren und wird die Entwicklung von Großtiermodellen für menschliche Krankheiten erleichtern. PMID: 21897845

Jacobi, Ashley M. Rettig, Garrett R. Turk, Rolf Collingwood, Michael A. Zeiner, Sarah A. Quadros, Rolen M. Harms, Donald W. Bonthuis, Paul J. Gregg, Christopher Ohtsuka, Masato Gurumurthy, Channabasavaiah B. Behlke, Mark A

Die Genom-Editierung mit dem CRISPR/Cas9-System erfordert das Vorhandensein von Guide-RNAs, die an die Cas9-Endonuklease als Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex in Zellen gebunden sind, der das Wirtszellgenom an den von den Guide-RNAs angegebenen Stellen spaltet. Neues genetisches Material kann während der Reparatur des Doppelstrangbruchs über homologieabhängige Reparatur (HDR) eingeführt werden, wenn geeignete DNA-Matrizen mit den CRISPR-Komponenten geliefert werden. Frühe Methoden verwendeten Plasmid- oder virale Vektoren, um diese Komponenten in der Wirtszelle herzustellen, jedoch zeigen neuere Ansätze, die rekombinantes Cas9-Protein mit synthetischen Leit-RNAs verwenden, die direkt als RNP-Komplex in Zellen eingeführt werden, einen schnelleren Wirkungseintritt mit weniger Off-Target-Effekten. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Verwendung chemisch modifizierter synthetischer Guide-RNAs, die eine verbesserte Nukleasestabilität aufweisen und das Risiko einer Auslösung einer angeborenen Immunantwort in der Wirtszelle reduzieren. Dieser Artikel bietet detaillierte Methoden zur Genom-Editierung unter Verwendung des RNP-Ansatzes mit synthetischen Leit-RNAs unter Verwendung von Lipofektion oder Elektroporation in Säugerzellen oder unter Verwendung von Mikroinjektion in Mauszygoten, mit oder ohne Zugabe einer einzelsträngigen HDR-Matrizen-DNA. Copyright © 2017 Die Autoren. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Sisunandar Rivale, Alain Turquay, Patricia Samosir, Yohannes Adkins, Steve W

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Treue von Kokosnusspflanzen (Cocos nucifera L.) zu untersuchen, die aus der Kryokonservierung gewonnen wurden. Zygotische Embryonen verschiedener Sorten wurden nach vier aufeinanderfolgenden Schritten kryokonserviert, nämlich: schnelle Dehydration, schnelles Einfrieren, schnelles Auftauen und in-vitro-Erholung gefolgt von Akklimatisierung. Am Ende der Akklimatisationsphase wurden die Sämlinge mit gleichaltrigen Artgenossen verglichen, die aus nicht kryokonservierten Embryonen gewonnen wurden. Beide Serien wurden morphologischen, zytologischen und molekularen Vergleichen unterzogen. Hinsichtlich der Wachstumsraten konnten keine signifikanten Unterschiede gemessen werden. Darüber hinaus konnte durch die Messung der Sprossverlängerungsraten, der Produktion geöffneter Blätter sowie der Anzahl und Gesamtlänge der Primärwurzeln keine morphologische Variation festgestellt werden.Die Karyotypanalyse ergab bei allen untersuchten Sorten unabhängig von der Kryokonservierung die gleiche Chromosomenzahl (2n = 32). Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontroll- und kryokonserviertem Material hinsichtlich der Art der Chromosomen, der Länge der langen und kurzen Arme, des Armlängenverhältnisses und des zentromerischen Index beobachtet werden. Die Idiogrammanalyse zeigte jedoch eine größere Anzahl von schwarzen Streifen auf Chromosomen, die aus kryokonserviertem Material isoliert wurden. Die genetische und epigenetische Treue wurde durch Mikrosatelliten-(SSR)-Analyse und globale DNA-Methylierungsraten bewertet, es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen genomischer DNA, die aus Setzlingen aus kryokonservierten Embryonen isoliert wurde, und entsprechenden Kontrollen beobachtet. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass die untersuchte Methode der Kryokonservierung keine groben morphologischen, genetischen oder epigenetischen Veränderungen hervorrief, was darauf hindeutet, dass es sich um eine geeignete Methode zur effizienten Konservierung von Kokosnusskeimplasma handelt.

Raveux, Aurélien Vandormael-Pournin, Sandrine Cohen-Tannoudji, Michel

Die Mikroinjektion des CRISPR/Cas9-Systems in Zygoten ist eine effiziente und vergleichsweise schnelle Methode, um genetisch veränderte Mäuse zu erzeugen. Bisher wurden nur wenige Knock-in-Mäuse mit diesem Ansatz generiert, und da keine systematische Studie durchgeführt wurde, sind Parameter, die die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-vermittelten gezielten Insertion kontrollieren, nicht vollständig etabliert. Hier haben wir den Einfluss mehrerer Parameter auf die Knock-in-Effizienz untersucht, die jeweils nur eine Variable ändern. Wir fanden heraus, dass die Knock-in-Effizienz von den injizierten Cas9-mRNA- und Single-Guide-RNA-Konzentrationen abhängig war und dass die zytoplasmatische Injektion im Vergleich zur pronukleären Injektion zu einer höheren genotypischen Komplexität führte. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass eine Injektion in den Vorkern im Vergleich zum Zytoplasma vorzuziehen ist, um Knock-in-Allele mit einem Oligonukleotid oder einem zirkulären Plasmid zu erzeugen. Schließlich zeigten wir, dass die Nickase-Variante Cas9D10A weniger effizient war als die Wildtyp-Cas9, um Knock-in-Allele zu erzeugen und eine höhere Mosaikrate verursachte. Somit liefert unsere Studie wertvolle Informationen, die dazu beitragen werden, die zukünftige Produktion präziser genetischer Modifikationen bei Mäusen zu verbessern.

Piacentino, Michael L. Chung, Oliver Ramachandran, Janani Zuch, Daniel T. Yu, Jia Conaway, Evan A. Reyna, Arlene E. Bradham, Cynthia A

Die Skelettstrukturierung im Seeigelembryo erfordert eine koordinierte Signalübertragung zwischen dem musterdiktierenden Ektoderm und den skelettogenen primären Mesenchymzellen (PMCs). Neuere Studien haben begonnen, die molekularen Grundlagen für diesen Prozess aufzudecken. Mit einem unvoreingenommenen RNA-Seq-basierten Screen haben wir zuvor den Liganden der TGF-ß-Superfamilie, LvBMP5-8, als skelettales Musterungsgen in Lytechinus variegatus-Embryonen identifiziert. Dieses Ergebnis ist überraschend, da sowohl BMP5-8- als auch BMP2/4-Liganden an der Dorsal-Ventral-(DV)- und Links-Rechts-(LR)-Achsenspezifikation des Seeigels beteiligt sind. Hier zeigen wir, dass zygotisches LvBMP5-8 für eine normale Skelettstrukturierung auf der linken Seite sowie für eine normale PMC-Positionierung während der Gastrulation erforderlich ist. Zygotisches LvBMP5-8 ist für die Expression des linksseitigen Markers soxE erforderlich, was darauf hindeutet, dass LvBMP5-8 für die linksseitige Spezifikation erforderlich ist. Interessanterweise finden wir auch, dass LvBMP5-8 Knockdown die serotonerge Neurogenese auf der linken Seite unterdrückt. Während die LvBMP5-8-Überexpression ausreicht, um Embryonen zu dorsalisieren, stellen wir fest, dass zygotisches LvBMP5-8 für die normale DV-Spezifikation oder -Entwicklung nicht erforderlich ist. Darüber hinaus dorsalisiert ektopes LvBMP5-8 keine LvBMP2/4-Morphantenembryonen, was darauf hinweist, dass BMP5-8 in Abwesenheit von BMP2/4 nicht ausreicht, um dorsal zu spezifizieren. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die zygotische LvBMP5-8-Signalgebung für die Spezifikation auf der linken Seite und für die normale skelettale und neuronale Musterbildung auf der linken Seite wesentlich ist, jedoch nicht für die DV-Spezifikation. Während also sowohl BMP2/4 als auch BMP5-8 die Spezifikation der LR-Achse regulieren, reguliert BMP2/4, aber nicht das zygotische BMP5-8 die Spezifikation der DV-Achse in Seeigelembryonen. Copyright © 2016 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Orsi, Guillermo A. Joyce, Eric F. Couble, Pierre McKim, Kim S. Loppin, Benjamin

Die Hybriddysgenese vom Typ Drosophila I-R ist ein Sterilitätssyndrom (SF-Sterilität), das mit der Mobilisierung des I-Retrotransposons in weiblichen Keimzellen einhergeht. Die SF-Sterilität resultiert aus einer embryonalen Letalität mit mütterlicher Wirkung, deren Ursprung seit ihrer Entdeckung vor etwa 40 Jahren unklar geblieben ist. Hier zeigen wir, dass meiotische Teilungen in SF-Oozyten katastrophal sind und bei der Befruchtung systematisch keinen funktionsfähigen weiblichen Vorkern produzieren. Infolgedessen stoppen die meisten Embryonen von SF-Weibchen ihre Entwicklung mit aneuploiden oder beschädigten Kernen schnell, während andere sich als nicht lebensfähige, androgenetische haploide Embryonen entwickeln. Schließlich zeigen wir, dass im Gegensatz zu Mutanten, die die Biogenese von piRNAs beeinflussen, SF-Eikammern keine persistenten DNA-Doppelstrangbrüche akkumulieren, was darauf hindeutet, dass die I-Element-Aktivität die funktionelle Organisation der meiotischen Chromosomen stören könnte, ohne eine frühe Reaktion auf DNA-Schäden auszulösen .

Usbekova, Svetlana Roy-Sabau, Monica Dalbiès-Tran, Rozenn Perreau, Christine Papillier, Pascal Mompart, Florence Thelie, Aurore Pennetier, Sophie Cognie, Juliette Cadoret, Veronique Royere, Dominique Monget, Philippe Mermillod, Pascal

Hintergrund Zygote Arrest 1 (ZAR1) ist eines der wenigen bekannten eizellenspezifischen Gene für den mütterlichen Effekt, die für den Beginn der Embryonalentwicklung bei Mäusen essentiell sind. Dieses Gen ist in Vertebraten evolutionär konserviert und das ZAR1-Protein ist durch das Vorhandensein einer atypischen Pflanzenhomöobox-Zing-Finger-Domäne gekennzeichnet, was auf seine Rolle bei der Transkriptionsregulation hindeutet. Diese Arbeit zielte auf die Untersuchung dieses Gens ab, das einer der Schlüsselregulatoren der erfolgreichen Präimplantationsentwicklung von Haustieren bei Schweinen und Rindern im Vergleich zum Menschen sein könnte. Methoden Screenings von somatischen Zellhybrid-Panels und in silico Forschung wurden durchgeführt, um die ZAR1-Chromosomenlokalisation und -sequenzen zu charakterisieren. Eine schnelle Amplifikation von cDNA-Enden wurde verwendet, um cDNAs voller Länge zu erhalten. Räumlich-zeitliche mRNA-Expressionsmuster wurden unter Verwendung von Northern Blot, reverser Transkription gekoppelt an Polymerasekettenreaktion und in situ Hybridisierung untersucht. Ergebnisse Wir zeigten, dass ZAR1 ein Einzelkopie-Gen ist, das auf Chromosom 8 bei Schweinen und 6 bei Rindern positioniert ist, und mehrere Varianten der entsprechenden cDNA wurden aus Oozyten kloniert. Die Sequenzanalyse von ZAR1-cDNAs zeigte zahlreiche kurze invertierte Wiederholungen innerhalb der kodierenden Sequenzen und mutmaßliche Pumilio-bindende und Embryo-Deadenylierungselemente innerhalb der 3'-untranslatierten Regionen, was die potentiellen Regulationswege anzeigt. Wir zeigten, dass ZAR1 ausschließlich in Oozyten in Schweineovarien exprimiert wurde, während der ersten Spaltungen in in vivo entwickelten Embryonen persistierte und in Morulae und Blastozysten stark abnahm. ZAR1-mRNA wurde auch in Hoden und, auf niedrigerem Niveau, in Hypothalamus und Hypophyse bei beiden Spezies nachgewiesen. ZAR1 wurde erstmals in Hodenkeimzellen, insbesondere in runden Spermatiden, lokalisiert. Außerdem wurden bei Schwein, Rind und Mensch nur kürzere ZAR1-Transkriptvarianten, die aus alternativem Spleißen resultieren, in Hoden im Vergleich zu Eizellen gefunden. Schlussfolgerung Unsere Daten legen nahe, dass zusätzlich zu seiner Rolle in der frühen Embryonalentwicklung, die durch

Hariton, Eduardo Kim, Keewan Mumford, Sunni L. Palmor, Marissa Bortoletto, Pietro Cardozo, Eden R. Karmon, Anatte E. Sabatini, Mary E. Styer, Aaron K

Es sollte die Assoziation von Eizellspender-Empfänger-Eigenschaften, Eizellspenderreaktion und Lebendgeburtschwangerschaftsrate nach frischer Spendereizelle IVF-ET bewertet werden. Retrospektive Kohortenstudie. Akademische reproduktionsmedizinische Praxis. Zweihundertsiebenunddreißig aufeinanderfolgende IVF-ET-Zyklen von frischen Spendereizellen vom 1. Januar 2007 bis 31. Dezember 2013 im Massachusetts General Hospital Fertility Center. Keiner. Lebendgeburtenrate pro eingeleitetem Zyklus. Das mittlere (±SD) Alter der Eizellspender und -empfängerinnen betrug 27,0 ± 3,7 bzw. 41,4 ± 4,6 Jahre. Die demografischen/reproduktiven Eigenschaften der Eizellenspender, der Test auf die ovarielle Reserve und der Spitzenserum-E 2 während der ovariellen Stimulation waren bei den Zyklen ähnlich, die zu einer Lebendgeburt führten bzw. nicht zu einer Lebendgeburt führten. Die Gesamtimplantations-, klinischen Schwangerschafts- und Lebendgeburtschwangerschaftsraten pro begonnenem Zyklus betrugen 40,5%, 60,8% bzw. 54,9%. Die größte Wahrscheinlichkeit einer Lebendgeburt wurde in Zyklen mit > 10 gewonnenen Eizellen, reifen Eizellen, Eizellen mit normaler Befruchtung (Zygote - zwei Vorkernstadium) und gespaltenen Embryonen beobachtet. Die Anzahl der Eizellen (gesamt und reif), Zygoten und gespaltenen Embryonen sind nach IVF-Zyklen von Spendereizellen mit Lebendgeburten verbunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass spezifische Peri-Fertilisationsfaktoren den Schwangerschaftsausgang nach IVF-Zyklen von Spendereizellen vorhersagen können. Copyright © 2017 Amerikanische Gesellschaft für Reproduktionsmedizin. Alle Rechte vorbehalten.

Peng, Jin Wang, Yong Jiang, Junyi Zhou, Xiaoyang Song, Lei Wang, Lulu Ding, Chen Qin, Jun Liu, Liping Wang, Weihua Liu, Jianqiao Huang, Xingxu Wei, Hong Zhang, Pumin

Eine genaue Genommodifikation bei großen domestizierten Tieren ist unter vielen Umständen wünschenswert. In der Vergangenheit war dies nur durch langwierige und mühsame Klonverfahren möglich. Hier haben wir versucht, dieses Ziel durch den Einsatz des neuesten genommodifizierenden Tools CRISPR/Cas9 zu erreichen. Wir machten uns daran, Humanalbumin-cDNA in den Schweine-Alb-Locus zu klopfen, um rekombinantes Humanserumalbumin (rHSA) herzustellen. HSA ist ein weit verbreitetes menschliches Blutprodukt und wird stark nachgefragt. Wir zeigen , dass die homologe Rekombination in Schweinezygoten sehr effizient ablaufen kann . Alle 16 Ferkel, die aus den manipulierten Zygoten geboren wurden, tragen das erwartete Knockin-Allel und wir haben die Anwesenheit von Humanalbumin im Blut dieser Ferkel nachgewiesen. Darüber hinaus wurde das Knockin-Allel erfolgreich über die Keimbahn übertragen. Es wird erwartet, dass dieser Erfolg in der Präzisionsgenomtechnik die Erforschung von Schweinen und anderen großen domestizierten Tieren anregt, die als Bioreaktoren für die Herstellung biomedizinischer Produkte oder die Erzeugung von Nutztierstämmen mit wünschenswerteren Merkmalen verwendet werden.

Nakagawa, Yoshiko Sakuma, Tetsushi Nishimichi, Norihisa Yokosaki, Yasuyuki Takeo, Toru Nakagata, Naomi Yamamoto, Takashi

Für die effiziente und schnelle Produktion gentechnisch veränderter Mäuse sind robuste reproduktionstechnische Techniken erforderlich. Wir haben über die effiziente Produktion von genomeditierten Mäusen mit reproduktiven Techniken wie Ultra-Superovulation, In-vitro-Fertilisation (IVF) und Vitrifikation/Erwärmung von Zygoten berichtet. Aufgrund der Arbeitseffizienz und der flexiblen Zeitplanung verwenden wir normalerweise vitrifizierte/gewärmte befruchtete Eizellen, die durch IVF für die Mikroinjektion erzeugt wurden. Hier untersuchten wir, ob die Kulturzeit von Zygoten vor der Mikroinjektion die Effizienz der Produktion von Knock-in-Mäusen beeinflusst. Knock-in-Mäuse wurden unter Verwendung von Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR-assoziiertem Protein 9 (Cas9)-System und einzelsträngigem Oligodesoxynukleotid (ssODN) oder PITCh (Precise Integration into Target Chromosom)-System erzeugt, einer Methode zur Integration von a Donorvektor unterstützt durch Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung. Die kryokonservierten befruchteten Eizellen wurden erwärmt, mehrere Stunden kultiviert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten mikroinjiziert. Die Mikroinjektion wurde mit Cas9-Protein, Guide-RNA(s) und einem ssODN- oder PITCh-Donorplasmid für den ssODN-Knock-in bzw. den PITCh-Knock-in durchgeführt. Durch Änderung des Zeitpunkts der Mikroinjektion wurden unterschiedliche Produktionseffizienzen von Knock-in-Mäusen beobachtet. Unsere Studie liefert nützliche Informationen für die CRISPR-Cas9-basierte Generation von Knock-in-Mäusen. © 2017. Herausgegeben von The Company of Biologists Ltd.

Maximova, Siela N. Florez, Sergio Shen, Xiangling Niemenak, Nicolas Zhang, Yufan Curtis, Wayne Guiltinan, Mark J

Theobroma cacao L. ist ein tropischer Obstbaum, dessen Samen zur Herstellung von Schokolade verwendet werden. Die in vitro somatische Embryogenese (SE) von Kakao ist ein Vermehrungssystem, das für eine schnelle Massenvermehrung nützlich ist, um Züchtungsprogramme zu beschleunigen und Pflanzen direkt an Landwirte zu liefern. Zwei Haupteinschränkungen von Kakao-SE bleiben: Die Effizienz der Embryoproduktion ist stark vom Genotyp abhängig und das Fehlen einer vollständigen Keimblattentwicklung führt zu niedrigen Embryo-zu-Pflanzen-Umwandlungsraten. Mit dem Ziel, die SE-Entwicklung besser zu verstehen und die Effizienz der SE-Konversion zu verbessern, haben wir Genexpressionsunterschiede zwischen zygotischen und somatischen Embryonen mit einem Whole Genom Microarray untersucht. Die Expression von 28.752 Genen wurde zu 4 Entwicklungszeitpunkten während der zygotischen Embryogenese (ZE) und 2 Zeitpunkten während der somatischen Kakaoembryogenese (SE) bestimmt. Innerhalb des ZE-Zeitverlaufs wurden 10.288 differentiell exprimierte Gene für Funktionen angereichert, die mit Reaktionen auf abiotische und biotische Stimuli, metabolische und zelluläre Prozesse zusammenhängen. Ein Vergleich der ZE- und SE-Expressionsprofile identifizierte 10.175 unterschiedlich exprimierte Gene. Viele TF-Gene, die vermutlich am Ethylenmetabolismus und der Ethylenreaktion beteiligt sind, wurden in SEs stärker exprimiert als in ZEs. Expressionsniveaus von Genen, die am Fettsäuremetabolismus, der Flavonoidbiosynthese und den Samenspeicherproteingenen beteiligt sind, wurden auch in den beiden Embryonentypen unterschiedlich exprimiert. Eine große Anzahl von Genen wurde während verschiedener Stadien der ZE- und SE-Entwicklung in Kakao unterschiedlich reguliert. Die relativ höhere Expression von Ethylen- und Flavonoid-verwandten Genen während der SE deutet darauf hin, dass die sich entwickelnden Gewebe während der SE-Reifung durch die in vitro-Umgebung einem hohen Stress ausgesetzt sein können. Die Expression von Genen, die an der Synthese von Auxin, mehrfach ungesättigten Fettsäuren und sekundären Metaboliten beteiligt sind, war in SEs im Vergleich zu ZEs trotz fehlender Lipid- und Metabolitakkumulation höher. Diese Unterschiede im Gen

Hintergrund Theobroma cacao L. ist ein tropischer Obstbaum, dessen Samen zur Herstellung von Schokolade verwendet werden. Die in vitro somatische Embryogenese (SE) von Kakao ist ein Vermehrungssystem, das für eine schnelle Massenvermehrung nützlich ist, um Züchtungsprogramme zu beschleunigen und Pflanzen direkt an Landwirte zu liefern. Zwei Haupteinschränkungen von Kakao-SE bleiben: Die Effizienz der Embryoproduktion ist stark vom Genotyp abhängig und das Fehlen einer vollständigen Keimblattentwicklung führt zu niedrigen Umwandlungsraten von Embryo zu Pflanze. Mit dem Ziel, die SE-Entwicklung besser zu verstehen und die Effizienz der SE-Konversion zu verbessern, haben wir Genexpressionsunterschiede zwischen zygotischen und somatischen Embryonen mit einem Whole Genom Microarray untersucht. Ergebnisse Die Expression von 28.752 Genen wurde zu 4 Entwicklungszeitpunkten während der zygotischen Embryogenese (ZE) und 2 Zeitpunkten während der somatischen Kakaoembryogenese (SE) bestimmt. Innerhalb des ZE-Zeitverlaufs wurden 10.288 differentiell exprimierte Gene für Funktionen angereichert, die mit Reaktionen auf abiotische und biotische Stimuli, metabolische und zelluläre Prozesse zusammenhängen. Ein Vergleich der ZE- und SE-Expressionsprofile identifizierte 10.175 unterschiedlich exprimierte Gene. Viele TF-Gene, die vermutlich am Ethylenmetabolismus und der Ethylenreaktion beteiligt sind, wurden in SEs stärker exprimiert als in ZEs. Expressionsniveaus von Genen, die am Fettsäuremetabolismus, der Flavonoidbiosynthese und den Samenspeicherproteingenen beteiligt sind, wurden auch in den beiden Embryonentypen unterschiedlich exprimiert. Schlussfolgerungen Eine große Anzahl von Genen wurde während verschiedener Stadien der ZE- und SE-Entwicklung in Kakao unterschiedlich reguliert. Die relativ höhere Expression von Ethylen- und Flavonoid-verwandten Genen während der SE deutet darauf hin, dass die sich entwickelnden Gewebe während der SE-Reifung durch die in vitro-Umgebung einem hohen Stress ausgesetzt sein können. Die Expression von Genen, die an der Synthese von Auxin, mehrfach ungesättigten Fettsäuren und sekundären Metaboliten beteiligt sind, war in SEs im Vergleich zu ZEs trotz fehlender Lipid- und Metabolitakkumulation höher

Wang, Miranda Ly, Michael Lugowski, Andrew Laver, John D. Lipshitz, Howard D. Smibert, Craig A Rissland, Olivia S

Bei tierischen Embryonen wird die Entwicklungskontrolle von ausschließlich mütterlichen Genprodukten auf diejenigen übertragen, die vom embryonalen Genom kodiert werden, in einem Prozess, der als Übergang von der Mutter zur Zygote (MZT) bezeichnet wird. Wir zeigen, dass das RNA-bindende Protein ME31B während der Drosophila-MZT an Tausende von mütterlichen mRNAs bindet und deren Expression unterdrückt. Allerdings führt ME31B die Repression in verschiedenen Phasen der MZT auf unterschiedliche Weise durch. Zu Beginn unterdrückt es die Translation, während seine Bindung später zur Zerstörung der mRNA führt, höchstwahrscheinlich als Folge einer translationalen Repression im Zusammenhang mit einem robusten mRNA-Zerfall. In einem von der PNG-Kinase abhängigen Prozess sinken die Spiegel von ME31B und seinen Partnern Cup und Trailer Hitch (TRAL) während der MZT um mehr als das Zehnfache, was zu einer Veränderung der Zusammensetzung der mRNA-Protein-Komplexe führt. Wir schlagen vor, dass ME31B ein globaler Repressor ist, dessen regulatorischer Einfluss sich basierend auf seinem biologischen Kontext ändert.

Von Neumann und Morgenstern veröffentlichten 1944 die Theory of Games and Economic Behavior und beschreiben die Spieltheorie als ein Modell, in dem es intelligenten rationalen Entscheidungsträgern gelingt, in Konflikten, kooperativen oder anderen wechselseitigen Beziehungen ihre besten Strategien zu finden, um den größten Nutzen zu erzielen [1] . Dieses Modell wurde anschließend in die Ökologie integriert, um die Fitness einer Art während der natürlichen Selektion zu simulieren, die als evolutionäre Spieltheorie (EGT) bezeichnet wird [2]. Wanget al. schlug epiGame vor, das väterliche und mütterliche Genome als intelligente Akteure nutzt, die während der Embryogenese konkurrieren, kooperieren oder beides, um die Fitness des Embryos zu maximieren [3]. Sie erweiterten die Spieltheorie weiter auf eine individuelle oder einzelne Zellumgebung. Während der frühen Zygotenentwicklung wird die DNA-Methylierung so umprogrammiert, dass das väterliche Genom vor dem mütterlichen Genom demethyliert wird. Nach dem Reset wird die Blastozyste während der Embryogenese remethyliert. Zu diesem Zeitpunkt haben das väterliche und das mütterliche Genom einen Interessenkonflikt bezüglich der Expression ihrer eigenen Gene. Das vorgeschlagene epiGame modelliert eine solche interaktive Regulation zwischen den elterlichen Genomen, um ein Gleichgewicht für die Embryonalentwicklung zu erreichen (Gleichung (2)).

Laver, John D. Li, Xiao Ray, Debashish Cook, Kate B. Hahn, Noah A. Nabeel-Shah, Syed Kekis, Mariana Luo, Hua Marsolais, Alexander J. Fung, Karen Yy Hughes, Timothy R. Westwood, J. Timothy Sidhu, Sachdev S. Morris , Quaid Lipshitz, Howard D. Smibert, Craig A

Hirntumor (BRAT) ist ein Drosophila-Mitglied der TRIM-NHL-Proteinfamilie. Diese Familie ist unter Metazoen konserviert und ihre Mitglieder fungieren als posttranskriptionelle Regulatoren. Es wurde angenommen, dass BRAT indirekt durch Interaktion mit dem RNA-bindenden Protein Pumilio (PUM) zu mRNAs rekrutiert wird. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass BRAT direkt an RNA bindet. Die genaue von BRAT erkannte Sequenz, das Ausmaß der BRAT-vermittelten Regulation und die genaue Rolle von PUM und BRAT bei der posttranskriptionellen Regulation sind unbekannt. Die genomweite Identifizierung von Transkripten, die mit BRAT oder mit PUM in Drosophila-Embryonen assoziiert sind, zeigt, dass sie größtenteils nicht überlappende Sätze von mRNAs binden. BRAT bindet mRNAs, die Proteine ​​kodieren, die mit einer Vielzahl von Funktionen assoziiert sind, von denen sich viele von denen unterscheiden, die von PUM-assoziierten Transkripten implementiert werden. Computeranalysen von In-vitro- und In-vivo-Daten identifizierten ein neues RNA-Motiv, das von BRAT erkannt wird und die BRAT-vermittelte Regulation in Gewebekulturzellen verleiht.Der regulatorische Status von BRAT-assoziierten mRNAs deutet auf eine herausragende Rolle von BRAT bei der posttranskriptionellen Regulation hin, einschließlich einer bisher nicht identifizierten Rolle beim Transkriptabbau. Die transkriptomische Analyse von Embryonen, denen funktionelle BRAT fehlt, zeigt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des Zerfalls von Hunderten mütterlicher mRNAs während des Übergangs von der Mutter zur Zygote. Unsere Ergebnisse stellen die erste genomweite Analyse der mit einem TRIM-NHL-Protein assoziierten mRNAs und die erste Identifizierung eines von dieser Proteinfamilie gebundenen RNA-Motivs dar. BRAT ist ein bedeutender posttranskriptionaler Regulator im frühen Embryo durch Mechanismen, die weitgehend unabhängig von PUM sind.

Hamm, Danielle C. Bondra, Eliana R. Harrison, Melissa M

Die verzögerte transkriptionelle Aktivierung des zygotischen Genoms ist ein nahezu universelles Phänomen bei Metazoen. Unmittelbar nach der Befruchtung wird die Entwicklung durch mütterlich abgelagerte Produkte gesteuert, und erst in späteren Stadien kommt es zu einer umfassenden Aktivierung des zygotischen Genoms. Obwohl die Mechanismen, die diese Genomaktivierung antreiben, derzeit unbekannt sind, hat sich gezeigt, dass der Transkriptionsaktivator Zelda (ZLD) diesen Prozess in Drosophila melanogaster maßgeblich vorantreibt. Hier definieren wir funktionelle Domänen von ZLD , die sowohl für die DNA - Bindung als auch für die transkriptionale Aktivierung benötigt werden . Wir zeigen, dass der C-terminale Cluster von vier Zinkfingern die Bindung an TAGteam-DNA-Elemente in den Promotoren früher exprimierter Gene vermittelt. Alle vier Zinkfinger sind für diese Aktivität erforderlich, und Spleißisoformen, denen drei der vier Zinkfinger fehlen, können die Transkription nicht aktivieren. Diese verkürzten Spleiß-Isoformen unterdrücken dominant die Aktivierung durch die voller Länge, embryonal exprimierte Isoform. Wir kartieren die Transkriptionsaktivierungsdomäne von ZLD auf eine zentrale Region mit geringer Komplexität. Trotz relativ geringer Sequenzkonservierung innerhalb dieser Domäne aktivieren ZLD-Orthologe von Drosophila virilis, Anopheles gambiae und Nasonia vitripennis die Transkription in D. melanogaster-Zellen. Die transkriptionelle Aktivierung durch diese ZLD-Orthologe legt nahe, dass ZLD durch konservierte Interaktionen mit einem oder mehreren Protein-Kofaktor(en) funktioniert. Wir haben unterschiedliche DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen innerhalb des kritischen Transkriptionsfaktors ZLD identifiziert, der die anfängliche Aktivierung des zygotischen Genoms steuert. © 2015 von The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Antoine, A F Faure, J E Cordeiro, S Dumas, C Rougier, M Feijó, J A

In diesem Artikel berichten wir über die direkte Messung eines Einstroms von extrazellulärem Ca(2+), der durch die Gametenfusion in Blütenpflanzen induziert wird. Dieses Ergebnis wurde während der In-vitro-Fertilisation von Mais unter Verwendung einer extrazellulären Ca(2+)-selektiven Vibrationssonde erzielt. Der Ca(2+)-Einstrom, der an der Oberfläche isolierter Eizellen mit oder ohne Adhäsion einer männlichen Samenzelle aufgezeichnet wurde, war nahe Null und über die Zeit stabil. Die Gametenfusion löste jedoch einen Ca(2+)-Einstrom in der Nähe der Spermieneintrittsstelle mit einer Verzögerung von 1,8 ± 0,6 s aus. Der Ca(2+)-Einstrom breitete sich anschließend als Wellenfront durch die gesamte Eizellplasmamembran aus und schritt mit einer geschätzten Geschwindigkeit von 1,13 Mikrometer (-1) fort. Einmal etabliert, waren die Ca(2+)-Einstromintensitäten aufrechterhalten, monoton und homogen über die ganze Eizelle, mit einem durchschnittlichen Spitzeneinstrom von 14,92 pmol.cm(-2) (-1) und einer durchschnittlichen Dauer von 24,4 min. Die Wellenfrontausbreitung der Kanalaktivierung korreliert gut mit den durch die Befruchtung induzierten zytologischen Veränderungen, wie z. Der Calciumeinstrom wurde durch Gadolinium wirksam gehemmt, was möglicherweise mechanosensitive Kanäle impliziert. Darüber hinaus ahmten künstliche Zuflüsse, die durch Inkubation mit Ca(2+)-Ionophoren erzeugt wurden, einige Aspekte der Eiaktivierung nach. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass während der Befruchtung in höheren Pflanzen die Fusion der Gametenmembran die ersten embryonalen Ereignisse durch Kanalöffnung und Ca(2+)-Einstrom einleitet. (c)[Ca(2+)] wiederum kann als Auslöser und möglicherweise als Raum- und Zeitkoordinator vieler Aspekte der Eiaktivierung wirken.

Meyer, Axel Begemann, Gerrit

Bei poeciliiden Fischen wurde die männliche Afterflosse in ein Gonopodium umgewandelt, ein intromittierendes Organ, das für die innere Befruchtung erforderlich ist. Erhöhte Testosteronspiegel induzieren die Metamorphose einer Untergruppe der Analflossenstrahlen, um zu wachsen und die spezialisierten Endstrukturen des Gonopodiums zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind weitgehend unbekannt. Hier untersuchten wir, ob die Retinsäure (RA)-Signalgebung an der Gonopodium-Entwicklung des Schwertträgers Xiphophorus hellerii beteiligt ist. Wir zeigten, dass aldh 1 a 2 , ein RA synthetisierendes Enzym, und die RA-Rezeptoren rar-ga und rar-gb während der Metamorphose in den Afterflossen exprimiert werden. Die Expression von aldh 1 a 2 wird konzentrationsabhängig durch Testosteron reguliert und ist sowohl bei hormoninduzierten als auch bei natürlich sich entwickelnden Gonopodien hochreguliert. Androgenrezeptor (ar), ein mutmaßlicher Regulator der Gonopodialentwicklung, wird in Gonopodienstrahlen zusammen mit aldh 1 a 2 und den RA-Rezeptoren exprimiert. Wichtig ist, dass die experimentelle Zunahme der RA-Signalgebung das Wachstum des Gonopodiums förderte und die Anzahl neuer Segmente erhöhte. Basierend auf Genexpressionsanalysen und pharmakologischer Manipulation der Gonopodiumentwicklung zeigen wir, dass der RA-Signalweg als Reaktion auf Androgensignale aktiviert wird und das Wachstum und die Entwicklung von Flossenstrahlen während der Metamorphose der Afterflosse in das Gonopodium fördert. PMID:24204880

Salvini, Mariangela Fambrini, Marco Giorgetti, Lucia Pugliesi, Claudio

Die Verbindung HaWUS/HaL1L , das gegensätzliche Transkriptionsverhalten und die Abnahme/Zunahme der positiven Histonmarker-Bindung zu beiden Genen deuten auf eine hemmende Wirkung von WUS auf HaL1L in zygotischen Sonnenblumenembryonen hin. Bei Arabidopsis ist eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die an den frühesten Ereignissen der Embryogenese beteiligt sind, die WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX (WOX) Proteinfamilie, die WUSCHEL (WUS) und andere 14 WOX-Proteine ​​umfasst, von denen einige zusätzlich zu . eine konservierte WUS-Box-Domäne enthalten die Homöodomäne. WUS-Transkripte erscheinen sehr früh in der Embryogenese, im 16-Zellen-Embryo-Stadium, werden aber allmählich auf das Zentrum des sich entwickelnden Apikalmeristems (SAM)-Primordiums beschränkt und werden weiterhin in Zellen der Nische/des Organisationszentrums von SAM und Blumen exprimiert Meristeme, um die Stammzellpopulation zu erhalten. Darüber hinaus spielt WUS eine entscheidende Rolle im Embryonalprogramm, das vermutlich den Übergang von vegetativ zu embryonal fördert und/oder die Identität der embryonalen Stammzellen aufrechterhält. Daten zur direkten Interaktion zwischen WUS und Schlüsselgenen für die Samenentwicklung (wie LEC1 und L1L) werden jedoch nicht erhoben. Die Neuheit dieses Berichts besteht in der Charakterisierung des Helianthus annuus WUS (HaWUS)-Gens und in seiner Analyse bezüglich des Musters des methylierten Lysins 4 (K4) des Histons H3 und des acetylierten Histons H3 während der Entwicklung des zygotischen Embryos. Außerdem wurde eine parallele Untersuchung für das HaL1L-Gen durchgeführt, da zwei Kopien der WUS-Bindungsstelle (WUSATA), die zuvor auf der HaL1L-Nukleotidsequenz identifiziert wurde, durch das rekombinante HaWUS-Protein gebunden werden konnten, was auf eine nicht beschriebene Wirkung von HaWUS auf die HaL1L-Transkription hindeutet .

Anil, V S Harmon, A C Rao, K S

Western-Blot-Analyse und Proteinkinase-Assays identifizierten zwei Ca(2+)-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) von 55 bis 60 kD in löslichen Proteinextrakten von embryogenen Sandelholzkulturen (Santalum album L.). Diese Sandelholz-CDPKs (swCDPKs) fehlten jedoch in Pflänzchen, die aus somatischen Embryonen regeneriert wurden. swCDPKs zeigten unterschiedliche Expression (überwacht auf Proteinebene) und Aktivität in verschiedenen Entwicklungsstadien. Zygotische Embryonen, Sämlinge und Endosperm zeigten eine hohe Akkumulation von swCDPK, aber das Enzym wurde in den löslichen Proteinen von Trieben und Blüten nicht nachgewiesen. swCDPK zeigte ein zeitliches Expressionsmuster im Endosperm, das eine hohe Akkumulation und Aktivität in reifen Früchten und Keimungsstadien zeigte. Das Enzym war stark in den Speicherkörpern der Endospermzellen lokalisiert. Die Studie berichtet unseres Wissens auch zum ersten Mal über eine posttranslationale Hemmung/Inaktivierung von swCDPK in zygotischen Embryonen während der Samenruhe und frühen Keimungsstadien. Die zeitliche Expression von swCDPK während der somatischen/zygotischen Embryogenese, Samenreifung und Keimung deutet auf eine Beteiligung des Enzyms an diesen Entwicklungsprozessen hin.

Beim Seeigel, einigen anderen wirbellosen Meerestieren und dem Frosch Xenopus wird die Eiaktivierung bei der Befruchtung von einem Anstieg des intrazellulären pH-Werts (pHi) begleitet. Wir haben den pHi in Keimbläschen (GV)-intakten Maus-Oozyten, ovulierten Eiern und in vivo befruchteten Zygoten unter Verwendung des pH-Indikatorfarbstoffs SNARF-1 gemessen. Der mittlere pH-Wert betrug 6,96 ± 0,004 (+/- SEM) in GV-intakten Oozyten, 7,00 ± 0,01 in ovulierten, unbefruchteten Eizellen und 7,02 ± 0,01 in befruchteten Zygoten, was darauf hindeutet, dass der pHi nach Keimbläschenabbau (GVBD) oder Befruchtung. Um zu untersuchen, ob kurz nach der Eiaktivierung vorübergehende pHi-Änderungen auftreten, wurden Mäuseeier parthenogenetisch durch 7% Ethanol in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aktiviert, wobei keine signifikante Änderung des pHi nach der Ethanolaktivierung erfolgte. Da eine erhöhte Na+/H+-Antiporteraktivität für den pHi-Anstieg beim Seeigel verantwortlich ist, wurde der pHi in Abwesenheit von zugesetztem Bicarbonat oder CO2 gemessen (eine Bedingung, unter der der Antiporter der einzige wichtige pHi-Regulationsmechanismus wäre, der funktionieren könnte, da die anderen waren Bicarbonat-abhängig) in GV-intakten Oozyten, ovulierten Eiern und in vivo befruchteten Zygoten, um zu bestimmen, ob ein Na+/H+-Antiporter aktiviert wurde. Es gab keinen physiologisch signifikanten Unterschied im pHi nach GVBD oder Befruchtung, wenn der pHi in bikarbonatfreiem Medium gemessen wurde, noch eine Veränderung nach parthenogenetischer Aktivierung. Somit ist eine Änderung des pHi kein Merkmal der Eiaktivierung bei der Maus.

Zhang, Zhenbin Sun, Liangliang Zhu, Guijie Cox, Olivia F. Huber, Paul W. Dovichi, Norman J

Ein Sulfonat-Silica-Hybrid-Monolith-Mikroreaktor mit starkem Kationenaustausch wurde synthetisiert und mit einer linearen polyacrylamidbeschichteten Kapillare für die Online-Probenvorbereitung und Kapillarzonenelektrophorese-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-MS/MS) von unten nach oben proteomischer Analyse gekoppelt. Die Proteinprobe wurde in einem sauren Puffer auf den Mikroreaktor geladen. Nach Online-Reduktion, Alkylierung und Verdau mit Trypsin wurden die Verdauungen mit 200 mM Ammoniumbicarbonat bei pH 8,2 für die CZE-MS/MS-Analyse unter Verwendung von 1 M Essigsäure als Hintergrundelektrolyt eluiert. Diese Kombination aus basischer Elution und sauren Hintergrundelektrolyten führt sowohl zur Probenstapelung als auch zur Bildung einer dynamischen pH-Verbindung. 369 Proteingruppen und 1274 Peptide wurden aus 50 ng Xenopus laevis Zygotenhomogenat identifiziert, was mit einer Offline-Probenvorbereitungsmethode vergleichbar ist, aber die Zeit für die Probenvorbereitung wurde von über 24 Stunden auf weniger als 40 Minuten reduziert. Eine drastisch verbesserte Leistung wurde durch die Kopplung des Reaktors an eine längere Trennkapillare (~100 cm) und ein Q Exactive HF-Massenspektrometer erzielt. 975 Proteingruppen und 3749 Peptide wurden aus 50 ng Xenopus-Protein unter Verwendung der Online-Probenvorbereitungsmethode identifiziert.

Anil, Veena S. Harmon, Alice C. Rao, K. Sankara

Western-Blot-Analyse und Proteinkinase-Assays identifizierten zwei Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) von 55 bis 60 kD in löslichen Proteinextrakten von embryogenen Sandelholzkulturen (Santalum album L.). Diese Sandelholz-CDPKs (swCDPKs) fehlten jedoch in Pflänzchen, die aus somatischen Embryonen regeneriert wurden. swCDPKs zeigten unterschiedliche Expression (überwacht auf Proteinebene) und Aktivität in verschiedenen Entwicklungsstadien. Zygotische Embryonen, Sämlinge und Endosperm zeigten eine hohe Akkumulation von swCDPK, aber das Enzym wurde in den löslichen Proteinen von Trieben und Blüten nicht nachgewiesen. swCDPK zeigte ein zeitliches Expressionsmuster im Endosperm, das eine hohe Akkumulation und Aktivität in reifen Früchten und Keimungsstadien zeigte. Das Enzym war stark in den Speicherkörpern der Endospermzellen lokalisiert. Die Studie berichtet unseres Wissens auch zum ersten Mal über eine posttranslationale Hemmung/Inaktivierung von swCDPK in zygotischen Embryonen während der Samenruhe und frühen Keimungsstadien. Die zeitliche Expression von swCDPK während der somatischen/zygotischen Embryogenese, Samenreifung und Keimung deutet auf eine Beteiligung des Enzyms an diesen Entwicklungsprozessen hin. PMID:10759499

Zhang, Yuan-Ming Zhang, Yinghao Guo, Mingyue

Wangs et al. Artikel [1] ist der erste, der die Spieltheorie (insbesondere die evolutionäre Spieltheorie) mit der epigenetischen Modifikation zygotischer Genome integriert. Sie beschrieben und bewerteten einen Modellierungsrahmen, der auf der evolutionären Spieltheorie basiert, um zu quantifizieren, wie Spermien und Eizellen durch epigenetische Prozesse interagieren, um die Embryonalentwicklung zu bestimmen. Sie untersuchten auch die internen Mechanismen für die normale Embryonalentwicklung: 1) evolutionäre Interaktionen zwischen DNA-Methylierung des väterlichen und mütterlichen Genoms und 2) die Anwendung der Spieltheorie, um zu formulieren und zu quantifizieren, wie verschiedene Gene konkurrieren oder kooperieren, um die Embryogenese durch Methylierung zu regulieren. Obwohl er in Bezug auf die spieltheoretische Modellierung nicht sehr umfassend und tiefgreifend ist, schließt dieser Artikel die Lücke zwischen der evolutionären Spieltheorie und der epigenetischen Kontrolle der Embryonalentwicklung durch leistungsstarke gewöhnliche Differentialgleichungen (ODEs). Das epiGame-Framework umfasst vier Aspekte: 1) Charakterisierung der Funktionsweise der epigenetischen Spieltheorie durch die Strategiematrix, in der das Muster und die relative Größe der Methylierungseffekte auf die Embryogenese durch die Kooperations- und Wettbewerbsmechanismen beschrieben werden, 2) Quantifizierung des Spiels, das die Richtung und Grad der PM-Interaktionen während der Embryonalentwicklung können durch das Vorzeichen und die Größe der Interaktionsparameter in Modell (2) erklärt werden, 3) Modellieren epigenetischer Interaktionen innerhalb der Morula, insbesondere für zwei gekoppelte nichtlineare ODEs, mit expliziten Funktionen in Modell (4) , die eine gute Anpassung an die beobachteten Daten für die beiden Geschlechter liefern (angepasster R2 = 0,956), und 4) die multifaktorielle Interaktionen in der Embryogenese von den gekoppelten ODEs in Modell (2) zu Triplett-ODEs in Modell (6) aufzeigen. Dieser Artikel erweitert eindeutig die Spieltheorie von der evolutionären Spieltheorie auf die epigenetische Spieltheorie.

Shi, Junchao Zhang, Xudong Liu, Ying Chen, Qi

In ihrem interessanten Artikel [1] Wang et al. schlug ein mathematisches Modell auf der Grundlage der evolutionären Spieltheorie [2] vor, um die grundlegende Frage in der Embryonalentwicklung anzugehen, nämlich wie Spermien und Eizellen durch epigenetische Prozesse miteinander interagieren, um eine Zygote zu bilden und eine erfolgreiche Embryoentwicklung zu lenken. Diese Arbeit basiert auf der Prämisse, dass die epigenetische Reprogrammierung (bezüglich der Löschung und Rekonstruktion epigenetischer Markierungen wie DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen) nach der Befruchtung von größter Bedeutung für die Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von Embryonen sein könnte, einer Prämisse, der wir voll und ganz zustimmen. angesichts der überzeugenden experimentellen Beweise, die berichtet wurden [3]. Wanget al. haben sich speziell dafür entschieden, den gut untersuchten Prozess der DNA-Methylierung-Reprogrammierung während der frühen Embryonalentwicklung von Säugetieren als Grundlage für die Entwicklung ihres mathematischen Modells, nämlich der epigenetischen Spieltheorie (epiGame), zu verwenden. Sie kamen zu dem Schluss, dass das DNA-Methylierungsmuster in frühen Embryonen von Säugetieren formuliert und quantifiziert werden könnte und ihr Modell weiter verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen, wie die Konkurrenz und/oder Kooperation exprimierter Gene, die die Fitness von Embryonen maximieren, zu quantifizieren. Die Bemühungen von Wang et al. in der quantitativen und systematischen Analyse des Beginns des Lebens offenbar von Wert sind und eine neue Richtung für die zukünftige Embryonenentwicklungsforschung sowohl von theoretischen als auch experimentellen Biologen darstellen. Auf der anderen Seite sehen wir ihre Theorie noch in den Kinderschuhen, weil es noch viele weitere Parameter zu berücksichtigen und Raum für Debatten gibt, wie beispielsweise die Fälle der haploiden Embryonenentwicklung [4]. Hier kommentieren wir kurz den dynamischen Prozess der epigenetischen Reprogrammierung, der über die DNA-Methylierung hinausgeht, ein dynamisches Zusammenspiel, das Histon-Modifikationen, nicht-kodierende RNAs, transponierbare Elemente u ' epigenetische Information in den Gameten - ein Spiel, das vor der Befruchtung begonnen hat.

Hamaji, Takashi Lopez, David Pellegrini, Matteo

Bei der Befruchtung durchlaufen Chlamydomonas reinhardtii-Zygoten ein Differenzierungsprogramm in eine diploide Zygospore, die von der Transkription von Hunderten von Zygoten-spezifischen Genen begleitet wird. Wir identifizierten ein eindeutiges Sequenzmotiv, das wir als zygotisches Antwortelement (ZYRE) bezeichnen, das in den Promotorregionen der frühen zygotischen Gene von C. reinhardtii stark angereichert ist. Ein Luciferase-Reporter-Assay wurde verwendet, um zu zeigen, dass native ZYRE-Motive innerhalb des Promotors des zygotischen Gens ZYS3 oder des Introns des zygotischen Gens DMT4 für die zygotische Induktion notwendig sind. Ein synthetischer Luciferase-Reporter mit einem minimalen Promotor wurde verwendet, um zu zeigen, dass stromaufwärts eingeführte ZYRE-Motive ausreichend sind, um eine zygotische Hochregulation zu verleihen, und dass die ZYRE-kontrollierte zygotische Transkription vom Homöodomänen-Transkriptionsfaktor GSP1 abhängig ist. Darüber hinaus sagen wir voraus, dass ZYRE-Motive Bindungsstellen für die Homöodomänenproteine ​​GSP1-GSM1 entsprechen, die in frühen Zygoten heterodimerisieren und die zygotische Genexpression aktivieren.« weniger

Forsberg, Lars A. Rasi, Chiara Pekar, Gyula Davies, Hanna Piotrowski, Arkadiusz Absher, Devin Razzaghian, Hamid Reza Ambicka, Aleksandra Halaszka, Krzysztof Przewoźnik, Marcin Kruczak, Anna Mandava, Geeta Pasupulati, Julia Saichandasher, Red Dasari, Ravi Chandra Lau, Joey Penagos-Tafurt, Nelly Olofsson, Helena M. Hallberg, Gunilla Skotnicki, Piotr Mituś, Jerzy Skokowski, Jaroslaw Jankowski, Michal Śrutek, Ewa Zegarski, Wojciech Tiensuu Janson, Eva Ryś, Janusz Tot, Jan P.

Sporadischer Brustkrebs (SBC) ist eine häufige Erkrankung ohne solide Mittel zur frühzeitigen Risikovorhersage in der Bevölkerung. Wir untersuchten 282 Frauen mit SBC, wobei wir uns auf Kopienzahlaberrationen in krebsfreiem Brustgewebe (unbeteiligter Rand, UM) außerhalb des Primärtumors (PT) konzentrierten. Insgesamt wurden 1162 UMs (1–14 pro Brust) untersucht. Die vergleichende Analyse zwischen UM(s), PT(s) und Blut/Haut desselben Patienten als Kontrolle ist der Kern des Studiendesigns. Wir identifizierten 108 Patienten mit mindestens einer aberranten UM, was 38,3% der Fälle entspricht. Zuwächse in der Genkopienzahl waren die Hauptart von Mutationen in mikroskopisch normalen Brustzellen, was darauf hindeutet, dass die onkogene Aktivierung von Genen über eine erhöhte Genkopienzahl ein vorherrschender Mechanismus für die Initiation der SBC-Pathogenese ist. Die Zunahme von ERBB2 mit Überexpression des HER2-Proteins war die häufigste Aberration in normalen Zellen. Fünf zusätzliche Wachstumsfaktorrezeptorgene (EGFR, FGFR1, IGF1R, LIFR und NGFR) zeigten ebenfalls wiederkehrende Zunahmen, und diese waren gelegentlich in Kombination mit der Zunahme von ERBB2 vorhanden. Alle in normalen Brustzellen gefundenen Aberrationen wurden zuvor in der Krebsliteratur beschrieben, was auf ihre ursächliche, treibende Rolle bei der Pathogenese von SBC hindeutet.Wir zeigen, dass die Analyse normaler Zellen von Krebspatienten zur Identifizierung von Signaturen führt, die das SBC-Risiko erhöhen können, und unsere Ergebnisse könnten die Wahl des chirurgischen Eingriffs zur Entfernung aller prädisponierenden Zellen beeinflussen. Die frühzeitige Erkennung von Kopienzahlgewinnen, die auf eine Prädisposition für die Entwicklung von Krebs hindeuten, lange bevor nachweisbare Tumore gebildet werden, ist ein Schlüssel für den erwarteten Wandel hin zu einem präventiven Paradigma der personalisierten Medizin für Brustkrebs. PMID:26430163

Die biolistische Transformation von Baumwollmeristemen, die aus reifen Samen isoliert wurden, wird in diesem Buchkapitel detailliert beschrieben. Dieses Verfahren ist einfach und vermeidet die Notwendigkeit, genotypabhängige regenerierbare Zellkulturen zu verwenden. Die Identifizierung der Keimbahntransformation mit dieser Methode ist jedoch mühsam und zeitaufwendig-c.

Wang, Yingchun Wang, Fangfei Sun, Tong Trostinskaia, Anna Wygle, Dana Puscheck, Elizabeth Rappolee, Daniel A

Um zu verstehen, wie mitogene Signale in die Trophoblasten in Präimplantationsembryonen übertragen werden, wurde die Expression von Molekülen des mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK)-Pfads getestet. Wir verwendeten immunzytochemische Mittel und eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, um zu testen, ob Genprodukte des MAPK-Weg-Moleküls auf Protein- und Phosphoproteinebene in der Zygote und auf RNA-Ebene in Ei und Zygote existieren. Darüber hinaus wiesen alle Antikörper die Hauptbande der richtigen Größe in Western von Plazenta-Zelllinien nach, die den am häufigsten vorkommenden Zelltyp in Präimplantationsembryonen darstellen. Ein Großteil der mRNA-Transkripte von MAPK-Weg-Genen wurde in unbefruchteten Eiern nachgewiesen und alle wurden in der Zygote exprimiert. Wir fanden, dass der MAPK-Pfad-Proteinsatz bestehend aus den folgenden Genprodukten vorhanden war: FRS2 alpha, GRB2, GAB1, SOS1, Ha-ras, Raf1/RafB, MEK1,2,5, MAPK/ERK1,2, MAPK/ERK5, und RSK1,2,3 (siehe Abkürzungen). Diese Proteine ​​wurden in Trophoblasten in embryonalen Embryonen am Tag (E) 3,5 nachgewiesen, wenn sie mitogene Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Signale vom Embryo oder koloniestimulierende Faktor-1-Signale vom Uterus vermitteln konnten. Der Phosphorylierungszustand und die Position der Phosphoproteine ​​in den Zellen legten nahe, dass sie bei der Vermittlung mitogener Signale wirken könnten. Interessanterweise wurde ein subtiler Übergang von der mütterlichen MAPK-Funktion zur zygotischen Funktion durch die Lokalisierung von drei MAPK-Weg-Enzymen zwischen E2.5 und E3.5 nahegelegt, Raf1-Phospho ist größtenteils bei E2.5 und E3.5 lokalisiert, und MEK1 ,2-Phospho reichert sich im Zellkern an E2.5 und E3.5 an. MAPK-Phospho verschiebt sich jedoch von der Kernakkumulation bei E2.5 zur zytoplasmatischen Akkumulation bei E3.5. Dieser Befund ähnelt der zytoplasmatischen MAPK-Phospho-Lokalisierung, über die in den Signalfeldern des Fibroblasten-Wachstumsfaktors in Embryonen nach der Implantation berichtet wurde (Corson et al. [2003] Development 130:4527-4537). Diese räumliche und zeitliche Ausdrucksstudie legt die Grundlage für die Planung und Analyse von Störungen

Das vorgestellte Material soll den Schülern helfen, geometrische Muster mit Fibonnaci-Zahlen und dem Goldenen Schnitt zu erkunden und die grundlegenden geometrischen Fähigkeiten zu überprüfen. Zur Vervielfältigung vorgesehene Arbeitsblatt-Master werden zur Verfügung gestellt. Es werden Vorschläge für mögliche Erweiterungen des Klassenzimmers zu den anfänglichen Aktivitäten gemacht . (MP)

Chouvenc, Thomas Helmick, Ericka E. Su, Nan-Yao

Während die Hybridisierung einer invasiven Art mit einer einheimischen Art häufig vorkommt, ist eine Hybridisierung zwischen zwei invasiven Arten selten. Formosa-Unterirdische Termiten (Coptotermes formosanus) und Asiatische Unterirdische-Termiten (C. gestroi) sind beide ökologisch erfolgreich und die beiden wirtschaftlich bedeutendsten Termiten-Schädlinge der Welt. Beide Arten haben sich durch menschliche Aktivitäten in vielen Gebieten der Welt verbreitet, ihre Verbreitungen überschneiden sich jedoch aufgrund unterschiedlicher ökologischer Anforderungen nur in drei engen Gebieten. In Südflorida, wo C. formosanus und C. gestroi beide invasiv sind, überlappten sich die Ausbreitungsflugzeiten beider Arten 2013 und 2014 erstmals nachweislich bevorzugt Paarungsverhalten mit C. formosanus-Weibchen und nicht mit Weibchen ihrer eigenen Art. Im Labor hatten heterospezifische und konspezifische Paarungen eine gleiche Koloniebildungsrate, aber heterospezifische beginnende Kolonien wiesen eine doppelt so hohe Wachstumsrate wie konspezifische beginnende Kolonien auf, was auf einen möglichen Fall von Hybridvitalität hindeutet. Da alle präzygotischen Barrieren zwischen den beiden Arten im Freiland aufgehoben wurden, erhöht das offensichtliche Fehlen postzygotischer Barrieren im Labor die Möglichkeit einer introgressiven Hybridisierung in Südflorida. Während Laborbeobachtungen im Feld noch bestätigt werden müssen und die späte Hybridfruchtbarkeit derzeit unbekannt ist, geben unsere Ergebnisse greifbare Besorgnis über die Hybridisierung von zwei großen zerstörerischen Schädlingsarten auf. Eine solche Hybridisierung wäre wahrscheinlich mit neuen wirtschaftlichen Auswirkungen verbunden.

Hintergrund Der breite Einsatz der gametozytoziden Artemisinin-basierten Kombinationstherapie (ACT) führte zu einer Verringerung der Übertragung von Plasmodium falciparum in mehreren afrikanischen Endemiegebieten. Eine verstärkte Wirkung auf die Malariabelastung kann durch die Entwicklung verbesserter übertragungsblockierender Formulierungen erreicht werden, einschließlich Molekülen, die die gametozytoziden Wirkungen von Artemisinin-Derivaten ergänzen und/oder auf die sich im Vektor entwickelnden Plasmodium-Stadien wirken. Azadirachtin, ein Limonoid (Tetranortriterpenoid), das in Samen von Neem (Azadirachta indica, Meliaceae) reichlich vorhanden ist, ist ein vielversprechender Kandidat, der die Exflagellation von Plasmodium in vitro bei niedrigen Konzentrationen hemmt. Diese Arbeit zielte darauf ab, das Übertragungsblockierungspotenzial von NeemAzal®, einem mit Azadirachtin angereicherten Extrakt aus Neemsamen, unter Verwendung des Nagetier-Malaria-in-vivo-Modells Plasmodium berghei/Anopheles stephensi zu bewerten. Methoden Anopheles stephensi-Weibchen wurde eine Blutmahlzeit an P. berghei-infizierten, gametozytämischen BALB/c-Mäusen angeboten, die eine Stunde vor dem Füttern mit NeemAzal intraperitoneal behandelt wurden. Die übertragungsblockierende Aktivität des Produkts wurde durch Bewertung der Oozystenprävalenz, der Oozystendichte und der Fähigkeit, gesunde Mäuse zu infizieren, bewertet. Um die anti-plasmodiale Wirkung von NeemAzal® auf frühe Mitteldarmstadien, d. h. Zygoten und Ookineten, zu charakterisieren, wurden Giemsa-gefärbte Mücken-Mitteldarmabstriche untersucht. Ergebnisse NeemAzal® blockierte die Entwicklung von P. berghei im Vektor bei einer Azadirachtin-Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht der Maus vollständig. Die insgesamt 138 untersuchten, behandelten Mücken (drei experimentelle Wiederholungen) zeigten keine Oozyste und keine der gesunden Mäuse, die ihren Stichen ausgesetzt waren, entwickelte eine Parasitämie. Die Untersuchung von Ausstrichen des Mitteldarminhalts ergab eine reduzierte Anzahl von Zygoten und postzygoten Formen sowie das Fehlen von reifen Ookineten bei behandelten Stechmücken. Postzygote Formen zeigten mehrere morphologische Veränderungen, die mit der Hypothese einer Azadirachtin-Interferenz mit der Funktionalität der Mikrotubuli vereinbar sind

Sharma, Dipika Kinsey, William H.

Die Befruchtung beginnt mit der Bindung und Verschmelzung eines Spermiums mit der Eizelle, einem Prozess, der einen Kalziumtransienten mit hoher Amplitude auslöst, der sich durch die Eizelle ausbreitet und eine Reihe vorprogrammierter Signaltransduktionsereignisse stimuliert, die für die Entwicklung der Zygote entscheidend sind. Die Identifizierung der Stoffwechselwege stromabwärts dieses Calciumtransienten bleibt ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Grundlage der Zygotenqualität. Die vorliegende Studie zeigt, dass die Calcium-Calmodulin-sensitive Protein-Tyrosinkinase PYK2 ein Ziel des befruchtungsinduzierten Calciumtransienten in der Zebrafisch-Oozyte ist und eine wichtige Rolle bei Aktin-vermittelten Ereignissen spielt, die für den Spermieneinbau entscheidend sind. Bei der Befruchtung wurde PYK2 zunächst an der Stelle der Spermien-Oozyten-Interaktion aktiviert und war eng mit Aktinfilamenten verbunden, die den Befruchtungskegel bilden. Spätere PYK2-Aktivierung war im gesamten Oozytenkortex offensichtlich, jedoch war die Aktivierung über der Tierhemisphäre am intensivsten. Die durch Befruchtung induzierte PYK2-Aktivierung könnte durch die Unterdrückung von Calciumtransienten im Ooplasma durch Injektion von BAPTA als Calciumchelator blockiert werden. Die PYK2-Aktivierung könnte in unbefruchteten Oozyten durch Injektion von IP3 in Konzentrationen, die ausreichend sind, um eine Calciumfreisetzung zu induzieren, künstlich induziert werden. Funktionell hemmte die Unterdrückung der PYK2-Aktivität durch chemische Hemmung oder durch Injektion eines dominant-negativen Konstrukts, das die N-terminale ERM-Domäne von PKY2 codierte, die Bildung eines organisierten Befruchtungskegels und reduzierte die Häufigkeit einer erfolgreichen Spermieninkorporation. Zusammen unterstützen die obigen Ergebnisse ein Modell, in dem PYK2 auf den durch Befruchtung induzierten Calciumtransienten reagiert, indem es die Reorganisation des kortikalen Aktinzytoskeletts fördert, um den Befruchtungskegel zu bilden. PMID: 23084926

Sershen Berjak, Patricia Pammenter, N.W. Wesley-Smith, James

Die Auswirkungen sequenzieller Verfahren, die für die Kryokonservierung von Embryonen erforderlich sind, die aus den widerspenstigen Samen von Haemanthus montanus herausgeschnitten wurden, wurden ultrastrukturell und in Verbindung mit der Atmungsaktivität und der Proteinsyntheserate bewertet. Frisches Material (Wassergehalt, 5,05 ± 0,92 g (-1) Trockenmasse) lieferte ultrastrukturelle Hinweise auf eine beträchtliche metabolische Aktivität, die durch die Atemfrequenz bestätigt wurde. Weder die Exposition gegenüber Glycerin noch Saccharose als penetrierende bzw. nicht penetrierende Kryoschutzmittel führte zu degradativen Veränderungen, obwohl eine erhöhte Vakuolisierung und Autophagie beide begleiteten, während die Atmungsaktivität und die Proteinsyntheseaktivität nicht beeinträchtigt wurden. Glycerin-kryogeschützte Embryonen blitzgetrocknet auf einen Wassergehalt von > 0,4 ​​g g (-1) zeigten organisierte ultrastrukturelle Merkmale und eine beträchtliche Autophagie, die mit der metabolischen Aktivität übereinstimmte, und obwohl die Atmungsaktivität geringer war, war die Proteinsyntheserate im Vergleich zu frischem Material erhöht. Bei Wassergehalten von 0,4 g g(-1) - bei denen der Vakuolisierungsgrad moderat blieb - wurden jedoch schnell abgekühlt. Die Ergebnisse dieser Studie werden insbesondere im Hinblick auf die Belastungen betrachtet, die Embryonen durch eine längere, relativ langsame Dehydration und den endgültigen Wassergehalt auf Embryonen mit beträchtlicher metabolischer Aktivität ausgeübt werden .

Kong, Qingran Banaszynski, Laura A. Geng, Fuqiang Zhang, Xiaolei Zhang, Jiaming Zhang, Heng O'Neill, Claire L Yan, Peidong Liu, Zhonghua Shido, Koji Palermo, Gianpiero D Allis, C David Rafii, Shahin Rosenwaks, Zev Wen, Duancheng

Die Derepression der Chromatin-vermittelten transkriptionellen Repression väterlicher und mütterlicher Genome gilt als der erste große Schritt, der die zygotische Genexpression nach der Befruchtung initiiert. Die Histonvariante H3.3 kommt sowohl in männlichen als auch in weiblichen Gameten vor und wird als wichtig für die Umgestaltung des väterlichen und mütterlichen Genoms für die Aktivierung sowohl während der Befruchtung als auch der Embryogenese angesehen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch wenig verstanden. Unter Verwendung unseres H3.3B-HA-markierten Mausmodells, das entwickelt wurde, um die H3.3-Expression in lebenden Tieren zu melden und verschiedene Quellen des H3.3-Proteins in Embryonen zu unterscheiden, zeigen wir hier, dass Spermien-abgeleitetes H3.3 (sH3.3) Protein wird kurz nach der Befruchtung aus dem Spermiengenom entfernt und während der Embryogenese über die zweiten Polkörperchen (PBII) aus den Zygoten extrudiert. Wir fanden auch, dass das mütterliche H3.3 (mH3.3) Protein bereits 2 h nach der Befruchtung in das väterliche Genom eingebaut wird und im väterlichen Genom bis zum Morula-Stadium nachweisbar ist. Der Knockdown von mütterlichem H3.3 führte zu einer beeinträchtigten Embryonalentwicklung sowohl bei befruchteten Embryonen als auch bei androgenetischen haploiden Embryonen. Darüber hinaus berichten wir, dass die mH3.3-Depletion in Oozyten sowohl die Aktivierung des Oct4-Pluripotenzmarkergens als auch die globale de novo-Transkription aus dem väterlichen Genom, die für die frühe Embryonalentwicklung wichtig ist, beeinträchtigt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H3.3-vermitteltes väterliches Chromatin-Remodeling für die Entwicklung von Präimplantationsembryonen und die Aktivierung des väterlichen Genoms während der Embryogenese essentiell ist. © 2018 von The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Epigenetik bezieht sich typischerweise auf Veränderungen in der Struktur eines Chromosoms, die die Genaktivität und -expression beeinflussen. Genomic Imprinting ist eine besondere Art epigenetischer Phänomene, bei denen die Expression eines Allels von seiner elterlichen Herkunft abhängt. Wenn ein von der Mutter (oder dem Vater) geerbtes Allel geprägt (d. h. stumm) wird, wird es als mütterliche (oder väterliche) Prägung bezeichnet. Imprinting entsteht oft durch DNA-Methylierung und neigt dazu, sich im Genom zusammenzuballen [1]. Es hat sich gezeigt, dass es bei vielen genetischen Erkrankungen des Menschen eine Schlüsselrolle spielt [2]. Die Prägung ist vererbbar und wird in Gameten vor und nach der Befruchtung umprogrammiert [1]. Manchmal ist der Umprogrammierungsprozess nicht reversibel, was zum Verlust der Prägung führt [3]. Obwohl Versuche unternommen wurden, Prägungsgene experimentell oder rechnerisch abzuleiten, ist der zugrunde liegende molekulare Mechanismus, der zu einer unausgeglichenen allelischen Expression führt, noch weitgehend unbekannt.

Ich isolierte ein Ciona intestinalis-Homolog von p53, Ci-p53/p73-a, in einem Microarray-Screen von schnell abgebauter mRNA der Mutter, indem ich die Transkriptome von unbefruchteten Eiern und Embryonen im 32-Zell-Stadium verglich. Eine höhere Expression des Gens in Eiern und eine niedrigere Expression in späteren embryonalen Stadien wurden durch Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WISH) bestätigt, und quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRT-PCR)-Expression war in Eiern und frühen Embryonen allgegenwärtig. Knockdown von Ci-p53/p73-a durch Injektion von Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden (MOs) störte die Bewegungen der Gastrulationszellen und die Expression von Notochord-Markergenen stark. Ein wichtiger Regulator der Notochord-Differenzierung in Ciona-Embryonen ist Brachyury (Ci-Bra), das direkt durch ein Zic-ähnliches Gen (Ci-ZicL) aktiviert wird. Die Expression von Ci-ZicL und Ci-Bra in A-Linien-Notochord-Vorläufern wurde in Ci-p53/p73-a-Knockdown-Embryonen herunterreguliert. Die mütterliche Expression von Ci-p53/p73-b, einem Homolog von Ci-p53/p73-a, wurde ebenfalls nachgewiesen. In Ci-p53/p73-b-Knockdown-Embryonen waren die Bewegungen der Gastrulationszellen, die Expression von Ci-ZicL und Ci-Bra in A-Liniennotochord-Vorläufern und die Expression des Notochord-Markergens in späteren Stadien gestört. Die stromaufwärts gelegene Region von Ci-ZicL enthält mutmaßliche p53-Bindungsstellen. Die cis-regulatorische Analyse von Ci-ZicL zeigte, dass diese Stellen an der Expression von Ci-ZicL in A-Linie Notochord-Vorläufern im 32-Zell- und frühen Gastrula-Stadium beteiligt sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass p53-Gene mütterliche Faktoren sind, die eine entscheidende Rolle bei der A-Linien-Notochord-Differenzierung in C. intestinalis-Embryonen spielen, indem sie die Ci-ZicL-Expression regulieren. Copyright © 2011 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Witty, Alec D. Mihic, Anton Tam, Roger Y. Fisher, Stephanie A. Mikryukov, Alexander Shoichet, Molly S. Li, Ren-Ke Kattman, Steven J. Keller, Gordon

Das Epikard unterstützt die Proliferation von Kardiomyozyten zu Beginn der Entwicklung und versorgt das sich entwickelnde Herz mit Fibroblasten und vaskulären glatten Muskelzellen. Es hat sich gezeigt, dass das Epikard eine wichtige Rolle beim Gewebeumbau nach Herzverletzungen spielt, was den Zugang zu dieser Zelllinie für das Studium der regenerativen Medizin erforderlich macht. Hier beschreiben wir die Erzeugung von epikardialen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen durch stadienspezifische Aktivierung der BMP- und WNT-Signalwege. Diese Zellen weisen morphologische Merkmale auf und exprimieren Marker der epikardialen Abstammungslinie, einschließlich der Transkriptionsfaktoren WT1 und TBX18 und des Retinsäure produzierenden Enzyms ALDH 1 A 2 . Wenn sie zu einem epikardialen-tomesenchymalen Übergang induziert werden, führen die Zellen zu Populationen, die Eigenschaften der Fibroblasten- und vaskulären glatten Muskellinien aufweisen. Diese Ergebnisse identifizieren BMP und WNT als Schlüsselregulatoren der epikardialen Linie in vitro und liefern ein Modell für die Untersuchung der epikardialen Funktion in der menschlichen Entwicklung und Krankheit. PMID:25240927

Miklavcic, John Janez Flaman, Paul

Die Bereiche Biologie, Medizin und Embryologie haben die Entwicklungsmeilensteine ​​des Menschen während der Schwangerschaft sehr detailliert beschrieben. Weniger klar ist, wann Menschen als Menschen, Personen oder Wesen mit gesetzlich geschützten Rechten anerkannt werden. Die Rechtspraxis ist unwiderruflich mit der ethischen Verhaltens verflochten, und die Zeit, in der ein menschliches Leben als Person betrachtet wird, hat Auswirkungen, die sich auf die Gesundheitsversorgung, die Gesetzgebung zur Abtreibung und die Autonomie des Einzelnen erstrecken. Dieser Artikel überprüft die wirtschaftliche Position, dass die Befruchtung der Moment ist, in dem die Person des Empfängnis beginnt. Alternative Positionen, die vorschlagen, dass die Persönlichkeit zu anderen möglichen Zeitpunkten nach der Befruchtung beginnt, werden vorgestellt und der ökonomischen Hypothese gegenübergestellt. Zusammenfassung: Dieser Artikel ist ein Originalwerk, das die verschiedenen Argumente für die menschliche Persönlichkeit bei der Befruchtung und danach kritisch analysiert. Die verschiedenen Positionen zur menschlichen Persönlichkeit werden hier verglichen und kontrastiert. Der Zeitpunkt der menschlichen Lebensspanne, zu dem die Persönlichkeit verliehen wird, hat wichtige Auswirkungen auf die Gesundheitsversorgung, die Gesetzgebung und die persönliche Autonomie.

Tartakoff, Alan Michael Jaiswal, Purnima

Wenn haploide Zellen von Saccharomyces cerevisiae gekreuzt werden, vereinigen sich die elterlichen Kerne und verschmelzen miteinander. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, haben wir Assays entwickelt, die den Einfluss von Medikamenten und Mutationen bewerten. Die Kernkongression wird durch Medikamente gehemmt, die die Aktin- und Tubulin-Zytoskelette stören. Die Fusion der Kernhülle (NE) besteht aus mindestens fünf Schritten, in denen vorläufigen Modifikationen ein kontrollierter Fluss von zunächst äußeren und dann inneren Membranproteinen folgt, alles vor der sichtbaren Erweiterung der Kerntaille oder der Koaleszenz der elterlichen Spindelpolkörper. Der Fluss von Kernporenkomplexen tritt nach der Dilatation auf. Karyogamie erfordert sowohl die Sec18p/NSF-ATPase als auch die ER/NE-luminale Homöostase. Nach der Fusion hält das Chromosomen-Tethering markierte elterliche Genome voneinander getrennt. Der Prozess der NE-Fusion und der Nachweis der Genomunabhängigkeit in Hefe liefern einen Prototyp für das Verständnis verwandter Ereignisse in höheren Eukaryoten.

Hu, Zhilian Holzschuh, Jochen Driever, Wolfgang

DNA-Schadensbindungsprotein 1 (DDB1) ist eine große Untereinheit des heterodimeren DDB-Komplexes, die DNA-Läsionen erkennt und den Nukleotidexzisions-Reparaturprozess einleitet. DDB1 ist auch Bestandteil des CUL4 E3-Ligase-Komplexes, der durch gezielte Ubiquitinierung wichtiger Regulatoren an einem breiten Spektrum zellulärer Prozesse beteiligt ist. Die Funktionen von DDB1 in der Entwicklung wurden in mehreren Modellorganismen untersucht, sind jedoch bisher nicht vollständig verstanden. Hier berichten wir über ein durch ENU induziertes mutiertes ddb1-Allel (ddb1m863), das in Zebrafischen (Danio rerio) identifiziert wurde, und analysieren seine Auswirkungen auf die Entwicklung. Zebrafisch ddb1 wird sowohl maternal als auch zygotisch breit exprimiert, mit verstärkter Expression in Proliferationszonen. Das mutierte Allel (ddb1m863 beeinflusst die Spleißakzeptorstelle von Exon 20 und verursacht einen Spleißdefekt, der zu einer Verkürzung des 1140 Aminosäuren langen Proteins nach Rest 800 führt, dem ein Teil der β-Propellerdomäne BPC und der C-terminalen helikalen Domäne CTD fehlt. ddb1m863 zygotisch mutierte Embryonen haben einen pleiotropen Phänotyp, einschließlich kleinerem und abnormal geformtem Gehirn, Kopfskelett, Augen, Kiefer und Kiemenbögen sowie reduzierten dopaminergen Neuronengruppen.In zygotischen ddb1m863-Mutantenembryonen entwickeln sich jedoch sich früh bildende Gewebe normal, was auf mütterliche Rettung zurückzuführen sein kann. In ddb1m863-Mutantenembryonen waren die pcna-exprimierenden proliferierenden Zellpopulationen reduziert, gleichzeitig mit einer erhöhten Apoptose. Wir beobachteten auch eine gleichzeitige starke Hochregulation von Transkripten des Tumorsuppressors p53 (tp53) und des Zellzyklusinhibitors cdkn1a (p21a/bCIP1/WAF1) in proliferierenden Geweben. Darüber hinaus war die Transkription der Cyclin-Gene ccna2 und ccnd1 in ddb1m863-Mutanten dereguliert. Die Verringerung der p53-Aktivität durch Antisense-Morpholinos linderte den apoptotischen Phänotyp in ddb1m863-Mutanten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ddb1 durch Transkriptionsmechanismen, die Gene regulieren, an der Aufrechterhaltung des ordnungsgemäßen Fortschreitens des Zellzyklus und der Lebensfähigkeit von sich teilenden Zellen während der Entwicklung beteiligt sein könnte

Bchini, Raphaël Vasiliou, Vasilis Branlant, Guy Talfournier, François Rahuel-Clermont, Sophie

Retinsäure (RA), ein Metabolit von Vitamin A, übt bei Wirbeltieren lebenslang pleiotrope Wirkungen aus. Daher muss die RA-Wirkung durch die koordinierte Wirkung von biosynthetischen und abbauenden Enzymen streng reguliert werden. Der letzte Schritt der Retinsäurebiosynthese wird irreversibel durch die NAD-abhängigen Retinaldehydrogenasen (RALDH) katalysiert, die zur Superfamilie der Aldehyddehydrogenase (ALDH) gehören. Niedrige intrazelluläre Netzhautkonzentrationen implizieren eine effiziente molekulare Substraterkennung, um eine hohe Affinität und Spezifität von RALDHs für Netzhaut zu gewährleisten. Diese Studie befasst sich mit den molekularen Grundlagen der Netzhauterkennung bei humanem ALDH1A1 (oder RALDH1) und Ratten-ALDH 1 A 2 (oder RALDH2) durch den Vergleich des katalytischen Verhaltens von Netzhautanaloga und die Nutzung der Fluoreszenzeigenschaften von Retinol. Wir zeigen, dass im Gegensatz zu langkettigen ungesättigten Substraten der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Retinaloxidation durch RALDHs mit der Acylierung verbunden ist. Die Verwendung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers bei Retinol-Wechselwirkung mit RALDHs belegt, dass die Netzhauterkennung in zwei Schritten erfolgt: Bindung an den Substratzugangskanal und eine langsamere Strukturreorganisation mit einer Geschwindigkeitskonstanten der gleichen Größenordnung wie der kcat für die Netzhautoxidation: 0.18 vs. 0,07 s-1 und 0,25 vs. 0,1 s-1 für ALDH1A1 bzw. ALDH 1 A 2 . Dies legt nahe, dass der Konformationsübergang des RALDH-Retinal-Komplexes wesentlich zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt beiträgt, der die Kinetik der Netzhautoxidation als Voraussetzung für die Bildung eines katalytisch kompetenten Michaelis-Komplexes steuert. Diese Schlussfolgerung stimmt mit der allgemeinen Vorstellung überein, dass strukturelle Flexibilität innerhalb des aktiven Zentrums von ALDH-Enzymen ein integraler Bestandteil der Katalyse ist. PMID:23220587

Kang, Hee Jung Hwang, Soo Jin Yoon, Jung Ah Jun, Jin Hyun Lim, Hyunjung Jade Yoon, Tae Ki Song, Haengseok

Prostaglandine nehmen an einer Vielzahl von weiblichen Fortpflanzungsprozessen teil, einschließlich Eisprung, Befruchtung, Embryoimplantation und Geburt. Insbesondere mütterliches Prostacyclin (PGI(2)) ist entscheidend für die Embryoimplantation und die Wirkung von PGI(2) wird nicht über seinen G-Protein-gekoppelten Membranrezeptor IP vermittelt, sondern über seinen nukleären Rezeptor, den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPARδ). Kürzlich haben mehrere Studien gezeigt, dass PGI(2) die Blastozystenentwicklung und/oder die Schlupfrate in vitro und anschließend die Implantations- und Lebendgeburtenrate bei Mäusen verbessert. Der Mechanismus, durch den PGI(2) die Embryonenentwicklung vor der Implantation in vitro verbessert, bleibt jedoch unklar. Mit molekularen, pharmakologischen und genetischen Ansätzen zeigen wir, dass die PGI(2)-induzierte PPARδ-Aktivierung das Schlüpfen von Blastozysten bei Mäusen beschleunigt. mRNAs für PPARδ, Retinoid-X-Rezeptor (heterodimere Partner von PPARδ) und PGI(2)-Synthase (PGIS) werden nach zygotischer Genaktivierung zeitlich induziert, und ihre Expression erreicht im Blastozystenstadium ein Maximum, was darauf hindeutet, dass ein funktioneller Komplex von PPARδ gebildet werden kann in der Blastozyste. Carbaprostacyclin (ein stabiles Analogon von PGI(2)) und GW501516 (ein PPARδ-selektiver Agonist) beschleunigten das Schlüpfen von Blastozysten signifikant, erhöhten jedoch nicht die Gesamtzellzahl der kultivierten Blastozysten. Während U51605 (ein PGIS-Inhibitor) das Schlüpfen von Blastozysten störte, stellte GW501516 das durch U51605 induzierte verzögerte Schlüpfen wieder her. Im Gegensatz zur Verbesserung des Blastozystenschlüpfens durch PPARδ-Agonisten hemmten PPAR-Antagonisten das Schlüpfen von Blastozysten signifikant. Darüber hinaus verursachte die Deletion von PPARδ in frühen Stadien von Präimplantations-Mausembryonen eine Verzögerung des Schlüpfens der Blastozysten, beeinträchtigte jedoch nicht die Entwicklung der Blastozyste. Zusammenfassend beschleunigt die PGI(2)-induzierte PPARδ-Aktivierung das Schlüpfen von Blastozysten bei Mäusen.

Kisielewska, J. Philipova, R. Huang, J.-Y. Whitaker, M.

Seeigel bieten ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Zellzykluskontrollmechanismen, die die DNA-Replikation in vivo steuern. Befruchtung und Zellzyklusprogression werden durch Ca2+-Signale eng koordiniert, aber die Mechanismen, die dem Beginn der DNA-Replikation nach der Befruchtung zugrunde liegen, bleiben weniger klar. In dieser Studie zeigen wir, dass die kalziumabhängige Aktivierung von ERK1 die Akkumulation von CyclinE/cdk2 im männlichen und weiblichen Vorkern und den Eintritt in die erste S-Phase fördert. Wir zeigen, dass die cdk2-Aktivität nach der Befruchtung schnell auf ein Maximum nach 4 min ansteigt, was zeitlich dem frühen ERK1-Aktivitätspeak entspricht. Die Abschaffung der MAP-Kinase-Aktivität nach der Befruchtung mit dem MEK-Inhibitor U0126 reduziert den frühen Peak der cdk2-Aktivität erheblich und verhindert die Akkumulation von CyclinE und cdk2 sowohl im Spermienvorkern als auch im Zygotenkern in vivo. Sowohl p27kip1 als auch Roscovitin, cdk2-Inhibitoren, verhinderten die DNA-Replikation, was auf eine Beteiligung von cdk2 an diesem Prozess in Seeigeln schließen lässt. Die Hemmung der cdk2-Aktivität unter Verwendung von p27kip1 hatte keine Wirkung auf die Phosphorylierung von MBP durch ERK, aber die Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins, eines cdk2-Substrats, wurde vollständig aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die cdk2-Aktivität der ERK1-Aktivierung nachgeschaltet ist. Dieses Regulationsmuster der DNA-Synthese stimmt mit dem Muster überein, das in somatischen Säugerzellen beobachtet wird. PMID:19665013

Bahia, Ana C. Dong, Yuemei Blumberg, Benjamin J. Mlambo, Godfree Tripathi, Abhai BenMarzouk-Hidalgo, Omar J. Chandra, Ramesh Dimopoulos, George

ZUSAMMENFASSUNG Die Übertragung von Malariaparasiten erfordert die erfolgreiche Entwicklung von Plasmodium-Gametozyten zu begeißelten Mikrogameten nach Aufnahme von Mückenblut und die anschließende Befruchtung von Mikro- und Makrogameten für die Entwicklung beweglicher Zygoten, genannt Ookineten, die den Mitteldarm der Anopheles-Vektormücke bei etwa 18- 36 Stunden nach Blutaufnahme. Im Mitteldarm der Mücke muss der Malariaerreger der angeborenen Immunantwort der Mücke und der schädlichen Wirkung ihrer kommensalen Bakterienflora standhalten. Wir haben die Mitteldarm-Kolonisationskapazität von 5 Darmbakterienisolaten aus Feld- und 2 aus Laborkolonien, Mücken und ihre Wirkung auf die Plasmodium-Entwicklung in vivo und in vitro sowie ihren Einfluss auf das Überleben der Mücken untersucht. Einige Bakterienisolate aktivierten das Immunsystem der Mücke, beeinflussten die Lebensdauer der Mücke und waren in der Lage, die Entwicklung von Plasmodium zu blockieren. Wir haben auch gezeigt, dass die Fähigkeit dieser Bakterien, die Parasiten zu hemmen, wahrscheinlich auf verschiedene Mechanismen und Faktoren zurückzuführen ist. Ein Serratia marcescens-Isolat war besonders effizient bei der Besiedlung des Darms der Mücken, gefährdete das Überleben der Mücken und hemmte Plasmodium sowohl im sexuellen als auch im asexuellen Stadium durch sezernierte Faktoren, wodurch es zu einem potenziellen Kandidaten für die Entwicklung einer Interventionsstrategie für die Malariaübertragung wurde. PMID:24428613

Feind, Victoria E. von Dassow, George

Die zytokinetische Furche entsteht durch die räumliche und zeitliche Regulierung der kortikalen Kontraktilität. Um die Rolle von Mikrotubuli bei der Furchenspezifikation zu testen, untersuchten wir die Myosin-II-Aktivierung in Stachelhäuterzygoten, indem wir die Lokalisation der Serin19-phosphorylierten regulatorischen leichten Kette (pRLC) nach genau abgestimmten Medikamentenbehandlungen untersuchten. Kortikales pRLC war vor der Zytokinese global erniedrigt, dann nur am Äquator erhöht. Wir haben die Zellzyklus-Biochemie (nicht Mikrotubuli) mit der pRLC-Depression und die unterschiedliche Mikrotubuli-Stabilität mit der Lokalisierung der nachfolgenden Myosin-Aktivierung in Verbindung gebracht. Ohne Mikrotubuli trat die pRLC-Akkumulation global statt äquatorial auf, und der Verlust nur dynamischer Mikrotubuli erhöhte die äquatoriale pRLC-Rekrutierung. Die Behandlung mit Nocodazol zeigte eine Population stabiler astraler Mikrotubuli, die sich während der Anaphase bildeten, diejenigen, die auf den Äquator gerichtet waren, wurden länger und ihre Spitzen fielen mit der kortikalen pRLC-Akkumulation zusammen. Das Schrumpfen des mitotischen Apparats mit Colchicin zeigte eine pRLC-Suppression in der Nähe dynamischer Mikrotubuli-Arrays. Wir schließen daraus, dass gegenläufige Effekte von stabilen versus dynamischen Mikrotubuli die Myosinaktivierung während der Zytokinese auf den Zelläquator konzentrieren. PMID:18955555

Ouellette, Marie-Hélène Martin, Emmanuel Lacoste-Caron, Germain Hamiche, Karim Jenna, Sarah

Kollektive Epithelzellmigration erfordert die Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Verbindungen, während gleichzeitig die Bildung von aktinreichen Vorsprüngen an der Vorderkante der wandernden Zellen ermöglicht wird. Die ventrale Einschließung von Caenorhabditis elegans-Embryonen hängt von der kollektiven Migration von anterior positionierten führenden hypodermalen Zellen in Richtung der ventralen Mittellinie ab, wo sie neue Verbindungen mit ihren kontralateralen Nachbarn bilden. In dieser Studie haben wir die zygotische Funktion von RGA-7/SPV-1 charakterisiert, einem CDC-42/Cdc42- und RHO-1/RhoA-spezifischen Rho-GTPase-aktivierenden Protein, das die Bildung aktinreicher Vorsprünge an den führenden Rand der führenden hypodermalen Zellen und die Bildung neuer Verbindungen zwischen kontralateralen Zellen. Wir zeigen, dass RGA-7 diese Prozesse antagonistisch mit dem CDC-42-Effektor WSP-1/N-WASP und den CDC-42-bindenden Proteinen TOCA-1/2/TOCA1 steuert. RGA-7 wird an räumlich unterschiedlichen Stellen an Verbindungen zwischen benachbarten führenden Zellen rekrutiert, wo es die Akkumulation von Clustern von aktiviertem CDC-42 fördert. Es hemmt auch die Ausbreitung dieser Cluster in Richtung der Vorderkante der Verbindungen und reguliert ihre Ansammlung und Verteilung an neuen Verbindungen, die zwischen kontralateralen führenden Zellen gebildet werden. Unsere Studie legt nahe, dass RGA-7 die kollektive Migration und die Bildung von Verbindungen zwischen Epithelzellen kontrolliert, indem es aktives CDC-42 innerhalb der Zell-Zell-Verbindungen räumlich einschränkt. © Der Autor (2015). Herausgegeben von Oxford University Press im Auftrag des Journal of Molecular Cell Biology, IBCB, SIBS, CAS. Alle Rechte vorbehalten.

Lian, Hua-Yu Jiao, Guang-Zhong Wang, Hui-Li Tan, Xiu-Wen Wang, Tian-Yang Zheng, Liang-Liang Kong, Qiao-Qiao Tan, Jing-He

Obwohl während der vorkernigen Entwicklung von Zygoten eine Fusion von Nukleolen beobachtet wurde und das Verhalten von Nukleolen in Vorkernen als Indikator für das embryonale Entwicklungspotential vorgeschlagen wurde, ist der Mechanismus der nukleolären Fusion unklar. Obwohl sowohl das Zytoskelett als auch der Nukleolus wichtige zelluläre Einheiten sind, gibt es keine speziellen Berichte über die Beziehung zwischen den beiden. Die Rolle des Zytoskeletts bei der Regulierung der Nukleolenfusion wurde unter Verwendung des aktivierten Maus-Oozytenmodells untersucht. Maus-Oozyten wurden für 6 h in aktivierendem Medium (Ca²⁺-freies CZB-Medium mit 10 mM SrCl₂) kultiviert, das mit oder ohne Inhibitoren für das Zytoskelett oder die Proteinsynthese vor der Vorkernbildung, der nukleolären Fusion und der Aktivität des reifungsfördernden Faktors (MPF) ergänzt wurde. Wurden untersucht. Während die Behandlung mit dem Mikrofilament-Inhibitor Cytochalasin D oder B oder dem intermediären Filament-Inhibitor Acrylamid die nukleoläre Fusion effizient unterdrückte, zeigte die Behandlung mit dem Mikrotubulus-Inhibitor Demecolcin oder Nocodazol oder dem Proteinsynthese-Inhibitor Cycloheximid keine Wirkung. Das Cytochalasin D- oder Acrylamid-sensitive zeitliche Fenster stimmte gut mit dem berichteten zeitlichen Fenster für die nukleoläre Fusion in aktivierten Oozyten überein. Während eine kontinuierliche Inkubation mit Demecolcin die Bildung von Vorkernen verhinderte, bildeten sich Vorkerne normal, wenn Demecolcin während der ersten Stunde der Aktivierungsbehandlung ausgeschlossen wurde, als die MPF-Aktivität dramatisch abfiel. Die Ergebnisse legen nahe, dass 1) Mikrofilamente und Zwischenfilamente, aber nicht Mikrotubuli die nukleoläre Fusion unterstützen, 2) Proteine, die für die nukleoläre Fusion erforderlich sind, einschließlich Mikrofilamente und Zwischenfilamente, nicht de novo synthetisiert werden und 3) die Mikrotubuli-Disruption die Vorkernbildung durch Aktivierung von MPF ​​verhindert. © 2014 von der Society for the Study of Reproduction, Inc.

Matsukuma, S Nakatsuru, Y Nakagawa, K Utakoji, T Sugano, H Kataoka, H Sekiguchi, M Ishikawa, T

Das E. coli ada-Gen kodiert für die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (O6MTase), die die Methylierung von Guanin an der O6-Position in der DNA repariert. Nach Rekombination mit einem chinesischen Hamster-Metallothionein-I-Genpromotor wurde das ada-Gen in C3H/HeN-Mauszygoten mikroinjiziert. Schließlich wurden transgene Mäuse erzeugt, die die ada-Fusions-DNA enthielten. Der integrierte ada-DNA-Komplex wurde auf die Nachkommen in einem Modus übertragen, der der Tandemintegration an einer einzelnen Chromosomenstelle entsprach, und es wurden auch Homozygote aus einer intertransgenen Mauskreuzung erhalten. RNA-Transkripte des chimären ada-Gens wurden in den Lebern dieser transgenen Mäuse unter Verwendung von Dot- und Northern-Blot-Analysen identifiziert. Die O6MTase-Aktivität war in der Leber von transgenen Mäusen der Linie Nr. 708 erhöht und war mehr als dreimal die Aktivität, die in nicht-transgenen Mäusen, insbesondere in den transgenen Homozygoten, gefunden wurde. Das ada-Genprodukt wurde in der Leber eines transgenen Homozygoten durch Immunoblot-Analyse nachgewiesen. Diese transgenen Mäuse haben ein großes Potenzial für die Analyse der Rolle der O6MTase bei der chemischen Karzinogenese.

Bryńska, Anita Lipińska, Elzbieta Matelska, Monika

Repetitive und stereotype Verhaltensweisen in Form von Interessenklischees oder spezifischen Routinetätigkeiten sind eines der diagnostischen Kriterien bei tiefgreifenden Entwicklungsstörungen. Das Auftreten repetitiver Verhaltensweisen bei Patienten mit tiefgreifenden Entwicklungsstörungen ist ein Ausgangspunkt für Fragen nach Art und Klassifizierungskriterien solcher Verhaltensweisen. Ziel des Artikels ist es, Fallstudien von Patienten mit tiefgreifenden Entwicklungsstörungen und komorbiden Symptomen in Form von Routineaktivitäten, Tics, Zwangssymptomen oder stereotypen Verhaltensweisen vorzustellen. Die erste Fallstudie beschreibt einen Patienten mit Asperger-Syndrom und Zwangssymptomen. Die diagnostischen Probleme bezüglich komplexer motorischer Tics werden in der zweiten Fallstudie diskutiert, die einen Patienten mit Asperger-Syndrom und Gilles-de-la-Tourette-Syndrom beschreibt. Die dritte und vierte Fallstudie beschreibt eineiige Zwillinge mit so genanntem High Functioning Autism, deren repetitive Aktivitäten entweder auf Zwangssymptome, stereotype Bewegungen, absolutes Konsistenzbedürfnis oder Echopraxie hinweisen. Die mögliche Komorbidität von tiefgreifenden Entwicklungsstörungen und Symptomen in Form von repetitiven Verhaltensweisen, möglichen Interaktionen sowie diagnostischen Herausforderungen wird in dem Artikel diskutiert.

Chen, Yuting Lu, Wenqing Gao, Na Long, Yi Shao, Yanjiao Liu, Meizhen Chen, Huaqing Ye, Shixin Ma, Xueyun Liu, Mingyao Li, Dali

Die Laborratte ist ein wertvoller Säugetiermodellorganismus für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung. Hier demonstrieren wir eine effiziente Methodik durch die Anwendung der Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen (TALENs) Technologie, um Leptinrezeptor (Lepr) Knockout-Ratten auf dem genetischen Hintergrund von Sprague Dawley (SD) zu erzeugen. Durch direkte Injektion von in vitro transkribierter mRNA von TALEN-Paaren in SD-Rattenzygoten wurden in zwei von drei resultierenden Jungtieren somatische Mutationen induziert. Einer der Gründer, der eine bi-allelische Mutation trug, zeigte einen frühen Beginn von Fettleibigkeit und Unfruchtbarkeit. Der andere Gründer trug eine chimäre Mutation, die effizient auf die Nachkommen übertragen wurde. Durch Phänotypisierung der resultierenden drei Rattenlinien mit unterschiedlichen Mutationen im Lepr-Locus fanden wir, dass die Stämme mit einer Frame-verschobenen oder vorzeitigen Stop-Codon-Mutation zu Fettleibigkeit und Stoffwechselstörungen führten. Es wurde jedoch kein offensichtlicher Defekt in einem Stamm mit einer Deletion im Leseraster von 57 bp in der extrazellulären Domäne von Lepr beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die deletierten Aminosäuren die Struktur und Funktion von Lepr nicht signifikant beeinflussen. Dies ist der erste Bericht über die Generierung des Modells der fettleibigen Ratte mit der Lepr-Mutante im SD-Stamm durch einen umgekehrten genetischen Ansatz. Dies deutet darauf hin, dass TALEN eine effiziente und leistungsstarke Gen-Editing-Technologie zur Generierung von Krankheitsmodellen ist.

King, Ryan S. Maiden, Stephanie L. Hawkins, Nancy C. Kidd, Ambrose R. Kimble, Judith Hardin, Jeff Walston, Timothy D.

Dishevelleds sind modulare Proteine, die an der Kreuzung divergierender Wnt-Signalwege liegen. Die DIX-Domäne von zerzausten Zellen moduliert einen β-Catenin-Zerstörungskomplex und vermittelt dadurch Entscheidungen über das Zellschicksal durch unterschiedliche Aktivierung von Tcf-Transkriptionsfaktoren. Die DEP-Domäne von zerzausten Stoffen vermittelt die planare Polarität von Zellen innerhalb einer Schicht durch die Regulierung von Aktinmodulatoren. Bei Caenorhabditis elegans werden asymmetrische Zellschicksalsentscheidungen durch die asymmetrische Lokalisierung von Signalkomponenten in einem Weg reguliert, der als Wnt/β-Catenin-Asymmetrieweg bezeichnet wird. Welche Domäne(n) von Disheveled diesen Weg regulieren, ist unbekannt. Wir zeigen, dass C. elegans-Embryonen von dsh-2 (or302) mutierten Müttern keine erfolgreiche Morphogenese durchlaufen, aber Transgene, die entweder die DIX- oder die DEP-Domäne von DSH-2 enthalten, sind ausreichend, um den mutierten Phänotyp zu retten. Embryonen, denen die zygotische Funktion von SYS-1/β-Catenin, WRM-1/β-Catenin oder POP-1/Tcf fehlt, zeigen ähnliche Defekte wie dsh-2-Mutanten, einschließlich eines Verlusts der Asymmetrie bei einigen Entscheidungen über das Zellschicksal. Die Entfernung von zwei zerzausten Stoffen (dsh-2 und mig-5) führt zu einem globalen Verlust der POP-1-Asymmetrie, der durch Zugabe von Transgenen, die entweder die DIX- oder DEP-Domäne von DSH-2 enthalten, gerettet werden kann. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass entweder die DIX- oder DEP-Domäne von DSH-2 in der Lage ist, den Wnt/β-Catenin-Asymmetrieweg zu aktivieren und anterior-posteriore Schicksalsentscheidungen zu regulieren, die für die richtige Morphogenese erforderlich sind. PMID:19298786

Perisé-Barrios, Ana J. Gómez, Rafael Corbí, Angel L. de La Mata, Javier Domínguez-Soto, Angeles Muñoz-Fernandez, María A.

Die Tumormikroumgebung begünstigt die Flucht vor der Immunüberwachung, indem sie die Immunsuppression fördert und proinflammatorische Reaktionen abschwächt. Da die meisten tumorassoziierten Makrophagen (TAM) ein M2-ähnliches Tumorzellwachstum aufweisen, das die Polarisation fördert, haben wir die Rolle des 2G-03NN24-Carbosilan-Dendrimers bei der M2-Makrophagen-Polarisation untersucht, um die potenzielle Anwendung von Dendrimeren in der Tumorimmuntherapie zu bewerten. Wir fanden, dass das 2G-03NN24-Dendrimer die LPS-induzierte IL-10-Produktion von in vitro erzeugten Monozyten-abgeleiteten M2-Makrophagen verringert und auch ihr Genexpressionsprofil in Richtung des Erwerbs von M1-Polarisationsmarkern (INHBA, SERPINE1, FLT1, EGLN3 und ALDH 1 A 2 ) und der Verlust von M2-polarisationsassoziierten Markern (EMR1, IGF1, FOLR2 und SLC40A1).Darüber hinaus verringert 2G-03NN24-Dendrimer die STAT3-Aktivierung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das 2G-03NN24-Dendrimer aufgrund seiner potenziellen Fähigkeit, die M2-ähnliche Polarisation von TAM zu begrenzen, ein nützliches Werkzeug für die Antitumortherapie sein kann. Die Tumormikroumgebung begünstigt die Flucht aus der Immunüberwachung, indem sie die Immunsuppression fördert und proinflammatorische Reaktionen abschwächt. Da die meisten tumorassoziierten Makrophagen (TAM) ein M2-ähnliches Tumorzellwachstum aufweisen, das die Polarisation fördert, haben wir die Rolle des 2G-03NN24-Carbosilan-Dendrimers bei der M2-Makrophagen-Polarisation untersucht, um die potenzielle Anwendung von Dendrimeren in der Tumorimmuntherapie zu bewerten. Wir fanden, dass das 2G-03NN24-Dendrimer die LPS-induzierte IL-10-Produktion von in vitro erzeugten Monozyten-abgeleiteten M2-Makrophagen verringert und auch ihr Genexpressionsprofil in Richtung des Erwerbs von M1-Polarisationsmarkern (INHBA, SERPINE1, FLT1, EGLN3 und ALDH 1 A 2 ) und der Verlust von M2-polarisationsassoziierten Markern (EMR1, IGF1, FOLR2 und SLC40A1). Darüber hinaus verringert 2G-03NN24-Dendrimer die STAT3-Aktivierung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Dendrimer 2G-03NN24 aufgrund seiner potentiellen Fähigkeit, die M2-ähnliche Polarisation von TAM . zu begrenzen, ein nützliches Werkzeug für die Antitumortherapie sein kann

Simmons, Michael J. Haley, Kevin J. Grimes, Craig D. Raymond, John D. Fong, Joseph C. L

Fusionen zwischen dem Drosophila hsp70-Promotor und drei verschiedenen unvollständigen P-Elementen, KP, SP und BP1, wurden mittels Hobo-Transformationsvektoren in das Drosophila-Genom eingefügt und die resultierenden transgenen Vorräte wurden auf Repression der P-Element-Transposase-Aktivität getestet. Nur die H(hsp/KP)-Transgene reprimierten die Transposase-Aktivität, und der Grad der Repression war mit dem eines natürlich vorkommenden KP-Elements vergleichbar. Die KP-Transgene unterdrückten die Transposase-Aktivität sowohl mit als auch ohne Hitzeschockbehandlungen. Sowohl das KP-Element als auch das H(hsp/KP)-Transgen reprimierten die vom modifizierten P-Element im P(ry(+), Delta2-3)99B-Transgen codierte Transposase-Aktivität effektiver als die vom vollständigen P-Element im H . codierte (hsp/CP)2-Transgen, obwohl das P(ry(+), Delta2-3)99B-Transgen die stärkere Transposasequelle war. Die Repression beider Transposasequellen schien auf einen zygotischen Effekt des KP-Elements oder Transgens zurückzuführen zu sein. Es gab weder Hinweise auf eine Repression durch einen rein maternalen Effekt noch gab es Hinweise auf eine Verstärkung der KP-Repression durch die gemeinsame maternale Übertragung von H(hsp/KP)- und H(hsp/CP)-Transgenen. Diese Ergebnisse stimmen mit der Idee überein, dass die KP-vermittelte Repression der P-Element-Aktivität ein KP-Repressor-Polypeptid beinhaltet, das nicht maternal übertragen wird, und dass die KP-vermittelte Repression nicht durch den 66-kD-Repressor verstärkt wird, der von vollständigen P-Elementen durch alternierende Spleißen ihrer RNA. PMID:12019235

Ein aktives Filter vom Operationsverstärkertyp, bei dem der einzige Kondensator in der Schaltung die Kompensationskapazität der Operationsverstärker ist, wobei die verschiedenen Rückkopplungs- und Kopplungselemente im Wesentlichen ausschließlich widerstandsbehaftet sind.

Itou, Junji Akiyama, Ryutaro Pehoski, Steve Yu, Xiaodan Kawakami, Hiroko Kawakami, Yasuhiko

Hintergrund Das Zebrafischherz regeneriert sich nach verschiedenen schweren Verletzungen. Häufige Prozesse der Herzregeneration sind die Proliferation von Kardiomyozyten, die Aktivierung des epikardialen Gewebes und die Neovaskularisation. Um die Herzregenerationsprozesse weiter zu charakterisieren, haben wir mildere Verletzungen eingeführt und die Reaktionen mit denen verglichen, die durch eine ventrikuläre Apexresektion, eine weit verbreitete Verletzungsmethode, hervorgerufen werden. Als verletzungsinduzierende Techniken verwendeten wir das Kratzen der Ventrikeloberfläche und das Punktieren des Ventrikels mit einer feinen Wolframnadel. Ergebnisse Das Kratzen der ventrikulären Oberfläche induzierte eine subtile Proliferation von Kardiomyozyten und Reaktionen des Epikards. Die Akkumulation von Endothelzellen war auf die Herzoberfläche beschränkt. Ventrikuläre Punktion induzierte Kardiomyozytenproliferation, endokardiale und epikardiale Aktivierung und Neovaskularisation, ähnlich der Resektionsmethode. Der Grad der Reaktionen war jedoch milder und korrelierte mit einer milderen Verletzung. Scheinoperation induzierte epikardiale aldh 1 a 2 Expression, jedoch nicht tbx18 und WT1. Schlussfolgerungen Die Punktion des Ventrikels induziert Reaktionen, die einer Resektion bei milderem Grad in einem kürzeren Zeitrahmen entsprechen, und würde als einfaches Verletzungsmodell verwendet. Das Kratzen des Ventrikels induzierte keine Herzregeneration und würde zum Untersuchen der Wundreaktionen auf das Epikard verwendet. PMID:25074230

Nakajima, Tadaaki Iguchi, Taisen Sato, Tomomi

Der Müllersche Gang entwickelt sich zu Eileiter, Uterus und Vagina, die alle in ihrer Morphologie und Funktion recht unterschiedlich sind. Das epitheliale Schicksal dieser weiblichen Fortpflanzungsorgane bei sich entwickelnden Mäusen wird durch Faktoren bestimmt, die aus dem Stroma sezerniert werden, jedoch ist noch unklar, wie die Stromadifferenzierung in den weiblichen Fortpflanzungsorganen, die aus dem Müllerschen Gang stammen, stattfindet. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der Retinsäure (RA)-Signalgebung bei der Entwicklung der weiblichen Fortpflanzungsorgane untersucht. Retinol-Dehydrogenase 10 (RDH10) und Aldehyd-Dehydrogenase-Familie 1 Unterfamilie A2 (ALDH 1 A 2 ) mRNAs und Proteine ​​und die Transaktivierungsaktivität von endogener RA wurden im Stroma der proximalen Müllerschen Gänge gefunden und nahmen von der proximalen zur kaudalen Region bei fetalen Mäusen allmählich ab. In organkultivierten Müllerschen Gängen induzierte Retinaldehyd- oder RA-Behandlung die Uterusepitheldifferenzierung, definiert als eine Schicht von Zylinderepithelzellen, die für oviduktale und vaginale Epithelmarker negativ sind. Im Gegensatz dazu induzierte die Hemmung der RA-Rezeptor (RAR)-Signalgebung eine Differenzierung des Vaginalepithels, die als Markergene des Vaginalepithels – positives geschichtetes Epithel charakterisiert wird. Transplantationsexperimente des organkultivierten Müllerschen Ganges zeigten eine irreversible Bestimmung des epithelialen Schicksals. Obwohl RAR nicht direkt an die Homeobox A10 (Hoxa10)-Promotorregion band, stimulierte die RA-RAR-Signalgebung die Hoxa10-Expression. Somit bestimmt die RA-RAR-Signalgebung im Müllerschen Gang das Schicksal des Stromas, um die zukünftige Gebärmutter und Vagina zu bilden. PMID:27911779

Troncoso-Ponce, Manuel Adrián Barthole, Guillaume Tremblais, Geoffrey

Bei Angiospermen leitet die doppelte Befruchtung des Embryosacks die Entwicklung des Embryos und des Endosperms ein. Bei Arabidopsis thaliana, einer exalbuminösen Art, wird das Endosperm während der Samenreifung auf eine Zellschicht reduziert und Reserven wie Öl werden massiv in den sich vergrößernden Embryo eingelagert. Hier betrachten wir die auffallend unterschiedlichen Fettsäure (FA) Zusammensetzungen der Öle, die in den beiden zygotischen Geweben gespeichert sind. Endospermöl ist mit ω-7 einfach ungesättigten FS angereichert, die mehr als 20 Mol-% der gesamten FS ausmachen, während diese molekularen Spezies im Embryo 10-mal weniger häufig vorkommen. Zwei eng verwandte Transkriptionsfaktoren, MYB118 und MYB115, werden zu Beginn der Reifungsphase im Endosperm transkriptionell induziert und teilen sich eine Reihe von Transkriptionszielen. Interessanterweise fehlen dem Endospermöl von myb115 myb118 Doppelmutanten ω-7 FAs. Die Identifizierung von zwei Δ9-Palmitoyl-ACP-Desaturasen, die für die ω-7-FA-Biosynthese verantwortlich sind und durch MYB115 und MYB118 im Endosperm aktiviert werden, ermöglicht es uns, ein Modell für die transkriptionelle Kontrolle der Öl-FA-Zusammensetzung in diesem Gewebe vorzuschlagen. Darüber hinaus zeigt eine erste Charakterisierung der Struktur-Funktions-Beziehung dieser Desaturasen, dass ihre besondere Substratspezifität durch Aminosäurereste, die ihre Substrattasche auskleiden, verliehen wird, die sie von der Archetyp-9-Stearoyl-ACP-Desaturase unterscheiden. PMID: 27681170

Wang, Qian Gosik, Kirk Xing, Sujuan Jiang, Libo Sun, Lidan Chinchilli, Vernon M. Wu, Rongling

Es wird angenommen, dass die epigenetische Reprogrammierung eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von Embryonen spielt. Wie der Methylierungszustand väterlicher und mütterlicher Genome die Embryogenese reguliert, hängt von der Interaktion und Koordination der Gameten zweier Geschlechter ab. Während die epigenetischen Interaktionen von Spermien und Eizellen intensiv erforscht werden, besteht eine Wissenslücke in der mechanistischen Quantifizierung dieser Interaktionen und ihrer Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung. Dieser Review zielt darauf ab, einen Modellierungsrahmen zu formulieren, um diese Lücke durch die Integration und Synthese der evolutionären Spieltheorie und der neuesten Entdeckungen der epigenetischen Kontrolle der Embryonalentwicklung durch Sequenzierung der nächsten Generation zu schließen. Dieser Rahmen, der als epigenetische Spieltheorie oder epiGame bezeichnet wird, betrachtet die Embryogenese als ein ökologisches System, in dem sich zwei sehr unterschiedliche und spezialisierte Gameten entweder durch Kooperation oder Konkurrenz oder beides koordinieren, um die Fitness von Embryonen unter der Darwinschen Selektion zu maximieren. Durch die Implementierung eines Systems gewöhnlicher Differentialgleichungen quantifiziert epiGame das Muster und die relative Größe der Methylierungseffekte auf die Embryogenese durch die Mechanismen der Kooperation und Konkurrenz. epiGame kann neue Einblicke in die Reproduktionsbiologie gewinnen und möglicherweise zur Entwicklung personalisierter Medikamente für die Intervention bei genetischen Störungen verwendet werden.

Die meisten Eizellen eliminieren ihre Zentriolen während der meiotischen Teilung durch unklare Mechanismen. In dieser Ausgabe haben Borrego-Pinto et al. (2016. J Cell. Biol. http://dx.doi.org/10.1083/jcb.201510083) zeigen, dass für eine erfolgreiche Embryoentwicklung die Mutterzentriolen durch Extrusion in die Polkörperchen aus Seestern-Oozyten eliminiert werden müssen. © 2016 Verlhac.

Der Beweis für räumliche Variationen im zytoplasmatischen freien Ca 2+ in spitzenwachsenden Zellen wird kurz zusammengefasst. Es werden Verfahren zum Nachweis solcher Gradienten unter Verwendung von Fura-2 mit Dual-Wellenlängen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Bisherige Ergebnisse zeigen, dass Ca 2+ -Gradienten in wachsenden Rhizoidenzellen vorhanden sind, aber physiologisch signifikante Gradienten wurden in den frühen Stadien der Polarisation noch nicht nachgewiesen.

Das Hausschwein ist ein wichtiges „Dual Purpose“-Tiermodell für landwirtschaftliche und biomedizinische Anwendungen. In der biomedizinischen Gemeinschaft besteht ein sich abzeichnender Konsens, dass, obwohl die Maus ein leistungsstarkes genetisches Modell ist, ein Bedarf an großen Tiermodellen wie Schweinen besteht, die entweder ser.

Wang, Qian Gosik, Kirk Xing, Sujuan Jiang, Libo Sun, Lidan Chinchilli, Vernon M. Wu, Rongling

Es wird angenommen, dass die epigenetische Reprogrammierung eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von Embryonen spielt. Wie der Methylierungszustand väterlicher und mütterlicher Genome die Embryogenese reguliert, hängt von der Interaktion und Koordination der Gameten zweier Geschlechter ab. Während die epigenetischen Interaktionen von Spermien und Eizellen intensiv erforscht werden, besteht eine Wissenslücke in der mechanistischen Quantifizierung dieser Interaktionen und ihrer Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung. Dieser Review zielt darauf ab, einen Modellierungsrahmen zu formulieren, um diese Lücke durch die Integration und Synthese der evolutionären Spieltheorie und der neuesten Entdeckungen der epigenetischen Kontrolle der Embryonalentwicklung durch Sequenzierung der nächsten Generation zu schließen. Dieser Rahmen, der als epigenetische Spieltheorie oder epiGame bezeichnet wird, betrachtet die Embryogenese als ein ökologisches System, in dem sich zwei sehr unterschiedliche und spezialisierte Gameten entweder durch Kooperation oder Konkurrenz oder beides koordinieren, um die Fitness von Embryonen unter der Darwinschen Selektion zu maximieren. Durch die Implementierung eines Systems gewöhnlicher Differentialgleichungen quantifiziert epiGame das Muster und die relative Größe der Methylierungseffekte auf die Embryogenese durch die Mechanismen der Kooperation und Konkurrenz. epiGame kann neue Einblicke in die Reproduktionsbiologie gewinnen und möglicherweise zur Entwicklung personalisierter Medikamente für die Intervention bei genetischen Störungen verwendet werden. Copyright © 2016 Elsevier B.V. Alle Rechte vorbehalten.

Zwei nicht überlappende autosomale Inversionen definiert ungewöhnliche Neo-Geschlechtschromosomen in der Hessischen Fliege (Mayetiola destructor). Wie andere Neo-Geschlechtschromosomen waren diese normalerweise heterozygot, nur in einem Geschlecht vorhanden und unterdrückten die Rekombination um einen geschlechtsbestimmenden Hauptschalter. Ihre ungewöhnliche Eigenschaft.

Maheshwari, Shamoni Tan, Ek Han West, Allan Franklin, F. Chris H. Comai, Luca

Die Anheftungsstelle von Spindelmikrotubuli an Metaphase-Chromosomen wird als Zentromer bezeichnet. Pflanzliche und tierische Zentromere werden epigenetisch durch eine Zentromer-spezifische Variante von Histon H3, CENH3 (alias CENP-A) spezifiziert. Im Gegensatz zu kanonischen Histonen, die invariant sind, akkumulieren CENH3-Proteine ​​Substitutionen mit einer beschleunigten Geschwindigkeit. Diese Diversifizierung von CENH3 ist ein Rätsel, da seine Rolle als Schlüsseldeterminante der Zentromeridentität bei allen Arten konstant bleibt. Hier fragen wir, ob die natürlich vorkommende Divergenz in CENH3 funktionelle Konsequenzen hat. Wir führten funktionelle Komplementationsassays an cenh3-1, einer Nullmutation in Arabidopsis thaliana, durch, wobei wir ungetaggte CENH3s von immer weiter entfernten Verwandten verwendeten. Im Gegensatz zu früheren Ergebnissen mit GFP-markiertem CENH3 stellen wir fest, dass die wesentlichen Funktionen von CENH3 in einer breiten evolutionären Landschaft erhalten bleiben. CENH3 von einer so weit entfernten Spezies wie der einkeimblättrigen Zea mays kann A. thaliana CENH3 funktionell ersetzen. Pflanzen, die CENH3-Varianten exprimieren, die bei Selbstbefruchtung fruchtbar sind, zeigen dramatische Segregationsfehler, wenn sie mit einem Wildtyp-Individuum gekreuzt werden. Die Nachkommen dieser Kreuzung umfassen Hybriddiploide, Aneuploide mit neuartigen genetischen Umlagerungen und Haploide, die nur das Genom des Wildtyp-Elternteils erben. Wichtig ist, dass es immer Chromosomen der Pflanze sind, die das divergente CENH3 exprimieren, die sich nicht trennen. Mit Chimären zeigen wir, dass es die Divergenz im sich schnell entwickelnden N-terminalen Schwanz von CENH3 ist, die Segregationsfehler und Genom-Eliminierung verursacht. Darüber hinaus analysierten wir N-terminale Schwanzsequenzen von Pflanzen-CENH3s und entdeckten ein modulares Muster der Sequenzkonservierung. Daraus leiten wir die Hypothese ab, dass, während die wesentlichen Funktionen von CENH3 weitgehend konserviert sind, sich der N-terminale Schwanz entwickelt, um sich an linienspezifische zentromerische Beschränkungen anzupassen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Abstammungs-spezifische Evolution von CENH3 die Unlebensfähigkeit und Sterilität der Nachkommen in Kreuzungen verursacht und gleichzeitig karyotypische Variation erzeugt. Somit kann die Evolution von CENH3 zu postzygotischen Reproduktionsbarrieren beitragen. PMID:25622028

Špírek, Mário Poláková, Silvia Jatzová, Katarína Sulo, Pavol

Nukleo-mitochondriale Wechselwirkungen, insbesondere diejenigen, die die primäre Divergenz biologischer Spezies bestimmen, können mit Hilfe von xenomitochondrialen Cybriden untersucht werden, bei denen es sich um Zellen handelt, bei denen die ursprünglichen Mitochondrien durch ihre Gegenstücke aus verwandten Spezies ersetzt werden. Saccharomyces cerevisiae-Zybriden werden einfach durch die Paarung des ρ0-Stammes mit beeinträchtigter Karyogamie und keimenden Sporen anderer Saccharomyces-Arten hergestellt und fallen in drei Kategorien. Cybrids mit kompatibler mitochondrialer DNA (mtDNA) aus Saccharomyces paradoxus CBS 432 und Saccharomyces cariocanus CBS 7994 sind metabolisch und genetisch ähnlich Cybriden, die mtDNA aus verschiedenen S. cerevisiae enthalten. Cybriden mit mtDNA von anderen S. paradoxus-Stämmen, S. cariocanus, Saccharomyces kudriavzevii und Saccharomyces mikatae benötigen eine Anpassungsphase, um eine effiziente oxidative Phosphorylierung zu etablieren. Sie zeigen einen temperaturempfindlichen Phänotyp, eine langsamere Wachstumsrate auf einer nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle und eine lange Verzögerungsphase nach der Umstellung von Glucose. Ihre verminderte Atmungskapazität und ihr reduzierter Cytochrom-aa3-Gehalt sind mit dem ineffizienten Spleißen von cox1I3β verbunden, dem Intron, das in allen Saccharomyces-Spezies, jedoch nicht in S. cerevisiae, gefunden wird. Der Spleißdefekt wird in Cybriden durch nuklearen Funktionsgewinn kompensiert und kann alternativ durch Überexpression des MRP13-Gens für das mitochondriale ribosomale Protein oder der MRS2-, MRS3- und MRS4-Gene, die am Intron-Spleißen beteiligt sind, unterdrückt werden. S. cerevisiae mit Saccharomyces bayanus mtDNA ist nicht in der Lage zu atmen und das Wachstum auf Ethanol-Glycerin kann nur nach Paarung mit einigen Mit−Stämmen wiederhergestellt werden. Die nukleo-mitochondriale Kompatibilitätsgrenze von S. cerevisiae und anderen Saccharomyces wurde zwischen S. kudriavzevii und S. bayanus im Abstand von S. cerevisiae um etwa 15 MYA festgelegt. Die MRS1-cox1 S. cerevisiae/S. paradoxus zytonukleäres Dobzhansky-Muller-Paar hat einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Artentrennung, da seine Unvollkommenheit durch eine Funktionsverstärkungsmutation ausgeglichen wird. PMID:25628643

Beschreibt eine wissenschaftliche Aktivität zur Bedeutung der Meiose für die Variabilität. Demonstriert anhand eines Münzwurfs die zufällige Anordnung von genetischem Material und erklärt, wie daraus Zygoten mit einer neuen DNA-Kombination entstehen. (YDS)

Alcaín, Francisco J Villalba, José M

Sirtuin 1-7 (SIRT1-7) sind Deacetylasen, deren Aktivität von NAD(+) abhängig ist. SIRT1 reguliert die p53-Aktivität herunter, erhöht die Lebensdauer, das Zellüberleben und die Neuroprotektion, es deacetyliert auch den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-Gamma und seinen Coaktivator 1alpha, fördert die Fettmobilisierung, erhöht die Größe und Anzahl der Mitochondrien und reguliert die Insulinsekretion positiv. Sirtuine verbinden die Nährstoffverfügbarkeit und den Energiestoffwechsel. Kalorienrestriktion, die die Lebensdauer verlängert und bei altersbedingten Störungen von Vorteil ist, aktiviert Sirtuin. Große Anstrengungen werden daher auf die Entwicklung von Sirtuin-Aktivatoren gerichtet. Nachdem die mögliche Beteiligung von Sirtuinen an pathophysiologischen Prozessen diskutiert wurde, befasst sich dieser Aufsatz mit neuen, synthetischen Sirtuin-Aktivatoren. Bis heute ist Resveratrol die stärkste natürliche Verbindung, die SIRT1 aktivieren kann und die positive Wirkung der Kalorienbeschränkung nachahmt. Resveratrol könnte bei der Behandlung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit helfen und den altersbedingten Rückgang der Herzfunktion und den Verlust von Nervenzellen verhindern. Da Resveratrol eine geringe Bioverfügbarkeit aufweist und mit mehreren molekularen Zielmolekülen interagiert, ist die Entwicklung neuer Moleküle mit besserer Bioverfügbarkeit und die gezielte Behandlung von Sirtuin in niedrigeren Konzentrationen ein vielversprechendes Gebiet der medizinischen Chemie. Kürzlich wurden neue SIRT1-Aktivatoren identifiziert, die bis zu 1000-mal wirksamer sind als Resveratrol. Diese verbessern die Reaktion auf Insulin und erhöhen die Anzahl und Aktivität der Mitochondrien bei übergewichtigen Mäusen. Studien am Menschen mit einer Resveratrol-Formulierung mit verbesserter Bioverfügbarkeit und mit einem synthetischen SIRT1-Aktivator laufen.

McAdon, Mark H. Nickias, Peter N. Marks, Tobin J. Schwartz, David J.

Katalysatoraktivator, der insbesondere zur Verwendung bei der Aktivierung von Metallkomplexen von Metallen der Gruppe 3-10 zur Polymerisation von ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, insbesondere Olefinen, geeignet ist, umfassend zwei Metall- oder Metalloidatome der Gruppe 13 und eine Ligandenstruktur, die mindestens eine Brückengruppe verbindet Liganden an den beiden Gruppe-13-Metall- oder Metalloidatomen.

Minneapolis Unabhängiger Schulbezirk 275, Minn.

Es werden 24 Aktivitäten vorgestellt, die für Grundschulkinder geeignet sind. Zu den Aktivitäten, die Kinder auf ihre Umgebung aufmerksam machen sollen, gehören Bodenbemalung, Gratsammeln, Insekten- und Teichwassersammeln, Studien an Insektengallen und Feldmäusen, Nachfolgestudien und ein Modell der natürlichen Auslese mit gefärbten Zahnstochern. EIN…

Dieses Dokument besteht aus Aktivitäten und Referenzen für den Astronomieunterricht.Die Aktivitäten (die Ziele, eine Liste der benötigten Materialien und Verfahren umfassen) konzentrieren sich auf: Beobachtung des Großen Wagens und Lokalisierung des Nordsterns Untersuchung der Sterne des Großen Wagens Herstellung und Verwendung eines Astrolabiums Untersuchung der retograden Bewegung des Mars Messung der Sonnen…

. wird zur Behandlung von Vergiftungen, zur Reduzierung von Blähungen (Blähungen), zur Senkung des Cholesterinspiegels, zur Vorbeugung von Kater und zur Behandlung von Galle verwendet. den Cholesterinspiegel im Blut senken. Abnehmendes Gas (Blähungen). Einige Studien zeigen, dass Aktivkohle wirksam ist.

. Nutzen für die Gesundheit 1 von 8 Abschnitten Die Grundlagen: Nutzen für die Gesundheit Was sind die Vorteile von körperlicher Aktivität? Physisch. eine Beeinträchtigung . Nächster Abschnitt Erste Schritte Vorheriger Abschnitt Nutzen für die Gesundheit 3 ​​von 8 Abschnitten Handeln Sie! Handeln Sie: .

Tan, Xiu-Wen Ji, Chang-Li Zheng, Liang-Liang Zhang, Jie Yuan, Hong-Jie Gong, Shuai Zhu, Jiang Tan, Jing-He

Durch welche Mechanismen beeinträchtigen Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) und Corticosteron die Entwicklung von Präimplantationsembryonen im Eileiter? CRH und Corticosteron wirken sich nicht direkt auf Präimplantationsembryonen aus, sondern beeinträchtigen deren Entwicklung indirekt, indem sie durch Aktivierung des Fas-Systems die Apoptose oviduktaler Epithelzellen (OECs) auslösen. Studien berichten, dass Stress die Embryonalentwicklung mit erleichterter Sekretion von CRH und Glukokortikoiden beeinträchtigt. Obwohl eine In-vivo-Studie gezeigt hat, dass Präimplantationsstress die Embryonenentwicklung in Verbindung mit der oviduktalen Apoptose und der Aktivierung des Fas-Systems beeinträchtigt, muss noch geklärt werden, ob CRH oder Glukokortikoide Embryonen direkt oder indirekt über Eileiterzellen schädigen. Es wurden Mäuse des Kunming-Stammes, Mäuse mit generalisierter lymphoproliferativer Störung (gld) mit einer Keimbahnmutation F273L im Fas-Liganden in einem genomischen C57BL/6J-Hintergrund und die Wildtyp-C57BL/6J-Mäuse verwendet. Weibliche Mäuse wurden 8-10 Wochen nach der Geburt verwendet. Während einige weibliche Mäuse 48 Stunden nach der Injektion von Pferde-CG getötet wurden, um Eileiter zu sammeln und OECs herzustellen, wurden andere getötet, um Zygoten nach der Paarung mit Männchen nach Superovulation mit eCG und hCG zu gewinnen. Die erhaltenen Zygoten wurden mit oder ohne CRH oder Corticosteron (CRH/Cort) kultiviert, entweder in Chatot-Ziomek-Bavister (CZB)-Medium mit oder ohne OECs oder in konditioniertem Medium (CM), das mit OECs vorbehandelt oder nicht mit CRH/Cort konditioniert wurde. Bei Embryonen, die zu verschiedenen Zeitpunkten der In-vitro-Kultur gewonnen wurden, wurden die Entwicklung vor der Implantation, das Niveau des Redoxpotentials und der Apoptose sowie die Expression von CRH-Rezeptor 1 (CRHR1), Glucocorticoid-Rezeptor (GR), Fas und 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (HSD) beobachtet. Nach Kultur von OECs mit oder ohne CRH/Cort wurden Redoxpotential und Apoptose, mRNA- und Proteinexpression von Wachstumsfaktoren und Proteinexpression von CRHR1, GR und Fas in OECs untersucht und der FasL-Spiegel in CM gemessen. Die gld Mäuse wurden verwendet

Mornet, René Theiler, Jane B. Leonard, Nelson J. Schmitz, Ruth Y. Moore, F. Hardy Skoog, Folke

Vier Serien von Azidopurinen wurden synthetisiert und im Tabakkallus-Bioassay auf Cytokininaktivität getestet: 2- und 8-Azido-N6-benzyladenine, -N6-(Δ2-Isopentenyl)adenine und -zeatine sowie N6-(2- und 4-Azidobenzyl)adenine. Die Verbindungen mit 2-Azido-Substitution am Adeninring sind so aktiv wie die entsprechenden Stammverbindungen, während diejenigen mit 8-Azido-Substitution etwa 10 oder mehr aktiv sind. Das 8-Azidozeatin, das das aktivste beobachtete Cytokinin ist, zeigte bei 1,2 × 10–5 Mikromolar, der niedrigsten getesteten Konzentration, eine höhere als die minimale nachweisbare Aktivität. Die Form der Wachstumskurve zeigt, dass wahrscheinlich sogar eine Konzentration von nur 5 × 10–6 Mikromolar wirksam wäre. Im Vergleich dazu betrug die niedrigste jemals für Zeatin berichtete aktive Konzentration 5 × 10–5 Mikromolar, was eine selten erreichte Sensitivität darstellt. Alle Azidoverbindungen wurden einer Photolyse in wässrigem Ethanol unterzogen, und die Photoprodukte wurden durch Massenspektrometrie mit niedriger und hoher Auflösung nachgewiesen und identifiziert. Sie werden als Produkte von Abstraktions- und Insertionsreaktionen der intermediären Nitrene erklärt. Das Potenzial der hauptsächlich freigesetzten Produkte als Cytokinine wurde auch durch Bioassays bewertet. 2-Azido-N6-(Δ2-isopentenyl)adenin konkurrierte mit [14C]Kinetin um das aus Weizenkeimen isolierte Cytokinin-bindende Protein. Wenn die Azidoverbindung in Gegenwart dieses Proteins photolysiert wurde, blockierte seine Anlagerung effektiv die Bindung von [14C]Kinetin. PMID:16661017

Die Forschung zum Einsatz aktiver Mikrowellen in der Fernerkundung, die während der Plenar- und Postersitzungen vorgestellt wurde, wird zusammengefasst. Die wichtigsten Highlights sind: Kalibrierungstechniken sind gut verstanden innovative Modellierungsansätze wurden entwickelt, die aktive Mikrowellenanwendungen verbessern (Segmentierung vor der Modellinversion, Verwendung des ERS-1-Scatterometers, Simulationen) Polarisationswinkel- und Frequenzdiversität verbessert die Charakterisierung von Eisschilden, Vegetation, und Bestimmung der Bodenfeuchte (X-Band-Sensorstudie) SAR (Synthetic Aperture Radar) Interferometrie-Potenzial entsteht.

Präsentiert die Literaturübersicht von 1978 zur Abwasserbehandlung. Diese Überprüfung umfasst: (1) Belebtschlammverfahren (2) Prozesskontrolle (3) Sauerstoffaufnahme und -übertragung (4) Phosphorentfernung (5) Nitrifikation (6) Industrieabwasser und (7) aerobe Faulung. Eine Liste von 136 Referenzen wird ebenfalls präsentiert. (HM)

Blattaktivitäten können eine Möglichkeit bieten, grundlegende Konzepte der Outdoor-Bildung zum Lernen in elementaren Themenbereichen zu verwenden. Zur Ausrüstung gehören Blätter, ein Klemmbrett mit Papier und ein Bleistift. Ein Beutel mit Blättern kann in den Klassenraum mitgenommen werden, wenn die Wetterbedingungen oder die Zeit es nicht zulassen, ins Freie zu gehen. Jeder Schüler sollte ein Blatt pflücken, untersuchen…

Nickel, Kai Pardàs, Montse Stiefelhagen, Rainer Canton, Cristian Landabaso, José Luis Casas, Josep R.

Wenn eine Person einen Raum betritt, entwickelt sie oder sie sofort ein mentales Konzept darüber, „was in dem Raum vor sich geht“, zum Beispiel können Personen im Raum arbeiten, Personen in ein Gespräch verwickelt sein oder der Raum kann leer sein . Die CHIL-Dienste sind auf dieselbe Art semantischer Beschreibung angewiesen, die im Folgenden als Aktivität bezeichnet wird. So könnte beispielsweise der „Connector“ oder der „Memory Jog“ eine dem jeweiligen Kontext angemessene Unterstützung bieten, wenn er über die aktuelle Aktivität vor Ort Bescheid weiß. Ein solches übergeordnetes Verständnis menschlicher Interaktionsprozesse könnte dann beispielsweise genutzt werden, um die aktuelle Verfügbarkeit des Nutzers in einer bestimmten Situation zu bewerten.

Ein Bericht wie dieser kann nur einen Hinweis auf die Probleme geben, die mit der Verwendung autonomer Aktivität als Mittel zur Bereitstellung eines "Fensters zum Gehirn" verbunden sind. Es ergeben sich mehrere Punkte. Einer der wichtigsten ist der sorgfältige und angemessene Einsatz der verfügbaren Techniken. Ein bekanntes Lehrbuch der experimentellen Psychologie, das vor einiger Zeit veröffentlicht wurde, befürwortete die Verwendung von zwei Groschen, die auf die Handfläche aufgetragen werden, um die elektrodermale Aktivität zu messen. Es war diese Art von Empfehlung, die dazu führte, dass der Einsatz psychophysiologischer Messungen in Verruf geriet. Wie im zweiten Abschnitt erwähnt, ist es wichtig, die beteiligten peripheren Mechanismen vollständig zu verstehen, bevor eine Messung der elektrodermalen Aktivität sinnvoll durchgeführt werden kann. Die richtige Verwendung von Silber/Silberchlorid-Elektroden und physiologisch angemessene Salzgehalte im Elektrolytmedium können zu genauen und wiederholbaren Messungen führen, wenn Artefakte nicht unachtsam eingebracht werden. Ebenso wichtig ist der Kontext, in dem die Studien durchgeführt werden. Es ist wichtig, die psychologische Invasivität der Technik zu erkennen, und hier schneidet die Messung der autonomen Aktivität wahrscheinlich gegenüber anderen verfügbaren Methoden ab, da nur eine sehr geringe Einschränkung des Probanden erforderlich ist und die Anzahl der anzuwendenden Schallköpfe minimal ist. Wichtig ist die Messung der autonomen Aktivität im gesamten experimentellen Kontext. Als Beispiel untersuchten Dawson und Schell den SCR auf Wörter, die zuvor mit Schock in Verbindung gebracht wurden. Wenn diese Wörter dem Ohr präsentiert wurden, auf das die Aufmerksamkeit in einem dichotischen Hörparadigma nicht gerichtet war, konnte ein SCR ausgelöst werden, obwohl das Subjekt die Präsentation des Stimulus nicht bemerkte. Die Bedeutung der Dawson- und Schell-Studie war die Sorgfalt, mit der sie sicherstellten, dass die Versuchsperson den kritischen Reiz wirklich nicht wahrnahm und die Aufmerksamkeit nicht vorübergehend vom überwachten Ohr abwandte. Mehr

Analgetika sind Mittel, die selektiv Schmerzen lindern, indem sie im ZNS und peripheren Schmerzmediatoren wirken, ohne das Bewusstsein zu verändern. Analgetika können narkotisch oder nicht narkotisch sein. Die Untersuchung des Schmerzes bei Tieren wirft ethische, philosophische und technische Probleme auf. Sowohl periphere als auch zentrale Schmerzmodelle sind enthalten, um den Test für die analgetische Eigenschaft der Pflanze deutlicher zu machen. In diesem Kapitel werden Methoden wie Hot-Plate- und Formalin- und Essigsäure-induzierte Schmerzmodelle vorgestellt, um die analgetische Wirkung von Heilpflanzen zu überprüfen.

Diese Studie ist Teil einer Reihe von Studien in Geophysik, die vom Studienausschuss Geophysik für das Forschungsforum Geophysik durchgeführt wurden. Ein Zweck jeder Studie besteht darin, Einschätzungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft bereitzustellen, um politischen Entscheidungsträgern bei Entscheidungen zu gesellschaftlichen Problemen, die die Geophysik betreffen, zu helfen. Ein wichtiger Bestandteil solcher Bewertungen ist die Bewertung der Angemessenheit des aktuellen geophysikalischen Wissens und der Eignung aktueller Forschungsprogramme als Informationsquelle für diese Entscheidungen. Die Studie befasst sich mit unserem aktuellen wissenschaftlichen Verständnis der aktiven Tektonik --- insbesondere den Mustern und Geschwindigkeiten laufender tektonischer » Prozesse. Viele dieser Prozesse können mit den begrenzten instrumentellen oder historischen Aufzeichnungen nicht vernünftig beschrieben werden, die meisten können jedoch für praktische Zwecke mit den geologischen Aufzeichnungen der letzten 500.000 Jahre angemessen beschrieben werden. Um laufende, aktive tektonische Prozesse besser zu verstehen, wird ein Programm zur Grundlagenforschung empfohlen, das sich insbesondere auf die quartäre tektonische Geologie und Geomorphologie, die Paläoseismologie, die Neotektonik und die Geodäsie konzentriert. Dieser Band enthält 16 Beiträge. Einzelne Beiträge werden in der Energiedatenbank separat erschlossen.« weniger

Wani, Nisar A Hong, Seungbum

Es wurden Experimente durchgeführt, um die Entwicklung von in vitro gereiften Kamel-Oozyten nach ihrer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) mit Nebenhodenspermien zu untersuchen, die von geschlachteten männlichen Kamelen gesammelt wurden. Eierstöcke und Hoden wurden von einem örtlichen Schlachthof in normaler Kochsalzlösung (NSS) bei 37 °C bzw. auf Eis (0-1 °C) gesammelt. Aus den Follikeln abgesaugte Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) wurden zufällig auf 4-Well-Kulturplatten (20-25 COCs/Well) verteilt, die 500 μl Reifungsmedium enthielten, und bei 38,5 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO 2 in Luft kultiviert für etwa 30 Std. Spermatozoen wurden aus den Cauda epididymites in Spritzen gesammelt, die 2-3 ml Tris-tes-Eidotter-Extender enthielten. Sie wurden langsam abgekühlt und bei Kühltemperatur (4 °C) gelagert. Am Tag der Anwendung wurden die Spermatozoen vor der Verwendung in ICSI durch die Swim-up-Technik präpariert. Die injizierten Oozyten wurden entweder durch Ionomycin und Roscovitin aktiviert oder ohne chemische Aktivierung in die Kultur gegeben. In Experiment 1 wurden mutmaßliche Zygoten fixiert und mit Hoechst 33342 zur Bewertung der Befruchtung nach 18 h Kultur gefärbt, während sie in Experiment 2 in 500 μL des Kulturmediums bei 38,5 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO . kultiviert wurden 2, 5 % O 2 und 90 % N 2 in Luft für 7 Tage, um ihre Entwicklung zu bewerten. Der Anteil der aktivierten Oozyten, wenn ICSI gefolgt von chemischer Aktivierung, war signifikant höher (P-aktivierte. In Experiment 2 spaltete sich eine höhere Anzahl von Oozyten (59 vs. 35%) und entwickelten sich zu Blastozysten (20 vs. 7%) in der Gruppe mit Post-ICSI-Aktivierung im Vergleich zu der Gruppe ohne chemische Aktivierung.Zusammenfassend ist dies nach unserem besten Wissen der erste Bericht, in dem Embryonen durch ICSI in Kamelen produziert wurden Chemische Aktivierung von Oozyten durch Ionomycin und Roscovitin, post-ICSI, ihre Spaltung und Entwicklung bis zum Blastozystenstadium verbessert Copyright © 2018

Mishra, Ajay Aloimonos, Yiannis

Das menschliche visuelle System beobachtet und versteht eine Szene/ein Bild, indem es eine Reihe von Fixierungen vornimmt. Jeder Fixationspunkt liegt innerhalb einer bestimmten Region beliebiger Form und Größe in der Szene, die entweder ein Objekt oder nur ein Teil davon sein kann. Als grundlegendes Segmentierungsproblem definieren wir die Aufgabe, die Region zu segmentieren, die den Fixationspunkt enthält. Das Segmentieren des Bereichs, der die Fixierung enthält, ist äquivalent zum Auffinden der einschließenden Kontur – ein verbundener Satz von Grenzkantenfragmenten in der Kantenkarte der Szene – um die Fixierung herum. Diese umschließende Kontur sollte eine Tiefengrenze sein. Wir stellen hier einen neuartigen Algorithmus vor, der diese umschließende Kontur findet und die Segmentierung eines Objekts bei gegebener Fixierung erreicht. Der vorgeschlagene Segmentierungsrahmen kombiniert monokulare Hinweise (Farbe/Intensität/Textur) mit Stereo und/oder Bewegung auf eine hinweisunabhängige Weise. Die semantischen Roboter der nahen Zukunft werden diesen Algorithmus verwenden können, um Objekte in jeder Umgebung automatisch zu finden. Die Fähigkeit, Objekte in ihrem Sichtfeld automatisch zu segmentieren, kann die visuelle Verarbeitung auf die nächste Stufe heben. Unser Ansatz unterscheidet sich von aktuellen Ansätzen. Während bestehende Arbeiten versuchen, die gesamte Szene auf einmal in viele Bereiche zu segmentieren, segmentieren wir nur einen Bildbereich, nämlich den, der den Fixationspunkt enthält. Experimente mit realen Bildern, die von unserem aktiven Roboter und aus den bekannten Datenbanken 1 gesammelt wurden, zeigen, dass der Ansatz vielversprechend ist.

Hojaev, Alischer S. Ibragimova, Elvira M.

Es ist bekannt, dass die Astronomie in Usbekistan alte Wurzeln und Traditionen hat (z. B. Mirzo Ulugh Beg, Abū al-Rayhān al-Bīrūnī, Abū ‘Abdallāh al-Khwārizmī) und das astronomische Erbe sorgfältig bewahrt. Heute spielen usbekische Astronomen eine Schlüsselrolle in der wissenschaftlichen Forschung, aber auch in der OAD- und Dekadenplan-Aktivität in der Region Zentralasien. Die International Aerospace School (IASS) ist eine erstaunliche und wundervolle Veranstaltung, die jährlich etwa 30 Jahre lang stattfindet. IASS ist ein einzigartiges Projekt in der Region, und am Anfang haben wir die Summer und Winter Schools verbracht. Zur Zeit versammeln wir im Sommercamp etwa 50 Studenten im Teenager- und Grundstudium im In- und Ausland (Frankreich, Malaysia, Türkei, Aserbaidschan, Pakistan, Russland usw.). Sie werden auf der Grundlage von Tests zu Astronomie- und Weltraumfragen ausgewählt. Während des zweiwöchigen IASS-Camps halten die eingeladenen Wissenschaftler, Kosmonauten und Astronauten sowie weitere Spezialisten Vorlesungen und praktische Übungen mit IASS-Studenten in der Astronomie, darunter tägliche Sonnen- und Nachthimmelbeobachtungen mit Meniskusteleskop, Weltraumforschung und -erkundung, Luft- und Raumfahrtmodellierung, Vorbereitung und Präsentation von Originalprojekten. Dies ist wichtig, damit das IASS nicht nur theoretische Grundlagen vermittelt, sondern die Studierenden auch praktisch ausbildet und die praktische Ausbildung ist das Hauptziel des IASS. Vorlesungen und Praxis auf dem Gebiet der Astronomie, durchgeführt mit direkter Beteiligung und großzügiger Unterstützung der Uranoscope Association (Paris, Frankreich). Das aktuelle 26. IASS soll im Juli 2015 stattfinden.

Hinrichs, Arne Kessler, Barbara Kurome, Mayuko Blutke, Andreas Kemter, Elisabeth Bernau, Maren Scholz, Armin M. Rathkolb, Birgit Renner, Simone Bultmann, Sebastian Leonhardt, Heinrich de Angelis, Martin Hrabĕ Nagashima, Hiroshi Hoeflich, Andreas Blum, Werner F. Bidlingmaier , Martin Wanke, Rüdiger Dahlhoff, Maik Wolf, Eckhard

Das Laron-Syndrom (LS) ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung beim Menschen, die durch funktionslose Mutationen des Wachstumshormonrezeptors (GHR)-Gens verursacht wird. Um ein Großtiermodell für LS zu etablieren, wurden Schweine mit GHR-Knockout (KO)-Mutationen erzeugt und charakterisiert. Die CRISPR/Cas9-Technologie wurde angewendet, um das Exon 3 des GHR-Gens in Schweinezygoten zu mutieren. Zwei heterozygote Gründersauen mit einer 1-bp- oder 7-bp-Insertion in GHR-Exon 3 wurden erhalten, und ihre heterozygoten F1-Nachkommen wurden gekreuzt, um GHR-KO, heterozygote GHR-Mutante und Wildtyp-Schweine zu produzieren. Da sich die letzteren beiden Gruppen in keinem der untersuchten Parameter signifikant unterschieden, wurden sie als die GHR-exprimierende Kontrollgruppe zusammengefasst. Das Charakterisierungsprogramm umfasste Körper- und Organwachstum, Körperzusammensetzung, endokrine und klinisch-chemische Parameter sowie Signalstudien im Lebergewebe. GHR-KO-Schweinen fehlte GHR und sie hatten deutlich reduzierte Serumspiegel des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF1) und eine reduzierte Aktivität des IGF-bindenden Proteins 3 (IGFBP3), aber erhöhte IGFBP2-Spiegel. Die Serum-GH-Konzentrationen waren im Vergleich zu Kontrollschweinen signifikant erhöht. GHR-KO-Schweine hatten ein normales Geburtsgewicht. Die Wachstumsverzögerung wurde im Alter von fünf Wochen signifikant. Im Alter von sechs Monaten war das Körpergewicht der GHR-KO-Schweine um 60 % gegenüber den Kontrollen reduziert. Die meisten Organgewichte von GHR-KO-Schweinen waren proportional zum Körpergewicht reduziert. Allerdings waren die Gewichte von Leber, Niere und Herz überproportional reduziert, während sich das relative Gehirngewicht fast verdoppelte. GHR-KO-Schweine hatten einen deutlich erhöhten Anteil des Gesamtkörperfetts im Verhältnis zum Körpergewicht und zeigten eine vorübergehende juvenile Hypoglykämie zusammen mit verringerten Serumtriglycerid- und Cholesterinspiegeln. Die Analyse der Insulinrezeptor-bezogenen Signalgebung in der Leber von erwachsenen nüchternen Schweinen zeigte eine erhöhte Phosphorylierung von IRS1 und PI3K. In Übereinstimmung mit dem Verlust von GHR wurde die Phosphorylierung von STAT5 signifikant reduziert. Im Gegensatz dazu ist die Phosphorylierung

Teaming ist in der heutigen Projektmanagementumgebung so üblich, dass die meisten von uns davon ausgehen, dass es selbstverständlich ist. Wir gehen weiterhin davon aus, dass Projektteams bei sinnvoller und herausfordernder Arbeit natürlich produktiv tätig werden, um ihre Aufgaben zu erledigen. Diese Annahme drückt sich in der einfachen (aber falschen) Gleichung aus: Team + Arbeit = Teamwork. Obwohl diese Gleichung einfach und geradlinig erscheint, ist sie für die meisten Projektorganisationen, deren Realität ein komplexes Netz institutioneller Normen ist, die auf individuellen Leistungen und Belohnungen basieren, alles andere als zutreffend. Dies zeigt die allererste erfolgreiche Teamerfahrung aus meiner frühen Air Force-Karriere. Als junger Leutnant wurde ich auf die Squadron Officer School geschickt, die der erste in einer Reihe von professionellen militärischen Ausbildungskursen der Air Force war, die ich während meiner Karriere absolvieren musste. Wir wurden sofort in Teams von zwölf Offizieren gebildet. Ein Großteil des Kurses war von Wettbewerben zwischen diesen Teams geprägt. Als jüngstes Mitglied meines Teams habe ich schnell den enormen Druck bemerkt, individuelle Führungsqualitäten zu zeigen. An einem Punkt zu Beginn des Kurses wetteiferten fast alle in unserer Gruppe darum, der Teamleiter zu werden. Dieser Konflikt war so intensiv, dass wir bei unserer ersten Outdoor-Teambuilding-Übung kläglich scheiterten. Wir haben so viel Zeit damit verbracht, um die Führung zu kämpfen, dass wir keines der Events auf dem Outdoor-Hindernisparcours abschließen konnten.Dieser völlige Mangel an Erfolg hat mich so entmutigt, dass ich unserem Team wenig Hoffnung auf zukünftige Erfolge gemacht habe. Was folgte, war eine sehr intensive Zeit des Gezänks, der Konflikte und sogar des Geschreis, während unser dysfunktionales Team versuchte, mit unseren frühen Misserfolgen fertig zu werden und einen Weg zum Erfolg zu finden. Der britische Arzt und Forscher Wilfred Bion (Experiences in Groups, 1961) entdeckte, dass allen Gruppen starke psychologische Kräfte innewohnen, die von der Erfüllung ihrer Hauptaufgaben ablenken. Diese hemmenden Kräfte überwinden und das Potenzial nutzen

Ma, Jun Flemr, Matyas Strnad, Hynek Svoboda, Petr Schultz, Richard M.

ZUSAMMENFASSUNG Der Übergang von der Eizelle zur Zygote beinhaltet die Umwandlung einer hochdifferenzierten Eizelle in totipotente Blastomeren und stellt eines der frühesten Hindernisse dar, die für eine weitere Entwicklung erfolgreich überwunden werden müssen. Der Abbau maternaler mRNAs, der wahrscheinlich das Herzstück dieses Übergangs darstellt, ist durch einen Übergang von der mRNA-Stabilität zu Instabilität während der Eizellreifung gekennzeichnet. Obwohl die Phosphorylierung des eizellenspezifischen RNA-bindenden Proteins MSY2 während der Reifung daran beteiligt ist, mütterliche mRNAs anfälliger für den Abbau zu machen, sind die Mechanismen, die dem mRNA-Abbau während der Eizellreifung zugrunde liegen, noch wenig verstanden. Wir berichten, dass DCP1A und DCP2, Proteine, die für die Entkappung der mRNA verantwortlich sind, von maternalen mRNAs kodiert werden, die während der Reifung über zytoplasmatische Polyadenylierungselemente in ihren 3′-untranslatierten Regionen für die Translation rekrutiert werden. Sowohl DCP1A als auch DCP2 werden während der Reifung phosphoryliert, wobei CDC2A die wahrscheinlich für beide verantwortliche Kinase ist, obwohl MAPK an der DCP1A-Phosphorylierung beteiligt sein könnte. Die Hemmung der Akkumulation von DCP1A und DCP2 durch RNA-Interferenz oder Morpholinos verringert nicht nur den Abbau von mRNAs während der meiotischen Reifung, sondern auch die Transkription des zygotischen Genoms. Die Ergebnisse zeigen, dass mütterlich rekrutierte DCP1A und DCP2 kritische Akteure beim Übergang von der mRNA-Stabilität zu Instabilität während der meiotischen Reifung sind und dass ein ordnungsgemäßer mütterlicher mRNA-Abbau erfolgreich sein muss, um den Übergang von der Eizelle zur Zygote durchzuführen. PMID:23136299

Betekhtin, Alexander Milewska-Hendel, Anna Lusinska, Joanna Chajec, Lukasz Kurczynska, Ewa Hasterok, Robert

Die pflanzliche Zellwand weist eine große Vielfalt hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung auf, die auch in verschiedenen Entwicklungsstadien stark variieren kann. In dieser Studie haben wir die Verteilung mehrerer Zellwandepitope in Embryonen von Brachypodium distachyon (Brachypodium) analysiert. Wir haben auch die Variationen der Kernform und die Anzahl der Nukleolen beschrieben, die in einigen Embryozellen auftraten. Durch den Einsatz von Transmissionselektronenmikroskopie sowie histologischen und Immunlokalisationstechniken konnte die Verteilung ausgewählter Arabinogalactanproteine, Extensine, Pektine und Hemicellulosen auf der Embryooberfläche, inneren Zellkompartimenten und im Kontext der Zellwandultrastruktur gezeigt werden. Wir zeigten, dass die Mehrheit der Arabinogalactan-Proteine ​​und Extensine auf der Zelloberfläche verteilt waren und dass Pektine der Hauptbestandteil der Samenhülle und anderer Teile, wie der Mesokotyl-Zellwände und der Radicula, waren. Hemicellulosen waren in der Zellwand bzw. außerhalb der Radicula-Protodermis lokalisiert. Die spezifische Anordnung dieser Komponenten kann auf ihre Bedeutung während der Embryonalentwicklung und der Samenkeimung hinweisen und damit auf die Bedeutung ihrer Schutzfunktionen hinweisen. Trotz der Unterschiede in der Zellwandzusammensetzung haben wir festgestellt, dass einige der Antikörper als Marker verwendet werden können, um spezifische Zellen und die Teile des sich entwickelnden Brachypodium-Embryos zu identifizieren.

Wang, Xiaolong Yu, Honghao Lei, Anmin Zhou, Jiankui Zeng, Wenxian Zhu, Haijing Dong, Zhiming Niu, Yiyuan Shi, Bingbo Cai, Bei Liu, Jinwang Huang, Shuai Yan, Hailong Zhao, Xiaoe Zhou, Guangxian He, Xiaoling Chen, Xiaoxu Yang, Yuxin Jiang, Yu Shi, Lei Tian, ​​Xiue Wang, Yongjun Ma, Baohua Huang, Xingxu Qu, Lei Chen, Yulin

Jüngste Fortschritte bei der Untersuchung des CRISPR/Cas9-Systems haben einen präzisen und vielseitigen Ansatz für die Genom-Editierung bei verschiedenen Arten bereitgestellt. Die Anwendbarkeit und Effizienz dieser Methode in großen Tiermodellen, wie der Ziege, wurden jedoch nicht umfassend untersucht. Hier haben wir durch Co-Injektion von einzelligen Embryonen mit Cas9-mRNA und sgRNAs, die auf zwei funktionelle Gene (MSTN und FGF5) abzielen, erfolgreich genmodifizierte Ziegen hergestellt, bei denen entweder eines oder beide Gene zerstört waren. Die Targeting-Effizienz von MSTN und FGF5 in kultivierten primären Fibroblasten betrug 60 %, während die Effizienz der Zerstörung von MSTN und FGF5 bei 98 getesteten Tieren 15 % bzw. 21 % und 10 % für doppelte Genmodifikationen betrug. Die On- und Off-Target-Mutationen der Zielgene in Fibroblasten sowie in Körpergewebe und Hoden von Gründer- und toten Tieren wurden sorgfältig analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Großtieren die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Standorte erreicht wurde, was zeigt, dass das CRISPR/Cas9-System das Potenzial hat, ein robustes und effizientes Gentechnik-Tool bei Nutztieren zu werden und daher für die Zucht von entscheidender Bedeutung und anwendbar sein wird. PMID:26354037

Das spezielle Reproduktionsprogramm von Orchideen bietet ein einzigartiges Evolutionsmodell mit bestäubungsgesteuerter Eientwicklung und Megasporogenese, einem modifizierten Embryogeneseprogramm, das zu Samen mit unreifen Embryonen führt, und Mykorrhiza-induzierter Samenkeimung. Die molekularen Mechanismen, die sich entwickelt haben, um diese beispiellosen Entwicklungsprogramme zu etablieren, sind jedoch weitgehend unklar. Hier führten wir vergleichende Studien zur genomweiten Genexpression verschiedener reproduktiver Gewebe durch und erfassten die molekularen Ereignisse, die mit unterschiedlichen Reproduktionsprogrammen in Phalaenopsis Aphrodite verbunden sind. Wichtig ist, dass unsere Daten Beweise dafür liefern, dass die Regeneration des Protokorm-ähnlichen Körpers (PLB) (die klonale Regenerationspraxis, die in der Orchideenindustrie verwendet wird) nicht dem Embryogeneseprogramm folgt. Stattdessen schlagen wir vor, dass SHOOT MERISTEMLESS, ein KNOTTED-LIKE HOMEOBOX-Gen der Klasse I, wahrscheinlich eine Rolle bei der PLB-Regeneration spielt. Unsere Studien stellen das derzeitige Verständnis der embryonalen Identität von PLBs in Frage. Zusammengenommen bilden die erhaltenen Daten einen grundlegenden Rahmen für die reproduktive Entwicklung von Orchideen und stellen eine wertvolle neue Ressource dar, um die Vorhersage von Genregulationsnetzwerken zu ermöglichen, die für spezialisierte Entwicklungsprogramme von Orchideenarten erforderlich sind. PMID:27338813


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