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Genauigkeit der Genomgrößenschätzung durch Durchflusszytometrie

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Ich arbeite an einem Genomprojekt und verwende ein in silico k-mer-Analyse, um die Größe unseres Genoms basierend auf den verfügbaren Illumina-Reads abzuschätzen. Die k-mer-basierte Schätzung ist über einen weiten Bereich konsistent k Werte, ist aber wesentlich niedriger als die vorherige Schätzung basierend auf der Durchflusszytometrie (beschrieben in Experimentelle Verfahren dieses Papiers). Wie genau sind Schätzungen der Genomgröße basierend auf der Durchflusszytometrie?


Da die Menge an Genomdaten und Bioinformatik-Ressourcen täglich wächst, stehen Forscher zunehmend vor der Herausforderung, den am besten geeigneten Ansatz für die Analyse ihrer Daten auszuwählen. Darüber hinaus wächst die Möglichkeit, vergleichende Genomanalysen durchzuführen, rasant. Dies gilt insbesondere für Pilze aufgrund ihrer geringen Genomgrößen (d. h. im Mittel 1C = 44,2 Mb). Angesichts dieser Möglichkeiten und mit dem Ziel, neue Einblicke in die Evolution von Mutualismen zu gewinnen, konzentrieren wir uns auf den Vergleich der Qualität ganzer Genom-Assemblies für pilzzüchtende Ameisensorten (Hymenoptera: Formicidae: Attini) und einen freilebenden Verwandten. Unsere Analysen zeigen, dass derzeit verfügbare Methoden und Pipelines zur Analyse von Sequenzdaten des gesamten Genoms verfeinert werden müssen. Durch die Verwendung verschiedener Genom-Assembler zeigen wir, dass die Größe der Genom-Assembly von der verwendeten Software abhängt. Dies wiederum beeinflusst die Vorhersage der Genzahl, wobei höhere Genzahlen positiv mit der Größe der Genomanordnung korrelieren. Darüber hinaus basieren die meisten derzeit verfügbaren Daten zur Größe des Pilzgenoms auf Schätzungen, die aus Gesamtgenom-Assemblies abgeleitet wurden, die aus Genomdaten mit kurzer Lesezeit generiert wurden, und nicht auf der genaueren Technik der Durchflusszytometrie. Hier haben wir die haploiden Genomgrößen von drei Ameisenpilzsymbionten durch Durchflusszytometrie unter Verwendung des Pilzes geschätzt Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. (1871) als Kalibrierstandard. Wir fanden heraus, dass die veröffentlichten Genomgrößen basierend auf Genom-Assemblies 2,5- bis 3-mal größer sind als unsere Schätzungen basierend auf der Durchflusszytometrie. Wir empfehlen daher, die Durchflusszytometrie zur Vorkalibrierung von Genom-Assembly-Pipelines zu verwenden, um falsche Schätzungen der Genomgröße zu vermeiden und robuste Assemblies zu gewährleisten.

Genomsequenzierung und -analysen nehmen aufgrund sinkender Kosten täglich zu, jedoch kann die Analyse der Daten aufgrund einer großen Verfügbarkeit von Software manchmal schwierig sein, die möglicherweise zu fehlerhaften Genomanordnungen führt. In unserer Studie zeigen wir, dass unterschiedliche Software zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen für die gleichen Genomdaten führen kann, das heißt, wenn die Genomanordnung länger ist, steigt auch die Anzahl der Gene, die aus dieser Anordnung vorhergesagt werden kann. Wir zeigen, dass durch genaue Messung der Genomgröße mittels Durchflusszytometrie die resultierenden Daten als Qualitätskontrolle für die Genomanordnungen dienen können.


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Analyse von Pflanzengenomgrößen mittels Durchflusszytometrie: eine Fallstudie, die den dynamischen Bereich und die Messlinearität demonstriert

Durchflusszytometer wurden ursprünglich entwickelt, um mit Zellsuspensionen, prototypisch Blutzellen, zu arbeiten, und die meisten Anwendungen beinhalten immer noch Proben dieses Typs. Trotz der Tatsache, dass Pflanzenzellen und ihre Protoplasten im Allgemeinen größer sind als Säugerblutzellen, können diese Zellen immer noch durchflusszytometrisch analysiert werden. In den meisten Wachstumsstadien bestehen höhere Pflanzen aus Geweben und Organen, komplexen dreidimensionalen Zellverbänden, die von Zellwänden zusammengehalten werden. Folglich müssen Pflanzen vor der Analyse zunächst verarbeitet werden, um Zellsuspensionen herzustellen, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind. Ein Ansatz besteht darin, die Zellwände mit Hilfe von Enzymen aufzulösen, die ihre Kohlenhydratbestandteile hydrolysieren, um Protoplasten freizusetzen, die dann einfach auf dem Zytometer analysiert werden können.

Der zweite Ansatz, der hier mit dem CytoFLEX beschrieben wird, beinhaltet die Analyse nicht von Protoplasten, sondern von Kernsuspensionen, die aus Pflanzengeweben und -organen durch ein einfaches Hackverfahren freigesetzt werden (2). Das Verfahren beinhaltet das Aufschneiden der Zellen innerhalb des Gewebes mit einer standardmäßigen zweischneidigen Rasierklinge. Das Homogenisat wird unter Verwendung eines Nylonmaschenfilters geklärt, durch den die freigesetzten Kerne geleitet werden. Anschließend werden die Kerne mit DNA-spezifischen Fluorochromen angefärbt, was eine durchflusszytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts der einzelnen Kerne ermöglicht. Das Interesse an der Messung von Pflanzengenomgrößen ergibt sich aus der Beobachtung, dass höhere Pflanzen, wenn sie artenübergreifend analysiert werden, einen außergewöhnlich großen Bereich an Genomgrößen aufweisen: eine aktuelle Untergrenze von etwa 0,13 pg pro 2C-Kern für Genlisea margaretae bis zu einer Obergrenze von 304,40 pg für Paris japonica (3). Das letztgenannte Genom ist ungefähr 50-mal größer als das menschliche Genom, und die DNA einer einzelnen Zelle von Paris japonica würde, wenn sie ausgestreckt ist, ungefähr 91 Meter lang sein.

Die Durchflusszytometrie in Verbindung mit dem Chopping-Verfahren bietet ein einfaches Mittel zur Bestimmung der Genomgröße, das allgemein für alle Arten anwendbar ist, und die Methodik wurde weltweit weit verbreitet, um zahlreiche Probleme in der grundlegenden und angewandten Biologie, Ökologie und Landwirtschaft anzugehen. Dazu gehören Anwendungen in der Biotechnologie, wie die Überwachung der genetischen Stabilität nach Transformation und Gewebekultur, die Priorisierung von Arten für die Sequenzierung des gesamten Genoms, die Validierung der Vollständigkeit ganzer Genomanordnungen und die Bereitstellung einer geeigneten Planung für gentechnische Verfahren wie die Herstellung von DNA-Bibliotheken. Anwendungen in der Landwirtschaft, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Produktion von haploiden und dihaploiden Linien unter Verwendung von Antheren-/Eierstockkulturen, gefolgt von einer Colchicinverdopplung, die Produktion von samensterilen triploiden Linien, die Produktion von Pflanzen mit tetraploiden und höheren Ploidiegraden, verbunden mit gewünschten Merkmalen wie Fruchtgröße, Qualitätskontrolle des Euploidie-Status für kommerzielle Saatgutpartien, Identifizierung von Individuen mit neuartigen Ploidiegraden und mit neuartigen Reproduktionsmodi (einschließlich Apomixis), Charakterisierung interspezifischer Hybridisierung basierend auf intermediären nuklearen DNA-Gehalten, Klassifizierung von Ploidieverteilungen innerhalb von Keimplasmasammlungen, Geschlechtsbestimmung bei zweihäusigen Pflanzen und Identifizierung von Hybriden, die zwischen Wildarten und zwischen Wild- und Kulturarten gebildet werden.

Anwendungen in der Pflanzenanatomie, Zellbiologie, Physiologie und Entwicklung, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Untersuchung der Regulation des Zellteilungszyklus und der Endoreduplikation in der Pflanzenentwicklung sowie die Auswirkungen von abiotischem und biotischem Stress auf diese Prozesse. Die Durchflusszytometrie hat auch zu weit verbreiteten Untersuchungen des Konzepts des Nukleotyps geführt, dh der phänotypischen Wirkung der Menge der nuklearen DNA, unabhängig von ihrem kodierten Informationsgehalt, auf das Kernvolumen, die Anteile des von Chromosomen besetzten Kerns, die Dauer der Mitose und Meiose, Samengröße und die minimale Generationszeit. Die Durchflusszytometrie ist auch nützlich zum Nachweis von Mixoploidie und Chimärismus. Die Analyse der Genexpression als Funktion des Zelltyps unter Verwendung von durchflusssortierten Kernen wird zunehmend als ein wichtiges Forschungsgebiet anerkannt. In der Taxonomie und Systematik ist die Durchflusszytometrie von unschätzbarem Wert beim Screening auf Reproduktionsmodi, Identifizierung von Artbildung und reproduktiver Isolierung, Beschreibung der Populationsdynamik in Hybridzonen, Entdeckung neuer Zytotypen und Zytotypstruktur über große Populationen, Nachweis und Abgrenzung von Pflanzen Arten für Biodiversität und Erhaltung, Studien über die Mechanismen der Evolution des Pflanzengenoms, die sich auf die Ursachen und Folgen der Variation des nuklearen DNA-Gehalts konzentrieren, und Informationen zur Evolution, die aus der Untersuchung des nuklearen DNA-Gehalts über verschiedene Phylogenien hinweg stammen. Groß angelegte vergleichende Analysen der Genomgröße können auch verwendet werden, um Korrelationen zwischen Genomgröße und Umweltfaktoren, zwischen Genomgröße und Samenmasse, zwischen Genomgröße und Artenreichtum über verschiedene Pflanzengruppen hinweg zu untersuchen, mit dem Hinweis, dass Arten mit großen Genomen anfälliger für das Aussterben, zwischen Genomgröße und invasivem Potenzial und zwischen ökologischer Nische und minimaler Genomgröße (insbesondere fleischfressende Pflanzen).

Als Folge des rasch steigenden Interesses an durchflusszytometrischen Analysen dieser Art und der immer größeren Zahl von Arten, für die Daten veröffentlicht werden, haben sich durchsuchbare Repositorien als wertvolle Ressource für die Zuordnung von DNA-Inhalten zu Genomgrößen herausgebildet, durch Bereitstellung von Kalibrierungsbeziehungen, wobei der Konsens auf Crowd-Sourcing-Methode angegangen wird. Eine der wichtigsten dieser Ressourcen ist die von Experten kuratierte Kew-C-Wert-Datenbank, die Werte des nuklearen DNA-Gehalts in Abhängigkeit von Gattung und Art in durchsuchbarer Form über das Internet bereitstellt (3). Kuratoren definieren auch &ldquoGold-Standard&rdquo nukleare DNA-Gehaltswerte, von denen angenommen wird, dass sie genauer und reproduzierbar sind (3). Insgesamt sind durchflusszytometrische Schätzungen des nuklearen DNA-Gehalts vergleichbar mit den Größen von Aggregaten aus der Sequenzierung des gesamten Genoms, obwohl das Vorhandensein stark repetitiver chromosomaler DNA typischerweise zu niedrigeren Schätzungen der Genomgröße führt, die aus sequenzbasierten Ansätzen erhalten werden. Es wurden verschiedene Faktoren identifiziert, die die durchflusszytometrische Kalibrierung durcheinander bringen können und vermieden werden können. Zum Beispiel ist die Bindung und die resultierende Fluoreszenz einiger DNA-spezifischer Fluorochrome Basenpaar-spezifisch und daher kein echtes Maß für die DNA-Menge über Spezies hinweg, die Kerngenome mit unterschiedlichen AT:GC-Verhältnissen aufweisen.

In diesem Protokoll verwenden wir Propidiumiodid (PI) als DNA-Fluorochrom. In Gegenwart von Ribonuklease, um Beiträge zur Fluoreszenz durch doppelsträngige RNA zu eliminieren, interkaliert PI die DNA-Doppelhelix und erzeugt eine intensive Fluoreszenz mit einem Anregungsmaximum bei etwa 535 nm und einem Emissionsmaximum bei 617 nm. Das Emissionsprofil ist relativ breit mit einer maximalen spektralen Breite von 50%, die ungefähr 100 nm (590-690 nm) überspannt.

PI wurde verwendet, um den DNA-Gehalt von vier Arten zu bestimmen: Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand), Solanum lycopersicum (Tomate), Zea mays (Mais) und Capsicum annuum (Pfeffer). Die zur Präparation der Arabidopsis- und Capsicum-Proben verwendeten Organe veranschaulichen das interessante Phänomen der Endoreduplikation, bei der somatische Zellen ohne dazwischenliegende Mitose in aufeinanderfolgende Runden der Genomreplikation (S-Phase) eintreten (4). Dieser endozyklische Prozess führt zu Polyploidie, die bei Pflanzen häufig vorkommt (7).

Abbildung. Durchflusszytometrie misst effektiv die Endoreplikation in Pflanzenzellen. Das rechte Bild zeigt verschiedene Arten der mitotischen Genreplikation während des Zellzyklus. Diese Ereignisse führen zu polyploiden Geweben. Auf der linken Seite ist der Arbeitsablauf zur Präparation von Pflanzengewebe durch Durchflusszytometrie dargestellt, einschließlich der Daten, die die Ergebnisse des mitotischen Endocyclings angeben.


2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Pflanzenmaterial

Insgesamt 127 Akzessionen mit der Bezeichnung Festuca ovina aus 20 Ländern wurden 2016 vom USDA Germplasm Resources Information Network (GRIN) bezogen (Ergänzungstabelle S1). Die Samen jeder Akzession wurden in mit BRK Promix-Erde (Premier Tech) gefüllte Gewächshaustöpfe (4 Zoll Größe) in der Plant Growth Facility der University of Minnesota in St. Paul ausgesät. Nach Erreichen des vier- bis fünfblättrigen Stadiums wurden fünf Sämlinge pro Zugang zufällig ausgewählt und in einzelne Kegelbehälter mit einer Größe von 1 Zoll verpflanzt. Die Pflanzen wurden 16 h Tag und 8 h Nacht mit zweitägigem Gießen und wöchentlicher Düngung unter Verwendung von Peat-lite 20-10-20-Dünger (J. R. Peters Inc.) mit zusätzlichem Ammoniumsulfat und chelatisiertem Eisen plus Mn (BASF) gezüchtet. Die fünf Genotypen jeder Akzession wurden vegetativ in sechs Replikationen jedes Genotyps kloniert und in eine Feldgärtnerei in der Minnesota Agricultural Experiment Station in St. Paul, MN, verpflanzt. Festuca ovina ‚Quatro‘ und F. brevipila „Beacon“ wurden auch als Standards auf dem Feld gepflanzt.

2.2 Durchflusszytometrie-Verfahren

Um den nuklearen DNA-Gehalt von Akzessionen zu bestimmen, wurde Durchflusszytometrie unter Verwendung des von Arumuganathan und Earle (1991) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Da das in dieser Studie verwendete Saatgut aus offener Bestäubung resultierte, haben wir drei Genotypen für jeden Beitritt ausgewertet, um eine genauere Darstellung der Ploidie der Population zu erhalten. Wenn die drei ausgewählten Genotypen nicht auf dem gleichen Ploidie-Niveau waren, wurde ein vierter Genotyp bewertet. Der Ploidiegrad der Akzession wurde durch die Ploidie der Mehrheitsgenotypen (75 %) bestimmt.

Frisch, reif F. ovina Blattproben auf dem Baumschulfeld wurden zwischen 9:00 und 11:00 Uhr geerntet und auf 1–2 cm beschnitten und für die Durchflusszytometrie verwendet. Gleichzeitig wurde im Gewächshaus mehrjähriges Weidelgras-Blattgewebe geerntet. Für jede Probe enthielt die Durchflusszytometrie-Färbelösung 4,29 µl Propidiumiodid, 0,71 ml CyStain UV Precise P Färbepuffer und 2,14 µl RNAseA. Zur Herstellung von Pflanzengewebe wurde eine 0,5 x 0,5 cm große Blattprobe mit einer Rasierklinge in 500 µl CyStain UV Precise P Extraktionspuffer (Sysmex) in kleine Stücke ausgeschnitten und durch einen 50 µl Filter (Sysmex) geleitet. Die Färbelösung wurde dem Durchfluss zugesetzt, um die Kerne in jeder Probe zu färben. Die Proben wurden auf Eis gelagert, bevor das Durchflusszytometer geladen wurde. Die Durchflusszytometrie wurde unter Verwendung des BD LSRII H4760-Instruments (BD Biosciences) mit PI-Laserdetektor unter Verwendung von 480 V mit mindestens 1.000 Ereignissen an der University of Minnesota Flow Cytometry Resource durchgeführt. Die Daten wurden auf der Software BD Biosciences FACSDiva 8.0.1 visualisiert und analysiert.

2.3 Schätzung des DNA-Gehalts und Bestimmung des Ploidy-Levels

2.4 Saatgrößenmessung und Vergleich

Für Samengrößenmessungen haben wir Samen aus Akzessionen mit gemeinsamen Ploidiestufen gepflückt, um einen Samengrößenvergleich durchzuführen (insgesamt 92 Akzessionen). Als Referenzen wurden auch Tetraploid Quatro und Hexaploid Beacon aufgenommen. Die Samen wurden auf einem digitalen Scanner (Epson Perfection v6 Flachbettscanner, Nagano, Japan) ausgebreitet und mit 600 Punkten pro Zoll mit einer Größe von 2169 mal 7019 Pixeln gescannt. Die Bilder wurden mit einem benutzerdefinierten Python-Skript (https://github.com/joanmanbar/seed_morphology) verarbeitet, das die Originalbilder transformierte, um die Seedlänge bzw angepasste Ellipse, während die Fläche als Anzahl der Pixel im Seed berechnet wurde. Die Saatfläche wurde für jeden der 92 Einträge für mindestens 10 Samen berechnet. Die Saatfläche wurde verwendet, um die Korrelation zwischen Ploidiegrad und Saatgröße zu analysieren und mit dem ggplot2-Paket in R visualisiert (Kahle & Wickham, 2013).


Abstrakt

Clusterbean (C. tetragonoloba) ist eine wichtige Leguminosen- und Industriepflanze mit großer genetischer Vielfalt, aber geringen genetischen, zytologischen und genomischen Informationen. In der vorliegenden Studie wurde ein optimiertes Verfahren der Durchflusszytometrie verwendet, um die Genomgröße von drei Clusterbohnenarten abzuschätzen, dargestellt durch C. tetragonoloba (cv. RGC-936) und zwei wilde Verwandte (C. serreta und C. senegalensis). Für eine genaue Schätzung des genomischen Inhalts, Singulett G0/G1 Populationen von mehreren Geweben wie Blättern, Hypokotyl und gereiften Samen wurden bestimmt und zusammen mit drei verschiedenen Pflanzenarten, nämlich. Pisum sativum (als primär), Oryza sativa, und Glycin max (sekundär), als externe und interne Referenzstandards. Samengewebe der Testprobe und G. max. lieferte die beste Schätzung des nuklearen DNA-Gehalts im Vergleich zu anderen Gewebeproben und Referenzstandards. Die Genomgröße von C. tetragonoloba wurde mit 580,9 ± 0,02 Mbp (1C) bestimmt, während der von C. serreta und C. senegalensis wurde auf 979,6 ± 0,02 Mbp (1C) bzw. 943,4 ± 0,03 Mbp (1C) geschätzt. So beherbergen die wilden Verwandten fast den doppelten Genomgehalt der kultivierten Streubohne. Die Ergebnisse dieser Studie werden die genomische Datenbank der Leguminosenfamilie bereichern und können als Ausgangspunkt für evolutionäre und genomische Studien an Clusterbohnen dienen.


Analyse von Pflanzengenomgrößen mittels Durchflusszytometrie: eine Fallstudie, die den dynamischen Bereich und die Messlinearität demonstriert

Durchflusszytometer wurden ursprünglich entwickelt, um mit Zellsuspensionen, prototypisch Blutzellen, zu arbeiten, und die meisten Anwendungen beinhalten immer noch Proben dieses Typs. Trotz der Tatsache, dass Pflanzenzellen und ihre Protoplasten im Allgemeinen größer sind als Säugerblutzellen, können diese Zellen immer noch durchflusszytometrisch analysiert werden. In den meisten Wachstumsstadien bestehen höhere Pflanzen aus Geweben und Organen, komplexen dreidimensionalen Zellverbänden, die von Zellwänden zusammengehalten werden. Folglich müssen Pflanzen vor der Analyse zunächst verarbeitet werden, um Zellsuspensionen herzustellen, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind. Ein Ansatz besteht darin, die Zellwände mit Hilfe von Enzymen aufzulösen, die ihre Kohlenhydratbestandteile hydrolysieren, um Protoplasten freizusetzen, die dann einfach auf dem Zytometer analysiert werden können.

Der zweite Ansatz, der hier mit dem CytoFLEX beschrieben wird, beinhaltet die Analyse nicht von Protoplasten, sondern von Kernsuspensionen, die aus Pflanzengeweben und -organen durch ein einfaches Hackverfahren freigesetzt werden (2). Das Verfahren beinhaltet das Aufschneiden der Zellen innerhalb des Gewebes mit einer standardmäßigen zweischneidigen Rasierklinge. Das Homogenisat wird unter Verwendung eines Nylonmaschenfilters geklärt, durch den die freigesetzten Kerne geleitet werden. Anschließend werden die Kerne mit DNA-spezifischen Fluorochromen gefärbt, was eine durchflusszytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts der einzelnen Kerne ermöglicht. Das Interesse an der Messung von Pflanzengenomgrößen ergibt sich aus der Beobachtung, dass höhere Pflanzen, wenn sie artenübergreifend analysiert werden, einen außergewöhnlich großen Bereich an Genomgrößen aufweisen: eine aktuelle Untergrenze von etwa 0,13 pg pro 2C-Kern für Genlisea margaretae bis zu einer Obergrenze von 304,40 pg für Paris japonica (3). Das letztgenannte Genom ist ungefähr 50-mal größer als das menschliche Genom, und die DNA einer einzelnen Zelle von Paris japonica würde, wenn sie ausgestreckt ist, ungefähr 91 Meter lang sein.

Die Durchflusszytometrie in Verbindung mit dem Chopping-Verfahren bietet ein einfaches Mittel zur Bestimmung der Genomgröße, das allgemein für alle Arten anwendbar ist, und die Methodik wurde weltweit weit verbreitet, um zahlreiche Probleme in der grundlegenden und angewandten Biologie, Ökologie und Landwirtschaft anzugehen. Dazu gehören Anwendungen in der Biotechnologie, wie die Überwachung der genetischen Stabilität nach Transformation und Gewebekultur, die Priorisierung von Arten für die Sequenzierung des gesamten Genoms, die Validierung der Vollständigkeit ganzer Genomanordnungen und die Bereitstellung einer geeigneten Planung für gentechnische Verfahren wie die Herstellung von DNA-Bibliotheken. Anwendungen in der Landwirtschaft, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Produktion von haploiden und dihaploiden Linien unter Verwendung von Antheren-/Eierstockkulturen, gefolgt von einer Colchicinverdopplung, die Produktion von samensterilen triploiden Linien, die Produktion von Pflanzen mit tetraploiden und höheren Ploidiegraden, verbunden mit gewünschten Merkmalen wie Fruchtgröße, Qualitätskontrolle des Euploidie-Status für kommerzielle Saatgutpartien, Identifizierung von Individuen mit neuartigen Ploidiegraden und mit neuartigen Reproduktionsmodi (einschließlich Apomixis), Charakterisierung interspezifischer Hybridisierung basierend auf intermediären nuklearen DNA-Gehalten, Klassifizierung von Ploidieverteilungen innerhalb von Keimplasmasammlungen, Geschlechtsbestimmung bei zweihäusigen Pflanzen und Identifizierung von Hybriden, die zwischen Wildarten und zwischen Wild- und Kulturarten gebildet werden.

Anwendungen in der Pflanzenanatomie, Zellbiologie, Physiologie und Entwicklung, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Untersuchung der Regulation des Zellteilungszyklus und der Endoreduplikation in der Pflanzenentwicklung sowie die Auswirkungen von abiotischem und biotischem Stress auf diese Prozesse. Die Durchflusszytometrie hat auch zu weit verbreiteten Untersuchungen des Konzepts des Nukleotyps geführt, dh der phänotypischen Wirkung der Menge der nuklearen DNA, unabhängig von ihrem kodierten Informationsgehalt, auf das Kernvolumen, die Anteile des von Chromosomen besetzten Kerns, die Dauer der Mitose und Meiose, Samengröße und die minimale Generationszeit. Die Durchflusszytometrie ist auch nützlich zum Nachweis von Mixoploidie und Chimärismus. Die Analyse der Genexpression als Funktion des Zelltyps unter Verwendung von durchflusssortierten Kernen wird zunehmend als ein wichtiges Forschungsgebiet anerkannt. In der Taxonomie und Systematik ist die Durchflusszytometrie von unschätzbarem Wert beim Screening auf Reproduktionsmodi, Identifizierung von Artbildung und reproduktiver Isolierung, Beschreibung der Populationsdynamik in Hybridzonen, Entdeckung neuer Zytotypen und Zytotypstruktur über große Populationen, Nachweis und Abgrenzung von Pflanzen Arten für Biodiversität und Erhaltung, Studien über die Mechanismen der Evolution des Pflanzengenoms, die sich auf die Ursachen und Folgen der Variation des nuklearen DNA-Gehalts konzentrieren, und Informationen zur Evolution, die aus der Untersuchung des nuklearen DNA-Gehalts über verschiedene Phylogenien hinweg stammen. Groß angelegte vergleichende Analysen der Genomgröße können auch verwendet werden, um Korrelationen zwischen Genomgröße und Umweltfaktoren, zwischen Genomgröße und Samenmasse, zwischen Genomgröße und Artenreichtum über verschiedene Pflanzengruppen hinweg zu untersuchen, mit dem Hinweis, dass Arten mit großen Genomen anfälliger für das Aussterben, zwischen Genomgröße und invasivem Potenzial und zwischen ökologischer Nische und minimaler Genomgröße (insbesondere fleischfressende Pflanzen).

Als Folge des rasch steigenden Interesses an durchflusszytometrischen Analysen dieser Art und der immer größeren Zahl von Arten, für die Daten veröffentlicht werden, haben sich durchsuchbare Repositorien als wertvolle Ressource für die Zuordnung von DNA-Inhalten zu Genomgrößen herausgebildet, durch Bereitstellung von Kalibrierungsbeziehungen, wobei der Konsens auf Crowd-Sourcing-Methode angegangen wird. Eine der wichtigsten dieser Ressourcen ist die von Experten kuratierte Kew-C-Wert-Datenbank, die Werte des nuklearen DNA-Gehalts in Abhängigkeit von Gattung und Art in durchsuchbarer Form über das Internet bereitstellt (3). Kuratoren definieren auch &ldquoGold-Standard&rdquo nukleare DNA-Gehaltswerte, von denen angenommen wird, dass sie genauer und reproduzierbar sind (3). Insgesamt sind durchflusszytometrische Schätzungen des nuklearen DNA-Gehalts vergleichbar mit den Größen von Aggregaten aus der Sequenzierung des gesamten Genoms, obwohl das Vorhandensein stark repetitiver chromosomaler DNA typischerweise zu niedrigeren Schätzungen der Genomgröße führt, die aus sequenzbasierten Ansätzen erhalten werden. Es wurden verschiedene Faktoren identifiziert, die die durchflusszytometrische Kalibrierung durcheinander bringen können und vermieden werden können. Zum Beispiel ist die Bindung und die resultierende Fluoreszenz einiger DNA-spezifischer Fluorochrome Basenpaar-spezifisch und daher kein echtes Maß für die DNA-Menge über Spezies hinweg, die Kerngenome mit unterschiedlichen AT:GC-Verhältnissen aufweisen.

In diesem Protokoll verwenden wir Propidiumiodid (PI) als DNA-Fluorochrom. In Gegenwart von Ribonuklease, um Beiträge zur Fluoreszenz durch doppelsträngige RNA zu eliminieren, interkaliert PI die DNA-Doppelhelix und erzeugt eine intensive Fluoreszenz mit einem Anregungsmaximum bei etwa 535 nm und einem Emissionsmaximum bei 617 nm. Das Emissionsprofil ist relativ breit mit einer maximalen spektralen Breite von 50%, die ungefähr 100 nm (590-690 nm) überspannt.

PI wurde verwendet, um den DNA-Gehalt von vier Arten zu bestimmen: Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand), Solanum lycopersicum (Tomate), Zea mays (Mais) und Capsicum annuum (Pfeffer). Die zur Präparation der Arabidopsis- und Capsicum-Proben verwendeten Organe veranschaulichen das interessante Phänomen der Endoreduplikation, bei der somatische Zellen ohne dazwischenliegende Mitose in aufeinanderfolgende Runden der Genomreplikation (S-Phase) eintreten (4). Dieser endozyklische Prozess führt zu Polyploidie, die bei Pflanzen häufig vorkommt (7).

Abbildung. Durchflusszytometrie misst effektiv die Endoreplikation in Pflanzenzellen. Das rechte Bild zeigt verschiedene Arten der mitotischen Genreplikation während des Zellzyklus. Diese Ereignisse führen zu polyploiden Geweben. Auf der linken Seite ist der Arbeitsablauf zur Präparation von Pflanzengewebe durch Durchflusszytometrie dargestellt, einschließlich der Daten, die die Ergebnisse des mitotischen Endocyclings angeben.


Zur Anwendung der Durchflusszytometrie bei der genomischen Größenbestimmung von Bambuspflanzen

Mach: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200212
  • Empfangsdatum: 2020-03-18
  • Rev. Aufnahmedatum: 2020-09-28
  • Online verfügbar: 2021-01-21
  • Datum der Veröffentlichung: 2021-01-21

Abstrakt: Zielsetzung Diese Forschung zielt darauf ab, die Auswirkungen des materiellen Gewebes und der Behandlungsmethode auf die Genomgröße von Bambuspflanzen zu untersuchen, mit dem ultimativen Ziel, die Genauigkeit der Bestimmung der Genomgröße von Bambuspflanzen zu verbessern. Methode Mit den Blättern und Trieben verschiedener Bambusarten als Materialien und dem Reis als Referenzstandard, während die Kernfärbungszeit auf 9 verschiedene Gradienten eingestellt ist, d.h. 1, 3, 5, 7, 9, 12, 18, 24 und 30 Minuten wurde eine Untersuchung der Gewebestellen und Färbematerialien verschiedener Bambuspflanzen unter Einsatz der Durchflusszytometrie durchgeführt. Ergebnis (1) Bei der gleichen Bambusart waren die Blätter und Triebe im Fluoreszenzpeak und der Genomgröße ähnlich, wobei der Genomgrößenunterschiedsbereich nur 0,04 betrug

0,20 S. (2) Die 12 Bambusarten unterscheiden sich in ihrer Kernfärbungszeit mit der Fluoreszenzintensität von Sinobambusa Tootsik, Sinobambusa Tootisik F. albo-striata, Pseudosasa japonica div. tsutsumiana, Pseudosasa japonica F. akebono, Indocalamus decorus, Sasaella glabra F. albo-striata und Chimonobambusa mamorea F. variegata das Maximum innerhalb von 1 Minute erreichen, das von Bambusa-Multiplex und Phyllostachys schwefelharnstoff das Maximum innerhalb von 3 Minuten erreichen, das von Pseudosasa amabilis div. amabilis und Thyrsostachy ssiamensis das Maximum innerhalb von 5 Minuten erreichen, während das von Phyllostachys schwefelharnstoff (Blatt) das Maximum innerhalb von 7 Minuten erreicht. (3) Die Fluoreszenzintensität der 12 Bambusse variiert stark von 1 bis 30 Minuten, alle über 5 % außer dem Blatt von P. amabilis div. amabilis, T. ssiamensis, B. Multiplex und das Shooting von S. Tootsik. Tatsächlich ist die Fluoreszenzintensität von P. japonica div. tsutsumiana und S. glabra F. albo-striata haben 12,93% bzw. 12,88% erreicht. (4) Was die Genomgröße von 12 Bambusarten betrifft, so sind 2 tropische holzige Bambusarten von B. Multiplex und T. ssiamensis änderte sich von (2,64 ± 0,54) pg auf (2,69 ± 1,01) pg, jedoch änderte sich das der 10 gemäßigten holzigen Bambusarten von (3,76 ± 1,51) pg auf (5,73 ± 1,85) pg der 10 gemäßigten Bambusarten, das Genom Größe von Phyllostachys änderte sich von (3,76 ± 1,51) pg auf (3,91 ± 0,95) pg, jedoch änderte sich die der anderen Bambusgattung von (4,82 ± 0,54) pg auf (5,73 ± 1,85) pg, was offensichtlich größer ist als Phyllostachys. Abschluss (1) Sowohl Blätter als auch Triebe von Bambus können als experimentelles Material verwendet werden, um ihre Genomgrößen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen. Die Kernfärbungszeit hat einen gewissen Einfluss auf die Bestimmung der Bambus-Genomgröße mit 3 bis 5 Minuten als optimale Färbezeit. (2) Die Genomgröße von tropischen holzigen Bambusarten ist offensichtlich kleiner als die von gemäßigten holzigen Bambusarten, während unter den gemäßigten holzigen Bambusarten die Genomgröße von Phyllostachys ist offensichtlich kleiner als die der anderen Gattung Bambusarten. [Ch, 1 Abb. 5 Registerkarte. 29 Ref.]

流式细胞 术 是 指 利用 流式细胞 仪 对 悬浮 细胞 或 微粒 等 进行 分析 的 现代 分析 技术, 该 技术 可 对 一些 特异 的 细胞 和 染色体 等 进行 分析 和 分 选, 还可 对 动植物 基因 组 大小 及 倍[ 1 - 3 ]细胞术在植物基因组大小研究中发挥了重要的作用,约265种菊科Asteraceae植物、157种莎草科Cyperaceae植物及191种毛茛属Ranunkel[ 2 , 4 - 7]C值(指单倍体细胞核的DNA含量)数据库已建立 [ 8 ] 。基因组大小信息可为植物系统分类、基因组测序及重测序等研究提供参考,因此,提高植物基因组大小测量精度至关重要 [ 9 - 10 ] 。竹类植物是重要的森林资源,全世界约119属1 482种,在中国分布的约37属500余种,变种变型100余种 [ 11 - 13 ]研究 中, 目前 仅有 毛竹Phyllostachys edulis, 莪 莉 竹Olyra latifolia, 芸香 竹Raddia guianensis及 瓜 多 竹Guadua angustifolia等竹种完成了全基因组测序工作,在整个竹类植物中所占比例还不足0,2% [ 10 , 14 - 15 ] 。另外,在竹类植物基因组大小研究中,目前约200个竹种的基因组[ 16 - 19 ] 2个步骤,因不同植物细胞内含物及代谢物成分不同,所用细胞核提取液在组成上存在较大差异。研究者们往往会重点关注细胞核提取液,而忽略染色时间对实验结果的12个竹种的Ich

1.1.材料

以 已 测序 的 水稻Oryza sativa为参照。12个竹种清单及采样信息见 表1 。流式细胞仪分析的植物材料要求是新鲜幼嫩的组织部位,不能进行冷冻和干燥等处理。竹类植物叶片和笋均可满足实验要求, 而且 方便 采集, 特别 是 竹笋 更 适合 长时间 保存. 唐 竹Sinobambusa Tootsik, 茶 竿 竹Pseudosasa amabilis div. amabilis, 孝顺 竹Bambusa-Multiplex及 黄皮 刚 竹Phyllostachys schwefelharnstoff4个竹种同时以叶片和笋为材料,花叶唐竹Sinobambusa Tootisik F. albo-striata, 黄皮 绿 筋 竹Phyllostachys schwefelharnstoff, 平安 竹Pseudosasa japonica div. tsutsumiana, 柳叶 细竹Thyrsostachy ssiamensis, 花叶 赤 竹Sasaella glabra F. albo-striata, 美丽 箬竹Indocalamus decorus, 曙 筋 矢 竹Pseudosasa japonica F. akebono及 红 秆 寒竹Chimonobambusa mamorea F. variegata8个竹种主要是从国内外一些竹种园收集而来。这些竹种数量有限,目前尚无笋,因此,这8个竹种均以叶片为材料。

竹 种材料 来源经纬度竹 种材料 来源经纬度
孝顺 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E茶 竿 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E
柳叶 细竹 浙江 农林 大学 智能 温室30°09′14″N, 119°26′00″E平安 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E
黄皮 刚 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E曙 筋 矢 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30°09′14″N, 119°26′00″E
黄皮 绿 筋 竹浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E花叶 赤 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30°09′14″N, 119°26′00″E
唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E美丽 箬竹 浙江 农林 大学 智能 温室30°09′14″N, 119°26′00″E
花叶 唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30°09′14″N, 119°26′00″E红 秆 寒竹 浙江 农林 大学 智能 温室30°09′14″N, 119°26′00″E

Tabelle 1. Beschreibung der geografischen Verbreitung von 12 Bambusarten

1.2.方法

1.2.1.流式细胞 仪 样品 制备

对于 竹类 植物 叶片 样品, 选取 顶端 尚未 展开 的 心 叶 或 紧邻 心 叶 已 完全 展开 的 嫩叶;. 对于 竹笋 样品, 选择 新鲜 无 病虫害 的 嫩 笋, 实验 过程 中 剥去 笋 壳 用 双面 刀片 切 取一段面积约1 cm 2 或厚度约1,0 mm的叶片,面积约0,25 cm 2 的嫩笋置于干净的培养皿中,然后向培养皿中加入500 μL细胞核提取液(Cystain UV-präziser P-Kernextraktionspuffer, TEILEC5003)润湿样品,用锋利的双面刀片迅速将样品剁碎,将培养皿倾斜静置1

2 min,使细胞核提取充分,之后向培养皿中加入2 ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol)染色液(Cystain UV-Präzisions-P-Färbepuffer,PARTEC,编号5003)对细胞核进行染色,然后用30目的滤头将样品过滤到进样管中,准备上机测样。

1.2.2.流式细胞 仪 样品 测定

根据前期多次预实验结果,设置样品染色时间为1、3、5、7、9、12、18、24和30 min共9个梯度,利用流式细胞仪(Partec CyFlow ploidiy Analyser)对样品进行测定. 为了 确保 测量 结果 的 准确性, 每次 实验 先 以 水稻 为 参照, 分析 已 测序 毛竹 的 基因 组 大小, 在 此 基础 上 再 对 其他 竹 种 基因 组 大小 进行 测量 和 分析. 为了 减少 误差, 每个 竹种设置3个不同重复,变异系数控制在5%以内。

1.2.3.不同竹种的DNA含量分析

登录C值数据库网站(http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html),查出水稻二倍体基因组对应的DNA含量2C为1,0 S.,并推算待测竹种的2C:待测竹种2C (pg)=(待测竹种峰值/水稻峰值)×水稻2C 值(1.0 pg),水稻单倍体基因组大小为466 Mb [ 20 ]

2.1.竹类 植物 叶片 和 笋 基因 组 大小 测量 结果 分析

利用 流式细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中, 样品 峰 形状 是 判断 实验 结果 是否 可靠 的 重要 依据. 样品 处理 过程 中 细胞核 提取 质量 越好, 相应 的 细胞 碎片 及 杂质 越 少, 杂 峰 就会 越 少, 样品 峰 往往 表现 得 尖 而 细, 测量 误差 也 较小, 实验 结果 较为 可靠; 反之, 样品 处理 过程 中 产生 的 细胞 碎片 越 多, 对应 的 杂 峰 也会 随之 增多, 进而 影响 甚至 改变 样品 峰图1 可以看出:孝顺竹、唐竹、茶竿竹及黄皮刚竹等4个竹种叶片和笋所呈现的峰在形状上均尖而细,碎片背景也非常少。另外,同一竹种的叶片和笋对应的峰形和峰值也十分相似,如孝顺竹的叶片和笋均表现出双峰,其中左侧较高的峰为2C4C( 图1A1

Abbildung 1. Durchflusszytometer-Spitzenwert einiger Bambusblätter und -sprossen

理论上, 荧光 强度 值 达到 最大, 说明 此时 细胞核 染色 最 充分, 获得 的 基因 组 大小 与其 真实 值 也 最接近. 为了 更 科学 地 对 竹类 植物 叶片 和 笋 对应 的 基因 组 大小 进行 比较 分析, 分别 以 黄4个竹种叶片和笋的最大荧光强度值为依据,计算出4个竹种叶片和笋对应的基因组大小。结果表明:4个竹种叶片和笋对应的基因组大小并非完全吻合,唐竹、茶竿竹、孝顺竹及黄皮刚竹叶片对应的2C值分别为(5.03±2.33)、(4.82±0.54)、(2.64±0.50)和(3.76±1.51) pg,而笋对应的2C值分别为(4,99±1,56)、(5,02±1,99)、(2,72±0,59)和(3,86±2,31) pg,其中茶竿竹、孝顺竹及黄皮刚竹叶片2C值略小于笋对应的2C值,差值分别为0,20、0,10和0,08 pg,而唐竹叶片2C值比其笋略大0,04 S. ( 表2 )。虽然4个竹种叶片和笋所获基因组大小并不完全吻合,但是差值非常小,在误差允许范围内。因此,对竹类植物而言Ich

物种材料 部位2C±标准差/pg±
/Mb
水稻 叶片1.00±0.00860.00±0.00
唐 竹 叶片5.03±2.334 325.80±2.33
4.99±1.564 291.40±1.56
茶 竿 竹 叶片4.82±0.544 145.20±0.54
5.02±1.994 317.20±1.99
孝顺 竹 叶片2.64±0.542 270.40±0.54
2.72±0.592 339.20±0.59
黄皮 刚 竹叶片3.76±1.513 233.60±1.51
3.86±2.313 319.60±2.31

Tabelle 2. Genomgröße von Blättern und Trieben von 4 Bambusarten

2.2.染色 时间 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 影响

3 :12个竹种在一定时间内达到最大荧光强度值后,随着染色时间延长,荧光强度值均有不同程度的减少,当染色时间延长到30 min时,大部分竹种的荧光强度值基本减少到最小。首先,同一竹种的叶片和笋的染色时长及荧光强度变化也不完全相同。以唐竹为例,叶片染色1 Minute荧光强度即达到最大,之后随着染色时间延长,荧光强度值不断减少,当染色时间延长到30 min时,荧光强度值减少到最小,约减少6,23%,而唐竹笋最大荧光强度则出现在3 min,之后随着染色时间延长,荧光强度不断减少,染色30 min时,其荧光强度减少到119,75±1,40,约减少2,67% ( 表3 和 表4 )。其次,12个竹种荧光强度在0

物种部位不同 染色 时间 对应 的 荧光 强度 峰值
1357912182430 Minuten
水稻 24.67±0.3824.42±0.4824.2±0.5224.16±0.4224.07±0.3623.94±0.3823.8±0.3423.47±0.2723.15±0.24
唐 竹 123.98±2.33123.32±2.68122.24±3.14121.48±3.27120.81±2.72119.83±2.84118.59±3.08117.32±2.55116.25±2.19
121.85±1.51123.04±1.56122.77±1.23122.11±1.51121.86±0.78120.82±0.35120.67±0.09119.75±1.40119.87±0.60
茶 竿 竹 118.13±1.24118.81±0.59118.97±0.54118.52±1.03117.99±0.92116.27±1.73115.82±2.62115.75±2.24115.31±2.43
123.39±1.90123.67±2.00123.75±2.00123.18±2.09122.57±1.57121.37±1.87119.56±2.31118.80±1.68118.85±1.24
孝顺 竹 64.07±0.4465.20±0.5464.92±0.5964.63±0.2264.88±0.4464.54±0.8363.85±0.8363.70±0.8663.35±0.74
67.22±0.5966.90±1.1565.60±1.9764.72±2.0763.71±2.9062.85±3.1764.79±1.6460.61±5.9059.81±6.10
黄皮 刚 竹 91.20±1.8392.27±1.6092.50±1.5292.70±1.3692.54±1.3691.98±1.9190.64±2.2790.11±1.9387.70±1.09
95.21±1.8395.35±2.3194.46±3.3292.72±3.2292.09±2.8191.10±2.2889.01±2.7488.30±2.0387.66±1.87
黄皮 绿 筋 竹95.84±1.1996.37±0.9595.66±1.2295.74±1.2395.10±1.5394.68±1.8593.47±1.8192.32±2.2591.27±3.96
平安 竹 134.17±0.93133.44±0.57132.43±1.18131.34±1.49130.17±1.63129.10±1.93125.12±4.50122.36±6.36116.82±8.22
花叶 唐 竹 126.61±1.96125.97±1.71125.58±2.88124.25±2.10123.76±1.86122.98±2.18120.92±2.30118.80±3.17117.99±2.33
花叶 赤 竹 132.17±1.58131.67±1.67131.36±1.46129.64±2.47127.77±3.32124.73±3.37122.08±3.05118.56±3.82115.14±3.52
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85141.20±1.47140.06±2.06139.30±2.20138.50±1.63137.64±1.84135.40±2.90133.01±2.20129.62±3.47
美丽 箬竹 133.08±1.14132.59±2.03130.98±3.10130.03±2.85127.63±2.80125.61±3.61121.71±4.26119.82±5.21116.67±6.85
柳叶 细竹 65.67±1.4765.88±0.8366.25±1.0166.23±0.6866.09±0.4066.14±0.4266.39±0.8365.12±1.4763.30±0.96
红 秆 寒竹 132.82±0.97132.29±1.73131.62±1.88131.36±2.02130.12±2.22130.10±2.21127.39±3.91126.18±3.35123.87±3.58

Tisch 3. Mittelwert unter verschiedenen Färbezeiten von 12 Bambusarten

竹 种材料 部位最大 荧光 强度最小 荧光 强度荧光 强度 减少 值变化比例/%
唐 竹 123.98±2.33116.25±2.197.736.23
123.04±1.56119.75±1.403.292.67
茶 竿 竹 118.97±0.54115.31±2.433.653.07
123.75±2.00118.80±1.684.954.00
孝顺 竹 65.20±0.5463.35±0.741.852.84
67.22±0.5959.81±6.107.4111.02
黄皮 刚 竹 92.70±1.3687.70±1.095.005.39
95.35±2.3187.66±1.877.698.07
黄皮 绿 筋 竹96.37±0.9591.27±3.965.105.30
平安 竹 134.17±0.93116.82±8.2217.3512.93
花叶 唐 竹 126.61±1.96117.99±2.338.626.81
花叶 赤 竹 132.17±1.58115.14±3.5217.0312.88
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85129.62±3.4711.678.26
美丽 箬竹 133.08±1.14116.67±6.8516.4112.33
柳叶 细竹 66.39±0.8363.30±0.962.954.45
红 秆 寒竹 132.82±0.97123.87±3.588.956.74

Tabelle 4. Fluoreszenzintensitätsänderung von 12 Bambussen

另外, 不同 竹 种 甚至 同一 竹 种 不同 组织 部位 对 染色 时间 反应 也不 完全相同. 以 叶片 材料 为例, 唐 竹, 花叶 唐 竹, 平安 竹, 曙 筋 矢 竹, 美丽 箬竹, 花叶 赤 竹 及 红 秆寒竹染色1 min即达到最大荧光强度,染色时间延长到3 min时,荧光强度略有衰减,但减少不明显( 表3 );孝顺竹和黄皮绿筋竹最大荧光强度出现在3 min,但与1、5 min对应的荧光强度相差不明显( 表3 );茶竿竹和柳叶细竹最大荧光强度出现在5 min,其中茶竿竹最大荧光强度与其3 min时的荧光强度最接近,而柳叶细竹最大荧光强度与其7 min时的荧光强度最接近,只有黄皮刚竹最大荧光强度出现在7 min,但与5、9 min对应的峰值十分接近( 表3 )。以笋为材料时,荧光强度随染色体时间变化情况与叶片相似,其中孝顺竹的笋最大荧光强度出现在1 min,唐竹和黄皮刚竹2个竹种笋的最大荧光强度出现在3 min,茶竿竹最大荧光强度出现在5 Minuten ( 表3 )。唐竹、茶竿竹、孝顺竹和黄皮刚竹4个竹种同时以叶片和笋为材料,但是叶片和笋对应的荧光曲线图也不完全相同,例如黄皮刚竹笋的最大荧光强度出现在3 min,叶片最大荧光强度却出现在7 min ( 表3 )。综上所述,无论是叶片还是竹笋,当染色时间延长到3 min时,75%的竹种已达到最大荧光强度值,延长到5 Minuten时,已有91,67%的竹种达到最大荧光强度值。因此,为确保竹类植物基因组大小测定结果的准确性,竹类植物染色时间最好控制在7 Minuten以内,以3

2.3. 12个不同属种竹种的基因组大小分析

表5 :孝顺竹和柳叶细竹对应的基因组大小分别为(2,64±0,54)和(2,69±1,01) pg,明显小于其他10个竹种;其次为刚竹属Phyllostachys的黄皮刚竹和黄皮绿筋竹,对应的2C(3,76±1,51)和(3,91±0,95) pg,明显小于其他一些竹属的竹种;再次为唐竹属Sinobambusa(5.03±2.33)和(5.13±1.96) pg。赤竹属Sasaella的 花叶 赤 竹, 箬竹 属Indocalamus的 美丽 箬竹 及 寒竹 属Chimonobambusa的红秆寒竹3个竹种基因组大小比较相近,对应的基因组大小分别为(5,36±1,58)、(5,39±1,14)和(5,38±0,97) pg。茶竿竹、平安竹和曙筋矢竹在分类上虽然为同一属,但彼此间差异较大,这3个竹种的基因组大小分别为(4,82±0,54)、(5,44±0,93)和(5,73±1,85) pg。

物种2C±标准差/pg±标准差/Mb物种2C±标准差/pg±标准差/Mb
水稻 1.00±0.00860.00±0.00茶 竿 竹 4.82±0.544 145.20±0.54
孝顺 竹 2.64±0.542 270.40±0.54平安 竹 5.44±0.934 678.40±0.93
柳叶 细竹 2.69±1.012 313.40±1.01曙 筋 矢 竹5.73±1.854 927.80±1.85
黄皮 刚 竹 3.76±1.513 233.60±1.51花叶 赤 竹5.36±1.584 609.60±1.58
黄皮 绿 筋 竹3.91±0.953 362.60±0.95美丽 箬竹5.39±1.144 635.40±1.14
唐 竹 5.03±2.334 325.80±2.33红 秆 寒竹5.38±0.974 626.80±0.97
花叶 唐 竹 5.13±1.964 411.80±1.96
:以12个竹种叶片对应的最大荧光强度值为依据,对其基因组大小进行了计算

Tabelle 5. Genomgröße von 12 verschiedenen Bambusarten

KUMAR等 [ 18 ] :分布在新加坡的孝顺竹基因组大小为(3,11±0,02) pg,而ZHOU等 [ 19 ] :分布在中国的孝顺竹基因组大小为(2,78±0,02) pg。本研究中孝顺竹叶片和笋对应的基因组大小分别为(2.64±0.54)和(2.72±0.59) pg,与ZHOU等 [ 19 ] 研究结果较为接近,与KUMAR等 [ 18 ] 研究结果存在一定差异。流[ 21 - 23 ] 。KUMAR等 [ 18 ] 以烟草Nicotiana tabacum为对照,采用碘化丙啶(PI)荧光染料对细胞核进行染色,为了去除烟草等植物细胞中一些特殊的内含物,细胞核提取液中加入了一定量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果PVP浓度过大,在一定程度上会影响细胞核与荧光染料的结合,进而影响细胞核染色效果 [ 24 ] 。本研究与ZHOU等 [ 19 ] 的实验方法相似,均以水稻为对照,用DAPI对细胞核进行ZHOU等 [ 19 ] 较为接近而与KUMAR等 [ 18 ] 有差异的主要原因。另外,本研究中红秆寒竹和茶竿竹对应的基因组大小分别为(5.38±0.97 )和(4,82±0,54) pg,比ZHOU等 [ 19 ] 研究的2个竹种的基因组略大。这种差异可能是由于染色时间不同而造成的。本研究表明:染色时间对竹类植物基因组大小测定结果存在一定影响,且不同竹种对染色时间要求并不完全相同,大部分竹种的细胞核可以被快速染色,如红秆寒竹、美丽箬竹及曙筋矢竹等1 Minute即可达到5

7 min才可达到最大荧光值。ZHOU等 [ 19 ] 对竹类植物基因组大小进行分析过程中,所有竹种均采用相同的染色时间,这可能是造成这种差异的主要原因。

[ 24 - 25 ] :①对照物种已测序,且基因组大小与待测物种基因组大小间存在显著差异,以便区分对照峰和样品峰;②对照样品与待测样具有一定的生物学相似性;③ [ 10 , 14 - 15 ]竹 种 在 经过 长时间, 长距离 运输 后, 部分 材料 萎蔫 或者 细胞核 结构 改变 已达 不到 实验 要求. 为了 检测 不同 对照 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 是否 存在 影响, 本 研究 尝试 同时 利用 水稻 和 毛竹2种参照所获基因组大小十分接近,但由于毛竹基 因 组 大小 与 待测 竹 种 黄皮 刚 竹, 黄皮 绿 筋 竹, 茶 竿 竹 及 唐 竹 等 竹 种 的 基因 组 相差 较小, 因此 测量 过程 中 对照 毛竹 的 峰 和 待测 竹 种 的 峰 间 存在 较大区域的重叠和干扰。水稻与竹类植物同属禾本科Poaceae,其种子通过催芽2

2个基本类型。根据分布区域,木本竹种又分为温带木本竹种和热带木本竹种2个类型 [ 11 , 26 ]温带木本竹种染色体数目比较稳定,基本上为2n=48(2n2倍),热带木本竹种染色体数目表现比较复杂,主要有2n=64,2n=70±2,2n=96,2n=104等多种类型 [ 19 , 27 - 29 ] 。本研究所分析的12个木本竹种中,孝顺竹和柳叶细竹为热带木本竹种,黄皮刚竹、黄皮绿筋:12个木本竹种基因组大小与2个竹种染色体数目多于另外10个温带木本竹种,但基因组大小却明显小于温带木本竹种,这与一些温带竹种[ 16 , 18 - 19 , 25 ] :竹类植物是异源多倍体植物,基因组主要分为A、B、C和D等4个C基因组竹种分别与B和D基因组竹种杂交形成染色体组类型分别为BBCC和CCDD的异源四倍体竹种(2n=48),之后A基因组竹种又与基因组类型为BBCC的异源四倍体竹种杂交形成染色体组类型为AABBCC的异源六倍体竹种(2n=72) [ 14 ] :黄皮刚竹、黄皮绿筋竹、唐竹、花叶唐竹、茶竿竹、平安竹、曙筋矢竹、花叶赤竹、美丽箬竹及红秆寒竹等温带竹种虽然染色体数目相同,但基因组大小却存在较大差异,2C3.76

5,73 pg,相差近1,52倍。这些竹种中,刚竹属的黄皮刚竹和黄皮绿筋竹对应的基因组大小分别为(3,76±1,51)和(3,91±0,95) pg,明显小于其他竹属 中 的 一些 竹 种. 另外, 唐 竹 属, 矢 竹 属, 赤 竹 属, 箬竹 属 及 寒竹 属 中 的 一些 竹 种 在 基因 组 大小 上 差异 不大, 特别 是 花叶 刺 竹, 美丽 箬竹 及3个竹种基因组大小十分接近。因此,根据12个不同竹种的基因组大小测定结果推测,赤竹属、箬竹属及寒竹属等属竹种在染色体组组成类型上可能相同或Ich

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Diskussion

Unsere Analyse zeigt, dass FCM genaue Daten zur Basenzusammensetzung liefert, die mit den Ergebnissen unabhängiger biochemischer Methoden korreliert sind. Obwohl wir nicht feststellen konnten, ob die beobachteten Unterschiede zwischen den FCM- und TMA-Schätzungen durch eine methodische Verzerrung von entweder FCM oder TMA verursacht wurden, war die beobachtete Differenz von C. 2% des geschätzten GC-Gehalts liefert eine praktische Abschätzung der Auflösungsgrenzen von FCM-Daten, die aus Messungen phylogenetisch entfernter Spezies mit einer bisher unbekannten Genomstruktur erhalten wurden. Diese Vorhersage beruhte insbesondere auf den Ergebnissen eines sorgfältig konzipierten Experiments, bei dem für alle Messungen ein individueller Standard verwendet wurde und die Messungen mit denselben Instrumenten und innerhalb weniger aufeinanderfolgender Tage durchgeführt wurden. Bei Änderungen dieses Designs und der Einführung anderer Quellen für mögliche Verzerrungen kann die Abweichung gelegentlich zunehmen. Unsere bisherigen Erfahrungen mit GC-Gehaltsmessungen in zahlreichen Taxa, einschließlich diverser Akzessionen verschiedener Oryza Arten ( marda et al., 2008 P. marda et al., unveröffentlicht), weist darauf hin, dass diese Verzerrung größtenteils methodischen Ursprungs wäre, während biologische Faktoren, wie das mögliche Vorhandensein intraspezifischer Variationen, nur einen sehr geringen Einfluss auf die Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Schätzungen des GC-Gehalts der Arten haben würden.

Unsere Experimente ergaben, dass die am besten geeignete DAPI-Bindungslänge für die FCM-Messungen des GC-Gehalts etwas weniger als 4 beträgt, was innerhalb der Grenzen der DAPI-Bindungslängen (zwischen 3 und 4) liegt, die im Allgemeinen in experimentellen Oligonukleotidstudien vorhergesagt werden (siehe Einführung). Trotz der allgemeinen Unsicherheit bezüglich des genauen Wertes der Bindungslänge des verwendeten AT-spezifischen DAPI hatte die Änderung dieses Parameters einen begrenzten Einfluss auf die untersuchten Pflanzen-GC-Gehaltsbereiche und auf die allgemeine Übereinstimmung zwischen den mit FCM und anderen alternativen Methoden erhaltenen Schätzungen. Daher könnte die von Barow & Meister (2002) empfohlene DAPI-Bindungslänge von 4 immer noch als universelle und ausreichend robuste Näherung verwendet werden, die eine zuverlässige FCM-Analyse des GC-Gehalts bei einer Vielzahl von Pflanzenarten ermöglicht. Dennoch ist beim Vergleich entfernt verwandter Taxa mit extrem unterschiedlichen Genomzusammensetzungen und GC-Gehalten, bei denen die Verwendung der richtigen Bindungslänge von erheblicher Bedeutung sein kann, noch einige Vorsicht geboten. Solche Unterschiede sind beispielsweise beim Vergleich von Pflanzengenomen mit isochore strukturierten Genomen warmblütiger Wirbeltiere zu erwarten (z. B. Mensch, Maus und Huhn Eyre-Walker & Hurst, 2001 Constantini et al., 2009 ), die daher derzeit nicht als sichere Referenzstandards für die Berechnung des pflanzlichen GC-Gehalts mit FCM empfohlen werden können. Dies ist ein kritischer Punkt, da die derzeit in FCM verwendeten Standards für die Berechnung der Basenzusammensetzung auf dem Vergleich mit der Sequenz von Mensch oder Huhn basieren ( Doležel et al., 1992 Marie & Brown, 1993 Barow & Meister, 2002 Doležel & Greilhuber, 2010 ) und die Auswirkung der unterschiedlichen Basenmusterung auf die resultierenden GC-Gehaltsschätzungen für Pflanzenreferenzstandards ist nicht bekannt. Da der Einfluss des GC-Gehalts des Standards für die korrekte Abschätzung des GC-Gehalts in Pflanzen wichtiger zu sein scheint als die Kenntnis der Bindungslänge, bevorzugen wir die Berechnung des pflanzlichen GC-Gehalts mit FCM auf Basis von O. sativa„Nipponbare“ (GC = 43,6%) als primärer Referenzstandard. Vier verschiedene Gruppen ( Vij et al., 2006 ) unabhängig voneinander sequenziert O. sativa‚Nipponbare‘ und C. 95 % seiner genomischen Sequenz sind bekannt, einschließlich der Zahl der sich stark wiederholenden Zentromer-Regionen ( International Rice Genome Sequencing Project, 2005 ), die in „vollständigen“ Genomprojekten, die in anderen Pflanzen durchgeführt werden (z. B. in Arabidopsis Bennett et al., 2003 Meister, 2005 ).

Im Gegensatz zu der großen Variation der FCM-Messungen, die durch den Vergleich phylogenetisch entfernter Arten mit kontrastierenden Genomorganisationen erhalten wurden, ist das Experiment mit Oryza und einige unserer früheren Analysen mit verwandten Grasarten ( Šmarda et al., 2008 ) zeigte deutlich, dass FCM eine empfindliche Methode ist, die den Nachweis kleiner Unterschiede im GC-Gehalt zwischen eng verwandten Taxa mit ähnlichen Genomstrukturen und wahrscheinlich ähnlichen Basenmustern ermöglicht. Bei Vergleichen zwischen eng verwandten Arten, bei konsistenter Verwendung eines einzigen Standards, könnte die Auflösung von FCM in der Größenordnung von Zehntel von GC % liegen. Experimente, bei denen eine Reihe von Proben mit einem einzigen Standard verglichen wird, erfordern keine Kenntnis des GC-Gehalts des Standards, und Schätzungen können einfach nur mit dem Farbstofffaktor berechnet werden, was die Verwendung jeder Spezies als Standard ermöglicht ( Barow & Meister, 2002 Meister & Barow, 2007). Somit scheint die Berechnung des absoluten GC-Wertes ein technisches Problem zu sein, das einen Forscher nicht daran hindern sollte, Rückschlüsse auf die Bedeutung der beobachteten Basenzusammensetzungsvariation zu ziehen, selbst wenn der genaue GC-Gehalt des Standards unbekannt bleibt.

Die Erforschung der Basenzusammensetzung hat in der mikrobiologischen Forschung eine lange Tradition, in der die Basenzusammensetzung ein wesentliches Klassifizierungskriterium darstellt ( Stackebrandt & Liesack, 1993 Stackebrandt et al., 2002 ) und ist, ähnlich wie die Genomgröße, ein wichtiger Prädiktor für die Artenökologie ( Rocha & Danchin, 2002 Musto et al., 2006 Mann & Phoebe-Chen, 2010). Ähnliche Forschungen zum Ausmaß und zur Dynamik der Genom-Evolution in Bezug auf die Basenzusammensetzung (DNA-Qualität) und ihre Bedeutung für die Ökologie und Artenverteilung fehlen bei Pflanzen aufgrund des Fehlens ausreichender Daten zur DNA-Basiszusammensetzung. Daher bietet FCM ein nützliches Werkzeug für die zukünftige Vervollständigung von Basenzusammensetzungsdaten in Pflanzen und die Aufklärung der evolutionären Dynamik der Basenzusammensetzung und ihrer biologischen Relevanz.

Unsere aktuellen FCM-Daten zum GC-Gehalt stellen sowohl den niedrigsten als auch den höchsten GC-Gehalt dar, der in Gefäßpflanzen beobachtet wurde (Tabelle 1) und zeigen, dass der Bereich des GC-Gehalts in Monokotyledonen mindestens 14% beträgt. Diese breite Spanne resultiert teilweise aus dem extrem hohen GC-Gehalt, der für Gräser gefunden wurde, im Einklang mit allen früheren FCM-Studien (Barow & Meister, 2002 Meister & Barow, 2007) und Sequenzdaten (vgl. Šmarda & Bureš, 2012). Der extrem hohe GC-Gehalt von Poaceae steht im Einklang mit dem ungewöhnlichen Muster der GC-Zusammensetzung der Grasgene ( Kuhl et al., 2004 Guo et al., 2007 ) und die Aufklärung der Selektionskräfte, die die Funktion dieser Gene vermitteln, könnten dazu beitragen, unser Wissen über die Funktion des GC-Gehalts signifikant zu verbessern (Šmarda & Bureš, 2012). Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass diese globalen Anstiege des GC-Gehalts mit einer intragenomischen Divergenz in der Genregulation und einer allgemeinen Verbesserung der Stressreaktion zusammenfallen könnten ( Tatarinova et al., 2010 ), die für den extremen evolutionären Erfolg von Gräsern in modernen geologischen Zeiten mitverantwortlich sein könnten ( Šmarda & Bureš, 2012 ). Studien an Bakterien- und Wirbeltiergenomen haben mehrere Hypothesen über die treibenden Kräfte der DNA-Basenzusammensetzung und die Auswirkungen vorgeschlagen, die sich ändernde GC-Gehalte auf die Artenökologie haben können (Übersicht in Šmarda & Bureš, 2012). Eine der am häufigsten diskutierten Hypothesen ist die Thermostabilitätshypothese, die aufgrund der höheren thermischen Stabilität von GC- gegenüber AT-reicher DNA eine erhöhte Toleranz von GC-reichen Organismen für höhere Temperaturen vorschlägt ( Galtier et al., 1999 Vinogradov, 2003 Musto et al., 2006 Bernardi, 2007 Bucciarelli et al., 2009). Aufgrund der Tatsache, dass die Synthese von GC-Basenpaaren energetisch anspruchsvoller ist ( Rocha & Danchin, 2002 ), können beispielsweise schnell wachsende Organismen bevorzugt aus AT-Nukleotiden aufgebaut sein, die kostengünstiger und leicht zu synthetisieren sind. und eine Abnahme des genomischen GC-Gehalts (im Vergleich zu nahen Verwandten) könnte bei parasitären und schnell wachsenden Arten, Arten mit extrem großen Genomen oder Arten, die in ressourcenbegrenzten Umgebungen leben (z & Bureš, 2012). Es wäre sinnvoll, diese Hypothesen in naher Zukunft an Pflanzen zu testen.

Die Messung des GC-Gehalts ist für Labore, die FCM-Messungen des DNA-Gehalts durchführen und die über mindestens zwei unabhängige Anregungslichtquellen verfügen (in demselben enthalten oder auf verschiedenen Durchflusszytometern angeordnet), leicht zugänglich. Die FCM-Messung des GC-Gehalts erfordert nur geringfügige Änderungen der Standardverfahren für DNA-Gehaltsmessungen und stellt die gleichen Anforderungen an die Gewebequalität und -quantität (vgl. Doležel et al., 2007 Greilhuber et al., 2007). Die einzigen Unterschiede bestehen in der Verwendung eines anderen basenspezifischen Farbstoffs ( Barow & Meister, 2002 ) und der Probenmessung in einem separaten Durchflusszytometer parallel zum Standardverfahren der DNA-Gehaltsmessung. Unsere Modifikation dieses Verfahrens für die Zwecke der GC-Gehaltsmessungen besteht nur darin, die Probe und den Standard für beide Farbstoffe zusammen in einer einzigen Petrischale zu zerkleinern und die entsprechenden Ergebnisse paarweise zu berechnen (anstatt die Mittelwerte von DAPI- und PI-Messungen über mehrere Tage), was dazu beiträgt, die möglichen Auswirkungen von Sekundärmetaboliten und die täglichen Schwankungen der Instrumente/Bediener zu begrenzen. Angesichts der Einfachheit der eingesetzten Modifikationen und der damit erreichten Reduzierung des Zeitaufwands für die Durchführung der Messungen und der damit verbundenen Kosten hoffen wir, dass die Messung des GC-Gehalts in Pflanzen durch FCM in naher Zukunft eine breitere Anwendung finden wird .


Analyse von Pflanzengenomgrößen mittels Durchflusszytometrie: eine Fallstudie, die den dynamischen Bereich und die Messlinearität demonstriert

Durchflusszytometer wurden ursprünglich entwickelt, um mit Zellsuspensionen, prototypisch Blutzellen, zu arbeiten, und die meisten Anwendungen beinhalten immer noch Proben dieses Typs. Trotz der Tatsache, dass Pflanzenzellen und ihre Protoplasten im Allgemeinen größer sind als Säugerblutzellen, können diese Zellen immer noch durchflusszytometrisch analysiert werden. In den meisten Wachstumsstadien bestehen höhere Pflanzen aus Geweben und Organen, komplexen dreidimensionalen Zellverbänden, die von Zellwänden zusammengehalten werden. Folglich müssen Pflanzen vor der Analyse zunächst verarbeitet werden, um Zellsuspensionen herzustellen, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind. Ein Ansatz besteht darin, die Zellwände mit Hilfe von Enzymen aufzulösen, die ihre Kohlenhydratbestandteile hydrolysieren, um Protoplasten freizusetzen, die dann einfach auf dem Zytometer analysiert werden können.

Der zweite Ansatz, der hier mit dem CytoFLEX beschrieben wird, beinhaltet die Analyse nicht von Protoplasten, sondern von Kernsuspensionen, die aus Pflanzengeweben und -organen durch ein einfaches Hackverfahren freigesetzt werden (2). Das Verfahren beinhaltet das Aufschneiden der Zellen innerhalb des Gewebes mit einer standardmäßigen zweischneidigen Rasierklinge. Das Homogenisat wird unter Verwendung eines Nylonmaschenfilters geklärt, durch den die freigesetzten Kerne geleitet werden. Anschließend werden die Kerne mit DNA-spezifischen Fluorochromen gefärbt, was eine durchflusszytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts der einzelnen Kerne ermöglicht. Das Interesse an der Messung von Pflanzengenomgrößen ergibt sich aus der Beobachtung, dass höhere Pflanzen, wenn sie artenübergreifend analysiert werden, einen außergewöhnlich großen Bereich an Genomgrößen aufweisen: eine aktuelle Untergrenze von etwa 0,13 pg pro 2C-Kern für Genlisea margaretae bis zu einer Obergrenze von 304,40 pg für Paris japonica (3). Das letztgenannte Genom ist ungefähr 50-mal größer als das menschliche Genom, und die DNA einer einzelnen Zelle von Paris japonica würde, wenn sie ausgestreckt ist, ungefähr 91 Meter lang sein.

Die Durchflusszytometrie in Verbindung mit dem Chopping-Verfahren bietet ein einfaches Mittel zur Bestimmung der Genomgröße, das allgemein für alle Arten anwendbar ist, und die Methodik wurde weltweit weit verbreitet, um zahlreiche Probleme in der grundlegenden und angewandten Biologie, Ökologie und Landwirtschaft anzugehen. Dazu gehören Anwendungen in der Biotechnologie, wie die Überwachung der genetischen Stabilität nach Transformation und Gewebekultur, die Priorisierung von Arten für die Sequenzierung des gesamten Genoms, die Validierung der Vollständigkeit ganzer Genomanordnungen und die Bereitstellung einer geeigneten Planung für gentechnische Verfahren wie die Herstellung von DNA-Bibliotheken. Anwendungen in der Landwirtschaft, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Produktion von haploiden und dihaploiden Linien unter Verwendung von Antheren-/Eierstockkulturen, gefolgt von einer Colchicinverdopplung, die Produktion von samensterilen triploiden Linien, die Produktion von Pflanzen mit tetraploiden und höheren Ploidiegraden, verbunden mit gewünschten Merkmalen wie Fruchtgröße, Qualitätskontrolle des Euploidie-Status für kommerzielle Saatgutpartien, Identifizierung von Individuen mit neuartigen Ploidiegraden und mit neuartigen Reproduktionsmodi (einschließlich Apomixis), Charakterisierung interspezifischer Hybridisierung basierend auf intermediären nuklearen DNA-Gehalten, Klassifizierung von Ploidieverteilungen innerhalb von Keimplasmasammlungen, Geschlechtsbestimmung bei zweihäusigen Pflanzen und Identifizierung von Hybriden, die zwischen Wildarten und zwischen Wild- und Kulturarten gebildet werden.

Anwendungen in der Pflanzenanatomie, Zellbiologie, Physiologie und Entwicklung, die von der Durchflusszytometrie profitieren, umfassen die Untersuchung der Regulation des Zellteilungszyklus und der Endoreduplikation in der Pflanzenentwicklung sowie die Auswirkungen von abiotischem und biotischem Stress auf diese Prozesse. Die Durchflusszytometrie hat auch zu weit verbreiteten Untersuchungen des Konzepts des Nukleotyps geführt, dh der phänotypischen Wirkung der Menge der nuklearen DNA, unabhängig von ihrem kodierten Informationsgehalt, auf das Kernvolumen, die Anteile des von Chromosomen besetzten Kerns, die Dauer der Mitose und Meiose, Samengröße und die minimale Generationszeit. Die Durchflusszytometrie ist auch nützlich zum Nachweis von Mixoploidie und Chimärismus. Die Analyse der Genexpression als Funktion des Zelltyps unter Verwendung von durchflusssortierten Kernen wird zunehmend als ein wichtiges Forschungsgebiet anerkannt. In der Taxonomie und Systematik ist die Durchflusszytometrie von unschätzbarem Wert beim Screening auf Reproduktionsmodi, Identifizierung von Artbildung und reproduktiver Isolierung, Beschreibung der Populationsdynamik in Hybridzonen, Entdeckung neuer Zytotypen und Zytotypstruktur über große Populationen, Nachweis und Abgrenzung von Pflanzen Arten für Biodiversität und Erhaltung, Studien über die Mechanismen der Evolution des Pflanzengenoms, die sich auf die Ursachen und Folgen der Variation des nuklearen DNA-Gehalts konzentrieren, und Informationen zur Evolution, die aus der Untersuchung des nuklearen DNA-Gehalts über verschiedene Phylogenien hinweg stammen. Groß angelegte vergleichende Analysen der Genomgröße können auch verwendet werden, um Korrelationen zwischen Genomgröße und Umweltfaktoren, zwischen Genomgröße und Samenmasse, zwischen Genomgröße und Artenreichtum über verschiedene Pflanzengruppen hinweg zu untersuchen, mit dem Hinweis, dass Arten mit großen Genomen anfälliger für das Aussterben, zwischen Genomgröße und invasivem Potenzial und zwischen ökologischer Nische und minimaler Genomgröße (insbesondere fleischfressende Pflanzen).

Als Folge des rasch steigenden Interesses an durchflusszytometrischen Analysen dieser Art und der immer größeren Zahl von Arten, für die Daten veröffentlicht werden, haben sich durchsuchbare Repositorien als wertvolle Ressource für die Zuordnung von DNA-Inhalten zu Genomgrößen herausgebildet, durch Bereitstellung von Kalibrierungsbeziehungen, wobei der Konsens auf Crowd-Sourcing-Methode angegangen wird. Eine der wichtigsten dieser Ressourcen ist die von Experten kuratierte Kew-C-Wert-Datenbank, die Werte des nuklearen DNA-Gehalts in Abhängigkeit von Gattung und Art in durchsuchbarer Form über das Internet bereitstellt (3). Kuratoren definieren auch &ldquoGold-Standard&rdquo nukleare DNA-Gehaltswerte, von denen angenommen wird, dass sie genauer und reproduzierbar sind (3). Insgesamt sind durchflusszytometrische Schätzungen des nuklearen DNA-Gehalts vergleichbar mit den Größen von Aggregaten aus der Sequenzierung des gesamten Genoms, obwohl das Vorhandensein stark repetitiver chromosomaler DNA typischerweise zu niedrigeren Schätzungen der Genomgröße führt, die aus sequenzbasierten Ansätzen erhalten werden. Es wurden verschiedene Faktoren identifiziert, die die durchflusszytometrische Kalibrierung durcheinander bringen können und vermieden werden können. Zum Beispiel ist die Bindung und die resultierende Fluoreszenz einiger DNA-spezifischer Fluorochrome Basenpaar-spezifisch und daher kein echtes Maß für die DNA-Menge über Spezies hinweg, die Kerngenome mit unterschiedlichen AT:GC-Verhältnissen aufweisen.

In diesem Protokoll verwenden wir Propidiumiodid (PI) als DNA-Fluorochrom. In Gegenwart von Ribonuklease, um Beiträge zur Fluoreszenz durch doppelsträngige RNA zu eliminieren, interkaliert PI die DNA-Doppelhelix und erzeugt eine intensive Fluoreszenz mit einem Anregungsmaximum bei etwa 535 nm und einem Emissionsmaximum bei 617 nm. Das Emissionsprofil ist relativ breit mit einer maximalen spektralen Breite von 50%, die ungefähr 100 nm (590-690 nm) überspannt.

PI wurde verwendet, um den DNA-Gehalt von vier Arten zu bestimmen: Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand), Solanum lycopersicum (Tomate), Zea mays (Mais) und Capsicum annuum (Pfeffer). Die zur Präparation der Arabidopsis- und Capsicum-Proben verwendeten Organe veranschaulichen das interessante Phänomen der Endoreduplikation, bei der somatische Zellen ohne dazwischenliegende Mitose in aufeinanderfolgende Runden der Genomreplikation (S-Phase) eintreten (4). Dieser endozyklische Prozess führt zu Polyploidie, die bei Pflanzen häufig vorkommt (7).

Abbildung. Durchflusszytometrie misst effektiv die Endoreplikation in Pflanzenzellen. Das rechte Bild zeigt verschiedene Arten der mitotischen Genreplikation während des Zellzyklus. Diese Ereignisse führen zu polyploiden Geweben. Auf der linken Seite ist der Arbeitsablauf zur Präparation von Pflanzengewebe durch Durchflusszytometrie dargestellt, einschließlich der Daten, die die Ergebnisse des mitotischen Endocyclings angeben.


Schau das Video: Flow Cytometry (Kann 2022).