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Wie funktioniert ein TOPflash/FOPflash-Assay zum Nachweis der Beta-Catenin-Proteinexpression?

Wie funktioniert ein TOPflash/FOPflash-Assay zum Nachweis der Beta-Catenin-Proteinexpression?


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Ich lese einen Artikel (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3596711/), in dem ein TOPflash/FOPflash-Assay verwendet wird, um Beta-Catenin-Proteinspiegel in einer COS-7-Zelllinie nachzuweisen. Ich kann weder in dem Artikel noch in einem anderen Artikel eine gute Erklärung finden, wie dieser Assay funktioniert. Ich verstehe, dass die Zellen mit TOPflash/FOPflash-Reporterplasmiden transfiziert sind, aber das war es auch schon. Jede Einsicht oder Umleitung wäre sehr dankbar.


Soweit ich verstehen kann, ist TOPflash ein Luciferase-Reporterplasmid, das zwei Sätze von 3 Kopien der Wildtyp-TCF-Bindungsregionen enthält. Wenn die kanonische Wnt-Signalgebung aktiviert wird, wird Beta-Catenin in den Zellkern translozieren, um mit TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren zu assoziieren, um die Transkription von Wnt-Zielgenen zu aktivieren. Da es sich um ein Luciferase-Plasmid handelt, sollten Sie bei Zugabe von Substrat einen Anstieg der relativen Luciferase-Aktivität feststellen. Wenn die Wnt-Signalgebung gehemmt ist, werden Sie einen Verlust der Luciferase-Expression feststellen. Der FOPflash wird als Negativkontrolle verwendet, da die TCF-bindenden Regionen stromaufwärts des Luciferase-Gens mutiert sind. Selbst wenn Beta-Catenin in den Zellkern transloziert, um die TCF-vermittelte Transkription zu aktivieren, sollten Sie keine Luciferase-Aktivität sehen.

Hoffe das hilft.


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