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Was verhindert die Translation des negativen Strangs der viralen genomischen RNA mit negativem Sinn?

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Einige RNA-Viren enthalten Negativ-Sense-RNA. Dann verwenden sie diese Negativ-Sense-RNA, um Positiv-Sense-RNA herzustellen, die dann in Protein übersetzt wird.

Meine Frage ist, was die Translationsmaschinerie der Zelle daran hindert, den negativen Strang in Protein zu übersetzen? Gibt es ein Signal, das darauf hinweist, dass es sich um einen negativen Strang handelt?


Baltimore-Klassifizierungssystem

  • 1971 stellte der mit dem Nobelpreis ausgezeichnete Virologe David Baltimore erstmals die Baltimore-Klassifikation des Virus vor. Das Baltimore-Klassifizierungssystem gilt als das am häufigsten verwendete System zur Virusklassifizierung.
  • Dieses Klassifikationssystem unterteilt die Viren in sieben Gruppen, basierend auf ihrer Art der Boten-RNA-Synthese (mRNA). In dieser Klassifikation wurden die Viren basierend auf ihrer Art der mRNA-Synthese während des Replikationszyklus des Virus organisiert.
  • Das Baltimore-Klassifikationssystem konzentriert sich auf einige wichtige Merkmale von Nukleinsäuren, wie z oder negativer Sinn.

Togaviren: Struktur und Replikation | Mikrobiologie

In diesem Artikel werden wir uns mit der Struktur und Replikation von Togaviren befassen.

Struktur von Togaviren:

Das Virus ist umhüllt und bildet kugelförmige Partikel mit 65-70 nm Durchmesser. Es enthält ein ikosaedrisches Kapsid, das aus 240 Monomeren besteht (Abb. 17.26). Es hat eine Triangulationszahl von (74). Die Hülle besteht aus 80 Trimer-Spikes, die Dimension jedes Spikes beträgt 3xE1/E2-Heterodimere. Die Spikes bestehen aus Glykoprotein, das als Bindungsproteine ​​an den Rezeptor der Wirtszellmembran fungiert.

Das Capsid besteht aus einer einteiligen, einzelsträngigen, (+) Sense, nicht segmentierten RNA von etwa 11,7 kb Länge (bestehend aus etwa 10.000-12.000 Nukleotiden). Es macht 4-8 % des Gesamtgewichts der Partikel aus. Der 5′-Terminus trägt eine methylierte Nukleotidkappe (5’cap) und der 3′-Terminus hat einen polyadenylierten Schwanz (3′ Poly-A) oder ein genomgebundenes Protein (VPg), daher ähnelt sein Genom dem von zelluläre mRNA (Abb. 17.27).

Replikation von Togaviren:

Das Virus bindet über das E-Glykoprotein an die Wirtsrezeptoren. Danach erfolgt die Fusion der Virusmembran mit der Vesikelmembran. Folglich wird das Virus in der Wirtszelle in Vesikel endozytiert. Das RNA-Genom wird in das Zytoplasma freigesetzt. Nach Eintritt in die Zelle erfolgt die Genexpression und Replikation im Zytoplasma (Abb. 17.28).

Die Virion-RNA ist infektiös und dient sowohl als Genom- als auch als virale Boten-RNA (Abb. 17.29). Das gesamte Genom wird in ein nicht-strukturelles (NS) Polyprotein übersetzt, das von Wirts- und viralen Proteasen prozessiert wird. Strukturelles Polyprotein wird durch eine subgenomische mRNA exprimiert (Abb. 17.29).

Charakteristischerweise gibt es zwei Translationsrunden: (+) Sense genomische RNA (󈧵S’ = 11,7kb) wirkt direkt als mRNA und wird teilweise translatiert (5′ Ende) um NS-Proteine ​​zu produzieren. Diese Proteine ​​sind für die Replikation verantwortlich und bilden einen komplementären (-) Sense-Strang (cRNA) als Matrize für die weitere (+) Sense-Strang-Synthese.

Folglich werden zwei Arten von (+) RNA synthetisiert, genomische RNA voller Länge und subgenomische mRNA (󈧞S’ = 4,1 kb). Die Translation der neu synthetisierten subgenomischen RNA führt zur Produktion von Strukturproteinen vom 3. Ende des Genoms (Abb. 17.29).

Die Replikation findet im Zytoplasma des Wirts statt, das an der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums auftritt. Unter Verwendung der genomischen RNA als Matrize wird eine einzelsträngige komplementäre RNA (cRNA) mit negativem Sinn synthetisiert. Sowohl neue genomische RNA als auch subgenomische RNA werden unter Verwendung der Negativ-Sense-RNA als Matrize synthetisiert.

Subgenomische RNA wird in Strukturproteine ​​übersetzt. Die Virusassemblierung erfolgt am endoplasmatischen Retikulum. Die Virionknospen am endoplasmatischen Retikulum werden zum Golgi-Apparat transportiert. Der Zusammenbau erfolgt auf der gesamten Zelloberfläche, und die Hülle wird erworben, wenn das Virus aus der Zelle knospt. Freisetzung und Reifung fast gleichzeitig und dann Knospung von der Zellmembran (Abb. 17.30).


SOJ | Zeitschrift für Virologie und Retrovirologie | Uneingeschränkter Zugang

Reverse Genetik, eine Technik, die verwendet wird, um spezifische Mutationen in virale Genome zu erzeugen, wurde zuerst für DNA-Viren durchgeführt, entweder durch Transfektion von Zellen mit Plasmiden, die das virale Genom kodieren, oder durch heterologe Rekombination von Plasmiden, die virale Sequenzen mit dem Virusgenom tragen [1,2]. Ihnen folgten Manipulationen von RNA-Genomen mit positivem Sinn. Die Transfektion von Plasmiden oder RNA, die von Plasmiden transkribiert wurde, die das Poliovirus-Genom enthielten, in anfällige Zellen führte zur Gewinnung des infektiösen Poliovirus [3,4]. Allerdings waren die Genome von Negativ-Sense-RNA-Viren im Vergleich zu DNA- und Positive-Sense-RNA-Viren für künstliche Manipulationen weniger zugänglich. Im Gegensatz zu Positiv-Sense-RNA-Viren, deren Genom auch eine funktionelle Boten-RNA (mRNA) ist, kann die nackte genomische RNA eines Negativ-Sense-RNA-Virus keine Infektion auslösen, wenn sie in einer permissiven Zelllinie exprimiert oder transfiziert wird . Ihre Genome sind das Komplement der mRNA und können daher nicht direkt in virale Proteine ​​übersetzt werden, ohne zuvor in komplementäre mRNA kopiert zu werden (Abbildung 1). Das minimal infektiöse Partikel ist der transkriptionell aktive Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, der aus der genomischen viralen RNA (vRNA) komplexiert mit dem viralen Nukleoprotein (NP) und dem RNA-abhängigen RNA-Polymeraseprotein besteht. Die virale RNA-Polymerase ist für die Transkription sowohl der mRNA als auch der komplementären, positiv-sinnigen Antigenom-RNA-Matrize essentiell, da tierische Zellen kein solches Enzym besitzen. Diese Funktion muss im Input-Virion präformiert bereitgestellt werden, da genomische RNA allein keine Infektion auslösen kann. Darüber hinaus unterscheidet sich die mRNA von der positiven komplementären RNA-Zwischenstufe, die für die Replikation verwendet wird, dadurch, dass sie 3'-verkürzt ist. Infolgedessen enthält die mRNA nicht alle viralen spezifischen Informationen, die für die Produktion neuer Genome erforderlich sind, und kann nicht als Matrize für die Transkription dienen.

Viren mit vollständig oder überwiegend negativem RNA-Genom umfassen sieben Virusfamilien: die nicht segmentierten Bornaviridae, Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, und Filoviridae, und das segmentierte Arenaviridae (2 Segmente), Bunyaviridae (3 Segmente) und Orthomyxoviridae (6-8 Segmente). Zu diesen Virusfamilien gehören eine Reihe von humanen und tierischen Krankheitserregern wie Influenza, Masern, Mumps, Tollwut, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Lassa, Ebola, Marburg,

Hundestaupe, humane Parainfluenza und Hantavirus. Die Gewinnung infektiöser Negativ-Sense-RNA-Viren aus klonierten komplementären DNAs (cDNAs) in den 1990er Jahren gehörte zu den wichtigsten Durchbrüchen in der RNA-Virologie Gene und ihre Produkte. Die Reverse-Genetik-Technologie eröffnete die Möglichkeit, Gene zu löschen, um ihre Funktion zu untersuchen, Mutationen einzuführen, um genetische Virulenzfaktoren zu bestimmen und heterologe virale Expressionsvektoren für Impfstoffe und Gentherapie zu entwickeln.

In der vorliegenden Übersicht verwenden wir IAV als Modellsystem, um die Errungenschaften bei der Entwicklung dieser Technologie für Negativ-Sense-RNA-Viren zusammenzufassen. Jedes Jahr bringen IAV-Infektionen 3-5 Millionen Menschen ins Krankenhaus, was zu erheblicher Morbidität, Mortalität und wirtschaftlichen Belastungen führt. Mehrere Anwendungen rekombinanter IAV-Viren sowie anderer viraler Systeme werden skizziert.

Die Rekonstitution von RNPs mit synthetischen oder gereinigten vRNAs wurde zur Grundlage für die Gentechnik des Influenzavirus. In den isolierten RNPs sind der Polymerasekomplex und NP mit der vRNA assoziiert. Um gentechnisch veränderte Viren zu erzeugen, muss synthetische RNA zu replikationskompetenten RNPs zusammengebaut werden. In vitro Die Rekonstitution von RNPs führte zur Transkription einer synthetischen RNA-Matrize und, was noch wichtiger ist, von aus Virionen gereinigten vRNAs voller Länge [5-7]. Hondaet al. [8] isolierten RNPs und trennten die RNA-Polymerase-RNA-Fraktion von NP durch differentielle Zentrifugation isolierter RNP-Kerne durch einen diskontinuierlichen CsCl-Glycerin-Gradienten. Der RNA-Polymerase-RNA-Komplex konnte die RNA-Synthese initiieren, war jedoch nicht in der Lage, RNA in voller Länge zu synthetisieren, es sei denn, NP wurde der Reaktion zugesetzt, was darauf hindeutet, dass der Polymerase-Komplex ausreicht, um die RNA-Synthese zu initiieren, während NP für die Verlängerung der RNA benötigt wird Abschrift. Inkubation von nackter RNA des Influenzavirus, entweder transkribiert von Plasmiden in vitro oder gereinigt durch Phenolextraktion mit freien NP/Polymerase-Fraktionen führte zur Bildung von transkriptionell aktiven Komplexen [8].

Luytjeset al. [9] entwickelten das erste System, um Influenzaviren zu modifizieren, indem sie ein Plasmid konstruierten, das die kodierende Region für die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) anstelle des NS-Gens in der Antisense-Orientierung enthielt, flankiert von den 3'- und 5'-untranslatierten Regionen (UTRs) von die vRNA des Influenzavirus-Segments acht (Abbildung 2). Diese Kassette wurde von einem T7-RNA-Polymerase-Promotor und einer Restriktionsenzymstelle flankiert, die die Produktion von in vitro Transkripte, die ein exaktes virusähnliches 3'-Ende enthalten. In vitro Die Transkription vom T7-Promotor führte zu einem RNA-Molekül, das die terminalen nicht-kodierenden Sequenzen enthielt, die mit denen übereinstimmten, die in Segment 8 des Influenzavirus gefunden wurden und eine Antisense-Kopie des CAT-Gens flankierten. Diese RNA konnte nicht translatiert werden, um aktives CAT-Protein zu ergeben, es sei denn, sie wurde selbst zuerst als Matrize verwendet, um mRNA mit positivem Sinn herzustellen. Da eukaryontische Zellen weder RNA-abhängige RNA-Polymerase- noch CAT-Aktivitäten besitzen, war der neue Ansatz ein sensitives Reportersystem. RNA-Transkripte wurden mit gereinigten NP- und Polymerase-Proteinen gemischt, um die Bildung von RNP-Komplexen zu ermöglichen. Vor oder nach ihrer Transfektion mit RNPs wurden die Zellen mit Helfer infiziert

Influenzavirus, um die für die RNA-Amplifikation erforderlichen viralen Proteine ​​bereitzustellen. Die CAT-Aktivität in Lysaten, die von transfizierten und infizierten Zellen stammten, zeigte die Transkription von vRNA-ähnlichen CAT-Transkripten, um mRNAs zu ergeben. Die rekombinante CAT-RNA wurde nicht nur transkribiert und repliziert, sondern auch in Nachkommen-Viruspartikel verpackt, wie durch die Fähigkeit der Medien aus Transfektionsexperimenten gezeigt wurde, CAT-Aktivität in Zellen nach serieller Passage sogar nach RNase-A-Behandlung zu induzieren. Diese Experimente zeigten, dass die UTRs von Influenzavirus-RNAs alle Signale enthalten, die für die Transkription, Replikation und Verpackung von CAT-vRNA erforderlich sind.

Diese Technik wurde anschließend verfeinert, um Influenzavirus zu erzeugen, das Neuraminidase (NA)-Proteine ​​enthält, die von Plasmid-cDNAs abgeleitet sind [10]. Es beruhte auf der Rekonstitution viraler RNPs aus in vitro-transkribierte RNA und gereinigte NPs. Der Protein-RNA-Komplex wurde in Zellen transfiziert, gefolgt von einer Infektion mit einem Helfer-Influenzavirus mit einem starken gegenselektierbaren Phänotyp, der gut charakterisiert war. Influenzavirus A/WSNHK ist ein Reassortant, das sieben Segmente aus Influenza A/WSN/33 und das NA-Gensegment aus Influenzavirus A/HK/8/86 enthält. Dieses reassortante Virus kann nur dann Plaques in Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK)-Zellen bilden, wenn das Zellkulturmedium mit einer Protease ergänzt wird, während der Elternstamm WSN/33 repliziert und große Plaques bildet, ohne dass exogene Protease erforderlich ist. Das für die Protease-Unabhängigkeit verantwortliche WSN/NA-Segment wurde in Form eines synthetischen RNP geliefert. Die Selektion des Virus, das das synthetische WSN/NA-Segment aus dem Helfervirus enthält, konnte durch Ausschluss von Protease aus dem Zellkulturmedium erreicht werden. Konstrukte wurden hergestellt, um den Plasmidursprung des WSN-Segments zu verifizieren, indem fünf stille Punktmutationen in die NA-Codierungssequenz eingeführt wurden. Der Einbau des synthetischen RNP in das Influenzavirus wurde durch das Vorhandensein von Mutationen in den Viren nachgewiesen, die in Abwesenheit von Protease gewonnen wurden. Dieses System ermöglichte zum ersten Mal eine ortsgerichtete Mutagenese eines IAV-Gens, es war jedoch abhängig von einer Helfervirus-Infektion und einer starken Selektion, die notwendig war, um rekombinante Viren vom Wildtyp-Helfervirus zu unterscheiden. Seit seinem ersten Bericht wurde die RNP-Transfektionsmethode auf verschiedene Weise verbessert oder modifiziert: Kopplung in vitro Transkription mit RNP-Rekonstitution [11] unter Verwendung von Elektroporation anstelle von DEAE-Transfektion [12] Herstellung der NP- und Polymeraseproteine ​​aus infizierten Zellen anstelle von gereinigtem Virus [13] und durch Hinzufügen von nativen RNP-Kernen anstelle von Helferinfluenzaviren [14].

Parallel zu den Bemühungen, eine reverse Genetik mit Influenzavirus durchzuführen, wurden Techniken zur Manipulation der Genome von nicht segmentierten Negativ-Sense-RNA-Viren entwickelt, die oft auf der Transkription von vRNA durch die T7-RNA-Polymerase beruhten. Eine wichtige Errungenschaft wurde von Pattnaik et al. [15], der eine Methode anwendete, die die Rettung von virusähnlichen Partikeln, die vollständig aus cDNA stammen, ohne VSV-Helfervirus ermöglicht. Die einem defekten interferierenden (DI)-Genom entsprechende cDNA wurde unter die Kontrolle des Bakteriophagen-T7-Promotors gestellt, so dass die Transkription am ersten DI-spezifischen Nukleotid beginnen würde. Das 3'-Ende des Transkripts wurde am letzten DI-Nukleotid gespalten, indem das antigenomische Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus (HDV) stromabwärts der DI-RNA angeordnet wurde. Das Ribozym wurde so positioniert, dass die autokatalytische Spaltung DI-Genom-RNA mit den genau erforderlichen Termini freisetzte. Plasmid-abgeleitete RNA wurde erfolgreich produziert in vivo durch Transfizieren dieses Konstrukts in Zellen, die zuvor mit einem rekombinanten Vacciniavirus vTF7-3 als Quelle für T7-Polymerase infiziert waren [16]. Die Co-Transfektion weiterer T7-Konstrukte mit VSV-Genen ermöglichte eine effiziente Verkapselung und Replikation der DI-RNA. In Anwesenheit aller VSV-Gene konnte die DI-RNA in VSV-DI-Partikel verpackt werden, die aus den Zellen knospen [15].

Ein ähnlicher Ansatz wurde später von Schnell et al. [17], der das rekombinante Tollwutvirus erfolgreich wiedergewonnen hat. Diese Autoren kotransfizierten Vacciniavirus-infizierte Zellen mit Plasmiden, die das virale Nukleokapsidprotein (N) und die Polymeraseproteine ​​(L und P) unter der Kontrolle von T7-Promotoren kodieren, zusammen mit einem Plasmid, das eine antigenomische RNA voller Länge unter der Kontrolle des T7-Promotors am 5'-Ende und eines selbstspaltenden Ribozyms am 3'-Ende. Nach Transkription von RNAs von den T7-Promotoren und Translation der kodierten Proteine ​​ordnen sich Nukleokapsidproteine ​​um die antigenomischen RNAs herum, und Polymeraseproteine ​​replizieren dann diese RNPs, um RNPs zu bilden, die genomische RNAs enthalten. Nach Transkription von mRNA aus dem genomischen RNP und Translation wird infektiöses Virus zusammengesetzt. Diese Technik der reversen Genetik wurde von Laboratorien adaptiert, die andere nichtsegmentierte RNA-Viren mit Lese- und Negativsense untersuchten, was zur Rettung von VSV [18,19], Masernvirus [20], RSV [21], Sendai-Virus [22,23], Human führte Parainfluenzavirus 3 [24,25] und Affenvirus 5 [26]. Es wurde angenommen, dass die Synthese einer Positiv-Sense-Anti-Genom-RNA aus cDNA der Schlüssel zur erfolgreichen Virusrettung ist. Diese RNA kann im Gegensatz zu genomischer RNA mit negativem Sinn nicht mit mRNA hybridisieren, die für virale Proteine ​​kodiert, und stört daher nicht die Viruserzeugung. Außerdem kann ein vorzeitiger Abbruch der T7-RNA-Polymerase-Transkription durch Abschnitte von Uridinresten, gefolgt von Haarnadelstrukturen, die in einigen Negativ-Sense-RNA-Viren vorhanden sind, verursacht werden [19].

Es wurden einige Modifikationen an der ursprünglichen Technik vorgenommen, wie die Verwendung von stabil transfizierten Zelllinien, die das T7-RNA-Polymeraseprotein exprimieren, oder eines oder mehrere der viralen Proteine, die für die Genomreplikation erforderlich sind [20]. Kato et al. [23] lieferte den zweiten Bericht über die Gewinnung des Sendai-Virus aus cDNAs. In diesem Bericht wurde das Virus aus transkribierten negativen und positiven Sense-RNAs gewonnen in vivo im Vaccinia-T7-System oder nach der Transkription in das System transfiziert in vitro. Die Effizienz der Gewinnung aus antigenomischen RNA-Konstrukten war viel höher als von Garcin et al. [22]. Diese Ergebnisse wurden erreicht durch: i) Verkürzung des T7-Promotors (durch Entfernen des Guanosintripletts), wodurch ein präzises 5'-Ende zu den viralen RNA-Transkripten bereitgestellt wird, ii) Optimierung der NP-, P- und L-Plasmidverhältnisse und iii) Hemmung der zytopathischen Wirkung von Vaccinia durch Inkubation in Gegenwart von AraC und Rifampicin [23]. Bei den meisten Verfahren wurde die antigenomische RNA mit positivem Sinn im Gegensatz zu der genomischen RNA mit negativem Sinn verwendet. Dies ist wegen eines Antisense-Problems kritisch. Wenn stattdessen das Negativ-Sense-Genom verwendet wird, können mRNAs, die für virale Proteine ​​kodieren, an die nackte genomische RNA hybridisieren und den kritischen Zusammenbau des Genoms in den RNP verhindern [27]. Wie bereits erwähnt, behalten die Negativsense-Viren ihr Genom immer in RNP-Form, wahrscheinlich teilweise, um dieses Antisense-Problem zu vermeiden. Sobald er in RNP-Form vorliegt, kann der positive Strang dann repliziert werden, um Minus-Sense-RNPs voller Länge zu bilden, die als entstehende RNA-Ketten in NPs gewickelt und somit immun gegen Störungen durch mRNAs sind.

Bunyavirus-Promotorelemente und die viralen Proteine, die für die Transkription und Replikation erforderlich sind, wurden mit einem reversen genetischen Ansatz untersucht. Dunn et al. [28] klonierten das CAT-Gen in der Negativ-Sense-Orientierung zwischen den 5'- und 3'-UTRs des Bunyamwera-Bunyavirus-S-RNA-Segments. Wie beim Influenzavirus sind die terminalen Sequenzen der Bunyavirus-RNAs komplementär, hochkonserviert und entscheidend für die Promotoraktivität. Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die die Proteine ​​exprimierten, die von den L- und S-Segmenten kodiert wurden, gefolgt von einer Transfektion mit in vitro transkribierte RNA, die zu CAT-Aktivität führte. Das S-Segment des Bunyavirus kodiert zwei Proteine, N und NSs, in überlappenden Leserastern. Um zu bestimmen, ob diese beiden Proteine ​​für die Transkription und Replikation erforderlich sind, wurden Konstrukte getestet, die nur N oder NS exprimieren. Die N-Protein-Expression führte zusammen mit der L-Protein-Expression zu einer CAT-Aktivität der Reporter-RNA, während mit den L- und NSs-Expressionskonstrukten keine CAT-Aktivität nachgewiesen wurde. Daraus wurde geschlossen, dass die L- und N-Proteine ​​für die Transkription und Replikation einer Bunyavirus-ähnlichen RNA ausreichend sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass das Bunyavirus-Polymerase-Protein wie der Influenzavirus-Polymerase-Komplex offenbar die Transkription und/oder Replikation intern starten kann [28].

Ein Jahr später, die erste Erholung der Bunyamwera-Virus vollständig aus cDNAs wurde von Bridgen und Elliott [29] berichtet. Im Gegensatz zum Influenza-System, das ein Helfervirus benötigte, wurde ein helferfreies System verwendet. Jedes antigenomische RNA-Konstrukt wurde von einem T7-Promotor exprimiert und wies das selbstspaltende Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym am 3'-Ende auf. Jedes Antigenom-Transkript enthielt zwei zusätzliche nichtvirale Guanosinreste am 5'-Ende. Drei Plasmide wurden transfiziert, die die drei antigenomischen Virussegmente (L, M und S) exprimierten, zusammen mit drei T7-Plasmiden, die die viralen mRNAs exprimierten, die für alle viralen Proteine ​​(N, NSs, G1, G2, NSm und L) kodieren, in HeLa-Zellen mit dem rekombinanten Vacciniavirus infiziert, das T7-Polymerase exprimiert. Um die Anzahl der Bunyavirus-Partikel im Verhältnis zur Anzahl der Vacciniavirus-Partikel zu erhöhen, nutzten die Autoren die Fähigkeit von Bunyamwera-Virus in Mückenzellen zu replizieren und führte einen Durchgangsschritt durch Aedes albopictus C6/36 Zellen. Daher wurden Extrakte der nach der Transfektion geernteten Zellen verwendet, um C6/36-Zellen zu infizieren, und nach 1 Woche wurden die Überstände dieser Zellen auf das Vorhandensein von . getestet Bunyamwera-Virus durch Plaquebildung auf BHK-Zellen. Die Rescue-Effizienz betrug bei der ursprünglichen Transfektion etwa 10-100 Plaques pro 107 Zellen, und die transfizierten Viren wuchsen mit der gleichen Kinetik und zum gleichen Titer wie authentische Bunyamwera-Virus [29].

Ein ähnlicher Ansatz wie der von Dunn et al. [28] wurde anschließend für das Rift Valley-Fieber (RVF) verwendet. Phlebovirus die ein Ambisense-S-RNA-Segment aufweist: Die N- und NSs-Proteine ​​werden in unterschiedlichen ORFs kodiert, wobei der NSs-ORF im vRNA-Sinn liegt. Beide Proteine ​​werden von spezifischen subgenomischen mRNAs translatiert. In dem für das RVF-Virus entwickelten reversen Genetik-System [30,31] wurde die Antisense-CAT-Reporter-cDNA auch unter Verwendung des T7-Vaccinia-Virus-Systems exprimiert, während die L- und N-Proteine ​​von Vaccinia-Virus-Rekombinanten geliefert wurden.

Obwohl der T7-RNA-Polymerase-Ansatz für die Transkription einzelner IAV-Gene verwendet wurde [32,33], wurde die Rettung von rekombinantem IAV mithilfe des T7-RNA-Polymerase-Ansatzes erst 2007 beschrieben [34]. In dieser Studie wurde T7-RNA-Polymerase von Plasmid-DNA exprimiert und rekombinantes Virus wurde in Vogel-, Hunde- und menschlichen Zelllinien produziert. Die Virusrettung mit diesem Ansatz war effizienter als mit dem unidirektionalen RNA-Polymerase I (pol I)-System, jedoch war die Produktion des rekombinanten Influenzavirus A/PR/8/34 nicht so effizient wie mit dem bidirektionalen RNA-pol I-System (diskutiert unter). Die Autoren schlugen vor, dass die Entwicklung eines bidirektionalen T7-RNA-Polymerase-Systems die Rettungseffizienz des T7-RNA-Polymerase-Ansatzes verbessern könnte [34].

Das von Neumann et al. [40] stellt den Abschluss dieser Arbeit dar und führte zu der Fähigkeit, jedes Gen im Genom des Influenzavirus zu manipulieren. Sie entwickelten ein System, das die Wirtszelle nutzt, um das Äquivalent neu freigesetzter RNPs herzustellen, indem sie acht Plasmide, die jedes der genomischen RNA-Segmente des Influenzavirus kodieren, unter der Kontrolle des RNA-pol I-Promotors und des Transkriptionsterminators zusammen mit vier Plasmiden, die die Polymerase-Komplexproteine ​​kodieren, kotransfizieren und NP-cDNAs unter der Kontrolle eines RNA-pol II-Promotors (Fig. 3B). Das Konzept der Co-Transfektion mehrerer Plasmide zur Wiederherstellung einer biochemischen Aktivität wurde erstmals zur Untersuchung der Herpesvirus-DNA-Replikation verwendet [41]. Der von Neumann et al. [40] für das Influenzavirus mit 12 Plasmiden war sehr beeindruckend. Das Fehlen eines Helferinfluenzavirus ermöglicht eine sofortige Charakterisierung des Virus aus der ersten Transfektion, wodurch die Wahrscheinlichkeit begrenzt wird, dass Viren, die Reversionen oder Second-Site-Mutationen enthalten, zu signifikanten Kontaminanten werden.

Danach bestand das Hauptziel darin, Influenzavirus aus der geringsten Anzahl von Plasmidkonstrukten zu erzeugen, die in kultivierte Zellen transfiziert werden können, um hohe Virusausbeuten zu erzielen. Hoffmannet al. [42] reduzierte die Zahl der Plasmide auf acht, um ein effizienteres System der reversen Genetik zu entwickeln: das RNA-Polymerase I/II-System. Sie inserierten virale cDNAs zwischen einem humanen pol I-Promotor und einem Maus-pol I-Terminator, um Negativsense-vRNAs zu produzieren, während virale Proteine ​​synthetisiert wurden, indem die pol I-Transkriptionskassette zwischen einem humanen CMV-pol II-Promotor und einem Rinder-Polyadenylierungssignal eingefügt wurde. Dieser einzigartige Ansatz ermöglichte die Produktion sowohl von Negativ-Sense-vRNAs, die in Vorwärtsrichtung synthetisiert werden, als auch von Positive-Sense-mRNAs, die in Rückwärtsrichtung synthetisiert werden. Die Reduzierung der Anzahl der für die IAV-Rescue verwendeten Plasmide erhöhte die Transfektionseffizienz von Säugerzellen, ermöglichte die Verwendung von Zelllinien mit geringer Transfizierbarkeit und führte zu höheren Virusausbeuten [42].

Während die Zwölf-Plasmid- und Acht-Plasmid-Reverse-Genetik-Systeme zur Erzeugung von IAV aus cDNAs am weitesten verbreitet sind, wurden auch Drei-Plasmid- und Ein-Plasmid-Systeme entwickelt, um die Transfektionseffizienz und Virusausbeute weiter zu verbessern. Neumannet al. [43] entwickelten ein Drei-Plasmid-IAV-Rescue-System, bei dem cDNAs zwischen dem humanen Pol I-Promotor und dem Maus-Pol I-Terminator platziert wurden. Diese Transkriptionskassetten (insgesamt acht) wurden dann in ein Plasmid kloniert.

Die viralen Proteine ​​PB2, PB1 und PA bzw. NP wurden von zwei Plasmiden exprimiert, wobei die cDNA von einem pol II-Promotor und einer Polyadenylierungssequenz flankiert wurde.

Ein Ein-Plasmid-Reverse-Genetik-System wurde von Zhang et al. [44]. cDNAs, die PB2, PB1, PA und NP kodieren, wurden zuerst zwischen einen Pol-I-Promotor-Terminator und einen Pol-II-Promotor-Terminator eingefügt. Der pol II-Promotor wurde aus der HA, NA, M oder NS enthaltenden Kassette weggelassen. Alle acht Kassetten wurden dann ligiert, um ein einzelnes Plasmid zu bilden. Die Virusausbeuten, die unter Verwendung des 23,6 kb 8-Einheiten-Plasmidsystems erzeugt wurden, waren vergleichbar mit dem 8-Plasmid-System in embryonalen Hühnerfibroblasten, während ihre Co-Kultur mit Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen die Ausbeuten weiter verbesserte. Da RNA Pol I speziesspezifisch ist, hängt die Wahl der Zelllinie, die verwendet wird, um das Influenzavirus unter Verwendung des Ein-Plasmid-Systems zu erzeugen, von der Art des verwendeten Pol I-Promotors ab. Die interessanten Faktoren, die zu reduzierten intraplasmidischen Rekombinationsereignissen und gewährleisteter Plasmidstabilität führen können, sind ein Vektor mit niedriger Kopienzahl (p15A ori, ungefähr 15 Kopien pro Bakterienzelle), eine minimierte Anzahl von CMV-Promotoren und eine verringerte Länge homologer Sequenzen durch abwechselnde Platzierung von a Einzelpromotor und eine Doppelpromotorkassette.

Während für das Influenzavirus pol I-basierte reverse Genetiksysteme entwickelt wurden, wandten sich Flick und Pettersson [45] dem RNA-pol I-Expressionssystem zu, um es als alternativen Ansatz zur Entwicklung eines reversen Genetiksystems für Bunyaviridae. Wie zuvor für das Influenzavirus beschrieben, werden im pol I-System cDNAs, die für virale RNA-Segmente kodieren, oder Reportergene, die von viralen Sequenzen flankiert werden, zwischen den RNA-pol I-Promotor und -Terminator kloniert, um Transkripte mit korrekten 5'- und 3'-Enden zu erzeugen ohne Modifikationen wie Kappenstruktur und Poly(A)-Schwanz [35, 46]. Flick und Pettersson [45] verwendeten das pol I-System, um Reportergene zu exprimieren, die von den 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen des mRNA-Segments des Uukuniemi (UUK)-Virus, einem Mitglied der Phlebovirus Gattung. Sie zeigten, dass das pol I-System zur Synthese chimärer RNA-Templates verwendet werden kann, die trotz fehlender Cap-Struktur und fehlendem Poly(A)-Schwanz ins Zytoplasma transportiert werden, wo sie von den entweder gelieferten UUK-Virus-Replikase-Komponenten amplifiziert und transkribiert werden durch Superinfektion mit dem UUK-Virus oder durch Expression viraler Proteine ​​aus getrennten Plasmiden. Es wurde festgestellt, dass die L- und N-Proteine ​​für die Transkription und Replikation notwendig und ausreichend sind. Eine wichtige Frage ist, ob das pol I-Transkript durch Replikation amplifiziert wird. Wie von Flick und Pettersson für das UUK-Virus gezeigt wurde, beobachteten sie, obwohl sie die RNA-Synthese nicht direkt quantifizierten, ein hohes Expressionsniveau von CAT und grün fluoreszierendem Protein (GFP), das ohne Replikation nicht hätte erreicht werden können. Basierend auf ihren früheren Erfahrungen war das Gesamtniveau der CAT-Aktivität viel höher als das der Influenzavirus-Hochregulierungsmutante. Schließlich legt die Tatsache, dass extrazelluläres Medium aus transfizierten und UUK-Virus-superinfizierten Zellen verwendet werden könnte, um die CAT-Aktivität seriell zu passieren, stark nahe, dass das pol I-Transkript amplifiziert und verpackt worden sein muss.

Das Vaccinia-Virus (VV) wurde entweder verwendet, um die Synthese der T7-RNA-Polymerase zu steuern [16], die dann die Expression des Reporterkonstrukts und der viralen Helferproteine ​​antreibt [18,21,24,26,47,48] oder um die viralen Helferproteine ​​direkt zu exprimieren [28,30,31]. Das pol I-System bietet jedoch mehrere Vorteile gegenüber den VV-basierten reversen Genetiksystemen. Zum Beispiel führt VV in die Zelle eine Reihe von unerwünschten enzymatischen Aktivitäten ein, die durch die Verwendung des pol I-Systems vermieden werden. Darüber hinaus ist es nicht erforderlich, das VV physikalisch oder biochemisch zu entfernen [17-19], indem das Virus durch Zellen übertragen wird, die für VV nicht permissiv sind, oder indem eine Variante des VV (MVA-T7) verwendet wird, die sich in Säugetieren nicht repliziert Zellen [49]. Diese Probleme können jedoch vermieden werden, indem Zelllinien verwendet werden, die die Bakteriophagen-T7-Polymerase stabil exprimieren, oder indem sie aus Plasmiden exprimiert werden. Das pol I-System hat auch den Vorteil, die genauen 5'- und 3'-Enden der RNA-Transkripte zu erzeugen, wodurch die Notwendigkeit der Expression von Runoff-Transkripten von Restriktionsenzym-gespaltenen Plasmiden oder die Verwendung eines Ribozyms zur Herstellung des korrekten 3'-Endes vermieden wird . Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass: i) im Gegensatz zum Influenzavirus die Transkription von RNA durch die meisten Negativ-Sense-Viren im Zytoplasma stattfindet, während Polymerase I RNA im Zellkern produziert, und ii) die RNA-pol-I-Transkription eine stringente Speziesspezifität aufweist, die verhindert, dass die Nutzung dieses Systems in jedem Zelltyp.

RNP-Rekonstitution in vivo und in vitro hat eine detaillierte Analyse des viralen Promotors und anderer cis-wirkender Signale ermöglicht, die für die Regulation der Transkription und Replikation wichtig sind (z. B. Polyadenylierungssignale, cis-wirkender Signale innerhalb der untranslatierten Regionen). Die Reverse Genetik hat es auch ermöglicht, die funktionelle Bedeutung viraler Proteine ​​während der Infektion, Struktur-Funktions-Beziehungen viraler Genprodukte und molekulare Aspekte der viralen Pathogenität zu untersuchen. Durch diese Technik erzeugte transfektante Viren können auch verwendet werden, um Probleme bezüglich Virus-Wirtszell-Interaktionen in Transport- und Zusammenbauprozessen viraler Komponenten anzugehen.

Die Entwicklung von reversen Genetik-Systemen für die Rhabdoviren, Paramyxoviren und Orthomyxoviren hat Werkzeuge bereitgestellt, um die Rollen der cisacting RNA-Elemente, die an der Replikation und Transkription beteiligt sind, genauer zu untersuchen. Mit diesem Ansatz zeigten Hoffman und Banerjee [24], dass die Nukleotide 1-12 (vom Terminus) des Leader-Promotors eine Domäne bildeten, die für die Replikation des humanen Parainfluenzavirus Typ 3 entscheidend ist. Darüber hinaus zeigten sie, dass keine Mutationen in diesen Regionen zu Transkriptionsdefekten führten, obwohl Mutationen in der intergenen Sequenz und dem Genstart an der Leadergen-Kreuzung die Transkription störten.

Die funktionelle Analyse des viralen Influenza-RNA-Promotors über reverse Genetik führte zu dem vorgeschlagenen „Korkenzieher“-Modell für die 5'- und 3'-vRNA-terminalen Abschnitte in ihrer koordinierten Bindung an die virale RNA-Polymerase [46, 50]. Ursprünglich wurde angenommen, dass der von den Termini aller Influenzavirus-Gensegmente gebildete Double-Sense-Panhandle an der Polymerase-Erkennung beteiligt sein könnte, jedoch führte die Anwendung dieses Ansatzes zu dem Schluss, dass 3'-terminale Sequenzen allein optimal als Promotor fungieren könnten [ 6]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass verschiedene Basenpaaraustausche nicht nur die Promotorfunktion wiederherstellten, sondern auch zu einer erhöhten Promotoraktivität führten, insbesondere wenn die Positionen 3 und 8 im 3'-Zweig oder 3 und 8 im 5'-Zweig des vRNA-Promotors Struktur waren an einem solchen komplementären Doppelaustausch beteiligt.

Die Konstruktion von cRNA-Promotorvarianten durch reverse Genetik der RNA-Polymerase I ermöglichte die Bestimmung der RNA-Polymerase-assoziierten, basengepaarten Konformation in einem Reportergen-Auslesesystem. It turned out to adhere to the 'corkscrew' model, similar, but slightly different in its binding interactions from the corresponding vRNA conformation. The observation of two transcription reactions, initiated in either direction from influenza vRNA and cRNA template molecules, allowed construction of bicistronic, ambisense RNA molecules for simultaneous expression of two proteins from a single segment of vRNA [51].

Two other studies used the RNA polymerase I system to determine the function of influenza virus proteins. Neumann et al. [52] generated virus-like particles that entirely lacked or possessed mutations in the NS2 gene and examined the effect of these modifications on vRNP nuclear export. This study confirmed a previous finding by O'Neill et al. [53] that NS2 is critical for vRNP nuclear export, mediated by a nuclear export signal in the N-terminal region of NS2. Watanabe et al. [54] studied the role of the M2 ion-channel protein. Viruses were generated that lacked or contained mutations in the M2 transmembrane domain, indicating that influenza A viruses can undergo multiple cycles of replication without M2 ion-channel activity in cell culture. However, viruses defective in M2 ion-channel activity did not efficiently replicate in mice, demonstrating that this activity is critical for the viral life cycle. Similar approaches can be employed to determine the functions of other influenza virus proteins or cellular events involving specific viral proteins [54].

Viral attenuation as a result of reverse genetics through specific mutations has practical significance in vaccine development. Such attenuating mutations include those eliminating gene products that are nonessential for replication in tissue culture, those rearranging gene order, and those deleting the cytoplasmic tails of viral glycoproteins [55-59]. Deletion mutants generally cannot revert, thus permanent attenuation should be possible in such recombinants.

Using a reverse genetics approach it is possible, for example, to produce a master strain of influenza virus with multiple attenuating mutations in the genes encoding internal proteins. This can be used to produce a high-yield reassortant virus that possesses the HA and NA from a currently circulating strain, exploited in the production of inactivated vaccines and as a potentially useful vector for gene transfer into mammalian cells. Studies with helper virus-dependent reverse genetics systems have demonstrated that influenza virus can accommodate additional genetic material. For several short polypeptides, including the V3 loop of HIV-1 gp 120 protein [60], a highly conserved epitope from the ectodomain of HIV-1 gp41 [61], and a B-cell epitope from the outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa [62], insertion in the antigenic sites of HA resulted in immune responses against the foreign epitope (reviewed in [63]).

Applications of the reverse genetics system can also be demonstrated using VSV as an example. It was shown that genes encoding foreign membrane glycoproteins can either be incorporated as extra genes in VSV or can be incorporated in place of the VSV G gene [64-66]. Therefore, it is possible to obtain viruses containing the foreign proteins in their envelopes by swapping the endogenous VSV G gene for genes encoding foreign glycoproteins. These viruses lack the normally broad tropism conferred by VSV G and can be targeted to specific cells. For example, VSV recombinants expressing the HIV receptor and a co-receptor in place of G incorporate both foreign proteins and are targeted specifically to cells infected with HIV-1 which display the HIV-1 envelope proteins on their surface [66].

Recombinant VSVs expressing foreign antigens have potential in vaccine application and have been shown to elicit protective immunity in experimental animals. Vaccination of mice with a single dose of recombinant VSV expressing the influenza hemagglutinin provided complete protection from influenza challenge [27]. Other examples cited include: expression and incorporation of the IAV neuraminidase (NA) proteins by Kretzschmar et al. [67], the HIV-1envelope protein (gp 160) with a VSV-G cytoplasmic tail by Johnson et al. [68], the MV fusion (F) and hemagglutinin (HA) proteins by Schnell et al. [64], the RSV Glycoprotein (G) and Fusion (F) protein and the cellular proteins CD4, CXCR4, and CCR5 by Schnell et al [66].

To summarize, reverse genetics approaches have now been described for representatives of most groups of negative-sense RNA viruses and gave an opportunity to study different aspects of viral replication, pathogenesis, interaction with vectors, and to develop genetically engineered vaccines.

Several bicistronic strategies have been used for the expression of foreign genes from the genome of IAV. These employ internal promoters [69], mini-genes [70], overlapping (e.g. -UAAUG-) or highly proximal stop/start sequences [71], and Internal Ribosome Entry Site (IRES) elements [72]. Each of these is associated with a number of limitations [73,74] but one particular disadvantage is uneven/unreliable protein expression levels. While the IRES allows cap-independent translation of a second protein from a single transcript the level of the second protein is often significantly reduced [75]. An alternative strategy is the use of self-processing viral 2A peptides which gives approximately equal expression of multiple genes under the control of a single promoter [76,77]. Analysis of recombinant foot-and-mouth disease virus (FMDV) polyproteins and artificial polyprotein systems in which 2A was inserted between two reporter proteins showed that just 2A, plus the N-terminal proline of the downstream protein (-LLNFDLLKLAGDVESNPG↓P-) was sufficient to mediate a highly efficient co-translational "cleavage" [76,78,79]. Briefly, the 2A region of the polyproteins manipulates the ribosome to "skip" the synthesis of the glycyl-prolyl peptide bond at its own carboxyl terminus leading to the release of the nascent protein followed by translation of the remaining downstream sequence. In this manner multiple, discrete, translation products are derived from a single open reading frame. This technology has been crucial for human gene therapies targeting cancer, production of induced human pluripotent stem cells for regenerative medicine, creation of transgenic animals and plants with improved nutritional properties and the production of high-value proteins for the pharmaceutical industry [80,81]. When using the 2A system it should be borne in mind that the 2A oligopeptide remains as a C-terminal extension of the upstream fusion partner. In the case of proteins translocated to the Endoplasmic Reticulum (ER) a strategy was adopted to include furin cleavage sequences (-&darr RRRR-, -&darr RKRR-, -&darr RRKR-) between the upstream protein and 2A to remove the "unwanted" tag [82]. In plants the first nine amino acids (SN&darrAADEVAT) of the LP4 peptide of Impatiens balsamina was connected to the 20aa 2A to generate a similar hybrid linker peptide [83,84].

Using reverse genetics techniques, several 2A-based strategies have been developed to generate recombinant influenza viruses expressing additional heterologous proteins. The genome of IAV consists of eight segments of negative-sense RNA. Among them, the smallest (NS, segment 8), encoding two proteins (NS1 and NEP) through an alternate splicing mechanism, is a suitable target for genetic manipulation. NS1 has been shown to tolerate relatively long insertions and foreign protein is produced in large quantities in infected cells. For instance, the segment was modified to express NS1-GFP and NEP as a single polyprotein with a self-cleaving 19aa porcine teschovirus-1 (PTV-1) 2A site between them to release the upstream fusion protein from NEP during translation (Figure 4A). Although the strategy depends on mutation of the splice acceptor signal to prevent splicing of this segment the GFP reporter virus replicated efficiently in different cell populations and caused significant pathogenicity in mice. In addition, the constructed GFP expressing viral vector was used as a tool for the tracking of influenza virus infection in animals treated with two antiviral agents, amantadine and oseltamivir, which block virus uncoating and virus spreading, respectively [85]. A novel approach for the sensitive quantification of viral infection and spread by analysis of enzymatic activity in cell culture supernatant was used by Eckert et al. [86] who inserted the Gaussia Luciferase (GLuc) reporter into segment 8 flanked by complete NS1 and 2A-NEP genes (Figure 4A). Independently, Heaton et al. [87] developed a luciferase-expressing IAV and identified the polymerase PB2 segment as a second site in the genome to tolerate a reporter gene insertion. In this virus, GLuc was connected to PB2 über a foot-and-mouth 2A sequence and had a KDEL, ER retention signal for in vitro characterization (Figure 4B). The luciferase virus, PR8-GLuc, was subsequently used for in

vivo experiments to study the efficacy of monoclonal antibodies that bind to the conserved IAV hemagglutinin stalk and protect mice in challenge studies.

It has been suggested that immunization with influenza virus NS vectors expressing the 6 kDa early secretory antigenic target protein (ESAT-6) derived from Mycobacterium tuberculosis might be a potent vaccination strategy against tuberculosis (TB) [88]. ESAT-6 was expressed as a fusion protein with the 125 N-terminal amino acid residues from the influenza virus NS1 protein via a FMDV 2A linker. In this work, the NS vectors could induce an M. tuberkulose-specific CD4+ T-cell response after intranasal immunization in mice. Moreover, vaccination of mice and guinea pigs provided protection against tuberculosis equivalent to that provided by the widely used Bacillus Calmette- Guérin (BCG) vaccine. The coding capacity of this selected vector to maintain longer inserts allowed cassettes expressing two mycobacterium antigens, ESAT-6 and Ag85A (ESAT6-2AAg85A), to induce a broader TB-specific immune response [89]. In contrast to Ag85A, ESAT-6 protein is absent in BCG, raising the possibility of performing a BCG-prime influenza vector-boost immunization regimen.

Efforts have also been made to insert foreign sequences into the open reading frame of hemagglutinin and neuraminidase segments 4 and 6 respectively. The essential NA and HA proteins project through the viral envelope and are also expressed on the surface of influenza virus-infected cells. There have been several attempts to generate replication-competent recombinant influenza viruses carrying a reporter gene in the NA segment [69,90-92]. Indeed, it was reported that the insertion of the bacterial CAT gene with the 2A sequence into NA vRNA allowed CAT and NA to be stably expressed in infected cells [90]. Interestingly, the disruption of NA vRNA packaging signals at the 3' end in this study may have resulted in attenuation of the virus. Several studies suggest that segment-specific packaging sequences found in both 3'- and 5'- UTRs and coding sequences flanking each open reading frame have critical roles in packaging segments into the virion [93-95]. An improved strategy for generating replication-competent recombinant IAV carrying EGFP in NA vRNA, as either EGFP + NA or NA + EGFP, retained the 3'- UTR and adjacent 183 nucleotides (nt) of the coding region and the 5'- UTR and adjacent 157nt of the coding region (Figure 4C)[92]. A follow-up report for this application described the generation of IAV expressing a NA-2A-GLuc fusion protein for monitoring the course of infection in real time in living animals [96].

Procedures developed during the last 25 years to genetically manipulate the genomes of negative-sense RNA viruses, commonly referred to as reverse genetics, have enhanced the investigation of viral gene expression and the dissection of cisacting regulatory sequences that are important for replication and transcription. These new methods allow us to study viruses that are present only in low titers in infected cells or whose isolation is problematic. Information has also been garnered on natural or induced RNA recombination and mechanisms generating DI RNAs.

A common feature of these various systems is that the template RNA is derived from a cDNA clone containing authentic viral terminal sequences. However, there are certain variations in the developed approaches: the delivery of the template, the sequences present in the template, the source of viral proteins and the type of promoter to drive the transcription and expression. The template can be transcribed within the cell or delivered into the cell either as a transfected naked RNA or RNP complex. The sequences present in the template may also differ and contain either authentic viral transcripts or defective interfering RNA sequences or reporter genes or mutated RNAs. Transcription of the template RNA requires viral proteins that can be supplied either by recombinant sources or by helper virus infection. To direct transcription of the template and expression of viral proteins, various types of promoters have been utilized. These included the bacteriophage T7 promoter, RNA polymerase type I promoters and RNA polymerase type II promoters.

Chimeric polyproteins incorporating 2A have been widely used as tools for co-expression of two (or more) proteins in biomedicine and biotechnology. An advantage of using 2As is the ability to consistently express a number of proteins at an equal level. Using an IRES to co-express proteins usually results in the upstream protein being expressed 10 times more than the downstream one [75]. After "fine-tuning" of the foot-and-mouth 2A sequence, we suggest that researchers opt for 2A30 (+11aa derived from the capsid protein 1D). This 2A proved to be the most favorable in terms of both length and cleavage efficiency and was unaffected by the sequence of the upstream gene [97,98]. In the case of shorter 2As, cleavage efficiency has been improved by insertion of various spacer sequences such as Gly- Ser-Gly or Ser-Gly-Ser-Gly ahead of the 2A sequence [99,100]. Although the FMDV 2A sequence has been the most widely used, biotechnologists should also be aware that other 2A-like sequences have been utilized successfully, including Equine rhinitis A virus (ERAV), PTV-1 and Thosea asigna virus (TaV) 2As[99,101,102]


Genome organization and replication

Fimoviruses differ from other related viruses (orthotospoviruses and orthobunyaviruses) by having a larger number of genomic RNA segments. RNA1 to RNA4 each encode a single protein (Figure 2.Fimoviridae). The function of proteins encoded by the other RNAs (RNA5 to RNA8) remain unknown (Tatineni et al., 2014). Like other negative-sense ssRNA multipartite viruses, some fimoviruses are known to use &ldquocap snatching&rdquo to initiate transcription and facilitate translation of their mRNAs, as it was proven in the cases of RRV and FMV (Walia and Falk 2012, Laney et al., 2011).

Figur 2.Fimoviridae. Coding strategy and genome segments of European mountain ash ringspot-associated virus (isolate Hamburg). Arrows represent the virion-complementary sense RNA, from which the proteins shown are translated. RdRP: RNA-dependent RNA polymerase Gn and Gc: putative glycoproteins cleaved (dotted lines) from the precursor molecule NP: nucleocapsid protein MP: putative movement protein.


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Prospects of RNA interference therapy in respiratory viral diseases: update 2006

Respiratory viruses, such as influenza, parainfluenza and respiratory syncytial virus (RSV), claim millions of lives annually. At present, there is no completely effective vaccine or drug against these highly mutable RNA viruses. Passive antibody therapies for RSV, despite their limited application and staggering cost, enjoy a virtual monopoly in a multibillion-dollar global market. Recently, however, pioneering discoveries have launched RNA interference as a novel, nucleic acid-based therapy against viral pathogens. Specifically, small interfering RNAs (siRNAs) offered protection against respiratory syncytial virus, parainfluenza and influenza. siRNA against RSV has entered Phase I clinical trials in humans, and preliminary reports are promising. If appropriately formulated for improved specificity, delivery and pharmacokinetics, siRNAs may indeed become effective antivirals in the clinics of the future. This paper provides an overview of the prospects and hurdles facing the antiviral siRNA drugs, with special emphasis on RSV.


6 RNA EDITING ON RNA VIRUS TRANSCRIPTS

Viral genomes display some of the highest genomic mutational frequencies known. Mutational patterns in viral genomes do not occur randomly, rather certain nucleotide mutations always occur more frequently that others, a phenomenon known as directional mutational pressure. The source of such unequal viral mutation rates is largely due to error-prone polymerases. RNA editing can be simply defined as the addition or substitution of RNA bases that were not originally encoded by the genome. RNA editing in paramyxoviruses, for example, occurs co-transcriptionally when the RNA-dependent-RNA polymerase (RdRp) interacts with a cis-acting sequence element (3’-UAAUUUUUUCCC) in the genome that causes a stuttering of the polymerase (Figure 3a). This “stuttering” mechanism is responsible for editing the RNA via the addition of up to 6 G's at a single RNA editing site (Iseni et al., 2002 ). Interestingly, RNA editing could also be done via cellular enzymes in a completely post-transcriptional process.

8 G residues due to slippage/stuttering of the viral RdRp in certain regions during transcription. Panel b. The cell possesses inducible RNA deaminases such as ADAR that can deaminate adenosine residues to inosines. These enzymes can increase the mutation rate of RNA viruses and thus can affect viral fitness and evolution

One cellular means of carrying out RNA editing is via the double-stranded RNA-specific adenosine deaminase (ADAR) enzymes (Figure 3b) (George, John, & Samuel, 2014 ). Humans possess three major ADAR isoforms: ADAR1-p150, ADAR1-p110, and ADAR2. ADAR enzymes facilitate adenosine deamination to inosine, which is biologically relevant since inosine behaves like guanosine and can base-pair with cysteine. During viral replication, the cysteine-inosine base-pairing will lead to guanosine being incorporated in place of inosine, ultimately leading to adenosine to guanosine transition mutations. The expression level of ADAR often increases as the cell detects increasing levels of foreign RNA. Interestingly, several viruses of the family Flaviviridae, including Hepatitis C virus, Bovine viral diarrhea virus, and Dengue virus, can stimulate ADAR expression, while many other virus families do not (Khrustalev, Khrustaleva, Sharma, & Giri, 2017 ). The consequence of ADAR editing of viral RNA is an increase in A to G transition rates (Liu et al., 2015 ). Studies on human metapneumovirus suggest that high levels of viral RNA editing may lead to the production of increased levels of defective interfering particles (van den Hoogen et al., 2014 ). The increased proportion of G's that results from ADAR editing might also have a positive effect on virus biology, enabling, for example, viral RNAs to form stronger or novel secondary structures given the higher stability of G-C base pairing. Finally, RNA editing strategies like ADAR enzymes do not act uniformly along the length of viral RNA genome, thus directional mutational pressure and subsequently genomic mutational rates are not constant. An emerging hypothesis is that stalling of either the viral RdRp or cellular ribosomes on viral RNAs is associated with mutational pressure, perhaps by enabling RNA editing enzymes like ADAR to act on viral RNAs (Khrustalev et al., 2017 ).


  • Positive sense, negative sense, double stranded viruses, and retroviruses are RNA viruses with different modes of replication.
  • Positive-sense ssRNA viruses (Group IV) have their genome directly utilized as if it were mRNA.
  • Replication of viruses involves primarily multiplication of the genome.
  • The polarity of single-stranded RNA viruses largely determines the replicative mechanism.
  • Genom: The complete genetic information (either DNA or, in some viruses, RNA) of an organism, typically expressed in the number of basepairs.
  • Virus: A submicroscopic infectious organism, now understood to be a non-cellular structure consisting of a core of DNA or RNA surrounded by a protein coat. It requires a living cell to replicate, and often causes disease in the host organism.
  • Reproduzieren: Process by which an object, person, place or idea may be copied mimicked or reproduced.

Replication of viruses primarily involves the multiplication of the viral genome. Replication also involves synthesis of viral messenger RNA (mRNA) from &ldquoearly&rdquo genes (with exceptions for positive sense RNA viruses), viral protein synthesis, possible assembly of viral proteins, then viral genome replication mediated by early or regulatory protein expression. This may be followed, for complex viruses with larger genomes, by one or more further rounds of mRNA synthesis: &ldquolate&rdquo gene expression is, in general, necessary for structural or virion proteins. Viral replication usually takes place in the cytoplasm.

Abbildung: DNA to RNA to protein: Schematic showing how antisense DNA strands can interfere with protein translation.

Viruses that replicate via RNA intermediates need an RNA-dependent RNA- polymerase to replicate their RNA, but animal cells do not seem to possess a suitable enzyme. Therefore, this type of animal RNA virus needs to code for an RNA-dependent RNA polymerase. No viral proteins can be made until viral messenger RNA is available thus, the nature of the RNA in the virion affects the strategy of the virus: In plus-stranded RNA viruses, the virion (genomic) RNA is the same sense as mRNA and so functions as mRNA. This mRNA can be translated immediately upon infection of the host cell. Examples: poliovirus (picornavirus), togaviruses, and flaviviruses.

Abbildung: The replication cycle of poliovirus: The cellular life cycle of poliovirus. It is initiated by binding of a poliovirion to the cell surface macromolecule CD155, which functions as the receptor (1). Uncoating of the viral RNA is mediated by receptor-dependent destabilization of the virus capsid (2). Cleavage of the viral protein VPg is performed by a cellular phosphodiesterase, and translation of the viral RNA occurs by a cap-independent (IRES-mediated) mechanism (3). Proteolytic processing of the viral polyprotein yields mature structural and non-structural proteins (4). The positive-sense RNA serves as template for complementary negative-strand synthesis, thereby producing a double-stranded RNA (replicative form, RF) (5). Initiation of many positive strands from a single negative strand produces the partially single-stranded replicative intermediate (RI) (6). The newly synthesized positive-sense RNA molecules can serve as templates for translation (7) or associate with capsid precursors to undergo encapsidation and induce the maturation cleavage of VP0 (8), which ultimately generates progeny virions. Lysis of the infected cell results in release of infectious progeny virions (9).

RNA viruses are classified into distinct groups depending on their genome and mode of replication (and the numerical groups based on the older Baltimore classification).

Positive-sense ssRNA viruses (Group IV) have their genome directly utilized as if it were mRNA, with host ribosomes translating it into a single protein which is modified by host and viral proteins to form the various proteins needed for replication. One of these includes RNA-dependent RNA polymerase (RNA replicase), which copies the viral RNA to form a double-stranded replicative form, in turn this directs the formation of new virions.