Information

11.3: Sequenzierung des gesamten Genoms – Biologie

11.3: Sequenzierung des gesamten Genoms – Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die Notwendigkeit der Montage

Da die Länge eines einzelnen, individuellen Sequenzierungs-Reads irgendwo zwischen 45bp und 700bp liegt, stehen wir vor dem Problem, die Sequenz längerer Fragmente zu bestimmen, wie etwa der Chromosomen in einem gesamten Genom des Menschen (3 x 109 bp). Offensichtlich müssen wir das Genom in kleinere Fragmente zerlegen. Dafür gibt es zwei verschiedene Strategien:

  1. Klon-für-Klon-Sequenzierung, bei der zuerst eine physische Karte erstellt und dann sequenziert wird, und
  2. Whole Genome Shotgun-Sequenzierung, die zuerst sequenziert und keine physische Karte erfordert.

Physische Zuordnung

Eine physische Karte ist eine Darstellung eines Genoms, das aus geklonten DNA-Fragmenten besteht. Die Karte besteht daher aus physischen Einheiten (DNA-Stücken) und nicht aus abstrakten Konzepten wie den Verknüpfungsfrequenzen und Genen, aus denen eine genetische Karte besteht (Abbildung (PageIndex{1})). In der Regel ist es möglich, genetische und physikalische Karten zu korrelieren, indem beispielsweise der Klon identifiziert wird, der einen bestimmten molekularen Marker enthält. Die Verbindung zwischen physikalischen und genetischen Karten ermöglicht es, die Gene, die bestimmten Mutationen zugrunde liegen, durch ein kartenbasiertes Klonen zu identifizieren.

Um eine physikalische Karte zu erstellen, werden große Fragmente des Genoms in Plasmidvektoren oder in größere Vektoren, die als bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) bezeichnet werden, kloniert. BACs können ungefähr 100-kb-Fragmente enthalten. Der Satz von BACs, der in einer Klonierungsreaktion produziert wird, ist redundant, was bedeutet, dass verschiedene Klone DNA aus demselben Teil des Genoms enthalten. Aufgrund dieser Redundanz ist es nützlich, den minimalen Satz von Klonen auszuwählen, die das gesamte Genom repräsentieren, und diese Klone entsprechend der Sequenz des ursprünglichen Chromosoms zu ordnen. Beachten Sie, dass dies alles getan werden muss, ohne die vollständige Sequenz jedes BAC zu kennen. Das Erstellen einer physikalischen Karte kann daher auf Techniken beruhen, die mit dem Southern-Blotting zusammenhängen: DNA von den Enden eines BAC wird als Sonde verwendet, um Klone zu finden, die dieselbe Sequenz enthalten. Von diesen Klonen wird dann angenommen, dass sie sich gegenseitig überlappen. Ein Satz überlappender Klone heißt a contig.

Klon-für-Klon-Sequenzierung

Die physische Kartierung klonierter Sequenzen wurde früher als Voraussetzung für die Genomsequenzierung angesehen. Der Prozess würde damit beginnen, das Genom in BAC-große Stücke zu zerlegen, diese BACs zu einer Karte anzuordnen und dann jede BAC in eine Reihe kleinerer Klone aufzuteilen, die normalerweise dann auch kartiert wurden. Schließlich würde ein minimaler Satz kleinerer Klone identifiziert, von denen jeder klein genug war, um sequenziert zu werden (Abbildung (PageIndex{8})). Da die Reihenfolge der Klone relativ zum vollständigen Chromosom vor der Sequenzierung bekannt war, konnten die resultierenden Sequenzinformationen am Ende des Projekts leicht zu einem vollständigen Chromosom zusammengesetzt werden. Die Klon-für-Klon-Sequenzierung minimiert daher die Anzahl der durchzuführenden Sequenzierungsreaktionen und macht den Sequenzaufbau unkompliziert und zuverlässig. Ein Nachteil dieser Strategie ist jedoch der mühsame Prozess der Erstellung einer physikalischen Karte vor jeder Sequenzierung.

Gesamtgenom-Shotgun-Sequenzierung

Diese Strategie zerlegt das Genom in Fragmente, die klein genug sind, um sequenziert zu werden, und setzt sie dann einfach wieder zusammen, indem man nach Überlappungen in der Sequenz jedes Fragments sucht. Es vermeidet das mühsame Erstellen einer physischen Karte (Abbildung (PageIndex{2})). Es erfordert jedoch viel mehr Sequenzierungsreaktionen als die Klon-für-Klon-Methode, da es beim Shotgun-Ansatz keine Möglichkeit gibt, redundante Fragmente zu sequenzieren. Es stellt sich auch die Frage, ob es möglich ist, komplette Chromosomen einfach auf der Grundlage der Sequenzüberlappungen vieler kleiner Fragmente zusammenzusetzen. Dies ist insbesondere dann ein Problem, wenn die Größe der Fragmente kleiner ist als die Länge einer sich wiederholenden DNA-Region. Dennoch wurde diese Methode nun erfolgreich in der nahezu vollständigen Sequenzierung vieler großer Genome (Reis, Mensch und viele andere) demonstriert. Es ist die aktuelle Standardmethode.

Schrotflintenbaugruppen sind jedoch selten in der Lage, ganze Genome zu vervollständigen. Das menschliche Genom zum Beispiel beruhte auf einer Kombination aus Shotgun-Sequenz und physischer Kartierung, um eine zusammenhängende Sequenz für die Länge jedes Arms jedes Chromosoms zu erzeugen. Beachten Sie, dass aufgrund der stark repetitiven Natur zentromerer und telomerer DNA Sequenzierungsprojekte selten diese heterochromatischen, genarmen Regionen umfassen.

Genomanalyse

Ein zusammengesetztes Genom ist eine Folge von Millionen von A, C, G, T. Welche davon repräsentieren Nukleotide, die Proteine ​​kodieren, und welche repräsentieren andere Merkmale von Genen und ihren regulatorischen Elementen? Der Prozess von Genom Anmerkung verlässt sich auf Computer, um Merkmale wie Start- und Stoppcodons, Introns, Exons und Spleißstellen zu definieren. Allerdings sind nur wenige der von diesen Programmen gemachten Vorhersagen völlig genau, und die meisten müssen experimentell für jedes Gen von besonderer Bedeutung oder Interesse überprüft werden.


Schau das Video: The Human Genome Project. Genetics. Biology. FuseSchool (Kann 2022).