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B9: CRISPR/Cas 9 - Biologie

B9: CRISPR/Cas 9 - Biologie


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Einführung

Die CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) Operon wurde zunächst als Teil des adaptiven Immunsystems von Bakterien und Archea entdeckt, das sich gegen Viren (Bakteriophagen) und unerwünschtes Plasmid, das von beiden Bakterien übertragen wird, wehren muss. Ideal wäre es, wenn Bakterien eine frühere Exposition gegenüber Viren und deren Nukleinsäuren als Grundlage ihres immunologischen Gedächtnisses erkennen. Angesichts der Tendenz viraler DNA, sich in das Wirtsgenom zu integrieren (was eine spätere Transkription und Translation der viralen Gene im Prozess der neuen Virusproduktion ermöglicht), könnte das immunologische Gedächtnis auf dieser viralen integrierten DNA basieren. Ohne ins Detail zu gehen, kann virale DNA zwischen zwei direkten Wiederholungen im bakteriellen Genom integriert werden. DNA von verschiedenen Viren aus früheren Expositionen wird ebenfalls auf die gleiche Weise eingebaut. Eine Integrationsstelle ist das CRISPR-Operon. Die DNA des CRISPR-Operons enthält sowohl proteinkodierende als auch nichtkodierende Regionen, die transkribiert und zu mindestens drei RNA-Molekülen prozessiert werden (siehe Abbildung unten):

  • eine kodierende Cas 9 mRNA, die translatiert wird, um die Cas 9 (CRISPR wieassoziiertes Protein);
  • eine nicht-kodierende cr-RNA (CRISPR-RNA)
  • eine nicht-kodierende tracr-RNA (transaktivierende CRISPR-RNA)

Die beiden reifen nichtkodierenden RNAs assoziieren schließlich, um einen binären Komplex zu bilden. Bei der Verwendung von CRISPR-Cas 9 in eukaroytischen Gen-Editing-Anwendungen werden die beiden nicht-kodierenden RNAs kovalent zu einer großen kombiniert Ssynthetisch gUid-RNA (sg-RNA), die später in diesem Abschnitt beschrieben wird. Das Cas 9-Protein ist eine Endonuklease, die beide Stränge der gebundenen Ziel-dsDNA stumpf an spezifischen Sequenzen spaltet. Dies geschieht, nachdem die DNA durch eine kurze (3-5+ Basen) Erkennung an zwei Arginine (1333 und 1335) in Cas9 bindet Protospacer angrenzendes Motiv (PAM) drei Basenpaare von der Spaltstelle entfernt. Die DNA muss auch komplementär und spezifisch an die proteingebunden nichtkodierende cr+tracr-RNAs (oder ein einzelnes sg-RNA-Molekül für Gen-Editing-Anwendungen). Die Bindung und Spaltung von Ziel-DNA würde offensichtlich eine erkannte DNA eines eindringenden Bakteriophagen inaktiv machen.

Die Grundlagenforschung des bakteriellen CRISPR-Systems hat zu revolutionären und explosiven Anwendungen dieses Gen-Editing-Systems in Eukaroyten geführt. Die Hoffnung ist, dass uns die CRISPR-Technologie eine präzise und unglaublich kostengünstige Möglichkeit bietet, eine Gentherapie in erkrankten Zellen und Organismen durchzuführen.

Wir haben die Struktur und Funktion vieler Proteine ​​diskutiert. Proteinenzyme sind der Schlüssel zum Leben, da sie fast alle biologischen Reaktionen katalysieren. Die meisten Schlüsselenzyme werden reguliert. Die Aktivität von Cas 9 muss sorgfältig kontrolliert werden. Denken Sie an die Konsequenzen, wenn das Enzym promiskuitiv an externen Zielen spalten würde! Dieser Abschnitt wird Ihnen helfen, einige kritische Eigenschaften dieses Enzyms zu verstehen:

  1. Wie findet das Enzym seine richtige Zielstelle, eine 20 Nukleotide lange DNA-Sequenz und eine proximale PAM-Stelle unter all den möglichen alternativen Stellen? Denken Sie daran, wie viele PAM-Sequenzen es im DNA-Genom des Wirts geben muss!
  2. Wie kann das Enzym „angeschaltet“ werden, wenn es seine Zielstelle findet, und ausgeschaltet bleiben, wenn es frei ist, aber was noch wichtiger ist, wenn es außerhalb der Stelle gebunden ist?

Zunächst diskutieren wir die Apoform des Enzyms ohne gebundenes Substrat und RNA.

ApoCas 9

Dieser Abschnitt konzentriert sich auf den Typ II-A Cas9 von Streptococcus pyogenes (SpyCas9 oder SpCas9). Cas 9 ist eine Endonuklease, die beide Stränge von DNA 3 Basenpaaren von einem DNA-Motiv, NCC/NGG, genannt PAM, spaltet. Es hat zwei unterschiedliche Lappen. Der Nukleaselappen (NUC), Aminosäuren 1-56 und 718-1368, besitzt zwei verschiedene Nukleasedomänen für die beiden Spaltungen. Der Erkennungs- oder Rezeptorlappen (REC), Aminosäuren 94-717, interagiert mit den RNA-Molekülen. Es gibt auch eine Arginin-reiche Brückenhelix (57-93).

Das Enzym hat zwei katalytische Nukleasedomänen:

  • HNH-ähnliche Nukleasedomäne, die den "Ziel"-DNA-Strang spaltet, der zur RNA komplementär ist und dem Enzym Spezifität verleiht. Die wichtigsten katalytischen Reste sind His 840 und Asn 854. Es enthält auch ein Mg-Ion;
  • Ruv-ähnliche Domäne, die den komplementären "Nicht-Ziel"-Strang mit den Schlüsselresten des aktiven Zentrums Asp 10, Glu 762, Asp 986 und His 983 spaltet. Sie enthält auch ein gebundenes Mn-Ion. Die beiden Lappen sind durch zwei Linker, Aminosäuren 712-717, und eine Arginin-reiche Brücke (basische Helix - BH), Aminosäuren 628-658, getrennt.

Die Gesamtstruktur des Apoenyzms (ohne gebundene RNA und DNA,pdb id 4cmp) ist in der folgenden Abbildung dargestellt, die die NUC-Domäne (hellblau) mit den beiden katalytischen Domänen (HNH und Ruv), die REC-Domäne (orange) zeigt. und die BH-Helix (rot).

Eine Nahaufnahme der beiden katalytischen Zentren ist in der Abbildung und Jsmol unten gezeigt.

Jmol: Cas 9 (4cmp und 4008) Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Ein Vergleich der Kristallstruktur des apo-Cas 9 und des ternären Cas 9:sgRNA:DNA-Zielstrang-Komplexes zeigt eine signifikante Konformationsänderung an bindenden Nukleinsäuren. Die Struktur des Holoenzyms (ternärer Komplex) ist in der Abbildung und in der Jsmol unten gezeigt.

Jmol: Cas 9 (4cmp und 4008) Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Das Ausmaß der Konformationsänderung zwischen Apo- und Holo-Cas 9-Enzymen kann durch Untersuchung des Abstands zwischen D435 und E 944/945 in der folgenden Abbildung gesehen werden. Die Bedeutung dieser Änderung wird später beschrieben.

Die folgende Abbildung zeigt den Weg von der Transkription der relevanten CRISPR-Gene (kodierend und nichtkodierend) bis zum Zusammenbau des ternären Komplexes und dem stumpfen Ende des DNA-Zielstrangs drei Nukleotide von der PAM-Sequenz entfernt.

Das Bild unten zeigt eine erweiterte Ansicht des ternären Komplexes.

Mechanismus der DNA-Bindung und -Spaltung

Die obigen Zahlen sprechen nicht über den Mechanismus der Bindungsprozesse, die den ternären Komplex bilden. Kinetische und strukturelle Studien wurden durchgeführt, um den Mechanismus der Bindung und Spaltung aufzuklären und die folgenden Fragen zu beantworten:

  • was bindet zuerst, die RNA oder DNA?
  • Welche Konsequenzen haben die tiefgreifenden Konformationsänderungen auf die Bildung des ternären Komplexes?

Die Spezifität der Ziel-DNA-Bindung hängt sowohl von Enzym:PAM-DNA als auch von Enzym:sgRNA (oder tracr- und crRNA)-Wechselwirkungen ab. Es sollte unwahrscheinlich erscheinen, dass die Trinukleotid-PAM-DNA-Sequenz (NGG in S. pyogenes). Die folgende Abbildung zeigt die Args:PAM-Interaktion (pdb-Code 4un3)

Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass die RNA zuerst bindet. Tatsächlich trifft dies auf die tracRNA zu, die an der Rekrutierung von Cas beteiligt ist, und die crRNA, die Spezifität für die Bindung der Ziel-DNA bietet. Der resultierende Cas9:RNA-Binärkomplex könnte dann das relevante DNA-Genom durchsuchen. Dazu gehört die DNA des Bakteriophagen bei einer Virusinfektion oder eukaryontische DNA, wenn das CRISPR-DNA-Operon mit den Genen für Cas 9 und einer sg-RNA in die eukaryontische Zelle transfiziert wurde. Nach der RNA-Bindung würde das Enzym die Konformation ändern und eine lose DNA-Bindung durch Cas 9:PAM-Wechselwirkungen ermöglichen.

Studien haben gezeigt, dass auch die Apo-Form DNA binden kann, dies jedoch lose und wahllos. Es dissoziiert schnell und die Bindung wird durch generische Polyanionen wie das Glycosoaminoglycan Heparin beeinflusst, was auf seine unspezifische Natur hinweist. Sobald sie gebunden sind, werden dann sowohl die Off-Target- als auch die Target-DNAs untersucht. Wenn eine Ziel-DNA eine PAM-Sequenz enthielt, würde der Komplex eine weitere Konformationsänderung durchlaufen, um die katalytischen Reste der HNH- und Ruv-Nuklease zu positionieren und die Duplex-DNA lokal abzuwickeln, um die stumpfen Enden zu schneiden.

Die Bindung von Cas 9 an die PAM-Stelle würde eine bessere Interaktion der ungewickelten DNA und der gebundenen RNA fördern. Wenn kein PAM vorhanden wäre, würde sich keine katalytisch wirksame Cas 9:Ziel-DNA bilden. Dies verhindert eine Spaltung außerhalb des Standorts. Diese allosterischen Veränderungen und Kontrollen sind für die Funktion der Endonuklease von entscheidender Bedeutung. Hier sind einige Ergebnisse, die diesen vorgeschlagenen Mechanismus unterstützen:

  • die Konformation von Apo Cas 9 ist katalytisch inaktiv;
  • bei der Bindung von RNA zu einem binären Komplex durchläuft Cas 9 eine dramatische Konformationsänderung, hauptsächlich im REC-Lappen. Bei unspezifischer Bindung von DNA sind die Konformationsänderungen jedoch viel geringer. Dies legt nahe, dass die meisten Konformationsänderungen vor der DNA-Bindung auftreten. In gewisser Weise fungiert RNA als allosterischer Aktivator des Enzyms (sowie als Hauptquelle für die Bindungsspezifität an die Ziel-DNA). Konformationsänderungen können direkt durch Vergleich von Kristallstrukturen oder Spektraltechniken wie dem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei verschiedenen angebrachten Fluorophoren bestimmt werden.
  • Cas 9: RNA-Interaktionen führen zur Anordnung der Region der RNA, die mit der DNA-PAM-Sequenz und angrenzenden Desoxynukleotiden interagiert (eine "Seed-Sequenz"), wodurch der Cas 9:RNA-Komplex scannen und mit potentiellen DNA-Zielen mit PAM-Sequenzen interagieren kann ;
  • Sobald eine PAM-Stelle gefunden wurde, führen Konformationsänderungen zum Abwickeln der dsDNA, was die Heteroduplex-Bildung zwischen der crRNA und dem Ziel-DNA-Strang ermöglicht;
  • da Cas 9 eine Vielzahl von DNA-Zielsequenzen erkennt (aber natürlich nur eine spezifische PAM-Sequenz), hängt die Bindung der Zielsequenz von der Geometrie, nicht von der Sequenz, der Ziel-DNA ab;
  • da die Bindung von Off-Target-DNA an den Cas 9:RNA-Komplex erfolgt, jedoch mit sehr seltener Spaltung, sind Bindung und Spaltung sehr unterschiedliche Schritte;
  • bei spezifischer DNA-Bindung bewegt sich das katalytische Zentrum von HNH in die Nähe der sessilen DNA-Bindungsstelle. Kristallstrukturen zeigten, dass das His des aktiven Zentrums nicht nahe genug ist, um die Spaltung zu erleichtern, was darauf hindeutet, dass die Bindung eines zweiten Metallions (siehe unten) erforderlich sein könnte. Molekulardynamikstudien zeigen, dass die HNH-Domäne "bemerkenswert plastisch" ist.

Das animierte Bild unten zeigt die relativen Konformationsänderungen vom Apo Cas 9 zum binären Cas 9:sgRNA-Komplex zum ternären Cas 9:sgRNA:Ziel-DNA-Komplex. Die katalytische Domäne der NUC ist in Hellblau, die REC (Rezeptor- oder RNA-Bindungsdomäne) in Orange, sgRNA in Rot und Ziel-DNA in Grün dargestellt. Beachten Sie erneut, dass Cas 9 bei der Bindung von RNA zur Bildung eines binären Komplexes eine dramatische Konformationsänderung erfährt, hauptsächlich im REC-Lappen. Die gezeigten pdb-Proteinsequenzen wurden unter Verwendung von pdbEfold ausgerichtet.

Ein möglicher verkürzter katalytischer Mechanismus für die Ruv-Nukleasedomäne ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Die roten Pfeile zeigen den zweiten Satz von Elektronenbewegungen an. Sein 983 dient als allgemeine Basis, um ein Proton aus Wasser zu abstrahieren, was es zu einem stärkeren Nukleophil macht. Es entsteht ein intermediäres trigonal bipyramidales Phospho-Intermediat, das zusammen mit dem vorhergehenden Übergangszustand durch das proximale Mg . stabilisiert wird2+ Ion (ein Beispiel für elektrostatische oder Metallionenkatalyse). Das Magnesium wird durch seine Wechselwirkung mit negativ geladenen Carboxylgruppen von Asp 10, Glu 762 und Asp 986 positioniert.

Neuere Daten deuten darauf hin, dass ein zweites Metallion an die Ruv-Stelle rekrutiert werden könnte, um die Spaltung der DNA weiter zu erleichtern. Das katalytische Zentrum von HNH hat eine Struktur (Beta-Beta-Alpha) und konserviertes His gemeinsam mit einer Klasse von Nukleasen, die ein Metallion benötigen. Im Gegensatz dazu weist das katalytische Zentrum von Ruv dieses gemeinsame sekundäre Strukturmotiv nicht auf und weist ein kritisches Histidin auf, beides gemeinsame Merkmale von Endonukleasen, die zwei Metallionen verwenden.

CRISPR und eukaryotische Genbearbeitung

Wie konnte das stumpfe Schneiden beider DNA-Stränge durch Cas 9 zum heiligen Gral der spezifischen eukaryotischen Gen-Editierung ohne Off-Site-Effekte führen? Das DNA-Genom zu zerschneiden scheint eine schlechte Idee zu sein. Tatsächlich ist es potenziell so schlimm, dass sich unzählige DNA-Reparaturmechanismen entwickelt haben, um den Schnitt zu reparieren. Dazu gehört die homologe Rekombination. Wenn sowohl die korrigierende DNA als auch die Komponenten des CRISPR-Systems zugeführt werden, könnte eine Zelle die korrigierende DNA nach dem doppelsträngigen Schnitt effektiv hinzufügen und eine schädliche Mutation reparieren. Weitere Informationen zur homologen Rekombination finden Sie in einem Lehrbuch der Molekularbiologie.

Mutationen in der PAM-Sequenz verhindern die Aktivität der Cas9-Nuklease. Daher ist die NGG-PAM-Sequenz für die oben beschriebenen Interaktionen und Aktivitäten von entscheidender Bedeutung. Dies scheint die Nützlichkeit von CRISPR-Cas 9 bei der eukaryotischen Gen-Editierung einzuschränken, bis man erkennt, dass das GG-Dinukleotid eine Häufigkeit von 5,2% im menschlichen Genom hat, was über 160 Millionen Vorkommen entspricht. Selbst dann kann es in einem Wunschgen-Ziel nicht vorkommen. Cas-9-Nuklease aus anderen Bakterien erweitert den Aktivitätsbereich des CRISPR/Cas-Systems, da sie mit anderen PAM-Sequenzen (NNAGAA und NGGNG für S. thermophilus und NGGNG für N. meningidtis). Ebenso sind Mutationen in der S. pyogenes PAM (NGG) wurden ebenfalls erstellt. Eine D1135E-Mutation behält die Spezifität für die normale NGG-PAM-Stelle bei, erhöht aber diese. D1135V-, R1335Q- und T1337R-Mutationen verändern die optimale PAM-Erkennungsstelle zu NGAN oder NGNG.

Die CRISPR-Bearbeitung kann leicht verwendet werden, um bestimmte Gene auszuschalten. Wenn Zellen mit einem Plasmid mit vielen Zielsequenzen transfiziert werden, kann das System außerdem verwendet werden, um mehrere Gene in einem Experiment zu editieren. Dies wäre sehr nützlich bei Studien zu Krankheiten, die mit mehreren Genen verbunden sind. Da die Kosten für CRISPR-Reagenzien (Plasmide, RNAs) so gering sind und die Spezifität des Editierens so hoch ist, ist die große Aufregung über den Einsatz von CRISPR zur Gen-Editierung bei menschlichen Krankheiten und zur Modifikation von Pflanzen- und Pilzgenomen gerechtfertigt.

Andere Systeme wurden entwickelt, um spezifisch an eine Ziel-DNA-Sequenz zu binden und diese dann zu spalten. Sie enthalten typischerweise ein Protein, das an ein spezifisches DNA-Ziel bindet, und eine assoziierte Endonuklease, die innerhalb der Ziel-DNA-Stelle spaltet. Typische prokaryontische Restriktionsenzyme binden an und schneiden an einer spezifischen Nukleotidsequenz (zum Beispiel spaltet Eco R1 an palindromischen G/AATTC-Sequenzen), um klebrige Enden zu bilden. Das Protein selbst bindet an diese DNA-Erkennungsstelle. Andere Beispiele basieren auf der Struktur bekannter Transkriptionsfaktoren. Zu diesem Zweck wurden Bibliotheken gentechnisch veränderter Proteine ​​mit Zn-Finger-DNA-Bindungsdomänen (entworfen für spezifische DNA-Zielsequenzen) fusioniert mit Endonukleasen erstellt. Ein weiteres Beispiel sind Proteine, die als TALENs (Transcription Activator-like Effector Nucleasen) bezeichnet werden. Dies sind Fusionsproteine, die eine TAL-Effektor-DNA-Bindungsdomäne und eine Nuklease enthalten. In jedem dieser Fälle ist ein 3D-gefaltetes Protein das spezifische Ziel-DNA-Erkennungsmolekül. Denken Sie daran, wie viel einfacher es tatsächlich ist, ein 1D-DNA-Erkennungselement, eine einfache lineare RNA-Sequenz, herzustellen, die bei der Bindung ihres komplementären Ziels die richtige 3D-Struktur annehmen würde.

Ein großes Problem beim Einsatz von CRISPR zur Gen-Editierung muss gelöst werden: Wie man die CRISPR-Komponenten in die richtigen Zellen eines Organismus bringt. Tatsächlich ist es das gleiche Problem, mit dem kleine Arzneimittelentwickler konfrontiert sind, nur dass die Komponenten viel größer sind. Ex-vivo Anwendungen, bei denen erkrankte Zellen aus dem Körper entfernt, durch CRISPR repariert und dann erneut injiziert werden, sind wahrscheinlich erfolgreicher. In diesen Fällen würde die Elektroporation die Aufnahme von Cas 9 und der sg-RNA ermöglichen. ichn vivo Die Therapie umfasste die Verwendung von Adeno-assoziierten Viren, in die Gene für Cas 9 und sg RNA eingekapselt werden konnten. Diese Technik, die für andere Genabgabesysteme verwendet wird, hat den Vorteil, dass sie immunologisch toleriert wird. Dieses System ermöglicht jedoch eine kontinuierliche Genexpression, die für die Gen-Editierung unerwünscht ist. Nach einer anfänglichen "Fixierung" eines mutierten Gens würde eine fortgesetzte Expression der CRISPR-Cas 9-Gene die Chancen für ein Off-Target-Schneiden erhöhen. Ein neuerer Ansatz besteht darin, die mRNA in künstlichen Lipid-Nanopartikeln zu transportieren, die in Zellen aufgenommen werden können. Einmal frei und innerhalb der Zelle in Protein und sg-RNA übersetzt, hat die Gen-Editierung eine Chance, bevor die RNA und das Protein abgebaut werden.

Das Neueste!

Hong Ma et al. haben das Gen für ein mutiertes MYBPC3-Gen in einem achtzelligen menschlichen Embryo korrigiert, der nicht in eine Gebärmutter transplantiert wurde. (Hong Ma et al. Correction of a pathogenic gen mutation in human embryos. Nature. doi:10.1038/nature23305. Online veröffentlicht am 02. August 2017). Die Mutation in diesem autosomal dominanten Gen verursacht eine Art kardialer Myopathie. Es kann zum plötzlichen Tod führen und wird bei 1 von 500 Personen gefunden. CRISPR wurde verwendet, um das mutierte Gen zu modifizieren. Die homologe Rekombination mit dem normalen Allel führte zur Reparatur des modifizierten Gens.


Das Genom-Editing-Tool TALEN übertrifft CRISPR-Cas9 in dicht gepackter DNA

Die Forscher verwendeten Einzelmolekül-Bildgebung, um die Genom-Editing-Tools CRISPR-Cas9 und TALEN zu vergleichen. Ihre Experimente zeigten, dass TALEN in dicht gepackten Teilen des Genoms, Heterochromatin genannt, bis zu fünfmal effizienter ist als CRISPR-Cas9. Fragiles X-Syndrom, Sichelzellenanämie, Beta-Thalassämie und andere Krankheiten sind die Folge genetischer Defekte im Heterochromatin.

Die Forscher berichten über ihre Ergebnisse im Journal Naturkommunikation.

Die Studie trägt zu den Beweisen bei, dass eine breitere Auswahl an Genom-Editing-Tools erforderlich ist, um alle Teile des Genoms zu erfassen, sagte Huimin Zhao, Professor für Chemie- und Biomolekulartechnik an der University of Illinois Urbana-Champaign, der die neue Forschung leitete.

"CRISPR ist ein sehr mächtiges Werkzeug, das zu einer Revolution in der Gentechnik geführt hat", sagte Zhao. "Aber es hat immer noch einige Einschränkungen."

CRISPR ist ein Bakterienmolekül, das eindringende Viren erkennt. Es kann eines von mehreren Enzymen wie Cas-9 tragen, die es ihm ermöglichen, virale Genome an bestimmten Stellen zu schneiden. TALEN scannt auch DNA, um bestimmte Gene zu finden und gezielt anzusprechen. Sowohl CRISPR als auch TALEN können so entwickelt werden, dass sie auf bestimmte Gene abzielen, um Krankheiten zu bekämpfen, die Eigenschaften von Nutzpflanzen zu verbessern oder für andere Anwendungen.

Zhao und seine Kollegen verwendeten Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, um direkt zu beobachten, wie die beiden Genome-Editing-Tools in lebenden Säugerzellen funktionierten. Mit fluoreszenzmarkierten Tags konnten die Forscher messen, wie lange CRISPR und TALEN brauchten, um sich entlang der DNA zu bewegen und Zielstellen zu erkennen und zu durchtrennen.

"Wir haben festgestellt, dass CRISPR in den weniger fest verwundeten Regionen des Genoms besser funktioniert, aber TALEN kann besser auf diese Gene in der Heterochromatin-Region zugreifen als CRISPR", sagte Zhao. "Wir haben auch gesehen, dass TALEN eine höhere Bearbeitungseffizienz als CRISPR haben kann. Es kann die DNA schneiden und dann effizienter Änderungen vornehmen als CRISPR."

TALEN war in mehreren Experimenten bis zu fünfmal effizienter als CRISPR.

Die Ergebnisse werden zu verbesserten Ansätzen führen, um auf verschiedene Teile des Genoms abzuzielen, sagte Zhao.

"Entweder können wir TALEN für bestimmte Anwendungen verwenden, oder wir könnten versuchen, CRISPR im Heterochromatin besser funktionieren zu lassen", sagte er.


Was ist CRISPR?

CRISPR ist eine Technologie, die zur Bearbeitung von Genen verwendet werden kann und als solche wahrscheinlich die Welt verändern wird.

Die Essenz von CRISPR ist einfach: Es ist eine Möglichkeit, ein bestimmtes Stück DNA in einer Zelle zu finden. Danach besteht der nächste Schritt bei der CRISPR-Genbearbeitung normalerweise darin, dieses DNA-Stück zu verändern. CRISPR wurde jedoch auch für andere Dinge angepasst, wie zum Beispiel das Ein- oder Ausschalten von Genen, ohne ihre Sequenz zu ändern.

Es gab Möglichkeiten, das Genom einiger Pflanzen und Tiere zu bearbeiten, bevor die CRISPR-Methode im Jahr 2012 vorgestellt wurde, aber es dauerte Jahre und kostete Hunderttausende von Dollar. CRISPR hat es billig und einfach gemacht.

CRISPR wird bereits in großem Umfang für die wissenschaftliche Forschung verwendet, und in nicht allzu ferner Zukunft könnten viele der Pflanzen und Tiere in unseren Farmen, Gärten oder Häusern mit CRISPR verändert worden sein. Tatsächlich essen einige Leute bereits CRISPRed-Lebensmittel.

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Die CRISPR-Technologie hat auch das Potenzial, die Medizin zu verändern, indem sie es uns ermöglicht, viele Krankheiten nicht nur zu behandeln, sondern auch zu verhindern. Vielleicht entscheiden wir uns sogar, es zu verwenden, um das Genom unserer Kinder zu verändern. Ein Versuch, dies in China zu tun, wurde als verfrüht und unethisch verurteilt, aber einige glauben, dass es in Zukunft Kindern zugute kommen könnte.

CRISPR wird auch für alle möglichen anderen Zwecke verwendet, vom Fingerabdruck von Zellen und der Protokollierung dessen, was in ihnen passiert, bis hin zur Steuerung der Evolution und der Schaffung von Gene Drives.

Der Schlüssel zu CRISPR sind die vielen Geschmacksrichtungen von “Cas”-Proteinen, die in Bakterien vorkommen und bei der Abwehr von Viren helfen. Das Cas9-Protein wird von Wissenschaftlern am häufigsten verwendet. Dieses Protein kann leicht so programmiert werden, dass es fast jede gewünschte Zielsequenz findet und daran bindet, indem man ihm einfach ein Stück RNA gibt, um es bei seiner Suche zu leiten.

Wenn das CRISPR-Cas9-Protein zusammen mit einem Stück Leit-RNA zu einer Zelle hinzugefügt wird, verbindet sich das Cas9-Protein mit der Leit-RNA und bewegt sich dann entlang der DNA-Stränge, bis es eine 20-DNA-Buchstaben lange Sequenz findet und an diese bindet stimmt mit einem Teil der Guide-RNA-Sequenz überein. Das ist beeindruckend, denn die DNA, die in jede unserer Zellen gepackt ist, hat sechs Milliarden Buchstaben und ist zwei Meter lang.

Was als nächstes passiert, kann variieren. Das Standardprotein Cas9 schneidet die DNA am Ziel. Wenn der Schnitt repariert ist, werden Mutationen eingeführt, die normalerweise ein Gen deaktivieren. Dies ist bei weitem die häufigste Anwendung von CRISPR. Man nennt es Genome Editing – oder Gene Editing – aber normalerweise sind die Ergebnisse nicht so präzise, ​​wie dieser Begriff vermuten lässt.

Mit CRISPR lassen sich auch gezielte Veränderungen vornehmen, etwa das Ersetzen fehlerhafter Gene – echtes Genome Editing – aber das ist weitaus schwieriger.

Es wurden maßgeschneiderte Cas-Proteine ​​entwickelt, die die DNA nicht schneiden oder in irgendeiner Weise verändern, sondern lediglich Gene ein- oder ausschalten: CRISPRa bzw. CRISPRi. Wieder andere, sogenannte Basiseditoren, ändern einen Buchstaben des DNA-Codes in einen anderen .

Warum nennen wir es CRISPR? Cas-Proteine ​​werden von Bakterien verwendet, um virale DNA zu zerstören. Sie fügen ihrem eigenen Genom virale DNA-Stücke hinzu, um die Cas-Proteine ​​zu leiten, und die seltsamen Muster dieser DNA-Stücke gaben CRISPR seinen Namen: geclusterte, regelmäßig angeordnete, kurze palindromische Wiederholungen. Michael Le Page


Cas9 und CRISPR als neues Werkzeug in der Molekularbiologie

Die Einfachheit der Typ-II-CRISPR-Nuklease mit nur drei erforderlichen Komponenten (Cas9 zusammen mit der crRNA und trRNA) macht dieses System für die Anpassung an die Genom-Editierung zugänglich. Dieses Potenzial wurde 2012 von den Labors Doudna und Charpentier (11) erkannt. Basierend auf dem zuvor beschriebenen Typ-II-CRISPR-System entwickelten die Autoren ein vereinfachtes Zweikomponentensystem, indem sie trRNA und crRNA zu einer einzigen synthetischen Single-Guide-RNA (sgRNA) kombinierten. Es wurde gezeigt, dass sgRNA-programmiertes Cas9 genauso effektiv ist wie Cas9, das mit separater trRNA und crRNA programmiert ist, um gezielte Genveränderungen zu steuern (Abbildung 2A).

Bis heute wurden drei verschiedene Varianten der Cas9-Nuklease in Genom-Editing-Protokolle übernommen. Das erste ist Wildtyp-Cas9, das doppelsträngige DNA ortsspezifisch spalten kann, was zur Aktivierung der Doppelstrangbruch-Reparaturmaschinerie (DSB) führt. DSBs können durch den zellulären Non-Homologous End Joining (NHEJ)-Weg (17) repariert werden, was zu Insertionen und/oder Deletionen (Indels) führt, die den Zielort unterbrechen. Alternativ, wenn eine Donor-Matrize mit Homologie zum Ziel-Locus bereitgestellt wird, kann das DSB durch den Homologie-Directed Repair (HDR)-Pfad repariert werden, was die Herstellung präziser Ersatzmutationen ermöglicht (Abbildung 2A) (17, 18).

Cong und Kollegen (1) führten das Cas9-System einen Schritt weiter in Richtung höherer Präzision, indem sie eine mutierte Form, bekannt als Cas9D10A, mit nur Nickase-Aktivität entwickelten. Dies bedeutet, dass es nur einen DNA-Strang spaltet und NHEJ nicht aktiviert. Stattdessen werden DNA-Reparaturen, wenn sie mit einem homologen Reparatur-Template ausgestattet sind, nur über den High-Fidelity-HDR-Weg durchgeführt, was zu weniger Indel-Mutationen führt (1, 11, 19). Cas9D10A ist in Bezug auf die Zielspezifität noch attraktiver, wenn Loci von gepaarten Cas9-Komplexen angesteuert werden, die darauf ausgelegt sind, benachbarte DNA-Nicks zu erzeugen (20) (siehe weitere Details zu &ldquogepaarten Nickasen&rdquo in Abbildung 2B).

Die dritte Variante ist ein Nuklease-defizientes Cas9 (dCas9, Abbildung 2C) (21). Die Mutationen H840A in der HNH-Domäne und D10A in der RuvC-Domäne inaktivieren die Spaltungsaktivität, verhindern jedoch nicht die DNA-Bindung (11, 22). Daher kann diese Variante verwendet werden, um sequenzspezifisch auf jede Region des Genoms ohne Spaltung abzuzielen. Stattdessen kann dCas9 durch Fusion mit verschiedenen Effektordomänen entweder als Gen-Silencing- oder Aktivierungswerkzeug verwendet werden (21, 23 &ndash 26). Darüber hinaus kann es als Visualisierungstool verwendet werden. Chen und Kollegen verwendeten beispielsweise dCas9 fusioniert mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), um repetitive DNA-Sequenzen mit einer einzelnen sgRNA oder nicht-repetitive Loci unter Verwendung mehrerer sgRNAs zu visualisieren (27).

Abbildung 2. CRISPR/Cas9-Systemanwendungen

A. Die Wildtyp-Cas9-Nukleasestelle spaltet spezifisch doppelsträngige DNA und aktiviert die Doppelstrangbruch-Reparaturmaschinerie. In Abwesenheit einer homologen Reparaturmatrize kann eine nicht-homologe Endverbindung dazu führen, dass Indels die Zielsequenz unterbrechen. Alternativ können präzise Mutationen und Knock-Ins hergestellt werden, indem ein homologes Reparaturmuster bereitgestellt wird und der homologiegerichtete Reparaturweg ausgenutzt wird.
B. Mutiertes Cas9 erzeugt einen ortsspezifischen Einzelstrang-Nick. Zwei sgRNA können verwendet werden, um einen gestaffelten Doppelstrangbruch einzuführen, der dann einer homologiegerichteten Reparatur unterzogen werden kann.
C. Nuklease-defizientes Cas9 kann mit verschiedenen Effektordomänen fusioniert werden, was eine spezifische Lokalisierung ermöglicht. Zum Beispiel Transkriptionsaktivatoren, Repressoren und fluoreszierende Proteine.


Wissenschaftler entwickeln den ersten CRISPR/Cas9-basierten Gene Drive in Pflanzen

Arabidopsis Pflanzen wurden verwendet, um den ersten CRISPR-Cas9-basierten Gene Drive in Pflanzen zu entwickeln. Bildnachweis: Zhao Lab, UC San Diego

Mit dem Ziel, widerstandsfähige Pflanzen zu züchten, die Dürre und Krankheiten besser widerstehen können, haben Wissenschaftler der University of California in San Diego den ersten CRISPR-Cas9-basierten Gene Drive in Pflanzen entwickelt.

Während die Gene-Drive-Technologie bei Insekten entwickelt wurde, um die Ausbreitung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten wie Malaria zu stoppen, demonstrierten Forscher im Labor von Professor Yunde Zhao zusammen mit Kollegen am Salk Institute for Biological Studies das erfolgreiche Design eines CRISPR-Cas9 -basierter Gene Drive, der genetische Elemente in Arabidopsis-Pflanzen schneidet und kopiert.

Die neue Forschung bricht mit den traditionellen Vererbungsregeln, die vorschreiben, dass Nachkommen genetisches Material von jedem Elternteil gleichermaßen erwerben (Mendelsche Genetik), und verwendet die CRISPR-Cas9-Editierung, um spezifische, gezielte Merkmale eines einzelnen Elternteils in nachfolgende Generationen zu übertragen. Solche Gentechnik könnte in der Landwirtschaft eingesetzt werden, um Pflanzen bei der Abwehr von Krankheiten zu helfen, um produktivere Pflanzen anzubauen. Die Technologie könnte auch dazu beitragen, Pflanzen gegen die Auswirkungen des Klimawandels wie zunehmende Dürrebedingungen in einer sich erwärmenden Welt zu schützen.

Die Forschung, die von dem Postdoktoranden Tao Zhang und dem Doktoranden Michael Mudget in Zhaos Labor geleitet wird, wird in der Zeitschrift veröffentlicht Naturkommunikation.

"Diese Arbeit widerspricht den genetischen Beschränkungen der sexuellen Fortpflanzung, dass ein Nachkommen 50% seines genetischen Materials von jedem Elternteil erbt", sagte Zhao, ein Mitglied der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie der Abteilung für biologische Wissenschaften. „Diese Arbeit ermöglicht die Vererbung beider Kopien der gewünschten Gene von nur einem Elternteil. Die Erkenntnisse können die für die Pflanzenzüchtung benötigten Generationen stark reduzieren.“

Die Studie ist die neueste Entwicklung von Forschern des Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) an der UC San Diego, die auf der Grundlage einer neuen Technologie namens „aktive Genetik“ aufgebaut wurde, die das Potenzial hat, die Populationsvererbung in einer Vielzahl von Anwendungen zu beeinflussen .

Die Entwicklung überlegener Pflanzen durch traditionelle genetische Vererbung kann teuer und zeitaufwändig sein, da Gene über mehrere Generationen weitergegeben werden. Mit der neuen aktiven Genetik-Technologie auf Basis von CRISPR-Cas9 können solche genetischen Verzerrungen viel schneller erreicht werden, sagen die Forscher.

"Ich freue mich, dass dieser Erfolg des Gene-Drives, der jetzt von Wissenschaftlern, die mit TIGS in Pflanzen verbunden sind, erzielt wurde und die Allgemeingültigkeit dieser zuvor an der UC San Diego demonstrierten Arbeit auf Insekten und Säugetiere ausdehnt", sagte Suresh Subramani, Global Director von TIGS. "Dieser Fortschritt wird die Pflanzen- und Pflanzenzüchtung revolutionieren und dazu beitragen, das globale Problem der Ernährungssicherheit anzugehen."


Anwendungen als Genome-Editing- und Genome-Targeting-Tool

Nach seiner ersten Demonstration im Jahr 2012 (9) ist das CRISPR/Cas9-System weit verbreitet. Dies wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um wichtige Gene in vielen Zelllinien und Organismen anzusteuern, darunter Mensch (34), Bakterien (41), Zebrafisch (32), C. elegans (42), Pflanzen (34), Xenopus Tropicalis (43), Hefe (44), Drosophila (45), Affen (46), Kaninchen (47), Schweinen (42), Ratten (48) und Mäusen (49). Mehrere Gruppen haben sich dieses Verfahren nun zunutze gemacht, um einzelne Punktmutationen (Deletionen oder Insertionen) in ein bestimmtes Zielgen über eine einzelne gRNA einzuführen (14, 21, 29). Unter Verwendung eines Paares von gRNA-gerichteten Cas9-Nukleasen stattdessen ist es auch möglich, große Deletionen oder genomische Umlagerungen wie Inversionen oder Translokationen zu induzieren (50). Eine neue aufregende Entwicklung ist die Verwendung der dCas9-Version des CRISPR/Cas9-Systems, um Proteindomänen für die transkriptionelle Regulation (26, 51, 52), epigenetische Modifikation (25) und mikroskopische Visualisierung spezifischer Genom-Loci (27) anzuvisieren.

Das CRISPR/Cas9-System erfordert lediglich die Neugestaltung der crRNA, um die Zielspezifität zu ändern. Dies steht im Gegensatz zu anderen Genom-Editing-Tools, einschließlich Zinkfinger und TALENs, bei denen eine Neugestaltung der Protein-DNA-Schnittstelle erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht CRISPR/Cas9 eine schnelle genomweite Abfrage der Genfunktion durch die Generierung großer gRNA-Bibliotheken (51, 53) für das genomische Screening.


Aufbau des Experiments

Um diese Fragen zu beantworten, bestand unsere Strategie (genannt "biochemische Rekonstitution") darin, das gesamte CRISPR-Cas9-System aus der komplexen Umgebung der Zelle herauszuholen und mit gereinigter RNA, DNA und Protein in einem Reagenzglas arbeiten zu lassen. Wie Sie sehen werden, erwies sich die Möglichkeit, verschiedene Reagenzglasreaktionen einzurichten, als sehr leistungsfähiger Ansatz zum Verständnis des CRISPR-Cas9-Mechanismus.

Herstellung von Cas9-Protein

Für unsere Experimente mussten wir das Protein Cas9 reinigen, eine Aufgabe, die schwierig sein kann und Wochen oder Monate dauern kann. Glücklicherweise kam ein energischer und talentierter Student aus Deutschland, Michael Hauer, gerade noch rechtzeitig ins Labor und arbeitete mit Martin zusammen, um den Proteinreinigungsprozess zu entwickeln. Er würde nur vier Monate in Berkeley bleiben, aber diese Monate würden sich als entscheidend für den Erfolg dieses Projekts erweisen.

Wissenschaftler nutzen das Bakterium Escherichia coli (E. coli) meist als Fabrik, um große Mengen eines bestimmten Proteins herzustellen. Um E. coli anzuweisen, welches Protein hergestellt werden soll, führen Wissenschaftler ein Plasmid, ein kreisförmiges DNA-Stück, in die Zelle ein. Dieser Vorgang der Insertion eines Plasmids in E. coli wird als "Transformation" bezeichnet. Im Inneren der Zelle liest die natürliche Maschinerie der Bakterien die Plasmid-DNA und beginnt mit der Produktion großer Mengen des gewünschten Proteins. E. coli kann sich ungefähr alle 20 Minuten teilen, so dass man nach nur wenigen Stunden Milliarden von Zellen mit Millionen von Proteinmolekülen in jeder erhalten kann. Als nächstes brechen wir die Zellen auf, um das darin enthaltene Protein freizusetzen. Sobald dies erledigt ist, besteht der nächste Schritt darin, Cas9 von anderen Proteinen sowie von DNA und RNA zu reinigen. Fortunately, our purification worked and Michael and Martin were able to obtain pure Cas9 (see Dig Deeper 1 on how this purification works).

We knew that a crRNA had to be involved in cutting DNA, since its sequence matched that of invading phage (see the Narrative on CRISPR by Barrangou ). We would make RNA from a DNA template in a test tube in a process called in vitro transcription. The minimal components required for transcription include a DNA template, RNA polymerase , and ribonucleotide triphosphates (UTP, ATP, GTP, CTP). When all of these components are added to a test tube for several hours, the RNA polymerase will produce millions of copies of a particular RNA (see Video 2 ).

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Video 2. Transcription. The process of making an RNA from a gene through the actions of the enzyme RNA polymerase. Video courtesy of HHMI BioInteractive. Please refer to the Terms of Use (https://www.hhmi.org/terms-of-use) for information on how this resource can be used.

From failure to success

In our first experiment, we wanted to test if Cas9 was the enzyme that cleaved the phage DNA. As described above, we knew that a crRNA had to be involved. Our first experiment was straightforward – combine Cas9 and crRNA with a target DNA (matching the crRNA) and see if the DNA was cut (we will discuss later the method we used to detect a cut in a DNA molecule). Disappointingly, nothing happened in our test-tube reaction – the DNA was not cut ( Figure 3 ).

Figure 3. The first test-tube reaction for DNA cutting, which did not work.

In science, many experiments "fail" (failure is in quotes because you can learn a lot from negative outcomes, as you will see). The key is not to get disappointed, but try to think through what to do next. Why did it not work? Was there a technical problem? Maybe we "killed" the cutting activity of Cas9 when we isolated it (see Dig Deeper 1 )? Or perhaps the conditions of our reaction in the test tube were not quite right? Maybe Cas9 was not the enzyme that cleaved the viral DNA? Or maybe we were missing something?

Thinking about the last possibility, our thoughts turned to the mysterious tracrRNA. We knew that it was involved in processing the crRNA. But could it also have a direct role in helping Cas9 to cut phage DNA?

We went back to the lab and set up our reactions again, now with three components – Cas9 enzyme, crRNA, and tracrRNA. To our delight, it worked! With two RNAs (crRNA and tracrRNA), Cas9 now could cut a DNA target. We were now on the right track ( Figure 4 ).

Figure 4. The second test-tube reaction for DNA cutting, which did work.

This experiment led us to propose a new model in which three components (Cas9, crRNA, and tracrRNA) come together to form a complex that searches for, identifies, and then cuts both strands of the DNA from an invading phage ( Figure 5 ).

Figure 5. CRISPR-Cas9 Cutting of DNA. Cas9 is an enzyme that binds tracrRNA and crRNA. The resulting complex scans along DNA, and if there is a sequence match to the crRNA, then it will cut the duplex DNA.

But we were not finished. This exciting result was followed by another eureka moment – could we join the crRNA and tracrRNA into one single RNA that would allow Cas9 to cut DNA? If so, could we then design a simple "single-guide RNA" (sgRNA) to cut any DNA sequence of our choosing?

Why would we want to build such a simple and sequence-specific DNA cutting system? The reason is when a DNA strand is cut, it can be repaired in a way that introduces a new DNA sequence into the repair site. If one could do this in a living organism, then one can potentially "rewrite" the DNA sequence in the genome of that organism. For example, let’s consider a patient who has a single mutated nucleotide in the hemoglobin gene that results in sickle cell anemia . Perhaps one could correct that one nucleotide to produce a normal protein and cure the disease.

In 2011, there were techniques for editing genes, but they were expensive, inefficient, and time-consuming. Thus, creating a simpler sequence-specific DNA cutting enzyme could have powerful applications. However, with three components (Cas9, crRNA, and tracrRNA), this system was not yet as simple as it could be. To make this programmable system even simpler to use, we wanted to reduce the naturally occurring three-component system (Cas9, crRNA, and tracrRNA) down to two components – Cas9 and a single RNA – which would be much easier to express in eukaryotic cells. Here is what happened in the key experiment described in the next section.


Cas9 Mechanism

The key step in editing an organism’s genome is selective targeting of a specific sequence of DNA. Two biological macromolecules, the Cas9 protein and guide RNA, interact to form a complex that can identify target sequences with high selectivity.

The Cas9 protein is responsible for locating and cleaving target DNA, both in natural and in artificial CRISPR/Cas systems. The Cas9 protein has six domains, REC I, REC II, Bridge Helix, PAM Interacting, HNH and RuvC (Figure 1) (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

The Rec I domain is the largest and is responsible for binding guide RNA. The role of the REC II domain is not yet well understood. The arginine-rich bridge helix is crucial for initiating cleavage activity upon binding of target DNA (Nishimasu et al. 2014). The PAM-Interacting domain confers PAM specificity and is therefore responsible for initiating binding to target DNA (Anders et al. 2014 Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014 Sternberg et al. 2014). The HNH and RuvC domains are nuclease domains that cut single-stranded DNA. They are highly homologous to HNH and RuvC domains found in other proteins (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

Figure 1: Cas9 Protein. The Cas9 protein is comprised of six domains: Rec I, Rec II, Bridge Helix, RuvC, HNH, and PAM Interacting. Domains are shown in schematic, crystal, and map form. (original figure) (crystal image rendered from PDB: 4CMP Jinek et al. 2014.)

The Cas9 protein remains inactive in the absence of guide RNA (Jinek et al. 2014). In engineered CRISPR systems, guide RNA is comprised of a single strand of RNA that forms a T-shape comprised of one tetraloop and two or three stem loops (Figure 2) (Jinek et al. 2012 Nishimasu et al. 2014). The guide RNA is engineered to have a 5′ end that is complimentary to the target DNA sequence.

Figure 2: Engineered Guide RNA. Engineered guide RNA is a single strand of RNA. It forms one tetraloop and two or three stem loops (three shown). Target complimentary region is shown in red. (original figure) (crystal image rendered from PDB: 4UN3 Anders et al. 2014.)

This artificial guide RNA binds to the Cas9 protein and, upon binding, induces a conformational change in the protein (Figure 3). The conformational change converts the inactive protein into its active form. The mechanism of the conformational change is not completely understood, but Jinek and colleagues hypothesize that steric interactions or weak binding between protein side chains and RNA bases may induce the change (Jinek et al. 2014).

Figure 3: Activation of Cas9 protein by guide RNA binding. Binding of the guide RNA induces a conformational change in the Cas9 protein. The conformational change causes activation of the Cas9 nuclease activity (Jinek et al. 2014). (original figure) (crystal image rendered from PDB: 4UN3 Anders et al. 2014)

Once the Cas9 protein is activated, it stochastically searches for target DNA by binding with sequences that match its protospacer adjacent motif (PAM) sequence (Sternberg et al. 2014). A PAM is a two- or three-base sequence located within one nucleotide downstream of the region complementary to the guide RNA. PAMs have been identified in all CRISPR systems, and the specific nucleotides that define PAMs are specific to the particular category of CRISPR system (Mojica et al. 2009). The PAM in Streptococcus pyogenes is 5′-NGG-3′ (Jinek et al. 2012). When the Cas9 protein finds a potential target sequence with the appropriate PAM, the protein will melt the bases immediately upstream of the PAM and pair them with the complementary region on the guide RNA (Sternberg et al. 2014). If the complementary region and the target region pair properly, the RuvC and HNH nuclease domains will cut the target DNA after the third nucleotide base upstream of the PAM (Anders et al. 2014) (Figure 4).

Figure 4: Target DNA binding and cleavage by Cas9. 1) Cas9 scans potential target DNA for the appropriate PAM (yellow stars). (2) When the protein finds the PAM, the protein:guide RNA complex will melt the bases immediately upstream of the PAM and pair them with the target complimentary region on the guide RNA (Sternberg et al. 2014). (3) If the complimentary region and the target region pair properly, the RuvC and HNH domains will cut the target DNA after the third nucleotide base upstream of the PAM. (original figure) (crystal images: Lower left and right rendered from PDB: 4UN3 Anders et al. 2014 Upper left rendered from PDB: 4CMP Jinek et al. 2014)


Our Role in Developing CRISPR/Cas9

We are proud to offer our newest line of CRISPR genome editing tools to the global research community. As the first company to commercially offer targeted genome editing technology nearly ten years ago, no one has more expertise in this field than us. This experience is especially important when it comes to crafting genome editing tools that possess the critical requirements of having specific targeting and robust cutting activity. We provide both in our new CRISPR product line, and now we put our skill into your hands with a quick and simple web-based design platform. Our CRISPR products can be ordered directly through the link below or browse the CRISPR content on this page to learn more about the technology.


Why Use CRISPR-Cas9 Antibodies?

Antibodies serve as great tool when working with Cas9 transfectants, and the top four reasons for using CRISPR-Cas9 antibodies are given below:

Ich. Transfection Efficiency

Verifying the success of CRISPR-Cas9 transfection is the primary reason to use CRISPR-Cas9 antibodies. Comparing the expression of Cas9 in transfected versus mock transfected cells is important to assess the efficiency of transfection. With the help of CRISPR-Cas9 antibodies, one can use Western blot and/or immunostaining to verify transfection efficiency.

Ii. CRISPR-Cas9 Expression

The levels as well as the duration of Cas9 expression are highly critical for CRISPR-Cas9 based genome editing. In stable clones, high expression levels of Cas9 may result in non-specific activity. This may be controlled through isolating multiple clones and screening them for Cas9 expression levels through Western blot analysis. For transient transfections, a chronic or prolonged expression of Cas9 may lead to the development of more off-target mutations. Transient nature of CRISPR-Cas9’s expression may be checked through Western blot analysis of the transfected samples collected at various time points.

Iii. Subcellular Localization

CRISPR-Cas9 must translocate to the nuclei of transfected cells for executing its effects on DNA. Nuclear localization of Cas9 may be verified through ICC/IF or IHC staining with CRISPR-Cas9 antibodies.

NS. Target Binding of CRISPR-Cas9

CRISPR based genome editing has two main elements: a synthetic RNA called “guide RNA” (gRNA) and a non-specific CRISPR-Cas9 enzyme. Structurally, the gRNA is composed of a “scaffold” sequence which is essential for Cas9 enzyme’s binding to gRNA and a user-designated “spacer” or “targeting” sequence which defines the genomic target to be manipulated. ChIP grade CRISPR-Cas9 antibodies are an excellent tool for testing the binding specificity of Cas9 enzyme using a gRNA of your choice and the primers for targeted/non-targeted region.


CRISPR/Cas9 gene editing can be used to eliminate entire chromosomes: a Q&A

In this Q&A, Hui Yang discusses his research published in Genombiologie, using CRISPR/Cas9 gene editing techniques to delete entire chromosomes, which may have implications for future therapeutics and our understanding of aneuploidy in tumorigenesis.

Why is eliminating an entire sex chromosome something you’ve been working on?

As is well known, CRISPR/Cas9 is an effective tool for gene editing, and this method has been widely used for editing genes or genomic regions by targeting specific single-guide RNA (sgRNAs). We initially planned to use the CRISPR/Cas9 system to study the biological functions of Y chromosome genes. The Y chromosome is highly specialized for male sex differentiation and fertility. However, so far only a few genes have been assessed for biological function in targeted knockout mice. Therefore, besides Y chromosome single-copy genes, we also tested whether Y chromosome genes with multiple copies could be efficiently deleted. To our surprise, we found that deletion of multiple-copy genes, Ssty1, Ssty2 und Rbmy1a1, resulted in sex reversal of male embryos. Experimental data revealed that the sex reversal was caused by an entire Y chromosome deletion, rather than the knockout of the multiple-copy genes. Thus, an entire chromosome, including sex chromosome X and Y, as well as an autosome, could be deleted by multiple DNA cleavages on the specific chromosome, induced by a sgRNA that targets multiple chromosome-specific sites or a cocktail of multiple sgRNAs, each targeting one specific site.

How does your study build on previous research?

With the advent of CRISPR/Cas9, scientists have been trying to apply this technique to multiple fields, including gene deletion, gene insertion, large fragment deletion and chromosome translocation. However, whether an entire chromosome could be deleted via CRISPR/Cas9 is an intriguing question. Previous studies showed that targeted chromosome elimination could be achieved by insertion of oppositely oriented loxP sites into a targeted chromosome followed by Cre-mediated sister-chromatid recombination, or by insertion of a TKNEO transgene into one copy of targeted chromosome followed by drug selection of chromosome-deletion clones via spontaneous chromosome loss. Both of these approaches require two-step manipulation and have a low yield of obtaining chromosome-deleted cells, thus unsuitable for in vivo Studien. By contrast, CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination offers a new approach to develop animal models with chromosome deletions, and a potential therapeutic strategy for human aneuploidy diseases involving additional chromosomes.

What are the clinical implications of this technique? Could you highlight a few specific conditions that this could prevent in the future?

Aneuploidy is a human genetic disorder related to the addition or deletion of a chromosome, leading to significant morbidity and mortality during infancy or childhood, including Down’s syndrome (an extra 21), Klinefelter Syndrome (an extra X) or XYY syndrome. Using CRISPR/Cas9 – mediated targeted chromosome elimination, an extra chromosome could be selectively eliminated in cultured cells, embryos, and, more importantly, tissues in vivo, providing a potential therapeutic approach for aneuploidy diseases. However, when one of two homologous X chromosome was deleted by this approach, we found that the remaining X chromosome was also mutated. We believe these mutations in the remaining one (XXY and XYY syndrome) or two chromosomes (Down’s syndrome) could be avoided by using sgRNAs that target only one of the two or one of the three homologous chromosomes, based on single nucleotide polymorphism. Aneuploidy is also a hallmark of cancer. CRISPR/Cas9 – mediated targeted chromosome elimination offers a new approach for studying aneuploidy in tumorigenesis and a potential treatment strategy against a broad spectrum of human tumors.

Could you describe how you achieved the elimination of a whole chromosome, what were the main challenges?

CRISPR/Cas9 is like a molecular scissor, which can specifically cut designated positions in a DNA sequence through the guide of sgRNA. In essence, the chromosome is a series of very long DNA sequences, with repetitive sequences on it. These repetitive sequences come up at particular intervals. By designing sgRNAs targeting these repetitive sequences, CRISPR/Cas9 can break all the repeats in the chromosome. You can image that as a tie being cut hundreds of times, and the chromosome would be destroyed beyond the limits of cell repair. Therefore, the targeted chromosome cannot participate in the process of DNA replication during the cell division, and will disappear in the offspring.

The main challenge of this technique is how to induce multiple DNA cleavages efficiently. The efficiency of chromosome deletion varies among different repeat sequences and it is very hard to predict whether these repetitive sequences “work well”. The other challenge is how to selectively targeted one of two or three chromosomes.

What are the ethical implications of gene editing techniques like CRISPR?

As researchers in the field of gene-editing, we all believe that this technology will play an important role in therapeutic treatment. Meanwhile, we fully understand the ethical concerns of this technique in society today, so we always support and obey ethical guidelines regarding use in editing human germ cell, terrorism, threats to ecological security and other guidelines proposed by specialists in the international conference of stem cells, etc. There are many issues to be solved before using this technique to treat patients, such as targeting efficiency, delivery methods and off-target effects. All technologies require necessary rules to constrain, thus we will communicate with various circles of society to ensure the safety of people and the environment.


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