Information

Wo finde ich die gewebespezifischen Proteinexpressionsspiegel für hTERT (Telomerase-Untereinheit)?

Wo finde ich die gewebespezifischen Proteinexpressionsspiegel für hTERT (Telomerase-Untereinheit)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich finde eine Reihe widersprüchlicher Quellen bezüglich der Gewebe, in denen hTERT - das Protein - exprimiert wird. Kennt jemand eine Quelle, die zuverlässig (so verbindlich oder weithin akzeptiert wie möglich) die verschiedenen Gewebe und Proteinexpressionsniveaus von hTERT auflistet?

Gibt es eine ähnliche Quelle für die Genexpression von hTERT?


Ich habe festgestellt, dass biogps.org alle benötigten Expressionsdaten enthält:

https://biogps.org

https://biogps.org/#goto=genereport&id=7015


Mechanismen der reversen Transkriptase der humanen Telomerase (hTERT) Regulierung: klinische Auswirkungen bei Krebs

Grenzenlose Selbsterneuerung ist eines der Kennzeichen von Krebs und wird durch die Erhaltung der Telomere erreicht, im Wesentlichen durch die Telomerase (hTERT) Aktivierung. Transkriptionelle Regulierung von hTERT Es wird angenommen, dass es eine wichtige Rolle bei der Telomerase-Aktivierung bei menschlichen Krebserkrankungen spielt.

Hauptkörper

Das dominierende Interesse an Telomerase resultiert aus ihrer Rolle bei Krebs. Die Rolle von Telomeren und Telomererhaltungsmechanismen ist als eine der Haupttriebkräfte bei der Erzeugung chromosomaler und genomischer Instabilität bekannt. Krebszellen haben die Fähigkeit erworben, ihr Alter der Seneszenz über Mechanismen zur Erhaltung der Telomerlänge zu überwinden, hauptsächlich durch Telomerase-Aktivierung.

hTERT Expression wird in Tumoren über mehrere genetische und epigenetische Mechanismen hochreguliert, einschließlich hTERT Verstärkungen, hTERT bauliche Varianten, hTERT Promotormutationen und epigenetische Modifikationen durch hTERT Promotor-Methylierung. Genetisch (hTERT Promotormutationen) und epigenetische (hTERT Promotormethylierung und miRNAs)-Ereignisse haben gezeigt, dass sie klinische Auswirkungen bei Krebs haben, die von h . abhängenTERT Aktivierung. Da Telomere für die zelluläre Selbsterneuerung entscheidend sind, spielen die für die Telomererhaltung verantwortlichen Mechanismen eine entscheidende Rolle bei Krebserkrankungen und könnten wichtige onkologische Biomarker sein. Also anstatt zu quantifizieren TERT Expression und ihre Korrelation mit der Telomerase-Aktivierung, die Entdeckung und Bewertung der verantwortlichen Mechanismen für TERT Die Hochregulation bietet wichtige Informationen, die für Diagnose, Prognose und Therapieüberwachung in der Onkologie genutzt werden können. Darüber hinaus kann ein besseres Verständnis dieser Mechanismen ihre Umsetzung in wirksame zielgerichtete Krebstherapien fördern.

Abschluss

Hier haben wir die zugrunde liegenden Mechanismen von hTERT Regulation, ihre Rolle bei der Onkogenese und die möglichen klinischen Anwendungen bei Telomerase-abhängigen Krebsarten.


Einführung

Telomere sind DNA-Protein-Strukturen, die sich an den Enden linearer Chromosomen befinden. Sie tragen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität bei, indem sie eine spezielle Kappenstruktur bilden, die die Chromosomenenden vor Abbau, End-to-End-Fusionen und Translokationen schützt (Bailey & Murnane, 2006). Säugetier-Telomere bestehen aus telomerischer DNA [sowohl einzelsträngiger (ss) als auch doppelsträngiger (ds) DNA] und einer Vielzahl von Proteinen, deren Kern als Shetterin-Komplex bezeichnet wird (Palm & de Lange, 2008). Beim Menschen besteht die telomere DNA aus einem Tandem-Array von TTAGGG-Wiederholungen, die bei der Geburt von 10 bis 15 kb reichen. In normalen Zellen verkürzen sich die Telomere nach jeder Zellteilungsrunde, weil konventionelle DNA-Polymerasen die Enden der linearen DNA nicht replizieren können (Olovnikov, 1973 Harley et al., 1990). Telomere werden als die molekulare Uhr angesehen, die die proliferative Kapazität von Zellen begrenzt, da gezeigt wurde, dass kurze Telomere eine replikative Seneszenz induzieren (Counter, 1996). Darüber hinaus wurde die Verkürzung der Telomere mit dem Altern des Organismus und mehreren altersbedingten menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht ( Garcia et al., 2007). Mechanismen, die die Telomerlänge und die gesamte Telomerstruktur aufrechterhalten können, können zu einer verlängerten Zellproliferation und damit zu einer Verlängerung der Lebensdauer führen ( Bodnar et al., 1998 Vaziri & Benchimol, 1998 Shay & Wright, 2007 Palm & de Lange, 2008).

Der Mechanismus, durch den die meisten Eukaryoten ihre Telomere synthetisieren und erhalten, erfolgt über das Enzym Telomerase, ein Ribonukleoprotein RT. Telomerase besteht minimal aus einer katalytischen Proteinuntereinheit, der Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) und einem RNA-Molekül, der Telomerase-RNA (TR) (Greider & Blackburn, 1985, 1989). Um telomere Wiederholungen zu synthetisieren de novo, TERT transkribiert eine RNA-Matrize innerhalb von TR auf die 3'-Enden von ssDNA (Autexier & Lue, 2006). Ein einzigartiges Merkmal der Telomerase ist ihre Fähigkeit, mehrere Runden der Telomersynthese zu katalysieren, ohne vom DNA-Substrat zu dissoziieren, eine Eigenschaft, die als Repeat-Addition-Processivity (RAP) bekannt ist (Greider, 1991).

Defekte in der Regulation oder Expression einer beliebigen Telomerasekomponente wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Pathologien in Verbindung gebracht. Beispielsweise wurde bei vielen menschlichen Krebsarten eine Hochregulation der Telomerase festgestellt (Kim et al., 1994), während eine verminderte Telomeraseaktivität und kurze Telomere mit mehreren vorzeitigen Alterungskrankheiten in Verbindung gebracht werden (Garcia et al., 2007). Kürzlich wurden Mutationen in der hTERT und hTR Gene wurden bei einer Untergruppe von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF) identifiziert ( Armanios et al., 2007 Tsakiri et al., 2007). IPF ist eine fortschreitende und tödliche Lungenerkrankung, die durch Fibrose und Schädigung des Lungenparenchyms und insbesondere des Alveolarepithels gekennzeichnet ist (Dempsey, 2006). Während die Ursache der Verletzung unbekannt ist, spiegeln die Stellen einer aktiven Fibrose eine unsachgemäße Reparatur des beschädigten Alveolarepithels wider, und das Vorhandensein von Fibroblastenherden und alveolärer Apoptose wird als Kennzeichen von IPF angesehen (Dempsey, 2006). IPF ist eine vorzeitige Alterungserkrankung, die typischerweise nach dem fünften Lebensjahrzehnt auftritt, wobei die Prävalenz mit dem Alter zunimmt. Die mittlere Sterblichkeit für die Krankheit beträgt ungefähr 3 Jahre nach der Erstdiagnose, und derzeit gibt es keine endgültigen Behandlungen. Eine der Schwierigkeiten bei der Entwicklung therapeutischer Strategien für IPF ist der unklare Mechanismus, der für die Ätiologie der Krankheit verantwortlich ist. Daher ist die Aufdeckung der molekularen Mechanismen hinter dem Ausbruch und der Entwicklung von IPF entscheidend für das Verständnis dieser Krankheit.

Während die Mehrheit der IPF-Fälle als sporadisch angesehen wird, haben etwa 15–20 % der Patienten mit IPF eine Familienanamnese der Krankheit, bei der das Vererbungsmuster mit einer autosomalen Dominanz mit variabler Penetranz übereinstimmt ( Marney et al., 2001). 2007, Tsakiri et al. identifizierte mehrere heterozygote hTERT Keimbahnmutationen bei Untergruppen von Patienten mit familiärer IPF. Sie stellten auch fest, dass Träger der hTERT Mutationen zeigten kürzere Telomere im Vergleich zu gleichaltrigen Familienmitgliedern, die die Mutationen nicht trugen. Dies legt nahe, dass eine Telomerase-Haploinsuffizienz zu einer beschleunigten Telomerverkürzung führen und somit zur Entwicklung von IPF beitragen kann.

Da die molekularen Mechanismen von IPF weitgehend unbekannt waren, untersuchten wir, wie IPF-assoziierte hTERT Mutationen beeinflussen die Telomerasefunktion. Insbesondere haben wir die Auswirkungen von drei zuvor identifizierten hTERT-Mutationen charakterisiert, die den Aminosäuresubstitutionen V144M, R865C und R865H entsprechen ( Tsakiri et al., 2007) zur Telomerasefunktion. Da sich der V144-Rest in der TEN-Domäne des N-Terminus befindet und der R865-Rest innerhalb des Motivs C der hochkonservierten RT-Domäne (Fig. 1A), stellten wir die Hypothese auf, dass diese IPF-assoziierten hTERT-Mutationen die Telomerasefunktion stören würden. Biochemische und zelluläre Techniken wurden verwendet, um die Wirkung dieser Mutationen auf RAP, DNA-Bindung und telomerische DNA-Synthese und das Zellwachstum zu bestimmen. Diese Studien haben es uns ermöglicht, hTERT V144 und R865 als zwei Reste zu identifizieren, die eine entscheidende Rolle bei der Telomerasefunktion, der Telomerverlängerung und der zellulären Immortalisierung spielen.

In vitro Telomerase-Aktivitäten von drei IPF-assoziierten hTERT-Mutanten. (A) Lineare Darstellung der hTERT-Proteinuntereinheit der Telomerase, in der sowohl hTERT V144 als auch R865 zwischen verschiedenen Spezies gut konserviert sind. (B) Rekonstituierte Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (RRL)-Reaktionen, die hTERT-Wildtyp (WT), V144M, R865C oder R865H enthielten, zeigten alle in vitro Telomerase-Aktivität unter Verwendung des Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assays in Abwesenheit (–) von RNAse A. Zugabe (+) von RNAse A hob die Telomerase-Aktivität auf. Die Dreiecke stellen fünffache Verdünnungen jeder Reaktion dar, um sicherzustellen, dass die Amplifikationsassays im linearen Bereich lagen. RRL, das einen leeren pCI-Vektor enthielt, war die Negativkontrolle. Da der TRAP ein PCR-basierter Assay ist, kann er nicht verwendet werden, um die DNA-Gesamtsynthese oder die Prozessivität der wiederholten Addition zu quantifizieren, daher wurde auch ein spezifischerer konventioneller Telomerase-Assay (CTA)-Assay durchgeführt (C). Die CTA zeigte, dass hTERT V144M ähnliche Aktivitätsniveaus (dargestellt als DNA-Synthese) wie hTERT WT aufwies, jedoch wiesen hTERT R865C und R865H einen schwerwiegenden Defekt in der DNA-Synthese auf. (D) Die Co-Expression von hTERT WT und hTERT V144M, R865C oder R865H zeigte ähnliche Aktivitätsniveaus wie hTERT WT allein. IPF, idiopathische Lungenfibrose.


<p>Dieser Abschnitt bietet nützliche Informationen über das Protein, hauptsächlich biologisches Wissen.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Mehr. </a></p> Funktion i

Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Enzym, das bei den meisten Eukaryoten für die Replikation der Chromosomentermini essentiell ist. Aktiv in Vorläufer- und Krebszellen. Inaktive oder sehr geringe Aktivität in normalen Körperzellen. Katalytische Komponente des Teleromerase-Holoenzymkomplexes, deren Hauptaktivität die Verlängerung von Telomeren ist, indem sie als reverse Transkriptase wirkt, die einfache Sequenzwiederholungen an Chromosomenenden hinzufügt, indem sie eine Matrizensequenz innerhalb der RNA-Komponente des Enzyms kopiert. Katalysiert die RNA-abhängige Verlängerung von 3'-chromosomalen Termini mit der 6-Nukleotid-Telomer-Wiederholungseinheit, 5'-TTAGGG-3'. Der Katalysezyklus umfasst Primerbindung, Primerverlängerung und Produktfreisetzung, sobald die Matrizengrenze erreicht wurde, oder eine entstehende Produkttranslokation gefolgt von einer weiteren Verlängerung. Aktiver auf Substraten mit 2 oder 3 Telomer-Wiederholungen. Die Telomerase-Aktivität wird durch eine Reihe von Faktoren reguliert, einschließlich Telomerase-Komplex-assoziierter Proteine, Chaperone und Polypeptid-Modifikatoren. Moduliert die Wnt-Signalisierung. Spielt eine wichtige Rolle beim Altern und bei der Antiapoptose.

<p>Manuell kuratierte Informationen, für die experimentelle Beweise veröffentlicht wurden.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Mehr. </a></p> Manuelle Behauptung basierend auf dem Experiment in i


MATERIALEN UND METHODEN

Zellkultur

C33A-, SiHa-, ME180- und HeLa-Zelllinien, die von Gebärmutterhalskrebs abgeleitet sind, sowie TSU-PR1-, PC3- und DU145-Zelllinien, die von Prostatakrebs abgeleitet sind, wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Leukämiezelllinie K562 wurde von der Human Science Research Rescue Bank erhalten. Die ersteren Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium und die letzteren in RPMI 1640 gezüchtet, die beide mit 10 % fötalem Kälberserum in Gegenwart von 5 % CO . ergänzt wurden2. Um die Zelldifferenzierung zu induzieren, wurden K562-Zellen mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) bei einer Endkonzentration von 80 nM für 48–72 h inkubiert.

Plasmidkonstruktion

Die Strukturen von hTERT-Promotor-Luciferase-Konstrukten wurden in einer früheren Studie beschrieben (21). Diese Reporterplasmide wurden mit dem Enhancer/Promotor-losen pGL3-basischen Luciferase-Reporterplasmid (Promega, Madison, WI) konstruiert. Der MZF-2-Expressionsvektor (pEF-BOS/MYC-MZF2), der freundlicherweise von Dr. S. Nagata (Osaka University, Osaka, Japan) zur Verfügung gestellt wurde, enthielt die MZF-2-cDNA, die vom Elongationsfaktor-Promotor und dem c-myc-Epitop-Peptid gesteuert wird Sequenzen im N-terminalen Ende der menschlichen MZF-2-cDNA (26). Eine auf PCR basierende ortsgerichtete Mutagenese wurde durchgeführt, um das mutierte Reporterplasmid pGL3-776-MZF2MT (27) zu konstruieren, in dem vier Konsensus-Bindungsmotive für MZF-2 im potentiellen Silencer des hTERT-Promotors durch Substitutionsmutation verändert wurden.

Luciferase-Assay

Die vorübergehende Transfektion von Luciferase-Reporterplasmiden in adhärente Zelllinien C33A, SiHa, HeLa und ME100 und nicht-adhärente K562-Zellen wurde mit LipofectAMINE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) bzw. Tfx-20 (Promega) gemäß den empfohlenen Protokollen durchgeführt von den Herstellern. Luciferase-Assays wurden mit dem Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) durchgeführt, bei dem Renilla Luciferase-Plasmide wurden als Kontrollplasmide co-transfiziert, um die Transkriptionseffizienz zu standardisieren. Alle Experimente wurden mit jedem Plasmid mindestens dreimal durchgeführt und die Ergebnisse sind Durchschnittswerte der relativen Luciferaseaktivität.

Stretch-PCR-Assay

Zur quantitativen Analyse der Telomerase-Aktivität wurden Stretch-PCR-Assays unter Verwendung des Telochaser-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Toyobo, Tokio, Japan) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf einem 7% Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und mit SYBR Green I Nukleinsäure-Gelfärbung (FMC BioProducts, Rockland, ME) sichtbar gemacht. Um die Effizienz der PCR-Amplifikation zu überwachen, wurden dem PCR-Ansatz pro Reaktion 10 ng interne Kontrollen aus λ-Phagen-DNA-Sequenzen (Toyobo) zusammen mit 50 pmol spezifischer Primer (Toyobo) zugesetzt. Die relative Telomeraseaktivität wurde bestimmt, indem die Bandenintensitäten der Telomeraseleitern gemessen und mit denen der internen Kontrollen verglichen wurden. Die Bandenintensität wurde unter Verwendung der NIH-Bildanalysesoftware gemessen.

RT-PCR-Assay

Die Herstellung von Gesamt-RNA aus Zelllinien erfolgte nach dem zuvor beschriebenen AGPC-Verfahren (28). Erststrang-cDNAs wurden mit AMV reverser Transkriptase (Pharmacia) mit 1 ug Gesamt-RNA aus den Zelllinien synthetisiert. Die aus jeder RNA-Probe synthetisierten cDNAs wurden in 50 µl Reaktionsmischung mit 2 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM KCl, 0,01 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 5 % Glycerin, 1 mM MgCl&sub2;2, 0,05 % Tween-20, 0,05 % Nonidet P-40, 5 U Taq DNA-Polymerase, jeweils 200 µM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 5 µCi [ 32 P]dCTP und 0,4 µM Sense- und Antisense-Primer. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Minute auf 90 °C erhitzt und dann wurden 26 PCR-Zyklen durchgeführt, einschließlich Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute, Annealing bei 65 °C für 1 Minute und Verlängerung bei 72 °C für 1,5 Minuten. Die PCR-Produkte wurden auf einem 8% Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und getrocknete Gele wurden durch Autoradiographie analysiert. Für PCR-Reaktionen wurden Sense- und Antisense-Oligonukleotidprimer für MZF-2 (5'-CCGGAGATGGGT-CACAGTCC-3' und 5'-TTGCTGAACACCTTGCCAC-3') verwendet. Die Effizienz der cDNA-Synthese aus jeder Probe wurde durch PCR mit GAPDH-spezifischen Primern, wie zuvor beschrieben, abgeschätzt (27).

Gelshift-Assay

Kernextrakte aus Cos7- und C33A-Zellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (26). Zur Überexpression von MZF-2 in Cos7-Zellen wurden 10 µg MZF-2-Expressionsvektor in 10 5 Cos7-Zellen nach der DEAE-Dextran-Methode (28) in 60 mm Kulturschalen transfiziert. Nach 48 h Transfektion wurden die Zellen geerntet und Kernextrakte hergestellt. Als Negativkontrolle wurden leere Vektoren auf die gleiche Weise transfiziert. In Gelshift-Assays wurden 5–10 µg Kernextrakte mit 0,5 µg Poly(dI·dC) in Gegenwart oder Abwesenheit von unmarkierten Kompetitoren auf Eis 20 min in einem 25 µl Reaktionsvolumen mit 10 % Glycerin, 25 mM HEPES, pH . inkubiert 7,9, 50 mM KCl, 0,5 mM PMSF, 1 mM Dithiothreitol und 4 mg/ml Rinderserumalbumin. Nach der Inkubation 10 000 c.p.m. von 32 P-Ende-markierten Oligonukleotidsonden mit den MZF-2-Konsensusmotiven bei –687 (5′-GTTTGCTCATGGTGGGGACCCCTCGCCG-3′) oder mutierten Oligonukleotiden (5′-GTTTGCTCATGGTAAAGACCCCTCGCCG-3′) wurden hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 4° . inkubiert C für weitere 20 min. Nach der Elektrophorese auf einem 4% Polyacrylamidgel wurde das Gel getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen. Für Supersift-Assays wurde Anti-c-Myc-Epitop-Tag-Antikörper (9E10 SantaCruz) mit Kernextrakten für 1 Stunde bei 4 °C vorinkubiert, gefolgt von einer Bindungsreaktion.


Reduzierte hTERT-Proteinspiegel sind mit DNA-Aneuploidie in der Dickdarmschleimhaut von Patienten mit langjähriger Colitis ulcerosa verbunden

Copyright: © Friis-Ottessen et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License [CC BY_NC 3.0] verbreitet wird.

Dieser Artikel wird erwähnt in:

Abstrakt

Einführung

Colitis ulcerosa (UC) ist eine entzündliche Darmerkrankung, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Dickdarmkrebs verbunden ist, und es wird geschätzt, dass 10 % der Patienten, die seit >10 Jahren an CU leiden, Dickdarmkrebs entwickeln (1,2). Die zugrunde liegende Pathogenese ist nicht vollständig bekannt, aber eine chronische Entzündung verzerrt die Schleimhautmorphologie und induziert Dysplasie und in der Folge Krebs. Karzinome treten vor allem nach längerer Krankheitsdauer von 8–10 Jahren auf (3) und entwickeln sich durch niedrig- und hochgradige Dysplasien. Es wird berichtet, dass Patienten, die nur eine Läsion mit einer Dysplasie von niedrigem Grad aufweisen, auch Karzinome aufweisen können (4). Die Dickdarmschleimhaut von CU-Patienten kann auch schwere molekulare Anomalien wie Chromosomeninstabilität (5) und DNA-Aneuploidie aufweisen. DNA-Aneuploidie kann in dysplastischen und nicht-dysplastischen Schleimhäuten von CU-Patienten vorhanden sein und soll mit der Krankheitsdauer in Zusammenhang stehen (6–9). Es kann als unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung eines Adenokarzinoms bei CU charakterisiert werden (10,11). CU-Patienten, die Dysplasie oder Adenokarzinome entwickeln, werden normalerweise als progressiv angesehen, während Patienten, die diese Phänotypen während eines Lebens mit CU nicht entwickeln, als nicht-progressiv gelten. Da die DNA-Aneuploidie als unabhängiger Risikofaktor für Malignome der UC-Kolonschleimhaut angesehen werden kann, haben wir dies auch als definierendes Merkmal eines UC-Progressor-Falls aufgenommen. Die Mechanismen, die ein UC-Kolon zu einem Progressor oder zu einem Non-Progressor machen, sind nicht vollständig bekannt, und es ist daher von Interesse, die Unterschiede in den molekularen Eigenschaften der Schleimhaut zwischen diesen beiden Typen von UC-betroffenen Kolon zu untersuchen. Molekulare Charakteristika von dysplastischen und nicht-dysplastischen Läsionen innerhalb eines Progressors, die bei nicht-progressiven Patienten nicht gefunden werden, könnten einen Beitrag zum Verständnis der Mechanismen der Karzinogenese im Dickdarmkolon leisten, die als Marker für gefährdete Personen dienen könnten.

Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, das in der Lage ist, die Telomersequenz zu verlängern, von dem allgemein bekannt ist, dass es in Keimbahnzellen aktiv und in den meisten somatischen Zellen inaktiv ist. Die beiden Hauptuntereinheiten der Telomerase sind die katalytische Untereinheit TERT-Telomerase reverse Transkriptase (hTERT beim Menschen) und TR (TER), die RNA-Komponente (hTR oder hTER beim Menschen). Neben hTERT und hTR sind auch eine Reihe von akzessorischen Proteinen eng mit dem Komplex assoziiert (12). Es wird allgemein angenommen, dass der hTERT-Spiegel ein limitierender Faktor für den Aufbau des Telomerase-Komplexes ist, und es wird berichtet, dass hTERT auch eine Rolle bei der Zellproliferation spielen kann, unabhängig von seiner Rolle bei der Telomerverlängerung (13). Telomerase-Aktivität wird häufig in Krebszellen berichtet, und

80–90% aller soliden Tumoren, einschließlich Darmkrebs, haben eine Telomeraseaktivität (14–16). Telomerase ermöglicht Krebszellen die replikative Unsterblichkeit, die eines der Kennzeichen von Krebs ist (17). Die Telomerase-Aktivität kann daher die Lebensdauer einer Zelle verlängern, was zu einer Anhäufung genetischer Veränderungen in der Zelle führt, die wiederum zur Entstehung von Krebs beitragen können (18). Bei CU-Schleimhaut variieren die Berichte über die Telomerase-Aktivität jedoch von verringerten Spiegeln (19), Spiegeln, die sich nicht von Nicht-UC-Kolonen unterscheiden (20–22), bis hin zu Berichten über erhöhte Aktivität (23, 24). Alle diese Untersuchungen verwendeten Versionen des Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assays oder PCR-ELISA, gültige Methoden zur Messung der Telomeraseaktivität in einer Probe unter Verwendung von Gewebeextrakten. Aufgrund der oft hohen Entzündungswerte in einem UC-Kolon sind erhöhte Mengen an Makrophagen und Neutrophilen vorhanden, und Gewebeextrakte aus der Kolonschleimhaut von UC-Patienten können daher diese Zelltypen umfassen. Ein TRAP-Assay aus Kolonschleimhautzellen kann daher die Telomeraseaktivität in Makrophagen und Leukozyten im Gewebe nicht von der der Epithelzellen unterscheiden, was die Interpretation der Ergebnisse erschwert. Insbesondere in einer Studie zur Telomerase-Aktivität in CU-Kolonschleimhaut, bei der Schleimhautzellen von Stromazellen getrennt wurden, zeigten die Ergebnisse unterschiedliche Aktivitätsniveaus in den beiden Sätzen. Die Telomeraseaktivität wurde in dysplastischer Schleimhaut als niedrig angegeben, und es wurde eine Korrelation zwischen Telomeraseaktivität und Entzündung festgestellt. In diesem Bericht wurde der DNA-Status nicht berücksichtigt (22). Es wurde auch darüber spekuliert, ob eine erhöhte Telomerase-Aktivität in der UC-Schleimhaut eine direkte Folge einer verstärkten Zellproliferation in aktiv entzündetem Dickdarmgewebe ist (24).

In der vorliegenden Studie verwendeten wir Immunhistochemie (IHC), um die hTERT-Spiegel in UC-Material zu bestimmen, da sie den Vorteil bietet, die Proteinexpression in bestimmten Zelltypen innerhalb des untersuchten Gewebes zu beurteilen, wodurch Makrophagen und Neutrophile ausgeschlossen werden können, die hTERT . verschleiern würden Ebene Daten. Wir untersuchten die hTERT-Proteinspiegel mit IHC in den Kolonschleimhautzellen einer Reihe von progressiven und nicht-progressiven Kolonen von Patienten mit langjähriger CU, um zu untersuchen, ob Unterschiede in der hTERT-Expression mit dem progressiven Status, der Entwicklung der Schleimhautdysplastik oder mit DNA- Ploidie-Status.

Materialen und Methoden

Patienten

Dreißig Patienten mit langjähriger CU wurden in diesen Bericht eingeschlossen. Alle Patienten litten vor der Kolektomie seit >10 Jahren an CU, und einige Patienten hatten bis zu 30 Jahre lang gelitten. Auch das Alter der Patienten zum Zeitpunkt des ersten Auftretens der Symptome war sehr unterschiedlich (im Alter von 10 bis 60 Jahren). Die 10 Patienten ohne Progression umfassten 5 Männer und 5 Frauen. Zu den Progressiven gehörten 17 Rüden und 3 Hündinnen. Die Verwendung dieses Materials zu Forschungszwecken wurde von der regionalen Ethikkommission, REK S-06062, ethisch genehmigt.

UC-Kolektomien: Progressive und Nicht-Progressoren

Die Kolektomiepräparate wurden bereits von Burum-Auensen et al. beschrieben (25). Die Kolektomien (n=30) wurden in Progressive und Non-Progressor eingeteilt, wobei 10 Non-Progressoren ohne dysplastische Läsionen und 20 Progressoren mit mindestens einem Dysplasie-/Krebsbereich auftraten. Die Mehrzahl der Fälle zeigte auch eine DNA-Aneuploidie.

Mindestens acht Stellen von jeder Kolektomie wurden untersucht, und innerhalb der Progressoren wurden 83 nicht-dysplastische Bereiche, 31 Bereiche mit unbestimmter Dysplasie, 29 Bereiche mit Dysplasie und 8 Adenokarzinome identifiziert. Da sich unsere Analysen auf präkanzeröse Morphologieveränderungen konzentrierten, wurden die Adenokarzinome ausgeschlossen. Insgesamt 18 nicht-dysplastische und 7 dysplastische Bereiche zeigten eine DNA-Aneuploidie. Die fortschreitenden Läsionen sind in Tabelle I gezeigt. Per Definition waren die nicht fortschreitenden Läsionen diploid und nicht dysplastisch.

Tabelle I

Zusammenfassung der Läsionen in den Progressor-Kolektomien (n=20) nach Morphologie und DNA-Ploidie-Status.

Tabelle I

Zusammenfassung der Läsionen in den Progressor-Kolektomien (n=20) nach Morphologie und DNA-Ploidie-Status.

Dickdarmprobe #
30 70 71 99 132 159 164 169 174 176 177 191 192 199 205 225 1514 1701 1729 1789
Diploid Nicht-Dysplasie 5 5 2 1 1 3 1 2 7 2 3 5 4 3 6 5 6 3 0 1
Unbestimmte Dysplasie 0 0 0 0 2 1 2 1 0 2 1 0 1 5 2 1 1 2 2 0
Dysplasie 0 2 0 3 1 1 2 0 1 0 0 0 1 0 1 2 0 2 6 0
Adenokarzinoma 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0
Aneuploid Nicht-Dysplasie 1 0 0 0 0 3 1 1 1 4 2 2 0 0 0 0 1 1 0 1
Unbestimmte Dysplasie 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 3
Dysplasie 0 0 0 1 1 1 2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Adenokarzinoma 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

a Adenokarzinome wurden aus den Analysen entfernt.

HTERT IHC

Gewebe-Mikroarrays (TMAs) von acht Stellen innerhalb jedes Dickdarms wurden unter Verwendung eines Beecher-Gewebe-Mikroarrays, wie zuvor beschrieben (25), hergestellt. Die Kerngröße betrug 0,6 mm. Alle Kerne wurden zuvor von einem erfahrenen Pathologen (OPFC) ausgewertet. Mindestens zwei Gewebekerne aus jeder Schleimhautregion wurden entnommen. Als Positivkontrollen wurden zwei Tonsillenschnitte verwendet. Schnitte (4 &mgr;m) wurden für 10 min einer 0,5% H 2 O 2 -Lösung ausgesetzt, gefolgt von einer Antigengewinnung im Citratpuffer bei pH 6,0. Die Inkubation von TMAs mit dem primären Antikörper gegen Telomerase [Maus monoklonaler ab5181, Verdünnung (1:500) Abcam, Cambridge, UK] wurde 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Färbung wurde mit einem Ventana Nexes-Gerät unter Verwendung des Ventana Iview DAB-Erkennungskits (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Schnitte, die mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) anstelle von primärem Antikörper gefärbt wurden, dienten als negative Färbekontrollen. Die hTERT-Proteinexpression wurde für jede Probe als Prozentsatz positiver Zellen von 1200 zufällig ausgewählten Schleimhautepithelzellen definiert. Nur Zellen mit Kernfärbung wurden als positiv für die hTERT-Expression gezählt. Die hTERT-Färbung einer Nicht-UC-Kontrollprobe und progressive Läsionen mit hohen und niedrigen hTERT-Spiegeln sind in Abb. 1 dargestellt 2).

Abbildung 1

Immunhistochemie (IHC) für hTERT. (A) Nicht-UC-Kontrollprobe (aus dem gesamten Abschnitt), (B) Colitis ulcerosa (UC)-Läsion mit niedrigen hTERT-Spiegeln und (C) UC-Läsion mit hohen hTERT-Spiegeln. Bilder von UC-Kolonen stammen von Tissue Microarray (TMA)-Kernen. Pfeile markieren Dickdarmschleimhautzellen, die für hTERT in niedrigen Expressionsniveaus positiv sind, Pfeilspitzen markieren hTERT-gefärbte Leukozyten. Bilder haben eine 400-fache Vergrößerung.

Figur 2

Western-Blot-Analyse bestätigt die Spezifität von ab5181, einem monoklonalen Antikörper für die hTERT-Expression. Der Antikörper war spezifisch und zeigte eine einzelne Bande bei 127 kDa, wenn er mit mehreren Krebszelllinien getestet wurde.

Wir haben zuvor die Immunfärbung für Ki67 für dieses Material vorgestellt, die signifikant erhöhte Ki67-Spiegel in UC-Dickdarms im Vergleich zu Nicht-UC-Kontrollen zeigt (25).

Statistische Analyse

Da jeder in diese Studie eingeschlossene Patient mit mehr als einer Biopsie beitrug, bewerteten wir die Proteinexpressionsspiegel in Bezug auf die morphologischen Parameter sowie die Assoziationsanalysen der Proteinspiegel für hTERT und Ki67, indem wir ein Mehrebenenmodell verwendeten, das Patientenunterschiede. Das lineare gemischte Modell (LMM) mit eingeschränkten maximalen Wahrscheinlichkeitsschätzungen (REML) und einem Bonferroni-Post-hoc-Test wurde durchgeführt. Tests wurden in PASW ® Statistics 18 (Chicago, IL, USA) durchgeführt. Alle Tests waren zweiseitig und ein p-Wert von 0,05 bedeutete Signifikanz.

Ergebnisse

TMA-Bewertung

TMAs zeigen nicht durchgängig vollständige Dickdarmkrypten, wie in ganzen Schnitten beobachtet, aber da wir in unserer Studie festgestellt haben, dass die Expression von hTERT gleichmäßig über die Dickdarmschleimhaut verteilt ist, kamen wir zu dem Schluss, dass die hTERT-Proteinspiegel zuverlässig geschätzt werden können (Daten nicht gezeigt).

Da die Ki67-Proteinexpression mit der Wachstumsfraktion in der UC-Kolonschleimhaut verbunden ist, betrachteten wir TMAs nicht als zuverlässig bei der Beurteilung der Ki67-Expression im Zusammenhang mit der dysplastischen Entwicklung.

Die Bewertung der Ki67-Proteinexpression wurde in den gleichen Gewebekernen wie die hTERT-Proteinbewertungen durchgeführt, daher wurde die Bewertung der Assoziation zwischen hTERT und Ki67 als zuverlässig erachtet.

HTERT-Spiegel in der Dickdarmschleimhaut von Progressiven vs. Nicht-Progressoren

Die hTERT-Spiegel waren signifikant erhöht (p < 0,001) in der Kolonschleimhaut von Progressoren und Nicht-Progressoren im Vergleich zu Nicht-UC-Kontrollen ( 3 ). Beim Vergleich von progressiven und nicht-progressiven Kolektomien wurde kein Unterschied beobachtet. Statistisch erhöhte Ki67-Spiegel im gesamten Dickdarm mit CU im Vergleich zu Kontrollen ohne UC wurden bereits früher präsentiert (25).

Figur 3

hTERT bei progressiven, nicht fortschreitenden und nicht-UC-Kontrollen bei Colitis ulcerosa (UC). Proteinspiegel von hTERT, nachgewiesen durch Immunhistochemie (IHC) bei Progressiven, Nicht-Progressoren und Nicht-UC-Kontrollen.

HTERT-Spiegel in der Dickdarmschleimhaut von progressiven Kolektomien

Die Progressoren wurden nach Alter bei Beginn eingeteilt, da sich kürzlich gezeigt hat, dass sich Progressoren mit spätem Beginn der CU (> 50 Jahre alt) in der Telomerbiologie von Progressoren mit frühem Beginn der CU (< 50 Jahre alt) unterschieden (26). Die Ergebnisse ergaben keinen statistischen Unterschied in den Proteinspiegeln von hTERT beim Vergleich von spät und früh einsetzender UC (p = 0,2).

Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in den hTERT-Expressionsniveaus zwischen diploiden Läsionen und Läsionen mit Aneuploidie festgestellt, ohne dass Unterschiede in der Schleimhautmorphologie korrigiert wurden (p = 0,12). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den hTERT-Spiegeln zwischen nicht-dysplastischen Läsionen, Läsionen mit unbestimmter Dysplasie und dysplastischen Läsionen ohne Korrektur des DNA-Ploidie-Status identifiziert (p=0,14). Bei der Stratifizierung der Schleimhautmorphologie und dem Vergleich der hTERT-Proteinspiegel innerhalb diploider Läsionen mit denen, die aneuploide Populationen beherbergen, stellten wir jedoch fest, dass die aneuploiden Läsionen dazu neigten, eine geringere hTERT-Expression aufzuweisen als die diploiden Gegenstücke ( 4 ).

Figur 4

hTERT bei diploiden und aneuploiden Läsionen von Progressoren. Expression von hTERT in Nicht-Progressoren und in Gebieten mit unterschiedlicher Morphologie, die diploide oder aneuploide Populationen in Progressiven beherbergen.

Innerhalb der nicht-dysplastischen aneuploiden und diploiden Läsionen des progredienten Dickdarms unterschieden sich die hTERT-Spiegel statistisch signifikant (p=0,037), wenn die Unterschiede zwischen den Patienten mit LMM berücksichtigt wurden. Die p-Werte, die unter Verwendung von LMM für den DNA-Ploidie-Status innerhalb jeder morphologischen Gruppe nachgewiesen wurden, sind in Tabelle II dargestellt. Durch Ignorieren der Patientenunterschiede und Verwendung eines t-Tests wurde ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den hTERT-Spiegeln, stratifiziert für den DNA-Ploidie-Status, innerhalb der Läsionen gefunden, die als unbestimmt für Dysplasie bewertet wurden. Diploide Läsionen wiesen höhere hTERT-Werte auf als aneuploide Läsionen.

Tabelle II

LMM-Test-p-Werte für hTERT-Proteinspiegel stratifiziert für den DNA-Ploidie-Status innerhalb verschiedener morphologischer Stadien von Progressoren.

Tabelle II

LMM-Test-p-Werte für hTERT-Proteinspiegel stratifiziert für den DNA-Ploidie-Status innerhalb verschiedener morphologischer Stadien von Progressoren.

Morphologie p-Wert
Nicht-Dysplasie 0.037
Unbestimmt für Dysplasie 0.374
Dysplasie 0.565

Assoziationen zwischen den Proteinspiegeln von hTERT und Ki67 in der Dickdarmschleimhaut von Progressiven und Nicht-Progressoren

Eine Assoziationsanalyse zwischen hTERT und Ki67 zeigte statistisch signifikante Ergebnisse innerhalb der Nicht-Progressoren (p=0,047) bei der Verwendung von LMM, die die Patientenvariation kompensieren. Innerhalb der verschiedenen Läsionen der Progressoren wurde keine Assoziation festgestellt (Tabelle III). Bei der Stratifizierung des DNA-Ploidie-Status wurde keine Assoziation zwischen den Proteinspiegeln von hTERT und Ki67 innerhalb der Progressoren festgestellt.

Tabelle III

P-Werte, die aus LMM-Analysen für die Assoziation zwischen hTERT und Ki67-Proteinexpression in der UC-Morphologie generiert wurden.

Tabelle III

P-Werte, die aus LMM-Analysen für die Assoziation zwischen hTERT und Ki67-Proteinexpression in der UC-Morphologie generiert wurden.

Morphologie p-Wert
Nicht-Progressor 0.047
Nicht-Dysplasie 0.097
Unbestimmt für Dysplasie 0.102
Dysplasie 0.731

[i] LMM, lineares gemischtes Modell UC, Colitis ulcerosa.

Alle Analysen wurden auch durchgeführt, wobei alle Fälle mit Adenokarzinomen ausgeschlossen wurden. Dies änderte die Ergebnisse nicht in statistisch signifikantem Maße.

Diskussion

In der vorliegenden Studie fanden wir signifikant erhöhte hTERT-Proteinspiegel in der Schleimhaut sowohl von Kolektomien mit progressiver als auch nicht-progressiver UC im Vergleich zu Kontrollproben ohne UC (p<0,001), aber es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den hTERT-Spiegeln in den progressiven festgestellt und Nicht-Progressor-Kolektomien. CU ist Berichten zufolge eine Erkrankung der beschleunigten Alterung der Dickdarmschleimhaut (27) mit einer erhöhten Zellteilungsrate, wie von Greco et al. (28) dokumentiert. Die Tatsache, dass wir ähnliche hTERT-Spiegel in progressiven und nicht-progressiven Kolektomien entdeckten, stimmt mit diesen Studien überein, da die Patienten seit >10 Jahren an CU litten. Erhöhte hTERT-Spiegel wurden bei leicht aktiver CU in der Schleimhaut von Patienten mit CU im Durchschnitt nach 6 Jahren gefunden (29).

For examination of possible differences in the levels of hTERT within the progressors we stratified the areas of the 20 progressor colectomies by morphological characteristics, and compared diploid areas with areas containing aneuploid clones, using LMM. This comparison showed a pattern of lower hTERT expression in aneuploid lesions within areas of similar morphology. Within the non-dysplastic lesions this difference was statistically significant (p=0.037). If each lesion was included in the analysis as independent data entries (Student’s t-test), we found a significant difference between hTERT levels in diploid and aneuploid lesions indefinite for dysplasia. However, the protein levels of hTERT vary between patients, a fact that potentially affects our statistical findings, creating false positives. Several of the aneuploid lesions of indefinite dysplastic morphology were found within the same colon (Table I), and this could skew our results. We therefore found the p-values yielded by the LMM analysis controlling for patient variations to be valid. The hTERT-protein expression in diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the levels found in the non-progressors, which are all non-dysplastic and diploid. This shows that when the confounding factor of differences in mucosal morphology is accounted for, reduced levels of hTERT are linked to DNA aneuploidy and possibly also associated with its development. Increased levels of hTERT may enhance the proliferative activity of the inflamed tissue harbouring increased levels of reactive oxygen species (ROS), and possibly contribute to the development of dysplasia and cancer. It has been demonstrated that UC colons have enhanced cell proliferation (24) and elevated levels of ROS (30). Both these agents are reported to facilitate telomere shortening. Too short or even missing telomeres can induce breakage-fusion-bridge (BFB) cycles, which again can lead to chromosomal instability (5) and DNA aneuploidy (31,32). Elevated levels of BFB were shown in UC-progressor colons, but DNA-ploidy status of the lesions examined was not investigated (31). Activation of telomerase can prevent BFB-cycles by adding telomeric sequences to short telomeres or broken chromosome ends (33). Our results showing less hTERT present in lesions that contain aneuploid cell populations are consistent with these results.

UC progressors have been shown to differ in mean telomere length depending on the patients’ age at disease onset, where early onset (<50 years of age when diagnosed) harboured shorter telomeres than those observed in UC progressors with later UC onset (26). All our patients had suffered from active colitis for >10 years at the time of colectomy and all had presented extensive colitis. Only two progressors were diagnosed with UC after the age of 50, and these did not differ in hTERT expression from the patients diagnosed at an earlier age.

It is possible that any differences in hTERT levels of the colonic mucosa between the progressors and non-progressors were levelled out by continuous impairment of the colonic mucosa due to inflammation and regeneration. Telomeres in UC colonic mucosa are reported to shorten more rapidly than in non-UC mucosa (27,31), and activation of telomerase might be a response to this attrition. This could indicate that hTERT expression is not a biomarker for differentiating a progressor colon from a non-progressor colon prior to colectomy.

A study of four colectomies from patients suffering from UC for >20 years revealed a regional correlation between dysplasia and telomerase activity measured by a version of the ELISA. One patient did not present dysplasia or telomerase activity (23). However, the ELISA method used in the study detected assembled telomerase enzyme complexes, and it was suggested that lack of detected telomerase activity in some of the samples could be due to degradation of the RNA component of the holoenzyme prior to sampling (23). IHC of hTERT may omit tissue-based problems such as partial degradation, as it is based on visual examination of stained formalin or alcohol-fixed, paraffin-embedded tissue.

IHC facilitates the investigation of protein expression in specific cell types within a tissue. This feature can prove valuable when examining UC colons, where a high percentage of leucocytes are generally present in the mucosa. Examining hTERT protein expression by IHC allowed us to assess the differences in the extent of hTERT expression in the colonic mucosal cells, without the confounding contributions from mucosal leukocytes. In a report examining coronary plaques, neutrophils were found to have elevated levels of telomerase activity (34). This is confirmed in our study by the presence of hTERT-positive leucocytes in the lamina propria (Fig. 1).

However, immunohistochemical detection of hTERT has proven to be a difficult task, as some antibodies can also bind to other proteins not associated with telomerase activity (35), antibodies that are not commercially available, or those that are commercially available but have not been proven to be specific (i.e., non-specific cytoplasmic rather than specific nuclear staining). As new antibodies binding to hTERT have become available and tested for binding specificity, reports of hTERT-expression have emerged. Elevated levels of hTERT in precancerous lesions have been identified in gastric tissue (36), and colonic adenocarcinomas (37). The hTERT protein levels of colonic mucosa may provide insight into the transition from normal-looking mucosal morphology towards a possible colorectal cancer, as normal colonic mucosa has low hTERT levels, whereas colorectal cancers have high levels of hTERT (38). In our study the nuclear hTERT staining was very distinct. The monoclonal hTERT antibody used was specific, as confirmed by western blotting of several human cancer cell lines that showed a single band at 127 kDa as expected (Fig. 2). We have previously shown, that progressors harboured significantly more ultra-short telomeres compared to non-progressor colons, and that the difference remained statistically significant when we compared the diploid, non-dysplastic progressor lesions to the non-progressors. In terms of mean telomere length, no difference was found between progressors and non-progressors (39). Thus, an association between mean telomere length and hTERT protein levels seems to exist, whereas no association was observed between the amount of ultra-short telomeres and levels of hTERT in longstanding UC.

In a previous study, our group showed that the proliferation marker Ki67 was significantly elevated in UC colons compared to non-UC control samples, thus confirming that proliferation is enhanced in UC colonic mucosa (25). Also, protein expression of Ki67 has been shown to increase with advancing degree of growth fraction due to the developing stage of dysplasia in the colonic mucosa of the UC colon (40). We found that hTERT expression was significantly associated with the expression of Ki67 within the non-progressor lesions. Within the progressors this association was lost, even when diploid, non-dysplastic lesions were examined separately. Together with our findings of a borderline significant p-value for association between hTERT and Ki67 within progressor non-dysplasia, and no significance detected within the increasing levels of distorted morphology (Table III), it seems the association between proliferation and hTERT protein expression is lost during the development of dysplasia. The lack of difference in hTERT protein levels between progressors and non-progressors, together with elevated amounts of ultra-short telomeres identified in the progressor lesions and the hTERT/Ki67association found only within non-progressors leads to the hypothesis that the positive association between hTERT and Ki67 in the non-progressors may be a protective agent against shortening of the cells telomeres.

In conclusion, we have shown that the protein levels of hTERT were significantly elevated in the mucosa of progressors and non-progressor UC colons compared to non-UC control samples. In the progressor colons, aneuploid non-dysplastic lesions had a significantly lower expression of hTERT than the diploid non-dysplastic lesions, and diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the non-progressors with regard to expression of hTERT protein in the colonic mucosal cells, thus low levels of hTERT associated with aneuploidy. We also found that within the non-progressors there was an association of hTERT expression and expression of the proliferation marker Ki67. No association of hTERT/Ki67 protein expression was detected in the progressors, even when only diploid non-dysplastic lesions were examined, indicating that the association of the two proteins may act as a protective mechanism against the development of progressor characteristics within a UC colon.

Danksagung

The authors would like to thank Thu Hong Thy Nguyen for helping with western blotting. This study was made possible by the generous funding from South-Eastern Norway Regional Health Authority and by Stiftelsen UNI. These organisations had no role in collecting, analysing or interpreting the data or in writing the report.

Verweise

Macdougall IP: The Cancer risk in ulcerative colitis. Lanzette. 2:655–658. 1964. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI


Einführung

Telomeres are nucleoprotein structures, which protect the ends of linear chromosomes from being recognized as DNA double-strand breaks [1]. Telomeres shorten with each round of cell division due to the end-replication problem. Normal human somatic cells replicate until their telomeres diminish to a critical threshold, at which point they enter permanent cell cycle arrest and are constrained to a senescent state [2]. Bypass of senescence due to loss of function of the p53 and pRB tumor suppressor pathways results in further telomere shortening which eventually becomes catastrophic, causing end-to-end fusions, genetic instability, and the potential for tumorigenesis.

Telomere shortening may be counteracted by telomerase, a ribonucleoprotein enzyme complex that synthesizes the repetitive telomeric DNA sequence (5'-TTAGGG-3') [3]. The subunits of telomerase include a reverse transcriptase protein, TERT, and an RNA molecule, hTR, which contains a template region. Telomerase activity is detectable during human development from the blastocyst stage to 16–18 weeks gestation in specific tissue types, but is undetectable in most tissues by two months post-natal [4]. In healthy adults, telomerase activity is restricted to germline cells (in the testes and ovaries) [4], peripheral blood mononuclear cells [5,6] and stem cells [7], presumably to support the proliferative requirements of these cell types. In germline cells, there is sufficient telomerase activity to prevent telomere shortening, but in somatic cells the level of telomerase activity is limited, and is only sufficient to slow down the telomere attrition that accompanies normal DNA replication. In contrast, in the great majority of cancers and immortalized cell lines telomere length is maintained in 85% of cancers this is due to upregulated levels of telomerase and in the remainder this is due to a non-telomerase mechanism [8,9].

One of the ways in which telomerase activity levels appear to be regulated is via alternative splicing of the TERT pre-mRNA [10]. The TERT gene contains 16 exons, and the TERT pre-mRNA can be spliced to yield more than 20 variant mRNAs [11–13]. During human development, loss of telomerase activity in somatic cells is associated with a change in the TERT splicing pattern such that the transcriptional output of the TERT gene consists entirely of splice variants that do not encode active TERT protein [14,15]. Control of alternative splicing is incompletely understood, but there is evidence that this may involve RNA:RNA pairing within the TERT pre-mRNA [16], and that it may be regulated by the cellular microenvironment [17]. Some of the splice variants encode proteins which can act as dominant negative inhibitors of telomerase activity [18,19]. This may be due in part to their ability to become incorporated into the telomerase enzyme complex, because biochemical studies have demonstrated that telomerase exists as a dimer and that its activity is dependent on both of the hTERT active sites being functional [20].

Mutations in hTERT, and in other genes that are required for normal telomere function, can cause short telomere syndromes, which are characterized by proliferative failure in various tissues, especially the bone marrow, lungs, and liver [21,22]. Patients suffering from these syndromes have a substantially increased risk of cancer [22,23], presumably due to excessive telomere shortening and an increased risk of genetic instability. In contrast to the high risk associated with these relatively rare mutations, genome-wide association studies (GWAS) have uncovered numerous single nucleotide polymorphisms (SNPs) in, or close to the hTERT gene which are relatively common in the population and are associated with a small, but highly significant increase in cancer susceptibility ([13,24–27] reviewed in [28]). Associations have also been found between hTERT SNPs and telomere length [13,24,29].

Despite the statistical robustness of GWAS, the associations remain observational. This is partly because most GWAS have only reported associations with the tagging SNPs in the TERT-CLPTM1L region on the commercial genotyping chips, but fine mapping is required to identify the putative causal SNPs. Mechanistic analysis is required to identify causal rather than correlated variants, and to accurately determine cancer risk. A functional understanding of causative variants may ultimately influence clinical decision-making.

Through our involvement with the Collaborative Oncologic Gene-Environment Study (COGS), we were able to carry out fine mapping of the hTERT Ort. This study revealed that the minor alleles at rs10069690 and at rs2242652 were candidate causal variants for risk of estrogen receptor-negative breast cancer, breast cancer in BRCA1 mutation carriers, serous low malignant potential ovarian cancer and serous invasive ovarian cancer with odds ratios ranging from 1.15–1.40 [13,24] and for risk of prostate cancer [13,24]. This rs10069690 SNP is also associated with risk of a wide variety of cancers, including colon cancer, acute lymphoblastic leukemia (ALL), and chronic lymphocytic leukemia (CLL) [25,30–32]. However, no fine mapping has been performed for the latter associations to determine whether it is likely to be directly responsible or simply correlated with a better candidate causal SNP. Consequently, there is a growing need to delineate how this allele confers cancer risk.

We previously generated hTERT minigenes, which included intron 4 with the major (G) or minor, cancer-risk associated (A) allele at rs10069690 [13]. Transfection of these minigenes into the telomerase-positive breast cancer cell line MCF7, and RT-PCR using primers spanning intron 4, revealed an additional band in the presence of the A allele [13]. When this band was excised and sequenced it was identified as a novel hTERT splice variant, INS1b, which contains an intron 4 insert of 480 base pairs. Sequence analysis showed that this transcript was the product of an alternative splicing event at an additional splice donor site created by the G to A polymorphism at rs10069690 (Fig 1A).

(A) Schematics of hTERT minigenes generated by inserting the intron 4 sequence, containing either the major (G) or minor (A) allele at rs10069690, into an hTERT cDNA expression construct. The sense-strand sequence of the minigene from the end of exon 4 to the beginning of exon 5 is shown. The red text indicates the splice site consensus sequences with vertical lines representing the exon-intron boundaries. The minor allele at rs10069690, a G to A polymorphism, introduces an additional splice donor site into the sequence. If this site is utilized, 480 bp of intron 4 is retained within the mature mRNA. (B) Schematic of mRNA and protein expression resulting from the minor allele at rs10069690. RT-PCR using primers spanning from the end of exon 3/beginning of exon 4 to the middle of exon 6 generate a 441 bp product from canonically spliced hTERT mRNA, and products that are 38 bp and 480 bp larger from alternative hTERT splice products INS1 and INS1b, respectively. The alternative splice variant formed from the utilization of the additional splice donor site contains a premature stop codon and is therefore predicted to encode a truncated form of hTERT, which contains the telomerase N-terminal (TEN) and RNA binding (RBD) domains, but not the reverse transcriptase (RT) and C-terminal (C-term) domains. (C) Three cell lines (HT1080, MCF7 and A2780) and cell strain (Fre-71s-1) were transfected with hTERT minigenes containing intron 4 with either the Major (G) or Minor (A) allele of rs10069690. RT-PCR was performed with the primers indicated in Fig 1B and products were separated by gel electrophoresis. In each case, the minigene with the minor allele at rs10069690 resulted in co-expression of canonical hTERT, and the variants INS1 and INS1b. Other bands were identified as non-specific (ns) hybrid DNA species, including a mixture of INS1b and canonical hTERT (INS1b/hTERT) transcripts. (D) RT-PCR was performed on cell lines homozygous (AA) or heterozygous (AG) for the minor allele at rs10069690 to identify endogenous expression of INS1b.

In the present study, we investigated the mechanism by which the SNP confers elevated cancer risk. We found that the presence of this polymorphism resulted in the production of both full length and an alternatively spliced hTERT transcript, which were expressed in a cell type-specific manner. The alternative transcript produced a severely truncated protein (INS1b), which retained its hTR binding capability but lacked the reverse transcriptase domain. INS1b directly caused decreased telomerase activity, telomere shortening, and an elevated telomere-specific DNA damage response. Our data demonstrate that INS1b binds to hTR, sequestering it in an inactive form, thereby acting in a dominant negative manner to limit the amount of active telomerase available to extend the telomeres. The combination of the fine mapping data and a mechanism for cancer risk make it highly likely that this is a causal, rather than a correlated cancer risk SNP.


EINLEITUNG

Lung cancer retains the leading position in cancer-related deaths in the United States. In 2002, it is estimated that there will be 154,900 deaths and 169,400 new cases from lung and bronchial cancer in the United States, compared with 156,900 deaths and 164,100 new cases in 2000 (1) . NSCLC3 comprises more than 80% of lung cancers, and complete surgical resection of primary tumors in early-stage disease is the only potentially curative treatment. For patients with stage I NSCLC (about 17% of all patients with NSCLC), the average 5-year survival rate is about 60%. Adjuvant cytotoxic chemotherapy has been proposed and evaluated in the setting of NSCLC, and it offers limited hope of improving prognosis (2) . One area of intense research on early-stage NSCLC is the identification of molecular markers to complement TNM staging to fully assess the prognosis of patients and to evaluate the effects of novel chemotherapy agents and regimens (3) . Such prognostic markers include a wide variety of protein molecular markers that can be classified by different antibodies as molecular genetic markers, metastatic propensity markers, differentiation markers, and proliferation markers (3) . Other markers have been evaluated at the mRNA level including retinoic acid receptor-β, cyclooxygenase-2, vascular endothelial growth factor, MMP-2 and -9, E-cadherin, angiopoietin-2, and CD44. These markers have been associated with clinicopathological variables and survival time in patients with NSCLC (4, 5, 6, 7, 8) .

Telomerase is a ribonucleoprotein enzyme that lengthens chromosome ends that have been shortened during successive cycles of cell division (9) . Telomerase is expressed in up to 85% of NSCLCs (10 , 11) , and its activation plays a critical role in tumorigenesis by sustaining cellular immortality (12 , 13) . Hahn et al. (14) proved that disruption of the intracellular pathways regulated by large T antigen, oncogenic ras, and telomerase suffices to create a human tumor cell. The components of human telomerase include an RNA subunit (hTERC), a catalytic protein subunit (hTERT), and other telomerase-associated proteins (15) . It has been shown that the expression pattern of hTERT is closely associated with telomerase activity (16, 17, 18) . The recent development of ISH techniques that can reliably detect hTERT mRNA has made it possible to examine the expression of this critical telomerase component at the single-cell level (18, 19, 20, 21) . In our previous study (22) , we evaluated hTERT expression in bronchial biopsy samples and found that it was a frequent event and appeared at a very early stage in cigarette smoking-induced lung carcinogenesis, making it clearer that telomerase plays a critical role in tumorigenesis. Because we have established a reliable ISH technique for detecting hTERT mRNA expression in paraffin-embedded tissue, we decided to evaluate the prognostic value of hTERT in a relatively homogeneous tumor, in a population of 153 patients with stage I NSCLC.


Verweise

Blackburn EH: Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Lett. 2005, 579: 859-862. 10.1016/j.febslet.2004.11.036.

Shay JW, Bacchetti S: A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer. 1997, 33: 787-791. 10.1016/S0959-8049(97)00062-2.

Belgiovine C, Chiodi I, Mondello C: Telomerase: cellular immortalization and neoplastic transformation. Multiple functions of a multifaceted complex. Cytogenet Genome Res. 2008, 122: 255-262. 10.1159/000167811.

Nakayama J, Tahara H, Tahara E, Saito M, Ito K, Nakamura H, Nakanishi T, Tahara E, Ide T, Ishikawa F: Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nat Genet. 1998, 18: 65-68. 10.1038/ng0198-65.

Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, Caddle SD, Ziaugra L, Beijersbergen RL, Davidoff MJ, Liu Q, Bacchetti S, Haber DA, Weinberg RA: hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Zelle. 1997, 90: 785-795. 10.1016/S0092-8674(00)80538-3.

Horikawa I, Barrett JC: Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003, 24: 1167-1176. 10.1093/carcin/bgg085.

Flores I, Benetti R, Blasco MA: Telomerase regulation and stem cell behaviour. Curr Opin Cell Biol. 2006, 18: 254-260. 10.1016/j.ceb.2006.03.003.

Ohmura H, Tahara H, Suzuki M, Ide T, Shimizu M, Yoshida MA, Tahara E, Shay JW, Barrett JC, Oshimura M: Restoration of the cellular senescence program and repression of telomerase by human chromosome 3. Jpn J Cancer Res. 1995, 86: 899-904.

Tanaka H, Shimizu M, Horikawa I, Kugoh H, Yokota J, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for a putative telomerase repressor gene in the 3p14.2-p21.1 region. Genes Chromosomes Cancer. 1998, 23: 123-133. 10.1002/(SICI)1098-2264(199810)23:2<123::AID-GCC5>3.0.CO2-4.

Horikawa I, Oshimura M, Barrett JC: Repression of the telomerase catalytic subunit by a gene on human chromosome 3 that induces cellular senescence. Mol Carcinog. 1998, 22: 65-72. 10.1002/(SICI)1098-2744(199806)22:2<65::AID-MC1>3.0.CO2-J.

National Center for Biotechnology Information. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]

Horikawa I, Cable PL, Mazur SJ, Appella E, Afshari CA, Barrett JC: Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene transcription: evidence for an endogenous mechanism of transcriptional repression. Mol Biol Cell. 2002, 13: 2585-2597. 10.1091/mbc.E01-11-0107.

Ducrest AL, Amacker M, Mathieu YD, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M, Lingner J: Regulation of human telomerase activity: repression by normal chromosome 3 abolishes nuclear telomerase reverse transcriptase transcripts but does not affect c-Myc activity. Krebs Res. 2001, 61: 7594-7602.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. Krebs Res. 2003, 63: 689-695.

Dowdy SF, Scanlon DJ, Fasching CL, Casey G, Stanbridge EJ: Irradiation microcell-mediated chromosome transfer (XMMCT): The generation of specific Chromosomal arm deletions. Genes Chromosomes Cancer. 1990, 2: 318-327. 10.1002/gcc.2870020410.

Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER: Search for unknown tumor-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003, 38: 307-321. 10.1002/gcc.10271.

Buerstedde JM, Takeda S: Increased ratio of targeted to random integration after transfection of chicken B cell lines. Zelle. 1991, 67: 179-188. 10.1016/0092-8674(91)90581-I.

Dieken ES, Epner EM, Fiering S, Fournier RE, Groudine M: Efficient modification of human chromosomal alleles using recombination-proficient chicken/human microcell hybrids. Nat Genet. 1996, 12: 174-182. 10.1038/ng0296-174.

Koi M, Lamb PW, Filatov L, Feinberg AP, Barrett JC: Construction of chicken x human microcell hybrids for human gene targeting. Cytogenet Cell Genet. 1997, 76: 72-76. 10.1159/000134519.

Kuroiwa Y, Shinohara T, Notsu T, Tomizuka K, Yoshida H, Takeda S, Oshimura M, Ishida I: Efficient modification of a human chromosome by telomere-directed truncation in high homologous recombination-proficient chicken DT40 cells. Nukleinsäuren Res. 1998, 26: 3447-3448. 10.1093/nar/26.14.3447.

Meaburn KJ, Parris CN, Bridger JM: The manipulation of chromosomes by mankind: the uses of microcell-mediated chromosome transfer. Chromosoma. 2005, 114: 263-274. 10.1007/s00412-005-0014-8.

Nishimoto A, Miura N, Horikawa I, Kugoh H, Murakami Y, Hirohashi S, Kawasaki H, Gazdar A, Shay J, Barrett JC, Oshimura M: Functional evidence for a telomerase repressor gene on human chromosome 10p15.1. Onkogen. 2001, 20: 828-835. 10.1038/sj.onc.1204165.

Oshimura M, Barrett JC: Multiple pathways to cellular senescence: role of telomerase repressors. Eur J Cancer. 1997, 33: 710-715. 10.1016/S0959-8049(97)00090-7.

Tanaka H, Horikawa I, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for inactivation of distinct telomerase repressor genes in different types of human cancers. Int J Cancer. 2005, 115: 653-657. 10.1002/ijc.20879.

Ji L, Minna JD, Roth JA: 3p21.3 tumor suppressor cluster: prospects for translational applications. Zukünftiges Oncol. 2005, 1: 79-92. 10.1517/14796694.1.1.79.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. Krebs Res. 2003, 63: 689-695.

Yang ZQ, Yoshida MA, Fukuda Y, Kurihara N, Nakamura Y, Inazawa J: Molecular cytogenetic analysis of 17 renal cancer cell lines: increased copy number at 5q31-33 in cell lines from nonpapillary carcinomas. Jpn J Cancer Res. 2000, 91: 156-163.

Garzon R, Calin GA, Croce CM: MicroRNAs in Cancer. Annu Rev Med. 2009, 60: 167-179. 10.1146/annurev.med.59.053006.104707.

Mitomo S, Maesawa C, Ogasawara S, Iwaya T, Shibazaki M, Yashima-Abo A, Kotani K, Oikawa H, Sakurai E, Izutsu N, Kato K, Komatsu H, Ikeda K, Wakabayashi G, Masuda T: Downregulation of miR-138 is associated with overexpression of human telomerase reverse transcriptase protein in human anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Krebs Sci. 2008, 99: 280-286. 10.1111/j.1349-7006.2007.00666.x.

Hoshiya H, Kazuki Y, Abe S, Takiguchi M, Kajitani N, Watanabe Y, Yoshino T, Shirayoshi Y, Higaki K, Messina G, Cossu G, Oshimura M: A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene. Mol Ther. 2009, 17: 309-317. 10.1038/mt.2008.253.

Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, Shirayoshi Y, Oshimura M: Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 321: 280-290. 10.1016/j.bbrc.2004.06.145.

Kazuki Y, Hoshiya H, Kai Y, Abe S, Takiguchi M, Osaki M, Kawazoe S, Katoh M, Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Kajitani N, Yoshino T, Shirayoshi Y, Ogura A, Shinohara T, Barrett JC, Oshimura M: Correction of a genetic defect in multipotent germline stem cells using a human artificial chromosome. Gen Ther. 2008, 15: 617-624. 10.1038/sj.gt.3303091.

Kouprina N, Larionov V: TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution. Nat. Rev Genet. 2006, 7: 805-812. 10.1038/nrg1943.

Nihei N, Kouprina N, Larionov V, Oshima J, Martin GM, Ichikawa T, Barrett JC: Functional evidence for a metastasis suppressor gene for rat prostate cancer within a 60-kilobase region on human chromosome 8p21-p12. Krebs Res. 2002, 62: 367-370.

Kugoh HM, Hashiba H, Shimizu M, Oshimura M: Suggestive evidence for functionally distinct, tumor-suppressor genes on chromosomes 1 and 11 for a human fibrosarcoma cell line, HT1080. Onkogen. 1990, 5: 1637-1644.

Wong JM, Kusdra L, Collins K: Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage. Nat Cell Biol. 2002, 4: 731-736. 10.1038/ncb846.

Tomizuka K, Yoshida H, Uejima H, Kugoh H, Sato K, Ohguma A, Hayasaka M, Hanaoka K, Oshimura M, Ishida I: Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. Nat Genet. 1997, 16: 133-143. 10.1038/ng0697-133.


Danksagung

Grant support: National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Postdoctoral Fellowships (228413, Y. Cao 228412, A.S. Nouwens), NHMRC Healthy Ageing Research Grant (219306, L.I. Huschtscha and R.R. Reddel), and a Wellcome Trust Senior Research Fellowship (GRO66727MA, T.M. Bryan).

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

We thank Kathleen Collins for the construct pBABE-puro-U3-hTR Karen MacKenzie and Laura Veas for the hTR2 and B2M primers Julie Jurczyluk for the construct pJJ101-hTERT1-182aa, in vitro transcribed hTR, and technical assistance Scott Cohen for the construct pUC-hTR and the direct telomerase activity assay and Jeremy Henson, Akira Nguyen, Ze Huai Zhong, Jane Noble, and Elizabeth Collins for technical assistance and advice.


Schau das Video: Telomerase Replication in Eukaryotes. End Replication (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Malloy

    Ich finde, dass Sie nicht Recht haben.Schreib in PN, wir reden.

  2. Hartwood

    Es tut mir leid, aber ich denke, Sie liegen falsch. Ich bin sicher. Lassen Sie uns dies diskutieren. Senden Sie mir eine E -Mail an PM, wir werden reden.



Eine Nachricht schreiben