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1.12: Molekulare Visualisierung eines Enzyms, der Acetylcholinesterase - Biologie

1.12: Molekulare Visualisierung eines Enzyms, der Acetylcholinesterase - Biologie


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12.1 Lernziele

Das Ziel dieses Labors ist es, einige der wichtigsten Strukturelemente eines wichtigen Enzyms, der Acetylcholinesterase (AChE), zu analysieren. Dazu verwenden Sie ein gängiges Strukturvisualisierungsprogramm und korrelieren AChE-Strukturelemente mit dem Enzymmechanismus. Sie verwenden Chimera, ein hochmodernes Programm zur molekularen Visualisierung, das von der National Science Foundation über die University of California, San Francisco, bereitgestellt wird. Dieses kostenlose Programm ist unter http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ verfügbar.

Um einen schnellen Überblick über das Programm zu geben, betrachten wir eine Multi-Drug-Resistenz-Efflux-Pumpe – das Protein, das durch den von Ihnen untersuchten Riboschalter gesteuert wird. Mit diesem Programm analysieren Sie dann das Enzym Acetylcholinesterase.

12.2 Einführung und Hintergrund

Acetylcholinesterase (AChE) zerstört den Nervenüberträger Acetylcholin durch Hydrolyse.

AChE ist eines der effizientesten Enzyme in der Natur – in gewisser Weise ein „perfektes“ Enzym. Aminosäureseitenketten am aktiven Zentrum sind präzise angeordnet, um Bindungsänderungen im Acetylcholin zu erzwingen (Abb. 12.1).

Insgesamt werden die Elektronen in Richtung des Estercarbonyls gedrängt, wodurch eine kovalente Zwischenstufe zwischen dem Reaktanten und dem Enzym entsteht (Abb. 12.2).

Der fein abgestimmte Mechanismus der Acetylcholinesterase bietet eine gute Illustration einiger gängiger katalytischer Prozesse:

  • Diese Woche werden Sie dieses Enzym auf molekularer Ebene untersuchen. Nächste Woche werden Sie die Enzymkinetik der Acetylcholinesterase untersuchen.

12.3 Einführung in die molekulare Visualisierung mit dem Programm Chimera

Das Visualisierungsprogramm Chimera wird Ihnen anhand der Struktur des Multi-Drug Resistance (MDR) Efflux Pump Proteins vorgestellt. Dies ist das Protein, das durch einen Riboswitch als Reaktion auf Antibiotika wie Tetracyclin hochreguliert wird. Das Protein pumpt dann die Antibiotika aus den Bakterien, wodurch die Zellen weiter wachsen können. Da die MDR-Effluxpumpe viele verschiedene Medikamente eliminiert, werden die Bakterien zu Multi-Droge beständig.

Die MDR-Effluxpumpe ist ein integrales Membranprotein. Als solche weist die Proteinstruktur einige gemeinsame strukturelle Eigenschaften von Membranproteinen auf. Erstens umfassen Transmembranhelices den Großteil des Proteins. Diese Helices dehnen die Breite der Lipiddoppelschicht aus und setzen hydrophobe Aminosäuren dem Inneren der Lipiddoppelschicht aus. Hydrophile Aminosäuren befinden sich dort, wo das Protein auf die Lipiddoppelschichtoberfläche trifft, sowohl auf der Außenseite der Zelle als auch auf der Innenseite.

Die Anweisungen zur Verwendung von Chimera folgen diesem Format:

Kursivschrift zeigt an, dass Sie zu a . gehen sollten Speisekarte oder ein Befehl Linie oder die Mauszeiger
Fett gedruckt… sagt dir, auf welches Menü du zugreifen musst
…Fett gedruckt kennzeichnet eine Auswahl aus dem aufgerufenen Menü
Fett gedruckt zeigt einen Befehl an

  1. Laden Sie zuerst die Proteindaten herunter. Strukturdaten für Makromoleküle sind von einer zentralen Datenbank, der RCSB Protein Data Bank, erhältlich. Jede Struktur erhält einen eigenen eindeutigen Code. Der hier verwendete Datensatz der Multi-Drug-Resistenz-Effluxpumpe ist beispielsweise „2GFP“.
    Speisekarte: Datei... Nach ID abrufen
    in das Feld eingeben 2GFP
    klicken Bringen Taste
  2. Die Kommandozeile kann für sehr spezifische Änderungen verwendet werden. Um die Befehlszeile anzuzeigen (oder auszublenden), gehen Sie zum Menü "Extras", Untermenü "Allgemeine Steuerelemente".
    Befehl: del:.B
    Befehl: Fokus
  3. Der Cursor (Maus) sorgt für schnelle Wechsel in der Proteinansicht.
    Mauszeiger: linke Maustaste + Cursor bewegen = Protein drehen
    Mauszeiger: Strg + linke Maustaste + Cursor bewegen = Protein auswählen
    Mauszeiger: rechte Maustaste + Cursor bewegen = Proteingröße ändern
    Mauszeiger: Strg + rechte Maustaste + Cursor bewegen = übersetzt Protein
    Platzieren Sie den Cursor über dem Protein, um bestimmte Aminosäuren zu identifizieren
  4. Das Menü „Voreinstellungen“ bietet Auswahlmöglichkeiten für gängige Darstellungsweisen des Proteins.
    Speisekarte: Voreinstellungen... Interaktiv 1
    Speisekarte: Voreinstellungen... Interaktiv 2
    Speisekarte: Voreinstellungen... Interaktiv 3
    Speisekarte: Voreinstellungen... Interaktiv 4
  5. Das Menü „Auswählen“ legt fest, welcher Teil des Proteins durch das Menü „Aktionen“ geändert wird. Probieren Sie die folgenden drei Beispiele aus:
    1. Beispiel #1: Eine Kette von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind (ein Polypeptid) wird ausgewählt und jede Aktion wird nun auf diese Kette angewendet (z. B. die Farbe ändern).
      Speisekarte: Wählen Sie... Kette... EIN
      Speisekarte: Aktionen... Farbe...?
    2. Beispiel #2: Alle Aminosäuren, die bei neutralem pH eine negativ geladene Seitenkette tragen (d. h. Carboxylate), werden ausgewählt und alle Atome/Bindungen in den Seitenketten sind (a) gezeigt und (b) nach Element gefärbt.
      Speisekarte: Auswählen... Auswahl löschen
      Speisekarte: Wählen Sie... Rückstand... Aminosäurekategorien... negativ
      Speisekarte: Aktionen... Atome/Bindungen... anzeigen
      Speisekarte: Aktionen... Farbe... nach Element
    3. Beispiel #3: Alle Aminosäuren, die bei neutralem pH-Wert eine positiv geladene Seitenkette tragen, werden ausgewählt und alle Atome/Bindungen in den Seitenketten werden gezeigt und nach Element gefärbt. Die Atome werden dann als tatsächliche Größe (Kugel) angezeigt. Schließlich wird das Protein als festes Objekt mit einer Oberfläche dargestellt, wie es tatsächlich aussehen würde.
      Speisekarte: Auswählen... Auswahlmodus (ersetzen)... anhängen
      Speisekarte: Wählen Sie... positiv
      Speisekarte: Aktionen... nach Element
      Speisekarte: Aktionen... Atome/Anleihen... Kugel
      Speisekarte: Aktionen... ausblenden

      Speisekarte: Auswählen... Oberfläche... anzeigen

  6. Das Werkzeugmenü kann weitere Informationen über Proteineigenschaften liefern.
    Speisekarte: Werkzeuge... Flächen-/Bindungsanalyse... Coulomb-Fläche
    Färbung
    klicken OK Taste
    Speisekarte: Aktionen...Oberfläche...Ausblenden
    Speisekarte: Werkzeuge... Darstellung... Farbe Sekundärstruktur
    klicken OK Taste
    Speisekarte: Datei... Sitzung schließen

12.4 Analyse von Acetylcholinesterase mit dem Computervisualisierungsprogramm Chimera

Die folgende Aufgabenreihe hilft Ihnen, den Umgang mit Computervisualisierungssoftware zu erlernen, um besser zu verstehen, wie das Enzym Acetylcholinesterase funktioniert. Folgen Sie den Anweisungen unten, um die Fragen zu beantworten.

1. Die Gesamtstruktur der Acetylcholinesterase. Proteine ​​werden durch Sekundärstrukturen stabilisiert, üblicherweise entweder β-Faltblätter oder α-Helices.

Speisekarte: Datei... Nach ID abrufen
in das Feld eingeben 1AMN
klicken Bringen Taste
Speisekarte: Extras... Farbe Sekundärstruktur
klicken OK Taste
Befehl: del:HOH :SO4

  1. (2 Pkt.) Wie viele Stränge sind in jedem der beiden β-Faltblätter enthalten?
  2. (3 Pkt.) Identifizieren Sie die beiden längsten α-Helices, indem Sie die Abkürzungen für die Aminosäuren am Anfang und am Ende jeder Helix auflisten. (Wenn Sie Ihren Mauszeiger über eine Stelle auf dem Protein platzieren, wird die Abkürzung angezeigt.) Wie viele Aminosäurereste befinden sich in jeder Helix? [Hinweis: Die Aminosäuren sind fortlaufend nummeriert.]

2. Substratanalog (NAF) an der aktiven Stelle. Aktive Stellen werden oft mit einem Substratanalog markiert oder markiert. Dies ist ein substratähnliches Molekül, das am aktiven Zentrum des Enzyms unvollständig reagiert. Es bleibt an das Enzym gebunden und markiert einige der katalytischen Aminosäureseitenketten. In diesem Fall bildet das Substratanalogon eine Struktur wie die in der Einleitung und im Hintergrund gezeigte tetraedrische Zwischenstufe.

Speisekarte: Wählen Sie...
Speisekarte: Aktionen... Anzeigen
Speisekarte: Wählen Sie... Invertieren (alle Modelle)
Speisekarte: Aktionen... Multifunktionsleiste... Ausblenden
Speisekarte: Aktionen... Ausblenden
Befehl: Anzeige: 200
Befehl: Fokus

  1. (4 Pkt.) Zeichnen Sie die Strukturformel für NAF, das mit einem Atom einer Aminosäureseitenkette verbunden ist (behandeln Sie den Rest der Seitenkette als „R“-Gruppe). Diese Struktur enthält zwei ionische Ladungen (eine positive und eine negative). Können Sie diese Gebühren ausfindig machen? Markieren Sie jedes mit einem „+“ oder einem „-“.
  2. (4 Pkt.) NAF bildet mit dem Enzym ein kovalentes Zwischenprodukt, genau wie das natürliche Substrat Acetylcholin. Dieses Zwischenprodukt wird als „tetraedrisches Zwischenprodukt“ bezeichnet. Warum denkst du, dass es diesen Namen trägt? Seien Sie so konkret wie möglich.

3. Nichtkovalente Wechselwirkungen zwischen dem aktiven Zentrum und dem Substratanalog. Van-der-Waals-Kontakte zwischen dem Protein und dem Substratanalogon sind sehr häufig.

Speisekarte: Auswählen... Auswahl löschen

Speisekarte: Wählen Sie... Rückstand... NAF

Speisekarte: Tools... Strukturanalyse... Konflikte/Kontakte
klicken Benennen Taste
klicken Kontakt Taste
prüfen Auswählen
deaktivieren Zeichne Pseudobindungen von Farbe
prüfen Farbe
klicken OK Taste

A. (3 Pkt.) Wie viele Atome von NAF stehen in direktem Kontakt mit dem Protein? Von wie vielen Atomen in NAF insgesamt? [Rot markierte Atome stehen in direktem Kontakt mit dem Protein.] Markieren Sie in Frage Nr. 3 jedes Atom, das in Kontakt mit einem Sternchen (*) ist, in Ihrer NAF-Struktur.

4. Visualisieren Sie die Aminosäuren, die das Substratanalogon unmittelbar umgeben Klicken Sie auf Grafikfenster und drücken Sie dann die Pfeiltaste nach oben [Dadurch wird das komplette NAF ausgewählt.]

Speisekarte: Aktionen... Anzeigen
Speisekarte: Aktionen... Sphäre
Befehl: Fokus
Speisekarte: Wählen Sie... Rückstand... NAF
Speisekarte: Aktionen... Farbe... Wählen Sie eine Farbe, die gut zu sehen ist

A. (4 Pkt.) Hat die NAF einen „Spielraum“, wenn sie am aktiven Ort gebunden ist? Wie, glauben Sie, könnte dies die Enzymkatalyse unterstützen?

5. Wählen Sie Aminosäuren des aktiven Zentrums aus, die die Reaktion katalysieren.

Speisekarte: Aktionen... Stick
Speisekarte: Aktionen... nach Element
Speisekarte: Auswählen...Invertieren (alle Modelle)
Speisekarte: Aktionen... nach Element
Befehl: zeigen :118 :119 :200 :327 :440 :NAF
Befehl: Fokus

A. (3 Pkt.) Identifizieren Sie das α-Kohlenstoffatom für jede Aminosäure. Der α-Kohlenstoff liegt zwischen einem Carboxyl „C=O“ und einem „N-H“ entlang des Proteinrückgrats. Die Seitenkette jeder Aminosäure ist ebenfalls mit dem α-Kohlenstoff verbunden. (Die Seitenkette einer Glycin-Aminosäure ist einfach ein „H“ und wird daher in der Struktur nicht gezeigt.) Eine Seitenkette ist kovalent an NAF gebunden. Bewegen Sie Ihren Cursor zum α-Kohlenstoff, um den abgekürzten Namen dieser Aminosäure zu erfahren. Verwenden Sie die Liste der Aminosäurestrukturen unten, um diese Aminosäure zu identifizieren und ihre Seitenkettenstruktur zu zeichnen.

B. (4 Punkte) Zeichnen Sie Strukturen für alle anderen Aminosäureseitenketten, die an diesem aktiven Zentrum gezeigt werden. Identifizieren Sie auch jede Aminosäure. Bei dem katalytischen Schritt, der von dieser durch Röntgenkristallographie bestimmten Struktur gezeigt wird, tragen zwei der Aminosäureseitenketten eine ionische Ladung (eine positiv und eine negativ). Identifizieren Sie die geladenen Seitenketten und geben Sie ihnen die entsprechenden Ladungen.

Speisekarte: Werkzeuge...Strukturanalyse... FindHbond
klicken OK Taste

C. (3 Pkt.) Die blauen Linien zeigen H-Brücken und die H-verbrückten Atome liegen nah genug beieinander, um Reaktionen zu katalysieren.

Zwei Wasserstoffbrückenbindungen, die mit NAF verbunden sind, stammen nicht von Aminosäureseitenketten. Beschreiben oder identifizieren Sie die Gruppen, von denen diese H-Brücken stammen.

Messen Sie den Abstand zwischen den Atomen entlang der blauen Linien (H-Brücken). [Platzieren Sie den Cursor über eine H-Brücke. Es erscheint ein Kästchen, das das Atom innerhalb jedes Rests, das an der H-Brücke beteiligt ist, sowie den Abstand der H-Brücke anzeigt.] Identifizieren Sie die Atome und geben Sie die Abstände an.

Strg + Linksklick und zum Auswählen über alle Atome ziehen
Speisekarte:Aktionen... Kugel

D. (4 Pkt.) Beachten Sie, dass sich die Elektronenwolken dort überlappen, wo H-Brücken auftreten. Was bedeutet das in Bezug auf die Bindung?

Speisekarte: Wählen Sie... Kette... A
Speisekarte: Aktionen... Bänder... Auswahl löschen
Befehl: Fokus
Speisekarte: Aktionen... Farben... grün

A. (4 Pkt.) Lokalisieren Sie NAF. Dies ist ein Marker für die Position des aktiven Zentrums. Beschreiben Sie die Position des aktiven Zentrums relativ zum Hauptprotein. Könnte dieser Ort Probleme für das Enzym verursachen? Kurz erklären.

7. Proteinoberflächenladungen und Katalyse

Befehl: del: NAF [Dies hinterlässt ein „Loch“ im aktiven Zentrum.]

Speisekarte: Werkzeuge... Coulomb-Oberflächenfärbung
wählen 11 für Anzahl Farben/Werte
klicken OK Taste
[Schließen Sie alle Fehlermeldungen. Diese Berechnung kann eine Minute dauern.]

A. (3 Pkt.) Beschreiben Sie die Lage der überwiegend blauen Region (positiv geladene Region) in Bezug auf das aktive Zentrum. Wie könnte diese relative Lage der Katalyse helfen?

B. (3 Pkt.) Beschreiben Sie die Lage der überwiegend roten Region (negativ geladene Region) in Bezug auf das aktive Zentrum. Wie könnte diese relative Lage der Katalyse helfen?

Speisekarte: Datei... Sitzung schließen

Speisekarte: Datei... Nach ID abrufen
Geben Sie in das Feld 2v96 ein
klicken Bringen Taste

Speisekarte: Voreinstellungen... Interaktiv 1 (Bänder)

Befehl: del :.b

Speisekarte: Datei... Nach ID abrufen
Geben Sie in das Feld 2va9 . ein
klicken Bringen Taste

Befehl: del :.b

Speisekarte: Tools... Strukturvergleich... Match Maker
Referenzstruktur hervorheben 2V96
prüfen Berechnen Sie nach der Überlagerung strukturbasiertes multiples Sequenz-Alignment
klicken Anwenden Taste
prüfen Überlagerung/Ausrichtung wiederholen... im sich öffnenden Fenster
prüfen Ausrichtung bis zur Konvergenz wiederholen
klicken OK Taste

Speisekarte: Werkzeuge... Strukturvergleiche... Morph-Konformationen
klicken Hinzufügen Taste
Doppelklick auf 2V96.pdb (#0) im neuen Fenster
Doppelklick auf 2VA9.pdb (#1) im neuen Fenster
Doppelklick auf 2V96.pdb (#0) im neuen Fenster
auswählen Aktion beim Erstellen: Konformationen ausblenden
klicken Schaffen Taste

Befehl: Fokus
MD Movie: Molekulare Bewegung... [Dies ist ein neues Fenster, das geöffnet wird.]
klicken Spiel Taste

9. Proteinbewegung am aktiven Zentrum

Befehl: Anzeige #2 :200

(Beachten Sie, dass dies das aktive Zentrum mit einer der Aminosäuren des aktiven Zentrums markiert.)

Befehl: Anzeige #2 :70 :74 :84 :121 :279 :290 :330 :331 :334

(Beachten Sie, dass diese Aminosäuren den „Tunnel“ in das aktive Zentrum auskleiden.)

A. (3 Pkt.) Diese Bewegungen wurden als „Atmen“ des „Tunnels“ beschrieben. Warum erwarten Sie solche Bewegungen im Tunnel, der zum aktiven Zentrum führt? Kurz erklären.

Hinweise für den Ausbilder

Dieses Labor ermöglicht es den Schülern, das Chimera-Programm „auszuprobieren“ – mit verschiedenen Einstellungen und Befehlen zu experimentieren. Wir finden, dass Chimera relativ benutzerfreundlich und fehlerverzeihend ist. Die Schüler werden ermutigt, diese kostenlose Software für ihren eigenen Gebrauch herunterzuladen. Chimera kann auch bei Hausaufgaben verwendet werden, die auf dem Vorlesungsteil eines Biochemiekurses basieren. Dies ist eine gute Gelegenheit, sich mit Themen aus der Vorlesung und dem Labor zu verbinden.

Molekulare Visualisierung von Acetylcholinesterase Prelab

Beantworten Sie die folgenden Fragen zu den allgemeinen Eigenschaften des Enzyms Acetylcholinesterase unter Verwendung üblicher Quellen (Internet, Biochemie-Lehrbuch usw.).

1. (3 Pkt.) Welche Reaktion wird durch Acetylcholinesterase katalysiert? Zeigen Sie die Strukturen von Edukten und Produkten auf.

2. (3 Pkt.) Wie wichtig ist Acetylcholinesterase allgemein für die neuronale Übertragung über eine Synapse?

3. (3 Pkt.) Wo befindet sich die Acetylcholinesterase im synaptischen Raum? Kommt Acetylcholinesterase zum Beispiel auf der präsynaptischen Membran oder auf der postsynaptischen Membran oder als lösliches Enzym im synaptischen Spalt oder ... vor? Kann dieses Enzym im Allgemeinen frei von der Synapse weg diffundieren? Kurz erklären.

Arbeitsblatt zu den Acetylcholinesterase-Eigenschaften

Beantworten Sie die folgenden Fragen zu den allgemeinen Eigenschaften des Enzyms Acetylcholinesterase unter Verwendung üblicher Quellen (Internet, Biochemie-Lehrbuch usw.).

1. (2 Pkt.) Ist die natürliche Form der Acetylcholinesterase eine einzelne Polypeptidkette (ein Monomer)? Oder kommt Acetylcholinesterase als Polymer vor? Erklären.

2. (2 Pkt.) Beschreiben Sie kurz die Schritte, die Acetylcholin unternimmt, beginnend mit der präsynaptischen Vesikel und endend, wenn Acetylcholin durch Acetylcholinesterase reagiert.

3. (3 Pkt.) Viele Nervengase (z. B. Sarin (GB), Soman (GD)) wurden entwickelt, um die Acetylcholinesterase zu beeinflussen. Was machen diese Nervengase speziell mit diesem Enzym? Wie beeinflusst die Veränderung der Acetylcholinesterase (verursacht durch Nervengase) die Nervenübertragung?

4. (3 Pkt.) Viele gängige Insektizide (z. B. Malathion, Sevin) beeinflussen auch die Acetylcholinesterase. Auch einige Medikamente zur Behandlung von Krankheiten wie Alzheimer und Myasthenia gravis zielen auf die Acetylcholinesterase ab. Beispiele für diese Medikamente umfassen Physostigmin (Eserin), Neostigmin und Pyridostigmin. Wie wird die Aktivität der Acetylcholinesterase durch diese Insektizide oder Medikamente beeinflusst? Wie wirkt sich diese Veränderung der Acetylcholinesterase auf die Nervenübertragung aus?


Ein neuartiger Acetylcholinesterase-Biosensor mit dualer Erkennungsstrategie basierend auf molekular geprägtem Polymer

MIP, das für bestimmte Einheiten selektiv ist, aber nicht für Phosphor von AP (Azephat) wurde hergestellt.

Durch MIP eingefangenes AP hemmte immer noch die AChE-Aktivität.

MIP und AChE, die selektiv für verschiedene Einheiten von AP sind, wurden in einen Sensor eingebaut.

MIP reichert AP selektiv aus Proben an, AChE quantifiziert die von MIP erfassten AP-Spiegel.

Der Sensor erkennt AP in Gemüse genauer als der AChE-Hemmtest.


Abstrakt

Unsere vorherige Simulation der Molekulardynamik (10 ns) der Maus-Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) zeigte eine komplexe Fluktuation der Schlucht des aktiven Zentrums des Enzyms. Nun berichten wir über eine 5-ns-Simulation von Acetylcholinesterase komplexiert mit Fasciulin 2. Fasciulin 2 bindet mit ausgezeichneter Komplementarität und vielen polaren und hydrophoben Wechselwirkungen an den Schluchteingang der Acetylcholinesterase. In dieser Simulation des Protein‐Protein‐Komplexes, bei dem Fasciculin 2 den Zugang von Liganden zur Schlucht sterisch zu blockieren scheint, beobachten wir erneut eine Wahrscheinlichkeitsverteilung der Schlucht mit zwei Spitzen. Wenn Fasciulin vorhanden ist, wird die Verteilung der Schluchtbreite so verändert, dass die Schlucht eher schmal ist. Darüber hinaus gibt es große Zunahmen bei der Öffnung alternativer Durchgänge, nämlich der Seitentür (in der Nähe von Thr 75) und der Hintertür (in der Nähe von Tyr 449). Schließlich wird die katalytische Triadenanordnung im aktiven Zentrum der Acetylcholinesterase durch gebundenes Fasciulin zerstört. Diese Daten belegen, dass Fasciulin zusätzlich zu der in der Kristallstruktur beobachteten sterischen Obstruktion die Acetylcholinesterase durch kombinierte allosterische und dynamische Mittel hemmen kann. Weitere Daten aus diesen Simulationen finden Sie unter http://mccammon.ucsd.edu/.

Bei Arbeiten mit mehr als einem Autor gibt das Sternchen den Namen des Autors an, an den Anfragen zur Arbeit gerichtet werden sollen.

Institut für Chemie und Biochemie, University of California, San Diego.

Institut für Physik, University of California, San Diego.

Institut de Biologie Structurale et Microbiologie.

Université de la Méditerranée.

Howard Hughes Medical Institute und Department of Pharmacology, University of California, San Diego.


ERGEBNISSE

Immunpräzipitationsanalyse auf ChAT-Aktivität im Optikuslappen

Bei Messung in Optikus-Homogenaten betrug die ChAT-Aktivität ≈ 6.100 ± 498 pmol [ 3 H] gebildetes ACh/min/mg Protein (n = 3), ein Wert, der etwa doppelt so hoch ist wie der im Rattenstriatum berichtete (Bellier und Kimura, 2007 .). ). Es wurde kein statistischer Unterschied zwischen der basalen ChAT-Aktivität und der ChAT-Aktivität in Pansorbin-Zellen gefunden, die zuerst mit dem Präimmunserum und dann mit den Optikus-Homogenaten behandelt wurden (159.918 ± 16.157 vs. 162.654 ± 19.195 dpm von [ 3 H] ACh gebildet n = 3). Als wir schließlich die Pansorbin-Zellsuspension, die Gewebeantigene des Optikuslappens trägt, über Anti-cChAT-IgG untersuchten, stellten wir eine hohe ChAT-Aktivität fest (254.163 ± 21.987 dpm gebildetes [ 3 H] ACh, n = 3), die sich signifikant von die Werte der beiden vorangegangenen Kontrollstudien (Kruskal-Wallis-Test, P < 0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass cChAT-ähnliche(s) Molekül(e) im Augenlappen eine ausreichende ChAT-Aktivität besitzen, um ACh zu synthetisieren.

Westernblot nach SDS-PAGE

Bei Behandlung mit entweder Präimmun- oder Anti-cChAT-Serum reagierte eine Anzahl von Oktopus-Gewebemolekülen mit dem sekundären Antikörper gegen Kaninchen-IgG auf unserem Western-Blot nach SDS-PAGE ( 1a ). Das cChAT-Antiserum ergab eine spezifische, intensiv gefärbte einzelne Bande auf dem Oktopus-Optiklappen, die das Präimmunserum nicht nachweisen konnte ( 1a ). Die Bande hatte ein Molekulargewicht von 81 kDa. Das Antiserum ergab auch eine einzelne Bande auf dem rekombinanten Ratten-cChAT-Protein. Sein Molekulargewicht von 69 kDa entsprach gut der erwarteten Größe und bestätigte damit die Validität der Western-Blot-Analyse.

Western-Blot unter Verwendung des cChAT-Antiserums auf Rohextrakten aus Oktopus-Optiklappen nach SDS-PAGE (ein) und blaue native SEITE (B). Die linke Spalte in a zeigt eine positive Kontrolle für Western Blot unter Verwendung des rekombinanten Ratten-cChAT (69 kDa), exprimiert in humanen embryonalen Nieren (HEK)-Zellen. Die rechte Spalte in a zeigt eine spezifische Bande für das cChAT-Antiserum von etwa 81 kDa. Das rechte Diagramm in b zeigt die ChAT-Aktivitäten in Gelschnitten und zeigt den höchsten Peak in einem geschnittenen Gel, der der einzelnen cChAT-immunreaktiven Bande bei etwa 81 kDa entspricht (linke Spalte in b). Sternchen zeigen unspezifische Banden an, die für das sekundäre Biotin-markierte Anti-Kaninchen-IgG gefärbt sind.

ChAT-Aktivitätsassay und Western-Blot nach Blue Native PAGE

Western Blot nach Blue native PAGE zeigte wieder eine cChAT-spezifische Einzelbande von ~81 kDa (Fig. 1b). Die Inkubation von elektrophoretisch behandelten Gelschnitten offenbarte einen scharfen Peak der ChAT-Aktivität um das geschnittene Gel herum entsprechend der 81 kDa positiven Bande ( 1b ). Dieser Peak war signifikant höher als der in allen anderen Gelfraktionen oder Kontrollgelen, die außerhalb der Probenspuren gesammelt wurden (153.050 ± 16.420 vs. 8.530 ± 920 und 8.210 ± 755 dpm von [ 3 H] ACh gebildet, n = 3 P < 0,05).

Immunhistochemie

Wir haben die Beschreibungen von Young (1971) und Messenger (1967) für die anatomische Organisation und Terminologie der hier untersuchten Nervengewebe von Kraken zu Rate gezogen.

Eine schematische Zeichnung veranschaulicht die Hauptkomponenten des visuellen Systems des Oktopus (Abb. 2). In der Regel schien die cChAT-Immunreaktivität ausschließlich auf neuronale Strukturen beschränkt zu sein. Weder gliale noch vaskuläre Elemente färbten sich jemals positiv für cChAT.

Schematische topografische Zeichnung, die die untersuchten Gehirnregionen des Oktopus veranschaulicht. 1, Auge 2, Sehnervenbündel 3, Sehlappen 4, Riechlappen 5, Stiellappen 6, Sehdrüse und 7, Sehbahn. A, anterior L, lateral M, medial P, posterior.

Kopffüßer haben extrem entwickelte visuelle Systeme. Das vordere Segment des Oktopusauges ähnelt dem vorderen Segment des Wirbeltierauges, da es eine Iris und eine verstellbare Linse hat. Das hintere Segment des Oktopusauges unterscheidet sich vom Wirbeltierauge, weil seine Netzhaut aus einer einzigen Schicht stäbchenförmiger Photorezeptoren besteht, deren Axone separate Sehnervenbündel bilden (Young, 1962a, b, 1971). Jedes Sehnervenbündel enthält sowohl zentripetale als auch zentrifugale Nervenfasern (Lund, 1966 Saidel, 1979 Suzuki und Yamamoto, 2002), tritt dorsal aus dem Auge aus, kreuzt sich in einem Chiasma und erreicht den Sehlappenkortex oder Cajals „Retina profunda (deep Netzhaut)“ (Cajal, 1917).

In dieser Studie haben wir keine cChAT-Immunreaktivität in irgendeinem Zelltyp im Auge, einschließlich der retinalen Photorezeptoren, nachgewiesen. In seltenen Fällen fanden wir seriell angeordnete cChAT-positive Punkte, wahrscheinlich Varikositäten in parallel oder senkrecht zur Sklera verlaufenden Nervenfasern in der Plexiform des Auges (Abb. 3a–b). Der Sehnerv enthielt einige cChAT-positive Krampfadern, obwohl ihre Axone zwischen den Krampfadern oft unsichtbar waren. Die Häufigkeit solcher positiven Fasern variierte von null bis höchstens drei in jedem dicken Bündel des Sehnervs (Abb. 3c).

Immunhistochemische Färbung für cChAT in der Oktopus-Retina (a, b), der Sehnerv (ON, C) und die äußere körnige Zellschicht des optischen Lappenkortex oder der tiefen Netzhaut (OGL, D mit Kernechtrot gegengefärbt). Pfeile weisen auf seltene Beispiele von spärlichen positiven Puncta hin. os, äußeres Segment der Photorezeptoren ns, Linie der Kerne von Satellitenzellen ist, inneres Segment der Photorezeptoren nr, Linie der Kerne der Photorezeptoren pr, plexiforme Schicht der Netzhaut r1, erste radiale Unterschicht der plexiformen Schicht der tiefen Netzhaut und t1, erste tangentiale Unterschicht der plexiformen Schicht der tiefen Netzhaut. Gestapelte Bilder mit der Hyperfocus-Software. Maßstabsbalken = 50 µm.

Optische Keule.

Der Oktopus-Optiklappen ist das Zentrum, in dem visuelle Eingaben, die über den Sehnerv übermittelt werden, kodiert, gespeichert und dekodiert werden, um motorische Reaktionen zu erzeugen. Der Optikuslappen besteht aus einer Rinde und einer Medulla. Der Kortex des Sehlappens enthält drei neuronale Zonen der tiefen Netzhaut, die aus einer äußeren und einer inneren Körnerzellschicht bestehen, die durch eine plexiforme Schicht getrennt sind. Die Medulla des optischen Lappens wird von zahlreichen Neuronen besetzt, die in Inseln gepackt sind, die von Neuropil umgeben sind (Young, 1971).

Es wurden keine cChAT-positiven Zellen innerhalb des optischen Lappenkortex, weder in der äußeren noch in der inneren Körnerzellschicht, noch natürlich in der zellfreien plexiformen Schicht beobachtet (Abb. 4a–c). In der äußeren Körnerzellschicht waren nur sehr wenige cChAT-positive Punkte zu sehen, die seriell angeordnet waren, was auf Krampfadern hindeutete (Abb. 3d, 4a). Die plexiforme Schicht zeigte das auffälligste Färbungsmerkmal mit starker Ablagerung von cChAT-positiven terminalen Punkten (Abb. 4a–c). Diese positiven Punkte schienen in den ersten beiden Tangentialschichten (t1 und t2) dichter angeordnet zu sein als in den verbleibenden beiden inneren Tangentialschichten (t3 und t4), die von Young (1962a) beschrieben wurden. Gelegentlich konnte der Weg solcher positiver Punkte über eine kurze Distanz (ca. 500–700 μm) von einer der vier Tangentialschichten zum Neuropil des Sehlappenmarks in der Nähe der inneren Körnerzellschicht verfolgt werden. In der inneren Körnerzellschicht zum Beispiel zeigte die cChAT-positive Färbung eine deutliche Morphologie radial orientierter Nervenfasern mit sichtbaren intervarikosen Axonen (Abb. 4a–c). Umgekehrt wies die erste radiale Schicht (r1) keine oder nur sehr wenige cChAT-positive Punkte auf (Abb. 3d, 4a–c). Obwohl die anderen drei inneren radialen Schichten (r2–r4) eine kleine Anzahl positiver Punkte enthielten, schienen sie verschobene cChAT-positive Anschlüsse benachbarter tangentialer Schichten zu sein.

Immunhistochemische Färbung für cChAT in Oktopus-Optiklappen. Optischer Lappenkortex oder tiefe Netzhaut a–c: Einige Fasern können von der Medulla des Sehlappens über die innere Körnerzellschicht bis zur Plexiformschicht (Pfeilspitzen) verfolgt werden. Innerhalb der plexiformen Schicht scheinen cChAT-immunpositive Fasern in den tangentialen Unterschichten (t1–t4) zu enden und geben wenige Äste in die radialen Unterschichten r2–r4 ab. Auch in der ersten radialen Unterschicht (r1) sind keine oder nur sehr wenige cChAT-immunpositive Fasern zu sehen. Äußerer Bereich der Medulla (D): Drei cChAT-immunreaktive Nervenfasern mit winzigen Krampfadern (Pfeilspitzen) verlaufen über die Zellinseln und ihr umgebendes Neuropil. cChAT-immunreaktive terminale, relativ große Punkte sind hauptsächlich im Neuropil gesprenkelt. Keine der hier gezeigten Zellinseln enthält cChAT-immunreaktive Zellen. Innere oder tiefe Regionen der Medulla (e–h): Intensiv immungefärbte, oft große und birnenförmige Zellen sind in Zellinseln zu sehen. Beachten Sie, dass ihre unipolaren Prozesse (Pfeile) glatt und nicht varikös sind. Beim Eintritt in die Neuropile scheinen die Prozesse Krampfadern zu bilden, die sich stark verzweigen und mit Krampfadern im Neuropil verschmelzen. OGL, äußere Körnerzellschicht PL, plexiforme Schicht IGL, innere Körnerzellschicht M, Medulla mi, Zellinsel der Medulla np, Neuropil der Medulla. Mit Kernechtrot gegengefärbt. Gestapelte Bilder mit der Hyperfocus-Software. Maßstabsbalken = 200 μm in a 100 μm in b,c 50 μm in d–h.

Auf cChAT gefärbte positive Zellen wurden in der Medulla des Optikuslappens gefunden. Sie befanden sich in Zellinseln und waren in eine überwältigende Anzahl von cChAT-negativen Zellen der Inseln eingebettet. Jede Zellinsel in einem Gewebeschnitt enthielt null bis fünf cChAT-positive Somata. Da jede Insel in der Fläche stark variierte, zählten wir die Anzahl der cChAT-positiven oder -negativen Somata mit dem Bildanalysator. Positive Somata waren eine Minderheit der ganzen Inselzellen, die von 0,03 % in oberflächlichen Bereichen der Medulla (Abb. 4d) bis höchstens 1,5 % in tieferen (in Richtung des Tractus opticus) Schichten der Medulla variierten (Abb. 4e–h) . Diese positiven Somata waren hauptsächlich unipolar und pyramidenförmig, mit der Hauptachse 22,3 ± 2,6 µm (15,0–32,6 µm) × der Nebenachse 9,9 ± 0,85 µm (5,9–12,4 µm). Einige positive unipolare Prozesse, die normalerweise glatt (nicht varikös) und kurz ohne Verzweigung waren, konnten vor dem Verlassen der Insel verfolgt werden. Nach dem Eindringen in das umgebende Neuropil wurde der Prozess jedoch varikös und verzweigte sich wiederholt in verschiedene Richtungen, um in den Neuropil-residenten Plexus cChAT-positiver Puncta und Krampfadern zu verschmelzen (Abb. 4e–h). Nahe der Mitte des Sehlappens besetzten ähnliche cChAT-positive Nervengeflechte das Neuropil zwischen den Inseln und breiteten sich unregelmäßig in Dichte und Richtung aus. In der Nähe des Hilums des Lappens (Abb. 5a) verliefen immunreaktive Fasern allmählich kollektiv, um regelmäßigere Bündel zu bilden, die sich im Sehtrakt mit zahlreichen positiven Krampfadern zu verbinden schienen (Abb. 5b).

Immunhistochemische Färbung für cChAT im Hilus des Sehnervenlappens (ein) und der Sehnerv (B). Pfeile folgen einigen Nervenfaserbündeln, die vom Medulla Neuropil zum Sehtrakt konvergieren. C: Niedrige Vergrößerung eines koronalen Abschnitts, medial des Sehlappens, der den hinteren Bereich des Stielkomplexes einschließlich der Sehdrüse, des hinteren Riechläppchens und des Sehtrakts zeigt. D: Starke Vergrößerung der Sehdrüse, die zeigt, dass cChAT-positive Puncta in enger Nachbarschaft zu cChAT-negativen residenten endokrinen Zellen liegen. e: Niedrige Vergrößerung eines koronalen Abschnitts medial des Optikuslappens, der die vordere Region des Stielkomplexes einschließlich der Wirbelsäulenzone und der Basalzone des Stiellappens zeigt. F: Starke Vergrößerung des Stiellappens mit cChAT-positiven Fasern und Enden, die dicht im Neuropil verteilt sind, während sie in der Wirbelsäulenzone spärlich verteilt sind. g,h: Der hintere Riechläppchen enthält positive neuronale Zellen großer bis mittelgroßer Somata im Kortex. Von diesen Zellen erstrecken sich dicke und glatte Fortsätze in das Neuropil, wo intensiv gefärbte endständige Anstecker reichlich abgelagert sind. OG, Sehdrüse OL, Sehlappen OT, Sehtrakt PeL, Stiellappen pOLF, hinterer Riechläppchen bz, Basalzone des Stiellappens co, kortikale Schicht des hinteren Riechläppchens mi, Zellinseln der Medulla np, Neuropil sp, Wirbelsäulenzone von Stiellappen. Mit Kernechtrot gegengefärbt. Gestapelte Bilder mit der Hyperfocus-Software. Maßstabsbalken = 100 µm in a,b,h 500 µm in c,e 50 µm in d,f 200 µm in g.

Stielkomplex.

Dieser Komplex besteht aus einem nichtnervösen Teil, der Sehdrüse, und zwei nervösen Teilen, dem Stiellappen und dem Riechlappen. Alle diese drei liegen auf der dorsalen Oberfläche des Tractus opticus, der den Optikuslappen sowohl mit dem supra- als auch mit dem subösophagealen Lappen verbindet (Messenger, 1967).

Optische Drüse.

In dieser Drüse wurden keine cChAT-positiven Somata beobachtet, jedoch wurden reichlich cChAT-positive Puncta und dünne Krampfadern beobachtet, die ein diskretes Netzwerk im Stroma bildeten. Diese positiven Puncta- und Krampfaderschwellungen wurden oft in enger Anlagerung an die Oberfläche von cChAT-negativen nicht-neuronalen Zellen gefunden (Abb. 5c, d).

Stiellappen.

Im Stiellappen, einschließlich der Wirbelsäule und der Basalzonen seiner kortikalen Schicht, wurden keine positiven Somata nachgewiesen. Ein dichtes Netzwerk von cChAT-positiven Punktpunkten und Fasern wurde in Neuropilen sowohl der Wirbelsäule als auch der Basalzonen gefunden. Positive Fasern, die in Längsrichtung im Neuropil der Basalzone verlaufen, schienen mit denen in der Medulla des Optikus und des Riechlappens lateral und denen im Tractus opticus nach medial zu konfluieren (Abb. 5e,f).

Olfaktorischer Lappen.

Der Riechlappen ist in drei unterteilt: den vorderen, mittleren (Median) und hinteren Lobulus. Positive Somata für cChAT wurden ausschließlich in der Kortikalis des hinteren Läppchens beobachtet, jedoch nicht in anderen Bereichen einschließlich des vorderen und mittleren Läppchens. Zwei Arten von positiven Somata waren erkennbar (Abb. 5g,h). Neuronen des ersten Typs waren durch große birnenförmige Somata gekennzeichnet, mit der Hauptachse 37,1 ± 2,7 µm (29,3–44,7 µm) × der Nebenachse 18,9 ± 1,2 µm (16,0–21,8 µm). Sie waren radial im hinteren Läppchenkortex orientiert. Diese Zellen wiesen intensiv gefärbte Fortsätze auf, die zum inneren Neuropil desselben Läppchens projizierten, das mit einem dichten Netzwerk aus immunreaktiven Puncta und Krampfadern gefüllt war. Positive Zellen des zweiten Typs besaßen mittelgroße runde oder ovale Somata mit einem Durchmesser von 10,9 ± 0,7 µm (8,2–13,3 µm). Sie befanden sich in einem tiefen Teil der Kortikalis nahe dem Neuropil. In Neuropilen sowohl des vorderen als auch des mittleren Riechläppchens waren cChAT-positive Puncta und Krampfadern dicht verteilt. These positive fibers seemed confluent with those in the neuropils of the posterior lobule, peduncle lobe, and optic lobe, and also those in the optic tract and the stroma of the optic gland.

The drawing in Figure 6 illustrates the distribution patterns of cChAT-immunoreactive neuronal cells and fibers in the octopus optic lobe and peduncle complex.

Schematic drawing showing the distribution patterns of cChAT-positive neuronal cells and fibers in a horizontal plane of octopus optic lobe and peduncle complex. 1, outer granule cell layer 2, plexiform layer 3, inner granule cell layer 4, islands of the medulla 5, neuropil of the medulla 6, optic gland 7, olfactory lobe (a, anterior lobule m, median lobule p, posterior lobule) 8, peduncle lobe 9, optic tract. A, anterior L, lateral M, medial P, posterior.


Abstrakt

Monocationic and dicationic cholinium ionic liquids (ILs) were synthesized and evaluated as acetylcholinesterase (AChE) inhibitors with in vitro and in silico models, and their cytotoxicity was assessed using human cell lines from skin (CRL-1502) and colon cancer (CaCo-2). The ILs with a longer alkyl chain were stronger AChE inhibitors, the dicationic ILs (DILs) being more active than the monocationic ILs. The best result was obtained for [N1,1,12,2(OH)]2Br2 at a concentration of 0.18 μM by reducing half enzyme activity without affecting the viability of tested cell lines. A saturation-transfer difference NMR (STD-NMR) binding study was carried out, demonstrating that [N1,1,12,2(OH)]2Br2 binds to AChE. STD-NMR competition binding experiments, using galanthamine as a reference ligand, clearly highlight that the IL displaces galanthamine in the AChE binding site pinpointing [N1,1,12,2(OH)]2Br2 inside the deep gorge of AChE. In order to obtain a three-dimensional (3D) view of the molecular recognition process, in silico molecular docking studies on the active site of AChE were carried out. The proposed 3D model of the AChE/DIL complex is in agreement with the STD-derived epitope mapping, which explains the competition with galanthamine and unveils key interactions in both peripheral and catalytic sites of AChE. These interactions seem essential to govern the recognition of DILs by the AChE enzyme. Our study provides a structural and functional platform that can be used for the rational design of choline-based ILs as potent AChE inhibitors.


Amino acid residues controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity

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Novel quinazolin-sulfonamid derivatives: synthesis, characterization, biological evaluation, and molecular docking studies

In the design of novel drugs, the formation of hybrid molecules via the combination of several pharmacophores can give rise to compounds with interesting biochemical profiles. A series of novel quinazolin-sulfonamid derivatives (9a-m) were synthesized, characterized and evaluated for their in vitro antidiabetic, anticholinergics, and antiepileptic activity. These synthesized novel quinazolin-sulfonamid derivatives (9a-m) were found to be effective inhibitor molecules for the α-glycosidase, human carbonic anhydrase I and II (hCA I and hCA II), butyrylcholinesterase (BChE) and acetylcholinesterase (AChE) enzyme, with Ki values in the range of 100.62 ± 13.68-327.94 ± 58.21 nM for α-glycosidase, 1.03 ± 0.11-14.87 ± 2.63 nM for hCA I, 1.83 ± 0.24-15.86 ± 2.57 nM for hCA II, 30.12 ± 3.81-102.16 ± 13.87 nM for BChE, and 26.16 ± 3.63-88.52 ± 20.11 nM for AChE, respectively. In the last step, molecular docking calculations were made to compare biological activities of molecules against enzymes which are achethylcholinesterase, butyrylcholinesterase and α-glycosidase.Communicated by Ramaswamy H. Sarma.

Schlüsselwörter: Quinazolin enzyme inhibition molecular docking sulfonamide.


Einführung

Die rasche internationale Ausbreitung des Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) des schweren akuten respiratorischen Syndroms, dem Erreger von COVID-19, ist mit zahlreichen Mutationen verbunden, die die virale Fitness verändern. Mutationen wurden in allen 4 Strukturproteinen dokumentiert, die vom viralen Genom kodiert werden, einschließlich des kleinen Hüllglykoproteins (E), des Membranglykoproteins (M), des Nukleokapsid-(N)-Proteins und des Spike-(S)-Proteins. Die bekanntesten Mutationen sind das Spike-Protein, das den Eintritt des Virus in die Zellen vermittelt, indem es mit dem Angiotensin-Converting-Enzym-2-(ACE2)-Rezeptor in Kontakt tritt. Es wurde über mehrere Strukturen von SARS-CoV-2-Spike-Proteinvarianten in Prä- und Postfusionskonformationen berichtet, darunter Komplexe mit ACE2 und einer Vielzahl von Antikörpern [1–13]. Mutationen, die in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des Spike-Proteins auftreten, sind aufgrund ihres hohen Potenzials, die Kinetik und die Stärke der Interaktion des Virus mit Zielzellen zu verändern, von besonderem Interesse. Diese Mutationen könnten auch die Bindung von Antikörpern beeinflussen, die in der Lage sind, das Virus zu binden und die Interaktion des Virus mit ACE2 zu blockieren.

Im Dezember 2020 wurden in Großbritannien (SARS-CoV-2 VOC202012/01) und Südafrika (501Y.V2) neue Varianten von SARS-CoV-2 dokumentiert, die mehrere Mutationen im Spike-Protein tragen [14,15]. Frühe epidemiologische und klinische Befunde weisen auf eine erhöhte Übertragbarkeit dieser Varianten in der Bevölkerung hin [16]. Obwohl sie phylogenetisch verschieden sind, ist ein gemeinsames Merkmal sowohl der britischen als auch der südafrikanischen Variante die Mutation des Restes 501 in der RBD von Asn zu Tyr (N501Y). Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Strukturstudien haben N501 als einen Schlüsselrest im Spike-Protein an der Grenzfläche zwischen RBD und ACE2 identifiziert, das an kritischen Kontakten mit mehreren ACE2-Resten beteiligt ist [5,6,10 ,13]. Studien, die in einem Mausmodell vor der Identifizierung der neuen UK-Variante durchgeführt wurden, legten nahe, dass Mutationen des Restes 501 mit einer erhöhten Rezeptorbindung und Infektiosität verbunden sein könnten [17,18]. Das Verständnis der Auswirkungen von N501Y auf die Antikörperneutralisation, die ACE2-Bindung und den Viruseintritt ist daher von grundlegendem Interesse bei den Bemühungen, die Ausbreitung von COVID-19 zu verhindern.


Electrostatic attraction by surface charge does not contribute to the catalytic efficiency of acetylcholinesterase.

Acetylcholinesterases (AChEs) are characterized by a high net negative charge and by an uneven surface charge distribution, giving rise to a negative electrostatic potential extending over most of the molecular surface. To evaluate the contribution of these electrostatic properties to the catalytic efficiency, 20 single- and multiple-site mutants of human AChE were generated by replacing up to seven acidic residues, vicinal to the rim of the active-center gorge (Glu84, Glu285, Glu292, Asp349, Glu358, Glu389 and Asp390), by neutral amino acids. Progressive simulated replacement of these charged residues results in a gradual decrease of the negative electrostatic potential which is essentially eliminated by neutralizing six or seven charges. In marked contrast to the shrinking of the electrostatic potential, the corresponding mutations had no significant effect on the apparent bimolecular rate constants of hydrolysis for charged and non-charged substrates, or on the Ki value for a charged active center inhibitor. Moreover, the kcat values for all 20 mutants are essentially identical to that of the wild type enzyme, and the apparent bimolecular rate constants show a moderate dependence on the ionic strength, which is invariant for all the enzymes examined. These findings suggest that the surface electrostatic properties of AChE do not contribute to the catalytic rate, that this rate is probably not diffusion-controlled and that long-range electrostatic interactions play no role in stabilization of the transition states of the catalytic process.


Abstrakt

In the last years, in order to achieve a better treatment of Alzheimer's disease (AD), much focus has been put on the development of cholinesterase (Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase) inhibitor drugs. Thus, the aim of this study is to discover promising active compounds for Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase enzymes inhibitors based on QSAR model and drug-likeness evaluation. In this study, a series of DL0410 and its 50 derivatives are accounted for the set up of two QSAR Modelle. This allows an exploration of the main molecular descriptors that control the inhibitory activity of specific compounds towards cholinesterase enzymes: Acetylcholinesterase (AChE) and Butyrylcholinesterase (BuChE). Simultanerously, the models can help to predict the inhibitory activity of new compounds within its applicability domain. A Multiple Linear Regression (MLR) analysis is carried out to derive QSAR Modelle. The results indicate that the QSAR models of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase inhibitory activity are robust and have a very good prediction capacity, testified by values of R 2 equal to 0.935 and 0.895, respectively. The analysis carried out by adopting the QSAR models succeed in screening 15 potential compounds with higher biological activity. Subsequently, the investigated compounds has been subjected to the drug-likeness evaluation and reactivity study. The results show that most of the compounds do not present any bioavailability problem when administered orally. The results also allow determining the compounds that have not clearance problems, those that are the most stable and the most reactive among those tested. These findings indicate that the newly designed candidate drugs have promising potential toward AChE and BuChE enzyme inhibition and should be experimentally investigated.


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