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DNA-DNA-Vernetzung mit Formaldehyd?

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Die 3C-Technologie (Chromosom Conformation Capture) zur Untersuchung der Chromatin-3D-Organisation beginnt mit einem Vernetzungsschritt unter Verwendung von Formaldehyd, um wechselwirkende DNA-Segmente zu finden. Nach meinem Verständnis geschieht die Vernetzung nur zwischen der DNA und Proteinen, die einen DNA-Protein-DNA-Komplex bilden. Das "einzige" ist vom Standpunkt der DNA aus, da natürlich auch Protein-Protein-Crosslinks auftreten werden.

Kann Formaldehyd zwei doppelsträngige DNA-Moleküle vernetzen? Erfasst der 3C-Ansatz auch direkte DNA-DNA-Wechselwirkungen?

Ich habe mir die Literatur angesehen, insbesondere Dekker et al. Beschreibung der Methode, konnte diese Informationen jedoch nicht finden. Vielen Dank.


Die Tatsache, dass es keine Quervernetzung zwischen verschiedenen Doppelsträngen gibt, könnte nur daran liegen, dass der Quervernetzer die Distanz zwischen Aminen verschiedener Basen auf verschiedenen Doppelsträngen nicht überbrücken kann.

Die auf Formaldehyd basierende Verknüpfung von Nukleobasen wurde von Chaw et al. (1980), wo Formaldehyd eine Lücke von ca. 3 Angström (2x 1,3 A für N-C-Bindung).

Selbst wenn Sie die am stärksten kondensierte Form der DNA wie bei Nukleosomen nehmen (siehe Röntgenmodell von Nukleosomen mit gebundener DNA), haben Sie immer noch mindestens 20 Angström zwischen den Basen verschiedener Doppelstränge. Gleichzeitig liegen zwischen den Nukleobasen desselben Doppelstrangs nur 3 Angström, was gut mit der Länge einer Methylbrücke übereinstimmt.


Squaramat-modifizierte Nukleotide und DNA zur spezifischen Vernetzung mit lysinhaltigen Peptiden und Proteinen

Squaramat-verknüpftes 2′-Desoxycytidin 5′-Ö-Triphosphat wurde synthetisiert und erwies sich als gutes Substrat für die KOD XL DNA-Polymerase bei der Primerverlängerung oder PCR-Synthese modifizierter DNA. Die resultierende Squaramat-verknüpfte DNA reagiert mit primären Aminen, um eine stabile Diamid-Verknüpfung zu bilden. Diese Reaktion wurde für Biokonjugationen von DNA mit Cy5- und Lys-enthaltenden Peptiden verwendet. Squaramat-verknüpfte DNA bildete kovalente Querverbindungen mit Histonproteinen. Dieses reaktive Nukleotid hat Potenzial für andere Biokonjugationen von Nukleinsäuren mit Aminen, Peptiden oder Proteinen, ohne dass ein externes Reagenz benötigt wird.

Protein-DNA-Wechselwirkungen sind von entscheidender Bedeutung bei der DNA-Verpackung, Replikation, Transkription, epigenetischen Modifikationen und Reparatur. 1 Transkriptionsfaktoren (TFs) sind besonders wichtige DNA-bindende Proteine, die die Genexpression durch sequenzspezifische Bindung an Promotorsequenzen regulieren. Von den ungefähr 1600 bekannten humanen TFs sind die detaillierte biologische Rolle und Bindungsmotive nur für einen kleinen Teil vollständig verstanden. 2 Obwohl es eine Reihe von Methoden zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und zur Identifizierung von DNA-bindenden Proteinen gibt, 3 besteht nach wie vor dringender Bedarf an anderen alternativen Methoden, insbesondere für schwach bindende Proteine. Kovalente Vernetzung ist eine der vielversprechendsten Methoden zur Identifizierung von DNA-bindenden Proteinen, aber kovalente Protein-DNA-Konjugate sind auch für andere Anwendungen in der chemischen Biologie oder der Biosensorik nützlich. 4

Es gibt einige allgemeine unspezifische Vernetzungsmethoden, die auf der photochemischen Erzeugung von Radikalen (aus 5-Halogenuracilen) 5 oder Carbenen (aus Diazirin-verknüpften Nukleobasen) 6 in DNA basieren, die durch C‐H‐Aktivierung zufällig an benachbarte Aminosäuren binden. Schwieriger, aber potenziell sehr nützlich sind Reaktionen, die für eine oder mehrere Aminosäureseitenketten spezifisch sind, aber bisher wurde nur eine sehr begrenzte Anzahl von ihnen für die DNA-Protein-Vernetzung beschrieben. Thiol-verknüpfte DNA kann mit Cys-enthaltenden Proteinen durch Disulfidbildung vernetzen. 7 Es wurde berichtet, dass Vinylsulfonamid-verknüpfte DNA mit Cys vernetzt, 8 während Chloracetamid mit Proteinen über Cys oder His vernetzt. 9 In beiden Fällen war der Proximity-Effekt entscheidend für die effiziente Bildung der kovalenten Vernetzung zwischen modifizierter DNA und Protein. Am häufigsten wurden Berichte über die Quervernetzung von Aldehyd-gebundener DNA mit Lys entweder durch ineffiziente und reversible Schiff-Basen-Bildung 10 oder (häufiger) durch irreversible reduktive Aminierung, 11, 12, die ein zusätzliches stöchiometrisches Reduktionsmittel (z. B. toxische NaBH3CN, was jede In-Cellulo- oder In-vivo-Verwendung erschwert). Lys-DNA-Wechselwirkungen sind sehr häufig und wichtig, insbesondere bei Histonen. Bisher wurde von keiner reaktiven Nukleobasen-Modifikation in DNA berichtet, die ohne ein externes Reagens irreversible Querverbindungen mit Lys bildet.

Monoamide der Quadratsäure (Squaramate) werden häufig für Biokonjugationen mit Lys und anderen Aminen verwendet. 13 Diamide (Squaramide) wurden als Phosphatsurrogat in Nukleotid 14 oder Oligonukleotid (ON)-Analoga verwendet. 15 Ein chemisch synthetisiertes 2′-Zucker-gebundenes Squaramat-RNA-Konjugat, das durch Reaktion von 2′-Amino-modifizierter RNA mit Diethylquadrat hergestellt wurde, soll mit der Aminoacyl-Transferase FemX . quervernetzenWv, 16 als einziges Beispiel für seine Verwendung bei der Nukleinsäure-Konjugation. Im Rahmen unseres Programms zu basenfunktionalisierten Nukleinsäuren für Anwendungen in der chemischen Biologie 17 entwickelten wir neuartiges Squaramat-verknüpftes Cytosin 2′-desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) für die enzymatische Synthese modifizierter DNA und die Vernetzung mit Proteinen.

Die Synthese der gewünschten modifizierten Nukleotide begann mit der Herstellung von 5-(3-Aminopropinyl)-2′-desoxycytidin (1) durch Deacylierung von bekanntem Trifluoracetylamid, 18 siehe Schema S1 in den Hintergrundinformationen. Die Reaktion von Amin 1 mit 2 Äquiv. Diethylsquarat ergab das Squaramat-verknüpfte Nukleosid dC ESQ in 80 % Ausbeute (Schema 1). Standard-Yoshikawa-Phosphorylierung 19 mit POCl3 gab das Monophosphat dC ESQ MP in 37 % Ausbeute, während die Triphosphorylierung 20 mit POCl3 gefolgt von Pyrophosphat und Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) ergab das Triphosphat dC ESQ TP in 7 % Ausbeute. Das Monophosphat dC ESQ MP diente als Modellverbindung für Reaktionen mit Lys und Peptiden (Schema 1). Die Reaktion von dC ESQ MP mit Ac-Lys oder einem Lys-enthaltenden Tripeptid bei Raumtemperatur in Boratpuffer (pH 9) über Nacht durchgeführt, um die gewünschten Konjugate zu ergeben dC ESQLys MP oder dC ESQ3 pept MP in 54 bzw. 63 %. Diese Nukleotid-Peptid-Konjugate wurden durch HPLC in reiner Form isoliert und durch NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie (MS) vollständig charakterisiert, um die erwartete Bildung der Amidbindung mit Lys zu bestätigen.

Synthese von Squaramat-modifiziertem 2′-Desoxycytidin und 2′-Desoxycytidin Mono- und Triphosphat und dC ESQ MP Addukte mit Ac-Lys und lysinhaltigem Tripeptid (AcAlaLysAlaNH2).

Dann testeten wir das Squaramat-gebundene dNTP (dC ESQ TP) als Substrat für die DNA-Polymerase-katalysierte Synthese modifizierter DNA (Abbildung 1 a). Zuerst führten wir die Primer-Extension (PEX) in Gegenwart von KOD XL-DNA-Polymerase mit entweder 19-, 20-, 31- oder 98-mer-Templat und einem 13-, 15- oder 25-mer-Primer (für die Oligonukleotidsequenzen) , siehe Tabellen S1 und S2 in den Hintergrundinformationen). In allen Fällen (Abbildung 1 b und Hintergrundinformationen, Abbildung S1) beobachteten wir die Bildung von PEX-Produkten voller Länge mit einem, vier oder achtzehn dC ESQ Modifikationen. Die PCR-Amplifikation mit 98-bp- oder 235-bp-Templaten verlief ebenfalls gut und ergab eine starke Bande, die dem modifizierten Amplikon entsprach (Abbildung S2). Dies zeigt, dass die reaktive dC ESQ TP Nukleotid reagiert nicht mit DNA-Polymerase (weder während der Verlängerung noch wenn modifizierte DNA als Matrize verwendet wird) und ist ein gutes Substrat und Baustein für die enzymatische Synthese reaktiver, modifizierter DNA-Sonden.

a) Synthese von Squaramat-modifizierter DNA (DNA_C ESQ ) und seine Vernetzung mit Sulfo-Cy5-NH2, Lysin, Tri- und Decapeptid. b) SDS-PAGE-Analyse des Einbaus von dC ESQ TP in DNA unter Verwendung von KOD XL Polymerase und Temp 20 1C. P: Primer A (+): natürliche dNTPs (−): natürliche dNTPs ohne dCTP C ESQ : dC ESQ TP, dGTP, dTTP, dATP. c) SDS-PAGE-Analyse der Konjugation von DNA_C ESQ (4,3 µm) mit Ac-Lys (11mm), Tripeptid (11mm) und Decapeptid (11mm). Bedingungen: Boratpuffer (0,5 m, pH 9), 37 °C, 36 h. Für die Oligonukleotidsequenz siehe Tabelle S1 in den Hintergrundinformationen.

Als nächstes testeten wir die Vernetzungsreaktionen von dC ESQ -verknüpfte DNA mit Aminen und Peptiden (Abbildung 1 a,c). Die Reaktionen von 20-bp DNA_C ESQ wurden bei Raumtemperatur in Boratpuffer (pH 9) durchgeführt. Die Reaktion mit Sulfo-Cy5-NH2 (100 Äquiv.) ergab das gewünschte fluoreszenzmarkierte DNA_C ESQCy5 (Hintergrundinformationen, Abbildung S3). Analoge Reaktionen von DNA_C ESQ mit Ac-Lys und Lys-enthaltendem Tripeptid oder Decapeptid wurden mit großem Überschuss (ungefähr 2500 Äquiv.) der Peptide durchgeführt, da bei diesen nicht-DNA-bindenden Peptiden kein Proximity-Effekt erwartet wurde. Unter diesen Bedingungen verliefen die Reaktionen mit mäßiger Effizienz und ergaben die gewünschten vernetzten Konjugate DNA_C ESQLys , DNA_C ESQ3pept oder DNA_C ESQ10pept mit 50, 43 bzw. 20 % Umsatz (Abbildung 1 c). Alle Konjugate wurden durch MALDI-MS charakterisiert und bestätigt (Hintergrundinformationen, Tabelle S4).

Schließlich die reaktive DNA-Sonde DNA_C ESQ wurde in Reaktionen mit Proteinen getestet. Wir verwendeten Rinderserumalbumin (BSA) als negative Kontrolle eines Proteins mit 60 Lysinen, das nicht mit DNA interagiert, die Kerndomäne von p53 21 als DNA-bindendes Protein, das Lysine enthält, aber nicht an der Bindungsstelle, und eine Reihe von rekombinante H2A-, H2B-, H3.1- und H4-Histone als Beispiele für Lys-reiche Proteine, die stark an DNA binden. Die Vernetzungsreaktionen wurden mit nur 2 Äquivalenten der entsprechenden Proteine ​​durchgeführt. Da bekannt ist, dass Histone Dimere und Oligomere bilden, gehen wir davon aus, dass dieses Verhältnis wahrscheinlich nahe an äquimolar ist. Um den physiologischen Bedingungen näher zu kommen, verwendeten wir Phosphatpuffer (oder TRIS oder HEPES, siehe Abbildung S8 in den Hintergrundinformationen) (pH 7.4).

Zuerst führten wir eine einfache kinetische Untersuchung der Vernetzungsreaktion von DNA_C ESQ mit Histon H3.1, um zu zeigen, dass die Reaktion den maximalen Umsatz in 16–24 h erreicht (Abbildung S5). Daher verwendeten wir in anderen Fällen 36-Stunden-Reaktionen, um ausreichende Umsätze zu gewährleisten. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Vernetzungsexperimente mit Proteinen. Zu unserer Freude sind die Reaktionen von DNA_C ESQ mit allen vier rekombinanten Histonen ergaben die kovalent vernetzten Konjugate mit geringerer Mobilität auf einem denaturierenden SDS-PAGE-Gel (Abbildung 2 b). Die aus der SDS-PAGE berechneten Umsätze dieser Reaktionen betrugen 31–34 % (Tabelle S5). Die Identität der kovalenten DNA-Protein-Konjugate mit H2B-, H3.1- und H4-Histonen wurde auch durch SDS-PAGE mit Proteinfärbung (Coomassie Blue, Hintergrundinformationen, Abbildung S7) und durch HPLC-MS-Analyse mittels Elektrospray-Ionisation (Unter Informationen, Abbildungen S16–S18). Auch ein längeres 98-bp-PEX-Produkt mit 18 Squaramatgruppen reagierte mit Histon H3.1, obwohl ein Gemisch vernetzter Produkte erhalten wurde (Abbildung S10). Auf der anderen Seite, DNA_C ESQ weder mit BSA oder p53 (Abbildung S9) noch mit DNA-Polymerase während der PEX oder PCR vernetzten. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Proximity-Effekt (Anwesenheit von Lysin(en) nahe der DNA-Bindungsstelle des Proteins) für eine effiziente Vernetzung in Abwesenheit eines großen Überschusses des Peptids oder Proteins entscheidend ist.

a) Quervernetzung von Squaramat-modifizierter DNA (DNA_C ESQ ) mit histonrekombinanten Proteinen. b) SDS-PAGE-Analyse von Vernetzungsexperimenten mit natürlicher oder modifizierter DNA und verschiedenen rekombinanten Proteinen (2 Äquiv. Protein zu DNA): 17,5 % SDS-PAGE-Gel. Bedingungen: Phosphatpuffer (4,5 mm, pH 7,4), 37 °C, 36 h.

Zusammenfassend haben wir ein neuartiges Squaramat-verknüpftes dNTP entwickelt und synthetisiert (dC ESQ TP) und zeigte, dass es ein sehr gutes Substrat für die KOD XL-DNA-Polymerase bei der PEX- oder PCR-Synthese reaktiver DNA-Sonden ist. Die Squaramatgruppe reagiert mit Aminen, um eine stabile kovalente Diamid-(Squaramid)-Bindung zu bilden. Wir haben gezeigt, dass die dC ESQ -modifizierte DNA-Sonden reagierten mit Amino-verknüpftem Cy5, um fluoreszenzmarkierte DNA zu bilden. Seine Reaktionen mit Lys-haltigen Peptiden liefen nur ab, wenn ein großer Überschuss des Peptids vorhanden war. Bei Reaktionen mit Lys-haltigen DNA-bindenden Proteinen hingegen, bei denen der Proximity-Effekt hilft, laufen die Reaktionen mit guten Umsätzen sogar in fast äquimolarem Verhältnis ab. Im Vergleich zu früher berichteten DNA-Lys-Konjugationen, die auf reduktiver Aminierung basieren, 11, 12 verläuft die Squaramat-Modifikation und ihre Umwandlung in ein stabiles Amid unter physiologischen Bedingungen (bei pH 7.4–9) und erfordert kein externes Reagens (d. h. toxisches NaBH .).3CN in reduktiven Aminierungen verwendet 11, 12 ). Daher hat diese reaktive Modifikation und die vorgestellte Methodik ein gutes Potenzial bei der postsynthetischen Markierung von DNA, 22 Biokonjugationen von DNA mit Peptiden, Proteinen oder anderen Biomolekülen 4 sowie bei Vernetzungsexperimenten zur Identifizierung und Untersuchung von DNA-bindenden Proteinen . In unserem Labor wird in dieser Richtung weiter geforscht.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (Praemium Academiae-Preis an M. Ho.) und von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (18-03305S an I. I. und M. Ho.) unterstützt. Die Autoren danken J. Konč (Universität Cambridge) für Ratschläge bei der MS-Charakterisierung der Konjugate.

Interessenkonflikt

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

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Abstrakt

Die Formaldehyd-Vernetzung ist ein wichtiger Bestandteil vieler Technologien, einschließlich der Chromatin-Immunpräzipitation und des Einfangens der Chromosomenkonformation. Das Verfahren bleibt jedoch trotz einer langen Geschichte seines Einsatzes in der Forschung empirisch und wenig charakterisiert. Über die Spezifität von ist wenig bekannt in vivo Vernetzung, ihre Effizienz und durch das Verfahren induzierte chemische Addukte. Es ist an der Zeit, diese Blackbox zu durchsuchen.

Wir halten es für dringend geboten, auf die Unsicherheit aufmerksam zu machen, die bei Ergebnissen von ChIP und anderen auf Formaldehyd-Fixierung basierenden Ansätzen dadurch entsteht, dass die Vernetzungseffizienz verschiedener Proteine ​​mit DNA und untereinander drastisch unterschiedlich ist und im Fall von in vivo Vernetzung, kann von lokalen Bedingungen in verschiedenen Zellkompartimenten abhängen.

Die aktuelle Chromatinforschung zeichnet sich durch die schnelle Ansammlung genomweiter Daten zur Verteilung verschiedener regulatorischer Proteine ​​entlang der Chromosomen aus. Diese Daten sind über verschiedene Datenbanken leicht zugänglich, und es wurden viele Anstrengungen unternommen, um immer mehr Daten in den Topf zu gießen. Überraschenderweise sind jedoch nicht viele Wissenschaftler besorgt über die Gültigkeit des Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Ansatzes. Das ChIP-Verfahren wurde vor >15 Jahren entwickelt [1] und im Wesentlichen wird das ursprüngliche Protokoll immer noch verwendet, ohne seine inhärenten Probleme zu berücksichtigen, obwohl man seit langem das Gefühl hat, dass „der Teufel im ChIP-Detail steckt“. Der problematischste Schritt ist die Formaldehydfixierung. Es wird allgemein angenommen, dass Formaldehyd jeden DNA-Protein-Komplex fixieren kann. Diese Annahme ist jedoch noch lange nicht allgemein bestätigt. Beispielsweise kann der lac-Repressor nicht durch Formaldehyd an DNA fixiert werden, obwohl seine DNA-bindende Domäne eine Reihe basischer Aminosäurereste enthält [2]. Das gleiche wurde für NF-κB berichtet [3]. Für Fachleute auf diesem Gebiet gibt es sprichwörtlich schwer zu vernetzende Chromatinkomponenten, und es wurden in einigen Einzelfällen spezifische Protokolle ausgearbeitet, um dieses Problem hauptsächlich empirisch zu lösen (siehe z. B. [ 4]). Es wurde festgestellt, dass es eine zeitliche Schwelle für Vernetzungsreaktionen gibt, bei der ein Protein, sobald die Verweilzeit auf <5 s sinkt, für die Formaldehyd-Vernetzung „unsichtbar“ wird [ 5]. Das Verfahren der Formaldehydfixierung bleibt in der Tat empirisch, und über die Spezifität von in vivo Vernetzung, ihre Effizienz und die durch dieses Verfahren induzierten chemischen Addukte. Daher fliegen Wissenschaftler, die Vernetzungsexperimente durchführen, tatsächlich im Blindflug, was zu großen Problemen bei der Dateninterpretation führen kann [ 6, 7].

In den letzten Jahren wurden Methoden (3C, 4C, Hi-C, ChIA-PET usw.) auf der Grundlage des Verfahrens zum Einfangen der Chromosomenkonformation (3C) [ 8] häufig verwendet, um Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen und andere Fragen im Zusammenhang mit dem 3D-Architektur des Genoms [ 9]. Das 3C-Protokoll basiert auf der Annahme, dass in lebenden Zellen assemblierte DNA-Protein-Komplexe durch Formaldehyd fixiert werden können und dann nach DNA-Spaltung durch Restriktionsenzyme die Komplexe mit entfernten regulatorischen Sequenzen, die durch Proteinbrücken verbunden sind, solubilisiert und verschiedenen Behandlungen in Lösung. Jüngste Studien unserer Gruppen haben gezeigt, dass dies nicht der Fall ist. Stattdessen erzeugt die Formaldehydfixierung ein starres Netzwerk aus Chromatinfasern, das die Behandlung mit Natriumdodecylsulfat und Restriktionsenzymen übersteht. Obwohl dieses vernetzte Chromatinnetzwerk durch Beschallung zerstört werden kann, scheinen viele ansonsten nachweisbare Kontakte zwischen DNA-regulatorischen Elementen, wie Promotoren und Enchancern von Beta-Globin-Genen, nach einer solchen Behandlung verloren zu gehen [ 10–12]. Diese Ergebnisse argumentieren, dass in lebenden Zellen die Vernetzung genomischer Elemente über Brücken, die von regulatorischen Proteinen hergestellt werden, im Vergleich zur Vernetzung von Chromatinfasern über Histone ein relativ seltenes Ereignis sein kann. Dies kann sowohl das seltene Nebeneinander von Verstärkern und Promotoren als auch die Ineffizienz der Formaldehyd-Vernetzung widerspiegeln. Tatsächlich gibt es bekannte Beispiele, die zeigen, dass durch 3C-Methoden erfasste Enhancer-Promotor-Wechselwirkungen nicht mit der Kolokalisierung dieser Elemente korrelieren in vivo mikroskopisch untersucht [13]. Andererseits wurde berichtet, dass Formaldehyd bei der Vernetzung von Proteinen, die nicht direkt an DNA gebunden sind, wie Transkriptions-Koaktivatoren und -Corepressoren, ineffizient ist [ 14, 15].

Diese Beobachtungen werfen weitere Fragen auf: „Gibt es Unterschiede zwischen der Effizienz der Vernetzung in Euchromatin und Heterochromatin, und wenn ja, wie korrelieren sie mit genomweiten 3C-Daten?“ Zum Beispiel Sanyal et al. berichteten über eine höhere 5C-Kontakthäufigkeit in offenen Chromatinregionen [16], aber es ist unklar, ob dieses Ergebnis teilweise auf technische Grenzen der 3C-Technologie zurückzuführen ist, die die Vernetzung von offenem Chromatin begünstigt. In einer anderen Studie desselben Labors wurde gezeigt, dass bei mitotischen Chromosomen sowohl die großräumige räumliche Segregation als auch die topologisch assoziierenden Domänen verloren gingen [17] ineffiziente Formaldehyd-Vernetzung des hochkondensierten Chromatins mitotischer Chromosomen. Andererseits scheint die Fähigkeit, 3C-Kontakte zu erkennen, von der Erhaltung der Architektur unlysierter Kerne abhängig zu sein [10]. Da es in der Mitose keinen Kern gibt, kann das Fehlen dieser Architektur/Kernkompartimente der Abwesenheit von 3C-Kontakten in der Mitose zugrunde liegen. Noch besorgniserregendere Ergebnisse lieferte die ChIP-seq-Analyse der Verteilung des Silent Information Regulator (Sir)-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae. Die Autoren dieser Studie entdeckten eine artefaktische Anreicherung mehrerer nicht verwandter Proteine, einschließlich des gesamten Silencing-Komplexes, an stark exprimierten Genen, was die Ergebnisse einiger zuvor veröffentlichter ChIP-Studien in Frage stellt [6]. Das beobachtete Phänomen hängt höchstwahrscheinlich mit der Existenz sogenannter High-occupancy-Zielregionen oder „Hotspots“ zusammen, an denen viele DNA-bindende Proteine ​​trotz Abwesenheit von an . ein Anreicherungssignal zeigen in vitro Bindungsstelle in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz [18].

Die Chemie der Formaldehyd-Vernetzung ist gut bekannt [ 1, 19], aber sie ist die in vivo Aspekte der Technik, die im Dunkeln bleiben. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Formaldehydfixierung eine Reaktion auf DNA-Schäden und eine massive Poly(ADP-Ribosyl)ierung von Kernproteinen auslöst, wodurch die Chromatinzusammensetzung verändert und ein Bias in die ChIP-Analyse eingeführt wird [7]. Die durch die Formaldehydbehandlung gebildeten Quervernetzungen sind durch Erhitzen und pH-Abfall vollständig und leicht reversibel, was weitere Analysen von Proteinen und DNA ermöglicht. Gleichzeitig wirft die Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Vernetzungsreaktion die Frage der Stabilität von DNA-Protein-Komplexen auf, die unter verschiedenen Bedingungen in verschiedenen Anwendungen erhalten werden. Es ist möglich, dass geringfügige Variationen der Bedingungen, unter denen die Vernetzung durchgeführt wird, die Wirksamkeit der Vernetzung und/oder die Stabilität der vernetzten Produkte wesentlich beeinflussen können. Dies kann nicht nur für ganze Zellen gelten, sondern auch für lokale Kompartimente innerhalb von Zellen, die in verschiedene physikalisch-chemische Mikroumgebungen im Nanobereich von Chromosomendomänen eingebettet sein können. Es ist daher nicht klar, inwieweit ChIP-Profile die Verteilung des untersuchten Proteins und inwieweit die lokalen Vernetzungsbedingungen widerspiegeln. Die Forschungsgeschichte zeigt bemerkenswerte Beispiele für gegensätzliche Schlussfolgerungen, die auf der Grundlage der Ergebnisse von Cross-Linking auf leicht unterschiedliche Weise durchgeführt wurden [ 20].

Wir möchten daher die Aufmerksamkeit der Forscher auf die Notwendigkeit lenken, die grundlegenden Schritte häufig verwendeter experimenteller Protokolle zu überdenken. So weit wie in vivo Formaldehyd-Vernetzung betrifft, ist es sicherlich an der Zeit, einige allgemein akzeptierte Annahmen umzukehren. Alle Beweise zeigen, dass die Formaldehyd-Vernetzung nicht mehr wie das Allheilmittel der Molekularbiologie verwendet werden kann. Es ist an der Zeit, diese Blackbox zu durchsuchen: Untersuchen Sie ihre in vivo Molekularbiologie, ihre Konsequenzen für die Datensammlung in ChIP-seq- und „C“-Technologien, ihre Grenzen sowie die Erforschung möglicher Verbesserungen und Alternativen.

Die Formaldehyd-Vernetzung wird häufig verwendet, um die Chromatinstruktur zu untersuchen, bleibt jedoch eine kaum verstandene „Black-Box“-Technologie.


Interkalationsverstärkte „Klick“-Vernetzung von DNA

DNA-DNA-Vernetzer stellen eine wichtige Familie von Chemotherapeutika dar, die unspezifisch mit endogenen Nukleophilen reagieren und daher unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen. Hier berichten wir über ein kationisches Sondheimer-Diin-Derivat „DiMOC“, das eine schwache, reversible Interkalation in Duplex-DNA aufweist (KD=15 μ m ), wo es einer Tandem-Stamm-vermittelten Quervernetzung von azidhaltiger DNA unterliegt, um DNA-DNA-Interstrang-Crosslinks (ICLs) mit einer außergewöhnlich hohen scheinbaren Geschwindigkeitskonstante zu ergeben kApp=2,1 × 10 5 m –1 s –1 . Dies entspricht einer 21.000-fachen Geschwindigkeitssteigerung im Vergleich zur Reaktion zwischen DIMOC und 5-(Azidomethyl)-2'-desoxyuridin (AmdU)-Nukleosid. Als Einzelwirkstoffe zeigten 5'-Bispivaloyloxymethyl (POM)-AmdU und DiMOC eine geringe Zytotoxizität, aber hochtoxische DNA-DNA-ICLs wurden durch metabolischen Einbau von AmdU-Gruppen in zelluläre DNA erzeugt, gefolgt von Behandlung der Zellen mit DiMOC. Diese Ergebnisse liefern die ersten Beispiele interkalationsverstärkter bioorthogonaler chemischer Reaktionen auf DNA und darüber hinaus die ersten strain-promoted double-click (SPDC)-Reaktionen in lebenden Zellen.

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Interkalationsverstärkte „Klick“-Vernetzung von DNA

DNA-DNA-Vernetzer stellen eine wichtige Familie von Chemotherapeutika dar, die unspezifisch mit endogenen Nukleophilen reagieren und daher unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen. Hier berichten wir über ein kationisches Sondheimer-Diin-Derivat „DiMOC“, das eine schwache, reversible Interkalation in Duplex-DNA aufweist (KD=15 μ m ), wo es einer Tandem-Stamm-vermittelten Quervernetzung von azidhaltiger DNA unterliegt, um DNA-DNA-Interstrang-Crosslinks (ICLs) mit einer außergewöhnlich hohen scheinbaren Geschwindigkeitskonstante zu ergeben kApp=2,1 × 10 5 m –1 s –1 . Dies entspricht einer 21.000-fachen Geschwindigkeitssteigerung im Vergleich zur Reaktion zwischen DIMOC und 5-(Azidomethyl)-2'-desoxyuridin (AmdU)-Nukleosid. Als Einzelwirkstoffe zeigten 5'-Bispivaloyloxymethyl (POM)-AmdU und DiMOC eine geringe Zytotoxizität, aber hochtoxische DNA-DNA-ICLs wurden durch metabolischen Einbau von AmdU-Gruppen in zelluläre DNA erzeugt, gefolgt von Behandlung der Zellen mit DiMOC. Diese Ergebnisse liefern die ersten Beispiele interkalationsverstärkter bioorthogonaler chemischer Reaktionen auf DNA und darüber hinaus die ersten strain-promoted double-click (SPDC)-Reaktionen in lebenden Zellen.

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Methoden

Rekombinante Proteine ​​und DNA-Templates

Rekombinante Kernhistone aus Xenopus laevis und Human-Linker-Histon H1.4 wurden exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben 7,29 siehe Ergänzende Verfahren für Details). Hühnchen-Linker-Histon H5 wurde von Abcam (ab81966) bezogen.

Humanes Volllängen-SCML2 (Q9UQR0) und SCML2 delta preSAM wurden in BL21 CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene, La Jolla, USA) mit einem C-terminalen His . überexprimiert6-tag und gereinigt durch Ni 2+ -NTA-Chromatographie (siehe Ergänzende Methoden für Details).

Das dsDNA-Oligonukleotid (21 bp) wurde durch Annealing von zwei komplementären Oligonukleotiden (Ergänzende Abb. 1i 21bp-fwd, 21bp-rev) 29 und 5'-markiert mit T4-Polynukleotidkinase und γ-[ 32 P]-ATP (6000 ) erzeugt Ci/mmol) nach Standardverfahren.

DNA-Fragmente für die Mononukleosomenrekonstitution wurden durch Verdau der folgenden Plasmide erzeugt: pUC18_52 × 187 70 für die 187 bp (AvaI) und die 171 bp (Verdau mit AvaI und NotI) Fragmente und pUC18_16 × 145 (Geschenk von Song Tan 71 ) (digest mit EcoRV) für das 145 bp-Fragment. Rekonstitutionsvorlagen wurden wie beschrieben isoliert 72 . 13 C/ 15 N-markierte 187 bp DNA wurde durch PCR unter Standardbedingungen unter Verwendung von nicht markierter 187 bp DNA als Matrize und 13 C/ 15 N-dNTPs (Sigma Aldrich Silantes GmbH) erzeugt. Primersequenzen sind in der ergänzenden Fig. 1i (187-fwd, 187-rev) aufgeführt. Biotinylierte 187 bp-DNA wurde durch PCR unter Verwendung des gleichen reversen Primers erzeugt, jedoch mit einem 5'-Biotin-Tag am 187-fwd-Primer. Oligonukleosomen wurden auf einer 12 × 200 × 601-DNA-Matrize rekonstituiert, die wie zuvor beschrieben hergestellt wurde 29,30,73.

Chromatin-Rekonstitution

Oligonukleosomale Arrays und Nukleosom-Core-Partikel wurden durch Salzgradientendialyse 74 unter Verwendung rekombinanter Histonproteinoctamere und der 12 × 200 × 601- oder 187 × 601-DNA-Matrizen rekonstituiert. Linkerhistone wurden dem Rekonstitutionsgemisch in stöchiometrischen Mengen zu Beginn der Dialyse zugesetzt 29 . Die Konzentration von rekonstituierten Oligonukleosomen und nukleosomalen Kernpartikeln wurde durch Messung von A . bestimmt260. Alle Massen- und Molkonzentrationen spiegeln somit den DNA-Gehalt wider.

UV-Vernetzung

Die Vernetzung von in vitro rekonstituierten Komplexen erfolgte durch Auftropfen von 50 μl-Tröpfchen eines Protein-DNA-Komplexes auf einen mit Parafilm beschichteten Metallblock auf Eis. Die Bestrahlung bei 254 nm wurde unter Verwendung einer im Haus gebauten Vernetzungsvorrichtung wie beschrieben 8 durchgeführt.

Alle DNA-Linker-Histon-Komplexe wurden in XL-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl) 30 min auf Eis inkubiert, bevor sie bei 254 nm bestrahlt wurden. Zur Vernetzung mit biotinylierten 187 bp DNA-Fragmenten wurden 0,25 nmol biotinylierte DNA und 0,225 nmol Linkerhistone in 40 µl XL-Puffer inkubiert und 0, 2, 3, 5 oder 10 min bei 254 nm bestrahlt. Die Reaktionsmischung wurde zu 40 µl paramagnetischen Streptavidin-beschichteten Beads (MagneSphere, Promega) in 1 ml PD300 (20 mM HEPES-KOH pH 7,8, 0,3 M KCl, 0,2 mM EDTA, 10 % [v/v] Glycerin, 0,2 % [v/v] Triton X-100) und 2 h bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Beads wurden 4 mal 5 min lang mit 1 ml PD800 (PD300, aber 0,8 M KCl) für Linker Histon H5 oder PD1000 (1 M KCl) gewaschen, wenn H1.4 verwendet wurde. Gebundene Proteine ​​wurden durch Inkubation von Magnetkügelchen in SDS-Probenpuffer für 5 min bei 95 °C eluiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch Western-Blotting gegen Histon H1 (Anti-H1, 1:1000, Active Motif 61201 für Details siehe Ergänzende Methoden) analysiert.

Experimente unter Verwendung des dsDNA-Oligonukleotids enthielten 100 pmol H5 oder H1.4 und 1 pmol [ 32 P]-markiertes dsDNA-Oligonukleotid, die für 2 min (H5) oder 2, 5 oder 10 min (H1.4) vernetzt wurden. Die vernetzten Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, mit Coomassie gefärbt und autoradiographiert. Gelscans und Autoradiogramme sind in der ergänzenden Abb. 18 unbearbeitet dargestellt.

Vernetzungsexperimente mit 187 bp DNA und Linkerhistonen für die MS-Analyse enthielten 50 µg DNA (0,43 nmol) und 33,5 µg H5 (1,6 nmol) bzw. 30 µg H1,4 (1,4 nmol) in 250 µl XL-Puffer. Die Proben wurden 5 oder 10 min bei 254 nm bestrahlt. Oligonukleosomen sowie X. laevis Mononukleosomen (jeweils 60 μg) wurden für 10 min bei 254 nm entweder in Rekonstitutionspuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) oder NaCl und MgCl . vernetzt2 wurden auf eine Endkonzentration von 150 mM bzw. 1 mM eingestellt. Das Reaktionsvolumen lag je nach Nukleosomenkonzentration zwischen 150 und 250 µl.

Für die SCML2-Nukleosomenquervernetzung wurden 50 µg Nukleosomen oder 50 µg Nukleosomen+H1.4 mit 23,5 µg SCML2 (entspricht einem molaren SCML2: Nukleosomen-DNA-Verhältnis von 0,75) in salzarmem Rekonstitutionspuffer für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert ein Endvolumen von 400 µl.

Jedes Vernetzungsexperiment mit rekombinanten Histonproben umfasste eine nicht vernetzte Probe als Kontrolle, die nicht bestrahlt, aber ansonsten während der Probenvorbereitung identisch behandelt wurde.

Kerne aus HeLa-S3-Zellen wurden durch hypotone Lyse und mechanischen Aufschluss 76 oder durch NP-40-basierte Zelllyse 77 isoliert. Zur Vernetzung wurden 5 × 10 7 Kerne in 1 ml PBS mit Protease-Inhibitoren (Roche, komplett EDTA-frei) resuspendiert.

HeLa-Kerne und native Mononukleosomen, die aus menschlichen HeLa-Zellen (52039 BPS Bioscience) gereinigt wurden, wurden in einer Glas-Petrischale für 10 Minuten auf Eis bestrahlt (254 nm).

Anreicherung von UV-induzierten Quervernetzungen für die MS-Analyse

Die Anreicherung von UV-induzierten Quervernetzungen wurde gemäß etablierten Protokollen für die RNA-Protein-Vernetzung 8,27,75 mit Modifikationen durchgeführt. UV-bestrahlte und Kontrollproben wurden mit 1 mM MgCl . ergänzt2 und 250 U Pierce TM Universalnuklease (88700, Thermo Fisher Scientific) und 2 h bei 37 °C inkubiert. Proteine ​​und Protein-DNA-Konjugate wurden mit Aceton präzipitiert und Pellets wurden zuerst in 4 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH 7,9 gelöst und dann durch Zugabe von drei Volumina 50 mM Tris-HCl pH 7,9 auf 1 M Harnstoff verdünnt. Die DNA wurde durch Zugabe von 250 U Benzonase weiter hydrolysiert und 1–2 h bei 37 °C inkubiert. Die Proteinhydrolyse wurde durch Zugabe von Trypsin (sequencing grade, Promega) in einem Massenverhältnis von 1:20 durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden weitere 12,5 U Benzonase HC für 1 h bei 37 °C zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Trypsin im Verhältnis 1:20 für 1 h bei 37 °C. Die Proben wurden unter Verwendung von C18-Säulen (ReproSil-Pur 120 Å, 5 µm, C18-AQ, Dr. Maisch, Deutschland) entsalzt, die im Haus wie für RNA-Protein-Crosslinks beschrieben 8 gepackt wurden. Desalted samples were enriched for cross-links by using in-house packed TiO2 columns (Titansphere 5 μm GL Sciences, Japan). Samples were dissolved in buffer A (5% [v/v] glycerol, 80% [v/v] acetonitrile, 5% [v/v] trifluoroacetic acid (TFA)) and applied to TiO2 columns pre-washed with buffer B (80% [v/v] acetonitrile, 5% [v/v] TFA) followed by equilibration with buffer A. After sample application, the columns were washed three times with buffer A, four times with buffer B and once with buffer B2 (60% [v/v] acetonitrile, 0.1% [v/v] TFA). Samples were eluted with buffer C (0.3 M NH4OH, pH 10.5). The elution step was repeated twice. The eluate was dried in a speed vac.

Enrichment of cross-links from native mononucleosomes

Nucleosomes were ethanol-precipitated and the pellet was dissolved in 4 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 7.9. Then, the sample was diluted to 1 M urea by adding three volumes of 50 mM Tris-HCl pH 7.9. 500 U Quick CIP (M0525S, NEB) were added and the sample was incubated for 2 h at 37 °C. 1 mM MgCl2, 1 kU of Pierce ™ universal nuclease, 20 U of DNase I (M0303S, NEB) and 1 kU of nuclease P1 (M0660S, NEB) were added for 2 h at 37 °C. Lys-C (mass-spec grade, Promega) was then added in a 1: 50 enzyme-to-protein ratio and the sample was incubated at 37 °C for 2 h. Trypsin digestion (1: 20 enzyme-to-protein ratio) was performed overnight at 37 °C. Finally, 1 kU of Pierce ™ universal nuclease were added to the sample following incubation at 37 °C for 2 h. The sample was desalted and enriched as described for recombinant histone samples. The resulting eluate was dried in a speed vac and dissolved in 10 mM NH4OH pH10, 5% [v/v] acetonitrile (ACN). One-twentieth of the material was directly subjected to LC-MS/MS measurement as input sample. Residual peptides were loaded onto an Xbridge C18 column (186003128, Waters) using an Agilent 1100 series chromatography system. The column was operated at a flow rate of 60 μl/min with a buffer system consisting of 10 mM NH4OH pH10 (buffer A) and 10 mM NH4OH pH10, 80% [v/v] ACN (buffer B). The column was equilibrated with 5% buffer B and developed over 64 min using the following gradient: 5% buffer B (0–7 min), 8–30% buffer B (8–42 min), 30–50% buffer B (43–50 min), 90–95% buffer B (51–56 min), 5% buffer B (57–64 min). The first 6 min were collected as one flow-through fraction, followed by 48 ×1 min fractions, which were reduced to 12 fractions by concatenated pooling. The fractions were dried in a speed vac.

Chromatin precipitation-based enrichment of UV-induced cross-links from HeLa nuclei for MS analysis

Nuclei were collected and pelleted at 1200×g 5 Minuten bei 4 °C. Chromatin isolation from cross-linked nuclei was performed as described 57 . 2.5–5 × 10 7 nuclei were digested with RNaseA (Thermo Fisher Scientific), followed by SDS and urea wash steps. After the final SDS wash step, the pellet was covered with 0.5 ml storage buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 10% glycerol, 1× protease inhibitors) and sonicated in a cooled water bath for 15 min, in alternating 30 s ‘on’ and 30 s ‘off’ cycles at the highest intensity setting (Bioruptor, Diagenode). Protein concentration was determined by a Bradford assay. The sonicated chromatin was adjusted to 0.05% SDS/1 mM MgCl2 and 250 U of Pierce universal nuclease were added. DNA digest was performed for 1 h at 37 °C and the reaction was stopped by adding five volumes of 100% acetone. After acetone precipitation the pellet was covered with 50 μl urea buffer (4 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2) and sonicated in a cooled water bath for 10 min, in alternating 30 s ‘on’ and 30 s ‘off’ cycles at the highest intensity setting. The urea concentration was adjusted to 1 M with 50 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM MgCl2 and 250 U universal nuclease (Pierce) were added for 2 h at 37 °C. Trypsin digest was performed overnight at 37 °C with a 1:20 ratio of trypsin to protein. Peptides were desalted using a Sep-Pak tC18 1 cc Vac cartridge (Waters), followed by TiO2 affinity chromatography as described for histone proteins.

SEC-based Enrichment of UV-induced cross-links from HeLa nuclei for MS analysis

2.5–5 × 10 7 HeLa nuclei were collected and pelleted at 600×g 5 Minuten bei 4 °C. Genomic DNA was isolated using DNAzol ™ reagent (Invitrogen ™ ) according to manufacturer’s instructions. Isolated DNA was dissolved in 8 mM NaOH and sonicated at 30% for 30 s (SFX150, tip diameter 3/32” (2.4 mm)). DNA was then ethanol-precipitated and dissolved in 1% SDS. The SDS concentration was diluted 1:10 and trypsin was added in a 1:60 enzyme-to-protein ratio. After overnight incubation at 37 °C, DNA was ethanol-precipitated and then dissolved in 4 M urea. Urea concentration was adjusted to 1 M and 40 μg of RNaseA and 4000 U of RNase T1 (Thermo Fisher Scientific) were added following incubation for 2 h at 37 °C. After ethanol-precipitation, the pellet was dissolved in 4 M urea following centrifugation at 17,000×g für 2min. The supernatant was loaded onto a Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) operated at a flow rate of 500 μl/min in 50 mM Tris/HCL pH 7.5, 2 mM EDTA. Fractions of 500 μl were collected and those containing both DNA and peptides were pooled and ethanol-precipitated. The pellet was dissolved in 4 M urea and then diluted 1:4. 1 mM MgCl2, 1000 kU of Pierce ™ universal nuclease and 1 kU of nuclease P1 were added following incubation for 3 h at 37 °C. Another trypsin digest was performed overnight at 37 °C. The sample was desalted using a Sep-Pak tC18 1 cc Vac cartridge, following TiO2 affinity chromatography as described before.

SDS-PAGE and in-gel digest of proteins from native mononucleosomes for proteomics

Ten microgram of native mononucleosomes were loaded onto a 4–12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen) and separated by SDS-PAGE. The entire lane was cut from the gel and into 23 slices that were treated according to 78 (See Supplementary Methods for details). Peptides were dried in a speed vac followed by ESI-MS/MS analysis. A scan of the coomassie stained gel is displayed unprocessed in Supplementary Fig. 18.

LC-MS/MS analysis

Sample pellets from TiO2 enrichment, high-pH reversed-phase chromatography or in-gel digestion were dissolved in 2% [v/v] acetonitrile, 0.05% [v/v] TFA. LC-MS/MS analyses were performed on Q Exactive mass spectrometers Plus, HF, HF-X or Exploris (Thermo Fisher Scientific) coupled to a nanoflow liquid chromatography system (1100 series, Agilent Technologies). Analytes were loaded on either an in-house-packed trapping column (2 cm ReproSil-Pur 120 Å, 5 μm, C18-AQ inner diameter, 150 μm) or a Pepmap 300 C18 column (Thermo Fisher Scientific) at a flow rate of 10–15 μl/min in buffer A (0.1% [v/v] formic acid) and washed for 3 min with buffer A. The sample was separated on an in-house-packed C18 column (30 cm ReproSil-Pur 120 Å, 3 μm, C18-AQ inner diameter, 75 μm) at a flow rate of 300 nl/min. Sample separation was performed using a linear gradient and a buffer system consisting of 0.1% [v/v] formic acid (buffer A) and 80% [v/v] acetonitrile, 0.08% [v/v] formic acid (buffer B). Linker histone-DNA cross-links were analyzed with a 38-min LC run, cross-linked X. laevis mononucleosomes, oligonucleosomal arrays, SCML2-nucleosome samples and native HeLa mononucleosomes were separated over 58 min and HeLa nuclei over 90 min. For histone-DNA and (oligo)nucleosome samples the column was equilibrated with 1% buffer B for 5 min and elution was performed with a linear gradient (2–48% B) over 19 or 44 min, followed by a wash step at 90% B and 95% B for 5 min each. For HeLa nuclei samples the column was equilibrated with 3% buffer B for 5 min and elution was performed with a linear gradient from 8 to 48% B over 75 min, followed by a wash step at 90% B and 95% B for 5 min each. Eluting peptides and heteroconjugates were analyzed online in positive mode using a data-dependent top 10, 15, 20, or 30 acquisition methods. MS1 and MS2 resolution were set to 120,000 and 30,000 FWHM, respectively for cross-link samples and to 60,000 and 15,000 FWHM for proteomics samples from in-gel digest. AGC targets were set to 10 6 and 10 5 . Precursors selected during MS1 scans (scan range m/z 350-1600) were fragmented using higher-energy collision-induced dissociation (HCD) fragmentation. All MS/MS experiments with chromatin, SCML2, native mononucleosomes and HeLa nuclei employed 28% or 30% normalized collision energy (NCE). Linker histone-DNA samples were initially analyzed at 20%, 25%, and 30% NCE to test fragmentation behavior of heteroconjugates. Other MS/MS parameters were set as follows: isolation width, 1.4–1.6 m/z dynamic exclusion, 9 s for cross-link samples, 30 s for proteomics samples max. injection time (MS1/MS2), 50 ms/120 ms or 50 ms/60 ms. The lock mass option (m/z 445.120025) was used for internal calibration.

Data analysis with MaxQuant

Proteomic analysis of MS-data from in-gel-digested native mononucleosomes and from cross-linked and non-cross-linked SCML2 samples was performed using MaxQuant software (version 1.6.0.1, 79 . For database search, a reviewed human database from Uniprot (downloaded 25.01.2019, 20,413 proteins) or a database containing all core histone sequences plus the SCML2 sequence was used for native mononucleosomes and SCML2 samples, respectively. Carbamidomethylation of cysteines was set as fixed and oxidation of methionines, as well as N-terminal acetylation were set as variable modifications. The maximum number of missed cleavages was set to two. The proteins from the output data were filtered for >2 unique peptides. For native mononucleosomes, the resulting list of proteins was used to create a sequence database for RNP xl cross-link search.

Data analysis with RNP xl

Data analysis and spectra validation were performed as described in 8 with the RNP xl tool 20 in the OpenMS software network (https://www.openms.de/, Version 2.5.0). Briefly: Raw files were converted to the.mzML format, centroided and spectra matching to linear peptides and phosphopeptides were filtered out. If a control sample was present, it was aligned with the cross-link sample based on retention time and spectra corresponding to features also present in the control sample were removed. The filtered.mzML files were subjected to RNP xl analysis (for DNA settings see Supplementary Fig. 1c, d, e). For linker-histone experiments, as well as for the initial analysis of chromatin-precipitation based in nucleo dataset (Supplementary Data 7, Chrtnprec_RNPxl_settings#1), we searched for C and T adducts only. The data obtained from reconstituted nucleosomes, native mononucleosomes and SEC-enriched in nucleo sample were searched including A, C, G and T adducts. In a second analysis of the chromatin-precipitation based in nucleo sample (Supplementary Data 7, Chrtnprec_RNPxl_settings#2) we also set up a search including A, C, G, and T. Other RNP xl search parameters were set as follows: max. DNA adduct length, 4 m/z mass tolerance (MS1/MS2), 6 ppm/20 ppm max. missed cleavages (HeLa nuclei/histones, chromatin, SCML2), 2/3. For a detailed documentation of OpenMS based cross-link data analysis, please refer to s.

Quantification of cross-links

Skyline software (https://skyline.ms) was used to measure quantitative differences in identified SCML2-DNA cross-link precursors using the MS1 scans from nucleosome and nucleosome+H1 samples. A library was generated containing all transitions (n = 74) derived from cross-link data with SCML2 to extract precursor ion chromatograms (XIC). Picked precursors were examined manually for the presence of at least two isotope peaks and, when present, in a ± 2 min time window of measured retention times and an m/z match tolerance of ±5 ppm. For each transition the ratio of XIC[nucleosome]:XIC[nucleosome+H1] was calculated and XIC ratios were compared for cross-links to deoxyribose and thymine.

For spectral counting based cross-link quantification, we counted manually validated cross-link spectra from RNP xl searches (CSMs, see Supplementary Note 1 for quality criteria) and divided this number by the total number of manually validated CSMs identified in the respective sample. In case of SCML2 data, the CSM count of individual cross-link sites was divided by the total number of SCML2 peptide spectrum matches (PSMs) that were identified by MaxQuant database search of the same sample.

Modeling of nucleosome structures

In order to generate a tetranucleosome model in which protein-DNA cross-links were satisfied, the cryo-EM structure of the 12 × 177bp chromatin fiber (EMD-2600 46 was adjusted. The fitted cryo-EM models were kindly provided by Prof. Ping Zhu (Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences). The relative position of each nucleosome within an adjacent pair, were adjusted by sliding each nucleosome past one another by approximately 10 Å which brought H2A, H2B, and H4 of each nucleosome unit together with the DNA of the adjacent unit. Cross-links between H2A Lys-95, H2B Lys-105, H2B Lys-113, and H4 Val-60 to any DNA backbone were monitored during translation to identify a position which brought each cross-link distance to within 10 Å distance. The overall model of the cross-link-satisfied tetranucleosome, differs through only relative positioning of the nucleosome stacks.

Gel-shift assays

Five picomole mononucleosomes were incubated with 0.5, 1.0, or 2.0 molar equivalents of recombinant SCML2. In the gel shift assays testing SCML2’s binding to linker DNA, unmodified nucleosomes reconstituted on 145, 171, or 187 bp template DNA were incubated with FL SCML2. In the assays testing the effect of the H1.4 linker histone, unmodied and H1.4-containing nucleosomes were incubated with FL SCML2. In the assays testing the effect of the preSAM region, unmodified and H1.4-containing nucleosomes were incubated with recombinant FL and delta preSAM SCML2. The reactions were performed in 10 mM Tris.HCl pH 7.9, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1 mM DTT for 1 h, at 300 rpm and 16 °C. The protein-nucleosome complexes were resolved on 1% agarose in 18 mM Tris and 18 mM boric acid at 100 V for 1 h at 4 °C and stained after the run with EtBr. All gel-shift assays are displayed unprocessed in Supplementary Fig. 18.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der zu diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.


Evaluation of inhaled low-dose formaldehyde-induced DNA adducts and DNA–protein cross-links by liquid chromatography–tandem mass spectrometry

As a widespread industrial chemical, formaldehyde carcinogenicity has been highly controversial. Meanwhile, formaldehyde is an essential metabolite in all living cells. Previously, we have demonstrated exogenous formaldehyde causes DNA adducts in a nonlinear manner between 0.7 and 15.2 ppm using [ 13 CD2]-formaldehyde for exposure coupled with the use of sensitive mass spectrometry. However, the responses from exposure to low doses of formaldehyde are still unknown. In this study, rats were exposed to 1, 30, and 300 ppb [ 13 CD2]-formaldehyde for 28 days (6 h/day) by nose-only inhalation, followed by measuring DNA mono-adduct (N 2 -HOMe-dG) and DNA–protein crosslinks (dG-Me-Cys) as formaldehyde specific biomarkers. Both exogenous and endogenous DNA mono-adducts and dG-Me-Cys were examined with ultrasensitive nano-liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Our data clearly show that endogenous adducts are present in all tissues analyzed, but exogenous adducts were not detectable in any tissue samples, including the most susceptible nasal epithelium. Moreover, formaldehyde exposure at 1, 30 and 300 ppb did not alter the levels of endogenous formaldehyde-induced DNA adducts or DNA–protein crosslinks. The novel findings from this study provide new data for risk assessment of exposure to low doses of formaldehyde.

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Cross-linking and cross-link reversal for ChIP - (Mar/07/2006 )

Right - a few months ago I started 'ChIPing' using the Upstate kit. I have optomised the sonication (thanks to helpful suggestions from this site regarding time and volume) and I have DNA in my input controls. However, there is an ominous lack of DNA in my 'ChIPed' samples. If any of you can answer these questions I'd be REALLY grateful,

(i) is the cross-linking with formadehyde very time or temperature sensitive? At the moment I follow the protocol, 1% formaldehyde (molecular grade) in total 1ml volume at 37C for 10 minutes. I add the formaldehyde at 2x concentration in 500ul to 500ul of cell suspension so that it mixes efficiently and quickly (one of you suggested that and it works very well, thanks!). As I get no product at the end of the protocol I wonder if the cross-linking is not good enough?

(ii) is the reversal of cross-linking with NaCl very time or temperature sensitive? Again, following protocol, 65C for 4hrs (what a pain!!) with NaCl

(iii) protease inhibitors - I don't trust mine! They are clearly very important as I need intake histones for the immunoprecipitation. I follow the protocol with final conc 1mM PMSF, 1ug/ml aprotinin and 1ug/mlpepstatin A). Please can someone tell me what they use and where the get it from??!!

Thank you - I really want this to work as it will make my PhD!!!

I suspect your problem is with your antibody. Are you sure that your antibody is working well under fix conditions? Many antibodies will work perfectly for normal IP but not for ChIP because of the fixation step. I don't think the reverse cross-link is your problem since the DNA in your "input control" is OK. As for the protease inhibitor, I suggests the Roche Complete Protease inhibitor Cocktail Tablet.

Are you working with suspension culture or adherent culture? If it is adherent culture, according to the protocol formaldehyde should be added to the cells before they are harvested.


Cross-linking Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Protocol

ChIP is a technique for studying the interactions between proteins with DNA as it is in nature. It depends on the specific antibody reactions with antigen, so which can truly reflect the combination of protein factors and genomic DNA in vivo. The target protein was cross-linked together with DNA. Then DNA is broken into small fragments by sonication or enzymatic hydrolysis. So we can pull down the predicted DNA fractions by the specific reactions between antibody and antigen. This process specifically enriched DNA fragments bound by target proteins. Finally, we can purify the DNA from the complex and validate the DNA following PCR or qPCR protocol.

ChIP lysis buffer: 1% TritonX-100, 0.1% NaDOC, 0.1% SDS, 1mM EDTA (pH8.0), 140mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0)
RIPA buffer: 1% NP-40, 0.5%NaDOC, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0)
Low salt wash buffer: 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.0)
High salt wash buffer: 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.0)
LiCl buffer: 0.25M LiCl, 1% NP-40, 1% NaDOC, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
TE buffer: 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
Elution buffer: 1% SDS, 100mM NaHCO3

Cross-linking and lysis - for transcription factor and cofactors

Cells culture in 10cm culture dishes with 20mL culture medium. When the density of cells reaches to 80%-90%, it can be used to a ChIP assay. The number of cells differs from the target protein which you are research on. You can refer to the form as follow:

Protein Number of cells(for a ChIP reaction) Protein target abundance
Histone protein
RNA polymerase II
10 4 hoch
Transcription factor 10 5 -10 6 Mittel
Cofaktor 10 7 or more low

To ensure a better result, we recommend more than 4×10 6 cells for histone protein and RNA polymerase II, while transcription factor or cofactor need more cells.1% formaldehyde is used as crosslinking agent to crosslink proteins and DNA. This process is time dependence. So we need to optimize the process for different cells. Crosslinking deficiency result a false negative result, while excessive crosslinking may cover epitope and result a false positive result. We recommend crosslink the sample foe 10min. The Crosslinking reaction can be reversed by glycine.

Take out the culture dishes and add 550μl 37% formaldehyde into 20ml culture medium. Mix the medium up to 1% final concentration of formaldehyde.

Place the culture dishes at RT for 10min. The process is the cross-link between protein and DNA and the time shouldn't too long, which will result in a false positive result.

Add 125mM glycine solution to terminate the cross-link reaction. Gently mix the solution up.

Place the culture dishes at RT for 5min.

Remove culture medium and wash the cells with ice PBS for 3 times.

Add 1ml ice PBS, Which contains protein inhibitors, into the dishes and scrap the cells from the dishes quickly.

Wash the bottom of dishes by PBS for twice with proper volume. Aspirate the PBS into the tube in step 6.

Centrifuge for 3min, 4℃ at 2500rmp to collect the pellets.

Add proper volume ChIP lysis buffer (1ml for 2×10 7 cells) to suspend the cells and lysate the cells on ice for 15min.

Sonicate the cells to broken the DNA and the ideal fractions of DNA is 200-1000bp. The condition of sonicate is differ from type of cells and the instrument you used. For each kind of cells, you have to explore the corresponding sonication conditions.

Centrifuge for 10min, 4℃ at 12000rmp

The sonicate process is also time dependence. The ideal fragment of DNA is 200-1000bp, and it need to optimize for different cell lines.

Sonicate the cells to broken the DNA and the ideal fractions of DNA is 200-1000bp. The condition of sonicate is differ from type of cells and the instrument you used. For each kind of cells, you have to explore the corresponding sonication conditions.

Centrifuge for 10min, 4℃ at 12000rmp. And separate the supernatant into a new tube.

Get 50μl supernatant for an agarose gel analysis to validate the effect of sonication.

Determination of DNA fragment

Add 70μl elution buffer to the 50ul chromatin.

Add 4.8μl 5M NaCl and 2μl 10mg/ml RNase A to incubate at 65℃ overnight. The purpose is to remove the interference of RNA.

Add 2μl 20mg/ml proteinase K to incubate at 60℃ for 1h. The aim is to break the reactions between protein and DNA and may be helpful to DNA purification.

Use a DNA purification kit to enrich the DNA or preform phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation method.

2% agarose gel is used to detect the sonication efficiency.

Take 500μl chromatin (dilute by RIPA buffer) which contains DNA from 1×10 7 cells into a tube and take 50μl chromatin as a input group.

Before the immunoprecipitation, you have to design four groups of experiments:


Contact-site cross-linking agents comprise a heterogeneous grouping of cross-linkers which share the common property of being able to cross-link only very closely juxtaposed residues in macromolecular complexes. We have defined contact-site cross-linking arbitrarily as the covalent joining of residues such that they are constrained to a distance which is equivalent to or less than their closest possible steric approach prior to becoming linked (1). We recognize two classes of contact-site cross-linkers, bridge type and zero-length type. The former, such as formaldehyde, become incorporated during cross-linking as one-atom bridges. The latter, such as the carbodiimides, operate as condensing agents with the result that the cross-linked residues become interjoined directly.

Contact-site cross-linkers have been used in several ways as specific probes of both the static and dynamic aspects of macromolecular structure. They can yield precise structural information about macromolecular contacts when actual sites of cross-linking are determined by peptide or nucleotide mapping techniques. In this way exact contacs between histones in the nucleosome, between protein and RNA in the ribosome, and between RNA polymerase and DNA have been determined. Contact-site cross-linkers have also been used to probe the perturbation of contacts following macromolecular conformational changes. Certain histonehistone ‘cross-linkable’ sites are rendered unreactive after induction of chromatin conformational changes thus serving to localize sites of perturbation.



Bemerkungen:

  1. Actassi

    Du hast nicht recht. Schreiben Sie in PM, wir werden diskutieren.

  2. Kinny

    Ich meine, du liegst falsch. Ich kann es beweisen. Schreiben Sie mir in PM, wir werden reden.

  3. Dean

    Sie machen einen Fehler. Ich kann meine Position verteidigen. Maile mir eine PM, wir reden.



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