Information

Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs)

Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) sind Teil der variablen Domänen in Immunglobulinen (Antikörpern) und T-Zell-Rezeptoren, die von B-Zellen bzw. T-Zellen erzeugt werden, wo diese Moleküle an ihr spezifisches Antigen binden. (Quelle: WIKI, mit kleiner Änderung)

Bedeutet das nun, dass dieser CDR das Paratop ist? Da es die gleiche Funktionalität wie Paratop hat, um an Epitope des Antigens zu binden. Ist CDR also eine Art Paratop?

(Ich habe seit 8 Jahren nicht mehr Biologie studiert und bin jetzt dabei, weil ich es für meine Forschung brauche. Wenn es also jemand in einfacher Sprache beschreiben kann, wäre es sehr hilfreich)


Das Paratop ist der Teil eines Antikörpers, der das Epitop des Antigens bindet. Die CDRs (Schwerketten-CDRs unten gezeigt) sind Teil der Struktur der variablen Domäne und enthalten die hypervariablen Regionen, die an das Epitop binden.

Von Wikimedia

Das eigentliche Paratop befindet sich innerhalb der hypervariablen Regionen, die sich innerhalb der CDRs befinden – das Paratop besteht nicht unbedingt aus der gesamten CDR-Region und kann tatsächlich nur aus Aminosäuren bestehen, die in einer oder zwei der drei CDRs auf jedem Antikörper enthalten sind Kette (schwer und leicht).

Wenn Sie auf der Suche nach einem guten Einführungstext in die Immunologie sind, kann ich Janeways wärmstens empfehlen Immunbiologie. Eine frühere Version ist auch im NCBI Bookshelf verfügbar.


Ein auf Keimbahnwissen basierender Computeransatz zur Bestimmung von Antikörper-Komplementaritäts-bestimmenden Regionen

Die Bestimmung von Gerüstregionen (FRs) und komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) in einem Antikörper ist für das Verständnis der zugrunde liegenden Biologie sowie für die Antikörperentwicklung und -optimierung unerlässlich. Es stehen jedoch keine Rechenalgorithmen zur Verfügung, um eine Antikörpersequenz oder eine Sequenzbibliothek kohärent und automatisch in FRs und CDRs einzugrenzen. Basierend auf den Kartierungsbeziehungen zwischen reifen Antikörpersequenzen und ihren entsprechenden Keimbahn-Gensegmenten wurde ein neuer Rechenalgorithmus zur automatischen Bestimmung von CDRs entwickelt. Obwohl ein Mensch mehr als 10 12 verschiedene Antikörpermoleküle in seinem präimmunen Repertoire herstellen kann, um eindringende Krankheitserreger abzuwehren, werden diese Antikörper aus Neuanordnungen einer sehr begrenzten Anzahl von keimbahnvariablen (V) Genen, Diversity (D) Genen und Verbindung ( J) Gensegmente gefolgt von somatischer Hypermutation. Die Gerüstregionen FR1, FR2 und FR3 in reifen Antikörpern werden von Keimbahn-V-Gensegmenten kodiert, während FR4 von J-Gensegmenten kodiert wird. Da es nur eine begrenzte Anzahl von Keimbahn-Gensegmenten gibt, können diese Gene vorab abgegrenzt werden, um eine Wissensdatenbank von FRs und CDRs zu generieren. Dann scannt der Algorithmus für eine gegebene Antikörpersequenz jedes vorab abgegrenzte Gen in der Wissensdatenbank, findet die am besten passenden V- und J-Segmente und identifiziert dementsprechend die FRs und CDRs.

Der beschriebene Algorithmus wird mit fast 25.000 menschlichen Antikörpersequenzen von NCBI streng getestet und erweist sich als sehr robust. Über 99,7% der Antikörpersequenzen können rechnerisch abgegrenzt werden. Von diesen abgegrenzten Sequenzen weisen nur 0,28 % somatische Insertionen und Deletionen in FRs auf, und ihre entsprechenden abgegrenzten Ergebnisse müssen manuell überprüft werden. Ein weiteres Merkmal des Algorithmus ist, dass er unabhängig von der CDR-Definition ist und leicht auf andere CDR-Definitionen neben den am weitesten verbreiteten Kabat-, Chothia- und IMGT-Definitionen erweitert werden kann. Neben der Abgrenzung von Antikörpersequenzen in FRs und CDRs eignet sich der beschriebene Algorithmus gut für die Sequenzannotation und die Sequenzqualitätskontrolle, indem ungewöhnliche Sequenzmuster und -merkmale erkannt werden. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass der Algorithmus leicht in andere Anwendungen eingebettet werden kann, beispielsweise um eine Genfamilien-spezifische PSSM (positionsspezifische Bewertungsmatrix) für das Antikörper-Engineering zu erstellen und eine Antikörpersequenz automatisch zu nummerieren.


Ein auf Keimbahnwissen basierender Computeransatz zur Bestimmung von Antikörper-Komplementaritäts-bestimmenden Regionen

Die Bestimmung von Gerüstregionen (FRs) und komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) in einem Antikörper ist für das Verständnis der zugrunde liegenden Biologie sowie für die Antikörperentwicklung und -optimierung unerlässlich. Es stehen jedoch keine Rechenalgorithmen zur Verfügung, um eine Antikörpersequenz oder eine Sequenzbibliothek kohärent und automatisch in FRs und CDRs einzugrenzen. Basierend auf den Kartierungsbeziehungen zwischen reifen Antikörpersequenzen und ihren entsprechenden Keimbahn-Gensegmenten wurde ein neuer Rechenalgorithmus zur automatischen Bestimmung von CDRs entwickelt. Obwohl ein Mensch mehr als 10 12 verschiedene Antikörpermoleküle in seinem präimmunen Repertoire herstellen kann, um eindringende Krankheitserreger abzuwehren, werden diese Antikörper aus Neuanordnungen einer sehr begrenzten Anzahl von keimbahnvariablen (V) Genen, Diversity (D) Genen und Verbindung ( J) Gensegmente gefolgt von somatischer Hypermutation. Die Gerüstregionen FR1, FR2 und FR3 in reifen Antikörpern werden von Keimbahn-V-Gensegmenten kodiert, während FR4 von J-Gensegmenten kodiert wird. Da es nur eine begrenzte Anzahl von Keimbahn-Gensegmenten gibt, können diese Gene vorab abgegrenzt werden, um eine Wissensdatenbank von FRs und CDRs zu generieren. Dann scannt der Algorithmus für eine gegebene Antikörpersequenz jedes vorab abgegrenzte Gen in der Wissensdatenbank, findet die am besten passenden V- und J-Segmente und identifiziert dementsprechend die FRs und CDRs.

Der beschriebene Algorithmus wird mit fast 25.000 menschlichen Antikörpersequenzen von NCBI streng getestet und erweist sich als sehr robust. Über 99,7% der Antikörpersequenzen können rechnerisch abgegrenzt werden. Von diesen abgegrenzten Sequenzen weisen nur 0,28 % somatische Insertionen und Deletionen in FRs auf, und ihre entsprechenden abgegrenzten Ergebnisse müssen manuell überprüft werden. Ein weiteres Merkmal des Algorithmus ist, dass er unabhängig von der CDR-Definition ist und leicht auf andere CDR-Definitionen neben den am weitesten verbreiteten Kabat-, Chothia- und IMGT-Definitionen erweitert werden kann. Neben der Abgrenzung von Antikörpersequenzen in FRs und CDRs eignet sich der beschriebene Algorithmus gut für die Sequenzannotation und die Sequenzqualitätskontrolle, indem ungewöhnliche Sequenzmuster und -merkmale erkannt werden. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass der Algorithmus leicht in andere Anwendungen eingebettet werden kann, beispielsweise um eine Genfamilien-spezifische PSSM (positionsspezifische Bewertungsmatrix) für das Antikörper-Engineering zu erstellen und eine Antikörpersequenz automatisch zu nummerieren.


Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) sind die Bindungsstellen für die spezifischen Antigene in Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren. Diese werden von B-Zellen bzw. T-Zellen erzeugt. Ein Satz von CDRs bildet ein Paratop. CDRs sind tatsächlich Teile der variablen Ketten in Immunglobulinproteinen.

Lernen Sie weiterhin Mikrobiologie-Erklärungen

Was ist Atomkraft?

Die Rasterkraftmikroskopie (AFM), auch als Rasterkraftmikroskopie (SFM) bekannt, ist eine Art der Rastersondenmikroskopie (SPM), die .

Was ist eine Belebtschlammbehandlung?

Die Belebtschlammbehandlung ist ein Verfahren zur Behandlung von Abwässern aus der Industrie und von Abwässern unter Verwendung von Belüftung und einer biologischen Flocke.

Was sind Actinorhizae?

Actinorhizae sind die Assoziationen und eine symbiotische Beziehung zwischen den feinen Pflanzenwurzeln und Actinomyceten. Diese symbiotische Beziehung führt zu .

Was ist Auxotroph?

Ein Auxotroph benötigt im Vergleich zu dem elterlichen Organismus, von dem es stammt, zusätzliches Nahrungswachstum, so wie es ist.

Was ist eine kompetente Zelle?

Kompetente Zellen sind solche Zellen, die fremde DNA in ihr Genom einbauen können. E. coli-Zellen werden meistens verwendet, um .

Was ist der &beta-Oxidationspfad?

Akute Infektionen sind solche Infektionen, die sofort ohne Symptome auftreten und nur über einen kürzeren Zeitraum behandelt werden können.


Mikroorganismen werden als azelluläre biologische Einheiten definiert, die zu klein sind, um mit bloßem Auge klar gesehen zu werden.

Prescotts Mikrobiologie 9. Auflage von Joanne Willey, Linda Sherwood, Christopher J. Woolverton

Lernen Sie weiterhin Mikrobiologie-Erklärungen

Was ist Adenosindiphosphat (ADP)?

Adenosindiphosphat (ADP) besteht aus einer zwei Phosphatgruppen und Adenosin. Wenn eine weitere Phosphatgruppe hinzugefügt wird, so ADP.

Was ist Zellwand?

Eine Zellwand ist eine organisatorische Schicht, die einige Zelltypen außerhalb der Zellmembran umgibt. Es kann .

Was ist Codon?

Codon ist eine Sequenz aus drei RNA- oder DNA-Nukleotiden, die einer bestimmten Aminosäure oder einem Stoppsignal während entspricht.

Was ist Capsomer?

Kapsomere sind die Untereinheiten von Kapsiden. Kapside sind die äußere Hülle aus Proteinen, die dem Virus Schutz bietet.

Was ist Kompetenz (einer Bakterienzelle)?

Kompetenz in der Mikrobiologie ist die Fähigkeit der Zelle, ihre Genetik zu verändern, indem sie extrazelluläre oder nackte DNA aus dem .

Was ist Katabolit-Aktivator-Protein (CAP)?

Katabolit-Aktivatorproteine ​​sind trans-wirkende Transkriptionsaktivatoren, die in Form von Homodimeren in Lösungen vorliegen. CAPs jede Untereinheit.


Fakultätsprofil

Assistenzprofessorin, Computerbiologie
Fachbereich Biologie und Biochemie

Büro: Wissenschafts- und Ingenieurforschungszentrum (SERC), 3007
Kontakt: [email protected]

Ausbildung: D.S., Bundesuniversität Rio Grande do Sul (UFRGS, Brasilien) M.S., UFRGS B.S, UFRGS

Abb. 1. Strukturelle Darstellung eines TCR/Peptid-HLA-Komplexes. Der T-Zell-Rezeptor (TCR) ist in Blautönen dargestellt (Karikatur Darstellung), wobei jeder eine der beiden variablen Domänen darstellt. Die variabelste Region innerhalb dieser Domänen entspricht den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs). Dies sind 6 flexible Schleifen (rot), die sowohl das Peptid als auch das HLA direkt kontaktieren. Die Peptidstruktur ist grün dargestellt (Oberfläche Darstellung). Die HLA ist grau dargestellt (Karikatur Darstellung).

Die Forschungsgruppe Dr. Dinler Amaral Antunes’ verwendet strukturbioinformatische Methoden wie Molecular Modeling, Molecular Docking und Molecular Dynamics, um Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit relevanten biomedizinischen Anwendungen zu untersuchen. Da sie ständig die Grenzen des Machbaren mit verfügbaren Werkzeugen verschieben, passt seine Gruppe auch aktiv neue Computermethoden an und entwickelt sie, um spezifische biologische Probleme anzugehen.

Abb. 2. Schematische Darstellung der Rolle von MHCs bei der T-Zell-Aktivierung. Klasse-I-Major-Histokompatibilitätskomplexe (MHC-I) sind in fast jeder Zelle vorhanden und an der Oberflächenpräsentation von Peptiden beteiligt, die von intrazellulären Proteinen abgeleitet sind. Diese Präsentation treibt die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen an und löst eine zelluläre Reaktion aus. Auf der anderen Seite sind Klasse-II-MHCs nur in “professionellen” Antigen-präsentierenden Zellen (Phagozyten) vorhanden, da sie an der Oberflächenpräsentation von Peptiden beteiligt sind, die von extrazellulären Proteinen abgeleitet sind. Diese Präsentation treibt die Aktivierung von T-Helferzellen an und löst eine humorale Reaktion aus. Das Verständnis der strukturellen Unterschiede zwischen diesen beiden Arten von MHC-Rezeptoren und ihrer Bindung an ihre Liganden ist der Schlüssel zur Entwicklung besserer Modellierungs- und Bindungsvorhersagemethoden. CD, Differenzierungscluster. TCR, T-Zell-Rezeptor. Modifiziert von Antunes et. al, 2019.

Neben Verbundprojekten mit breiteren biomedizinischen Anwendungen (z. B. Wirkstoffforschung) konzentriert sich sein Labor insbesondere auf die Untersuchung der Mechanismen der zellulären Immunität. Diese Art der adaptiven Immunität wird durch T-Zell-Lymphozyten vermittelt und ist der Schlüssel für immunologische Reaktionen, die sowohl auf Viren als auch auf Krebszellen abzielen. T-Zellen können Proteinstücke (d. h. Peptide) erkennen, die an der Oberfläche anderer Zellen durch eine Familie von Rezeptoren, die als humane Leukozytenantigene (HLAs) bekannt sind, präsentiert werden. Die Erkennung von Peptid-HLA-Komplexen wird durch die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) des T-Zell-Rezeptors (TCR) vermittelt, die einen zentralen Schritt für die Aktivierung von T-Zellen und die Entwicklung zellulärer Immunität darstellen.

Das Verständnis der molekularen Merkmale, die die Affinität und Spezifität der TCR/pHLA-Interaktion antreiben, kann neue Möglichkeiten für biomedizinische Anwendungen in verschiedenen Bereichen eröffnen, einschließlich der Entwicklung antiviraler Impfstoffe, der Krebsimmuntherapie und der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. In den letzten zehn Jahren hat Dr. Antunes mehrere Werkzeuge entwickelt, um die computergestützte Modellierung und Strukturanalyse von Peptid-HLA-Komplexen zu ermöglichen. Nun möchte er diese Computermethoden mit Daten aus Hochdurchsatz-Molekularbiologie- und Proteomik-Ansätzen kombinieren, um die Sicherheit und Wirksamkeit zukünftiger T-Zell-basierter Immuntherapien zu verbessern.


Rückgratflexibilität von CDR3 und Immunerkennung von Antigenen

Die konformative Entropie ist eine wichtige Komponente der Protein-Protein-Interaktionen, jedoch gibt es keine zuverlässige Methode zur Berechnung dieses Parameters. Wir haben ein statistisches Maß für die restliche Rückgratentropie in gefalteten Proteinen entwickelt, indem wir die ϕ-ψ-Verteilungen der 20 Aminosäuren in gemeinsamen Sekundärstrukturen verwendet haben. Die Entropiemuster des Rückgrats von Aminosäuren innerhalb von Helix, Blatt oder Spirale bilden Cluster, die die Verzweigungs- und Wasserstoffbindungseigenschaften der Seitenketten des Sekundärstrukturtyps rekapitulieren. Dieselben Arten von Resten in Coil und Sheet haben identische Rückgratentropien, während Helixreste viel kleinere Konformationsentropien aufweisen. Aus den Kristallstrukturen von 34 niederaffinen T-Zell-Rezeptoren und 40 hochaffinen Fabs als Ergebnis der Bildung von Proteinkomplexen schätzten wir die Rückgrat-Entropieänderung für Immunglobulin-komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) ab. Überraschenderweise entdeckten wir, dass der berechnete Rückgratentropieverlust nur der CDR3, aber nicht aller CDRs, signifikant mit den kinetischen und Affinitätskonstanten der 74 ausgewählten Komplexe korrelierte. Folglich schlagen wir einen einfachen Algorithmus vor, um Prolin-Mutationen einzuführen, die die Konformationsflexibilität von CDRs einschränken und die Kinetik und Affinität von Immunglobulin-Wechselwirkungen verbessern. Die Kombination der Prolin-Mutationen mit rational designten Mutanten aus einer früheren Studie führte zu einem 2400-fachen Anstieg der Affinität des A6-T-Zell-Rezeptors für Tax-HLAA2. Dieses Mutationsschema konnte jedoch keine signifikanten Bindungsänderungen in der bereits hochaffinen C225-Fab/huEGFR-Schnittstelle induzieren. Unsere Ergebnisse werden als Roadmap dienen, um effektivere Zielfunktionen zu formulieren, um Immunkomplexe mit verbesserten biologischen Funktionen zu entwickeln.

Schlüsselwörter: T-Zell-Rezeptor-Affinitätsreifung Antikörper-Rückgrat-Entropie-Konformationsflexibilität.


VIPase

Strukturchemie

Die rekombinante leichte Kette ist ein 27 kDa Protein, das drei Gerüstregionen und drei komplementaritätsbestimmende Regionen enthält. Unter den bekannten Keimbahn V L Genen ist die Sequenz der Anti-VIP-Leichtkette der Keimbahn V . am ähnlichstenL Gen 2 (70/3) (EMBL/GenBank: Z72384). Die Anti-VIP-Leichtkette enthält das J1-Gen. In Bezug auf die Keimbahn V . sind vier Sequenzsubstitutionen offensichtlichL/J-Gene (Keimbahnreste in Klammern gezeigt): His27d(Asp), Thr27e(Ser), Ile34(Asn) und Gln96(His). Neben dem natürlich codierten VL Domäne enthält die rekombinante leichte Kette einen zehn Rest c-mein C Tag und ein Poly(His)-Tag mit sechs Resten an seinem C-Terminus.

Die leichte Kette liegt überwiegend in Monomerform in neutraler wässriger Lösung vor. Bei Konzentrationen über 1 µM können geringe Mengen an Dimeren der leichten Kette nachgewiesen werden.

Die identifizierte katalytische Triade der leichten Kette von VIPase hat eine strukturelle Matrize für die Entwicklung maßgeschneiderter proteolytischer Antikörper bereitgestellt. Der Einbau der Ser27a-His93-Asp1-Triade in eine nichtkatalytische Leichtkette durch ortsgerichtete Mutationen verlieh der Leichtkette proteolytische Aktivität [26]. In Übereinstimmung mit dem erwarteten nukleophilen Mechanismus wurde die Peptidaseaktivität der mutierten leichten Kette durch den Serinprotease-Inhibitor Diisopropylfluorphosphat gehemmt.

Das Vh Die Domäne von Antikörpern trägt häufig wesentlich zur nichtkovalenten Antigenbindung bei. Kopplung der VIPase VL Gebiet mit seinem natürlichen Vh Domänenpartner verlieh dem resultierenden Einzelketten-Fv-Fragment eine verbesserte Bindungsaffinität für VIP (verringerte Km) und kinetische Effizienz (kKatze/Km) [27]. Durch Molecular Modeling ist eine beträchtliche räumliche Trennung der Vh Domänenreste des Ser 27a-Nukleophils waren offensichtlich (>10 Å), was darauf hindeutet, dass die Vh Domäneneffekte sind der Fernerkennung des erweiterten Übergangszustands der VIP-Hydrolyse zuzuschreiben. In Übereinstimmung mit dem nukleophilen Katalysemechanismus zeigte die leichte Kette eine irreversible Bindung von biotinylierten Phosphonatdiestern, die durch denaturierende Elektrophorese nachweisbar war [28] . VIP hemmte die Markierung der leichten Kette durch Phosphonatdiester, was bestätigt, dass die Bindung auf das aktive Zentrum gerichtet ist.

Der Ansatz der Domänenpaarung kann erweitert werden, um neue katalytische Spezifitäten zu entwickeln. Mutationen wurden in die dritte komplementaritätsbestimmende Region des Bestandteils V . eingeführth Domäne im VIPase-Einzelketten-Fv-Fragment, das im vorhergehenden Absatz zitiert wurde, um die katalytische Spezifität auf das Amyloid-β-Peptid zu lenken [29] . Es wurde beschrieben, dass die Paarung einer VIP-hydrolysierenden leichten Kette mit der schweren Kettenuntereinheit eines für ein Hepatitis-C-Virus-Antigen spezifischen Antikörpers einen katalytischen Antikörper liefert, der das virale Antigen hydrolysieren kann [30].


Einführung

Antikörper sind tetramere Proteine, die aus zwei schweren und zwei leichten Ketten bestehen, die durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten zusammengehalten werden. Die leichte Kette besteht aus einer variablen (VL) und einem konstanten Bereich (CL), während die schwere Kette von IgG1 Antikörper-Subtyp besteht aus einer variablen Domäne (Vh) und drei konstante Domänen (Ch1, Ch2, Ch3). Jede Domäne wird durch eine Disulfidbindung stabilisiert. Die variablen Domänen haben jeweils drei hypervariable Schleifen, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) bekannt sind, die die Hauptregionen sind, die an der Antigenbindung beteiligt sind. Die CDRs werden von der Framework-Region unterstützt, die die Struktur der variablen Domäne bestimmt.

Variable Fragmente (Fv) sind die kleinsten Fragmente eines Antikörpers, die mit ähnlicher Affinität und Spezifität wie Antikörper voller Länge an das Antigen binden können. Im Periplasma von wurden nicht-kovalent assoziierte funktionelle Fv-Fragmente produziert E. coli bereits 1988 [1]. Da sich die nicht-kovalente Reassoziation von Fv-Fragmenten jedoch als instabil erwies, umgingen Bird et al. dieses Hindernis, indem sie die Vh Domäne zum VL Domäne durch ein kurzes flexibles Peptid, wodurch ein Einzelketten-Fv oder scFv erzeugt wird, so dass beide Domänen von einem Gen exprimiert werden können und eine äquimolare Expression beider Fv bereitstellen [2]. Jedes Fv enthält eine Intradomänen-Disulfidbindung, daher erfordert die scFv-Expression normalerweise eine oxidierende Umgebung, wie sie im eukaryotischen endoplasmatischen Retikulum oder bakteriellem Periplasma gefunden wird. Die Disulfidbindung jeder Fv-Domäne ist hochkonserviert und entscheidend für die Domänenstabilität und Löslichkeit [3,4]. Die Gesamtstabilität eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments hängt nicht nur von der intrinsischen Stabilität jeder Domäne ab, sondern auch von der Stabilität der Domänenschnittstellen [5,6]. Nur intrinsisch sehr stabile scFv können sich in Abwesenheit beider Disulfidbrücken falten [7] und in reduzierenden Umgebungen, wie sie im Zytoplasma einer Zelle vorkommen, bilden die meisten scFv nicht-funktionelle unlösliche Aggregate.

Obwohl Antikörper sezernierte Proteine ​​sind, besteht ein zunehmendes Interesse an Intrabodies, d. h. Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die intrazellulär exprimiert und zurückgehalten werden können. Das Zielen eines Intrakörpers auf die Zelle ermöglicht das Studium der Proteinfunktion in vivo oder die Modulation molekularer Ereignisse innerhalb der Zelle, z.B. Stabilisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Neutralisierung intrazellulärer Antigene oder sogar Katalyse von Reaktionen [8–10]. Der potenzielle Intrakörper muss hyperstabil sein, um sich in der reduzierenden Umgebung des Zytoplasmas zu falten.

Bisher wurde nur von wenigen scFv berichtet, dass sie in Abwesenheit beider Disulfidbrücken löslich und funktionsfähig sind. Die bahnbrechenden Arbeiten auf dem Gebiet der Intrabody-Produktion liegen etwa 20 Jahre zurück. i) Ohage und Steipe zeigten, dass es durch rationales Engineering möglich ist, hyperstabile V . zu konstruierenL Domänen, die sich im Zytoplasma falten konnten [11] ii) Proba et al mittels molekularer Evolution (DNA-Shuffling und Phagen-Display) stabiles und funktionelles scFv ohne Disulfidbindungen in beiden Vh und VL [12] basierend auf dem scFv-Fragment des Levan-bindenden Antikörpers ABPC48, dem natürlicherweise einer der konservierten Cysteinreste in V . fehlth [13] iii) Martineau et al Durch zufällige genetische Mutation, Screening und Selektion wurden hohe Ausbeuten an disulfid-freiem scFv gegen β-Galactosidase im Zytoplasma von E. coli [14] iv) Tavladoraki et al zeigten, dass scFv, abgeleitet vom antiviralen Antikörper F8, im Zytoplasma einer transgenen Pflanze funktionell exprimiert wurde und E. coli, und hatte freie Sulfhydrylgruppen [8].

Die an Disulfidbindungen beteiligten Cysteine ​​befinden sich im scFv-Gerüst, was darauf hindeuten könnte, dass diese Regionen für die Disulfid-Abhängigkeit der scFv-Faltung und -Stabilität verantwortlich sind. Es wurde berichtet, dass intrinsisch stabiles scFv als Gerüst zum Aufpfropfen von Antigenbindungsschleifen von anderen Antikörpern verwendet werden könnte, um löslicheres und stabileres scFv zu erzeugen [15,16]. Die Transplantation von Antigen-bindenden Regionen wurde zuerst für die Antikörper-Humanisierung angewendet, um das Risiko einer durch einen Nagetier-Antikörper ausgelösten Immunantwort zu verringern [17]. Fuhrmann et al humanisierten anti-HER2-Maus-Antikörper (mumAb4D5) und generierten einen Antikörper mit sehr günstigen Faltungseigenschaften [18]: Jung und Plückthun verwendeten das Gerüst von anti-HER2-scFv (unter dem Namen „4D5“) zur Transplantation von CDRs der aggregationsanfälligen Fluorescein-Bindung Antikörper 4-4-20 und das resultierende scFv zeigten eine verbesserte Löslichkeit und thermische Stabilität [15]. Anti-HER2-scFv-Framework diente auch als Gerüst für die Transplantation von CDRs aus EGP-2-bindendem MOC31-scFv und das erzeugte scFv zeigte eine erhöhte Stabilität und eine bessere Expression [16]. Darüber hinaus erzeugten Wörn und Plückthun ein biologisch funktionelles Cystein-freies Derivat von Anti-HER2-scFv durch Mutation von Cysteinresten zu Valin oder Alanin, jedoch bildete diese scFv-Variante Einschlusskörperchen im Periplasma von E. coli und in vitro eine Rückfaltung war notwendig, um aktives Protein zu erhalten (7).

Während sich die Transplantation hypervariabler Loops als ausreichend erwiesen hat, um die Antigenbindungsaffinität zu erhalten [19,20], war es in vielen Fällen notwendig, auch mehrere Gerüstreste vom väterlichen scFv zu übertragen, um die Bindungseigenschaften zu erhalten: Diese Gerüstreste wurden haben einen entscheidenden Einfluss auf die Konformation bestimmter CDRs oder sind sogar direkt an der Antigenbindung beteiligt [21–24].

Es ist seit fast 20 Jahren bekannt, dass sich einige scFv-Antikörperfragmente in Abwesenheit von Disulfidbrücken falten können [8,12,13]. Die Disulfidabhängigkeit/Unabhängigkeit der Faltung muss mit der Stabilität der nativen Faltung ohne Disulfidbindung verknüpft sein [z.B. 11], aber es ist unklar, inwieweit dies von der Gerüstregion des scFv oder der CDRs abhängt. Da sich die CDRs im Kern des Gerüsts befinden und weder in den VL oder Vh Domäne [25] ist die einfachste Hypothese, dass das Gerüst für die Disulfid-Abhängigkeit/Unabhängigkeit der Faltung wichtiger ist als die CDRs, und wenn dies zutrifft, dann sollte es möglich sein, CDRs von Disulfid-abhängigen scFv in Disulfid-unabhängige Gerüste auszutauschen und erhalten gefaltetes Protein ohne Disulfidbildung, aber nicht und umgekehrt. Um diese Hypothese zu testen, ist ein schnelles Screening erforderlich, das keine Verzerrung aufgrund der Verwendung verschiedener Kompartimente oder aufgrund der alleinigen Verwendung von Cysteinmutanten im scFv einführt. Es wurde berichtet, dass die Faltung für disulfidunabhängige scFv durch die Isomerisierung von Prolylen eingeschränkt wird [4,26] und daher ist die Anwesenheit ausreichender Katalysatormengen für diesen langsamen Faltungsschritt unerlässlich. Zuvor [27] berichteten wir über die lösliche Expression einer Vielzahl von scFv und Fabs im Zytoplasma von E. coli, in Gegenwart von Faltungskatalysatoren, einer Sulfhydryloxidase Erv1p und einer Disulfidbindungsisomerase, PDI, die ein System namens CyDisCo (zytoplasmatische Bildung von Disulfidbindungen in E. coli). Wir testeten die Expression von Fragmenten verschiedener Antikörper-Isotypen (IgG, IgM, IgA, IgE), Unterklassen (IgG1, IgG2, IgG4, IgA1) und stammt von verschiedenen Arten (Mensch, Maus, humanisiert). Von elf getesteten scFv wurde eine lösliche Expression bei zehn beobachtet. Die Ausbeuten variierten von 4 mg/l bis 271 mg/l ohne Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und einem spezifischen Antikörpertyp, wobei IgG . am häufigsten und am schlechtesten exprimiert wurde1. Jede scFv-Expression wurde parallel in Abwesenheit von Faltungshelfern getestet und nur zwei scFv, Natalizumab und Trastuzumab (in [27] als „Tysabri“ bzw. „Herceptin“ bezeichnet) wurden in Abwesenheit von Disulfidkatalysatoren effizient löslich exprimiert Bindungsbildung. Das von Trastuzumab abgeleitete scFv hat identische Vh und VL Domänen wie das von Jung und Plückthun verwendete Anti-HER2-scFv [7]. Bei Verwendung von CyDisCo werden die sechs zytoplasmatischen E. coli Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen sind vorhanden und daher sollte die Prolylisomerisierung effizient katalysiert werden. Darüber hinaus ist ein paralleles +/- CyDisCo-Screening für die Produktion in jedem möglich E. coli Belastung und es wurden keine physiologischen Veränderungen als Reaktion auf CyDisCo berichtet. Daher könnte CyDisCo verwendet werden, um auf Disulfidabhängigkeit der Faltung von scFv zu screenen.

Hier untersuchen wir den Beitrag von CDRs und Gerüstregionen zur Disulfid-Abhängigkeit der Faltung von scFv. Für die Studie wurden vier scFv ausgewählt, zwei mit einem hohen Grad an Disulfid-Unabhängigkeit (Trastuzumab und Natalizumab) und zwei weitere Disulfid-abhängige (IgA1 und Maa48). Wir tauschten CDRs aus und testeten die Disulfid-Abhängigkeit der Faltung im Zytoplasma von E. coli mit dem CyDisCo-System. Um die Disulfid-unabhängige Faltung zu verifizieren, mutierten wir alle vier Cysteine ​​in Trastuzumab und Natalizumab scFv zu Alanin. Wir untersuchten auch die thermische Stabilität und Sekundärstruktur von löslich exprimiertem scFv, um Korrelationen mit der Disulfid-Abhängigkeit zu untersuchen. Obwohl dies für die Frage der Disulfid-Abhängigkeit der Faltung nicht direkt relevant ist, haben wir auch Bindungsstudien durch Western-Blotting oder Dot-Blotting oder Oberflächenplasmonenresonanz der meisten produzierten scFv durchgeführt, um anderen Forschern auf dem Gebiet der Hybrid-scFv-Produktion zu helfen.


Immunprofiling: So funktioniert es

Wie bereits erwähnt, ist Immunprofiling die quantitative Messung von Antigenrezeptoren (ARs-Antikörper oder T-Zell-Rezeptoren) in einer Probe. Die massiv-parallele (NextGen) DNA-Sequenzierung ist hierfür eine häufig verwendete Methode, da die Rezeptordiversität schnell und kostengünstig gemessen werden kann mit dem zusätzlichen Vorteil, dass einzelne Rezeptoren quantifiziert werden können.

AR-Diversität ist das Ergebnis zufälliger Rekombination plus DNA-Baseninsertionen

Um die Basis und Leistungsfähigkeit von DNA-Sequenzierungsassays zu verstehen, müssen wir die Grundlagen der AR-Entwicklung und -Reifung verstehen. Das adaptive Immunsystem aller Wirbeltiere mit Kiefer ist insofern ähnlich, als eine immense AR-Diversität durch einen DNA-Neuanordnungsprozess erzeugt wird [1], der Gene innerhalb verschiedener Gruppen miteinander rekombiniert. Jeder Rezeptor-Locus hat diskrete Gruppen von Genen, die als Variable (V), Diversity (D) und Joining (J) bezeichnet werden. Es gibt auch Constant (C)-Gene, aber zum Zweck der Antigenerkennung bilden die V(D)J-Gene das "geschäftliche" Ende des AR. Daher konzentriert sich dieser Beitrag auf die V(D)J-Rekombination und behandelt C-Gene und Klassenwechsel.

Menschliche AR-Loci. Die Gene für jede AR-Kette existieren an separaten Orten (Loci) im Genom. Farbnuancen werden verwendet, um die verschiedenen Gengruppen anzuzeigen (V: Rot, D: Grün, J: Gelb und C: Blau). Allgemeine Genlängen (in Nukleotiden [nt, Basen] sind unter den Gengruppennamen angegeben. Die Anzahl der Gene für jede Gruppe ist unter jedem Locus-Diagramm angegeben. Das Chromosom ( chr ), auf dem sich die Loci befinden, ist am Ende eines jeden angegeben Die Daten für die Abbildung wurden der IMGT-Datenbank entnommen: http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/LocusGenes/genetable/human/geneNumber, 14. November 2018

Beim AR-Rekombinationsverfahren wird ein Gen in jeder Gengruppe (V, D, von J) mit einem Gen in einer anderen Gruppe kombiniert. Als Beispiel wird ein Antikörper (BCR) aus einem Molekül der schweren Kette (IGH) und einem Molekül der leichten Kette (Kappa [IGK] oder Lambda [IGL]) hergestellt. Die schwere Kette weist V-, D- und J-Gene auf, während die Loci der leichten Kette nur V- und J-Gene aufweisen. Beim IGH-Rekombinationsprozess wird ein D-Gen mit einem J-Gen kombiniert und das resultierende DJ-Gen wird mit einem V-Gen kombiniert. Die Rekombination der leichten Kette kombiniert einfach ein V-Gen mit einem J-Gen. Da der Prozess zufällig ist, ist die Anzahl der möglichen VDJ- oder VJ-Gene das Produkt der Anzahl der V-, D- und J-Gene bzw. V- und J-Gene. Die Gesamtdiversität ist das Produkt der VDJ- und IGL-VJ-Kombinationen plus das Produkt der VDJ- und IGK-VJ-Kombinationen (BCRs sind Dimere eines IGH und entweder einer IGL oder einer IGK-Kette).

Wenn die obige Mathematik durchgeführt wurde, geht die Zahl der möglichen Rezeptoren in die Millionen. Während Millionen groß erscheinen, ist es tatsächlich klein, wenn man bedenkt, dass die Zahl der zu erkennenden Antigene grenzenlos ist. Wie ist das möglich? Die einfache Antwort ist, dass der Rekombinationsprozess „schlampig“ ist. Bei der Rekombination werden die Gensegmente über einen Proteinkomplex zusammengeführt, der die Gene zusammenfügt und die dazwischenliegende DNA auslöst [2]. Die Schleife wird gespalten, um stumpfe terminale Enden der DNA zu erzeugen, die dann mit Enzymen verbunden werden, die eine variable Anzahl zufälliger DNA-Basen an jeder V-, D- oder J-Verbindung hinzufügen können, um eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Rezeptorsequenzen zu erzeugen.

Der Rekombinationsprozess. Für Loci mit D-Genen besteht der erste Schritt (1) darin, ein D-Gen mit einem J-Gen zu kombinieren. Als nächstes (2) wird ein V-Gen mit dem DJ-Gen kombiniert, um eine VDJ-Einheit zu bilden (3). Die zusätzlichen Basen werden durch rosa Balken zwischen den V-D-J-Übergängen angezeigt. Da V-Gene auch Promotoren für die Transkription enthalten, wird eine Prä-mRNA hergestellt, die die VDJ-Einheit, alle zusätzlichen J-Gene, ein Intron und das benachbarte C-Gen enthält (4). Der letzte Schritt besteht darin, das Intron und alle "zusätzlichen" J-Gene (5) herauszuspleißen, um die reife AR-mRNA zu erzeugen.

Immunprofiling untersucht die Sequenzen der V(D)J-Regionen

Erwartungsgemäß sind die V(D)J*-Übergänge die Bereiche mit der höchsten Diversität in ARs. Die Antigenerkennungsdomänen des AR-Proteins haben drei Regionen, die mit Antigenen interagieren. Auch bekannt als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die ersten beiden, CDR1 und CDR2, werden vom V-Gen kodiert. CDR3 wird von der V(D)J-Junction-Region kodiert, und aus Sicht des Immunprofils ist dies die wichtigste Region. Da CDR3-Segmente zwischen 60 und 100 Basen lang sind, sind sie ideale Kandidaten für die massiv parallele Hochdurchsatz-Short-Read-Sequenzierung auf der Illumina-Plattform. Daher ist das Immunprofiling ein Wachstumsbereich in der Biotechnologie.

Bei Immunprofiling-Assays wird das CDR3-Segment aus DNA oder RNA (umgewandelt in cDNA) sequenziert. In beiden Fällen wird PCR verwendet, um DNA, die CDR3 enthält, unter Verwendung von V-Gen- und J-Gen-Primern zu amplifizieren**. Even though the combinations of V(D)J that are possible in a sample is large, the number of primers required is simply the total number of V and J genes for a given AR locus. For example, profiling the TCR beta receptors (above figure) requires 61 primers (48 V gene and 13 J gene).

Despite the modest number of primers needed in an immunoprofiling assay the sequences that the primers bind to will result in significant differences in PCR amplification frequencies between individual receptor molecules. This is due to hybridization efficiency which is affect by the local DNA sequence. Primers that bind more efficiently result in greater amounts of amplified DNA. Thus to make immunoprofiling a quantitative assay, amplification differences need to be accounted for.

To account for amplification differences, Adaptive Biotechnologies (Seattle WA) developed synthetic DNA molecules that contain the same V and J gene primer binding sequences as the receptors that are being sequenced [3]. In our TCR beta example, up to 624 synthetic DNAs are needed. The synthetic DNA molecules are added (spiked in) to assays at a defined concentration. Once sequencing is complete the final dataset will have some number of sequences, called reads, that match each synthetic DNA. The ratio of the number of reads to their corresponding number of spiked in molecules corresponds to the PCR amplification frequency for that primer sequence combination. As the reads derived from sample material will also have many, if not all, ot the same primer combinations - with very different “middle” sequences - we can apply the ratios determined from the synthetic DNA reads to normalize the data.

Structure of V(D)J region and immunoprofiling . Either DNA or RNA (cDNA) can be sequenced with the same V and J gene primers. The bottom diagram shows the AR binding region. CDRs are flanked by Framework regions (FWR). V gene and J gene primers bind to the FWR3 (V) and FWR4 (J) regions, respectively. The pink regions indicate the additional bases that are added during recombination.

DNA sequencing-based immunoprofiling quantitatively measures AR diversity in samples by determining the sequences of V(D)J junctions. AR receptor diversity is vast due to a combinatorial rearrangement process that inserts a variable number of random DNA bases at each junction. In the sequencing process V(D)J junctions are amplified with V and J gene specific primers and, to be quantitative, differences in amplification rates that are due to primer sequences must be factored into each assay.

References / notes:

* The (D) in V(D)J is to note that a D gene is it present in some chains (IGH, TCRB, TCRD) but not others (IGL, IGK, TCRA, TCRG).

1. Litman GW, Rast JP, Fugmann SD. The origins of vertebrate adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 201010(8):543-53.

3. Carlson CS, Emerson RO, Sherwood AM, Desmarais C, Chung MW, Parsons JM, Steen MS, LaMadrid-Herrmannsfeldt MA, Williamson DW, Livingston RJ, Wu D, Wood BL, Rieder MJ, Robins H. Using synthetic templates to design an unbiased multiplex PCR assay. Nat. Komm. 20134:2680.

** There are other ways to prepare DNA for immunoprofiling that do not require individual primers. Such assays will have more steps that can introduce other kinds of artifacts, and (or) be limited to RNA sequencing.


Schau das Video: Antibody Humanization Service - Creative Biolabs Original Version (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Gardall

    Ich entschuldige mich, ich kann nichts helfen. Ich denke, Sie werden die richtige Entscheidung finden. Nicht verzweifeln.

  2. Askuwheteau

    Ich teile Ihre Meinung voll und ganz. Da ist etwas und die Idee ist gut, ich unterstütze es.

  3. Martel

    Vielleicht ist es falsch?

  4. Fatin

    Ich bestätige. Alle oben haben die Wahrheit gesagt. Wir können zu diesem Thema kommunizieren.

  5. Pslomydes

    Meiner Meinung nach liegst du falsch. Ich kann meine Position verteidigen. Schreib mir per PN.

  6. Kikree

    Ich glaube, ich mache Fehler. Wir müssen diskutieren. Schreiben Sie mir in PM.



Eine Nachricht schreiben