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9. DNA-Transposition - Biologie

9. DNA-Transposition - Biologie


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Die letzte Methode zur Veränderung der DNA in einem Genom, die wir betrachten werden, ist Umsetzung, das ist die Bewegung der DNA von einem Ort zum anderen. DNA-Segmente mit dieser Fähigkeit, sich zu bewegen, heißen transponierbare Elemente. Früher dachte man, dass transponierbare Elemente nur in wenigen Arten vorkommen, heute werden sie jedoch als Bestandteil des Genoms praktisch aller Arten erkannt.

  • 9.1: Transponierbare Elemente (Transposons)
    Transponierbare Elemente (sowohl aktive als auch inaktive) besetzen ungefähr die Hälfte des menschlichen Genoms und einen wesentlich größeren Anteil einiger Pflanzengenome! Diese beweglichen Elemente sind in der Biosphäre allgegenwärtig und vermehren sich sehr erfolgreich. Wir erkennen jetzt, dass einige transponierbare Elemente auch Viren sind, zum Beispiel können einige Retroviren in ein Wirtsgenom integrieren, um endogene Retroviren zu bilden.
  • 9.2: Sind Transposons Parasiten oder Symbionten?
    Verleihen die transponierbaren Elemente dem "Wirt" einen selektiven Vorteil? Oder sind sie nur parasitär oder "egoistisch", existieren nur, um die Anzahl der Kopien des Elements zu erhöhen? Dieses kritische Thema ist eine anhaltende Kontroverse.
  • 9.5: Die Transposition erfolgt durch Einfügen in versetzte Pausen
    Eine gemeinsame Eigenschaft praktisch aller transponierbaren Elemente ist, dass sie sich durch Einfügen in einen gestaffelten Bruch in einem Chromosom bewegen, d. h. ein Strang ist am Bruch etwas länger als der andere. Der erste Hinweis darauf war die Beobachtung, dass auf jeder Seite eines transponierbaren Elements die gleiche kurze DNA-Sequenz gefunden wird. Die Sequenz innerhalb dieser flankierenden direkten Wiederholungen ist für jede Kopie des transponierbaren Elements charakteristisch, aber die Größe ist charakteristisch für eine bestimmte Familie von Elementen.
  • 9.6: Klassen transponierbarer Elemente
    Die beiden Hauptklassen transponierbarer Elemente werden durch die Zwischenstufen des Transpositionsprozesses definiert. Eine Klasse bewegt sich durch DNA-Zwischenprodukte, wobei Transposasen und DNA-Polymerasen verwendet werden, um die Transposition zu katalysieren. Die andere Klasse bewegt sich durch RNA-Zwischenprodukte, wobei RNA-Polymerase, Endonukleasen und reverse Transkriptase verwendet werden, um den Prozess zu katalysieren. Beide Klassen sind bei vielen Arten reichlich vorhanden, aber einige Gruppen von Organismen haben ein Übergewicht der einen oder der anderen.
  • 9.E: DNA-Transposition (Übungen)
  • Zusätzliche Konsequenzen der Umsetzung
  • Dissoziationselemente
  • Mechanismus der DNA-vermittelten Transposition
  • Mechanismus der Retrotransposition
    Obwohl der Mechanismus der Retrotransposition nicht vollständig verstanden ist, ist klar, dass mindestens zwei enzymatische Aktivitäten genutzt werden. Eine davon ist eine Integrase, die eine Endonuklease ist, die an der Integrationsstelle spaltet, um einen gestaffelten Bruch zu erzeugen. Die andere ist die RNA-abhängige DNA-Polymerase, auch Reverse Transkriptase genannt. Diese Aktivitäten werden in einigen autonomen Retrotransposons kodiert, einschließlich sowohl LTR-Retrotransposons als auch Nicht-LTR-Retrotransposons.
  • Instabile Allele
    Die Insertion eines Kontrollelements kann ein instabiles Allel eines Locus erzeugen, das als mutable bezeichnet wird. Diese Instabilität kann sowohl in somatischen als auch in Keimbahngeweben beobachtet werden. Die Instabilität kann durch die Reversion einer Mutation aufgrund der Exzision und Transposition des Kontrollelements entstehen. Nach Exzision und Reintegration kann das transponierbare Element die Expression eines Gens an der neuen Stelle verändern. Dieser neue Phänotyp zeigte an, dass das Element mobil war.

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Transposons: Definition und Typen (mit Diagramm)

Das Vorhandensein von transponierbaren Elementen wurde erstmals Ende der 1940er Jahre von Barbara McClintock in Mais (Mais) vorhergesagt. Nach mehreren sorgfältigen Studien fand sie heraus, dass sich bestimmte genetische Elemente von einer Stelle zu einer völlig anderen Stelle im Chromosom bewegen. Sie bezeichnete dieses Phänomen, dass sich genetische Elemente verändern, als Transposition und diese genetischen Elemente wurden von ihr als kontrollierende Elemente bezeichnet.

Diese Kontrollelemente wurden später von Alexander Brink als transponierbare Elemente bezeichnet. Ende der 1960er Jahre wurde dieses Phänomen auch bei Bakterien entdeckt.

Folglich nannten sie die Molekularbiologen Transposons. Ein Transposon kann definiert werden als: „eine DNA-Sequenz, die sich an einer neuen Stelle im Genom bewegen oder einfügen kann.“ Das Phänomen der Bewegung eines Transposons an eine neue Stelle im Genom wird als Transposition bezeichnet.

Transposons kodieren ein spezielles Protein namens Transposase, das den Transpositionsprozess katalysiert. Transposons sind für verschiedene Organismengruppen spezifisch. Sie bilden einen ziemlich rechenschaftspflichtigen Anteil des Genoms von Organismen wie Pilzen, Bakterien, Pflanzen, Tieren und Menschen. Transposons haben einen großen Einfluss darauf, die genetische Zusammensetzung von Organismen zu verändern oder zu verändern.

Transposons oder transponierbare genetische Elemente werden oft auch als „mobile genetische Elemente“ bezeichnet. Sie können nach verschiedenen Grundlagen wie ihrer Art der Transposition oder nach den Organismen, in denen sie vorkommen, kategorisiert werden.

Arten von Transposons:

Verschiedene Transposons können ihre Stellen ändern, indem sie verschiedenen Transpositionsmechanismen folgen.

Aufgrund ihres Umsetzungsmechanismus können Transposons in folgende Typen eingeteilt werden:

(i) Transposons zum Ausschneiden und Einfügen:

Sie transponieren durch Exzision (Schneiden) der transponierbaren Sequenz von einer Position im Genom und deren Insertion (Einfügen) an eine andere Position innerhalb des Genoms (Abb. 1).

Die Cut-and-Paste-Transposition umfasst zwei Transposase-Untereinheiten. Jede Transposase-Submission bindet an die spezifischen Sequenzen an den beiden Enden des Transposons. Diese Untereinheiten des Transposase-Proteins kommen dann zusammen und führen zur Exzision des Transposons.

Dieser ausgeschnittene ‘Transposon-Transposase-Komplex’ wird dann in die Zielempfängerstelle integriert. Auf diese Weise wird das Transposon von einer Stelle abgeschnitten und dann durch einen durch das Transposase-Protein vermittelten Mechanismus an einer anderen Stelle eingefügt (Fig. 2).

Beispiele für Transposons vom Cut-and-Paste-Typ sind IS-Elemente, P-Elemente in Mais, Hobo-Elemente in Drosophila usw.

(ii) Replikative Transposons:

Sie transponieren nach einem Mechanismus, der die Replikation einer transponierbaren Sequenz beinhaltet, und diese so gebildete DNA-Kopie wird in die Zielstelle eingefügt, während die Donorstelle unverändert bleibt (Fig. 3). Somit gibt es bei dieser Art der Transposition einen Gewinn einer Kopie des Transposons und sowohl das Donor- als auch das Empfänger-DNA-Molekül haben nach der Transposition jeweils eine transponierbare Sequenz.

In Bakterien gefundene Tn3-Elemente sind gute Beispiele für solche Transposons.

(iii) Retro-Elemente:

Ihre Transposition wird durch einen Prozess erreicht, der die Synthese von DNA durch reverse Transkription (d. h. RNA-DNA) unter Verwendung von RNA-Elementen als Matrize beinhaltet (Fig. 4). Diese Art der Transposition beinhaltet ein RNA-Zwischenprodukt, die transponierbare DNA wird transkribiert, um ein RNA-Molekül zu produzieren.

Diese RNA wird dann als Matrize zur Herstellung einer komplementären DNA durch die Aktivität des Enzyms Reverse Transkriptase verwendet. Diese so gebildete einzelsträngige DNA-Kopie wird dann doppelsträngig gemacht und dann in die Ziel-DNA-Stelle eingefügt. Die transponierbaren Elemente, die für ihre Bewegung eine reverse Transkriptase benötigen, werden Retro-Transposons genannt.

Die Retro-Elemente können viral oder nicht-viral sein. Von diesen beiden sind die nicht-viralen Retro-Elemente wichtig und können weiter klassifiziert werden als:

(A) Retrovirus-ähnliche Elemente:

Sie tragen Long Terminal Repeats (LTR). Beispiele sind Copia, Zigeunerelemente bei Drosophila.

LTR fehlen. Beispiele sind LINEs und SINEs beim Menschen.

Transponierbare Elemente in Prokaryoten:

Obwohl die Anwesenheit von Transposons in Eukaryoten vorhergesagt wurde, wurde die erste Beobachtung auf molekularer Ebene in Bakterien durchgeführt, die ein Prokaryoten sind.

Bakterielle transponierbare Elemente sind von den folgenden Typen:

(a) Einfügesequenzen oder IS-Elemente:

Sie sind die transponierbaren Sequenzen, die an verschiedenen Stellen in den bakteriellen Chromosomen eingefügt werden können.

IS-Elemente enthalten ITRs (Inverted Terminal Repeats), diese wurden erstmals in E.coli beobachtet. IS-Elemente sind relativ kurz und überschreiten normalerweise 2500 bp nicht. Die an den Enden von IS-Elementen vorhandenen ITRs sind ein wichtiges Merkmal, das deren Mobilität ermöglicht. Die in den IS-Elementen von E. coli vorhandenen ITRs liegen normalerweise im Bereich zwischen 18-40 bp.

Der Begriff ‘Invertierte Terminalwiederholung’ (ITR) impliziert, dass die Sequenz am 5-Ende eines Strangs identisch mit der Sequenz am 5′-Ende des anderen Strangs ist, jedoch in umgekehrter entgegengesetzter Richtung verläuft (Abb. 5). Im Exoli-Chromosom sind mehrere Kopien mehrerer IS-Elemente wie IS1, IS2, IS3, IS4 und IS5 vorhanden.

(b) Prokaryontisches Transposon-Element:

Diese werden auch zusammengesetzte Transposons genannt und sind durch das Symbol Tn gekennzeichnet. Es besteht aus zwei IS-Elementen, von denen eines an jedem Ende einer DNA-Sequenz vorhanden ist, die Gene enthält, deren Funktionen nicht mit dem Transpositionsprozess zusammenhängen. Es wurde gefunden, dass diese Transposons an den Enden invertierte Wiederholungen aufweisen. Die Länge dieser invertierten Wiederholungen reicht von wenigen Nukleotiden bis etwa 1500 bp.

Man kann sagen, dass dies die großen Transposons sind, die durch das Einfangen einer immobilen DNA-Sequenz innerhalb von zwei Insertionssequenzen gebildet werden, wodurch sie sich bewegen kann. Beispiele für solche Transposons umfassen die Mitglieder der Tn-Reihe wie Tn1, Tn5, Tn9, Tn10 usw.

Transponierbare Elemente in Eukaryoten:

(a) Transposons in Mais:

Im Folgenden werden verschiedene Arten von Transposons beschrieben, die in Mais vorkommen:

Dieses System von transponierbaren Elementen in Mais wurde von Barbara Mc analysiert und vorgestellt. Klintock. Dabei steht Ac für Activator und Ds für Dissoziation. Barbara fand heraus, dass Ds- und Ac-Gene manchmal mobil waren und an verschiedene chromosomale Stellen verschoben wurden, was zu unterschiedlichen Kernel-Phänotypen führte.

Das Ds-Element wird durch Ac aktiviert und dient bei Aktivierung als Standortlieferant für den Bruch im Chromosom. Ac kann sich autonom bewegen, während Ds sich nur in Gegenwart von Ac bewegen kann (Fig. 6). Die Transposition mit diesem Ac-Ds-System erzeugt veränderte Kernel-Phänotypen.

Andere übertragbare Elemente von Mais sind:

ich. spm (Suppressor-Mutator)-System,

iii. Mu (Mutator)-System usw.

(b) Transposons in Drosophila:

In Drosophila findet man eine Reihe von transponierbaren Elementen, die unterschiedlichen Typs sind und einen ziemlich hohen Anteil des Drosophila-Genoms ausmachen.

Einige dieser Transposons sind unten aufgeführt:

Diese wurden während des Studiums von entdeckt ‘Hybrid-Dysgenesie’ das ist eine Sterilität verursachende Bedingung. Sie sind 2,9 kb lang und enthalten 31 bp lange invertierte terminale Wiederholungen. Eine hohe Rate der P-Element-Transposition verursacht eine Hybriddysgenese. P-Elemente kodieren für das Transposase-Enzym, das bei ihrer Transposition hilft. Diese sind auch als Vektoren zum Einführen fremder Gene in Drosophila nützlich.

Ihre Transposition verursacht bei Drosophila Mutationen für die Augenfarbe. Sie haben eine Größe von ungefähr 5-8 kb mit einer direkten terminalen Wiederholung (DTR) von ungefähr 276 bp an jedem Ende. In jedem dieser direkten Wiederholungen ist ein kurzer invertierter Wiederholungsschritt (IR) von etwa 17 bp Länge vorhanden. Etwa 10-80 Copia-Elemente sind im Zellgenom vorhanden (Abb. 7).

Dies sind die Foldback-Elemente, die im Genom von Drosophila vorhanden sind. Diese haben die Fähigkeit, sich aufgrund des Vorhandenseins langer invertierter terminaler Wiederholungen zurück zu falten, um eine Stamm- und Schleifenstruktur zu bilden. Ihre Transposition führt zu einer veränderten Expression, indem sie durch Insertion eine Mutation hervorruft oder die normale Genexpression beeinflusst.

Andere wichtige Arten von transponierbaren Elementen, die in Drosophila vorkommen, sind:

(c) Transposons beim Menschen:

Transposons beim Menschen liegen in Form repetitiver DNA vor, die aus Sequenzen besteht, die innerhalb des gesamten menschlichen Genoms eingestreut sind. Diese Sequenzen sind transponierbar und können sich an verschiedene Stellen innerhalb des Genoms bewegen.

Diese sind von den folgenden zwei Arten:

(1) SINEs (kurze eingestreute Elemente):

300 bp lang und kann etwa 5 lakh mal im menschlichen Genom vorhanden sein. Alu-Sequenzen sind die am besten charakterisierten SINEs beim Menschen.

Diese werden als bezeichnet ‘Alu’ Elemente, weil sie spezifische Nukleotidsequenzen enthalten, die durch das Restriktionsenzym namens Alul gespalten werden. Alu-Elemente enthalten Direct Terminal Repeats (DTR) von 7-20 bp Länge. Diese DTRs helfen ihnen beim Einfügen während der Transposition.

(2) LINEs (lange eingestreute Elemente):

6400 bp lang und sind etwa 1 lakh mal im menschlichen Genom vorhanden. Prominentestes Beispiel ist die LI-Sequenz. Diese transponierbaren Elemente sind einige der am häufigsten vorkommenden und am häufigsten vorkommenden Familien mäßig wiederholter Sequenzen in der menschlichen DNA.

Bedeutung transponierbarer Elemente:

1. Transposons können die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Genoms verändern, indem sie ihre Position im Genom ändern.

2. Transponierbare Elemente verursachen Mutationen durch Insertion, Deletion usw.

3. Transposons leisten einen positiven Beitrag zur Evolution, da sie einen enormen Einfluss auf die Veränderung der genetischen Organisation von Organismen haben.

4. Sie sind auch als Klonierungsvektoren bei der Genklonierung nützlich. Beispielsweise werden P-Elemente häufig als Vektor zur Einführung von Transgenen in Drosophila verwendet.

5. Transposons können auch als genetische Marker bei der Kartierung der Genome verwendet werden.

6. Transposon-vermitteltes Gen-Tagging wird durchgeführt, um ein bestimmtes Gen zu suchen und zu isolieren.

Techniken der Genkartierung:

Eine Genkarte ist die detaillierte schematische Darstellung der Positionen von Genen oder Sequenzen von Interesse in einem Chromosom. Es kann auch Details der relativen Abstände zwischen diesen Genen liefern. Eine Genkarte kann auch als Genomkarte oder Molekularkarte bezeichnet werden. Es versucht, die strukturelle und funktionelle Organisation des Genoms eines Organismus zu beschreiben.

Die Genkartierung hat in den letzten zwei Jahrzehnten nicht nur bei Pflanzen, sondern auch bei Tieren viel Aufmerksamkeit erlangt. Diese Karten bieten einen immensen Nutzen bei der Verbesserung kommerziell wichtiger Pflanzen oder Tiere. Die Genkartierung des menschlichen Genoms ist das Hauptziel des Human Genome Project (HGP). Es wird sicherlich helfen, die genetischen Störungen beim Menschen zu lösen.

Genkarten helfen auch bei der Bewertung der genetischen Vielfalt und der taxonomischen Klassifizierung von Organismen im Vergleich. Die gebräuchlichste Technik zur Entwicklung einer Genkarte ist die Verwendung von molekularen Markern. Die Grundlage für das Funktionieren molekularer Marker bildet der Polymorphismus.

Polymorphismus:

Das Genom des Organismus enthält eine Reihe von Polymorphismen (wörtliche Bedeutung ist viele Formen). Diese Polymorphismen sind eigentlich die Positionen im Genom, an denen die Nukleotidsequenz nicht bei jedem Mitglied einer Population gleich ist. Diese variablen Stellen können als DNA-Marker (oder molekularer Marker) für die Genomkartierung verwendet werden.

Der Nachweis von Polymorphismus kann auf eine der folgenden Arten erfolgen:

Dieser Nachweis kann aufgrund der Unterschiede in Struktur und Zusammensetzung der Proteine ​​erfolgen, die von den polymorphen Stellen der Genome kodiert werden.

Dies kann durch visuelle Untersuchung erfolgen, ohne dass eine spezielle biochemische oder molekulare Technik erforderlich ist.

(iii) Molekularer Nachweis:

Dies erfolgt auf DNA-Ebene, d. h. die DNA-Sequenzen mit den Unterschieden können nachgewiesen werden. Der auf molekularer Ebene auftretende Polymorphismus, d. h. in der DNA-Sequenz, kann effizient als molekularer/DNA-Marker verwendet werden und ist daher für die Erstellung von Genkarten wichtig.

Molekulare Marker:

Diese können auch als DNA-Marker bezeichnet werden. Sie stellen die primäre Methode zur Entwicklung von Genkarten dar. Molekulare Marker zeigen tatsächlich die Variabilität auf DNA-Ebene. Molekulare Marker können als DNA-Sequenzen beschrieben werden, die Variationen auf DNA-Ebene zeigen, die in den nachfolgenden Generationen leicht nachgewiesen und überwacht werden können.

Auf der Grundlage der Prinzipien und Methoden, die für die Entwicklung und Verwendung der molekularen Marker verwendet wurden, können sie in Hybridisierungs-basierte Marker und PCR-basierte Marker eingeteilt werden.

Ein guter molekularer Marker muss polymorph sein und sollte gleichmäßig im Genom verteilt sein. Ein molekularer Marker sollte einfach und schnell nachweisbar sein. Wie bereits erwähnt, wird molekularer Marker hauptsächlich in der Entwicklung von Genkarten verwendet.

Nachfolgend sind verschiedene wichtige DNA-Marker aufgeführt, die für die Genkartierung verwendet werden:

(i) RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus):

Es ist ein auf Hybridisierung basierender molekularer Marker. Das Prinzip des RFLP-Markers ist der Restriktionsverdau einer reinen DNA-Probe durch Restriktionsendonuklease-Enzyme. Es repräsentiert den Polymorphismus als einzelne Basenänderungen.

(ii) RAPD (zufällig amplifizierte polymorphe DNA):

Es handelt sich um eine auf PCR (Polymerase Chain Reaction) basierende Technik. Grundprinzip der Funktionsweise von RAPD ist die DNA-Amplifikation mittels PCR. RAPD ist eine schnellere Technik.

(iii) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism):

Es ist eine Kombination von Funktionen von RAPD und RFLP. Das grundlegende Funktionsprinzip von AFLP ist die PCR-Amplifikation von Genomfragmenten, die durch die Anwendung von Restriktionsenzymen hergestellt werden. AFLP ist eine schnellere und weniger aufwendige Technik.

(iv) VNTR (variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen):

Diese werden auch als Mini-Satelliten bezeichnet. Polymorphismus in VNTRs ist mit der Anzahl der Wiederholungseinheiten an einer bestimmten Position in einem Chromosom bei verschiedenen Individuen verbunden.

(v) STRs (kurze Tandem-Wiederholungen):

Diese werden auch als Mikrosatelliten bezeichnet. Sie zeigen Polymorphismus aufgrund der Variation in der Anzahl der Wiederholungen. Dies sind ideale Marker, um eine hochauflösende molekulare Karte zu entwickeln. Die molekularen Marker werden zur Erstellung von Genomkarten sowohl in Pflanzen als auch in Tieren und Mikroorganismen verwendet. Jedoch werden auch viele andere Techniken wie in-situ-Hybridisierung usw. für die Kartierung verwendet.

Arten von Genkarten:

Basierend auf den Strategien zur Erstellung von Genkarten gibt es folgende Arten von Genkarten:

Genetische Karte:

Sie wird durch genetische Studien gewonnen, die mendelsche Prinzipien wie Crossing-Over, Linkage usw. verwenden. Solche Karten werden als nicht sehr genau angesehen. Sie geben nur Auskunft über die Position der betroffenen Gene (d. h. auf welchem ​​Chromosom sie vorhanden sind) und geben auch ungefähr eine Vorstellung über den relativen Abstand zwischen den betroffenen Genen.

Linkage Map ist der Begriff, der insbesondere für solche genetischen Karten verwendet wird, in denen die relativen Abstände zwischen genetischen Markern oder betroffenen Genen in Form von Rekombinationsfrequenzen zwischen ihnen gemessen werden. Die Entfernungseinheit in einer Verknüpfungskarte ist CentiMorgan (cM) oder Karteneinheit. Ein cM ist definiert als der Abstand, der eine Rekombination von 1% zwischen den Genen ermöglicht.

Bei der Erstellung von Kopplungskarten werden die Rekombinationsfrequenzen zwischen den Genen untersucht. Die auf dieser Rekombinationsfrequenz basierenden Daten werden verarbeitet, um den Abstand zwischen den Genen zu messen.

In den letzten Jahren wurde eine Reihe fortschrittlicher Computersoftware eingeführt, die bei der schnellen und genauen Verarbeitung von Daten über die Rekombinationsfrequenz hilft und somit die Verknüpfungskarten von Genomen erstellt. Einige dieser Computersoftwares sind – LINKAGE, MAPMAKER, CRI-MAP usw.

Ein Hauptnachteil der genetischen Karte besteht darin, dass manchmal die Abstände zwischen den Genen in einer genetischen Karte nicht der tatsächlichen Entfernung zwischen ihnen auf dem Chromosom entsprechen. Oftmals können Lücken auf den genetischen Karten bleiben.

Dies geschieht im Wesentlichen, weil die Rekombinationsfrequenzen (die als Maß für den Abstand zwischen den Genen verwendet werden) offensichtlich von den Umweltbedingungen und der Art und Position der für die Untersuchung verwendeten Mutanten beeinflusst werden.

In letzter Zeit wurden verschiedene Techniken für die genetische Kartierung entwickelt. Diese beinhalten die Verwendung von DNA-Sequenzen, die keine Gene sind, sondern Variationen in einer Population aufweisen. Solche Sequenzen werden als molekulare Marker bezeichnet.

Die wichtigsten molekularen Marker für die genetische Kartierung sind:

(a) RFLP: Diese polymorphen Marker wurden zur genetischen Kartierung in einer Reihe von Kulturpflanzen zusammen mit Mäusen, Menschen, Drosophila usw. verwendet. Bisher wurden genetische RFLP-Karten erfolgreich in Weizen, Reis, Roggen, Gerste, Tomate, Kartoffel usw. entwickelt.

(b) RAPD: Genetische Karten werden erfolgreich unter Verwendung einer PCR-basierten Technik namens RAPD erstellt. Diese Marker bieten eine bequemere und schnellere Methode der genetischen Kartierung als RFLPs. Die genetische Karte von RAPD liefert jedoch weniger Informationen.

(c) Genetische Karten wurden erfolgreich konstruiert, indem auch Minisatelliten (auch variable Anzahl von Tandemwiederholungen, VNTR genannt) und Mikrosatelliten (d. h. kurze Tandomwiederholungen, STR) verwendet wurden.

(d) Zur Herstellung genetischer Karten können auch die AFLPs verwendet werden. Die AFLP-Technik weist die Merkmale von sowohl RFLP als auch RAPD auf und ist eine vorteilhaftere und schnellere Technik zum Konstruieren genetischer Karten.

Zytogenetische Karte:

Sie können auch als zytologische Karten oder Chromosomenkarten bezeichnet werden. Wenn Gene bestimmten Chromosomenarmen zugeordnet werden und auch ihre Abstände zum Zentromer angezeigt werden, dann wird die Karte als zytogenetische Karte bezeichnet und die Technik wird als zytogenetische Kartierung bezeichnet.

Eine zytogenetische Karte ermöglicht es, betroffene Gene nicht nur auf einem bestimmten Chromosom, sondern auch auf bestimmten Regionen dieses Chromosoms zu lokalisieren. Die zytogenetische Kartierung wird im Allgemeinen besser im Fall von Organismen verwendet, die größere mikroskopisch beobachtbare Chromosomen aufweisen.

Es gibt verschiedene Techniken, die zur Konstruktion zytogenetischer Karten verwendet werden können. Einige von ihnen sind unten aufgeführt:

(a) FISH (Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung):

Die Technik der in-situ-Hybridisierung beinhaltet den Nachweis und die Lokalisierung der gewünschten DNA-Sequenz direkt in der Zelle. Wenn die in-situ-Hybridisierung die Markierung mit fluoreszierenden Molekülen beinhaltet, wird dies als fluoreszierende in-situ-Hybridisierung (FISH) bezeichnet. Durch die Verwendung von FISH können die Gene in der richtigen Reihenfolge auf dem Chromosom innerhalb der Zelle lokalisiert werden und so eine zytogenetische Karte liefern.

Die zytogenetischen Karten können auch unter Verwendung molekularer Marker wie RFLP erstellt werden. Bei diesem Ansatz befindet sich der RFLP-Locus auf den spezifischen Regionen eines bestimmten Chromosoms.

(c) Verwendung von somatischen Zellhybriden:

Die somatischen Zellhybride mit Chromosomen bekannter Identität wurden erfolgreich zur Herstellung zytogenetischer Karten vorzugsweise beim Menschen verwendet. Zum Beispiel haben die Mensch-Maus-Hybride somatischer Zellen zur Kartierung von Genen auf dem menschlichen Chromosom auf spezifischere Regionen geführt.

Physikalische Karte:

Diese Karten stellen die korrekte Reihenfolge der Gene auf dem Chromosom dar und basieren auf den physikalischen Abständen zwischen den Genen oder zwischen einem Gen und dem Zentromer.

In einer physikalischen Karte wird die Distanz nie in centiMorgan angegeben, sondern als Anzahl der Basenpaare zwischen den Genen. Physische Karten gelten als genauer als genetische Karten. Sie führen letztendlich dazu, die gesamte Sequenzierung des gesamten Genoms zu erhalten und dies auch mit der Kenntnis der physikalischen Abstände zwischen den Genen.

Es handelt sich um eine Art physikalischer Abbildung, da darin Abstände in Form von Basenpaaren angegeben werden. Es ist eine erfolgreiche Technik zur Kartierung des prokaryotischen Genoms. Die Herstellung von Restriktionskarten beinhaltet die Verwendung von Restriktionsendonukleaseenzymen, die die DNA an spezifischen Stellen spalten. Um eine Restriktionskarte herzustellen, werden ein oder mehrere Restriktionsendonukleaseenzyme verwendet, um DNA an verschiedenen Stellen zu spalten (Fig. 9).

Als Ergebnis werden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge erhalten. Die Probe mit solchen DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe wird dann zur Trennung einer als Gelelektrophorese bezeichneten Technik unterzogen. Folglich wird eine Reihe von Banden auf dem Gel erhalten, wobei die Position der Banden von seiner Größe abhängt.

Dieses Gel mit verschiedenen Banden wird dann mit Hilfe von DNA-Fragmenten bekannter Länge kalibriert, um die Spaltstellen zu erhalten. Diese Spaltungsstellen werden dann identifiziert und zusammen kartiert, um eine vollständige Restriktionskarte zu erzeugen.

Verschiedene Techniken zur Erstellung von physischen Karten sind:

(a) ISH (in situ Hybridisierung) Technik:

Es kann für die physische Kartierung verwendet werden, dies wurde erfolgreich zum Erhalten von physischen Kartierungen in Roggen, Weizen und Gerste verwendet. Eine fortgeschrittene Technik FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) kann auch für die physikalische Kartierung verwendet werden.

(B) Physisches Mapping kann auch unter Verwendung von Chromosomenaberrationen wie Duplikation, Deletion und Translokation durchgeführt werden.

(C) Physikalische Karten können auch unter Verwendung eines Kartierungsreagenzes entwickelt werden. Das Kartierungsreagenz ist eigentlich eine Sammlung von DNA-Fragmenten, die ein komplettes Chromosom oder das gesamte Genom umfassen.

(D) Die Technik des Chromosomen-Walkings ist auch hilfreich, um physische Karten zu entwickeln. Diese Technik ist jedoch bei höheren Eukaryoten aufgrund des Vorhandenseins stark wiederholter Sequenzen nicht von großem Nutzen.

(e) Die Verwendung von YAC (Yeast Artificial Chromosom) hat sich auch als sehr nützlich für die physikalische Kartierung von Drosophila und Menschen erwiesen.

Bedeutung von Genkarten:

1. Genkarten spielen eine wichtige Rolle in der Forschung zur Pflanzen- und Tierbiotechnologie.

2. Für das Human Genome Project (HGP) sind genetische und physikalische Karten wichtig.

3. Genkarten helfen den Genetikern, phylogenetische Beziehungen und evolutionäre Muster von Organismen zu studieren.

4. Diese sind hilfreich für die Charakterisierung genetischer Ressourcen und die Einschätzung der genetischen Vielfalt.

5. Genkarten haben einen enormen Nutzen bei Programmen zur Verbesserung der Kulturpflanzen.

6. Sie können eine zusätzliche Hilfestellung bei der Lösung der Probleme im Zusammenhang mit einer Reihe schädlicher genetischer Störungen beim Menschen sein.

Chromosomenwandern:

Chromosomen-Walking ist ein wichtiger Aspekt der Zytogenetik:

Es ist eine Methode zur Analyse langer DNA-Abschnitte. Unter Verwendung dieser Technik können große Chromosomenregionen mit einer Länge von etwa 1000 kb leicht charakterisiert werden. Im Gegensatz dazu können die herkömmlichen Klonierungsverfahren oder PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) etc. nur etwa 100 kb lange Chromosomensegmente charakterisieren.

Das Chromosomen-Walking wird auf dem DNA-Fragment durchgeführt, das das interessierende Gen enthält:

Der Prozess beginnt mit einem bekannten Gen, das in der Nähe des interessierenden Gens auf dem DNA-Fragment vorhanden ist. Für das Chromosomen-Walking werden interessierende Klone aus der genomischen Bibliothek abgeleitet.

Während des Chromosomen-Walkings wird das Endstück eines klonierten DNA-Fragments subkloniert und als Sonde verwendet, um einen weiteren überlappenden Klon aus der Genombibliothek zu gewinnen. Die Restriktionskartierung solcher überlappender Sequenzen kann verwendet werden, um die ursprüngliche Sequenz der DNA-Strecken zu konstruieren, die untersucht werden.

Dies sind die markierten DNA- oder RNA-Moleküle, die verwendet werden, um Zielgene oder -moleküle zu identifizieren.

Das Klonen eines Klons wird als Subklonen bezeichnet.

Schritte beim Chromosomenwandeln:

ich. Der erste interessierende Klon wird aus der genomischen Bibliothek ausgewählt, nachdem er durch eine Sonde identifiziert wurde.

ii. Ein kleines Fragment von einem Ende dieses Klons wird subkloniert.

iii. Dieses subklonierte Fragment wird nun als Sonde verwendet und mit einem anderen Klon aus der genomischen Bibliothek hybridisiert.

NS. Nun wird der mit dem Subklon des ersten Klons hybridisierte zweite Klon aufgrund des Vorhandenseins einer überlappenden Region identifiziert.

v. Das Endstück des zweiten Klons wird dann subkloniert und zur Hybridisierung mit einem anderen Klon aus der Bibliothek verwendet.

vi. Auch hier wird der dritte Klon, der mit dem Subklon des zweiten Klons hybridisiert ist, ebenfalls aufgrund des Vorhandenseins einer überlappenden Region identifiziert.

vii. Dieser Vorgang des Subklonens und Sondierens der genomischen Bibliothek wird wiederholt, um überlappende Klone zu gewinnen, bis das interessierende Gen erreicht ist.

viii. Restriktionskarten der überlappenden Klone können konstruiert werden, um die gesamte Sequenz der ursprünglichen DNA-Strecke zu erhalten (Fig. 10).

Anwendungen des Chromosomen-Walkings:

1. Diese Technik wird erfolgreich zur Charakterisierung großer Chromosomenregionen eingesetzt.

2. Chromosomen-Walking wird zur Identifizierung spezifischer Gene verwendet.

3. Es kann auch zur Isolierung bestimmter Gene verwendet werden.

4. Chromosomen-Walking ist eine Technik, die häufig zur Erstellung von Genomkarten, insbesondere der physikalischen Karten, verwendet wird.

5. Es ist von großer Bedeutung für die Identifizierung genetischer Störungen beim Menschen wie Mukoviszidose, Muskeldystrophie usw.

Einschränkungen des Chromosomen-Walkings:

1. Diese Technik ist zeitaufwendig.

2. Es ist eine mühsame Technik.

3. Es erfordert den Aufbau einer genomischen Bibliothek.

4. In komplexen eukaryotischen Genomen, wie denen des Menschen, ist es normalerweise schwierig, Chromosomen-Walking durchzuführen, da sie stark repetitive Sequenzen tragen.


Moderne genetische Analyse.

Mehrere verschiedene Transpositionsmechanismen werden von prokaryotischen transponierbaren Elementen verwendet. Und wie wir später sehen werden, weisen eukaryotische Elemente noch weitere Transpositionsmechanismen auf.

In E coli, wir können identifizieren replikativ und konservativ (nicht-replizierende) Arten der Transposition. Beim Replikationsweg wird während des Transpositionsereignisses eine neue Kopie des transponierbaren Elements erzeugt. Die Umsetzung führt dazu, dass eine Kopie an der neuen Site erscheint und eine Kopie an der alten Site verbleibt. Beim konservativen Weg gibt es keine Replikation. Stattdessen wird das Element aus dem Chromosom oder Plasmid herausgeschnitten und in die neue Stelle integriert.


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An efficient and accurate integration of mini-Mu transposons in vitro: a general methodology for functional genetic analysis and molecular biology applications

Transposons are mobile genetic elements and have been utilized as essential tools in genetics over the years. Though highly useful, many of the current transposon-based applications suffer from various limitations, the most notable of which are: (i) transposition is performed in vivo, typically species specifically, and as a multistep process (ii) accuracy and/or efficiency of the in vivo or in vitro transposition reaction is not optimal (iii) a limited set of target sites is used. We describe here a genetic analysis methodology that is based on bacteriophage Mu DNA transposition and circumvents such limitations. The Mu transposon tool is composed of only a few components and utilizes a highly efficient and accurate in vitro DNA transposition reaction with a low stringency of target preference. The utility of the Mu system in functional genetic analysis is demonstrated using restriction analysis and genetic footprinting strategies. The Mu methodology is readily applicable in a variety of current and emerging transposon-based techniques and is expected to generate novel approaches to functional analysis of genes, genomes and proteins.


Jump around: transposons in and out of the laboratory

Since Barbara McClintock's groundbreaking discovery of mobile DNA sequences some 70 years ago, transposable elements have come to be recognized as important mutagenic agents impacting genome composition, genome evolution, and human health. Transposable elements are a major constituent of prokaryotic and eukaryotic genomes, and the transposition mechanisms enabling transposon proliferation over evolutionary time remain engaging topics for study, suggesting complex interactions with the host, both antagonistic and mutualistic. The impact of transposition is profound, as over 100 human heritable diseases have been attributed to transposon insertions. Transposition can be highly mutagenic, perturbing genome integrity and gene expression in a wide range of organisms. This mutagenic potential has been exploited in the laboratory, where transposons have long been utilized for phenotypic screening and the generation of defined mutant libraries. More recently, barcoding applications and methods for RNA-directed transposition are being used towards new phenotypic screens and studies relevant for gene therapy. Thus, transposable elements are significant in affecting biology both in vivo and in the laboratory, and this review will survey advances in understanding the biological role of transposons and relevant laboratory applications of these powerful molecular tools.

Schlüsselwörter: CRISPR-Cas genomics insertion library phenotypic screening transposable elements transposon mutagenesis.


Palindromes on the Y chromosome

A startling finding is that, with one exception, the Y chromosome repeats are organized as palindromes, with two very similar long sequences pointing in opposite directions, connected by a 'spacer' (Figure 2) [7]. A companion paper [13] shows that at least some of the palindromes are present in chimpanzees and gorillas, so their origin predates the split between humans and their closest relatives. There is very little sequence divergence between the arms of the palindromes, compared to the divergence between human and chimpanzee sequences. This strongly suggests that there is ongoing gene conversion between the arms, maintaining their sequence similarity. A simple population genetics argument yields an estimate of the rate of conversion as 2.2 × 10 -4 per nucleotide per generation, comparable with values from other sources [13]. The MSY therefore experiences recombination, although of a type that does not affect its divergence from the X.

Portions of the Y chromosome palindrome P6, sequenced in both human and chimpanzee. The white region is the 'spacer' separating the arms of the palindrome (the spacer is about 46 kb in length). The black regions are the arms of the palindrome. The numbers indicate the percentage sequence divergence, either between the arms of the palindrome within a species, or between homologous regions in humans and chimpanzees. (Modified from Figure 1 of [13].)

A consequence, though probably not a cause (given that evolution has no foresight), of the existence of the palindromes is that ongoing gene conversion will inhibit the spread by genetic drift of a deleterious mutation through just one of the two arms, allowing selection to preserve the functionality of both copies [14]. It is possible that the unusual abundance of palindromes among functional duplications on the Y reflects the fact that unequal crossovers between sister chromatids cannot occur among palindromes without causing disruptive chromosome rearrangements this will prevent their loss through the generation of single-copy units by unequal crossing over, as can happen with tandem duplications [15].

The organization of the human Y chromosome thus reflects a combination of several evolutionary processes: the degeneration of the bulk of the genes, which were originally common to the primeval X/Y chromosome pair the accumulation of genes with male-specific functions by sporadic transpositions from the X chromosome and autosomes and a unique recent transposition of a large piece of X chromosomal material. It is therefore probably premature to predict the ultimate demise of the human Y chromosome, as has recently been done [16]. Some species have indeed lost all trace of the Y chromosome, so that males are Xo, not XY [1]. But this can happen only if the male-determining function of the Y chromosome is abolished and is replaced by an X/autosome-balance sex-determination system of the kind found in Drosophila und Caenorhabditis, which is probably rather hard to pull off [17]. Together with the presence of several genes required for male fertility on the human Y chromosome, these considerations imply that human males are likely to be stuck with their bizarre genetic make-up for the foreseeable evolutionary future.


Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position

We describe an assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq), based on direct in vitro transposition of sequencing adaptors into native chromatin, as a rapid and sensitive method for integrative epigenomic analysis. ATAC-seq captures open chromatin sites using a simple two-step protocol with 500-50,000 cells and reveals the interplay between genomic locations of open chromatin, DNA-binding proteins, individual nucleosomes and chromatin compaction at nucleotide resolution. We discovered classes of DNA-binding factors that strictly avoided, could tolerate or tended to overlap with nucleosomes. Using ATAC-seq maps of human CD4(+) T cells from a proband obtained on consecutive days, we demonstrated the feasibility of analyzing an individual's epigenome on a timescale compatible with clinical decision-making.

Figuren

Figure 1. ATAC-seq is a sensitive, accurate…

Figure 1. ATAC-seq is a sensitive, accurate probe of open chromatin state

Figure 2. ATAC-seq provides genome-wide information on…

Figure 2. ATAC-seq provides genome-wide information on chromatin compaction

( ein ) ATAC-seq fragment sizes…

Figure 3. ATAC-seq provides genome-wide information on…

Figure 3. ATAC-seq provides genome-wide information on nucleosome positioning in regulatory regions


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Abkürzungen

ISTInsertion sequence
MITEMiniature inverted-repeat transposable element
ORFOpen reading frame
TETransposable element
TIRTerminal inverted repeat
TSDTarget site duplication

Additional files

Multiple sequence alignment of all 30 miniature inverted-repeat transposable element (MITE) copies. Sequences are named by their coordinates in the P. salinus Genom.

The secondary structure of the P. salinus miniature inverted-repeat transposable element (MITE) consensus sequence [Repbase ID: Submariner_Ps1] predicted by mFold.

Pairwise alignment of a site with a miniature inverted-repeat transposable element (MITE) insertion (bottom sequence) and its paralogous empty site (top sequence) in P. salinus. Target site duplications are underlined in red.

Frequency histogram showing pairwise divergences between individual MITE insertions in P. salinus and the miniature inverted-repeat transposable element (MITE) consensus sequence.

Pairwise alignment of a site with a DNA transposon insertion (bottom sequence) and its paralogous empty site (top sequence) in A. castellanii. Target site duplications are underlined in red.

Multiple sequence alignment of (1) the putative transposase sequences from Submariner_Ac1 und Submariner_Ac2, (2) the four DNA transposase hits we obtained from Repbase using Submariner_Ac1 as a query (Mariner-1_AP, Mariner-2_AP, Mariner-3_AP, and Mariner44_CB), (3) two representative transposases from each of five well-established Tc1/mariner clades (Fot1, Pogo, Tc1, Gizmo, and Mogwai), and (4) the five hits obtained from the NCBI non-redundant protein database (nr) using Submariner_Ac1 as a query (four bacterial sequences — Beggiatoa sp. PS, gi|152068700 Deltaproteobacterium NaphS2, gi|300441029 Kandidat Magnetoglobus multicellularis str. Araruama, gi|571786598 and Desulfobacula sp. TS, gi|667676338, and one uncultured archaeal sequence, GZfos18F2, gi|52548731). Sequences are identified by their GenBank accession numbers or Repbase IDs, if applicable, which correspond to the nucleotide sequences from which the transposase amino acid sequences were deduced. The multiple alignments were generated by PSI-Coffee, an aligner within the T-Coffee multiple alignment package that aligns distantly related protein sequences using homology extension [83, 84]. Red arrows indicate the DDE amino acid triad that coordinates metal ion (Mg 2+ ) binding during catalysis of typical cut-and-paste transposition.

Pairwise alignment of the miniature inverted-repeat transposable element (MITE) in the A. castellanii genome and the MITE in P. salinus (Submariner_Ps1) that has the highest sequence similarity (out of the 30 MITE copies) with the MITE in A. castellanii.

The search for homologs of the P. salinus miniature inverted-repeat transposable element (MITE) flanking sequences in other genomes.

Proximity of P. salinus miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) to annotated P. salinus Gene.

Predicted secondary structure of the hypothetical protein encoded by P. salinus gene Ps_1377, one of the predicted P. salinus open reading frames that includes miniature inverted-repeat transposable element (MITE) sequence. In this example, the first 60 amino acids of the predicted protein are MITE-derived and form three stable secondary structures: one β-strand and two α-helices. Secondary structure prediction was done using PSIPRED.


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