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Verlängern eines kleinen DNA-Fragments

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Gibt es eine Möglichkeit, ein kleines DNA-Fragment, sagen wir 150 bp, zu verlängern, indem man Kopien von sich selbst macht und jede Kopie dieses kleinen Fragments an das Ende dieser 150 bp-Sequenz anhängt?

Zum Beispiel möchte ich ein 1 kbp+ DNA-Fragment, das aus Kopien dieser exakten 150 bp-Sequenz besteht.

Ich führe optische Tests an DNA-Strängen durch, aber das Problem ist, dass die DNA-Fragmente, die ich anvisiere, zu klein sind.

Wenn das DNA-Fragment jedoch nur eine wiederholte Sequenz des DNA-Fragments ist, das ich teste, liefern die Tests die gleichen Ergebnisse. Aus diesem Grund versuche ich, aus nur einem immer wieder kopierten DNA-Fragment einen langen DNA-Strang zu erstellen.

Gibt es ein Verfahren, das ich befolgen kann, um dies zu erreichen?


Wenn Sie versuchen, 1 kbp an sich wiederholenden 150 bp-Sequenzen zu erhalten, ist die Synthese als großer Brocken möglicherweise die bessere Idee. Es kostet ~150-300$, spart aber potenziell jede Menge Zeit. (siehe gBlock von IDT in den USA)

PCR und Ligation mit repetitiven Sequenzen ist schmerzhaft. Es mag stimmen, dass Sie Geld sparen, aber Zeit und Frustration können teurer sein.


Angesichts der Kosten oder der DNA-Synthese könnten Sie wahrscheinlich die beiden Einzelstränge bestellen und sie miteinander verbinden. Bauen Sie zwei überhängende Enden des komplementären Restriktionsenzyms in die Sequenz ein. Konstruieren Sie beispielsweise an einem Ende einen Teil Bam HI Baustelle und auf der anderen Seite Ingenieur a Bgl II Seite? ˅. Diese klebrigen Enden werden anlagern, aber das resultierende Ligationsprodukt kann von keinem der Enzyme geschnitten werden.

Durch abwechselnde Ligations-, Verdauungs- und Ligationszyklen können Sie Konkatemere Ihres Ausgangsfragments aufbauen. Dann können Sie die längeren Stücke gelreinigen und sie in einen entsprechend vorbereiteten Vektor subklonieren.


Ich empfehle dir, es zu versuchen Rekursive direktionale Ligation. Es soll genau das tun, was Sie anstreben, d. h. kurze DNAs in eine längere "polymerisieren". Das Protokoll finden Sie hier http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm015630n


Was ist Klon-für-Klon-Sequenzierung?

Bei der Klon-für-Klon-Sequenzierung wird eine Karte jedes Chromosoms des Genoms erstellt, bevor die DNA in Fragmente aufgespalten wird, die für die Sequenzierung bereit sind.

  • Bei der Klon-für-Klon-Sequenzierung wird das Genom in große Stücke mit einer Länge von 150 Kilobasen (150.000 Basenpaare) zerlegt.
  • Die Position dieser Chunks auf den Chromosomen wird aufgezeichnet (kartiert), um sie nach der Sequenzierung in die richtige Reihenfolge zu bringen.
  • Die Stücke werden dann in bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) eingefügt und in Bakterienzellen zum Wachsen gebracht.
  • Die DNA-Stücke werden jedes Mal kopiert, wenn sich die Bakterien teilen, um viele identische Kopien zu produzieren.
  • Die DNA in den einzelnen Bakterienklonen wird dann in noch kleinere, sich überlappende Fragmente zerlegt. Jedes Fragment ist 500 Basenpaare lang, so dass sie eine überschaubarere Größe für die Sequenzierung haben.
  • Diese Fragmente werden in einen Vektor eingebracht, der eine bekannte DNA-Sequenz besitzt.
  • Die DNA-Fragmente werden dann sequenziert, beginnend mit der bekannten Sequenz des Vektors bis hin zur unbekannten Sequenz der DNA.
  • Nach der Sequenzierung werden die kleinen DNA-Fragmente zusammengefügt, indem Überlappungsbereiche identifiziert werden, um die großen Stücke, die ursprünglich in die BACs eingefügt wurden, neu zu bilden.
  • Diese „Zusammensetzung“ wird von Computern durchgeführt, die Überlappungsbereiche erkennen und die DNA-Sequenz zusammensetzen.
  • Wenn man dann der zu Beginn erstellten Karte folgt, können die großen Brocken als Teil der vollständigen Genomsequenz wieder in die Chromosomen eingebaut werden.
  • Der Klon-für-Klon-Ansatz wurde in den 1980er und 1990er Jahren verwendet, um die Genome des Fadenwurms zu sequenzieren. C. elegans, und die Hefe, S. cerevisiae.
  • Die Klon-für-Klon-Sequenzierung war die bevorzugte Methode während des 2001 abgeschlossenen Humangenomprojekts.

DNA-Replikation in Prokaryoten

Denken Sie daran, dass das prokaryontische Chromosom ein kreisförmiges Molekül mit einer weniger ausgedehnten Wickelstruktur als eukaryontische Chromosomen ist. Das eukaryotische Chromosom ist linear und stark um Proteine ​​gewunden. Obwohl es viele Ähnlichkeiten im DNA-Replikationsprozess gibt, erfordern diese strukturellen Unterschiede einige Unterschiede im DNA-Replikationsprozess dieser beiden Lebensformen.

Die DNA-Replikation ist bei Prokaryonten sehr gut untersucht worden, vor allem wegen der geringen Größe des Genoms und der großen Zahl verfügbarer Varianten. Escherichia coli hat 4,6 Millionen Basenpaare in einem einzigen kreisförmigen Chromosom, und alles wird in ungefähr 42 Minuten repliziert, beginnend von einem einzigen Replikationsursprung und um das Chromosom herum in beide Richtungen. Dies bedeutet, dass pro Sekunde ungefähr 1000 Nukleotide hinzugefügt werden. Der Prozess ist viel schneller als bei Eukaryoten. [link] fasst die Unterschiede zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Replikationen zusammen.

Unterschiede zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Replikationen
Eigentum Prokaryoten Eukaryoten
Ursprung der Replikation Einzel Mehrere
Replikationsrate 1000 Nukleotide/s 50 bis 100 Nukleotide/s
Chromosomenstruktur kreisförmig linear
Telomerase Nicht anwesend Gegenwärtig

Klicken Sie sich durch ein Tutorial zur DNA-Replikation.


Sandweg

Leicht modifiziert von Horton et al. (2006).

Während der DNA-Replikation bildet sich an der Replikationsgabel, an der sich die beiden DNA-Stränge trennen, eine molekulare Maschine, die als Replisom bezeichnet wird. Das Replisom enthält Aktivitäten, die die Stränge trennen und sie für die Synthese durch die Replisomenversion der DNA-Polymerase, in Bakterien DNA-Polymerase III genannt, voneinander trennen. Der Komplex hat zwei verschiebbare Klammern, die den Komplex an die DNA-Stränge binden, sodass die DNA-Replikation hochgradig prozessiv ist.

DNA-Polymerasen katalysieren die Kettenverlängerung ausschließlich in 5&prime &rarr 3&prime-Richtung. Da die beiden DNA-Stränge antiparallel sind, erfolgt die Synthese unter Verwendung eines Matrizenstrangs in der gleichen Richtung wie die Gabelbewegung, aber die Synthese unter Verwendung des anderen Matrizenstrangs erfolgt in der entgegengesetzten Richtung der Gabelbewegung. Der neue Strang, der durch Polymerisation in die gleiche Richtung wie die Gabelbewegung gebildet wird, wird als führender Strang bezeichnet. Der durch Polymerisation in die entgegengesetzte Richtung neu gebildete Strang wird als nacheilender Strang bezeichnet.

Desoxyribonukleinsäure (DNA) Erinnern Sie sich daran, dass das Replisom ein DNA-Polymerase-III-Holoenzym-Dimer mit zwei Kernkomplexen enthält, die die Polymerisation katalysieren können. Einer von ihnen ist für die Synthese des Leitstrangs und der andere für die Synthese des nacheilenden Strangs verantwortlich.

Hier ist ein Video, das den gesamten Prozess zeigt (Quelle unbekannt, bitte kontaktieren Sie mich, wenn Sie wissen, wer dieses Video gemacht hat). Die Details eines der wichtigen Schritte sind unterhalb der Falte dargestellt.

A. Die Synthese von Lagging-String ist diskontinuierlich

Der führende Strang wird als ein kontinuierliches Polynukleotid synthetisiert, beginnend am Ursprung und endend an der Terminationsstelle. Im Gegensatz dazu wird der nacheilende Strang diskontinuierlich in kurzen Stücken in der entgegengesetzten Richtung der Gabelbewegung synthetisiert. Diese nacheilenden Strangstücke werden dann durch eine separate Reaktion verbunden.

Die kurzen Stücke der nacheilenden DNA werden zu Ehren ihres Entdeckers Reiji Okazaki Okazaki-Fragmente genannt. Der Gesamtmechanismus der DNA-Replikation wird als semidiskontinuierlich bezeichnet, um die unterschiedlichen Mechanismen für die Replikation jedes Strangs hervorzuheben.

B. Jedes Okazaki-Fragment beginnt mit einem RNA-Primer

Es ist klar, dass die Synthese des nachlaufenden Strangs diskontinuierlich ist, aber es ist nicht offensichtlich, wie die Synthese jedes Okazaki-Fragments initiiert wird. Das Problem ist, dass keine DNA-Polymerase mit der Polymerisation beginnen kann de novo es kann nur bestehenden Polymeren Nukleotide hinzufügen. Diese Einschränkung stellt keine Schwierigkeit für die Leitstrangsynthese dar, da, sobald die DNA-Synthese im Gange ist, Nukleotide kontinuierlich zu einer wachsenden Kette hinzugefügt werden. Auf dem nacheilenden Strang erfordert die Synthese jedes Okazaki-Fragments jedoch ein neues Initiationsereignis. Dies wird erreicht, indem kurze RNA-Stücke an der Replikationsgabel hergestellt werden. Diese RNA-Primer sind komplementär zur Matrize des nacheilenden Strangs. Jeder Primer wird von seinem 3&prime-Ende durch DNA-Polymerase I verlängert, um ein Okazaki-Fragment zu bilden, wie in der Figur gezeigt. (Die Synthese des Leitstrangs beginnt ebenfalls mit einem RNA-Primer, aber es ist nur ein Primer erforderlich, um die Synthese des gesamten Strangs einzuleiten.)

Durch die Verwendung kurzer RNA-Primer wird die Einschränkung umgangen, die der Mechanismus der DNA-Polymerase auferlegt, nämlich, dass sie die DNA-Synthese nicht initiieren kann de novo. Die Primer werden von einem DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Enzym namens Primase synthetisiert dnaG-Gen in E coli. Die dreidimensionale Kristallstruktur der katalytischen Domäne von DnaG zeigte, dass sich ihre Faltung und ihr aktives Zentrum von den gut untersuchten Polymerasen unterscheiden, was darauf hindeutet, dass sie einen neuen Enzymmechanismus verwenden könnte. Primase ist Teil eines größeren Komplexes namens Primosom, der neben Primase viele andere Polypeptide enthält. Das Primosom ist zusammen mit der DNA-Polymerase III Teil des Replisoms.

Mit fortschreitender Replikationsgabel wird die elterliche DNA abgewickelt und immer mehr einzelsträngige DNA wird freigelegt. Ungefähr einmal pro Sekunde katalysiert Primase die Synthese eines kurzen RNA-Primers unter Verwendung dieser einzelsträngigen DNA als Matrize. Die Primer sind nur wenige Nukleotide lang. Da die Replikationsgabel mit einer Geschwindigkeit von etwa 1000 Nukleotiden pro Sekunde vorrückt, wird ein Primer für etwa alle 1000 eingebauten Nukleotide synthetisiert. DNA-Polymerase III katalysiert die Synthese von DNA in der 5&prime &rarr 3&prime-Richtung durch Verlängerung jedes kurzen RNA-Primers.

C. Okazaki-Fragmente werden durch die Wirkung von DNA-Polymerase I und DNA-Ligase verbunden

Okazaki-Fragmente werden schließlich zu einem kontinuierlichen DNA-Strang verbunden. Die Reaktion verläuft in drei Schritten: Entfernung des RNA-Primers, Synthese von Ersatz-DNA und Versiegelung der angrenzenden DNA-Fragmente. Die Schritte werden durch die kombinierte Wirkung von DNA-Polymerase I und DNA-Ligase ausgeführt.

DNA-Polymerase I von E coli wurde vor etwa 45 Jahren von Arthur Kornberg entdeckt. Es war das erste gefundene Enzym, das die DNA-Synthese mit Hilfe eines Matrizenstrangs katalysieren konnte. In einem einzelnen Polypeptid enthält DNA-Polymerase I die Aktivitäten, die im DNA-Polymerase III-Holoenzym gefunden werden: 5&prime &rarr 3&prime Polymeraseaktivität und 3&prime &rarr 5&prime Korrekturlesende Exonukleaseaktivität. Darüber hinaus weist DNA-Polymerase I eine 5&prime &rarr 3&prime-Exonuklease-Aktivität auf, eine Aktivität, die in der DNA-Polymerase III nicht gefunden wird.

DNA-Polymerase I kann mit bestimmten proteolytischen Enzymen gespalten werden, um ein kleines Fragment zu erzeugen, das die 5&prime &rarr 3&prime-Exonukleaseaktivität enthält, und ein größeres Fragment, das die Polymerisations- und Korrekturleseaktivitäten beibehält. Das größere Fragment besteht aus den C-terminalen 605 Aminosäureresten und das kleinere Fragment enthält die verbleibenden N-terminalen 323 Reste. Das große Fragment, bekannt als Klenow-Fragment, wird häufig für die DNA-Sequenzierung und viele andere Techniken verwendet, die eine DNA-Synthese ohne 5&prime &rarr 3&prime-Abbau erfordern. Darüber hinaus verwenden viele Studien zu den Mechanismen der DNA-Synthese und des Korrekturlesens das Klenow-Fragment als Modell für kompliziertere DNA-Polymerasen.

Die Abbildung (rechts) zeigt die Struktur des Klenow-Fragments, das mit einem DNA-Fragment komplexiert ist, das ein fehlgepaartes terminales Basenpaar enthält. Das 3&prime-Ende des naszierenden Strangs ist an der 3&prime &rarr 5&prime-Exonukleasestelle des Enzyms positioniert. Während der Polymerisation besetzt der Matrizenstrang die Furche am oberen Ende der Struktur und mindestens 10 bp doppelsträngiger DNA werden durch das Enzym gebunden, wie in der Abbildung gezeigt. Viele der Aminosäurereste, die an der DNA-Bindung beteiligt sind, sind in allen DNA-Polymerasen ähnlich, obwohl die Enzyme ansonsten in dreidimensionaler Struktur und Aminosäuresequenz ziemlich unterschiedlich sein können.

Die einzigartige 5&prime &rarr 3&prime Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase I entfernt den RNA-Primer am Anfang jedes Okazaki-Fragments. (Da sie nicht Teil des Klenow-Fragments ist, ist die 5&prime &rarr 3&prime-Exonuklease in der obigen Abbildung nicht gezeigt, aber sie würde sich oben in der Struktur neben der Furche befinden, die den Matrizenstrang beherbergt.) Als Primer entfernt wird, synthetisiert die Polymerase DNA, um die Region zwischen Okazaki-Fragmenten zu füllen, ein Vorgang, der als Nick-Translation bezeichnet wird (siehe Abbildung unten). Bei der Nick-Translation erkennt die DNA-Polymerase I die DNA-Kette und bindet daran. Auf diese Weise bewegt das Enzym die Kerbe entlang des nacheilenden Strangs. Nach Abschluss von 10 oder 12 Hydrolyse- und Polymerisationszyklen dissoziiert die DNA-Polymerase I von der DNA und hinterlässt zwei Okazaki-Fragmente, die durch eine Kerbe im Phosphodiester-Rückgrat getrennt sind. Die Entfernung von RNA-Primern durch
DNA-Polymerase I ist ein wesentlicher Bestandteil der DNA-Replikation, da das Endprodukt vollständig aus doppelsträngiger DNA bestehen muss.





Der letzte Schritt bei der Synthese des nacheilenden DNA-Strangs ist die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen der 3&prime-Hydroxylgruppe am Ende eines Okazaki-Fragments und der 5&prime-Phosphatgruppe eines benachbarten Okazaki-Fragments. Dieser Schritt wird durch DNA-Ligase katalysiert. Die DNA-Ligasen in eukaryontischen Zellen und in Bakteriophagen-infizierten Zellen benötigen ATP als Cosubstrat. Im Gegensatz, E coli DNA-Ligase verwendet NAD + als Cosubstrat. NAD + ist die Quelle der Nukleotidylgruppe, die zuerst auf das Enzym und dann auf die DNA übertragen wird, um ein ADP-DNA-Zwischenprodukt zu erzeugen.

[©Laurence A. Moran und Pearson/Prentice Hall]


Neu gefundenes Phalanx-Fragment zeigt Denisova-Menschen näher an modernen Menschen als Neandertaler

Die genomische Sequenzierung einer außergewöhnlich gut erhaltenen DNA in einem Phalangealfragment aus der Denisova-Höhle (Sibirien) im Jahr 2010 ergab, dass sie zu einem Angehörigen einer bisher unbekannten menschlichen Population gehörte, den Denisova-Menschen, die eng mit den Neandertalern verwandt waren[1].

Da jedoch nur wenige Denisova-Knochen gefunden wurden, bleibt die Morphologie dieser Hominine ungewiss. Nun hat ein Team von Wissenschaftlern des Institut Jacques Monod (CNRS / Universitéeacute de Paris) ein weiteres in der Denisova-Höhle gefundenes Fragment vermessen und fotografiert. Die Genomanalyse zeigt, dass es sich um das fehlende Stück derselben Phalanx handelt, dessen proximales Fragment eine anfängliche Sequenzierung des Denisovan-Genoms ermöglichte.

Gemeinsam mit Kollegen des PACEA-Labors (CNRS / Universität Bordeaux / französisches Kulturministerium) und der Universität Toronto (Kanada) verglichen die Wissenschaftler das neue Fragment mit den Phalangen von Neandertalern und anatomisch modernen Menschen. Ihre Analyse zeigt, dass es dem letzteren sehr nahe kommt und weniger dem ersteren ähnelt.

Diese strukturelle Ähnlichkeit erstreckt sich jedoch nicht auf die Molaren und den Unterkiefer auf dem tibetischen Plateau[2], die eher archaische Merkmale aufweisen. Die Forscher sind fasziniert von dem morphologischen Mosaik von Denisova und suchen nach neuen Skelettresten, um diese "dritte" menschliche Gruppe besser zu charakterisieren.

Ihre Ergebnisse werden veröffentlicht in Wissenschaftliche Fortschritte (4. September 2019).

[1] J. Krause et al., Das komplette mitochondriale DNA-Genom eines unbekannten Hominins aus Südsibirien. Natur 464, 894-897 (2010). D. Reich et al., Genetische Geschichte einer archaischen Hominin-Gruppe aus der Denisova-Höhle in Sibirien. Natur 468, 1053-1060 (2010). M. Meyer et al., Eine Genomsequenz mit hoher Abdeckung von einem archaischen Denisova-Individuum. Wissenschaft 338, 222-226 (2012).

[2] D. Reich et al., Genetische Geschichte einer archaischen Hominin-Gruppe aus der Denisova-Höhle in Sibirien. Natur 468, 1053-1060 (2010). V. Slon et al., Das Genom der Nachkommen einer Neandertaler-Mutter und eines Denisova-Vaters. Natur 561, 113-116 (2018). S. Sawyer et al., Nukleare und mitochondriale DNA-Sequenzen von zwei Denisova-Individuen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 15696-15700 (2015). F. Chen et al., Ein Denisova-Unterkiefer aus dem späten Mittelpleistozän vom tibetischen Plateau. Natur, (2019).


Okazaki-Fragmente

Der Prozess von DNA Replikation beinhaltet die Trennung der beiden Stränge der DNA Doppelhelix, die an einem sich bewegenden Ort auftritt, der als a . bekannt ist Replikationsgabel. Das Ergebnis ist eine kontinuierliche Trennung von Strängen, von denen nur einer als kontinuierlich Vorlage. Der andere Strang muss zwar ebenfalls kontinuierlich zur Verfügung gestellt werden, muss aber in Richtung weg von der Replikationsgabel.

Dieser Vorgang führt zu a Nachlaufstrang Vorlage das ist ständig wird zur Verfügung gestellt, kann aber nicht verwendet werden, bis genügend Vorlage zur Verfügung gestellt wurde, die eine weitere Runde von . einleitet DNA Replikation auf diesem Strang lohnt sich. Die resultierende Strecke von neu synthetisiert DNA das ist damit verbunden nacheilender Strang oder diskontinuierlicher Strang wird als Okazaki-Fragment bezeichnet.

Okazaki-Fragmente, wie bei DNA Replikation im Allgemeinen erfordert RNA-Priming, das als Beginn eines Okazaki-Fragments dient. Diese RNA-Primer werden anschließend entfernt von DNA-Polymerase am Ende des Okazaki-Fragments Polymerisation (d. h., Grundierung Entfernung vom vorherigen Okazaki-Fragment in Verbindung mit Abschluss der aktuellen Okazaki-Fragment). Die vollständigen, aber noch getrennten Okazaki-Fragmente werden dann zu einem einzigen Strang von DNA über die Enzym, DNA-Ligase.

Eine Möglichkeit, die Konzepte von . zu betrachten kontinuierlich gegen diskontinuierlich Reproduzieren von DNA ist in Bezug auf das Erhalten von Band aus einer Bandrolle. Manchmal benötigen Sie viel Klebeband und können das Klebeband abrollen, während Sie das Klebeband anbringen. In diesem Fall wird das Klebeband im Wesentlichen so schnell aufgebracht wie es abgerollt wird und wird abgerollt so schnell wie es aufgebracht wird, wobei jedoch jeder Vorgang an etwas anderen Stellen abläuft.

Im Gegensatz dazu, wie verwendet man typischerweise kleinere Klebebandstücke, dh Klebebandfragmente? Hier besteht die Tendenz, das Klebeband nicht beim Abrollen anzubringen, sondern nur so viel Klebeband zu entfernen, wie man denkt, und dann diese Klebestreifen einzeln anzubringen. In diesem Fall finden das Abrollen und die Anwendung nicht gleichzeitig statt. Wenn Sie außerdem mehrere kleine Klebebandstücke benötigen, ist der Klebeprozess buchstäblich diskontinuierlich, d. h. in mehrere einzelne Schritte aufgeteilt, anstatt in einem großen, langen Schritt zu erfolgen.


Zelltod und DNA-Schäden, die durch das Tet-On-regulierende HSV-tk/GCV-Suizidgensystem in MCF-7-Zellen verursacht werden

Ganciclovir (GCV) beeinflusst den molekularen Mechanismus des Zelltods und der DNA-Schädigung durch das rAAV (rekombinantes Adeno-assoziierte Virus) vermittelte Tet-On/HSV-tk/GCV-Suizidgensystem in der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7. Ein rAAV/TRE/Tet-On/HSV-tk, das ein Tet-On-regulierendes System und ein Suizidgen HSV-tk kombiniert, wurde verwendet, um die menschliche Brustkrebszelllinie MCF-7 zu transfizieren, und therapeutische Wirkungen auf dieses System wurden untersucht. Anschließend haben wir RT-PCR, Western Blotting und einen modifizierten Comet-Assay verwendet, um den potenziellen Mechanismus des HSV-tk/GCV-Suizidgensystems bei Brustkrebsbehandlungen zu untersuchen. Der MTT-Assay hat gezeigt, dass die Zellzahl der GCV+rAAV+Dox-Gruppe im Vergleich zu anderen Gruppen nach der Behandlung signifikant verringert war und die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass es in dieser Gruppe eine erhebliche Zunahme der S-Phase-Zellen gab, was bedeutet, dass die HSV- Das tk/GCV-Suizidgensystem arbeitet wahrscheinlich auf den Zellzyklus. RT-PCR wies das Expressionsniveau von p21 erhöht nach und PCNA hatte einen gegenteiligen Trend. Western Blotting zeigte eine erhöhte Proteinexpression von p21 und p53 und eine Abnahme von PCNA, CDK1, Cyclin B in der GCV+rAAV+Dox-Gruppe. Der modifizierte Comet-Assay zeigte, dass die sehr kleinen zusätzlichen Fragmente, die durch die GCV+rAAV+Dox-Gruppenbehandlung erzeugt wurden, als kleine Wolke sichtbar sind, die sich vom Kometen in Richtung Elektrophorese erstreckt. Der therapeutische Mechanismus des HSV-tk/GCV-Suizidgensystems auf der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 besteht wahrscheinlich darin, dass die Expression von p21 über einen p53-abhängigen Signalweg für DNA-Schäden hochreguliert wird, was zu einer Abnahme der Proteinexpression von PCNA, Cyclin B, CDK1 in MCF-7-Zellen und Förderung des Zellzyklusarrests in der G1/S-Phase. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das HSV-tk/GCV-Suizidgensystem den Tod von MCF-7-Zellen durch Blockierung des Zellzyklus und DNA-Schäden verursacht.

Schlüsselwörter: Ganciclovir HSV-tk Humaner Brustkrebs Selbstmordgensystem.


Die Identifizierung und Analyse von Genen und Genprodukten

Restriktionsenzyme (um die DNA zu schneiden) und Gelelektrophorese (um die resultierenden Fragmente zu trennen) können verwendet werden, um eine physikalische Karte von DNA-Segmenten in einem Verfahren zu erstellen, das als . bekannt ist Restriktionszuordnung.

Es gibt auch eine Reihe von Techniken, die verwendet werden können, um bestimmte Gene oder Genprodukte innerhalb einer Genbibliothek zu identifizieren: Southern-Blotting weist das Vorhandensein bestimmter Nukleotidsequenzen in einer Sammlung von DNA-Fragmenten mit einer DNA-Sonde nach - einem DNA-Abschnitt, der mit Radioaktivität oder chemischer Fluoreszenz markiert wurde Northern-Blotting untersucht die Gentranskription durch Identifizierung spezifischer RNA-Sequenzen mit markierten DNA-Sonden und Western-Blotting weist spezifische Proteine ​​mit markierten Antikörpern nach.

Die leistungsstärkste experimentelle Technik zur Untersuchung der Genetik auf molekularer Ebene ist jedoch DNA-Sequenzierung, die die Bestimmung der Nukleotidsequenzen von Genen – sogar ganzer Chromosomen – ermöglicht. Ähnliche Techniken stehen zur Analyse der Nukleotidsequenzen von RNA-Molekülen und der Aminosäuresequenzen von Proteinen zur Verfügung. Automatisierte Sequenzierungstechnologien ermöglichen es uns nun, das gesamte Genom von Organismen von Bakterien bis hin zu Menschen zu sequenzieren.


Schrotflinten-Sequenzierung und Montage

Der Vorgang, durch den Wissenschaftler die DNA-Sequenz eines Organismus entschlüsseln, wird als Sequenzierung bezeichnet. 1975 entwickelte Frederick Sanger die grundlegende Sequenzierungstechnologie, die noch heute weit verbreitet ist. Obwohl diese Technologie in den letzten 30 Jahren kontinuierlich verbessert wurde, können wir nur zwischen 1.000 und 2.000 Basenpaare DNA gleichzeitig entschlüsseln – eine erhebliche Einschränkung, da selbst die einfachsten Viren Zehntausende von Basenpaaren enthalten, Bakterien enthalten Millionen, und Säugetiergenome enthalten Milliarden von Basenpaaren. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben Wissenschaftler eine Technik namens Shotgun-Sequenzierung entwickelt, bei der die DNA-Sequenz eines Organismus in eine große Anzahl kleiner Fragmente zerlegt wird (Abbildung 1), die Enden der Fragmente werden sequenziert (Abbildung 2) und dann die resultierenden Sequenzen werden mit einem Computerprogramm namens Assembler zusammengefügt (Abbildung 3).

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Abbildung 1. Original-DNA wird in eine Sammlung von Fragmenten zerlegt

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Abbildung 2. Die Enden jedes Fragments (grün gezeichnet) sind sequenziert

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Abbildung 3. Die Sequenzlesevorgänge werden basierend auf Sequenzähnlichkeiten zusammengebaut


Tragen Sie Neandertaler-DNA? Die Form Ihres Schädels kann verraten.

Die Form Ihres Gehirns kann viel über den Neandertaler in Ihnen aussagen. Neue Forschungen haben ergeben, dass moderne Menschen, die bestimmte genetische Fragmente unserer nächsten ausgestorbenen Verwandten tragen, möglicherweise mehr längliche Gehirne und Schädel haben als andere Menschen.

Der moderne Mensch besitzt einzigartige, relativ kugelförmige Schädel und Gehirne. Im Gegensatz dazu haben die nächsten ausgestorbenen Verwandten des modernen Menschen, die Neandertaler, die länglichen Schädel und Gehirne, die für die meisten Primaten typisch sind.

Frühere Forschungen hatten vorgeschlagen, dass diese kontrastierenden Schädelformen Unterschiede in der Größe verschiedener Gehirnregionen bei modernen Menschen und Neandertalern widerspiegeln könnten und wie diese Gehirnbereiche miteinander verbunden waren. "Denn Gehirngewebe versteinert jedoch nicht, sodass die zugrunde liegende Biologie schwer fassbar geblieben ist", sagte Philipp Gunz, Co-Leiter der Studie, Paläoanthropologe am Max-Planck-Institut für evolutionäre Anthropologie in Leipzig, gegenüber Live Science. [3D-Bilder: Das menschliche Gehirn erforschen]

Um dieses Rätsel zu lösen, machten die Wissenschaftler zunächst CT-Scans (Computertomographie) von sieben fossilen Neandertalerschädeln und 19 modernen menschlichen Schädeln. Sie entwickelten Abdrücke des Inneren der Hirnhäute der Schädel und maßen deren Rundheit.

Als nächstes analysierten die Forscher fast 4.500 moderne Menschen, für die sie sowohl genetische Daten als auch Magnetresonanztomographie (MRT)-Scans ihres Gehirns hatten.

„Wir kamen zu dem Schluss, dass wir, wenn wir spezifische Neandertaler-DNA-Fragmente in einer ausreichend großen Probe lebender Menschen identifizieren könnten, in der Lage wären zu testen, ob eines dieser Fragmente in Richtung einer weniger kugelförmigen Gehirnform drängt, was es uns ermöglicht, auf Gene zu zoomen, die möglicherweise wichtig für dieses Merkmal", sagte der leitende Studienautor Simon Fisher, Neurogenetiker am Max-Planck-Institut für Psycholinguistik in Nijmegen, den Niederlanden, gegenüber Live Science.

Frühere Arbeiten ergaben, dass moderne Menschen und Neandertaler mehrere Episoden der Vermischung erlebten, wodurch Neandertaler-DNA in das moderne menschliche Genom eingeführt wurde. In der neuen Studie entdeckten die Wissenschaftler, dass Neandertaler-DNA-Fragmente in den modernen menschlichen Chromosomen 1 und 18 mit weniger runden Gehirnen verbunden waren.

"Die Auswirkungen des Tragens dieser seltenen Neandertaler-Fragmente sind subtil", sagte Fisher. "Die Auswirkungen der Neandertaler-Genvarianten sind gering, man könnte sie nicht in der Kopfform eines Menschen sehen, wenn man sie trifft."

Die Neandertaler-DNA-Fragmente enthielten zwei Gene, die früher mit der Gehirnentwicklung in Verbindung gebracht wurden. Einer, UBR4, ist mit der Bildung von Neuronen verbunden, und der andere, PHLPP1, ist mit der Entwicklung einer fettigen Isolierung um Nervenzellen herum verbunden.

Die Forscher fanden heraus, dass diese Neandertaler-DNA die stärksten Auswirkungen auf Gehirnstrukturen hat, die als Putamen und Kleinhirn bekannt sind und beide Schlüssel für die Vorbereitung, das Erlernen und die Koordination von Bewegungen sind. Das Putamen bildet den äußeren Teil der Basalganglien des Gehirns, die mit Gedächtnis, Aufmerksamkeit, Planung, dem Erlernen von Fähigkeiten und möglicherweise Sprache und Sprache verbunden sind.

Die Wissenschaftler stellten fest, dass wenn eine Person mehr Neandertaler-DNA als der Durchschnitt hat, dies nicht unbedingt bedeutet, dass ihr Gehirn länglicher ist. "Zwei Menschen, die sehr ähnliche Gesamtmengen an Neandertaler-DNA haben - zum Beispiel 1 Prozent ihres Genoms - können durchaus unterschiedliche Fragmente tragen", sagte Fisher.

Die Forscher stellten auch fest, dass diese Schädelunterschiede wahrscheinlich keine Unterschiede zum Zeitpunkt der Geburt eines Säuglings widerspiegeln: Moderne Menschen und Neandertaler haben zu dieser Zeit ähnliche Gehirngehäuse- und Schädelformen, sagte Gunz. Nach der Geburt führten Unterschiede in der Gehirnentwicklung wahrscheinlich zu den ausgeprägten Unterschieden, die in der Schädelform zwischen Erwachsenen der beiden Abstammungslinien gefunden werden, fügte er hinzu.

Zukünftige Forschung kann nach mehr Neandertaler-DNA suchen, die mit modernen menschlichen Gehirnen verbunden ist, und bestimmen, welche spezifischen Auswirkungen diese alten genetischen Varianten haben könnten, indem Gehirngewebe mit Neandertaler-DNA im Labor gezüchtet wird, sagte Fisher.

Die Wissenschaftler haben ihre Ergebnisse am 13. Dezember online in der Zeitschrift Current Biology detailliert beschrieben.


Figur 2

Abbildung 2. Strukturen des niedermolekularen Liganden 1, das ausgewählte Peptid 2, und der bivalente Inhibitor 3.

Als nächstes wird eine Bibliothek kleiner zyklischer Peptide durch Phagen-Display synthetisiert (6). Diese Bibliothek ist an die Zipper-Domäne des Proteins Fos angehängt, das mit Jun ein Heterodimer bilden kann. Die an Fos gebundenen Peptide können in sechs Positionen variieren, flankiert von zwei Cysteinresten, die ein Disulfid bilden können, das Peptid cyclisieren und von die Zipper-Domäne von Fos durch einen Spacer, der aus mehreren zusätzlichen Aminosäuren besteht. Die sechs variablen Positionen können jede der gängigen Aminosäuren aufnehmen, und Ghosh und Kollegen konstruierten eine Bibliothek mit >1 Milliarden Mitgliedern, die die Größe jeder Sammlung kleiner Moleküle bei weitem überstieg. Wenn Fos und Jun zusammenkommen, befinden sich die zyklischen Peptide in unmittelbarer Nähe zu den niedermolekularen ATP-Analoga, und die Konjugate, die noch an Phagen gebunden sind, können gegen die Zielkinase gescreent werden.

Eine Charge von niedermolekular-konjugiertem Jun wurde mit der Fos-Bibliothek gemischt und immobilisierter cAMP-abhängiger Proteinkinase A (PKA), einer gut charakterisierten Kinase, ausgesetzt. Nachdem ungebundene Phagen weggespült wurden, wurden gebundene Phagen eluiert und amplifiziert und der Vorgang wurde für mehrere Zyklen wiederholt. Im Fall der AdoC-derivatisierten Jun-Bibliotheken lieferte das Verfahren trotz Vorsichtsmaßnahmen nur Peptide, die an die PKA-haltige Matrix banden. Bei der Selektion mit Staurosporin-konjugiertem Jun entdeckten die Forscher jedoch nach sechs Selektionsrunden eine Reihe von Peptiden. Am häufigsten war CTFRVRFGC (Verbindung 2, Figur 2). Von Bedeutung ist, dass die Affinität des identifizierten Peptids wahrscheinlich zu gering ist, um ohne die Hilfe des Staurosporin-konjugierten Jun.

Die Forscher synthetisierten dieses zyklische Peptid und testeten seine Affinität zusammen mit dem zur Selektion verwendeten Staurosporin-Derivat (Abbildung 2). Anschließend synthetisierten sie einen bivalenten Inhibitor, der aus den beiden Molekülen besteht, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Glücklicherweise ist das zweiwertige Molekül 3 hat eine höhere Potenz als eine der beiden Komponenten, mit einem IC50 von 2,6 nM im Vergleich zu 243 nM für das Staurosporin-Derivat 1 (oder 78 nM für das Jun-Staurosporin-Konjugat) und 57 µM für das zyklische Peptid 2. Darüber hinaus ist der bivalente Inhibitor gegen fünf verschiedene Kinasen viel weniger aktiv als gegen PKA. Obwohl fünf Kinasen einen sehr kleinen Teil des Kinoms darstellen, ist dies dennoch ein ermutigender Anfang.

Ein konzeptioneller Präzedenzfall für diese Arbeit ist die Schaffung von Bisubstrat-Analoga-Inhibitoren, bei denen ein ATP-Mimetikum an ein von einem Kinase-Substrat abgeleitetes Peptid angehängt wird (7-9). Eine Stärke der neuen Technik besteht darin, dass nichts über die Struktur der Kinase oder über ihr bevorzugtes Substrat bekannt sein muss, da das Peptid empirisch durch Phagen-Display selektiert wird. Tatsächlich ist im aktuellen Beispiel nicht klar, wo auf der PKA das ausgewählte zyklische Peptid bindet, und die Beobachtung, dass keines der ausgewählten Peptide eine Sequenzidentität mit bekannten physiologischen Substraten aufweist, legt nahe, dass sie außerhalb der Substratbindungsstelle binden können (2) . Obwohl von den Autoren nicht erwähnt, ist ein weiterer Präzedenzfall das Konzept selbstorganisierender chemischer Bibliotheken, bei denen kleine Molekülfragmente an DNA angehängt werden. Kleine Moleküle, die ein Zielprotein binden, können durch ihre DNA-Tags identifiziert und anschließend miteinander verbunden werden (10). In einigen Formaten kann diese Technik auf Bibliotheken zurückgreifen, die in ihrer Größe mit denen vergleichbar sind, die durch Phagen-Display erreicht werden (11). Schließlich beginnt Tethering with Extenders auch mit einem Fragment, von dem bereits bekannt ist, dass es an ein Protein bindet. Ein kovalenter Linker (wie eine Disulfidbindung) an diesem Fragment wird verwendet, um ein weiteres Fragment einzufangen, wodurch sowohl ein zweites Fragment mit Affinität für das Ziel gefunden als auch die Konnektivität zwischen den beiden Fragmenten hergestellt wird (12).

Wie bei jedem Machbarkeitsnachweis gibt es auch bei der aktuellen Studie Einschränkungen. Erstens sind die beteiligten Moleküle zu groß, um als Fragmente angesehen zu werden, obwohl sie von der Entdeckung fragmentbasierter Liganden inspiriert sind. Das identifizierte Peptid 2 hat ein Molekulargewicht von 986,17, fast das Doppelte des von Lipinski . empfohlenen et al. für ein orales Medikament (13). Sogar das succinoylierte Staurosporin-Derivat 1 hat ein Molekulargewicht von 566,6, das größer ist als die meisten der klinisch zugelassenen Kinasehemmer wie Imatinib (Molekulargewicht 493,6), Erlotinib (Molekulargewicht 393,4), Sunitinib (Molekulargewicht 398,5), Dasatinib (Molekulargewicht 488,0) und Sorafenib (Molekulargewicht 464,8).

Eine zweite Komplikation ist der Linker, der 30 Å lang ist. Die Vorteile der Fragmentanordnung werden durch die entropischen Kosten des Einfrierens drehbarer Bindungen in Linkern zunichte gemacht, daher sollte der Linker idealerweise so kurz wie möglich sein (14). Die zweiwertige Verbindung 3 bindet an PKA mit geringer nanomolarer Affinität, was beeindruckend ist. Wäre der Linker jedoch idealer, wären die Bindungsenergien der beiden Komponenten 1 und 2 sollte grob additiv sein, was einen Inhibitor mit einer Wirksamkeit im niedrigen pikomolaren Bereich ergeben würde.

Im aktuellen Beispiel ist die Bindungsstelle des cyclischen Peptids unbekannt, daher wählten die Autoren einen langen Linker, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass beide Teile des bivalenten Inhibitors produktiv binden können. Hoffentlich würde ein besseres Verständnis des Bindungsmodus es zukünftigen Verbindungen ermöglichen, einen kürzeren Linker zu haben. There is, however, a darker possibility: Perhaps the cyclic peptide binds far away from the ATP-binding site. Indeed, the geometry of the Fos-Jun dimer could very well prefer compounds that bind at some distance from one another. The α-carbons at the end of the zipper region are >10 Å apart (15), and with three or more amino acids as spacers between the ends of the proteins and the small molecules, the binding sites could be >40 Å apart from one another (2).

Finally, given the very nature of the phage-display methodology employed, one of the components must be a peptide. While the number of peptide drugs is increasing (6), peptides often suffer from poor absorption, distribution, metabolism, excretion, and pharmacokinetic properties. Indeed, the low cell permeability of most peptides suggests that they are unlikely to be broadly effective against intracellular targets, and most kinases are intracellular.

Thus, the technique may prove more useful with extracellular targets, of which there are an abundance of intriguing choices. For example, it has potential to target protein–protein interactions. Small-molecule ligands are known for the cytokine interleukin-2, which is involved in T-cell proliferation, and such ligands could serve the same function as the staurosporine derivative served for PKA (16, 17). Moreover, in theory one need not even be limited to small-molecule ligands. One intriguing approach might be to start with a small-molecule ligand attached to Jun, use the technique to a identify a peptide ligand, and then apply the technique again, this time using the newly identified peptide as the known binder to find a second peptide ligand that could be linked to the first to yield a fully peptidic bivalent inhibitor. Whatever the direction, it is likely that the marriage of phage display with concepts from fragment-based ligand discovery will produce many exciting discoveries.


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