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Warum wird ACE2 nicht als Medikament gegen Covid verwendet?

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Kann ACE2 hergestellt und als Medikament gegen Covid verwendet werden? Ich habe gelesen, dass es das Rezeptormolekül ist. Wenn es im Organismus ist, soll das Virus daran binden und könnte keine Zellen mehr angreifen? Ist das richtig?


Da ist ein Zelle Vordruck von Monteil et al. (DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.004), die argumentiert, dass das humane rekombinante lösliche ACE2-Protein kompetitiv an das SARS-CoV-2-Virus binden und seine Fähigkeit zur Infektion und Replikation reduzieren kann:

Hier berichten wir, dass humanes rekombinantes lösliches ACE2 (hrsACE2) in klinischer Qualität, das bereits in klinischen Studien der Phase 1 und 2 getestet wurde (Haschke et al., 2013, Khan et al., 2017), das Viruswachstum in Vero E6 Zellen um den Faktor 1.000-5.000. Darüber hinaus zeigen wir, dass menschliche Blutgefäßorganoide und Nierenorganoide leicht infiziert werden können, was durch hrsACE2 im frühen Stadium der Infektion signifikant gehemmt werden kann.

Obwohl es nicht perfekt ist, können andere Faktoren und Rezeptoren an der Infektiosität beteiligt sein:

Unsere Daten zeigen nun, dass dieses humane ACE2-Molekül von klinischer Qualität – aber nicht lösliches ACE2-Maus – SARS-CoV-2-Infektionen signifikant hemmen und die Viruslast um den Faktor 1.000-5.000 reduzieren kann. Wie in Antikörper-Neutralisierungsexperimenten vieler Viren beobachtet wurde, ist die Hemmung jedoch nicht vollständig, wenn auch eindeutig dosisabhängig. Dies könnte daran liegen, dass es andere Korezeptoren/Hilfsproteine ​​oder sogar andere Mechanismen geben könnte, über die Viren in Zellen eindringen können, wie dies ursprünglich für SARS vorgeschlagen wurde (Jeffers et al., 2004; Qi et al., 2020). ).

Eine Person hat Recht zu kommentieren, dass dies in vitro Studien. Mit anderen Worten, sie behandeln Zellkulturen auf dem funktionellen Äquivalent einer Petrischale: Vero-Zelllinien oder Simulationen von menschlichem Gewebe (Organoiden) und sehen, was passiert.

Die in vitro Studien sind nützlich und wichtig, aber es ist ein großer Schritt von denen zur 1) Behandlung von Menschen in vivo - Entwicklung eines Medikaments, das das Virus tatsächlich und sicher dort angreifen kann, wo es Atemwegs- und Nierengewebe infiziert - und 2) dieses Medikament in großen Mengen, billig, sicher usw. herstellen und verteilen.

Aber der größere Punkt dieser Studien besteht darin, zu zeigen, dass Wissenschaftler definitiv über die Mechanismen nachdenken, mit denen das Virus Zellen infiziert, und zu sehen, ob es Möglichkeiten gibt, das Virus auf diese Weise zu stören und einzuschränken.

Wie Ihr Gedanke, ACE2 zu verwenden, haben einige Forscher andere Viren wie Poliovirus und HIV untersucht, um zu sehen, ob es ähnliche lösliche Liganden gibt, die sie an Antikörper binden und sicher an den Menschen abgeben können, als allgemeine therapeutische Idee.

Sie fanden heraus, dass HIV-1, das die Bindung an den CD4-Rezeptor verwendet, um T-Zellen zu infizieren, eine Mutationsresistenz gegen lösliches CD4 entwickeln und andere Mechanismen nutzen könnte, um eine Infektion zu verursachen. Durch Hinzufügen eines zweiten Rezeptors CCR5 zum Immunglobulin konnten andere Forscher jedoch die Fähigkeit des HIV-1-Virus einschränken, eine Resistenz gegen beide Rezeptoren zu entwickeln, was eine gewisse Möglichkeit für diesen Ansatz als Impfstoff bietet.

All diese Probleme erschweren die Verwendung von Rezeptoren, um das Virus "auszublenden". Aber es ist ein Weg, der erforscht wird, insbesondere für dieses Virus in einer Notsituation.


Wissenschaftler suchen nach Antworten auf Hypertonie – COVID-19 Link

BOSTON – In der Welt von Ralph Baric, PhD, ist nicht viel Zufall.

Also wurde er munter, als er sah, dass SARS-CoV-2, das Virus, das die COVID-19-Krankheit verursacht, über ACE2-Rezeptoren in die Lunge gelangt und dass Menschen mit Bluthochdruck schlechtere Ergebnisse haben als diejenigen mit jeder anderen Grunderkrankung.

„Ich dachte schon seit einiger Zeit, dass es genauer erforscht werden muss“, sagte Baric, Professor für Epidemiologie, Mikrobiologie und Immunologie an der UNC Gillings School of Global Public Health in Chapel Hill, North Carolina, jahrzehntelang die Ausbrüche von Coronaviren untersuchen.

Baric ist nicht allein. Während sich die National Institutes of Health und private Unternehmen darum bemühen, bestehende und neuartige Behandlungen für COVID-19 zu testen, versuchen Forscher und Ärzte festzustellen, ob der Anstieg der schweren COVID-19-Erkrankung bei Patienten mit Bluthochdruck zu Beginn ein Zufall von Alter und Allgemeinerkrankung ist Gesundheit, oder wenn es auf die Rolle von ACE2-Rezeptoren sowohl bei Bluthochdruck als auch bei COVID-19-Infektionen spricht. Und wenn es einen Zusammenhang gibt, wollen sie wissen, ob ACE-Hemmer Menschen mit dem höchsten Risiko für eine schwere COVID-19-Erkrankung helfen oder schaden.

„Es ist wirklich wichtig zu sagen, dass dies alles theoretische Überlegungen sind“, sagte Chris Longenecker, MD, von der Case Western Reserve University School of Medicine in Cleveland, der Barics Präsentation auf der virtuellen Konferenz über Retroviren und opportunistische Infektionen (CROI) 2020 sah , die jetzt online ist.

"Es gibt derzeit keine Beweise dafür, dass mir bekannt ist, dass sie einen klinischen Nutzen haben", sagte Longenecker Medizinische Nachrichten von Medscape.

Während derselben Sitzung präsentierte Zunyou Wu, MD, PhD, Chef-Epidemiologe am Chinesischen Zentrum für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten, Daten, die zeigen, dass mehr als 40 % der Menschen mit einer schweren Infektion eine grundlegende Hypertonie hatten. Unter den Schwerkranken war Diabetes die zweithäufigste Komorbidität mit etwa der Hälfte dieser Rate. Ähnliche Daten wurden an anderer Stelle beschrieben, wie berichtet von Medizinische Nachrichten von Medscape.

SARS-CoV-2 und ACE2

Es stellt sich heraus, dass SARS-CoV-2 nahezu maßgeschneidert für den menschlichen Körper war. Obwohl es anscheinend aus Fledermäusen oder Arten hervorgegangen ist, von denen sich Fledermäuse ernähren, geht man derzeit davon aus, dass es eine Reihe dieser "SARS-ähnlichen" Viren bereits in Fledermausgemeinschaften gibt, die ACE2-Rezeptoren verwenden, um in Zellen einzudringen. Die Rezeptoren existieren in mehreren Spezies, und beim Menschen sind sie in Herz und Lunge punktiert.

Darüber hinaus spielen sie eine Rolle bei der Entstehung von Bluthochdruck und Diabetes und kommen vermehrt bei Menschen mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen vor.

Selbst wenn ein Virus in Fledermäusen existiert, braucht es normalerweise mehrere Mutationsrunden, bevor es von der ursprünglichen Wirtsart auf eine andere Art und dann auf den Menschen übergeht. Und es kann auch einige Zeit dauern, bis ein Virus von einer relativ gutartigen Infektion zu einer Epidemie wird.

Aber Baric und andere Forscher, die bestehende Fledermaus-Coronaviren sequenziert haben, glauben nun, dass Fledermauspopulationen „mit vorprogrammierten Viren gesät sind, die so konzipiert sind, dass sie mehrere Fledermaus-ACE2-Rezeptoren verwenden. Durch Zufall können einige von ihnen tatsächlich direkt den Menschen oder ein sekundäres Reservoir verwenden“. Gastgeber“, sagte er.

Mit anderen Worten, die Viren können die Linie überspringen und direkt von einem Nur-Fledermaus-Virus zu einem menschlichen Virus übergehen. „Und in einigen Fällen sind diese Viren möglicherweise in der Lage, direkt auf den Epidemiebereich zu programmieren“, erklärte Baric.

Die Tatsache, dass SARS-CoV-2 auf ACE2-Rezeptoren abzielt, könnte von Bedeutung sein, sagte Baric. Zum Beispiel befindet sich ACE2 auf einem geschlechtsgebundenen Chromosom, was bedeutet, dass Frauen den Rezeptor in höheren Konzentrationen exprimieren als Männer. Aber nach Wus Daten haben Männer schlechtere COVID-19-Ergebnisse als Frauen.

Und dann ist da noch das Problem der ACE-Hemmer. Inhibitoren des Reinin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, zu denen auch ACE-Hemmer gehören, verursachen laut einem kürzlich veröffentlichten Kommentar in . eine Erhöhung der Expression von ACE2-Rezeptoren Natur Bewertungen Kardiologie.

„Die Sicherheit und mögliche Auswirkungen einer Antihypertonie-Therapie mit ACE-Hemmern oder Angiotensin-Rezeptor-Blockern bei Patienten mit COVID-19 sollten sorgfältig abgewogen werden“, schreiben die chinesischen Forscher. "Ob Patienten mit COVID-19 und Bluthochdruck, die einen ACE-Hemmer oder Angiotensin-Rezeptor-Blocker einnehmen, auf ein anderes blutdrucksenkendes Medikament umsteigen sollten, bleibt umstritten und es sind weitere Beweise erforderlich."

Diese erhöhte Expression von ACE2-Rezeptoren wurde kürzlich in einer BMJ Brief, in dem Schweizer Forscher darauf hinweisen, dass "wir schnelle epidemiologische und präklinische Studien brauchen, um diesen Zusammenhang zu klären."

Besteht ein Zusammenhang zwischen ACE-Hemmern und dem Virus, „könnten wir möglicherweise das Risiko tödlicher COVID-19-Verläufe bei vielen Patienten verringern, indem wir diese Medikamente vorübergehend ersetzen“, schreiben sie.

Es hat sich jedoch gezeigt, dass ACE2 eine schützende Rolle beim Influenza-induzierten akuten Atemnotsyndrom spielt, und mit zunehmendem Alter sinkt die ACE2-Expression, sagte Baric, der zustimmt, dass mehr Forschung erforderlich ist.

"Es besteht wahrscheinlich ein direkter Zusammenhang mit dem Niveau der ACE2-Expression und der Schwere der Erkrankung", sagte er. „Und es spielt wahrscheinlich eine Rolle bei den altersbedingten“ Schweregradtrends, die wir bei COVID-19 gesehen haben.

In einer Studie aus dem Jahr 2013 wurden niedermolekulare Medikamente untersucht, die an ACE2 binden und eine Infektion durch SARS verhindern sollen. "Es ist eine sehr gute Idee, zurückzugehen und die Verwendung dieser Medikamente sowohl in vitro als auch in verbesserten Tiermodellen erneut zu untersuchen", sagte Baric.

Unbeantwortete Fragen

Für das CROI-Publikum warf das Thema Bluthochdruck und COVID-19 mehr Fragen als Antworten auf.

Nach der Sitzung fragte Keri Althoff, PhD, von der Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health in Baltimore per Tweet nach der Anzahl der Raucher in der Bevölkerung, über die Wu berichtet hat, und der Anzahl der Patienten, die blutdrucksenkende Medikamente einnehmen, aber noch nicht hat von Wu gehört, erzählte sie Medizinische Nachrichten von Medscape.

Longenecker sagte, er sei versucht, einen Schritt zurück von der Dynamik von ACE2-Rezeptoren und ACE-Hemmern zu machen, und fragt sich, ob der Zusammenhang zwischen Bluthochdruck und schlechteren COVID-19-Ergebnissen bei älteren Menschen einfach überrepräsentiert sein könnte.

"Ältere Menschen haben höhere Bluthochdruck-Raten, höhere Raten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen", sagte er Medizinische Nachrichten von Medscape. „Das könnte eine Erklärung sein. Es hat vielleicht nichts mit dem Angiotensin-Rezeptor zu tun.

Epidemiologie von COVID-19 jetzt und in Zukunft

Bisher hat sich SARS-CoV-2 weiter und schneller ausgebreitet als SARS und weist andere klinische Merkmale auf. Wu zeigte beispielsweise, dass im Gegensatz zum ursprünglichen SARS-Ausbruch in den frühen 2000er Jahren, als die Virusausscheidung Tage nach Auftreten der Symptome begann, die Virusausscheidung von SARS-CoV-2 24 bis 48 Stunden vor Auftreten der Symptome beginnen kann.

„Für SARS-Patienten ist das Tragen einer Maske gut genug, um die Übertragung zu stoppen“, erklärte Wu. "Bei COVID-19 müssen sowohl Patienten als auch gesunde Menschen Masken tragen, um die Übertragung zu stoppen."

Das Virus sei auch weniger tödlich als SARS, sagte John Brooks, MD, vom National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD und TB Prevention an den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) während seiner Präsentation.

Angesichts der aktuellen Daten und je nachdem, wie gut die USA beim Testen und Behandeln von Menschen mit dem Virus sind, wird die wahrscheinliche Sterblichkeitsrate durch COVID-19 laut CDC jedoch zwischen 0,5% und 3,5% liegen.

„COVID-19 könnte 5- bis 35-mal tödlicher sein als die saisonale Influenza“, sagte Brooks. Am Mittwoch sagte Anthony Fauci, MD, Direktor des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, bei einer Anhörung vor dem Kongress, dass er erwartet, dass COVID-19 zehnmal so tödlich sein wird wie die Grippe.

Konferenz zu Retroviren und opportunistischen Infektionen (CROI) 2020. Präsentiert am 10. März 2020.


REVIEW Artikel

  • 1 Neuroprotektionsprojekt, Zentrum für Gentechnik und Biotechnologie, Pharmazeutische Abteilung, Havanna, Kuba
  • 2 Zytoprotektionsprojekt, Zentrum für Gentechnik und Biotechnologie, Pharmazeutische Abteilung, Havanna, Kuba
  • 3 Intensivstation 8B, Krankenhaus Hermanos Ameijeiras, Havanna, Kuba
  • 4 Biomedizinische Forschungsdirektion, Zentrum für Gentechnik und Biotechnologie, Havanna, Kuba

Die pandemische Verbreitung von SARS-CoV-2 mit seiner besonderen Eigenschaft, die interferonbasierte endogene Reaktion zu inaktivieren und damit die angeborene Immunität zu beeinträchtigen, ist zu einer Herausforderung für die internationale Wissenschaft und Medizin geworden. Glücklicherweise haben rekombinante Interferone als therapeutische Produkte eine lange Geschichte von vorteilhaften therapeutischen Ergebnissen bei der Behandlung chronischer und akuter Viruserkrankungen und auch bei der Therapie einiger Krebsarten gesammelt. Eine der ersten antiviralen Behandlungen während des Ausbruchs von COVID-19 in China basierte auf der Verwendung von rekombinantem Interferon alfa 2b, sodass viele Kliniker damit begannen, es nicht nur als Therapie, sondern auch als prophylaktischer Ansatz, hauptsächlich bei medizinischem Personal, einzusetzen. Gleichzeitig lieferte die Grundlagenforschung zu Interferonen neue Erkenntnisse, die zu einem viel besseren Verständnis der Behandlung mit Interferonen, die ursprünglich als antivirale Mittel betrachtet wurden, beigetragen haben. In diesem Übersichtsartikel beschreiben wir kurz Interferone, wie sie im Falle einer Virusinfektion induziert werden und wie sie nach Kontakt mit ihrem spezifischen Rezeptor auf Zielzellen Signale auslösen. Darüber hinaus werden einige der Gene beschrieben, die durch Typ-I-Interferone stimuliert werden, sowie die Art und Weise, wie die Interferon-vermittelte Signalübertragung durch Coronaviren und insbesondere durch SARS-CoV-2 torpediert wird. Das Angiotensin-Converting-Enzym-2-Gen (ACE2) ist eines der Interferon-Antwortgene. Obwohl diese Tatsache für viele Wissenschaftler zu einer nachteiligen Wirkung der Interferon-Behandlung bei COVID-19-Patienten führen könnte, trägt die ACE2-Expression zum Gleichgewicht des Renin-Angiotensin-Systems bei, das durch SARS-CoV-2 bei seiner Internalisierung in die Zelle stark beeinflusst wird . Dieses Manuskript enthält auch die Beziehung zwischen Typ-I-Interferonen und Neutrophilen, NETose und Interleukin 17. Schließlich diskutieren wir unter dem Untertitel “take-home-Messages” die Gründe für eine rechtzeitige Behandlung mit Interferonen im Kontext von COVID- 19 wird betont.


ACE2-Funktion, Rezeptorverteilung und RAS-Homöostase

RAS als Signalweg wirkt als homöostatischer Regulator der Gefäßfunktion und auf Gewebeebene reguliert es die Funktion innerhalb von Organen wie Niere, Lunge und Herz.17 Auf regionaler Ebene reguliert RAS den Blutfluss zu den Organen und steuert trophische Reaktionen auf eine breite Palette von Auslösern, einschließlich Zelltod, Verletzung, Entzündung, Fibrose und Gefäßreparatur.18 Viele dieser regulatorischen Elemente beinhalten gegensätzliche Funktionen, um schnell koordinierte Reaktionen auf lokale Reize zu ermöglichen.

Die Dipeptid-Carboxypeptidase ACE metabolisiert Angiotensin I zu Angiotensin II (AngII) und AngII wird anschließend von der Carboxypeptidase ACE2 zum Vasodilatator Angiotensin (1–7) (Ang 1–7) metabolisiert.19 Während ACE und AngII im Fokus therapeutischer ACE2 wird seit mehr als vier Jahrzehnten gezielt eingesetzt20. ACE2 hat sich erst vor kurzem als wichtiger Akteur bei RAS-Ungleichgewichten, insbesondere bei Vorliegen einer Krankheit, durchgesetzt. Obwohl ACE2 eine Sequenzhomologie mit der extrazellulären Domäne von ACE aufweist, funktioniert es ganz anders als Carboxypeptidase19 und wird nicht durch ACE-Hemmer blockiert. Daher stellt ACE2 einen endogenen Gegenregulationsweg mit RAS dar und wirkt entgegen der ACE-Achse (Abbildung 3). Tatsächlich könnte ACE2 im kardiovaskulären System bei der Regulierung der lokalen Wirkungen von AngII und Ang1–7 wichtiger sein als ACE, mit Konsequenzen für die ausgleichende RAS-Aktivierung.21 22 AngII trägt zu systemischer Hypertonie bei und fördert lokal Vasokonstriktion, endotheliale Dysfunktion, Gefäßentzündung , endothelialer oxidativer Stress, Migration glatter Muskelzellen, Proliferation und Kontraktion sowie In-situ-Thrombose.23 24 Im Kontext des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) wird AngII als zentraler Akteur bei der vaskulären Permeabilität, Zytokin-Amplifikation und inflammatorischen Zellinfiltration angesehen. 21 23 24 Im Gegensatz dazu wirkt Ang1–7 den lokalen vaskulären Effekten von AngII entgegen, wirkt antioxidativ und entzündungshemmend und schwächt Gefäßerkrankungen in Mausmodellen ab.25

Homöostase von RAS-ACE2 unter normalen gesunden Bedingungen10 19 Störung der RAS-ACE2-Homöostase bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bluthochdruck und Diabetes mellitus22 27 COVID-19 kann möglicherweise RAS bei CVD-Patienten weiter hochregulieren und die Annahme von ACE233 verringern, dass die rhACE2-Ersatztherapie das RAS-ACE2-Gleichgewicht um . verbessert Erhöhung von ACE2 und Verringerung der RAS-Aktivierung.37 CVD, kardiovaskuläre Erkrankung HTN, Hypertonie DM, Diabetes mellitus RAS, Renin-Angiotensin-System rhACE2, rekombinantes humanes ACE2.

Genetische Knockout-Studien zeigen, dass ein ACE2-Mangel unter normalen Bedingungen im Vergleich zur ACE-Gen-Deletion relativ geringe Auswirkungen auf den Blutdruck, die kardiovaskuläre Homöostase und die Nierenfunktion hat.26 Unter oxidativem Stress, Sepsis, Entzündung oder experimentellem Bluthochdruck, Diabetes, Atherosklerose , Myokardinfarkt oder Herzinsuffizienz, verstärkt ACE2-Mangel den RAS-assoziierten pathologischen Phänotyp in Tiermodellen27 und klinischen Proben.28 Darüber hinaus zeigen ACE2-Knockout-Modelle erhöhte Gewebe- und zirkulierende Spiegel von AngII und reduzierte Ang1–7,22 mit beschleunigter diabetischer Nephropathie29 und stärkere AngII-induzierte Herzhypertrophie, Fibrose und Infarkt,30 wohingegen eine ACE-Deletion eine mäßige Verringerung des zirkulierenden AngII bewirkt, aber keine Wirkung auf die Gewebespiegel.31 Dies würde mehrere Nicht-ACE-Wege für die AngII-Erzeugung im Körper unterstützen, aber begrenzte Wege für AngII-Abbau, der die potenzielle Bedeutung von ACE2 . unterstreicht Störung auf Gewebeebene, insbesondere in Zuständen der RAS-Aktivierung. Darüber hinaus unterstreicht dies das Potenzial des ACE2-Ersatzes als wirksamere Strategie zur Reduktion von AngII und zur Steigerung von Ang1–7 im Vergleich zur konventionellen RAS-Hemmung.

Somit besteht bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen ein Ungleichgewicht zwischen erhöhter RAS-Aktivierung und reduzierten gegenregulatorischen Wirkungen von ACE2 (Abbildung 3), was Patienten mit erhöhter kardiovaskulärer Risikobelastung anfällig für Zustände machen kann, die Asymmetrien bei RAS/ACE2 verschlimmern.


Angiotensin-(1-7) ersetzen, um Lungenschäden bei SARS-CoV-2-Infektion zu verhindern?

Department of Pharmacology, School of Medicine, Universidad Autónoma de Madrid, Spanien (C.P.).

Instituto de Investigaciones Sanitarias IdiPAZ, Madrid, Spanien (C.P.).

Salvador Moncada, FRS, FMedSci, HonFBPhS, Manchester Cancer Research Centre, The University of Manchester, 555 Wilmslow Rd, Manchester M20 4GJ, Vereinigtes Königreich

Manchester Cancer Research Centre, The University of Manchester, Vereinigtes Königreich (S.M.).

Wie das Coronavirus des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV) dringt das neue Coronavirus SARS-CoV-2, das die epidemische Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, in menschliche Zellen ein, indem es an das Angiotensin-konvertierende Enzym-2 (ACE2) bindet. wenn auch mit einer höheren Affinität. 1 Sobald das virale Spike-Protein an ACE2 gebunden ist, wird es von der Wirts-Serin-Protease TMPRSS2 geprimt, was letztendlich die Fusion von viralen und zellulären Membranen ermöglicht.

ACE2 ist ein Schlüsselprotein des schützenden Zweigs des Renin-Angiotensin-Systems, das Angiotensin (Ang) II, das biologisch aktive Hauptpeptid des RAS, in seinen physiologischen Antagonisten Ang-(1-7) umwandelt.ACE2 metabolisiert auch Ang I zu Ang-(1-9), das dann durch das Angiotensin-konvertierende Enzym in Ang-(1-7) umgewandelt wird. Ang-(1-7) wirkt den vasokonstriktorischen, proinflammatorischen, prooxidativen, proproliferativen oder profibrotischen Wirkungen entgegen, die von Ang II über AT1-Rezeptoren ausgeübt werden (Abbildung).

Abbildung. Diagramm, das die wichtigsten Stoffwechselwege darstellt, die durch das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) und das Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) im Renin-Angiotensin-System angetrieben werden. Die pharmakologischen Ziele für ACE-Hemmer (ACEI) und Angiotensin-AT1-Rezeptor-Blocker (ARB) werden ebenfalls gezeigt. Ang zeigt Angiotensin an.

Die Bindung von SARS-CoV an ACE2 reguliert seine Expression herunter, was zu einem Anstieg von Ang II führt. 1 ACE2 wird in vielen Organen exprimiert, kommt jedoch besonders häufig in Alveolarepithelzellen und vaskulären Endothelzellen vor. 2 Dies würde erklären, warum die Lunge besonders anfällig für das neue Coronavirus ist. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Letalität von SARS-CoV vom Verlust wichtiger regulatorischer Faktoren in der Lunge im Zusammenhang mit der Herunterregulierung von ACE2 abhängt. 3

Ang-(1-7) scheint beim Schutz vor Lungenentzündung und Fibrose entscheidend zu sein. Dieses Heptapeptid hemmt die Apoptose der Alveolarzellen, schwächt die Endothelzellaktivierung und den Verlust von Barrierefunktion und Ödemen ab und begrenzt die Synthese von proinflammatorischen und profibrotischen Zytokinen. Dies ist besonders relevant, da sowohl eine akute Lungenschädigung als auch ein akutes Atemnotsyndrom von einem Zytokinsturm und einer überwältigenden Entzündungsreaktion begleitet werden. 2 Tatsächlich werden aktivierte Endothelzellen zunehmend als Hauptorganisatoren der Entzündungsreaktion beim akuten Atemnotsyndrom erkannt.

Bluthochdruck ist eine Komorbidität, die den Schweregrad der neuen Coronavirus-Infektion verschlimmern kann. 4 Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht klar, aber die blutdrucksenkenden Medikamente wie AT1-Rezeptorblocker oder Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren erhöhen die ACE2-Expression im Tiermodell und beim Menschen. Da ACE2 der Rezeptor für das neue Coronavirus ist, wurde vorgeschlagen, dass bei Patienten, die mit diesen Medikamenten behandelt werden, der Anstieg des Rezeptors zu einer erhöhten Infektion und damit zu einer Verschlimmerung der Krankheit führen kann. Ob diese Behandlungen zugunsten von ACE2-neutralen Arzneimitteln wie Calciumkanalblockern aufgegeben werden sollten, wird derzeit diskutiert. 5 Für diesen Vorschlag gibt es jedoch derzeit keine definitiven Beweise beim Menschen.

Andererseits ist die schützende Wirkung der ACE2-Überexpression besser verstanden und hat zu der gegensätzlichen Hypothese geführt, dass die Verwendung von AT1-Rezeptorblockern vor viral induzierter Lungenschädigung schützen könnte. In einem Modell der SARS-CoV-Infektion erwies sich die Blockade von AT1-Rezeptoren als wirksam bei der Abschwächung von Lungenödemen und schweren Lungenverletzungen. 3 Zusätzlich zur Abschwächung der Bindung von Ang II an seine AT1-Rezeptoren können die vorteilhaften Wirkungen von AT1-Rezeptorblockern durch zwei mögliche Mechanismen erklärt werden: (1) Das wiederhergestellte ACE2, das normalerweise während der Virusinfektion verringert wird, hilft, die Konzentrationen von Ang . zu reduzieren II, 3 und (2) gibt es eine erhöhte Erzeugung des schützenden Ang-(1-7).

Weitere klinische und experimentelle Beweise sind erforderlich, um diese Kontroverse zu lösen. In der Zwischenzeit schlagen wir vor, dass während einer Virusinfektion eine Erhöhung der Ang-(1-7)-Konzentration für den Schutz vor Endothelzellaktivierung und Lungenschäden von entscheidender Bedeutung sein könnte. Die Verwendung von Ang-(1-7) oder eines seiner Mimetika sollte neben anderen Strategien zur Vermeidung von Schäden bei Hochrisikopatienten in Betracht gezogen werden.

Finanzierungsquellen

Dr. Peiró wird durch ein Stipendium von Plan Nacional de I+D (SAF2017-84776-R) unterstützt.


Kritische Funktionen von ECs bei COVID-19-Entzündungen

Angeborene Immunrezeptor-vermittelte Entzündungsreaktionen in ECs

EC-Funktionen können in der Immunologie der vaskulären Homöostase und Pathologie unter zwei Aspekten betrachtet werden. Erstens sind ECs ein konstitutiver und integraler Bestandteil des Gefäßsystems und verursachen somit intrinsisch Gefäßerkrankungen, wenn sie einmal dysfunktional sind. Zweitens vermitteln ECs aktiv Entzündungs- oder Immunreaktionen an Infektions- oder Verletzungsstellen. 21,22 Die angeborene Immunität dient als erste Verteidigungslinie gegen mikrobielle Krankheitserreger. Es hängt von einer begrenzten Anzahl funktioneller Proteine ​​oder Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ab, wie z. RIG-I)-ähnliche Rezeptoren (RLRs). 37 Eine Entzündung wird häufig ausgelöst, wenn PRRs Gewebeschäden oder mikrobielle Infektionen erkennen. 37,38 Bis heute ist unser Wissen über spezifische angeborene Immunantworten auf SARS-CoV-2 in ECs unbekannt. Angesichts der konservierten Mechanismen der angeborenen Immunität werden die Virus-Wirt-Wechselwirkungen mit SARS-CoV-2 jedoch wahrscheinlich viele von denen rekapitulieren, die andere Virustypen oder mikrobielle Infektionen betreffen. Während einer SARS-CoV-Infektion wurde ein PRR-vermittelter Nachweis von viraler einzelsträngiger RNA (ssRNA) und doppelsträngiger RNA (dsRNA), die als pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) bezeichnet werden, und eine weitere Aktivierung der antiviralen angeborenen Immunantwort beobachtet. 39,40 Vorhandene pharmakologische Modulatoren von PRR-vermittelten Entzündungsreaktionen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

6 und TLR9 wurden in allen Arten von gewebespezifischen ECs nachgewiesen. 41,42 Poly (I:C), ein synthetisches dsRNA-Analogon, kann TLR1/2, TLR3 und TLR4 direkt aktivieren. 41 Bei Aktivierung durch TLR werden die Signalwege des nuklearen Faktors Kappa-B (NF-κB) und der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) initiiert über myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) und/oder TIR-Domänen enthaltendes Adapter-induzierendes Interferon-β (TRIF). 41 Dieser Prozess löst eine hyperinflammatorische Reaktion aus, indem er die Produktion von Interleukin (IL)-6, IL-8, Tumornekrosefaktor (TNF)-α und IL-1β sowie Adhäsionsmolekülen (E-Selectin, P-Selectin .) fördert , ICAM und VCAM). Folglich wird die Gefäßpermeabilität durch das Disrupted Junction Protein Claudin-5 und die Induktion von prokoagulierenden Faktoren wie Gewebefaktoren, Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ-1 (PAI-1), von Willebrand-Faktor (vWF) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPa .) erhöht ). 42 Während TLR7/8 in ECs nicht nachgewiesen wird, exprimieren humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) TLR3. 43 ECs produzieren auch Typ-I-Interferone wie IFN-α. IFN-α ist als signifikantes Zytokin während antiviraler Reaktionen bekannt. 43 Darüber hinaus kann TLR9 in ECs aktiviert werden, wenn DAMPs erkannt werden, wie beispielsweise DNA und Proteine, die nach einer Gewebeverletzung außerhalb der Zelle freigesetzt werden. 44 Nach der Aktivierung wird eine schnelle Phosphorylierung von NF-κB und Adhäsionsmolekülen E-Selectin und ICAM-1-unabhängiger MAPK-Signalweg nachgewiesen. 44 Darüber hinaus scheint eine Sepsis-assoziierte Lungenentzündung von der Aktivierung der endothelialen TLR4-regulierenden Neutrophilen-Sequestrierung in die Lunge abhängig zu sein. 45 Zusammenfassend sind TLRs in ECs nicht nur für die Abwehr des Wirts gegen Infektionen wichtig, sondern tragen auch zu mikrovaskulären Dysfunktionen und Entzündungen während systemischer Infektionen bei.

Die NOD-Proteine ​​NOD1 und NOD2 sind zwei Mitglieder der NLR-Familie, die als zytoplasmatische PRRs fungieren. 41 Verschiedene Arten von ECs, wie HUVECs, mikrovaskuläre ECs und humane Aorten-Endothelzellen, exprimieren NOD1. 41,46 Bei mikrobieller Stimulation wurde gezeigt, dass ECs IL-8 in NOD1-abhängiger Weise produzieren. 46,47 Die NLR-Proteine ​​mit einer PYD (NLRPs) werden als eine weitere NLR-Untergruppe klassifiziert. NLRPs interagieren mit ASC und Caspase-1 und bilden Multiproteinkomplexe, die Inflammasomen genannt werden. 48 Inflammasomen (z. B. NLRP1 und NLRP3) regulieren die proteolytische Verarbeitung von proIL-1β und proIL-18 zu reifen Formen und einen entzündlichen Zelltod, der als Pyroptose bezeichnet wird. 41 NLRP1/3, ASC und Caspase-1-Expression wurden in Lungen- und Gefäß-EKs bestätigt. 49,50 Der NLRP3-Weg wurde kürzlich als neues Ziel für die Behandlung von COVID-19 in Betracht gezogen. 51

RIG-I und das Melanom-Differenzierungs-assoziierte Gen 5 (MDA5) sind zwei wichtige zytoplasmatische Sensoren für virale RNA, die zur RLR-Familie der PRR gehören. 37,41,42 RIG-I und MDA5 wurden als ECs (z. B. HUVECs) nachgewiesen, und die RIG-I-Expression wird bei mikrobieller Stimulation hochreguliert. 37,41 Das CARD-enthaltende Adaptermolekül mitochondrial antiviral-signaling protein (MAVS) wird sowohl von RIG-I als auch von MDA5 aktiviert, die wiederum die Signalwege stimulieren, was zu einer IRF3/7-abhängigen IFN-α/β-Antwort und NF- B-abhängige inflammatorische Gene-Transkription. 37

ECs in adaptiven Immunantworten

Für die T-Zell-Aktivierung werden im Allgemeinen Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplexe (MHCs) und kostimulatorische Moleküle benötigt. 52 Alle Blutgefäße sind von ECs ausgekleidet, die eine Barriere zwischen Blutimmunzellen und Parenchymgewebe bilden, und die Wechselwirkung zwischen T-Zellen und organresidenten ECs ist größtenteils schwer fassbar geblieben. Interessanterweise ergab eine kürzlich durchgeführte Studie mit Einzelzell-Transkriptomik, dass in einem Subtyp von Lungenkapillar-ECs ein hohes Maß an Genen im Zusammenhang mit der MHC-Klasse-II-vermittelten Antigenpräsentation nachgewiesen wurde, 53 was auf eine potenzielle Funktion als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) hindeutet. bei der Immunüberwachung gegen respiratorische Pathogene für diesen EG-Subtyp. Angesichts des Fehlens kostimulatorischer CD80/CD86-Moleküle auf der Zelloberfläche sind ECs jedoch nicht in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren. Somit fungieren sie wahrscheinlich als semiprofessionelle APCs. 54 Wenn ECs durch IFN-γ (meist aus Th1-Zellen gewonnen) reaktiviert werden, um MHC-Moleküle zu exprimieren, stimulieren ECs effektiv die Zytokinproduktion und Proliferation von CD4/8-Gedächtnis-T-Zellen. 55 Es wurde berichtet, dass mikrovaskuläre ECs die transendotheliale Migration von Effektorgedächtnis-CD4-T-Zellen stimulieren könnten. 23 Darüber hinaus können die ECs aus chronisch entzündeten Geweben bei der Polarisierung von Entzündungsreaktionen im Zusammenhang mit der adaptiven Immunität wirken. 23 Im peripheren Blut von Infektionen mit COVID-19 war eine Überaktivierung von T-Zellen, gekennzeichnet durch eine erhöhte Anzahl von Th17-Zellen und eine Hyperaktivierung von CD8-T-Zellen, nachgewiesen worden. 56 Zusammenfassend deuten die obigen Beweise darauf hin, dass die Interaktion von ECs mit T-Zellen bei schweren Infektionen mit COVID-19 zu einer übermäßigen Entzündung führen kann.

Endotheliale Adhäsionsmolekül-abhängige Leukozytenrekrutierung

Venuläre ECs bilden den Hauptort des Leukozytentransports aus dem zirkulierenden Blut in die Gewebe. Es wird angenommen, dass ECs an der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blutkreislauf in die Infektions- und Entzündungsherde beteiligt sind. 23 Während des Prozesses einer SARS-CoV-2-Infektion binden entzündliche Zytokine von IL-1 und TNF-α, die aus aktivierten Leukozyten stammen, an die extrazellulären Domänen von IL-1-Rezeptor 1 (IL-1R1) und TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) auf der Oberfläche der Endothelmembran, wodurch verschiedene Kinasekaskaden initiiert werden und zur Aktivierung von NF-κB und Aktivatorprotein 1 (AP-1) führen. 23 Diese Transkriptionsfaktoren induzieren Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, VCAM-1, E-Selectin und P-Selectin). VCAM-1 wurde ursprünglich als CD11-/CD18-unabhängiger Endothelligand für mononukleäre Leukozyten definiert. 23 Es erkennt α4β1- und α4β7-Integrine von Leukozyten. VCAM-1 hat sich vor kurzem als ein wichtiges induzierbares EC-exprimiertes Adhäsionsmolekül herausgestellt, das die Rekrutierung von Monozyten an Verletzungs- und Infektionsstellen vermittelt. 23 ICAM-1, exprimiert auf der Oberfläche des Endothels und im peripheren Gefäßsystem, wird in Läsionen hochreguliert. Durch Bindung mit Leukozyten-β2-Integrinen (CD11/CD18) unterstützt ICAM-1 den Leukozyten-Arrest und die feste Adhäsion und vermittelt die Transmigration von Monozyten und Lymphozyten. 23 Neutrophile und T-Zellen, insbesondere regulatorische T-Zellen (Tregs) im peripheren Blut des Menschen, besitzen E-Selectin-Liganden und werden so rekrutiert. 23,57 P-Selectin ist ein Adhäsionsmolekül, das hauptsächlich auf Blutplättchen und Endothel exprimiert wird und das Rollen, Adhäsion und Transmigration von Leukozyten durch Bindung an ein disulfidgebundenes homodimeres mucinähnliches Glykoprotein, P-Selectin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL -1) durch Leukozyten exprimiert. 58 P-Selectin spielt eine wichtige Rolle bei Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen, insbesondere bei der Modulation von Entzündungswegen und der Abwehr von Infektionen. 58 Wie bereits erwähnt, sind die Serumspiegel von Adhäsionsmolekülen (ICAM-1, VCAM-1, E-Selectin und P-Selectin) bei schweren Infektionen mit COVID-19 signifikant erhöht. 25,59 Die Autopsiebiopsie von SARS-CoV-2-infizierten Lungen zeigt eine mononukleare und polymorphonukleare Aggregation, begleitet von den apoptotischen ECs. 60 Wir vermuten, dass diese von ECs exprimierten Adhäsionsmoleküle eine Entzündungszellinfiltration vermitteln und eine EC-Schädigung, die durch Leukozyten verursacht wird, zur Entzündung beiträgt, insbesondere in den Kapillaren während der COVID-19-Progression. Vorhandene pharmakologische Modulatoren, die direkt oder indirekt auf die durch Endothelaktivierung vermittelte Leukozytenrekrutierung wirken, sind in Tabelle 2 aufgeführt.


ACE2 und assoziierte Moleküle in der Skelettmuskulatur im RAS

ACE2-Ang 1-7 Signalweg als Gegenregulationssystem des RAS

Abbildung 1 ACE2, das sich auf dem Chromosom Xp22 befindet, wird in eine integrale Membranpeptidase vom Typ I mit 40% Identität und 61% Ähnlichkeit mit ACE transkribiert [6]. Eine neuere Strukturanalyse ergab, dass ACE2 zumindest in Gegenwart des Aminosäuretransporters B0AT1 ein Homodimer bildet, für das ACE2 als Chaperonprotein fungiert [7]. Im Gegensatz zu ACE, das als Peptidyl-Dipeptidase fungiert, spaltet die Ektodomäne von ACE2 Angiotensin II [1–8] (Ang II) in Ang 1-7 als Monocarboxypeptidase. Humanes ACE2 spaltet auch Angiotensin I zu Angiotensin 1-9 mit einer geringeren katalytischen Wirksamkeit als Ang II zu Ang 1-7, jedoch fehlt die Wirkung bei Mäusen ACE2 [6,8]. 2003 haben Santos et al. zeigten, dass die Bindung von Ang 1-7 an die Nieren bei Mäusen mit einem Mangel an Mas, einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der früher als Proto-Onkogen angesehen wurde, aufgehoben wurde, und identifizierten Mas als einen funktionellen Rezeptor von Ang 1-7 [9 ]. Während in den 1980er Jahren über die biologische Aktivität von Ang 1-7 berichtet wurde [10–12], hat die Identifizierung des primären Enzyms und Rezeptors zur Herstellung bzw. Bindung des Peptids Studien veranlasst, die Rolle von Ang 1-7 in pathologische und physiologische Zustände [2,13]. Ang 1-7 vermittelt mehrere intrazelluläre Signalwege, einschließlich der Synthese von Stickstoffmonoxid hauptsächlich über den AKT-eNOS-Weg, Hemmung der MAP-Kinase-Signalgebung (ERK1/2, p38 und JNK), Hemmung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch NADPH-Oxidasen, Hemmung der TGF-β-SMAD-Signalgebung und Modulation der cAMP-Signalgebungsantwort [13-17]. Diese Signalwege üben die gefäßerweiternden, antiproliferativen, entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von Ang 1-7 aus [13-17]. Während in mehreren Studien mit genetischer Deletion von Mas oder Mas-spezifischen Antagonisten (dh A779) gezeigt wurde, dass Ang 1-7 seine Wirkung durch Bindung an Mas ausübt [13,15,16,18-20], gibt es mehrere andere Rezeptoren, die an Ang 1-7 binden und biologisch relevante Zell- und Organreaktionen ausüben könnten, einschließlich MrgD, ein Mitglied von Mas-verwandten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren [21, 22] und Ang II-Typ2-Rezeptoren [17, 23, 24]. Ang 1-7 bindet auch an Ang-II-Typ-1-Rezeptoren (AT1) und fungiert als voreingenommener Agonist von AT1 [25,26]. Darüber hinaus wurde kürzlich berichtet, dass Alamandin (Ala–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe), ein endogenes Peptid, das sich von Ang 1-7 (Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His –Pro-Phe) in einer N-terminalen Aminosäure und wird durch ACE2 von Angiotensin A abgespalten, bindet an MrGD und provoziert eine ähnliche Schutzorganantwort wie Ang 1-7 [27–30]. Bisher wurde keine Studie über die Funktion von Alamandin in der Skelettmuskulatur berichtet. Während ACE2 eine wichtige Determinante bei der Regulierung des Gewebespiegels von Ang 1-7 ist, ist Neprilysin, ein integrales Membranprotein vom Typ II, das Angiotensin I in Ang 1-7 spaltet, auch an der Regulierung des Gewebe- und Plasmaspiegels von Ang 1- beteiligt. 7 [30–32]. Neprilysin spaltet auch Ang 1-7 zu kleinen Peptiden sowie ACE [33,34] und Angiotensin 1-2, das proteolytische Produkt von Neprylisin, hat sich als relevant für die Insulinsekretion des Pankreas erwiesen [35]. Während die ACE2-Ang 1-7-Mas-Achse einen wichtigen Weg darstellt, um der Aktivierung der ACE-Ang II-AT1-Achse entgegenzuwirken, haben jüngste Forschungsentwicklungen mehrere alternative Wege aufgezeigt und das regulatorische Netzwerk des RAS vielfältig erweitert [ 30].

Kaskaden von RAS und ACE2

*Hergestellt mit enzymatischer Decarboxylierung von Ang II. Abkürzung: Ang I, Angiotensin I.

*Hergestellt mit enzymatischer Decarboxylierung von Ang II. Abkürzung: Ang I, Angiotensin I.

In Bezug auf die organspezifische Aktivität von ACE2 ist die Ektodomänen-Abspaltung von ACE2 durch ein Disintegrin und Metalloproteinase 17 (ADAM17), auch bekannt als TNFα-konvertierendes Enzym (TACE), eine wichtige biologische Reaktion, die die ACE2-Aktivität des Gewebes unter mehreren pathologischen Bedingungen abbaut [ 36–39]. Die Aktivität von ADAM17 nimmt als Reaktion auf verschiedene Entzündungsreize zu [40,41] und zirkulierendes lösliches ACE2, das durch die Ausscheidung mit ADAM17 produziert wird, hat sich als potenzieller Biomarker für menschliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einschließlich Herzinsuffizienz [42–44], Vorhofflimmern erwiesen [45], chronische Nierenerkrankung [46], Arteriosklerose [47], Myokardinfarkt [48] und Schlaganfall [49]. Petel et al. berichteten, dass Ang II die myokardiale Aktivität von ADAM17 erhöht, während myokardiale ACE2-Proteinspiegel und -aktivität mit einem entsprechenden Anstieg der Plasma-ACE2-Aktivität erheblich verringert werden [37]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Skelettmuskulatur ADAM17 bei verschiedenen Erkrankungen zunimmt, einschließlich erhöhter Adipositas [50] und Typ-2-Diabetes [51], und dass ein PPARγ-Agonist die Muskel-ADAM17-Aktivität reduziert [52], jedoch die Beziehung zwischen ADAM17 und ACE2 in der Skelettmuskulatur wurde noch nicht untersucht. Darüber hinaus liegen derzeit keine Studien zur Veränderung der zirkulierenden ACE2-Spiegel bei Patienten mit Muskelerkrankungen vor.

ACE2-Ang 1-7 im Skelettmuskel

Die Skelettmuskulatur ist ein zentraler Akteur bei der Regulierung nicht nur des motorischen Systems, sondern auch der metabolischen Homöostase durch Modulation der Insulinsensitivität [53, 54]. Aktivierung des klassischen RAS-Signalwegs: Die ACE-Ang II-AT1-Achse ist nachweislich an der Muskelpathogenese beteiligt und fördert Störungen des motorischen Systems oder der Insulinsensitivität, d. h. Muskelschwund begleitet von pathologischem Muskelumbau [55–57] oder Insulinresistenz [58,59] bzw. Hinsichtlich des ACE2-Ang 1-7-Signalwegs als Gegenregulationssystem der ACE-Ang II-AT1-Achse haben sich frühere Studien in der Skelettmuskulatur hauptsächlich auf die schützende Rolle von Ang 1-7 beim pathologischen Muskelumbau und der Insulinresistenz konzentriert. und direkte Beweise, die ACE2 mit diesen Pathologien in Verbindung bringen, sind relativ gering. Die Rolle von Ang 1-7 bei Muskelerkrankungen wurde bereits ausführlich untersucht [13,60–63]. In diesem Abschnitt stellen wir kurz eine wichtige Evidenz zur Unterstützung der schützenden Rolle von Ang 1-7 bei Muskelerkrankungen vor und diskutieren die plausible Rolle von ACE2 beim Muskel-RAS im Rahmen der verfügbaren Evidenz.

Muskelaufbau

Abbildung 2 Muskelschwund ist eine Morbidität, die durch mehrere Faktoren verursacht wird, einschließlich solcher außerhalb der Skelettmuskulatur, wie Störungen der Motoneuronen, anormale Ernährung, systemische Entzündungen, körperliche Immobilität und beeinträchtigte Sauerstoffversorgung [64]. Hier diskutieren wir nur Pathologien, die direkt einen Muskelumbau verursachen können, der zu Muskelschwund führt. Der pathologische Muskelumbau umfasst zwei primäre Veränderungen der Skelettmuskulatur, einschließlich Atrophie und Fibrose, die unabhängig voneinander auftreten können, aber synergistisch das Fortschreiten von Funktionsstörungen bei mehreren pathologischen Zuständen mit Muskelschwund modulieren. Der Prozess des Muskelumbaus könnte auch eine endotheliale Dysfunktion in der Muskelmikrozirkulation beinhalten, und der Einfluss des RAS auf die endotheliale Dysfunktion in der Skelettmuskulatur wird im nächsten Abschnitt untersucht. Wie bereits erwähnt, spielt die Aktivierung des klassischen RAS-Signalwegs eine zentrale Rolle bei der Entwicklung eines pathologischen Muskelumbaus, indem sie Atrophie und Fibrose in der Skelettmuskulatur fördert [60,63]. Kurz gesagt, Muskelatrophie wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Ang II beeinträchtigt die Muskelproteinsynthese hauptsächlich durch die Hemmung des IGF-1-AKT-mTOR-Signalwegs. Der Proteinabbau wird auch durch Ang II über die Induktion mehrerer Zellsignalwege gefördert, einschließlich der Hochregulierung von Atrogenen wie Atrogen-1 und MuRF-1, die einen Ubiquitin-Proteasom-abhängigen Proteinabbau und eine Caspase-abhängige myonukleäre Apoptose induzieren [ 60,63]. Dieses durch Ang II verursachte Ungleichgewicht von Proteinsynthese und -abbau wird in erster Linie der NOX2-abhängigen ROS-Produktion und nachfolgenden zellulären Phänomenen einschließlich NfκB-abhängiger Entzündung und mitochondrialer Schädigung zugeschrieben [60,63].

Die ACE2-Ang 1-7-Mas-Achse gegenreguliert die Wirkung der ACE-Ang II-AT1-Achse bei der Entwicklung des pathologischen Muskelumbaus

Muskelfibrose kann auftreten, wenn beschädigte oder atrophierte Muskelfasern durch Bindegewebe ersetzt werden, und Ang II spielt eine zentrale Rolle bei der Förderung der Muskelfibrose [60,63]. Die NOX2-abhängige ROS-Produktion ist auch ein vorgelagerter Signalweg der Ang II-induzierten Fibrose, und TGF-β und der TGF-β-induzierte Bindegewebe-Wachstumsfaktor gelten als Schlüsselakteure in diesem Prozess [60,63,65]. Darüber hinaus könnte der Prozess der Ang II-induzierten Fibrose eine NfκB-induzierte Gewebeentzündung und die beeinträchtigte Regenerationsfähigkeit von Muskelvorläuferzellen und Satellitenzellen beinhalten, während aufgrund konkurrierender Studien über die Wirkung von Ang II auf die Muskelregeneration Kontroversen bestehen [60, 66,67].

Das derzeitige Verständnis der vorteilhaften Wirkung von Ang 1-7 auf den Muskelumbau wird hauptsächlich durch die Hemmung des Ang II-assoziierten Phänomens zur Induktion von Atrophie und Fibrose erklärt. Die biologische Rolle der Ang 1-7-Signalgebung durch Mas wurde durch eine Studie vorgeschlagen, die zeigte, dass pathologische Zustände, die einen Muskelumbau induzieren, einschließlich Immobilisierung und Infusion von Ang II und LPS, die Muskel-Mas-Expression erhöhen [68]. In Übereinstimmung damit fanden wir, dass Muskel Mas war bei 15 Monate alten hypertensiven Tsukuba-Mäusen, die menschliches Renin und Angiotensinogen trugen, 3,7-fach hochreguliert, was darauf hindeutet, dass Mas als Ausgleich für die chronische Überlastung von Ang II ansteigen könnte [4]. Ang 1-7-Infusion linderte Muskeldysfunktion bei mehreren pathologischen Zuständen, einschließlich Ang II-Infusion [69–71], Muskeldystrophie [72,73], durch Nichtgebrauch induzierte Atrophie [74,75], chronische Lebererkrankung [76], erschöpfendes Schwimmen Bewegung [77] und Krebskachexie [78] bei Nagetieren. Die meisten dieser Studien verwendeten genetische Deletion [72, 75] oder pharmakologische Hemmung [69–72] von Mas, um die Abhängigkeit von Mas von den Ang 1-7-induzierten Wirkungen auf den pathologischen Muskelumbau zu zeigen, während Murphy et al. verwendeten muskelspezifische Mas-Überexpressionsmäuse oder einen Mas-Agonisten, um die schützende Wirkung von Mas bei krebsinduziertem Muskelschwund zu zeigen [78].

Im Gegensatz zu den zahlreichen Evidenzlinien für Ang 1-7 und Mas existiert derzeit nur eine Studie, die die potenzielle Rolle von ACE2 beim pathologischen Muskelremodelling untersucht [79]. In dieser Studie haben Riquelme et al. berichteten, dass die ACE2-Aktivität und der Proteinspiegel in der Skelettmuskulatur durch die genetische Induktion von Muskeldystrophie oder chronischer Verletzung mit lokalem BaCl . erhöht wurden2 Injektion. Dies könnte einen Kompensationsmechanismus implizieren, um den Schutzweg des RAS gegen Muskelverletzungen hochzuregulieren, zusammen mit einem Anstieg von Mas bei mehreren Muskelpathologien [4,68]. Sie zeigten auch, dass die Muskelinjektion von Adenovirus, das für menschliches ACE2 kodiert, die Kollagen-I-Spiegel und die Makrophageninfiltration in die betroffenen Muskeln verringerte, was darauf hindeutet, dass die erhöhte Ang 1-7-Produktion durch ACE2-Überexpression zur Pathologiereduzierung bei Muskeldystrophie beiträgt [79]. Die biologische Relevanz von endogenem ACE2 beim Muskelremodelling muss jedoch noch bestimmt werden, da unbekannt bleibt, ob der potenziell von endogenem ACE2 produzierte Gewebe-Ang 1-7-Spiegel ausreicht, um zum Schutz vor der Entwicklung eines pathologischen Muskelremodellings beizutragen. Acuna et al. berichteten, dass die genetische Deletion oder der Antagonist A779 von Mas die Muskelarchitektur verschlechtert und die Fibrose- und TGF-β-Signalgebung mit verminderter Muskelkraft bei dystrophischen MDX-Mäusen erhöht, was darauf hindeutet, dass endogenes Mas in der Skelettmuskulatur für den Schutz vor pathologischem Muskelremodelling relevant ist [72]. Angesichts des alternativen Weges der Ang 1-7-Produktion durch Neprilysin [30–32] bleibt jedoch ungeklärt, ob die vorgeschlagene Rolle des endogenen Mas beim Muskelremodelling vollständig mit der katalytischen Aktivität von ACE2 verknüpft ist. Studien mit ACE2-funktionsdefizienten Tieren können hilfreich sein, um Schlussfolgerungen zu diesem Thema zu ziehen.

Muskelinsulinresistenz

Abbildung 3 Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die durch die Aktivierung des klassischen RAS-Signalwegs verursachte Insulinresistenz in der Skelettmuskulatur hauptsächlich zwei unabhängige Mechanismen beinhaltet: hämodynamische Störung der lokalen Zufuhr von Insulin und Glukose in die Skelettmuskulatur und Fehlregulation der insulinvermittelten Zellsignale für die Aufnahme von Glukose in die Skelettmuskulatur [58–60]. Ersteres ist mit einer verminderten Blutversorgung verbunden, die möglicherweise durch Ang II-vermittelte Vasokonstriktion und endotheliale Dysfunktion in der Muskelmikrozirkulation verursacht wird. Ang II-vermittelte endotheliale Dysfunktion umfasst mehrere Signalwege, die schließlich zu einer verminderten Produktion von Stickstoffperoxid führen [80–82]. Letzteres ist eine reduzierte Translokation des zytoplasmatischen Glucosetransporters 4 (GLUT4) zur Plasmamembran als Reaktion auf die Insulinbindung an Insulinrezeptoren in Skelettmuskelzellen. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch ROS verursacht, die durch die Ang II-induzierte Aktivierung von Muskel-NOX2 erzeugt wird [83], die intrazelluläre Signalkaskaden von Insulin, einschließlich des Insulinrezeptorsubstrats, Phosphatidylinositol-3-Kinase, 3-Phosphoinositid-abhängige Kinasen und AKT ., stört [58–60]. Frühere Studien haben gezeigt, dass Ang 1-7 diesen zellulären Mechanismen von Ang II entgegenwirkt, indem es Insulinresistenz hauptsächlich über einen Rezeptor, Mas, vermittelt. Erstens haben mehrere Beweislinien bestätigt, dass Ang 1-7 die endotheliale Dysfunktion in verschiedenen Organen wiederherstellen könnte, indem es der durch Ang II induzierten Beeinträchtigung der NO-Produktion entgegenwirkt [84–91]. Die Beteiligung von Mas am Ang 1-7-induzierten Endothelschutz wurde durch eine endotheliale Dysfunktion bei Nagetieren mit genetischer [92–94] oder pharmakologischer Blockade von Mas [95] gezeigt. Interessanterweise wurde kürzlich berichtet, dass Skelettmuskel-Angiogenese und Endothelzellröhrenbildung durch Ang 1-7 induziert und entweder durch genetische Deletion von AT1a oder pharmakologische Blockade von Mas bei Dahl-Salz-sensitiven Ratten gehemmt wurden [96], was einen früheren Befund stützt, dass die Interaktion zwischen AT1 und Mas ist entscheidend für die Rolle von Ang 1-7 in der Endothelfunktion [97]. Konsequenterweise hat sich auch gezeigt, dass die potenzielle Produktion von Ang 1-7 durch ACE2 zum Endothelschutz beiträgt. Eine Überexpression oder pharmakologische Aktivierung von ACE2 verbessert die Endothelfunktion in systemischen [98–100] und pulmonalen Arterien [101]. Dennoch gibt es keine direkten Beweise dafür, dass die potenzielle Schutzfunktion von ACE2, Ang 1-7 und Mas bei der Insulinsensitivität wirklich der Verbesserung der Mikrozirkulation in der Skelettmuskulatur zugeschrieben wird. Die direkte Wirkung von Ang 1-7 hauptsächlich durch Mas bei der insulinvermittelten Translokation von GLUT4 wurde auch durch mehrere Beweislinien in Fettgewebe [102, 103], Herz [104], Leber [103] und Skelettmuskulatur [103, 105, 106] gezeigt. Vor kurzem wurde berichtet, dass die insulinsensibilisierende Wirkung von Bewegung durch den selektiven Mas-Agonisten A779 in der Skelettmuskulatur aufgehoben wurde, was darauf hindeutet, dass Ang 1-7, wirkend durch Mas, an der durch Anstrengung induzierten Erhöhung der Insulinsensitivität beteiligt ist [107]. In Bezug auf die Assoziation von ACE2 mit dem Muskelglukosestoffwechsel haben wir zuvor festgestellt, dass ein Mangel an ACE2 die Insulinresistenz und die Glukosetoleranz als Reaktion auf eine fettreiche Ernährung und eine Ang-II-Infusion übertrieben [108].


Die Autoren danken Prof. Ran Friedman vom Department of Chemistry and Biomedical Sciences, Linnaeus University, Kalmar, Schweden, für seine aufschlussreichen Kommentare.

ACE2, Angiotensin-Converting-Enzym 2 AP-2α, aktivierendes Enhancer-Bindungsprotein 2 alpha C/EBPβ, CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein Beta COVID-19, Coronavirus-Krankheit 2019 GCF, GC-Rich Sequence DNA-Binding Factor GIT, Magen-Darm-Trakt GR-α, Glucocorticoid-Rezeptor alpha NF-AT1, Kernfaktor aktivierter T-Zellen PAX5, gepaarte Box 5 RXR-α, Retinoid-X-Rezeptor alpha SNP, Einzelnukleotid-Polymorphismus TFBS, Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle TMPRSS2, Transmembranprotease, Serin 2 VDR, Vitamin-D-Rezeptor XBP-1, X-Box-Bindungsprotein 1.


Amiodaron verändert späte Endosomen und hemmt die SARS-Coronavirus-Infektion auf postendosomaler Ebene

Amiodaron stört den endozytischen Stoffwechselweg, hemmt die Proteolyse und verursacht die Bildung von Vakuolen, aber die Aufnahme und intrazelluläre Verteilung des Arzneimittels, der Ursprung der Vakuolen und die funktionellen Folgen der Amiodaronakkumulation bleiben unklar. Unser Ziel war es, die Aufnahme von Amiodaron zu untersuchen, die Herkunft von Vakuolen zu klären und die Wirkung von Amiodaron auf den Lebenszyklus des Coronavirus zu untersuchen, das für das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS) verantwortlich ist, das, um in Zellen einzudringen, auf der proteolytischen Spaltung von ein virales Spike-Protein durch die endosomale Proteinase Cathepsin L. Unter Verwendung von alveolären Makrophagen untersuchten wir die Aufnahme von 125 I-Amiodaron und 125 I-B2, einem Analogon, dem die laterale Gruppe Diethylamino-β-ethoxy fehlt, und analysierten die Auswirkungen von Amiodaron auf die Verteilung von endosomalen Markern und von der Aufnahme eines acidotropen Farbstoffs. Darüber hinaus haben wir mit Vero-Zellen den Einfluss von Amiodaron auf die in vitro Verbreitung des SARS-Coronavirus. Wir haben das gefunden (1) Amiodaron verbindet sich mit verschiedenen Zellmembranen und reichert sich in sauren Organellen an (2) die Diethylamino-β-ethoxygruppe ist eine wichtige Determinante der Aufnahme (3) Vakuolen, die sich bei Exposition gegenüber Amiodaron bilden, sind vergrößerte späte Endosomen (4) Amiodaron hemmt die Ausbreitung in vitro des SARS-Coronavirus und (5) Die Trypsinspaltung des viralen Spike-Proteins vor der Infektion, die den Viruseintritt durch die Plasmamembran ermöglicht, beeinträchtigt die antivirale Aktivität von Amiodaron nicht. Wir schließen daraus, dass Amiodaron späte Kompartimente des endozytischen Signalwegs verändert und die SARS-Coronavirus-Infektion hemmt, indem es nach dem Transit des Virus durch die Endosomen wirkt.

Dieser Artikel zeigt, dass Vakuolen vergrößerte späte Endosomen sind und Amiodaron hemmt in vitro schwere Coronavirus-Infektion des akuten respiratorischen Syndroms, die nach der Abgabe des viralen Genoms in das Zytoplasma wirkt.

Eine eigentümliche Folge der Amiodaron-Gabe ist die Bildung von Vakuolen, multilamellaren Einschlusskörperchen und kristallartigen Ablagerungen in verschiedenen Zelltypen, aber auch der Ursprung dieser Strukturen ist unbekannt (3, 6).

Um einige dieser Punkte zu klären, analysierten wir unter Verwendung von Alveolarmakrophagen die Aufnahme und intrazelluläre Verteilung von 125 I-Amiodaron und 125 I-B2, einem Analogon, dem die Diethylamino-β-ethoxygruppe fehlt (7). Darüber hinaus analysierten wir mit konfokaler Mikroskopie die Auswirkungen von Amiodaron auf die Verteilung von Markern der frühen und späten Endosomen und auf die Aufnahme eines acidotropen Farbstoffs. Da die Infektion von Zielzellen durch das Coronavirus (CoV), das für das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS) verantwortlich ist, auf der endosomalen Spaltung eines viralen Oberflächenproteins beruht, haben wir schließlich auch den Einfluss von Amiodaron auf die in vitro Verbreitung dieses neu aufgetretenen Infektionserregers (8).

SARS-CoV ist ein umhülltes Virus mit einem positivsträngigen RNA-Genom, das keulenförmige Vorsprünge aufweist, die von Trimeren des Spike (S)-Proteins gebildet werden. Der erste Schritt im viralen Lebenszyklus ist die Bindung des S-Proteins an seinen Rezeptor, das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2). Anschließend wird das Virus durch rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen und endet in einem sauren endosomalen Kompartiment, wo das S-Protein durch die endosomale Protease Cathepsin L proteolytisch gespalten wird. Protein S löst dann die Vermischung von viralen und endosomalen Membranen aus, was die Freisetzung des Virus bewirkt Genom in das Zytoplasma (9-16). Nachdem wir festgestellt hatten, dass Amiodaron späte Kompartimente des endozytischen Signalwegs stört, haben wir seine Auswirkungen auf den Lebenszyklus des SARS-CoV getestet.

Die Antikörper stammten von Stressgen Biotechnologies, Eugene, OR (Rab4 und Fas), Ancell, Bayport, MN (CD63), Abcam, Cambridge, UK (EEA1) und Athens Research and Technology, Athens, CA (Cathepsin L).

Amiodaron stammte von Sigma (St. Louis, MO). B2 (2-Butyl-3-(3',5'-diiod-4-hydroxy)-benzofuran) wurde wie beschrieben synthetisiert (7).

125 I-Amiodaron (spezifische Aktivität 34,7 Ci/mmol) und 125 I-B2 (3,36 Ci/mmol) wurden nach der Methode von Bellen und Mitarbeitern (17) hergestellt.

Wasserlöslichkeit und Wechselwirkung mit Membranen von Amiodaron und B2 wurden wie berichtet (18, 19) gemessen.

Vero-Zellen (ATCC CCL-81) wurden in GlutaMAX I (Gibco, Carlsbad, CA), 1% Penicillin-Streptomycin, 5% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HyClone, Logan, UT) gehalten. Alveoläre Makrophagen, erhalten nach institutioneller Genehmigung und schriftlicher Zustimmung aus Lungenlappen, die wegen Lungenkrebs reseziert wurden, wurden in Ringer Buffered 0.1% Albumin (RBA) (4) gehalten.

Makrophagen, 60 Minuten lang gegenüber Medium oder 2,0 μM Phenylarsinoxid, 2,5 mM Amantadinhydrochlorid, 1,5 μM Filipin, 10 μM Cytochalasin D, 0,1 μM Wortmannin, 0,1 μM Bafilomycin A . exponiert1, oder 0,1 μM Concanamycin A (alle von Sigma), wurden für 0 bis 90 Minuten mit 0,2 μM 125 I-Amiodaron oder 125 I-B2 inkubiert, bevor die Zellradioaktivität gemessen wurde. In einigen Experimenten wurden Fraktionen des postnukleären Überstands (4, 20) auf Radioaktivität, Protein (21), Arylsulfatase (22), Rab4, CD63 und Fas (durch Western-Blotting) getestet.

Makrophagen, die 24 Stunden lang 0 bis 10 μM Amiodaron ausgesetzt waren, wurden fixiert, permeabilisiert, mit Anti-EEA1- und Anti-CD63-Antikörpern inkubiert, mit alexa 488– oder alexa 546–konjugierten sekundären Antikörpern exponiert (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Niederlande) und analysiert durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (Zeiss LSM510 Zeiss, Mailand, Italien) (23).

Makrophagen, die 24 Stunden mit 0 bis 10 µM Amiodaron inkubiert wurden, wurden 30 Minuten lang 1 µmol/L LysoSensor Green DND-189 (Molecular Probes) ausgesetzt (24). Anschließend wurden konfokale Bilder aufgenommen (Nikon Eclipse TE300 Nikon, Tokio, Japan) und die emittierte Fluoreszenz gemessen (Till Photonics, Martinsried, Deutschland).

Makrophagen wurden 24 Stunden lang 0 oder 10 μM Amiodaron ausgesetzt, bevor Cathepsin L in Zelllysaten durch Western-Blotting analysiert wurde (25).

Vero-Zellmonolayer in 24-Well-Gewebekulturplatten, die 2 Stunden mit 0 bis 50 μM Amiodaron vorbehandelt waren, wurden mit SARS-CoV mit einer Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 1 für 1 Stunde bei 37 °C infiziert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und über Nacht in Gegenwart von Amiodaron inkubiert. Im Überstand freigesetztes Virus wurde auf Vero-Zellen und TCID . titriert50 berechnet nach Spaerman-Kaerber.

Vero-Zellen wurden 1 Stunde bei 37 °C mit Medium, 40 mM NH ., behandelt4Cl oder mit Amiodaron (10 oder 50 μM). SARS-CoV wurde dann für 1 Stunde bei 4 °C (m.o.i. von 1) zugegeben. Nach Entfernen des Inokulums wurden die Zellen zweimal mit MEM ohne FCS gewaschen, bevor sie 5 Minuten bei Raumtemperatur mit L-1-Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon-behandeltem Trypsin (10 &mgr;g/ml Sigma) behandelt wurden. Nach der Trypsinentfernung wurden die Zellen über Nacht in Wachstumsmedium, NH&sub2;4Cl oder Amiodaron und Virustiter im Überstand wurden bestimmt (13–15).

Die Daten sind Mittelwerte ± SEM oder Mittelwerte ± 95 % Konfidenzintervall (KI). Unterschiede wurden mit gepaarten . analysiert T Test, Dunnet-Test oder Dunn-Test. P < 0,05 wurde als signifikant erachtet.

Amiodaron war wasserlöslicher als B2, insbesondere bei saurem pH. Tatsächlich stieg die Löslichkeit von Amiodaron in Wasser von 0,069 ± 0,005 auf 2,04 ± 0,11 µM, während die von B2 von 0,009 ± 0,0001 auf 0,10 ± 0,01 µM anstieg (Unterschiede zwischen Amiodaron und B2 und zwischen pH 5,0 und 7,4, alle statistisch signifikant). Die Affinität von Amiodaron für Membranen, ausgedrückt als logkICH BIN, war signifikant größer als die von B2 bei pH 7,4 (bzw. 4,23 ± 0,02 versus 3,20 ± 0,04), aber kleiner als die von B2 bei pH 5,0 (3,63 ± 0,04 versus 4,57 ± 0,08).

Kürzlich berichteten Bergstrom und Mitarbeiter, dass die Löslichkeit von Amiodaron in Wasser um 5 Größenordnungen zunimmt, wenn der pH-Wert von 7,4 auf 5,0 gesenkt wird (18). Der Grund für die Diskrepanz zu unseren Ergebnissen ist unklar. Es könnte daran liegen, dass wir mit 4 μM Amiodaron in Methanol (der höchstmöglichen Konzentration) begonnen haben, während Bergstrom und Kollegen mit einem Überschuss an festem Medikament begannen.

Mit Ausnahme der konfokalen Mikroskopie wurden alle in dieser Arbeit vorgestellten Studien an menschlichen Alveolarmakrophagen zuvor an Kaninchen-Alveolarmakrophagen durchgeführt. Wir fanden keinen Unterschied zwischen den Arten unter Berücksichtigung der folgenden Punkte: (1) 125 I-Amiodaron-Aufnahme und Verteilung zwischen den Organellen des postnukleären Überstands (2) Auswirkungen von Amiodaron auf die Zellmorphologie auf EM-Ebene (3) Wirkung von Amiodaron auf die Aufnahme von Lysosensor (4) Wirkung von Amiodaron auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Daher sind wir ziemlich sicher, dass die auf humanen alveolären Makrophagen beobachteten Wirkungen nicht mit ihrem Ursprung aus resezierten Lungen in Zusammenhang stehen, die Neoplasien in anderen Schnitten aufweisen als denen, die einer bronchoalveolären Lavage unterzogen wurden.

Wie in 1A gezeigt, assoziierte Amiodaron schnell mit alveolären Makrophagen. Die Bindung/Aufnahme war über die Zeit linear und war entscheidend von der Anwesenheit der Diethylamino-β-ethoxygruppe abhängig, da 125 I-B2, dem diese Gruppe fehlt, mit Makrophagen 50-mal langsamer assoziiert als Amiodaron ( 1 ).

Abbildung 1. Bindung/Aufnahme von 125 I-Amiodaron und 125 I-B2 durch humane alveoläre Makrophagen. (EIN) Anhaftende Zellen (10 6 ) wurden mit 0,2 µM 125 I-Amiodaron oder 125 I-B2 inkubiert und die zellassoziierte Radioaktivität wurde zu den angegebenen Zeiten gemessen. M ± SE, n = 4. Anders als B2: *P < 0.03, **P < 0,01 (gepaart) T Prüfung). (B) Wirkung von Inhibitoren auf die Bindung/Aufnahme von Amiodaron durch alveoläre Makrophagen. Zellen, die 60 Minuten lang Normalmedium (Kontrollen) oder 2,5 mM Amantadinhydrochlorid (Amant), 2,0 µM Phenylarsinoxid (Phen), 1,5 µM Filipin, 10 µM Cytochalasin D (Cyt), 0,1 µM Wortmannin (Würze), 0,1 µM . ausgesetzt waren Bafilomycin A1 (Bafilom) oder 0,1 μM Concanamycin A (Concan) wurden 60 Minuten mit 0,2 μM 125 I-Amiodaron inkubiert, bevor die zellassoziierte Radioaktivität gemessen wurde (n = 3–6). Aufnahme aus Kontrollzellen = 100 %. *Unterschied von allen anderen außer Bafilomycin oder Concanamycin, P < 0,05 durch ANOVA.

Clathrin-vermittelte Endozytose, Caveolae, der vektorielle Transfer von Materialien über den endozytischen Weg, Flüssigphasen-Endozytose oder das Zytoskelett können ohne Änderung der Nettoaufnahme von Amiodaron gehemmt oder gestört werden. Tatsächlich Phenylarsinoxid und Amantadin (Hemmer der Clathrin-vermittelten Endozytose), Filipin (Hemmer der Endozytose durch Caveolae), Cytochalasin D (ein Zerlegen des Zytoskeletts) und Wortmannin (das die Flüssigphasen-Endozytose, Phagozytose und die vektorielle Bewegung hemmt von Materialien durch den endozytischen Weg) beeinflusste die Assoziation von 125 I-Amiodaron mit Makrophagen nicht ( 1B ). Auf der anderen Seite Bafilomycin A1 und Concanamycin A, das die vakuoläre Acidität durch Hemmung der V-ATPase abbaut, verringerte die Aufnahme, ohne sie aufzuheben ( 1B ). Da die verwendeten Inhibitoren keine nachteilige Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatten, legen diese Ergebnisse nahe, dass es keinen bevorzugten Aufnahmemechanismus von Amiodaron gibt und dass Amiodaron neben der Akkumulation in sauren Organellen auch mit anderen Zellstrukturen assoziiert. In einer Reihe von Experimenten, in denen wir Makrophagen 0, 30, 60 und 120 Minuten mit 125 I-Amiodaron inkubierten und dann den postnukleären Überstand einer Reihe von Differenzzentrifugationen von jeweils 10 Minuten (3.000 × g, 6,000 × g, 10,000 × g, 20,000 × g, 100,000 × g) akkumulierte Amiodaron in allen Pellets. Der größte Teil der Radioaktivität (über 85% der Gesamtmenge) wurde mit den 3.000 × g, 6,000 × g, und 10.000 × g Pellets, während die 100.000 × g der Überstand enthielt zu jedem Zeitpunkt weniger als 2% der Gesamtradioaktivität (nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass freies Jod einen geringen Anteil der Gesamtradioaktivität darstellte.

Um das Schicksal von Amiodaron nach der Aufnahme zu klären, inkubierten wir alveoläre Makrophagen mit 0,2 μM 125 I-Amiodaron und verfolgten dann die Verteilung der Radioaktivität zwischen den aus dem postnuklearen Überstand isolierten Organellen. In dem von uns verwendeten System wandern die Lysosomen zum Boden des Röhrchens, frühe und späte Endosomen bleiben im oberen Drittel, Fragmente der Plasmamembran bleiben oben und Mitochondrien sammeln sich ganz unten im Gradienten, wie aus der Verteilung abgeleitet spezifischer Marker: Arylsulfatase (Lysosomen), Rab4 (frühe Endosomen), CD63 (späte Endosomen), Fas (Plasmamembran) ( Abbildung 2 ) (23). Cytochrom-C-Oxidase (Marker der Mitochondrien) konzentriert sich in den Fraktionen 1–4, während EEA1 (ein weiterer Marker für frühe Endosomen) die gleiche Verteilung von Rab4 aufweist (nicht gezeigt).

Figur 2. Assoziation von Amiodaron mit Organellen des postnukleären Überstands. Anhaftende humane alveoläre Makrophagen (5 × 10 6 Zellen) wurden gegen 0,2 μM 125 I-Amiodaron ± 0,5 μM Bafilomycin A . exponiert1 zu den angegebenen Zeiten. Der postnukleäre Überstand wurde dann durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert und auf den Fraktionen wurde die Radioaktivität gezählt (oben) wurde die Anwesenheit von Fas, Rab 4 und CD63 durch Western-Blotting analysiert (Mitte) und die Arylsulfatase-Aktivität wurde gemessen (Unterseite). Die Figur ist repräsentativ für drei Experimente. Diamanten, 30 Minuten Quadrate, 60 Minuten Dreiecke, 120 Minuten Kreise, 120 Minuten + Bafilomycin.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, akkumulierte sich die Radioaktivität, wenn Makrophagen mit 0,2 μM 125 I-Amiodaron inkubiert wurden, allmählich in Organellen, die an den Extremen des Gradienten wanderten und sich in größerem Maße nach unten hin sammelten. Die Behandlung mit Bafilomycin verringerte die mit beiden Organellenpopulationen verbundene Radioaktivität deutlich ( 2 ). So scheint es, dass Amiodaron, das den Zellen in niedrigen Konzentrationen präsentiert wird, zeitabhängig mit verschiedenen Organellen des postnukleären Überstands assoziiert, von denen einige aufgrund der Sedimentierbarkeit, der Verteilung von Markern und der Empfindlichkeit als Endosomen und Lysosomen identifiziert werden können Behandlung mit Bafilomycin A1.

Diese Ergebnisse wurden von Makrophagen erhalten, die mit 0,2 µM Amiodaron inkubiert wurden, während die Patienten chronisch Konzentrationen im Bereich von 1 bis 4 µM ausgesetzt waren. Um die Wirkung höherer Amiodaronkonzentrationen zu testen, inkubierten wir alveoläre Makrophagen 16 Stunden lang sowohl mit 0,2 als auch mit 10,0 μM 125 I-Amiodaron und analysierten dann die Verteilung der Radioaktivität zwischen den Organellen des postnukleären Überstands. Wie in 3 gezeigt, hatte die Konzentration von Amiodaron deutliche Auswirkungen auf die Verteilung der Radioaktivität. Tatsächlich verteilte sich Amiodaron, wenn es in geringer Konzentration vorhanden ist, hauptsächlich zum unteren Ende des Gradienten, was auf eine bevorzugte Akkumulation in Lysosomen hindeutet. Bei hohen Konzentrationen akkumulierte Amiodaron hauptsächlich am oberen Ende des Gradienten, was auf eine bevorzugte Akkumulation in Endosomen hindeutet.

Figur 3. Wirkung verschiedener Amiodaronkonzentrationen auf die Verteilung des Arzneimittels auf die Organellen des postnukleären Überstands. Anhaftende humane alveoläre Makrophagen (5 × 10 6 ) wurden mit 0,2 (Diamanten) oder 10.2 (Quadrate) μM 125 I-Amiodaron für 16 Stunden. Der postnukleare Überstand wurde dann durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert, wie in 2 angegeben, und die Verteilung der Radioaktivität durch den Gradienten wurde analysiert. M ± SE (n =3). Anders als Kontrolle, *P < 0,02 (gepaart) T Prüfung).

125 I-B2 wurde von alveolären Makrophagen in einem so geringen Ausmaß aufgenommen, dass die Radioaktivität des postnukleären Überstands kaum größer war als der Hintergrund (nicht gezeigt).

Um die Vesikel zu charakterisieren, die sich bei Exposition gegenüber Amiodaron bilden, analysierten wir die Auswirkungen des Arzneimittels auf die Verteilung von Markern, die üblicherweise verwendet werden, um frühe und späte Endosomen, bzw. EEA1 und CD63, zu identifizieren. Wie in Abbildung 4 gezeigt, dekorierte EEA1 in Kontrollzellen eine Population von runden Organellen, die hauptsächlich an einem Ende der Zelle lokalisiert waren, während CD63 mit Strukturen assoziiert war, die sich sowohl als Puncta als auch als dünnes Netz präsentierten, das über das Zytoplasma verstreut war, ein Muster, das mit die bekannte tubulo-vesikuläre Morphologie, die von späten Endosomen in Makrophagen gezeigt wird (26). Nur wenige Organellen waren für beide Marker positiv ( 4 ). Amiodaron beeinflusste die Verteilung von EEA1 nicht, veränderte jedoch dramatisch die Verteilung von CD63, das sich hauptsächlich am Rand großer Vakuolen an der Zellperipherie befand ( 4 ). Wie in Kontrollzellen waren nur sehr wenige Organellen für beide Marker positiv. Somit stört Amiodaron das Aussehen und die Verteilung der frühen Endosomen nicht, hat aber deutliche Auswirkungen auf die Organisation der späten Endosomen.

Figur 4. Durch Amiodaron induzierte Vakuolen sind vergrößerte späte Endosomen. Humane alveoläre Makrophagen wurden 16 Stunden mit Normalmedium (Kontrollen) oder mit 10 µM Amiodaron inkubiert. Die Zellen wurden dann permeabilisiert und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern gegen EEA1 als einem frühen endosomalen Marker und Antikörpern gegen CD63 als einem späten endosomalen Marker gefärbt. Konfokale Bilder werden mit EEA1 angezeigt Grün und CD63 erscheint rot. kolokalisierte Strukturen erscheinen Gelb im zusammengeführten Bild.

Amiodaron verändert dramatisch die Verteilung von Lysosensor Green DND-189, einem acidotropen Farbstoff, der sich durch Protonierung in sauren Organellen anreichert und dessen Fluoreszenzintensität proportional zum Säuregehalt ist (24). Tatsächlich akkumulierten Kontrollmakrophagen Lysosensor als kleine Vesikel, die sich in der Nähe des Zellkerns gruppierten und zeigten auch eine diffuse Färbung des Zytoplasmas, während Makrophagen, die mit 10 μM Amiodaron behandelt wurden, Lysosensor in großen Vakuolen akkumulierten, die sich hauptsächlich an der Zellperipherie befanden (Abbildung 5A). Neben der Änderung der Verteilung von Lysosensor DND-189 verringerte Amiodaron die Nettoaufnahme der Sonde, wie durch die Abnahme der von ganzen Zellen emittierten Fluoreszenz angezeigt ( 5B ). Die Wirkung war dosisabhängig und bei 2 μM Amiodaron signifikant. Die geringere Aufnahme von Lysosensor in Gegenwart von Amiodaron scheint eher auf eine verminderte Aufnahme als auf eine erhöhte Freisetzung der Sonde zurückzuführen zu sein, da Zellen, die mit Lysosensor beladen und dann Amiodaron ausgesetzt waren, ihre Fluoreszenz langsamer verloren als Zellen, die mit Lysosensor beladen und dann exponiert wurden auf normales Medium (nicht gezeigt).

Abbildung 5. Wirkung von Amiodaron auf die Aufnahme und Verteilung von Lysosensor Green DND-189 durch alveoläre Makrophagen. Zellen (10 6 ), die 16 Stunden lang mit Medium (Kontrollen) oder Amiodaron in den angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden, wurden 30 Minuten lang 1 &mgr;mol/L LysoSensor Green DND-189 ausgesetzt. Nach dem Waschen wurden konfokale Bilder erhalten (EIN) und die von einzelnen Zellen emittierte Fluoreszenz bei 505 nm als Reaktion auf ein Anregungslicht von 440 nm gemessen (B). Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente, in denen die von 20 Zellen emittierte Fluoreszenz gemessen wurde. *Anders als Kontrolle, P < 0,05 # verschieden von der Kontrolle und 2 μM Amiodaron, P < 0,01 durch ANOVA.

Wie in Abbildung 6 gezeigt, veränderte 10 μM Amiodaron nicht die Gesamtmenge an Catehepsin L, die in Lysaten vorhanden war, die aus Alveolarmakrophagen gewonnen wurden, und beeinflusste nicht die Reifung dieses Enzyms, da das Verhältnis zwischen dem unreifen Procathepsin L (38 kD), dem Zwischenform von 30 kD und reifes Cathepsin L (24, 25 kD) blieben unverändert (25).

Abbildung 6. Amiodaron beeinflusst weder den Gesamtzellgehalt noch die Reifung von Cathepsin L. Alveolarmakrophagen (2 × 10 6 Zellen) wurden 24 Stunden mit Medium (Kontrollen) oder mit 10 µM Amiodaron inkubiert. Zelllysate (20 μg Protein) wurden dann durch Polyacrylamidgelelektrophorese fraktioniert, auf Nitrocellulose übertragen und mit einem Antiserum Anti-Cathepsin L sondiert. Bänder sind Pro-Cathepsin L (38 kD), eine Zwischenform (30 kD) und reifes Cathepsin L (zwei Banden von 24 und 25 kD, die unter den verwendeten Bedingungen nicht aufgelöst wurden). Repräsentativ für vier Experimente.

Es wurde bereits gezeigt, dass Amiodaron den Abbau von Surfactant Protein A hemmt, was zur Akkumulation des ungespaltenen Proteins in einem endosomalen Kompartiment führt (4). Da die Infektion von Zielzellen durch das SARS-CoV auf der proteolytischen Spaltung des S-Proteins durch die lysosomale Cysteinproteinase Cathepsin L angewiesen ist (13, 14), untersuchten wir die Möglichkeit einer Wirkung von Amiodaron auf den Lebenszyklus des SARS -CoV. Alle Arbeiten mit lebendem SARS-CoV wurden in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 bei Novartis Vaccines, Siena, Italien, durchgeführt. Vorversuche zeigten, dass Amiodaron von Vero-Zellen aufgenommen wird, wobei die Aufnahme unter Berücksichtigung von Kinetik und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren mit der von Alveolarmakrophagen vergleichbar ist.

Vero-Zellen wurden 2 Stunden mit 0 bis 50 µM Amiodaron inkubiert und dann mit SARS-CoV (m.o.i. von 1) infiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen und in Gegenwart des Arzneimittels in Wachstumsmedium weiter inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Zellkulturüberstand geerntet und das Virus durch Titration quantifiziert. Wie in Abbildung 7A gezeigt, die die Ergebnisse von vier unabhängigen Experimenten darstellt, beeinflusste Amiodaron den Lebenszyklus von SARS-CoV in einer konzentrationsabhängigen Weise: 5 μM Amiodaron induzierte eine signifikante Verringerung des Virustiters 10 μM Amiodaron verringerte den Virustiter 10 mal 50 μM Amiodaron brachten den Virustiter unter die Nachweisgrenze, die bei 10 TCID . lag50/ml in diesem Assay.

Abbildung 7. Wirkung von Amiodaron auf die SARS-CoV-Infektion. (EIN) Vero-Zellen, 2 Stunden mit 0 bis 50 μM Amiodaron inkubiert, 1 Stunde SARS-CoV (1 m.o.i.) ausgesetzt und erneut 24 Stunden mit Amiodaron inkubiert. Viruskonzentration im Überstand, bestimmt durch Titration in Vero-Zellen. Gepunktete Linie = untere Nachweisgrenze. Repräsentativ für vier Experimente. *Erheblicher Unterschied zu niedrigeren Amiodaron-Konzentrationen (P < 0,05). (B) Wirkung von NH4Cl oder Amiodaron zur Infektiosität des mit Trypsin behandelten SARS-Coronavirus. Die Zellen wurden 2 Stunden bei 37 °C mit Medium (Kontrolle), 40 mM NH&sub2; inkubiert4Cl oder Amiodaron (10 oder 50 μM). Danach wurden die Zellen 1 Stunde bei 4°C mit SARS-CoV (1 moi/Zelle) inkubiert und dann wurde zellgebundenes Virus 5 Minuten bei 25°C mit oder ohne L-1-Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon inkubiert -behandeltes Trypsin. Danach wurden die Zellen bei 37 °C für 24 Stunden mit DMSO (Kontrollen), 40 mM NH . inkubiert4Cl oder Amiodaron (10 oder 50 μM) und der Virustiter wurde im Überstand bestimmt. Stellvertretend für zwei Experimente. *Erheblich anders als alle anderen (P < 0,05). In beiden Panels sind die Werte Mittelwerte von ± 95 % Konfidenzintervall (Spearman-Karber).

Amiodaron kann für Zellen toxisch sein (4, 7) und seine antivirale Aktivität könnte auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Zellen zurückzuführen sein. Um dies auszuschließen, wurden Vero-Zellen 24 Stunden mit 0 bis 50 µM Amiodaron inkubiert und anschließend ihre Fähigkeit, Propidiumiodid einzubauen, mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Wir fanden, dass die Lebensfähigkeit der Zellen bis zu 30 μM Amiodaron über 97%, bei 40 μM Amiodaron 91% und bei 50 μM Amiodaron 83% betrug. Somit hat Amiodaron eine antivirale Aktivität bei Konzentrationen, bei denen es keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit hat.

Die antivirale Wirkung von Amiodaron könnte auf eine direkte Wirkung des Medikaments auf das SARS-CoV zurückzuführen sein. Um diesen Punkt zu verdeutlichen, wurde SARS-CoV in Wachstumsmedium 24 Stunden bei 37 °C ohne oder mit 10 μM Amiodaron inkubiert. Vor der Titration auf Vero-Zellen wurden die beiden Beimischungen 10-fach verdünnt, so dass die Amiodaron-Konzentration auf 1 µM absank (was keinen Einfluss auf die Ausbreitung von SARS-CoV hat). Wir fanden keinen signifikanten Unterschied im Virustiter zwischen den beiden Ablagerungen (Daten nicht gezeigt). In einem weiteren Experiment wurde SARS-CoV bei 37 °C für 24 Stunden mit 5 oder 50 µM Amiodaron inkubiert. Dann wurde die 50 µM Amiodaron-Virus-Mischung mit frischem Medium auf 5 µM verdünnt und beide Mischungen wurden auf Vero-Zellen titriert. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied im Virustiter zwischen den beiden Ablagerungen (Daten nicht gezeigt). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass eine direkte Interaktion von Amiodaron mit dem SARS-CoV unwahrscheinlich oder nicht signifikant ist.

SARS-CoV dringt in Zielzellen ein, indem es über das S-Protein an den Oberflächenrezeptor ACE2 bindet. Das Virus wird dann aufgenommen und endet in einem sauren endosomalen Kompartiment, wo Protein S nach Proteolyse durch Cathepsin L die Freisetzung des viralen Genoms in das Zytoplasma auslöst. Eine leicht saure pH-Umgebung im Endosom scheint wichtig zu sein, da die Infektion durch lysosomotrope Mittel wie NH . blockiert werden kann4Cl oder Chloroquin (13). Im Prinzip könnte Amidaron die Infektiosität von SARS-CoV verringern, indem es die Dichte von Oberflächenrezeptoren verringert, die Ansäuerung von Organellen oder die Synthese, Reifung oder Aktivität von Cathepsin L stört. Diese Mechanismen sind jedoch unwahrscheinlich. Tatsächlich verändert Amiodaron die Dichte der ACE2-Rezeptoren auf der Zelloberfläche nicht, wie durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines humanen monoklonalen Antikörpers gegen ACE2 (nicht gezeigt) bestimmt wurde die Synthese und Reifung von Cathepsin L stören ( 6 ).

In einem abschließenden Experiment testeten wir, ob Amiodaron frühe Stadien des Viruslebenszyklus stört, insbesondere solche, die die Endosomen betreffen, in denen das Medikament aktiv zu sein scheint. Wir argumentierten, dass, wenn die Endosomen die einzige Schnittstelle von Amiodaron mit dem Viruslebenszyklus wären, es möglich sein könnte, die Virusinfektiosität durch Trypsinbehandlung von SARS-CoV, das an Zielzellen gebunden ist, wiederherzustellen (was es dem Virus ermöglicht, direkt mit dem Virus zu fusionieren). Plasmamembran und um Zellen zu infizieren, ohne den endosomalen Weg zu nutzen). Dementsprechend wurden Vero-Zellen mit Amiodaron vorinkubiert und dann ließ man das Virus bei 4°C an die Zellen binden. Danach wurde Trypsin zugegeben, um die Fusion von Virus und Zellmembranen und die direkte Freisetzung des Virusgenoms in das Zytosol zu ermöglichen (15). Danach wurden die Zellen über Nacht in Wachstumsmedium inkubiert und der Virustiter bestimmt. Wie in Abbildung 7B gezeigt, konnte die Trypsin-Behandlung von zellgebundenem Virus die durch Ammoniumchlorid vermittelte Infektionsblockade überwinden, die Kontrolle in diesem Experiment, aber nicht die durch Amiodaron induzierte Blockierung, was stark darauf hindeutet, dass Amiodaron den SARS-CoV-Lebenszyklus nach stört Übertragung des viralen Genoms in das Zytosol.

Die Assoziation von Amiodaron mit Zellen wird stark von der Seitengruppe Diethylamino-β-ethoxy beeinflusst. Tatsächlich hatte Amiodaron bei pH 7,4 eine größere Löslichkeit in Wasser und eine höhere Affinität für Membranen als B2, während Amiodaron bei pH 5,0 eine größere Löslichkeit in Wasser, aber eine geringere Affinität für Membranen als B2 aufwies, was darauf hindeutet, dass die Diethylamino-β-ethoxy-Gruppe beides begünstigen kann die Übertragung des Arzneimittels von Trägerproteinen auf die Plasmamembran und Anreicherung in sauren Organellen. Es ist jedoch klar, dass die Assoziation mit sauren Organellen nur eine der Möglichkeiten ist, auf denen sich Amiodaron in den Zellen anreichert, da die Dissipation der vakuolären Acidität zwar abnimmt, aber die Aufnahme nicht aufhebt.

Aus den vorliegenden Beweisen schlagen wir vor, dass Amiodaron mit der Plasmamembran assoziieren und sich dann entsprechend dem Abschnitt der Plasmamembran, in dem es sich gerade befindet, auf verschiedene Zellkompartimente verteilen könnte. Amiodaron, das in frühe Endosomen endet, wird dem Schicksal dieser Organellen entlang des Endozytoseweges folgen und könnte, wenn der pH-Wert des Lumens sinkt, von der begrenzenden Membran zum Lumen wandern. Diese Interpretation kann die Verteilung des Arzneimittels auf alle Zellmembranen, das Fehlen eines bevorzugten Aufnahmemechanismus, die Assoziation mit sauren Organellen, die verminderte Aufnahme nach Dissipation der vakuolären Acidität und die bevorzugte Assoziation mit Lysosomen (die die niedrigsten interner pH-Wert).

Patienten, die chronisch mit Amiodaron behandelt werden, weisen Plasmakonzentrationen im Bereich von 1 bis 4 μM auf (1). Wir haben versucht, diesen Zustand zu reproduzieren, indem wir akut alveoläre Makrophagen 10 μM Amiodaron ausgesetzt haben, einer Behandlung, die die Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt und die Bildung von Vakuolen ähnlich den beobachteten induziert in vivo (4, 7).Wir zeigen nun, dass die Vakuolen vergrößerte späte Endosomen sind und dass frühe Endosomen ihre übliche Konfiguration beibehalten, in Übereinstimmung mit früheren Beweisen, die darauf hindeuten, dass Amiodaron selektiv das späte Kompartiment des endozytischen Weges stört (4, 7).

Die Biogenese und das ordnungsgemäße Funktionieren der späten Kompartimente des Endozytosewegs hängen von einem hochkonservierten Satz von Proteinen (Hrs, ESCRT I-III, Alix) ab, die sich auf der zytoplasmatischen Seite der frühen Endosomen ansammeln und sie zu späten Endosomen/multivesikulären Körpern (27 .) , 28). Kürzlich wurde festgestellt, dass die Suppression von hVps34, das Phosphatidylinositol in Phosphatidylinositol-3-phosphat (die Andockstelle für SCRTIII) umwandelt, ähnliche, wenn auch nicht identische Veränderungen mit denen durch Amiodaron erzeugt (29). Zu diesen Veränderungen zählen die Schonung der frühen Endosomen, die Bildung von vergrößerten späten Endosomen, eine gestörte endolysosomale Proteolyse und subtile Reifungsstörungen von Cathepsin D (29). In Anbetracht der Tatsache, dass ESCRT III an der Bildung multivesikulärer Körper beteiligt ist (27, 28), ist es daher verlockend, zu spekulieren, dass Amiodaron auf ein verwandtes Target wirken könnte und dass vergrößerte späte Endosomen von der verminderten Bildung intralumenaler Vesikel herrühren könnten.

Wir haben zuvor festgestellt, dass die Inkubation von alveolären Makrophagen mit 10,0 μM Amiodaron die Größe des lysosomalen Kompartiments verringert (4). Dies könnte die Beobachtung erklären, dass 125 I-Amiodaron, wenn es Makrophagen in einer niedrigen Konzentration (0,2 μM) präsentiert wird, hauptsächlich an Lysosomen verteilt wird, während es bei einer höheren Konzentration (10,2 μM) hauptsächlich an Endosomen verteilt wird.

Ein Schrumpfen des lysosomalen Kompartiments könnte auch die verminderte Aufnahme von Lysosensor durch mit Amiodaron inkubierte Makrophagen erklären.

Viele behüllte Viren dringen durch rezeptorvermittelte Endozytose in Zielzellen ein und ihr genetisches Material erreicht das Zytoplasma nach Fusion von viralen und endosomalen Membranen. Dieser Prozess erfordert die Neuordnung eines Virusoberflächenproteins und das Freilegen einer hydrophoben Domäne, des Fusionspeptids (30). Bei vielen Viren erfordert eine solche Umlagerung lediglich das leicht saure Milieu eines endosomalen Kompartiments, aber einige Viren, wie das Ebola-Virus und das SARS-CoV, benötigen auch die Aktivität einer endosomalen Protease (14, 31). Im Fall von SARS-CoV ist die für die Zellinvasion benötigte Protease die endosomale Protease Cathepsin L. Tatsächlich kann die SARS-CoV-Infektion durch Inhibitoren der V-ATPase, durch lysosomotrope Mittel wie Ammoniumchlorid und durch Inhibitoren von Cathepsin blockiert werden L (13).

Endosomale Kompartimente und ihre ordnungsgemäße Funktion spielen eine wichtige Rolle im Lebenszyklus des SARS-CoV. Daher dachten wir, dass Amiodaron, das die endolysosomale Hydrolyse hemmt und die späten Kompartimente des endozytischen Weges stört, den Viruseintritt in die Zielzellen beeinträchtigen könnte . Wir fanden, dass Amiodaron die SARS-CoV-Infektiosität hemmt und dass die Hemmung auf postendosomaler Ebene zu erfolgen scheint, da Amiodaron die Oberflächendichte von ACE2 nicht beeinflusst, die luminale Acidität nicht abbaut, die Synthese und Reifung von Cathepsin L nicht beeinträchtigt. und kann durch die Behandlung von zellgebundenem Virus mit Trypsin, das den Viruseintritt durch die Plasmamembran ermöglicht, nicht antagonisiert werden.

Wie Amiodaron die SARS-CoV-Amplifikation hemmt, bleibt derzeit jedoch unklar, angesichts seiner Auswirkungen auf die Zellmorphologie (4, 7) ist es jedoch verlockend, zu spekulieren, dass es Schritte des Viruslebenszyklus unter Beteiligung von Zellmembranen stören könnte. Amiodaron könnte beispielsweise den Aufbau oder die Funktion virusspezifischer, flaschenförmiger zytoplasmatischer Kompartimente stören, die von einer Doppelmembran begrenzt werden, in die neue virale RNA synthetisiert wird (32–34). Alternativ könnte Amiodaron den Zusammenbau von Strukturproteinen und genomischer RNA zu neuen Virionen stören oder die Freisetzung von Virusnachkommen in den extrazellulären Raum hemmen, da die Proteinkomplexe, die für die Biogenese multivesikulärer Körper (die ESCRTs) notwendig sind, auch die Virus-Knospung vermitteln ( 27). Darüber hinaus ist es immer noch möglich, dass die antiviralen Wirkungen von Amiodaron auch in den Endosomen auftreten.

Der Nachweis einer Aktivität von Amiodaron gegen SARS-CoV ist eindeutig vorläufig und seine Anwendbarkeit in der Klinik ist fraglich, da die Konzentrationen erforderlich sind, um eine antivirale Wirkung zu erzielen in vitro höher sind als die Serumspiegel von Patienten, die wegen Herzrhythmusstörungen behandelt wurden. Wir sind jedoch der Meinung, dass dieses Thema aus mehreren Gründen einer weiteren Prüfung bedarf. Der erste Grund ist das in vivo Amiodaron wird in Metaboliten umgewandelt, die viele der Aktivitäten des Muttermedikaments (7) beibehalten, und daher würde die antivirale Aktivität von Amiodaron durch einen Test in einem Tiermodell von SARS viel geklärt werden, in der Hoffnung, dass Amiodaron und seine Metaboliten gegen das Virus kooperieren könnte. Ein weiterer Grund zu studieren in vivo Die antivirale Aktivität von Amiodaron beruht auf Veränderungen des Virustropismus während der Infektion, da vermutet wurde, dass SARS-CoV zu Beginn der Infektion über den endosomalen Weg in die Zielzellen eindringen kann, während in späteren Stadien eine Entzündung eine Vielzahl von Proteasen freisetzen könnte die den Viruseintritt durch die Plasmamembran induzieren könnten, was zu einer weiteren Erhöhung der Replikationsrate führt (15). Wir vermuten, dass Amiodaron diesen Amplifikationsmechanismus abschwächen könnte, da in vitro seine antivirale Aktivität scheint unabhängig vom Mechanismus des Viruseintritts in die Zielzellen zu sein. Ein weiterer Grund für die Durchführung von Schutzstudien an Tieren besteht darin, dass Amiodaron in Verbindung mit Arzneimitteln versucht werden könnte, die den Viruslebenszyklus durch andere Wirkmechanismen beeinflussen (16).

Wir schließen daraus, dass Amiodaron späte Kompartimente des endozytischen Signalwegs stört und die SARS-Coronavirus-Infektion hemmt, indem es nach der Abgabe des viralen Genoms in das Zytosol wirkt.

Die Autoren danken Professor Federico Rea für seine Hilfe bei der Isolierung menschlicher Alveolarmakrophagen.


Aktueller Stand der antiviralen und arzneimittelfähigen Targets von SARS CoV-2 und anderen humanpathogenen Coronaviren

Coronaviridae ist eine eigentümliche Virusfamilie mit einem sehr großen RNA-Genom und einem charakteristischen Aussehen, die mit einer bemerkenswerten Tendenz ausgestattet ist, vom Tier auf den Menschen zu übertragen. Seit Beginn des 21. Tatsächlich traten in den letzten zwei Jahrzehnten zwei menschliche Coronaviren auf, die schwere Atemwegserkrankungen verursachten: das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus (SARS-CoV-1) und das nahöstliche respiratorische Syndrom-Coronavirus (MERS-CoV), das mehr als 10.000 kumulative Fälle mit Sterblichkeit verursachte Raten von 10 % für SARS-CoV-1 und 34,4 % für MERS-CoV. In jüngerer Zeit ist das Coronavirus-Virus 2 des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2) in China aufgetaucht und wurde als ätiologischer Erreger des jüngsten Ausbruchs der COVID-19-Pandemie identifiziert. Es hat sich weltweit schnell verbreitet und weltweit fast 22 Millionen Fälle und ∼ 770.000 Todesfälle mit einer geschätzten Sterblichkeitsrate von ∼ 3,6 % verursacht, was eine angemessene und wirksame Prävention und Behandlung vor ernsthafte Herausforderungen stellt. Mit Ausnahme des nukleotidanalogen Prodrugs Remdesivir gibt es derzeit trotz mehrerer Bemühungen keine bekannte spezifische, bewährte pharmakologische Behandlung, die in der Lage ist, die Viruseindämmung und -clearance der SARS-CoV-2-Infektion effizient und schnell zu induzieren, sowie keine breite Spektrum-Medikament für andere humanpathogene Coronaviren. Ein weiterer Störfaktor ist der Mangel an molekularen Informationen über die Resistenzneigung von Coronaviren, eine Lücke, die geschlossen werden sollte, um die Wirksamkeit antiviraler Medikamente zu optimieren.

Vor diesem Hintergrund bietet die vorliegende Übersichtsarbeit eine systematische Aktualisierung des aktuellen Wissensstandes der ausgeprägten weltweiten Bemühungen um die Entwicklung antiviraler Strategien zur Bewältigung der Infektion durch SARS-CoV-2 und andere humanpathogene Coronaviren, die Resistenzprofile aufzeigen. Die Aufmerksamkeit wurde auf antivirale Medikamente gerichtet, die hauptsächlich auf virale Protease, RNA-Polymerase und Spike-Glykoprotein abzielen, die getestet wurden in vitro und/oder in klinischen Studien sowie zu vielversprechenden Wirkstoffen, die nachgewiesenermaßen gegen Coronaviren wirksam sind in silico Ansatz zur Wiederverwendung von Medikamenten. In diesem Zusammenhang werden auch neue Erkenntnisse über Verbindungen berichtet, die durch strukturbasiertes virtuelles Screening in der DrugBank-Datenbank mit einem Multi-Targeting-Profil identifiziert wurden. Wir haben speziell 14 vielversprechende Verbindungen identifiziert, die sich durch eine gute in silico Bindungsaffinität zu mindestens zwei der vier untersuchten Targets (virale und Wirtsproteine). Unter diesen zeigten Ceftolozan und NADH das beste Multi-Targeting-Profil, wodurch potenziell das Auftreten resistenter Virusstämme reduziert werden konnte. Wir konzentrierten uns auch auf potenziell neue pharmakologische Ziele für die Entwicklung von Verbindungen mit Anti-Pan-Coronavirus-Aktivität. Durch die Analyse eines großen Satzes viraler Genomsequenzen liefert die aktuelle Übersichtsarbeit eine umfassende und spezifische Karte konservierter Regionen in humanen Coronavirus-Proteinen, die für die Virusreplikation essentiell sind und daher keine oder nur eine sehr begrenzte Mutationsneigung aufweisen. Diese stellen daher wichtige arzneimittelfähige Angriffspunkte für neue Verbindungen gegen diese Virusfamilie dar. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung hochwirksamer und innovativer pharmakologischer Strategien von größter Bedeutung für die Behandlung und/oder Prophylaxe der aktuellen Pandemie, aber möglicherweise auch für zukünftige und unvermeidbare Ausbrüche humanpathogener Coronaviren.


Desinfektionsmittel helfen das Coronavirus abzutöten&mdashaber bitte nicht trinken

Entschuldigung, anscheinend gab es ein zweites Missverständnis.
Er meinte nicht, dass seine Aussage ein Witz war.

Er wollte sagen, er sei ein Witzbold.

Die Demokraten waren sehr enthusiastisch, 2016 für die erste Präsidentin zu stimmen, und sie verloren immer noch (obwohl sie die Mehrheit der Volksabstimmungen gewannen).

Beide Parteien verzeichneten eine Rekordbeteiligung.

Ich denke, alle Trump-Anhänger sollten zuhören und tun, was ihr Präsident vorschlägt.

Und doch liegt die Ablehnung von Trump Woche für Woche bei etwa 50 %.

Die Hälfte der Amerikaner findet das in Ordnung.

Und doch liegt die Ablehnung von Trump Woche für Woche bei etwa 50 %.

Die Hälfte der Amerikaner findet das in Ordnung.

Verschwenden Sie keine Zeit mit Nachdenken oder Verstehen. Konzentrieren Sie sich nur auf die Wahlen im November.

Ich behaupte, dass er nicht dumm ist, sondern dass er so egoistisch ist und seinen Schwanz-Stempel auf alles setzen muss, was er zufälliges Zeug sagt, nur um sicherzustellen, dass seine Stimme ein Teil davon ist.

Die USA sind ein Land, in dem sie Piktogramme von erstickenden Säuglingen anbringen müssen, weil sonst Eltern klagen, nachdem sie sie ihren Kleinkindern (tödlich) als Spielzeug gegeben haben.

Die USA sind ein Land, in dem sie beim Wischen des Bodens die Schilder "rutschig bei Nässe" anbringen müssen, oder es wird Klagen von Verletzten geben, die irgendwie nicht gelernt haben, dass Flüssigkeiten den Reibungskoeffizienten senken.

Und doch zwingt etwas den Präsidenten, Worte zu sagen, die so ausgelegt werden können, als würden Menschen giftige Chemikalien essen. Er kann die Worte einfach nicht halten. Er muss etwas hinzufügen, um sich mit der Nachricht zu verbinden, dass Bleichmittel Viren abtötet. Da alle wahren/nützlichen/erzieherischen Dinge bereits von den Ehrlichen/Hilfsreichen/Informierten gesagt wurden, bleibt nur noch übrig. Quatsch.

Kein Wunder, dafür gibt es ein deutsches Wort: Geltungsdrang. Das Bedürfnis, gezählt/Teil des Gesprächs/bewundert zu werden.

Das hölzerne Staatsoberhaupt hat nie deutlicher gemacht, dass er ein Schlangenölverkäufer ist.

Ich habe eine Schlagzeile gesehen:
"Keine Desinfektionsmittel injizieren, warnt Lysol, als Trump die Idee aufwirft"

Dies war keine Parodie. Dies war nicht in The Onion.

Und anscheinend auch müde von einem funktionierenden Land.

In ihren Augen war es schon kaputt, weil sie nicht ganz oben auf dem Stapel waren..

Sie brauchen nur eine Million Dollar con Impfstoffpatent und sie werden mit Ellison, Trump und dem Rest da sein.

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

"Sarkastisch, sich mit den Medien anzulegen."

Ich hoffe, Trump beschließt, sich selbst eine Hochgeschwindigkeits-Bleikapsel zu injizieren.

Ich hoffe tatsächlich, dass er ein hohes Alter erreicht. Seiner kleinen narzisstischen Schutzblase beraubt und gezwungen, sich dem zu stellen, was er wirklich ist und getan hat, und natürlich die Aufzeichnung dieser Dinge in der Geschichte für die ganze Nachwelt.

Ein schneller Tod durch Vergessen ist für solche Kreaturen viel zu einfach! *

* Normalerweise plädiere ich nicht dafür, Dinge zu bestrafen, die kognitiv nicht in der Lage sind, aus der Bestrafung zu lernen (würdest du einen Hund auspeitschen, weil er kein Englisch lernen kann?), aber ich mache hier eine Ausnahme, wie es der Anschauungsunterricht könnte anderen zugute kommen.

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Ich gehe davon aus, dass die Temperatur für die Zerstörung in der Luft wäre. Nicht in einer schönen Kochsalzlösung im Inneren eines lebenden Körpers, wo die Temperaturen und Wirkungen aufgrund der unterschiedlichen oxidativen Umgebung vermutlich unterschiedlich wären.

(Ups! Que Mr. Trump schlägt vor, dass Menschen Luft direkt in ihre Venen spritzen!)

Ich bin mir nicht sicher, wie genau die Analyse ist.

Ich lebe in Singapur und die Temperatur schwankt in letzter Zeit zwischen 30 und 35 Grad. Hier ist es super feucht – im Durchschnitt mindestens über 80 Prozent.

Im letzten Monat hatten wir eine Explosion von Fällen, hauptsächlich in Wohnheimen für ausländische Arbeiter. Diese ausländischen Arbeiter arbeiten hauptsächlich im Bausektor oder bringen den Müll usw. alles unter der heißen Sonne heraus. Die Schlafsäle haben keine Klimaanlage und sind erwartungsgemäß sehr heiß.

Hey, sehen Sie sich das an, seit dem 1. März dieses Jahres ist die Popularität der Suche nach "25. Zusatzartikel" enorm gestiegen.

In der Zwischenzeit fertige ich meine Pläne für das Donald J. Trump-Denkmal ab. Ich denke, wir können ein klappriges Nebengebäude hinter dem Lincoln Memorial in D.C. aufstellen, mit dem speziellen Toilettenpapier, das mit der US-Verfassung bedruckt ist, damit Sie sich damit den Arsch abwischen können, genau wie "The Donald".

Suchen Sie nach einer Go Fund Me-Seite, die in Kürze geöffnet wird.

Die Handlanger des Scheißkerls versuchen jetzt, ihn zu drehen, da er „sarkastisch“ war.

Nein, er machte seinen üblichen Blödsinn, füllte die Luft mit seinen akustischen Ausscheidungen, ohne sich darum zu kümmern, was tatsächlich aus seinem Mund kam. Alles, was er tat, war, so auszusehen, als ob er seine Untergebenen zu Get Stuff Done kommandierte, denn das ist der einzige Trick, den er neben dem Lügen hat.

Der Spin "Das war sarkastisch!" wird verwendet, wenn sie nichts Besseres zu verwenden haben.

Haben sie das schon mal benutzt? Normalerweise verdoppeln sie sich mit der Dummheit und/oder lügen einfach nur über "Fake News".

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Die Demokraten waren sehr enthusiastisch, 2016 für die erste Präsidentin zu stimmen, und sie verloren immer noch (obwohl sie die Mehrheit der Volksabstimmungen gewannen).

Beide Parteien verzeichneten eine Rekordbeteiligung.

Nur als FYI, laut Wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _Wahlen
2016 hatte nur eine Rekordbeteiligung in absoluten Zahlen. In Prozent der Bevölkerung im Wahlalter lag 2016 mit 55,7% auf der (deprimierend niedrigen) hohen Seite der Zahlen des letzten halben Jahrhunderts. Aber es war nicht annähernd der Rekord. 2008 hatte 58,2% (ebenfalls kein Rekord) und 2012 knapp 54,9%.

Und nur weil ich neugierig war. Es hat nur Informationen seit 1828, aber das Hoch war 1876 bei 81,8%. Seit mehr als einem Jahrhundert haben wir 70 % nicht gebrochen.

Er könnte den Leuten sagen, dass sie Favor-Aid mit Zyanid trinken sollen.

Die Demokraten waren sehr enthusiastisch, 2016 für die erste Präsidentin zu stimmen, und sie verloren immer noch (obwohl sie die Mehrheit der Stimmen gewannen).

Beide Parteien verzeichneten eine Rekordbeteiligung.

Nur als FYI, laut Wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _Wahlen
2016 hatte nur eine Rekordbeteiligung in absoluten Zahlen. In Prozent der Bevölkerung im Wahlalter lag 2016 mit 55,7% auf der (deprimierend niedrigen) hohen Seite der Zahlen des letzten halben Jahrhunderts. Aber es war nicht annähernd der Rekord. 2008 hatte 58,2% (ebenfalls kein Rekord) und 2012 knapp 54,9%.

Und nur weil ich neugierig war. Es hat nur Informationen seit 1828, aber das Hoch war 1876 bei 81,8%. Wir haben 70 % seit mehr als einem Jahrhundert nicht gebrochen.

Ich glaube, niemand weiß, wie schlimm die Dinge sein können. Das Aufsammeln der Teile wird schwierig.

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Ihre Nase ist der Ort, an dem die Luft erwärmt wird, bevor sie in Ihre Lunge gelangt. An den Eintrittspunkten (Nase und Augen) kann es viel kühler sein als in Ihrem Körper.

Die Demokraten waren sehr enthusiastisch, 2016 für die erste Präsidentin zu stimmen, und sie verloren immer noch (obwohl sie die Mehrheit der Stimmen gewannen).

Beide Parteien verzeichneten eine Rekordbeteiligung.

Nur als FYI, laut Wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _Wahlen
2016 hatte nur eine Rekordbeteiligung in absoluten Zahlen. In Prozent der Bevölkerung im Wahlalter lag 2016 mit 55,7% auf der (deprimierend niedrigen) hohen Seite der Zahlen des letzten halben Jahrhunderts. Aber es war nicht annähernd der Rekord. 2008 hatte 58,2% (ebenfalls kein Rekord) und 2012 knapp 54,9%.

Und nur weil ich neugierig war. Es hat nur Informationen seit 1828, aber das Hoch war 1876 bei 81,8%. Wir haben 70 % seit mehr als einem Jahrhundert nicht gebrochen.

Ich glaube, niemand weiß, wie schlimm die Dinge sein können. Das Aufsammeln der Teile wird schwierig.

Ich glaube, das sagten auch die Ägypter, Griechen, Römer und Spanier.

Wenn Sie mich fragen, sieht es so aus, als ob Trump versucht, seine eigenen Wähler zu töten.

Je mehr ich darüber nachdenke, desto verrückter erscheint es.

Das ist nicht wie Bush II, wo viele Leute ihn einen Idioten nannten. Ich bin mir immer noch ziemlich sicher, dass er wahrscheinlich ein einigermaßen intelligenter Typ ist, nur ein beschissener Redner, der einige Dinge getan hat, die etwas weniger als klug waren.

Ich denke, Trump könnte *eigentlich* von unterdurchschnittlicher Intelligenz sein. Ich bin mir sicher, dass die meisten Leute, die sich nicht emotional mit der politischen Welt beschäftigen, wissen, dass der Typ nicht der hellste Laser bei der Lichtshow ist, das ist schon lange klar. Ich sage nicht, dass er eine tiefgreifende geistige Behinderung hat oder dass er auf der Glockenkurve drei Sigma links ist, aber… wow. Mir fehlen nur die Worte.

Apropos George W. Bush, letztes Jahr habe ich ein Interview gesehen, in dem er über sein Malhobby sprach, und ich war überrascht, wie viel beredter er war, als ich ihn in Erinnerung hatte. Es war wundervoll.

Wenn ich darüber nachdenke, glaube ich nicht, dass er wirklich besser im Sprechen wurde, aber im Vergleich zu unserem derzeitigen Präsidenten könnte er genauso gut Shakespeare sein.

Für mich war die Sache mit W., dass ich zwar mit allem nicht einverstanden war, was der Mann jemals sagte oder tat, aber ich glaubte, dass ER an die Wahrheit glaubte, was er sagte, und er tat, was er für das Land am besten hielt. Wir waren uns einfach nicht einig über Interpretationen und was wir als Reaktion darauf tun sollten. Ich denke, er ist und war ein SEHR echter Mann. Und ich glaube, sein Vater war es auch.

Donald Trump war, ist und wird immer ein Betrüger und Gauner bleiben. Er ist nur für sich und seine Familie dabei.

Und nachdem er mehrere nahe Verwandte an Demenz verloren hat, glaube ich wirklich, dass er auch die ersten Anzeichen dafür zeigt. Einige der Dinge, die er tut, sind identisch mit dem, was meine Großmutter und meine Urgroßmutter taten, als ihre Bedingungen fortschritten.

Ich bin ein wenig verwundert über den fast entschuldigenden Ton, den dieser Artikel annimmt.

Sein erster Vorschlag war, dass wir mit einem ungeheuren [etwas – Trump hat tendenziell Probleme damit, einen Gedankenzug zu beenden] „den Körper treffen“, sei es UV oder nur ein sehr starkes Licht. Er springt zu dieser Idee von der Info, dass Sonnenlicht auf äußeren Oberflächen Cov2 schnell abbaut. Offensichtlich kann dieses Licht nicht in Ihren Körper eindringen, also erhöht er den Einsatz, indem er vorschlägt, dass wir Licht in eine Person bringen könnten, "was Sie entweder durch die Haut oder auf andere Weise tun können". "Anders" würde ziemlich viel bedeuten, ein helles sichtbares Licht oder schlimmeres UV-Licht in jemanden einzufügen.

Dann sagt er: „Dann sehe ich das Desinfektionsmittel, wo es in einer Minute ausfällt. Eine Minute. Und gibt es eine Möglichkeit, so etwas zu tun, durch Injektion ins Innere oder fast durch eine Reinigung?"

Man könnte argumentieren, dass "so etwas tun" darauf hindeutet, dass er nicht speziell daran gedacht hat, einer Person Desinfektionsmittel zu injizieren - aber fast alles, was als Desinfektionsmittel gilt, wird genauso gefährlich sein. und wie seine bizarre Werbung für Chloroquin werden die Leute diesen Teil überspringen und ihn lesen, da "Trump denkt, dass Lysol durch Mainlining Covid19 heilen wird!"

Es war kein Moment des "Trumps lauten Denkens".

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Ihre Nase ist der Ort, an dem die Luft erwärmt wird, bevor sie in Ihre Lunge gelangt. An den Eintrittspunkten (Nase und Augen) kann es viel kühler sein als in Ihrem Körper.

Es ist auch insofern nicht gleichwertig, selbst bei 80% Feuchtigkeit und 35 ° C - das ist auf einer nicht biologischen Oberfläche. Sobald sich das Virus in Ihren Atemwegen befindet, hat es Zeit, mit der Auskleidung Ihrer Nasenwege, Ihres Rachens und der Atemwege in Kontakt zu kommen und eine Chance zu bekommen, eine Zelle zu infizieren.

Timeout, wie lange es dauert, mäßig tief einzuatmen – weniger als eine Sekunde. In dieser Sekunde kann es bis zum Boden Ihrer Lunge wandern. Und es ist nicht ein Virus, es wird eine Wolke davon sein.

Der Grund, warum SC2 so ansteckend ist, liegt darin, dass die Proteine ​​auf der „Krone“ außergewöhnlich gut an den ACE3-Rezeptoren dieser Zellen haften, sodass es nur wenige braucht, um eine Infektion auszulösen.

Eines, das passiert, geschieht alles INNERHALB Ihrer Lungenzellen, wo helles Licht oder Desinfektionsmittel oder hohe Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit keinen Unterschied machen. Sobald sie aus einer Zelle ausbrechen, werden Zehntausende die Zellen um sie herum infizieren oder schnell durch Husten übertragen.

Ich würde wirklich gerne den Slack-Chat für Ars Orbiting HQ im Vorfeld dieses Artikels sehen. Wirklich.

Alle Nachrichtenagenturen sollten kollektiv aufhören, über das zu berichten, was Donald Trump *sagt* und nur über das berichten, was er tatsächlich *tat*, denn in jedem Nachrichtenartikel geht es ausnahmslos darum, wie schockierend dumm seine Kommentare zu *allem* sind, also schalten die Leute es einfach aus.

Wenn Donald Trump etwas wirklich Schreckliches *angestellt* hat, ist es im weißen Rauschen seiner dummen Kommentare verloren oder am nächsten Tag vergessen, wenn er etwas anderes Schockierendes sagt.

Dieser Artikel ist ein perfektes Beispiel – wie viele Menschen hätten ernsthaft daran gedacht, sich Desinfektionsmittel zu injizieren, wenn niemand wusste, dass Trump es jemals erwähnt hat?

Es ist fast so, als wüsste er, wie die Medien über ihn berichten und handelt entsprechend, um maximales Chaos zu schaffen.

Er hat etwas wirklich Schreckliches getan, indem er vorgeschlagen hat, dass Menschen Desinfektionsmittel als Heilmittel gegen COVID-19 injizieren.

Die Demokraten waren sehr enthusiastisch, 2016 für die erste Präsidentin zu stimmen, und sie verloren immer noch (obwohl sie die Mehrheit der Stimmen gewannen).

Beide Parteien verzeichneten eine Rekordbeteiligung.

Nur als FYI, laut Wikipedia
https://en.wikipedia.org/wiki/Voter_tur . _Wahlen
2016 hatte nur eine Rekordbeteiligung in absoluten Zahlen. In Prozent der Bevölkerung im Wahlalter lag 2016 mit 55,7% auf der (deprimierend niedrigen) hohen Seite der Zahlen des letzten halben Jahrhunderts. Aber es war nicht annähernd der Rekord. 2008 hatte 58,2% (ebenfalls kein Rekord) und 2012 knapp 54,9%.

Und nur weil ich neugierig war. Es hat nur Informationen seit 1828, aber das Hoch war 1876 bei 81,8%. Wir haben 70 % seit mehr als einem Jahrhundert nicht gebrochen.

Ich glaube, niemand weiß, wie schlimm die Dinge sein können. Das Aufsammeln der Teile wird schwierig.

Ich glaube, das sagten auch die Ägypter, Griechen, Römer und Spanier.

Ich rede nicht nur von dieser Pandemie.

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Ihre Nase ist der Ort, an dem die Luft erwärmt wird, bevor sie in Ihre Lunge gelangt. An den Eintrittspunkten (Nase und Augen) kann es viel kühler sein als in Ihrem Körper.

Es ist auch insofern nicht gleichwertig, selbst bei 80% Feuchtigkeit und 35 ° C - das ist auf einer nicht biologischen Oberfläche. Sobald sich das Virus in Ihren Atemwegen befindet, hat es Zeit, mit der Auskleidung Ihrer Nasenwege, Ihres Rachens und der Atemwege in Kontakt zu kommen und eine Chance zu bekommen, eine Zelle zu infizieren.

Timeout, wie lange es dauert, mäßig tief einzuatmen – weniger als eine Sekunde. In dieser Sekunde kann es bis zum Boden Ihrer Lunge wandern. Und es ist nicht ein Virus, es wird eine Wolke davon sein.

Der Grund, warum SC2 so ansteckend ist, liegt darin, dass die Proteine ​​auf der „Krone“ außergewöhnlich gut an den ACE3-Rezeptoren dieser Zellen haften, sodass es nur wenige braucht, um eine Infektion auszulösen.

Eines, das passiert, geschieht alles INNERHALB Ihrer Lungenzellen, wo helles Licht oder Desinfektionsmittel oder hohe Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit keinen Unterschied machen. Sobald sie aus einer Zelle ausbrechen, werden Zehntausende die Zellen um sie herum infizieren oder schnell durch Husten ausgeschieden.

Im Ernst - ich habe dazu eine technisch-wissenschaftliche Frage. Und ja, bitte haben Sie Verständnis - ich weiß sehr wenig über Virii und Biologie im Allgemeinen (eher ein Computer-Hardware-Typ).

Auf den ersten Blick bedeutet dies, dass das Virus bei 35 ° C / 80 % Luftfeuchtigkeit im Vergleich zu 24 ° C / 20 % Luftfeuchtigkeit schnell stirbt. Naiv würde ich mir jedoch vorstellen, dass das Innere des Körpers eher 35 ° C (37,5 ° C?) Fängt es an, *DAS* schnell zu reproduzieren? Wie in 5-10 Minuten? Ich dachte immer, die Virusreproduktion brauchte ein paar Stunden, um wirklich in Gang zu kommen, aber ich liege wahrscheinlich falsch.

Ihre Nase ist der Ort, an dem die Luft erwärmt wird, bevor sie in Ihre Lunge gelangt. An den Eintrittspunkten (Nase und Augen) kann es viel kühler sein als in Ihrem Körper.

Es ist auch insofern nicht gleichwertig, selbst bei 80% Feuchtigkeit und 35 ° C - das ist auf einer nicht biologischen Oberfläche. Sobald sich das Virus in Ihren Atemwegen befindet, hat es Zeit, mit der Auskleidung Ihrer Nasenwege, Ihres Rachens und der Atemwege in Kontakt zu kommen und eine Chance zu bekommen, eine Zelle zu infizieren.

Legen Sie fest, wie lange es dauert, mäßig tief einzuatmen – weniger als eine Sekunde. In dieser Sekunde kann es bis zum Boden Ihrer Lunge wandern. Und es ist nicht ein Virus, es wird eine Wolke davon sein.

Der Grund, warum SC2 so infektiös ist, liegt darin, dass die Proteine ​​auf der „Krone“ außergewöhnlich gut an den ACE3-Rezeptoren dieser Zellen haften, sodass es nur wenige braucht, um eine Infektion auszulösen.

Eines, das passiert, geschieht alles INNERHALB Ihrer Lungenzellen, wo helles Licht oder Desinfektionsmittel oder hohe Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit keinen Unterschied machen. Sobald sie aus einer Zelle ausbrechen, werden Zehntausende die Zellen um sie herum infizieren oder schnell durch Husten ausgeschieden.

Eines der interessanten Dinge an diesem speziellen Enzym ist, dass es auf der Oberfläche der Lungenalveolenzellen nicht allzu viel vorkommt, zumindest im Vergleich zu einigen der inneren Organe. Das bedeutet, dass das Virus diese Zellen in aller Ruhe infizieren und seine Nachkommen in die Ausatmung freisetzen kann, ohne die Lungenfunktion ernsthaft zu beeinträchtigen. Erst wenn sich der Angriff nach innen auf die verschwenderischen Brutstätten verlagert, beginnt der Zytokinsturm ernsthaft.


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