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Moleküle, Targets und Isoformen

Moleküle, Targets und Isoformen


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Ich habe eine Frage. Gegeben ein Molekül A und zwei Isoformen eines Gens X, Y und das Wissen, dass A auf X abzielt. Kann ich daraus schließen, ob A auf Y abzielt?

Denken Sie als Motivation an Furosemide (= A) und SLC12A1, SLC12A2. Von Drugbank weiß ich, dass Furosemide auf SLC12A1 abzielt, und von KEGG weiß ich, dass Furosemide auf beide Gene abzielt. Ich frage mich, ob ich das KEGG-Wissen schon aus dem Drugbank-Wissen ableiten kann…

Beste, Alex :)


Die kurze Antwort ist nein. Entscheidend ist, ob die Sequenz und Faltung (wenn Sie von der Bindung von A an Proteine ​​anstelle von DNA sprechen) jeder Isoform Ihres Gens immer noch zur Bindung von A führt.

Mit anderen Worten, A kann an X binden. Y, eine Isoform von X hat möglicherweise nicht die gleiche Sequenz, an die A gerne bindet. Oder im Fall von Proteinen und A kann sich Y etwas anders falten, was die Zugänglichkeit von A zu Y verhindert.


Tenascin-Isoformen: mögliche Angriffspunkte für die Diagnose und Therapie von Krebs und Mechanismen, die ihre Expression regulieren

Funktionell unterschiedliche Tenascin (TN)-Isoformen, die unterschiedliche Anzahlen von III-Homologie-Wiederholungen enthalten, werden durch alternatives Spleißen eines einzelnen TN-Primärtranskripts erzeugt. Kürzlich wurde berichtet, dass die größere TN-Isoform im Allgemeinen in neoplastischen Geweben stärker exprimiert wird als in den normalen Geweben, aus denen der Tumor stammt. Dies ist zumindest bei Brustläsionen auf die hohe proliferative Aktivität der Stromaelemente zurückzuführen. Tatsächlich ist das TN-Spleißen zellzyklusabhängig und bietet somit ein brauchbares System zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die alternatives Spleißen regulieren, und legt nahe, dass zellzyklusabhängige Modifikationen im Spleißmuster der primären Transkripte (die sehr wahrscheinlich nicht auf das TN . beschränkt sind) pre-mRNA) kann auch ein regulatorischer Mechanismus des Zellzyklus sein. Darüber hinaus ermöglicht die sehr hohe Akkumulation der größeren TN-Isoform bei Neoplasien, dass breitere diagnostische und therapeutische monoklonale Antikörper, die für die größeren TN-Isoformen spezifisch sind, für eine Reihe von Tumoren in Betracht gezogen werden.


Überblick über zielspezifische Assay-Services

Reaction Biology bietet Compound-Screening-Assays für mehr als 1000 Targets an, um die Entdeckung neuer Medikamente zu unterstützen. Die meisten unserer Assays sind Hochdurchsatz-kompatibel und können an Ihre spezifischen Anforderungen angepasst werden.

Reaktionsbiologie bietet das branchenweit größte Portfolio an Kinase-Assays. Wir sind bestrebt, einen End-to-End-Service für die Entdeckung von Kinase-Wirkstoffen anzubieten, der alle Schritte des präklinischen Wirkstoffforschungsprozesses abdeckt.

Epigenetische Enzyme steuern die Mechanik der genetischen Expression und fungieren als „Ein“- und „Aus“-Schalter für das menschliche Genom. Fehlfunktionen dieser Enzyme sind an vielen immunologischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie an Krebs beteiligt. Wir sind bestrebt, einen End-to-End-Service für die epigenetische Wirkstoffforschung bereitzustellen, der alle Schritte des präklinischen Wirkstoffforschungsprozesses abdeckt.

Für die Wirkstoffforschung, die auf den Kras-Weg abzielt, steht eine Reihe von Assay-Formaten zur Verfügung. Biochemische und biophysikalische Methoden ermöglichen die Untersuchung verschiedener KRas-Regulatoren.

Das Screening von Verbindungen gegen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP)-Enzyme wird mit radiometrischen Aktivitätsassays nach Goldstandard durchgeführt.

Die Aktivität von Phosphatasen wird mit einem fluoreszenzbasierten Ansatz für die Profilierung von Anti-Phosphatase-Verbindungen quantifiziert.

Unser großes Panel an Protease-Assays ermöglicht die gezielte Wirkstoffsuche von Protease-Inhibitoren sowie ein Selektivitäts-Screening mit unserem Protease-Panel. Alle Assays basieren auf Fluoreszenz und quantifizieren die Proteaseaktivität.

Die Reaktionsbiologie bietet Assays zur Untersuchung von Testmolekülen, die auf den Apoptoseweg abzielen. Die Assay-Technologie misst die Bindung des apoptotischen Proteins wie BCL2 an ein Substratpeptid wie BAK.

Stoffwechselweg-Assays

Um die Entdeckung neuer Medikamente gegen Phosphodiesterase-Enzyme zu unterstützen, bietet Reaction Biology Aktivitätsassays für das Screening von Verbindungen an.

Die Reaktionsbiologie bietet ein Wirkstoffprofil für die 6 wichtigsten CYP-Isoformen, um frühzeitig Hinweise auf die Toxizität eines Wirkstoffs zu geben.

Assays für das Screening von Verbindungen zur Hemmung des Proteasoms und der Deubiquitinasen werden von Reaction Biology mit fluoreszenzbasierten Aktivitätsassays angeboten.

Reaktionsbiologie bietet zellbasierte Tests zur Entdeckung von Medikamenten, die auf Ionenkanäle abzielen.

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Reaction Biology bietet eine Reihe von zellbasierten Assays, um die Entdeckung neuer Medikamente zur Modulation von nuklearen Rezeptoren zu unterstützen.

Zusätzliche Ziele

Reaktionsbiologie kann Sie bei der Herstellung von Proteinen und Assays für eine Vielzahl von Zielklassen wie Kinasen, Epigenetik, PARPs, DUB, HSP, Protease, Phosphatase und viele mehr unterstützen.


Eine strukturbiologische Perspektive auf bioaktive kleine Moleküle und ihre pflanzlichen Ziele

Die strukturbiologischen Bemühungen der letzten Jahre haben zahlreiche Co-Kristallstrukturen bioaktiver kleiner Moleküle hervorgebracht, die mit ihren pflanzlichen Zielmolekülen interagieren. Diese Studien umfassen die Ziele verschiedener Phytohormone, von Pathogenen abgeleiteter Effektoren, Herbizide und anderer bioaktiver Verbindungen. Hier diskutieren wir, dass diese Sammlung von Strukturen ausgezeichnete Beispiele für neun kollektive Beobachtungen enthält: molekulare Klebstoffe, Allosterie, Inhibitoren, molekulare Mimikry, promiskuitive Bindungsstellen, unerwartete Elektronendichten, natürliche Selektion bei atomarer Auflösung und Anwendungen in der strukturgesteuerten Mutagenese und in kleinen Molekülen Entwurf.

Höhepunkte

► Es wurden über 70 Kristallstrukturen von Pflanzenproteinen mit bioaktiven kleinen Molekülen berichtet. ► Wir diskutieren neun kollektive Beobachtungen aus diesen Manuskripten. ► Wir fanden klare Beispiele für kleine Moleküle, die als Inhibitoren, allosterische Liganden oder molekulare Klebstoffe wirken. ► Kleine Moleküle können auch körpereigene Moleküle nachahmen oder an promiskuitive Bindungsstellen binden. ► Unerwartete Elektronendichten haben überraschende Liganden enthüllt. ► Strukturbiologie an Herbizid-Targets erklärt Resistenzmutationen. ► Strukturinformationen wurden für das Design kleiner Moleküle und die strukturgesteuerte Mutagenese verwendet.


Moleküle, Targets und Isoformen - Biologie

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Ergebnisse

In Planta Expression von Pi04314 verstärkt die Infektion

Der Kandidat RXLR-Effektor PITG_04314/PexRd24 (Pi04314) wird während der biotrophen Infektionsphase in allen stark und spezifisch hochreguliert P. infestans getestete Isolate 22,23,24 . Wir haben seine Hochregulation während der frühen Infektionsstadien (24–72 h nach der Impfung) von bestätigt N. Benthamiana mittels quantitativer reverser Transkription (qRT)-PCR im Isolat 88069, das wir für Laborstudien verwenden (ergänzende Abb. 1a). N. Benthamiana ist ein weit verbreiteter Modellhost für P. infestans, da es vorübergehende Agrobakterium-vermittelte Genexpression, virusinduziertes Gen-Silencing (VIGS) und nicht-invasive konfokale Mikroskopie zur Unterstützung der funktionellen Charakterisierung molekularer Interaktionen zwischen Pathogen und Wirt 16,19,20,26 .

Um die subzelluläre Lokalisation von Pi04314 zu bestimmen, wurde eine N-terminale grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion an Pi04314 vorübergehend in exprimiert N. Benthamiana. GFP–Pi04314, das stabil war in planta (Ergänzende Abb. 1b), stark akkumuliert im Nukleoplasma und Nukleolus, mit zusätzlichem zytoplasmatischem Hintergrund (Abb. 1a Ergänzende Abb. 1c). Um zu bewerten, ob Pi04314 eine Rolle beim Beitrag zu spielt P. infestans Virulenz wurde GFP-Pi04314 vorübergehend in der Hälfte von an . exprimiert N. Benthamiana Blatt mit freiem GFP, das im anderen exprimiert wird. Die beiden Blatthälften wurden tropfengeimpft mit P. infestans Zoosporen, und die Läsionsgröße wurde 7 Tage nach der Inokulation (d.p.i.) gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Hälften der Blätter, die GFP-Pi04314 exprimieren, signifikant fördern (Varianzanalyse (ANOVA), P<0.001) größer P. infestans Läsionen im Vergleich zu freiem GFP, was darauf hindeutet, dass die Aktivität von Pi04314 innerhalb von Wirtszellen für eine Infektion von Vorteil ist (Fig. 1b, ergänzende Fig. 2).

(ein) Bilder sind Projektionen der konfokalen Z-Serie von GFP-Pi04314 und die Formen der Fusion mit hinzugefügten Targeting-Signalen myrGFP–Pi04314 und NLSGFP-Pi04314, um das Niveau der Effektorfusion im Kern zu verringern bzw. zu erhöhen. Eingesetzte Bilder sind einzelne optische Schnitte durch die Zellkerne. Maßstabsleiste, 20 μm. (B) GFP–Pi04314 und NLSGFP–Pi04314 können fördern P. infestans Wachstum nach Agrobakterium-vermittelte Expression im Vergleich zu einer GFP-Kontrolle. Der Läsionsdurchmesser unterschied sich nicht signifikant zwischen myrGFP–Pi04314-exprimierende Pflanzen und die Kontrolle. Fehlerbalken sind Standardfehler und das Diagramm repräsentiert die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten (n= 56 pro Konstrukt). Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P≤0.005).

Um den Ort der Pi04314-Aktivität innerhalb der Wirtszellen weiter zu untersuchen, wurde der Effektor mit einem N-terminalen Myristoylierungssignal exprimiert (myrGFP–04314), wie zuvor beschrieben 19 , um es mit Pflanzenmembranen zu assoziieren und so vom Zellkern wegzulenken. Diese Strategie wurde bevorzugt gewählt, um ein nukleares Exportsignal hinzuzufügen, da der Effektor bei einem nuklearen Exportsignal immer noch in den Nukleus eindringen würde, bevor er exportiert wurde 27 . Die myrDie GFP-04314-Fusion war tatsächlich weitgehend vom Kern befreit (Abb. 1a Ergänzende Abb. 1c). Im Gegensatz dazu wurde zur Fokussierung von Pi04314 im Kern ein N-terminales Kernlokalisierungssignal hinzugefügt (NLSGFP–Pi04314) 28 . Die NLSDas GFP-Pi04314-Fusionsprotein wurde hauptsächlich im Zellkern nachgewiesen und blieb stabil in planta (Abb. 1a Ergänzende Abb. 1c). myrGFP–Pi04314 und NLSGFP-Pi04314-Fusionen wurden vorübergehend in N. Benthamiana und die Blätter wurden herausgefordert P. infestans. Abbildung 1b zeigt, dass der Ausdruck von myrGFP-Pi04314 verursachte keinen statistisch signifikanten Anstieg der Infektion im Vergleich zur freien GFP-Kontrolle (ANOVA, P=0.406), während GFP–Pi04314 und NLSGFP-Pi04314-Unterstützung vergleichbar P. infestans Läsionsgrößen (ANOVA, P= 0,964), die höher sind als die freie GFP-Kontrolle (ANOVA, P<0.001) oder als myrGFP–Pi04314 (ANOVA, P=0,006 und P=0,007 bzw.). Auf der Grundlage dieser Beobachtungen schlagen wir vor, dass die Lokalisierung von Pi04314 im Wirtskern erforderlich und ausreichend ist, um eine verstärkte Blattbesiedelung durch zu fördern P. infestans.

Pi04314 interagiert mit drei Isoformen von PP1c

Um mögliche Wirtsziele von Pi04314 zu identifizieren, wurde eine Hefe-2-Hybrid (Y2H)-Bibliothek, die aus infizierter Kartoffel-cDNA 16 erstellt wurde, bis zu einer Tiefe von 2,6 Millionen Hefe-Cotransformanten mit einem GAL4-DNA-Bindungsdomäne-Pi04314-Fusionskonstrukt ("bait" ). Achtzehn Hefekolonien wurden aus Selektionsplatten gewonnen, die Fusionen der GAL4-Aktivierungsdomäne ("Beute") enthielten, deren Sequenzen drei verschiedenen Isoformen von Kartoffel-PP1c-Familienproteinen entsprechen, im Folgenden als StPP1c-1, StPP1c-2 und StPP1c-3 bezeichnet. Ein phylogenetischer Baum basierend auf einer getrimmten Anordnung der Kartoffelproteine ​​mit Arabidopsis Typ-1-Proteinphosphatasen (TOPPs) zeigten, dass StPP1c-1, StPP1c-2 und StPP1c-3 mit AtTOPP1, AtTOPP2, AtTOPP4 und AtTOPP5 Cluster bilden (ergänzende Fig. 3). Ausdrucksstufen dieser drei StPP1c Gene werden in den ersten 2 Tagen der nicht signifikant verändert P. infestans Infektion (ergänzende Abb. 3), was keinen Hinweis darauf liefert, dass sie immunreagibel sind.

Um die Interaktionen zu bestätigen, wurde paarweise Y2H mit den StPP1c-Beuteklonen voller Länge gegen den Köder Pi04314 durchgeführt, wobei der RXLR-Effektor SFI3 als negativer Kontrollköder verwendet wurde. Während SFI3 eine ähnliche Kernlokalisation wie Pi04314 zeigt und auch verbessert P. infestans Blattbesiedelung bei vorübergehender Expression in planta, im Gegensatz zu Pi04314 unterdrückt es frühe Transkriptionsreaktionen, die durch das bakterielle PAMP flg22 aktiviert werden, was darauf hindeutet, dass es keine ähnliche Funktion hat 19 . Pi04314 interagiert mit jeder PP1c-Isoform, wie durch die Induktion der B-Galactosidase-Aktivität und das Wachstum auf Medien ohne Histidin angezeigt, während die SFI3-PP1c-Kombinationen keinen der Reporter aktivierten (Abb. 2a).

(ein) Hefe, die die PP1c-Isoformen mit Pi04314 co-exprimierte, wuchs auf Histidin-(HIS)-Medium und ergab b-Galactosidase-(B-gal)-Aktivität, während die mit dem Kontroll-SFI3 oder dem leeren Vektor (EV) co-exprimierten dies nicht taten. (B) Immunpräzipitation (IP) von Proteinextrakten aus agroinfiltrierten Blättern mit GFP-Trap bestätigte, dass cMyc-markierte PP1c-Isoformen spezifisch mit GFP-Pi04314 und nicht mit der GFP-SFI3-Kontrolle assoziiert sind. Die Expression von Konstrukten in den Blättern ist mit + gekennzeichnet. Proteingrößenmarker sind in kDa angegeben und die Proteinbeladung wird durch Ponceau-Färbung angezeigt.

Um zu bestätigen, dass diese Wechselwirkungen auch auftreten in planta Co-Immunpräzipitation (Co-IP)-Experimente wurden unter Verwendung von GFP-Pi04314 und N-terminalen cMyc-markierten PP1c-Konstrukten (cMyc-PP1c-1, cMyc-PP1c-2 und cMyc-PP1c-3) mit GFP-SFI3 als ein nicht interagierendes Steuerelement. Die GFP- und cMyc-Fusionskonstrukte wurden vorübergehend in N. Benthamiana und nach Immunpräzipitation mit GFP-TRAP_M-Beads wurden die Konstrukte cMyc-PP1c-1, cMyc-PP1c-2 und cMyc-PP1c-3 in Gegenwart von GFP-Pi04314 immunpräzipitiert, jedoch nicht mit der GFP-SFI3-Kontrolle, während alle Konstrukte wurden in den relevanten Inputfraktionen nachgewiesen (Abb. 2b).

Pi04314 relokalisiert die StPP1c-Isoformen aus dem Nukleolus

Um die subzelluläre Lokalisation des monomeren rot fluoreszierenden Proteins (mRFP) der Isoform StPP1c zu untersuchen, wurden N-terminale Fusionskonstrukte generiert (mRFP-PP1c-1, mRFP-PP1c-2 und mRFP-PP1c-3) und nachfolgend betrachtet Agrobakterium-vermittelter Ausdruck in N. Benthamiana mit konfokaler Mikroskopie. Jedes mRFP-PP1c-Fusionsprotein war überwiegend im Nukleoplasma und im Nukleolus lokalisiert, mit zytoplasmatischer Hintergrundfluoreszenz (ergänzende Abb. 4a).

Da die Isoformen von Pi04314 und StPP1c bei unabhängiger Expression ähnliche subzelluläre Lokalisationen zeigten, wurde jedes mRFP-PP1c-Konstrukt mit GFP-Pi04314 oder mit GFP-SFI3 als Kontrolle co-exprimiert. Bemerkenswerterweise zeigte jedes mRFP-PP1c-Konstrukt eine reduzierte nukleoläre Fluoreszenz, wenn es mit GFP-Pi04314 koexprimiert wurde, während sich die nukleoläre mRFP-PP1c-Lokalisierung nicht änderte, wenn es mit GFP-SFI3 exprimiert wurde (Abb. 3a).

(ein) Bildersätze sind einzelne optische Schnitte typischer Kerne, die GFP-Pi04314 oder die GFP-SFI3-Kontrolle koexprimieren, wobei jede Isoform von PP1c an mRFP fusioniert ist. Maßstabsleiste, 5 μm. Weiße Pfeile zeigen mRFP-Fluoreszenzintensitätsdiagramme an, die in den Grafiken rechts neben jedem Bild dargestellt sind. (B) Diagramme der durchschnittlichen Verhältnisse von nukleolärer zu nukleoplasmatischer mRFP-Fluoreszenz aus den PP1c-Isoformen allein oder mit jedem Effektor co-exprimiert, was zeigt, dass ein signifikanter Verlust von mRFP-PP1c aus dem Nukleolus nur in Gegenwart von GFP-Pi04314 auftrat. Die Mittelwerte wurden aus Bildern von mehr als 50 Kernen für jede Bedingung erhalten. Fehlerbalken sind z.B. und der Graph repräsentiert die kombinierten Daten von sechs biologischen Replikaten. Buchstaben in den Grafiken kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001).

Das Verhältnis von mRFP-PP1c nukleolärer zu nukleoplasmatischer Fluoreszenz wurde in mehr als 50 Kernen für jedes Konstrukt und (Co-)Expressionsereignis gemessen und zeigte tatsächlich eine statistisch signifikante Abnahme (ANOVA, P<0,001) bei Co-Expression mit GFP-Pi04314, verglichen mit Co-Expression mit GFP-SFI3, oder wenn jedes mRFP-PP1c-Konstrukt allein exprimiert wurde (Fig. 3b). Die reduzierte nukleoläre mRFP-PP1c-Akkumulation in Gegenwart von GFP-Pi04314 kann dadurch erklärt werden, dass (1) die Pi04314-Wechselwirkung eine Relokalisierung von PP1c aus dem Nukleolus verursacht oder (2) Pi04314 den Abbau von PP1c speziell im Nukleolus provoziert. Es gab jedoch keine Hinweise auf eine unterschiedliche mRFP-PP1c-Akkumulation, wenn sie allein exprimiert oder mit GFP-Pi04314 oder GFP-SFI3 co-exprimiert wurde (ergänzende Abb. 4b). Darüber hinaus wurde eine Abnahme der nukleoplasmatischen GFP-Fluoreszenz auch spezifisch beobachtet, wenn GFP-Pi04314 mit jeder mRFP-PP1c-Isoform co-exprimiert wurde, verglichen mit GFP-Pi04314 allein (Ergänzende Abb. 5). In Abwesenheit eines nachweisbaren Proteinabbaus ist die beobachtete Abnahme beider Interaktionspartner im Nukleolus konsistent mit einer Relokalisierung der GFP-Pi04314/mRFP-PP1c-Komplexe vom Nukleolus, möglicherweise in das Nukleoplasma. In Übereinstimmung damit, wenn es mit dem falsch lokalisierten . ausgedrückt wird myrGFP-Pi04314, mRFP-PP1c-Nukleolenfluoreszenz war ungestört (ergänzende Abb. 6). Im Gegensatz dazu, wie erwartet, wenn mRFP-PP1c-1 mit dem nuklearfokussierten NLSGFP-Pi04314, reduzierte nukleoläre Fluoreszenz im Vergleich zur nukleoplasmatischen Fluoreszenz wurde sowohl für den Effektor als auch für das mutmaßliche Ziel beobachtet (ergänzende Abb. 7).

Um zu untersuchen, ob auch während einer Infektion eine Relokalisierung von PP1c aus dem Nukleolus auftritt, N. Benthamiana exprimierenden GFP-PP1c-1 wurde mit Zoosporen von transgenen P. infestans 88069, das das fluoreszierende Protein Td-Tomate exprimiert. Das Verhältnis von nukleolärer zu nukleoplasmatischer GFP-Fluoreszenz war in Wirtszellen, die mit Haustorien interagieren, im Vergleich zu nicht infizierten . signifikant reduziert N. Benthamiana Blattzellen (Abb. 4). Dies weist darauf hin, dass eine Relokalisierung von GFP-PP1c-1 auch während der frühen Infektionsstadien auftritt.

(ein) Diagramm, das zeigt, dass das mittlere Verhältnis von nukleolärer zu nukleoplasmatischer Fluoreszenz von GFP-PP1c-1 in Zellen mit P. infestans Haustoria (kombiniert aus drei biologischen Replikaten mit insgesamt 35 Kernen, gemessen von Zellen, die GFP-PP1c-1-Fluoreszenz exprimieren und rot fluoreszierende Haustorien aus P. infestans Stamm 88069 tdt), verglichen mit 22 GFP-PP1c-1-exprimierenden Kernen in nicht infizierten Zellen. Buchstaben bezeichnen statistische Signifikanz (ANOVA, P=0.001). (B) Bilder sind repräsentativ für die verschiedenen Muster, die bei der GFP-PP1c-1-Relokalisierung vom Nukleolus beobachtet wurden. Die nukleoläre GFP-PP1c-1-Fluoreszenz in haustorierten Zellen war im Vergleich zu nicht infizierten Zellen (untere Abbildung) entweder erheblich abgeschwächt (obere Abbildung) oder reduziert (mittlere Abbildung). Entsprechende Fluoreszenzintensitäts-Plots (aus Pfeillinien, die in jedem Bild angezeigt werden) werden in Diagrammen rechts neben dem Bild gezeigt. Rot fluoreszierende Haustorien sind mit * Maßstabsbalken, 10 µm, gekennzeichnet.

Pi04314 interagiert mit PP1c über ein konserviertes R/KVxF-Motiv

Die Aktivität der Proteinphosphatase wird häufig durch Interaktionen mit Proteinbindungspartnern reguliert. PP1c-Phosphatasen in Säugetieren assoziieren mit >200-regulatorischen Untereinheiten, die PP1c an verschiedene Stellen innerhalb der Zelle zielen und Substratspezifität bereitstellen. Die meisten regulatorischen Untereinheiten interagieren mit PP1c über ein konserviertes PP1c-Bindungsmotiv, das als R/KVxF bekannt ist und dem Konsensus [K/R][K/R][V/I]X[F/W] entspricht. Die R/KVxF-Bindungsfurche von PP1c ist 20 Å vom aktiven Zentrum entfernt und somit hemmt die Bindung die Phosphataseaktivität nicht 29 . Nichtsdestotrotz interagieren viele inhibitorische Untereinheiten von PP1c auch über das R/KVxF-Motiv, wie die weit konservierte Inhibitor-2-Untereinheit in veranschaulicht Arabidopsis 30. Wir beobachteten ein Kandidatenmotiv, KVTF, von den Resten 117 bis 120 in der C-terminalen Region von Pi04314, was die Möglichkeit erhöht, dass dies die Wechselwirkung zwischen dem Effektor und den PP1c-Isoformen vermittelt. Daher mutierten wir diese Reste zu Alaninen (ergänzende Fig. 8), um Pi04314mut zu erzeugen.

Pi04314mut war nicht in der Lage, mit PP1c-1, PP1c-2 oder PP1c-3 in Hefe zu interagieren, unter Verwendung des Y2H-Assays (gezeigt für PP1c-1 Abb. 5) oder in planta unter Verwendung von Co-IP (Abb. 5 Ergänzende Abb. 9a). Darüber hinaus gelang es nicht, die PP1c-Isoformen aus dem Nukleolus zu relokalisieren (Abb. 5c, d, ergänzende Abb. 9b, c). Entscheidend ist, dass es im Gegensatz zum Wildtyp (WT) Pi04314 nicht verbessert wurde P. infestans Kolonisation von N. Benthamiana Blätter (Abb. 5e). Die Interaktion von Pi04314 mit PP1c-Isoformen ahmt somit regulatorische Untereinheiten nach, indem sie über ein R/KVxF-Motiv bindet. Hinsichtlich der potentiellen Wirkungsweise dieses Effektors bieten sich drei Möglichkeiten an: (1) er wirkt als inhibitorische Untereinheit, um die PP1c-Aktivität zu verhindern (2) er konkurriert um die Bindung endogener PP1c-regulatorischer Untereinheiten und wirkt somit indirekt als Inhibitor von normale PP1c-Aktivität oder (3) es fungiert als regulatorische Untereinheit, die die PP1c-Aktivität auf definierte Substrate zur Dephosphorylierung richtet.

(ein) Hefe-2-Hybrid-Assay nach Co-Expression von PP1c-1 und Wildtyp (WT) Pi04314, das auf −Histidin (−HIS)-Medium wuchs und β-Galactosidase (B-gal)-Aktivität aufwies, während Co-Expression von PP1c-1 mit Pi04314mut nicht. (B) Immunpräzipitation von WT-GFP-Pi04314- und GFP-Pi04314mut-Proteinextrakten aus agroinfiltrierten Blättern mit GFP-Trap bestätigte, dass cMyc-PP1c-1 nur mit WT-GFP-Pi04314 co-immunpräzipitierte. Die Expression von Konstrukten in den Blättern ist mit + gekennzeichnet. Proteingrößenmarker sind in kDa angegeben, die Proteinbeladung wird durch Ponceau-Färbung angezeigt und die verwendeten Antikörper sind wie angegeben (αcMyc und αGFP). (C) Ein einzelner optischer Schnitt durch co-exprimierende Kerne zeigt, dass die mutierte Effektorfusion GFP-Pi04314mut, die mit mRFP-PP1c-1 co-exprimiert wurde, keine Reduktion der mRFP-Fluoreszenz im Nukleolus verursachte, während dies bei WT GFP-Pi04314 der Fall war. Maßstabsleiste, 10 μm. Weiße Pfeile zeigen mRFP-Fluoreszenzintensitätsdiagramme an, die in den Grafiken rechts neben jedem Bild dargestellt sind. (D) Diagramm zeigt das durchschnittliche Verhältnis von nukleolärer zu nukleoplasmatischer mRFP-Fluoreszenz aus allein exprimiertem mRFP-PP1c-1, mit der WT-Effektorfusion GFP-Pi04314 und mit dem mutierten Effektor GFP-Pi04314mut. Die Mittelwerte wurden von mindestens 30 Kernen für jede Probe erhalten. Fehlerbalken sind z.B. und der Graph repräsentiert die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten. Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (e) Die GFP-Fusion zum mutierten Pi04314 ist nicht mehr in der Lage, P. infestans Infektion, gemessen am Läsionsdurchmesser. Fehlerbalken sind z.B. und die Grafik stellt die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten dar (n= 108 pro Konstrukt). Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P≤0.022).

Stummschaltung von NbPP1c dämpft P. infestans Infektion

Um die potenzielle Rolle der PP1c-Aktivität bei der Prävention oder Förderung von Krankheiten zu testen, haben wir das Äquivalent identifiziert PP1c Familienmitglieder in N. Benthamiana (Ergänzende Abb. 2) und ihre Expression mit VIGS zum Schweigen gebracht. Da Phosphatase-kodierende Teile von Mitgliedern der PP1c-Familie hoch konserviert sind, haben wir die divergenten Teile an den terminalen 5′- und 3′-Regionen jedes Gens ausgewählt. NbPP1c-1, NbPP1c-2 und NbPP1c-3, und synthetisierte zwei DNA-Stränge für die Klonierung in den VIGS-Vektor des Tabakrasselvirus (TRV): einer kombinierte die drei 5′-Enden (TRV-PP1c5′) und der andere kombinierte die drei 3′-Enden (TRV-PP1c3′ Ergänzende Abb. 10 A). Agrobakterium Stämme, die diese Konstrukte enthielten, wurden in 2 Wochen alte N. Benthamiana Sämlinge. Die Gen-Silencing-Level wurden nach 2–3 Wochen in Pflanzen in jedem biologischen Replikat mittels qRT-PCR überprüft. Sowohl TRV-PP1c5′ als auch TRV-PP1c3′ VIGS-Konstrukte wurden durchweg niedergeschlagen NbPP1c-1, NbPP1c-2 und NbPP1c-3 Transkriptspiegel um 80–90% im Vergleich zur Transkriptakkumulation in TRV-GFP-Kontrollpflanzen (ergänzende Abb. 10b). Obwohl etwas kleiner als Pflanzen, die TRV-GFP exprimieren, wurde das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen, die TRV-PP1c5′ und TRV-PP1c3′ exprimieren, nicht anderweitig gestört (Ergänzende Abb. 10c). Um ein potenzielles Off-Target-Silencing zu untersuchen, wurden Transkriptspiegel für eine zusätzliche PP1c Gen mit gegenseitigen besten BLAST-Hits in Kartoffel und N. Benthamiana, genannt StPP1c-4 und NbPP1c-4, die sowohl AtTOPP8 als auch AtTOPP9 von ähneln Arabidopsis (Ergänzende Abb. 2). StPP1c-4 interagiert nicht mit Pi04314 in Hefe unter Verwendung von Y2H oder in planta unter Verwendung von Co-IP (ergänzende Abb. 11a, b), was darauf hindeutet, dass es kein Ziel dieses Effektors ist. Wir haben das gefunden NbPP1c-4 Transkriptspiegel wurden durch TRV-PP1c5′- oder TRV-PP1c3′-Expression in . nicht reduziert N. Benthamiana (Ergänzende Abb. 10b), was darauf hinweist, dass unsere Stummschaltung spezifisch ist für NbPP1c-1, NbPP1c-2 und NbPP1c-3.

Wir haben untersucht, ob P. infestans Die Kolonisation wurde durch das Schweigen verändert NbPP1c-1, NbPP1c-2 und NbPP1c-3. Bemerkenswerterweise in N. Benthamiana Pflanzen, die entweder TRV–PP1c5′ oder TRV–PP1c3′ exprimieren, deutlich weniger P. infestans Im Vergleich zu TRV-GFP-Kontrollpflanzen entwickelten sich Infektionsläsionen. Darüber hinaus sind auf Blättern, auf denen sich Läsionen gebildet haben, deutlich weniger P. infestans Sporangien wurden produziert (Abb. 6). Dies weist darauf hin, dass P. infestans Die Kolonisierung der stummgeschalteten Pflanzen wurde abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass das Pathogen PP1c für die Krankheitsentwicklung benötigt. Dies veranlasste uns zu untersuchen, ob die PP1c-Aktivität für P. infestans Infektion.

(ein) Diagramm, das die prozentuale Reduzierung der Impfungen zeigt, die zu P. infestans Läsionen in Pflanzen, die TRV-PP1c3′ oder TRV-PP1c5′ exprimieren, im Vergleich zu einer TRV-GFP-Kontrolle. Fehlerbalken sind z.B. und die Grafik stellt die kombinierten Daten von sechs biologischen Replikaten dar (n=50 pro Konstrukt). Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P≤0.009). (B) Diagramm, das die Verringerung der durchschnittlichen Anzahl von Sporangien pro ml zeigt, die aus infizierten Blättern von Pflanzen, die TRV-PP1c3′ oder TRV-PP1c5′ exprimieren, im Vergleich zu den TRV-GFP-Kontrollpflanzen gewonnen wurden. Fehlerbalken sind z.B. und die Grafik stellt die kombinierten Daten von vier biologischen Replikaten dar (n=32 pro Konstrukt). Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (C) Beispielblätter zeigen P. infestans Läsionsentwicklung auf Kontroll- und TRV-PP1c3′- oder TRV-PP1c5′-Pflanzen.

Phosphatase-totes PP1c-1mut schwächt die Infektion ab

Da die Silencing-Experimente nahelegten, dass PP1c-Isoformen für die volle Virulenz von P. infestansfolgerten wir, dass die KVTF-vermittelte Interaktion mit Pi04314 nicht mit dem Effektor übereinstimmt, der (1) als Inhibitor der PP1c-Aktivität agiert oder (2) indirekt PP1c-Funktionen hemmt, indem er um die Bindung mit endogenen regulatorischen Untereinheiten konkurriert, obwohl dies tatsächlich so sein kann eine Teilkonsequenz der Interaktion. Stattdessen schlagen wir vor, dass Pi04314 mit PP1c-Isoformen interagiert, um deren Aktivität zu nutzen.

Bevor wir dies testeten, untersuchten wir, ob Pi04314 als Inhibitor der PP1c-Aktivität wirken könnte. Zunächst co-exprimierten wir GFP-PP1c-1 mit dem leeren Vektor cMyc oder mit cMyc-Pi04314 und als Kontrolle co-exprimierten wir GFP mit cMyc-Pi04314. Nach der Immunpräzipitation mit GFP-Trap_M-Kügelchen wurde die Phosphatase-Aktivität direkt an den Kügelchen vor der Elution der Proteine ​​für Western-Analysen getestet. Während mit cMyc-Pi04314 exprimiertes GFP keine Phosphatase-Aktivität lieferte, waren ähnlich hohe Spiegel (ANOVA, P= 0,001) Aktivität wurden mit GFP-PP1c-1 nachgewiesen, das entweder mit dem leeren cMyc-Vektor oder mit cMyc-Pi04314 exprimiert wurde ( 7a ). Immunblots zeigten, dass cMyc-Pi04314 wie erwartet nur mit GFP-PP1c-1 co-immunpräzipitiert wurde ( 7b ). Dies weist darauf hin, dass cMyc-Pi04314 im Komplex mit GFP-PP1c-1 die Phosphatase-Aktivität nicht hemmt. Umgekehrt wurde cMyc-PP1c-1 mit freiem GFP, mit GFP-Pi04314 oder mit nicht-wechselwirkendem GFP-Pi04314mut co-exprimiert. Jedes GFP-Fusionsprotein wurde mit GFP-Trap_M-Kügelchen immunpräzipitiert und die Phosphatase-Aktivität erneut direkt auf den Kügelchen getestet. Während bei GFP-Pi04314 Phosphatase-Aktivität nachgewiesen wurde, wurde bei freiem GFP oder GFP-Pi04314mut keine solche Aktivität beobachtet (Abb. 7c). Nach der Elution von Proteinen aus den Kügelchen bestätigten wir, dass cMyc-PP1c-1 nur in Gegenwart von GFP-Pi04314 co-immunpräzipitiert wurde ( 7d ). Somit hemmt Pi04314, das mit PP1c-1 assoziiert ist, die Phosphataseaktivität nicht.

(ein) Graph der Phosphatase-Aktivität, gemessen direkt auf GFP-Trap_M-Kügelchen nach Immunpräzipitation von GFP, co-exprimiert mit cMyc-Pi04314 oder GFP-PP1c-1, co-exprimiert entweder mit cMyc-Vektor oder cMyc-Pi04314. Fehlerbalken sind z.B. und der Graph repräsentiert kombinierte Daten von drei biologischen Replikaten. Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (B) Immunpräzipitation von Proteinextrakten aus agroinfiltrierten Blättern mit GFP-Trap bestätigte, dass cMyc-Pi04314 zusammen mit GFP-PP1c-1 immunpräzipitiert wird. Die Expression von Konstrukten in den Blättern ist mit + gekennzeichnet. Proteingrößenmarker sind in kDa angegeben und die Proteinbeladung wird durch Ponceau-Färbung angezeigt. Verwendete Antikörper sind angegeben (αcMyc und αGFP). (C) Graph der direkt auf GFP-Trap_M-Kügelchen gemessenen Phosphatase-Aktivität nach Immunpräzipitation von GFP, GFP-Pi04314 oder GFP-Pi04314mut, co-exprimiert mit cMyc-PP1c-1. Fehlerbalken sind z.B. und der Graph repräsentiert die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten. Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (D) Immunpräzipitation von Proteinextrakten aus agroinfiltrierten Blättern mit GFP-Trap bestätigte, dass cMyc-PP1c-1 mit dem GFP-Pi04314-Effektor co-immunpräzipitiert wurde, aber nicht mit GFP-Pi04314mut. Die Expression von Konstrukten in den Blättern ist mit + gekennzeichnet. Proteingrößenmarker sind in kDa angegeben und die Proteinbeladung wird durch Ponceau-Färbung angezeigt. Die verwendeten Antikörper sind wie angegeben (αcMyc und αGFP).

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Überexpression einer Phosphatase-toten Mutante einer der PP1c-Isoformen als „dominant negativ“ wirken könnte und die verstärkte P. infestans Blattkolonisation durch Bindung an den Effektor, aber keine Phosphatase-Aktivität mehr. Auf der Grundlage der vorherigen Charakterisierung des Rests des aktiven Zentrums in PP1c-Isoformen 31 identifizierten wir den äquivalenten Rest in PP1c-1 (H129 ergänzende Abb. 3b) und mutierten ihn zu einem Alanin, wodurch PP1c-1mut erzeugt wurde. Folgender Ausdruck in N. Benthamiana, wurden freies GFP, GFP-PP1c-1 und GFP-PP1c-1mut unter Verwendung von GFP-TRAP_M-Kügelchen immunpräzipitiert, was zeigt, dass jedes Fusionsprotein stabil und intakt war (Ergänzende Abb. 12a), und die Phosphatase-Aktivität wurde direkt auf den Kügelchen getestet. Während die GFP-PP1c-1-Phosphatase-Aktivität statistisch signifikant war (ANOVA, P<0,001) höher als bei der GFP-Kontrolle, wurde keine solche Aktivität mit dem GFP-PP1c-1mut nachgewiesen, was seine Inaktivität bestätigt (Abb. 8a, ergänzende Abb. 12b).

(ein) Immunpräzipitation von Proteinextrakten aus agroinfiltrierten Blättern mit GFP-Trap. Die Expression von Konstrukten in den Blättern ist mit + gekennzeichnet. Proteingrößenmarker sind in kDa angegeben und die Proteinbeladung wird durch Ponceau-Färbung angezeigt. Die verwendeten Antikörper sind wie angegeben (αcMyc und αGFP). (B) Graph der Phosphataseaktivität des Wildtyp-GFP-PP1c-1 und des mutierten GFP-PP1c-1mut zeigt, dass die Mutante eine ähnliche Hintergrundaktivität wie die GFP-Leervektorkontrolle aufwies. Fehlerbalken sind z.B. und der Graph repräsentiert die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten. Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (C) Graph des durchschnittlichen Verhältnisses von nukleolärer zu nukleoplasmatischer GFP-Fluoreszenz des GFP-Pi04314-Fusionsproteins, exprimiert mit mRFP-PP1c-1mut oder, als Kontrolle, freiem mRFP. Fehlerbalken sind z.B. und die Grafik stellt die kombinierten Daten von drei biologischen Replikaten dar (n=40 pro Konstrukt). Buchstaben in der Grafik kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (ANOVA, P<0,001). (D) Ein einzelner optischer Schnitt durch koexprimierende Kerne zeigt, dass die Effektorfusion GFP-Pi04314 im Nukleolus reduziert wurde, wenn sie mit mRFP-PP1c-1mut co-exprimiert wurde, jedoch nicht mit freiem mRFP. Maßstabsleiste, 10 μm. Weiße Pfeile zeigen mRFP-Fluoreszenzintensitätsdiagramme an, die in den Grafiken rechts neben jedem Bild dargestellt sind. (e) Die Co-Expression des cMyc-PP1c-1-Wildtyps veränderte die Verstärkung von . nicht signifikant P. infestans growth caused by expression of the GFP–Pi04314 effector compared with the control. However, co-expression of the mutant cMyc–PP1c–1mut with GFP–Pi04314 caused a significant reduction in effector-induced enhancement of colonization. Error bars are s.e. and the graph represents the combined data from three biological replicates (n=102 per construct). Letters on the graph denote statistically significant differences (ANOVA, P<0,001). (F) Expression of wild-type cMyc–PP1c-1 did not significantly alter P. infestans infection compared with the control empty (cMyc) vector (EV), but expression of the phosphatase-dead mutant cMyc–PP1c–1mut significantly reduced lesion growth. Error bars are s.e. and the graph represents the combined data from three biological replicates (n=73 per construct). Letters on the graph denote statistically significant differences (ANOVA, P<0,001).

For PP1c–1mut to act as dominant negative, its interaction with Pi04314 must be maintained. We co-expressed cMyc–PP1–1cmut or cMyc–PP1c-1 with GFP–Pi04314, immunoprecipitating the latter with GFP–TRAP_M beads, and observed that cMyc–PP1–1cmut, like cMyc–PP1c-1, was co-immunoprecipitated with the effector (Fig. 8b). This confirmed that the H129A mutation did not perturb interaction with Pi04314. When we investigated the localization of mRFP–PP1c–1mut using confocal microscopy, we observed that, like the WT protein, it accumulated in the nucleoplasm with cytoplasmic background. However, unlike the WT protein, there was no detectable accumulation of mRFP–PP1c–1mut in the nucleolus (Supplementary Fig. 12). Nevertheless, consistent with the interaction of Pi04314 with PP1c–1mut being maintained in planta, co-expression of mRFP–PP1c–1mut with GFP–Pi04314 still significantly reduced accumulation of the effector in the nucleolus, compared with a free mRFP control, which also does not localize in the nucleolus (Fig. 8c,d).

To investigate whether the PP1c–1mut had an effect on the enhanced P. infestans leaf colonization promoted by transient expression of Pi04314, free GFP was expressed on one-half of N. Benthamiana leaves and either GFP–Pi04314 alone, GFP–Pi04314 co-expressed with WT cMyc–PP1c-1, or GFP–Pi04314 co-expressed with cMyc–PP1c–1mut on the other half. P. infestans zoospores were drop-inoculated onto each half of the leaves, and infection allowed to progress for 6 days. Whereas GFP–04314 alone, as anticipated, or GFP–Pi04314 co-expressed with cMyc–PP1c-1 WT, promoted similar levels of significantly enhanced (ANOVA, P<0.001) P. infestans lesion development compared with the GFP control, lesion sizes on leaves where GFP–04314 was co-expressed with cMyc–PP1c–1mut were no different to the GFP control (Fig. 8e). This indicates that the expression of the phosphatase-dead PP1c–1mut form prevents Pi04314 effector activity.

To further investigate the potential for the phosphatase-dead PP1c–1mut form to be detrimental to P. infestans infection, an empty cMyc vector (EV) was expressed on one-half of N. Benthamiana leaves and either cMyc–PP1c-1 WT or cMyc–PP1c–1mut expressed on the other. A higher inoculum of P. infestans zoospores was drop-inoculated onto each side of the N. Benthamiana leaves to promote enhanced colonization, and infections were allowed to progress for 7–8 days. Lesion sizes on leaf halves where cMyc–PP1c WT was expressed were no different to those where EV control was expressed. In contrast, expression of cMyc–PP1c–1mut resulted in significantly (ANOVA, P<0,001) reduced lesion sizes compared with the EV control (Fig. 8f). Thus, overexpression of the phosphatase-dead PP1c–1mut reduces levels of P. infestans Infektion.

Pi04314 suppresses JA- and SA-responsive genes

We have shown that when expressed in planta, Pi04314 interacts with three isoforms of PP1c to enhance P. infestans leaf colonization in a phosphatase activity-dependent manner. However, it remains unclear that how the effector could be of benefit to P. infestans. We investigated whether Pi04314 could suppress cell death triggered by the P. infestans PAMP INF1, or by co-expression of the tomato cell-surface receptor Cf4 and Cladosporium fulvum effector AVR4. We have shown previously that Cf4-mediated cell death is suppressed by the RXLR effector PexRD2 (ref. 20) and that cell death mediated by both INF1 and Cf4 is suppressed by AVR3a 16 . In contrast to GFP–AVR3a, GFP–Pi04314 failed to suppress either INF1- or Cf4-mediated cell death (Supplementary Fig. 13).

We next generated transgenic susceptible potato cultivar E3 lines expressing Pi04314 and selected two lines (OE-6 and OE-8) for study (Supplementary Fig. 14). Both lines showed enhanced P. infestans colonization (Fig. 9a,b) relative to untransformed cv E3, consistent with the observation (Fig. 1) that transient expression of Pi04314 enhanced colonization in N. Benthamiana. We treated leaves of the control cv E3, OE-6 and OE-8 with flg22 and investigated early-responsive gene WRKY8, encoding a transcription factor that is directly phosphorylated by the MAPK salicylic acid-induced protein kinase (SIPK) 32 and ACRE31, a generally used early flg22 marker 26 . Both genes were strongly upregulated in cv E3, OE-6 and OE-8 only 30 min after flg22 treatment (Fig. 9 Supplementary Fig. 14). This agrees with the previous observation that Pi04314 does not suppress early flg22-responsive gene induction 19 . We next selected genes that rapidly respond to exogenous application of SA and methyl jasmonate (meJA), based on recent potato microarray studies 33 , which are available on a searchable database (https://ics.hutton.ac.uk/solarray/). We selected two genes upregulated at 1 h after treatment of meJA (StMYC2-like und StJAZ1-like), and two genes upregulated at 1 h by SA (designated StWRKY40-like und StWRKY16-like) and confirmed their upregulation at 1 h in potato cv E3 following appropriate treatments (Fig. 9 Supplementary Fig. 14). In contrast, following treatments with SA or meJA, induction of all four genes was attenuated in lines OE-6 and OE-8 (Fig. 9), suggesting that Pi04314 may attenuate SA and JA defence pathways.

(ein) Representative leaf images, exposed to UV, showing increased lesion sizes on Pi04314-expressing transgenic lines E-6 and OE-8, compared with the untransformed control, cv E3. (B) Mean lesion diameter is significantly increased in OE-6 and OE-8 lines compared with the control, cv E3. Letters denote statistical significance (ANOVA, P<0.001) from three biological replicates, each containing inoculation of three leaves from each of the six plants. (C) Relative expression of flg22 marker genes StWRKY8 und StACRE31 30 min after treatment with flg22 in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). (D) Relative expression of JA-responsive genes StJAZ1-like (StJAZ1L) und StMYC2L 1 h after treatment with meJA in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). (e) Relative expression of SA-responsive genes StWRKY40-like (StWRKY40L) und StWRKY16L 1 h after treatment with SA in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). Results in B-E are the mean of three independent biological replicates. Error bars show s.e. and * denotes significantly reduced induction (ANOVA, P<0.001) of responsive genes in transgenic lines compared with the E3 control.


Molecules, Targets and Isoforms - Biology

Chemical genetics employs diverse small-molecule compounds to elucidate biological processes in a manner analogous to the mutagenesis strategies at the core of classical genetics. Screening small-molecule libraries for compounds that induce a phenotype of interest represents the forward chemical genetic approach, whereas the reverse approach involves small molecules targeting a single protein. Here, we review key differences between the goals for small-molecule screening in industry gegen academia, recent developments in high-throughput screening, and publicly available resources of compound collections, screening facilities, and databases. A particularly exciting outcome of a chemical genetic screen is the discovery of a previously unknown role for a protein in a pathway together with compounds that affect the function of that protein. In illustrative cases, such discoveries have led to progress toward therapeutic development and more commonly have increased the size of the small molecule “toolbox” available to the research community for the study of biological processes.


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Danksagung

We thank the Packard Foundation, Amgen, Astra Zeneca and Novartis and the US National Institutes of Health (NIH GM 79465) for providing funding for this work. C.J.C. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. B.C.D. was partially supported by a Chemical Biology Training Grant from the NIH (T32 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"GM066698","term_id":"222039788","term_text":"GM066698">> GM066698). Due to space limitations, we apologize if we inadvertently omitted citations of major contributions to this area.