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Welche Rolle spielen Guanidin-HCl und Ethanol bei der Bindung von DNA an Kieselsäure?

Welche Rolle spielen Guanidin-HCl und Ethanol bei der Bindung von DNA an Kieselsäure?


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Ich versuche zu verstehen, wie genau die Bindung an Kieselgel (in Kits) funktioniert, und ich kann keine Papiere finden, die eine Erklärung der Physik oder Chemie liefern; insbesondere auf die Art und Weise, wie Guanidin-HCl wirkt.

Holen wir sie also von Anfang an.

Zuerst passen wir die DNA-Bindungsbedingungen an, indem wir einen Puffer hinzufügen, der Guanidin-HCl und Ethanol enthält, und dann zentrifugieren wir unsere Probe. Ich wusste, dass Guanidin-HCl die Tertiärstruktur von Proteinen zerstört, aber irgendwo habe ich gelesen, dass es auch der DNA hilft, sich an eine Kieselsäuresäule zu binden. Ich habe gesucht, um herauszufinden, wie es funktioniert, aber ich konnte kein Papier finden. Welche Rolle spielt Ethanol in diesem Schritt? Ist es nur, um Proteine ​​und Polysaccharide aus der Probe zu entfernen?


Guanidin HCL ist ein chaotropes Salz. Chaotrope Salze sind entscheidend für die Zelllyse und die Bindung an das Silica-Harz. Insbesondere haben Chaotrope zwei wichtige Rollen bei der Nukleinsäureextraktion

  1. Destabilisieren Sie Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen.

    • Führt zur Destabilisierung von Proteinen (einschließlich Nukleasen).

      Makromolekulare Struktur und Funktion hängen von der Nettowirkung dieser Kräfte ab (siehe Proteinfaltung), daher folgt daraus, dass eine Zunahme chaotroper gelöster Stoffe in einem biologischen System Makromoleküle denaturiert, die enzymatische Aktivität reduziert und Stress auf eine Zelle (dh eine Zelle) auslöst Stressschutzmittel synthetisieren müssen). Die tertiäre Proteinfaltung hängt von hydrophoben Kräften von Aminosäuren während der gesamten Proteinsequenz ab. Chaotrope gelöste Stoffe verringern den hydrophoben Nettoeffekt hydrophober Regionen aufgrund einer Fehlordnung von Wassermolekülen neben dem Protein. Dadurch wird die hydrophobe Region in der Lösung solubilisiert, wodurch das Protein denaturiert wird. Dies ist auch direkt auf die hydrophobe Region in Lipiddoppelschichten anwendbar; Wenn eine kritische Konzentration eines chaotropen gelösten Stoffes erreicht wird (in der hydrophoben Region der Doppelschicht), wird die Membranintegrität beeinträchtigt und die Zelle wird lysiert. [Quelle]

  2. Unterbrechen Sie die Assoziation von Nukleinsäuren mit Wasser.

    • Dadurch werden optimale Bedingungen für deren Übertragung auf Kieselsäure geschaffen.

      Salze können chaotrope Eigenschaften haben, indem sie Ladungen abschirmen und die Stabilisierung von Salzbrücken verhindern. Die Wasserstoffbrückenbindung ist in unpolaren Medien stärker, daher können Salze, die die chemische Polarität des Lösungsmittels erhöhen, auch die Wasserstoffbrückenbindungen destabilisieren. Mechanistisch liegt dies daran, dass nicht genügend Wassermoleküle vorhanden sind, um die Ionen effektiv zu solvatisieren. Dies kann zu Ionen-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Salzen und Wasserstoffbrückenbindungsspezies führen, die günstiger sind als normale Wasserstoffbrückenbindungen. [Quelle]

Ethanol ist wie Guanidin HCL ein chaotopisches Mittel. Ethanol wird aus 2 Gründen hinzugefügt:

  1. Verstärken und beeinflussen Sie die Bindung von Nukleinsäuren an die Kieselsäure.

    • Beeinflussen nicht-kovalente intramolekulare Kräfte wie oben beschrieben.

    • Reduzieren Sie die Assoziation von Nukleinsäuren mit Wasser. Von Melzak et al. (1996):

      Eine Verringerung der Wasseraktivität in Lösung durch Zugabe entweder eines chaotropen Salzes oder eines Alkohols ändert die helikale Struktur der B-DNA entweder kontinuierlich zu C-DNA oder durch einen scharfen kooperativen Übergang zu A-DNA (28). Jeder Übergang wird von einer Abnahme der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche begleitet.

  2. Die richtige Konzentration ermöglicht das Waschen der Salze von der Membran. [Quelle].


Zitate

  • Melzaket al. (1996) Treibende Kräfte für die DNA-Adsorption an Siliciumdioxid in Perchloratlösungen. J. Kolloidgrenzfläche Sci. 181: 635 - 644.

In der heutigen Welt der DNA-Analyse durch Multiplex- und Real-Time-PCR ist die Bedeutung hochwertiger, gereinigter DNA nicht zu unterschätzen. Für den erfolgreichen Abschluss von Experimenten ist es entscheidend, ein geeignetes DNA-Isolierungssystem zu finden, das Ihre Anforderungen an Downstream-Anwendungen erfüllt.

Dieser DNA-Reinigungsleitfaden enthält allgemeine Informationen zu den Grundlagen der DNA-Extraktion, der Plasmidpräparation und der DNA-Quantifizierung sowie dazu, wie optimierte Reinigungsverfahren Ihre Produktivität steigern können, damit Sie weniger Zeit für die Reinigung von DNA und mehr Zeit für die Entwicklung von Experimenten und die Analyse von Daten aufwenden.

Darüber hinaus deckt dieser Leitfaden die breite Palette von Promega-Produkten ab, die für die Aufreinigung von Genom-, Plasmid- und Fragment-/PCR-Produkten erhältlich sind. Neben der Diskussion der DNA-Extraktionssysteme von Promega berücksichtigen wir auch die Aspekte Skalierbarkeit, Reinheit, Ausbeute und deren Auswirkungen auf nachgelagerte Anwendungen, um das beste System für Ihre Anforderungen zu finden.


Einführung

Die Isolierung von Plasmid-DNA zur Klonierung und Proteinexpression wird seit Jahrzehnten verwendet [1–3] und ist nach wie vor eine der am häufigsten verwendeten Methoden von Molekularbiologen. Die Plasmidreinigung umfasst zwei Schritte: bakterielle Lyse und DNA-Isolierung. Bakterielle Lyse wird oft durch alkalische Lyse erreicht, eine schnelle und effektive Methode zur Trennung von Protein und genomischer DNA von kleinen Plasmiden [3]. Für die Isolierung von Plasmid-DNA stehen jedoch mehrere Verfahren zur Verfügung.

Kommerzielle Plasmidpräparationskits verringern Zeit und Arbeit. Die Isolierung von Plasmid-DNA über Silica-Spin-Säulen ist derzeit die Standardmethode [4, 5]. Diese hängen vermutlich von der Fähigkeit „chaotroper Salze“ ab, DNA zu dehydratisieren, wodurch die DNA über ihre Phosphatgruppen reversibel an die Kieselsäure binden kann [6, 7]. Allerdings erfordern Kits mit hoher Ausbeute im Vergleich zu Kits mit geringerer Ausbeute einen hohen Zeitaufwand (Tabelle 1, Maxiprep vs. Miniprep). Darüber hinaus wird die DNA-Ausbeute durch die Säulengröße eingeschränkt, da Silica-Säulen begrenzte Mengen an Plasmid-DNA binden [4]. Daher bewerben Hersteller traditionell ihr Plasmid-Isolationskit mit der maximalen DNA-Menge, die von einer Säule gebunden werden kann (Tabelle 1). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Schätzungen weder die Plasmidgröße, den Typ oder die Kopienzahl noch die Wachstumsbedingungen des Bakterienstamms oder des Bakterienstamms selbst berücksichtigen. Von all diesen Faktoren ist bekannt, dass sie die DNA-Ausbeute beeinflussen.

Die Plasmid-DNA-Präzipitation über Ethanol oder Isopropanol, die das Ladungsscreening durch Wasser unterbricht und positive Ionen in der Lösung mit DNA-Phosphatgruppen interagieren lässt, wurde vor der Entwicklung von Silica-Säulen häufig verwendet. Obwohl die Kosten gering sind, erfordern die Schritte der Präzipitation, Zentrifugation und des Pelletwaschens selbst bei Präparationen im kleinen Maßstab beträchtliche Zeit, und Kits mit hoher Ausbeute erfordern Bakterienkulturen in größerem Maßstab und sogar noch mehr Zeit. Interessanterweise enthalten die Bindungs- und Waschpuffer einiger kommerzieller Silica-Spinsäulen auch Alkohole (z. B. Ethanol im QIAprep Miniprep PE-Waschpuffer [8]), die wie chaotrope Salze die DNA-Interaktion mit der Silica-Matrix erhöhen können.

Hier berichten wir über ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung hoher Plasmid-DNA-Ausbeuten bei deutlich reduziertem Zeit- und Arbeitsaufwand, das wir Miraprep nennen.


Hintergrund: Die Methylierung des DNA-Promotors ist eine Signatur für das Stummschalten von Tumorsuppressorgenen. Die am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von DNA-Methylierung umfassen 3 separate, unabhängige Prozesse: DNA-Extraktion, Bisulfit-Konvertierung und Methylierungsnachweis über ein PCR-Verfahren, wie z. B. methylierungsspezifische PCR (MSP). Diese Methode umfasst viele getrennte Schritte mit damit verbundenen Materialverlusten, wodurch möglicherweise die analytische Sensitivität verringert wird, die für die Analyse anspruchsvoller klinischer Proben erforderlich ist.

Methoden: Methylierung auf Beads (MOB) ist eine neue Technik, die DNA-Extraktion, Bisulfit-Umwandlung und PCR in einem einzigen Röhrchen durch die Verwendung von superparamagnetischen Siliciumdioxid-Beads (SSBs) als gemeinsamen DNA-Träger integriert, um die Entfernung von Zelltrümmern und den Pufferaustausch durchgängig zu erleichtern den gesamten Prozess. Darüber hinaus wird PCR-Puffer verwendet, um Bisulfit-behandelte DNA von SSBs für nachfolgende Zielamplifikationen direkt zu eluieren. Die diagnostische Sensitivität von MOB wurde durch Methylierungsanalyse der CDKN2A [Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 2A (Melanom, p16, hemmt CDK4), auch bekannt als p16 TINTE4a ]-Promotor in der Serum-DNA von Lungenkrebspatienten und verglichen mit denen konventioneller Methoden.

Ergebnisse: Methylierungsanalyse bestehend aus DNA-Extraktion gefolgt von Bisulfit-Umwandlung und MSP wurde innerhalb von 9 h in einem einzigen Röhrchen erfolgreich durchgeführt. Die mediane Prä-PCR-DNA-Ausbeute war bei der MOB-Technik 6,61-fach höher als bei herkömmlichen Techniken. Darüber hinaus erhöhte MOB die diagnostische Sensitivität in unserer Analyse der CDKN2A Promotor im Patientenserum durch den erfolgreichen Nachweis von Methylierung bei 74 % der Krebspatienten gegenüber der Nachweisrate von 45 %, die mit herkömmlichen Techniken erzielt wurde.

Schlussfolgerungen: Die MOB-Technik kombiniert erfolgreich 3 Prozesse in einem einzigen Röhrchen, was eine einfache Handhabung und einen erhöhten Detektionsdurchsatz ermöglicht. Die erhöhte Prä-PCR-Ausbeute in MOB ermöglichte einen effizienten, diagnostisch sensitiven Methylierungsnachweis.

Die am besten charakterisierten epigenetischen Veränderungen sind die erbliche transkriptionelle Stilllegung von Tumorsuppressorgenen (TSGs) 2 durch aberrante CpG-DNA-Hypermethylierung ihrer Promotoren (1) (2). Die Wirkung einer solchen Promotor-Methylierung ist ähnlich wie bei genetischen Mutationen mit Funktionsverlust und wurde bei gut charakterisierten TSGs beobachtet, die erbliche Krebsformen verursachen, wenn sie bei Keimbahnereignissen mutiert werden (3) (4) (5). Da eine methylierungsbasierte Geninaktivierung sehr früh während der Krebsprogression erfolgen kann, noch bevor Mutationen beobachtet werden, kann der Nachweis der DNA-Methylierung für die Krebsfrüherkennung nützlich sein (6)(7)(8). In den letzten Jahren wurden mehrere Ansätze entwickelt, um methylierte Sequenzen in nicht-pathologischen und Krebsgeweben nachzuweisen und zu differenzieren. Methoden der ersten Generation basierten hauptsächlich auf der Verwendung von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen, gefolgt von Southern Blotting (9). Methoden der zweiten Generation umfassen Ansätze, die sich entweder darauf konzentrieren, Regionen mit unterschiedlicher Methylierung in nicht-pathologischen und Krebsgeweben zu entdecken oder das Methylierungsprofil von Kandidaten-TSGs zu analysieren (8)(10)(11). Diese Techniken lassen sich grob einteilen in (ein) CpG-Nachweismethoden, einschließlich methylierungsspezifischer PCR (MSP), quantitativer MSP und verschachtelter MSP (B) detaillierte Analyse spezifischer Muster der CpG-Methylierung, wie zum Beispiel bei der Bisulfit-Sequenzierung und (C). Die meisten dieser Verfahren umfassen eine DNA-Extraktion, gefolgt von einer Natriumbisulfit-Umwandlung (14) der denaturierten Matrizen-DNA. Die konventionelle DNA-Extraktion umfasst typischerweise eine chemische Lyse von Zellen, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung (PC), die sowohl Zentrifugation als auch Lufttrocknung erfordert (15). Die extrahierte DNA wird dann einer Natriumbisulfit-Umwandlung unterzogen, die eine Denaturierung der genomischen DNA, eine Desaminierung von unmethylierten Cytosinen mit einer hohen Natriumbisulfit-Konzentration und eine Desulfonierung mit einer starken Base erfordert. Temperatur, pH-Wert und Salzkonzentration erfordern eine sorgfältige Kalibrierung, und die empfohlene Zeit für eine effiziente Bisulfit-Umwandlung beträgt 12–16 h (11). Eine hohe DNA-Ausbeute und -Qualität sowie eine angemessene Effizienz bei der Bisulfit-Behandlung sind Voraussetzungen für das gute Funktionieren dieser Techniken.

Angesichts dieser vielen Schritte sind konventionelle Verfahren relativ aufwendig im Vergleich zu Verfahren der DNA-Extraktion auf einem festen Substrat, bei denen DNA in chaotropen Salzen enthaltenden Lösungen, wie denen von Iodid oder Perchlorat, an eine Siliciumdioxidoberfläche bindet (16). Obwohl Festsubstratmethoden implementiert wurden, um den Prozess zu vereinfachen, ist die Methylierungsanalyse immer noch ein unzusammenhängender Prozess, bei dem DNA-Extraktion, Bisulfit-Umwandlung und die PCR in getrennten Röhrchen durchgeführt werden. Die Methylation-on-Beads (MOB)-Technik geht dieses Problem als Einzelröhrchen-Methylierungs-Nachweismethode an (siehe Abb. 1 in der Datenergänzung, die der Online-Version dieser Kurzmitteilung unter http://www.clinchem.org beiliegt /content/vol56/issue6). MOB beginnt mit Zelllysaten oder Patientenproben, die mit superparamagnetischen Silica-Beads (SSBs) (17) in einer chaotropen Lösung von Guanidin-HCl in Zitronensäurepuffer gemischt werden, was die Bindung von DNA an SSBs fördert. Ungebunden in der Lösung bleiben andere Makromoleküle und Zelltrümmer, die dann durch Extraktion der flüssigen Phase entfernt werden. Zusätzliche Waschschritte mit Alkohol sind erforderlich, um eine ausreichende DNA-Reinheit für die nachfolgende Analyse zu gewährleisten. Die gebundene DNA wird dann in einem Puffer geringer Ionenstärke eluiert und für den nächsten Schritt dieses Prozesses verwendet (siehe Tabelle 1 und Ergänzende Methoden in der Online-Datenergänzung). Das MOB-Protokoll kann in 9 h abgeschlossen werden, von der DNA-Isolierung bis zur Methylierungsanalyse mit MSP, quantitativem MSP oder methylierungsspezifischem Quantenpunkt-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (MS-qFRET) (18).

Die Steigerung der Prä-PCR-DNA-Ausbeuten mit MOB ist auf eine Kombination von Prozessen zurückzuführen. Die große Oberfläche von SSBs ermöglicht das Einfangen großer DNA-Mengen, die Minimierung der Wasch-/Bindungsschritte verringert den DNA-Verlust bei jedem Schritt und die Einzelröhrchen-Verarbeitung reduziert den DNA-Verlust, der während des Röhrchentransfers auftritt. Eine unzureichende DNA-Ausbeute stellt eine Herausforderung für die Entwicklung blutbasierter Biomarker-Detektionssysteme dar. Um den Vorteil eines Einzelröhrchen-Verfahrens zu veranschaulichen, haben wir die Prä-PCR-Ausbeute und den Methylierungsnachweis mit dem MOB-Ansatz mit dem herkömmlichen PC/Bisulfit-Umwandlungs/MSP-Assay verglichen. Wir haben eine repräsentative Vergleichsanalyse mit 15 Serumproben von Lungenkrebspatienten (7 Patienten im Stadium I, 3 Patienten im Stadium II und 5 Patienten im Stadium III) durchgeführt ( Abb. 1 ). Die Wiederfindung mit MOB war für jede Patientenserumprobe größer als für die PC/Bisulfit-Umwandlung (mediane Zunahme 6,61-fach). Die Extraktionsausbeuten waren mit der MOB-Methode höher als mit kommerziellen Kits, die für die DNA-Extraktion bestimmt waren (siehe Abb. 2A in der Online-Datenergänzung). Die Analyse wurde auf 10 weitere Proben ausgeweitet, darunter frisches Gewebe und in Paraffin eingebettetes Gewebe von gesunden Patienten, frisches Tumorgewebe von Krebspatienten und Sputumproben. Mit MOB wurden im Vergleich zur herkömmlichen PC/Bisulfit-Umwandlungsmethode Steigerungen der medianen DNA-Ausbeute um das 7,8-, 5,3-, 6,4- bzw. 7,5-Fache erzielt (siehe Abb. 2B in der Online-Datenergänzung).

Prä-PCR-DNA-Ausbeute aus Serum für die MOB-Methode und die konventionelle PC/Bisulfit-Umwandlungsmethode.

Die Ausbeuten wurden für eine Zufuhr von 25 µl Serum normalisiert.

Prä-PCR-DNA-Ausbeute aus Serum für die MOB-Methode und die konventionelle PC/Bisulfit-Umwandlungsmethode.

Die Ausbeuten wurden für eine Zufuhr von 25 µl Serum normalisiert.

Abgesehen davon, dass es sich um ein Einrohrverfahren handelt, weist diese Technik die einzigartige Eigenschaft der Kombination von Desaminierung und Desulfonierung auf, eine Vereinfachung gegenüber dem herkömmlichen Ansatz, der Binde- und Waschschritte zwischen diesen beiden Verfahren erfordert. Die Minimierung der Anzahl der Bindungs- und Waschschritte erhöht die DNA-Ausbeute weiter und verringert die Testzeit (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus verwendet die Technik SSBs innerhalb des Röhrchens sowohl für den Bisulfit-Umwandlungsprozess als auch für die PCR. Um zu zeigen, dass das Vorhandensein von SSBs die Bisulfit-Umwandlung nicht behindert, haben wir Echtzeit-MSP zur Bewertung verwendet CDKN2A 3 [Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 2A (Melanom, p16, hemmt CDK4), auch bekannt als p16 TINTE4a ] Promotor-Methylierung. Wir werteten 5 Dreifachreaktionen mit Input-DNA aus unterschiedlichen Bisulfit-Behandlungsdauern aus (0, 1, 3, 4 und 8 h) und verglichen die Ergebnisse mit denen der Kontrolle, die 16 h konventioneller Bisulfit-Behandlung verwendete (siehe Ergänzende Methoden in der Online-Datenergänzung). Die Ergebnisse zeigen, dass 4 h Bisulfit-Behandlung für die Umwandlung ausreichen und dass die Anwesenheit von Beads den Umwandlungsprozess nicht verändert (siehe Abb. 3 im Online-Datenergänzungsmittel). Darüber hinaus zeigt die Möglichkeit, präzise quantitative Methylierungsergebnisse in Echtzeit und reproduzierbare PCR-Produkte zu generieren, dass die Beads für die PCR nicht schädlich sind.

Die DNA-Quellen im Serum sind noch unbekannt, umfassen jedoch wahrscheinlich sowohl zirkulierende Tumorzellen als auch freie DNA, die aus Tumormassen freigesetzt wird. Die Bewertung der Methylierung im Serum oder Plasma kann daher ein nützliches Instrument zur Früherkennung von Krebs sein. Mehrere Studien haben eine Hypermethylierungs-assoziierte Inaktivierung von gezeigt CDKN2A als frühes und häufiges Ereignis bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (Plattenepithelkarzinom, 60–80 % Adenokarzinom, 30–45 %) und anderen Krebsarten (19)( 20)( 21). Obwohl die meisten dieser Studien MSP als analytisches Werkzeug zur Beurteilung der Genmethylierung verwendet haben, war die Ausweitung einer solchen Analyse auf klinisch verwendbare Serum- und Bluttests durch die mangelnde Sensitivität früherer Methoden begrenzt. Um direkt zu untersuchen, ob eine Verbesserung der DNA-Ausbeuten den Methylierungsnachweis beeinflussen kann, haben wir in einer verblindeten Studie den MOB- und den konventionellen PC/Bisulfit/MSP-Ansatz verglichen, um die Methylierung der CDKN2A Promotor in 49 Patientenserumproben (18 nicht-pathologische und 31 Krebsproben). Die 31 Tumorproben wurden von Patienten mit diagnostiziertem Lungenkrebs vorselektiert, die ebenfalls CDKN2A Promotormethylierung in den entsprechenden Tumoren. Die verwendeten Primer und Methoden sind in den Supplemental Methods und Tabelle 2 des Online Data Supplement detailliert beschrieben. Wohingegen CDKN2A Methylierung wurde bei 14 von 31 Lungenkrebspatienten mit der konventionellen PC/Bisulfit/MSP-Technik nachgewiesen, die MOB-Methode konnte CDKN2A Methylierung bei 23 dieser 31 Patienten (siehe Tabelle 3 in der Online-Datenergänzung).

Wenn die für die Methylierungsanalyse verwendeten Proben große DNA-Mengen enthalten (dh Zelllinien, Tumore usw.), kann eine Einzelröhrchenanalyse der gesamten zugeführten Menge unnötig sein, jedoch ermöglicht MOB die Lagerung entweder der extrahierten DNA oder des Bisulfits -behandelte DNA, die später für nachgelagerte Analysen verwendet werden kann. Darüber hinaus ist die parallele Durchführung mehrerer Reaktionen mit dem MOB-Ansatz möglich, da er die direkte Aufteilung der magnetischen Beads in mehrere Röhrchen ermöglicht. Wir testeten die MOB-Methode mit der Darmkrebszelllinie RKO und erzielten Ausbeuten an extrahierter DNA von 20–60 µg. Nach Aufteilen der SSB-gebundenen DNA in 10 verschiedene Röhrchen hatten wir noch genügend Material für eine erfolgreiche MSP-Analyse der CDKN2A, CDKN2B [Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 2B (p15, hemmt CDK4)] und PYCARD (PYD- und CARD-Domäne enthaltend auch bekannt als ASC und TMS1) Promotoren (Daten nicht gezeigt).

Dieses magnetisch betätigte Einzelröhrchen-Methylierungsanalysesystem mit SSBs sollte automatisierbar und mit kommerziell erhältlichen Robotern kompatibel sein, die magnetisches Einfangen verwenden, da Reagenzien auf ähnliche Weise in das Einzelröhrchen ein- und ausgezogen werden und weil die Bindungs- und Elutionsprozesse konsistent sind. Die Einführung von SSBs vereinfacht die Probenhandhabung, umgeht den Einsatz von Flüssigkeitstransfer, Lufttrocknung und Zentrifugation und erhöht die Ausbeuten gegenüber herkömmlichen Methoden. Die im Röhrchen vorhandenen SSBs behindern nicht die Bisulfit-Umwandlung, MSP oder andere Methoden [einschließlich MS-qFRET (18)], eine Eigenschaft, die die analytische Sensitivität durch nanotechnologische Detektion weiter verbessern kann (siehe Abb. 4 im Online-Datenergänzung). ). Die Minimierung von Bindungs- und Waschschritten durch Kombination von Desaminierung und Desulfonierung kann die Effizienz weiter verbessern. Da der Prozess in nur 9 h abgeschlossen werden kann, stellt die Methode einen praktikablen Weg für die klinische Umsetzung der Methylierungsanalyse dar.

diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen

Nichtstandardisierte Abkürzungen: TSG, Tumorsuppressorgen MSP, methylierungsspezifische PCR PC, Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation MOB, Methylierung auf Beads SSB, Silica Superparamagnetic Bead MS-qFRET, methylierungsspezifischer Quantenpunkt-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer.

Humane Gene: CDKN2A, Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 2A (Melanom, p16, hemmt CDK4) CDKN2B Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 2B (p15, hemmt CDK4) PYCARD, PYD und CARD-Domänen enthaltend.

Autorenbeiträge:Alle Autoren bestätigten, dass sie zum intellektuellen Inhalt dieses Papiers beigetragen haben und die folgenden 3 Anforderungen erfüllt haben: (a) wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung, Datenbeschaffung oder Analyse und Interpretation von Daten (b) Entwurf oder Überarbeitung des Artikels für geistigen Inhalt und (c) endgültige Genehmigung des veröffentlichten Artikels.

Angaben der Autoren zu potenziellen Interessenkonflikten:Nach der Einreichung des Manuskripts füllten alle Autoren das Formular zur Offenlegung potenzieller Interessenkonflikte aus. Mögliche Interessenkonflikte:

Anstellung oder Führung: Keine deklariert.

Berater- oder Beraterrolle: S. B. Baylin, Oncomethylome Sciences, BioNumerik Pharmaceuticals, Constellation Pharmaceuticals und Syndax Pharmaceuticals J.G. Herman, Onkomethylomwissenschaften.

Aktienbesitz: S. B. Baylin, Onkomethylomwissenschaften.

Honorar: S. B. Baylin, Oncomethylome Sciences, Constellation Pharmaceuticals und BioNumerik Pharmaceuticals.

Forschungsförderung: V. J. Bailey, der Hodson Trust und die Siebel Scholars Foundation M. Brock, Oncomethylome Sciences S.B. Baylin, Oncomethylome Sciences, BioNumerik Pharmaceuticals, National Cancer Institute gewährt SPORE CA058184 und R21-CA120742-01, National Science Foundation gewährt 0546012, 0730503 und 0725528 und National Institute of Environmental Health Sciences J.G. Herman, Onkomethylomwissenschaften.

Sachverständigengutachten: Keine deklariert.

Rolle des Sponsors: Die Förderorganisationen spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Auswahl der eingeschlossenen Patienten, der Überprüfung und Interpretation der Daten oder der Erstellung oder Genehmigung des Manuskripts.


DNA-Extraktion mit dem Qiagen-Kit - (23. Mai 2013 )

Jetzt frage ich mich, was die ATL- und AL-Puffer sind.
Auch der AW1- und AW2-Puffer.

Was ich bisher gefunden habe ist:
ATL: Lyse von tierischem Gewebe. Das ist ziemlich einfach und ich verstehe das.
AL: Hier bin ich verwirrt => Ich habe gefunden (googeln), dass es sich um einen Zelllysepuffer handelt? Aber warum brauche ich einen weiteren Lysepuffer? Wird ATL nicht verwendet, um das Gewebe und die Zellen zu lysieren? oder?

AW1: wird verwendet, um die Proteine ​​zu denaturieren, damit sie den Filter passieren können
AW2: 70% Ethanol zum Auswaschen der Salze. Es enthält auch ein Qiagen-Konzentrat.. aber keine Ahnung, was das bedeutet..

Irgendwelche Ideen zu diesem AL-Puffer?

Zunächst einmal glaube ich nicht, dass es wirklich notwendig ist, QIAGEN-Puffer zusammenzustellen, solange es für Sie funktioniert. Viele von ihnen sind sowieso proprietär.

Von dem, was ich gefunden habe, enthält AL-Puffer Guanidinsalze für eine bessere Säulenbindung und ein besseres Detergenz.

AW1 und 2 sind Waschpuffer, die als Konzentrate geliefert werden, AW1 enthält eine strenge Waschung mit niedriger Quanidinkonzentration und AW2 ist eine Ethanollösung auf Tris-Basis zur Entfernung von Salzen.

Trof sagte am Do 23. Mai 19:26:24 2013:

Zunächst einmal glaube ich nicht, dass es wirklich notwendig ist, QIAGEN-Puffer zusammenzustellen, solange es für Sie funktioniert. Viele von ihnen sind sowieso proprietär.

Von dem, was ich gefunden habe, enthält AL-Puffer Guanidinsalze für eine bessere Säulenbindung und ein besseres Detergenz.

AW1 und 2 sind Waschpuffer, die als Konzentrate geliefert werden, AW1 enthält eine strenge Waschung mit niedriger Quanidinkonzentration und AW2 ist eine Ethanollösung auf Tris-Basis zur Entfernung von Salzen.

Ich kann verstehen, aber ich frage mich, was der Unterschied zwischen Gewebelysepuffer (ATL) und Lysepuffer (AL) ist.
Es scheint ziemlich seltsam zu sein, zwei Lysepuffer zu verwenden.

Nicht wirklich. Wenn Sie die Isolierung selbst durchführen würden, würden Sie wahrscheinlich für jeden Fall einen spezifischen Lysepuffer verwenden, aber kommerzielle Kits können keine Puffer verschwenden, die Sie nicht verwenden werden. Also haben sie es mit einem für alle Zwecke notwendigen Lyse- und Äquilibrierungspuffer und einem wahrscheinlich stärkeren nur für Gewebe gemacht.
Kommerzielle Kit-Protokolle sind für die Art und Breite ihrer Verwendung optimiert, was aus Sicht der üblichen Laborpraxis weniger einfach erscheinen mag.

Zu Ihrer Information der Qiagen ATL-Puffer besteht hauptsächlich aus SDS und dient dazu, die Nukleaseaktivität zu zerstören, ohne die Proteinase K (PK) zu sehr zu schädigen, und hilft der PK, Proteine ​​​​zu verdauen.  Sie könnten 5-10mM CaCl2 hinzufügen, um der PK zu helfen und vielleicht EDTA (

2 mM), um Mg2+ von Nukleasen zu entfernen, aber das 2-5% SDS plus PK zerstört wirklich das Protein (und Hb im Blut), während die Nuklease stirbt.  RNAase A wird in ähnlicher Weise sterben. ATL hat auch einen pH-Wert von 8,6 (wahrscheinlich Tris) und scheint dem "Schwanzspitzen"-Verdauungspuffer ähnlich zu sein.  AL-Zusatz (

4M GuHCl)  setzt das verdaute Protein in Lösung und dann Zugabe von ETOH (zu

33 %) hilft, das SDS in Lösung zu halten, da es dazu neigt, mit GuHCl auszufallen.


Nukleinsäure-Extraktionsmethoden

Nukleare Extraktionsmethoden lassen sich grob in zwei verschiedene Typen einteilen:

Lösungsbasierte Methoden

Viele der frühen Verfahren zur Nukleinsäureextraktion beruhten darauf, gefrorene biologische Proben zu zermahlen und sie dann mit Lösungen von Chemikalien zu mischen, die entwickelt wurden, um die Reinigung von RNA und/oder DNA zu ermöglichen.

1. Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation (mit Ethidiumbromid)

Diese Methode basiert auf dem Phänomen des Auftriebs und der spezifischen Dichte. Cäsiumchlorid (CsCl) ist ein extrem dichtes Salz. Wenn Lösungen dieses Salzes bei sehr hohen Geschwindigkeiten (typischerweise >100.000 U/min) zentrifugiert werden, baut das CsCl einen Konzentrationsgradienten auf, bei dem es an einem Ende oder an der Seite des Zentrifugenröhrchens, in dem es sich befindet, hochkonzentriert ist , und viel weniger konzentriert bei der anderen. Wird der Zentrifugationsvorgang sanft beendet und die Zentrifuge langsam abgebremst, setzt sich die dichtere Lösung (mit höherer CsCl-Konzentration) am Boden des Röhrchens ab und hält den Konzentrationsgradienten für einige Zeit aufrecht. Andere in der Lösung gelöste Moleküle trennen sich entsprechend ihrer Dichte, wobei die dichteren Moleküle zum Boden des Röhrchens und weniger dichte Moleküle nach oben wandern. Wenn DNA in Gegenwart eines Moleküls namens Ethidiumbromid ist, bindet es sich daran und wird unter UV-Licht fluoreszierend. Das Ethidiumbromid passt auch die Dichte der DNA so an, dass sie sich beim Zentrifugieren in Richtung der Mitte des Röhrchens bewegt. Verunreinigungen bewegen sich an verschiedene Positionen und werden daher von der DNA getrennt, die leicht zu sehen und zu gewinnen ist, da sie fluoreszierend ist. Nachfolgende Schritte trennen dann die DNA von CsCl und Ethidiumbromid. Diese Technik ist besonders effektiv für die Trennung von Plasmiden –, die kleine DNA-Stränge sind, die Bakterien verwenden, um Informationen über Antibiotikaresistenzen miteinander auszutauschen, sowie mitochondriale DNA und andere spezifische DNA-Moleküle, die an charakteristische Mengen an Ethidiumbromid binden und daher haben einzigartige Dichten. Es ist einfach, mitochondriale und Plasmid-DNA zu trennen. Diese Nukleinsäuren sind in stark gewundenen (supercoiled) kreisförmigen Mustern angeordnet. DNA, die nicht supercoiled ist (wie viel längere chromosomale DNA-Spezies) binden an unterschiedliche Mengen Ethidiumbromid und haben eine unterschiedliche Dichte, wodurch sie leicht von der Plasmid-DNA getrennt werden können.

2. Guanidinium Thiocyanat-Phenol-Chloroform Nukleinsäureextraktion

Eine wässrige Lösung des Salzes Guanidiniumthiocyanat, wenn sie mit den Lösungsmitteln Phenol und Chloroform gemischt wird, ermöglicht eine effektive Reinigung von RNA durch eine minimale Anzahl von Schritten. Wenn Proben zerkleinert und mit Chloroform, Phenol, Natriumacetat und Guanidiniumthiocyanat vermischt und zentrifugiert werden, trennt sich die Salzlösung von den Lösungsmitteln und liefert eine obere wässrige Phase und eine untere organische Phase, die aus den Lösungsmitteln besteht. RNA verbleibt in der wässrigen Phase, während Proteine, andere Nukleinsäuren und andere Verunreinigungen in die organische Phase oder an die Grenzfläche zwischen den beiden Phasen wandern.

3. Extraktion von Cetyltrimethylammoniumbromid-Nukleinsäuren

Diese Technik wird hauptsächlich für Pflanzenproben sowie deren Teile wie Körner, Samen und Blätter verwendet. Es wird auch für viele Lebensmittelproben verwendet. Nukleinsäuren und einige andere Polysaccharide sind in Lösungen von 2% Cetyltrimethylammoniumbromid-Nukleinsäureextraktion (CTAB) bei hohem pH-Wert unlöslich. Neutrale Polysaccharide und Proteine ​​sind löslich. Dies bietet eine einfache Möglichkeit, viele schwierige Verunreinigungen auf pflanzlicher Basis vor der weiteren Reinigung zu entfernen.

4. Chelex®-Extraktion

Diese Technik wird in der Forensik zur DNA-Extraktion aus verschiedenen Quellen wie Wangenabstrichen, Blutfleckkarten und Haaren verwendet. Diese Methode verwendet ein Harz (Handelsname Chelex®, das an gängige Inhibitoren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bindet. Dies ergibt eine ziemlich grobe Probe, die jedoch die DNA konserviert und für die PCR-basierte forensische Analyse nützlich macht.

5. Alkalische Extraktion

Diese Technik wird für die Plasmid-DNA-Isolierung, allein für relativ rohe Präparate oder als erster Schritt in praktisch allen Plasmid-Reinigungsverfahren verwendet. Dabei werden die interessierenden Bakterien aus einem Kulturmedium geerntet und die Bakterien folglich einer stark alkalischen Lösung ausgesetzt. Darauf folgt im Allgemeinen das Mischen des alkalischen Extrakts mit dem Detergens Natriumdodecylsulfat, das Proteine ​​​​und die meisten anderen Verunreinigungen entfernt. Einer der größten Vorteile dieser Methode ist, dass, da viele Proteine ​​an die große chromosomale DNA gebunden sind, diese DNA zusammen mit den Proteinen entfernt wird. Da molekulare Klonierungstechniken von der Manipulation von Plasmid-DNA abhängen, ist das Entfernen der chromosomalen DNA kritisch.

Festphasen-Nukleinsäureextraktion

Festphasenextraktionsverfahren funktionieren, indem sie bewirken, dass Nukleinsäuren an feste Träger binden, wie z. B. magnetische Beads, die mit Siliciumdioxid oder anderen Materialien beschichtet sind. Die Perlen (oder andere Träger) werden dann mit Alkohol gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird der Träger mit einer Flüssigkeit gewaschen, die die Nukleinsäuren wieder löslich macht, wodurch die DNA in einem als Elution bezeichneten Prozess vom Träger befreit wird. Eine einfache Methode besteht darin, dem rohen Nukleinsäureextrakt eine Lösung zuzusetzen, die ein Chaotrop enthält. Chaotrope Mittel sind Moleküle, die das Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen Wassermolekülen unterbrechen. In Gegenwart von Chaotropen sind Nukleinsäuren weitaus weniger löslich und binden sich an Glas, silikabeschichtete Magnetkügelchen und andere feste Träger, wodurch sie leicht von Verunreinigungen getrennt werden können. Festphasenextraktionsverfahren können auch von der selektiven Bindung von DNA und RNA an Ionenaustauscherharze oder andere Chemikalien abhängen.


Pyrimidine

Pyrimidine sind heterozyklische aromatische Verbindungen, deren Molekülstruktur der von Pyridinmolekülen ähnlich ist. Es fällt unter die Kategorie der Diazine, die Benzolringe sind, die 2 Stickstoffatome enthalten. Pyrimidine weisen das Vorhandensein von Stickstoffatomen an den Positionen 1 und 3 ihrer Ringstruktur auf. Es gibt zwei Arten von Pyrimidinen in Form von DNA-Basen.

Cytosin

Die chemische IUPAC-Bezeichnung für Cytosin ist 4-Aminopyrimidin-2(1H)-on. Es ist ein Pyrimidin-Derivat mit Substitutionen einer Amingruppe an 4 und einer Ketogruppe an 2 Positionen. Es wurde erstmals 1894 von Albrecht Kossel und Albert Neumann aus Kalbsthymusgewebe entdeckt. Es kommt in der DNA als Nukleotid, Cytidin, vor. Die Methylierung von Cytosin ergibt 5-Methylcytosin, während seine Hydroxylierung 5-Hydroxymethylcytosin ergibt. Es kommt in der DNA als Desoxycytidintriphosphat (dCTP) vor.

Thymin

Die chemische IUPAC-Bezeichnung für Thymin ist 5-Methylpyrimidin-2,4(1H,3H)-dion. Es entsteht durch die Methylierung des Uracil-Moleküls am 5. Kohlenstoffatom. Es wurde neben Cytosin von Kossel und Neumann entdeckt. Es bildet das Nukleotid Thymidin. In Gegenwart von UV-Licht bildet diese Base Dimere zwischen zwei benachbarten Thymidinmolekülen entlang des DNA-Strangs. Es kommt in der DNA als Desoxythymidintriphosphat (dTTP) vor.


Ethanol ist ein gutes Lösungsmittel

Both ethanol and isopropanol mix well (are miscible with) water, but they have lower dielectric constants than water, meaning that their ability to shield positive and negative charges in the solution and keep them segregated is much poorer. The dielectric constant for water, for example, is 78.5, while the constant for ethanol is 24.3. DNA is negatively charged, so it's attracted to positive ions in the solution like potassium or sodium. Ethanol has a poorer ability than water to keep the positively charged ions and the DNA apart.


Glucose for Osmolarity

50mM (millimolar) glucose sugar is added to GTE buffer to maintain osmolarity where the solute concentration outside the cells is close to that inside the cells. This prevents premature cell lysis, which can cause lower DNA yields to due to aggregation and degradation. The other components of the buffer also contribute to the osmolarity of the solution, but glucose, being a non-electrolyte, is a good choice because it does not interfere with the solution's buffer properties.


Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.

This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Verfahren

Gel-purification is a standard procedure performed to recover desired DNA fragments from agarose gels after electrophoretic separation. After dissolving the gel fragment and running it through a specialized filter, this procedure yields DNA freed from impurities such as salts, free nucleotides and enzymes, suitable for downstream applications.

The basic principle behind DNA recovery from agarose gel involves a sequence of bind, wash, and elute steps. Once the gel is in solubilizing buffer, it is applied onto a “spin column,” which, upon centrifugation, allows DNA molecules to selectively bind to a silica-filter while the impurities flow through into a collection tube.

DNA is able to bind to silica thanks to a high salt concentration in the gel solubilization buffer. This buffer is believed to disrupt the hydration structure around the filter and create a cation salt bridge between the strong negative charges on the filter and negative charges on the DNA. Residual impurities are removed by washing with ethanol.

Water or low salt buffer is added to the column and will 𠇎lute,” or free, the DNA from it, presumably by disrupting the cation bridge. The DNA is now purified from the gel.

The first step in the gel purification procedure involves casting the agarose gel and performing electrophoresis of the DNA samples. Once the gel-run is complete, desired DNA fragments are visualized against UV light and fragments are selected after comparing against a molecular weight standard.

If the gel is unstained, the band location can be approximately determined based on a comparison to the DNA ladder. While cutting the gel with a razor blade, one must take care to recover as much DNA as possible with as little agarose as possible.

When handling ethidium bromide stained gels and working in front of UV light, gloves and protective eyewear should be used. After cutting the desired DNA from the gel, dispose of the gel and running buffer properly, in compliance with institutional safety protocols.

Once isolated, the piece of gel is placed in a microfuge tube and weighed on a balance. Using the approximation that 100 mg of gel occupies 100 l, a volume of solublilization buffer that is 4X the gel weight is added to the gel piece. After being placed in buffer, the gel piece is incubated at around 50 C to melt the agarose.

Once melted, the solubilized gel is added onto a spin column and the solution is centrifuged, which will cause all of the DNA and other particulates to stick to the filter.

Next, the bound DNA is washed by adding 70% ethanol to the filter, followed by centrifugation, which will remove residual impurities from the filter. Flow through is discarded, and this washing step is then generally repeated up to three times. The empty filter is spun again to remove residual ethanol, and the silica filter is allowed to dry at room temperature. Water or elution buffer is added to the filter, and with another round of centrifugation, purified DNA is collected in the bottom of the tube.

The method you’ve just seen applies to gel purification with silica spin column filters. Other methods exist that make use of the same basic principles of DNA binding to silica followed by washing and elution steps. For example, silica can be mixed with DNA in a suspension called “glassmilk,” which can be pelleted and washed, and later eluted. Also, suction can be used to pull DNA through silica filters and, later, elute it. Be sure to understand your lab’s gel purification procedures.

Now that you have learned how to recover DNA from agarose gels, let us examine a few downstream applications that use DNA obtained from gel-purification.

For example, gel-purification is an intermediate step in Chromatin Immunoprecipitation, a technique that aims to isolate the regulatory proteins that bundle genomic DNA, in order to identify which sequences are being regulated. The isolated fragments are gel-purified and sequenced, in order to be mapped onto the individual chromosome regions.

Subcloning - the process of moving a gene in one vector to another - can involve gel purification. For example, gene sequences from one vector can be digested from one construct, and assembled into chimeric sequences via PCR, after which they are gel purified and put into other constructs.

Perhaps the simplest application of gel-purification is its use after long-term storage at -80 ⶬ of excised DNA bands following electrophoresis.

You have now learned how to extract DNA fragments from agarose gel, the variations of bind, wash, and elute procedures followed as per individual user-preference, and finally some of the possible downstream applications of this method. As always, thank you for watching.


Schau das Video: ADHD As A Difference In Cognition, Not A Disorder: Stephen Tonti at TEDxCMU (Kann 2022).