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Was passiert nach dem Reinigungsschritt bei der Hi-C-Sequenzierung?

Was passiert nach dem Reinigungsschritt bei der Hi-C-Sequenzierung?


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Ich bin Statistiker und lese einen Artikel über Hi-C und versuche, einen der Schritte im DNA-Isolierungs- und -Sequenzierungsprozess besser zu verstehen.

Da ich ein Statistiker, versuchen Sie bitte, in Ihren Antworten zu viel Jargon zu vermeiden, und wenn Sie Jargon verwenden müssen, definieren/erklären Sie es bitte.
Insbesondere bin ich verwirrt über den Isolations- und Scherschritt. Um mich zu erklären, werde ich auf Folgendes verweisen Bilder, beschriftet mit 1 bis 4.

Bild 1)
Bild 2)
(Quelle: nature.com)
Bild 3)
(Quelle: babraham.ac.uk)
Bild 4)
(Quelle: nature.com)
Ich verstehe, dass die DNA mit Restriktionsenzymen zerschnitten wird, wodurch eine Wolke von DNA-Fragmenten entsteht, von denen einige vernetzt sind und andere nicht. Wenn diese Stücke mit Biotin angefügt und in a . ligiert werden verdünnen Mischung, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Stücke mit sich selbst ligieren, was zu einem von beiden führt; 1) ein Ring aus NICHT vernetzten Strängen (wie in der dritten Zeichnung in .) Bild 3 markiert "Selbstligation") oder 2) Achter aus Strängen, die vernetzt SIND (wie in der vierten Zeichnung in Bild 1).

Folgendes finde ich jetzt verwirrend:

  1. Der Pull-Down-Schritt zieht die Biotin enthaltenden Ringe nach unten, aber Bild 1 und Bild 4 lassen es so aussehen, als ob nur die vernetzten Bits heruntergezogen werden und nicht die Soloringe. Haben beide kein Biotin? Und würden somit beide in die gezogene Stichprobe hineingezogen? Oder beruht der Pull-Down-Prozess auf einem Molekül mit 2 Biotin? Wenn nicht, kann man erkennen, ob ein heruntergezogenes DNA-Stück das Ergebnis eines vernetzten oder Solo-Stücks DNA ist?

  2. Warum sind nicht alle losen Enden der DNA ligiert? Bild 2? Unvollständige Verdauung? Beeinflusst dies die Biotinbindung?

  3. Meine nächste Frage. Angenommen, der Pull-Down-Prozess wählt nur die vernetzten Achter aus, dann gereinigt (d.h. das vernetzende Protein oder Formaldehyd wird entfernt) und bildet einen Ring, der aus zwei Strängen ligierter DNA besteht (wie in der oberen rechten Ecke von Bild 4). Der Prozess zeichnet dann ein genomweites Kontaktmatrix $m_{ij}$, die Anzahl der "Ligationsprodukte" zwischen Locus $i$ und ort $j$. Was ist ein "Ligationsprodukt"?

Tut mir leid, ich weiß, dass das oben viel ist, aber ich möchte es verstehen Natur der Daten, bevor ich sie analysiere. Danke für deine Hilfe.


Nach dem Restriktionsverdau besteht die Probe also aus DNA-Fragmenten mit 5'-Überhängen. Diese werden durch Klenow DNA-Polymerase aufgefüllt, wobei Biotin-dCTP an beiden Enden jedes Fragments hinzugefügt wird. Dann werden die Fragmente unter Bedingungen (dh niedriger DNA-Konzentration) ligiert, so dass eine Ligation zwischen nicht vernetzter DNA weniger wahrscheinlich ist. Diese reduzierte Ligationseffizienz (die bereits durch die Verwendung von stumpfen Endfragmenten verringert wird) bedeutet, dass möglicherweise nicht alle vernetzten Fragmente ligiert werden, was ich mir in Bild 2 vorstellen kann Ligationsprodukte (dh sie sind die Produkte der Ligationsreaktion).

Nach diesem Schritt wird die Probe mit T4-DNA-Polymerase behandelt, die neben Polymerase-Aktivität (offensichtlich) auch 3'->5'-Exonuklease-Aktivität aufweist. Somit werden alle freien DNA-Enden, die nicht ligiert wurden, getrimmt, wodurch das Biotin entfernt wird. Nach diesem Schritt wird Biotin hauptsächlich an Ligationsstellen vorhanden sein und diese Moleküle können selektiv von den Kügelchen nach unten gezogen werden. Ich sage hauptsächlich, weil einige dieser sogenannten Dangling-Ends noch Biotin enthalten, aber diese können beim Kartieren unterschieden werden (siehe Bild unten).

Was die Selbstkreise angeht: Da sie ligiert wurden, enthalten sie Biotin und werden mit der vernetzten DNA nach unten gezogen. Da diese DNA jedoch vom gleichen genomischen Locus stammt, können sie während der Kartierung auch von gültigen interagierenden Paaren unterschieden werden:

[Quelle]

Abschließend noch eine kurze Anmerkung zum Pull-Down-Mechanismus. Die Kügelchen sind mit einem Protein namens Streptavidin (oder Avidin) beschichtet, das nur sehr fest an Biotin bindet. Nur ein Biotin muss an ein Molekül (wie DNA) gebunden werden, damit es eingefangen wird.


DNA-Ligation

Die Ligation von DNA ist ein kritischer Schritt in vielen modernen Arbeitsabläufen der Molekularbiologie. Das Versiegeln von Nicks zwischen benachbarten Resten eines Einzelstrangbruchs auf einem Doppelstrangsubstrat und das Zusammenfügen von Doppelstrangbrüchen werden enzymatisch durch DNA-Ligasen katalysiert. Die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-Hydroxyl und 5'-Phosphat benachbarter DNA-Reste verläuft in drei Schritten: Zunächst wird die Ligase durch Reaktion mit freiem ATP selbstadenyliert. Als nächstes wird die Adenylgruppe auf das 5'-phosphorylierte Ende des "Donor"-Strangs übertragen. Schließlich erfolgt die Bildung der Phosphodiesterbindung nach der Reaktion des adenylierten Donorendes mit dem benachbarten 3'-Hydroxyl-Akzeptor und der Freisetzung von AMP. In lebenden Organismen sind DNA-Ligasen essentielle Enzyme mit entscheidenden Rollen bei der DNA-Replikation und -Reparatur. Im Labor wird die DNA-Ligation sowohl für Klonierungs- als auch für Nicht-Klonierungsanwendungen durchgeführt.

DNA-Ligase-Fidelität: Wann ist es wichtig?

High-Fidelity-Polymerasen sind überall – aber warum brauchen Sie eine High-Fidelity-Ligase? Und was meinen wir überhaupt mit &ldquotreue&rdquo, wenn wir von Ligatur sprechen? In diesem Webinar diskutiert der NEB-Wissenschaftler und Ligase-Experte Greg Lohman die Mismatch-Ligation durch DNA-Ligasen und die molekulardiagnostischen Anwendungen, die von der Verwendung von High-Fidelity-DNA-Ligasen wie NEB&rsquos HiFi . abhängen Taq DNA-Ligase zum Nachweis einzelner Basenunterschiede in der DNA.

DNA-Ligation

Die Ligation, der Vorgang des Verbindens von DNA-Fragmenten mit einer DNA-Ligase, verläuft in drei Schritten. Erfahren Sie mehr über die Funktion der Ligatur mit unserer kurzen Tutorial-Animation.

Welche Molverhältnisse sollte ich für die DNA-Ligation verwenden?

Das optimale Reaktantenverhältnis hängt von der nachgeschalteten Anwendung ab.

Warum muss ich meiner DNA-Ligation PEG hinzufügen?

Polyethylenglycol (PEG) ist ein wichtiges Reagens bei Ligationsreaktionen, finden Sie heraus, warum.

Was sind die besten Bedingungen für die DNA-Ligation?

Finden Sie heraus, wie die nachgeschaltete Anwendung die besten Reaktionsbedingungen für die Ligation vorgibt.

Sind manche Ligaturen schwieriger als andere?

Die Ligation von stumpfen Enden und Einzelbasenüberhängen erfordert optimierte Reaktionsbedingungen.


Lernziele

  • Welche Patientenproben werden verwendet, um mögliche Krankheitserreger zu identifizieren?
  • Was macht die PCR, wie funktioniert sie und warum ist sie nützlich?
  • Wie trennt man die gewünschte DNA von allen anderen?
  • Wie funktioniert ein automatischer DNA-Sequenzer?
  • Warum ist es möglich, eine DNA-Sequenz zur Identifizierung von Bakterien zu verwenden?

Anweisungen: Das virtuelle Labor ist in sechs Abschnitte unterteilt, die Sie durch die entsprechenden Verfahren führen. Vergessen Sie nicht, auch den Notizbuchabschnitt zu lesen, der weitere Erklärungen darüber enthält, was Sie tun und warum. Beantworten Sie beim Ausfüllen jedes Abschnitts die entsprechenden Fragen.

Probenvorbereitung

1. Der erste Schritt im Extraktionsprozess verwendet eine Drahtschleife, um was zu tun?

2. Warum sind die Verdauungsenzyme für die DNA-Extraktion notwendig?

3. Die Zentrifuge trennt den Zellinhalt in zwei verschiedene Schichten. Beschreiben Sie diese Schichten und was darin enthalten ist.

PCR-Amplifikation

4. PCR steht für ___________________________________

6. Beschreiben Sie, was während der 3 Zyklen passiert

7. Wie viele Kopien des ursprünglichen DNA-Strangs wurden nach 30 Zyklen hergestellt?
Warum wird diese Phase als "Quotamplifikation" bezeichnet?

PCR-Aufreinigung

8. Um zu bestätigen, dass die PCR funktioniert hat, werden drei Spuren durchgeführt, die 3 Materialien enthalten. Welche Materialien befinden sich in den 3 Bahnen?

Spur 1 _______________________ Spur 2 ____________________ Spur 3 _______________________

9. Was ist der allgemeine Zweck der Reinigungsstufe?

Sequenzierungsvorbereitung

10. Beschreiben Sie das “Sequencing Brew”, dem Sie Ihre gereinigte PCR hinzugefügt haben.

11. Der Zweck der zweiten PCR besteht nicht darin, identische Kopien wie bei der ersten von Ihnen durchgeführten PCR zu erstellen. Was ist der Zweck dieser PCR?

DNA-Sequenzierung

12. Was ist das endgültige PCR-Produkt, das Material, das in Ihren 12 Röhrchen enthalten ist?

13. Was ist Gelelektrophorese?

Sequenzanalyse

15. Welche Identität haben die Bakterien in Ihrer Probe? Befolgen Sie die auf der Seite aufgeführten Schritte und seien Sie geduldig. Die Suche nach BLAST-Daten kann eine Weile dauern.

Erweiterung und formative Bewertung

**Schauen Sie sich die Lernziele am Anfang dieses Blattes an. Haben Sie diese Ziele erreicht? Wiederholen Sie die Simulation, um die beteiligten Schritte zu verstärken. Schreibe einen kurzen Aufsatz in dem die Lernziele in diesem Lab erläutert werden, um zu zeigen, dass Sie sie erreicht haben.**


Modul 1: Methode zur Bestimmung der Aminosäuresequenz und Peptidsynthese

Peptid wird als Edman-Abbau bezeichnet, wobei das Reagens Phenylisothiocyanat ist.

Und um Phenylisothiocyante hat sich eine schöne Chemie entwickelt, und das ist es

nach dem Angriff der N-terminalen Aminosäure auf Phenylisothiocyanat, das ein

elektrophil. Dies induziert schließlich eine Spaltung der ersten Peptidbindung, was zu a

Peptid, das eine Aminosäure weniger ist als das Ausgangspeptid. Und das kannst du isolieren

Peptid und Sie können auch erkennen, welche Aminosäure mit Phenyl reagiert hat

Isothiocyanat und Sie können den Vorgang wiederholen.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen, die nicht darauf zurückzuführen sind, dass Edman-Abbaureaktionen

sind nicht sehr quantitativ, tatsächlich sind die Reaktionen mit mehr als 90 . sehr ergiebig

prozentuale Ausbeute. Sie müssen jedoch bedenken, dass auch bei Schritten mit 90

Prozent Reaktionsausbeute, nach dem zweiten Schritt beträgt die Reaktion insgesamt 81 Prozent

Ertrag. Und so reduziert es sich drastisch, weil es bei jedem Schritt sinkt, wenn wir bedenken

dass die Ausbeute 90% beträgt, dann wird es nach 10 Schritten sein

35 %. Ebenso die Gesamtausbeute nach

10 Schritte sind nahe 9%, wenn die Ausbeute der einzelnen Schritte mit 80% angenommen wird. Die

Der Prozentsatz wird erhalten, wenn Sie nur zehn mit 9 multiplizieren und das ergibt den Ertrag und

das wird geteilt durch merken geteilt durch es ist ein Prozentsatz.

Letztendlich wird der Prozentsatz also sehr niedrig sein, nur ein Beispiel, angenommen, Sie tun vier

Schritte, wobei jeder Schritt eine Ausbeute von 90 % aufweist. Der Betrag wird also 9 x 9 x 9 x 9 betragen, das wird also

Machen Sie es 81, dann 73 und 66. Schließlich wird es also etwa 63 % Ausbeute sein (65,6% um genau zu sein)

nach 4 Schritten. Der Ertrag sinkt also und derzeit ist die Einschränkung, dass Sie gehen können

möglicherweise bis zu etwa 30 Aminosäuresequenzen pro Zyklus pro auf einmal, in einem Schuss

Edman-Abbau. Wenn Sie also ein Protein haben, sind wir dort gelandet, aber das Problem liegt darin, wenn

Sie haben das Protein, das sehr groß ist und Proteine ​​​​in der Regel sehr groß sind.

Die Frage ist nun, was ist der Unterschied zwischen Protein und Peptid? Manchmal wir

nennen wir Peptid, manchmal nennen wir Proteine ​​normalerweise ist es im Grunde das molekulare

Last. Es gibt keine festen Regeln, aber wenn etwas weniger als 50 Aminosäuren enthält

Säuren, dann wird das als Peptid bezeichnet. Wenn es mehr als 50 Aminosäuren hat, normalerweise

dann wird das als Protein eingestuft. Aber der allgemeine Begriff, der beide abdeckt, ist

„Polypeptid“-Polypeptide enthalten Peptide mit weniger als 50 Aminosäuren sowie Proteine

mehr als 50 Aminosäuren. Aber es gibt keine scharfe Abgrenzung zwischen den beiden.

Kommen wir nun noch einmal auf die Frage zurück, dass, wenn Sie eine Aminosäure haben, die ein

große Anzahl von Aminosäuren, was werden Sie dann tun? Denn auf eine Art du

kann nur bis zu etwa 30 Aminosäuren bestimmen und wenn es mehr als 30 sind, wenn es mehr hat

als sagen wir 100 Aminosäuren, dann müssen Sie das Protein in kleinere Stücke schneiden. ich

Ihnen gesagt, dass es Enzyme gibt, die dazu beitragen können, dass einige Enzyme sehr spezifisch sind. Du

kann dies nicht tun, indem das Protein mit Säure oder Base behandelt wird, die Amidbindungen hydrolysiert

sie sind jedoch nicht spezifisch. So wird jede Amidbindung hydrolysiert.

Sie müssen also eine gewisse Spezifität beim Aufbrechen des Proteins in kleinere Stücke haben.

Es ist im Grunde das, was als maßgeschneiderter Bruch bezeichnet wird, bedeutet, dass der Schneider die

Stück eines Tuches in so kleinere Stücke zerteilen, die sie schließlich zusammenbinden und zu

das Kleid machen. Dies ist ein sehr ähnlicher Prozess, bei dem Sie das Protein in kleinere Stücke schneiden.

bestimme die Reihenfolge dieser kleineren Stücke, die Reihenfolge der Aminosäuren dieser kleineren

Stücke und wieder zusammenbinden, zusammenfügen. in diesem Verbinden bedeutet nicht physisches Verbinden, du wieder

schreibe einfach, was die Sequenzen sind und kombiniere dann schließlich die Sequenzen, um es herauszufinden

Jetzt gibt es wieder Probleme damit, denn wenn Sie annehmen, Sie haben ein Protein wie

Dies. Ich habe davon erzählt, wenn du es in sagen wir drei Teile zerschneidest A B C und du bestimmst die

Aminosäuresequenz all dieser drei. Dann kommt die nächste Frage, was ist das?

Nachdem Sie das Protein in drei Stücke geschnitten haben, wissen Sie wirklich, welches Stück es ist

kommt zuerst, gefolgt von welcher und was ist die dritte. Also, was müssen Sie tun, wenn

Sie haben drei Stücke, dann können Sie addieren, was der N-Terminus ist (von Sander

Methode), was ist der C-Terminus (nach der Carboxypeptidase-Methode). Und wenn du das tust

dann weißt du, welches tatsächlich zwischen A und C liegt.

Lassen Sie uns nun über einige dieser Enzyme sprechen, die das Protein selektiv schneiden können

Molekül in drei Stücke wie dieses. Daher werden sie künstliche Scheren genannt. Lass uns jetzt reden

über was sind das für eine künstliche Schere oder die Enzyme, über die wir reden?

hat eine ganz besondere Selektivität bei der Spaltung der Peptidbindungen an bestimmten Positionen.

Enzyme sind auch Proteine. Also, im Grunde genommen sind sie Proteine, die eine katalytische Kraft haben

Enzyme genannt, sprechen wir hier von Enzymen. Diese Enzyme brechen also die

Protein (die Peptidbindung), daher werden sie zusammenfassend als Peptidase bezeichnet, weil sie

Was sind nun einige dieser Enzyme? Sie sind alle natürlich gemacht und eine besondere

eine heißt Chymotrypsin, eine andere heißt Trypsin, dann hast du Pepsin. Also, diese

sind einige der Proteasen oder Peptidasen, die Sie auch als Protease bezeichnen können, weil sie

Brechen die Peptidbindung, zerbrechen sie das Protein in Teile.

Daher werden sie auch Proteasen genannt, manchmal Proteasen, manchmal Peptidasen. Und,

Dies sind die Enzyme, die am häufigsten verwendet werden Trypsin und Chymotrypsin, da sie die

solche, die sehr spezifisch sind. Spezifisch bedeutet, dass sie nur bestimmte Aminosäuren erkennen

Säuren und nur wenn sie diese Aminosäuren erkennen, spalten sie die Peptidbindung

mit diesen Aminosäuren verbunden.

Jedes Enzym, das eine breitere Spezifität hat, bedeutet eine breitere Spezifität zu identifizieren

viele Aminosäuren von diesen 20, dann hast du die Möglichkeit das Peptid zu spalten oder

das Protein in viele Fragmente, die wir auch nicht wollen. Denn wir wollen Fragmente

die groß sind, die eine optimale Größe haben sowie die Anzahl sollte nicht sehr groß sein

Unnötig, wenn das Protein in 10 Stücke von 10 Aminosäuren geschnitten wird, dann ist das nicht der Fall

dienen dem Zweck, denn ein Edman-Zyklus wird letztendlich zur Bestimmung führen

unserer 30 Aminosäuren, daher macht es keinen Sinn, ein Enzym zu wählen, das eine sehr breite

Deshalb haben sich die Leute für dieses Chymotrypsin und Trypsin entschieden, weil sie es sind

extrem selektiv, ihre Selektivität ist ziemlich eng. Ziemlich schmal bedeutet, dass sie nur

erkennen sehr spezifische (bestimmte Mindestanzahl) Aminosäuren. Chymotrypsin, was ist das?

ist, wenn Sie eine Peptidbindung CONH haben und wenn es zufällig ein Aromat ist

Aminosäure auf dieser Seite und eine weitere Aminosäure auf dieser Seite.

Dann spaltet Chymotrypsin die Peptidbindung zwischen dieser aromatischen Aminosäure und der

andere Aminosäure vom C-terminalen Ende. Chymotrypsin spaltet sich nur, wenn es

Phenylalanin, das eine aromatische Aminosäure ist, erinnern Sie sich an diese aromatischen Aminosäuren,

dann Tyrosin, das Y ist, und W, das Tryptophan ist. Das sind also die drei aromatischen Amino

Säuren (F, Y und W). Wenn sie also vorhanden sind, wird die Peptidbindung gespalten, aber

Denken Sie daran, dass diese aromatische Aminosäure durch 2 Peptidbindungen verbunden ist. Einer ist auf der N-

Terminusseite und eine andere in Richtung des C-Terminus.

Es bricht also tatsächlich die Peptidbindung, an der die aromatische Aminosäure beteiligt ist

Carbon Ende. Also, was ich meine ist im Grunde das ist auch wieder mit einem anderen verbunden

Peptidbindung auf der linken und rechten Seite. Hier muss man für aromatische Aminosäure sagen, es

bricht die Peptidbindung unter Beteiligung der Aminosäure am Carboxyende. Die C-Doppelbindung

O an diesem Ende, denn das ist das Carboxy-Ende auf dieser Seite. Also, das ist über Chymotrypsin

und, aber eine Sache, die Sie sich merken müssen, ist, dass diese benachbarte Aminosäure eine ist

Einschränkung, dass, wenn diese Aminosäure zufällig Prolin ist, die Hydrolyse nicht stattfinden kann

Platz. Also, in der nächsten Aminosäure, die mit der aromatischen Aminosäure verbunden ist, passiert

Prolin sein, dann kann diese Hydrolyse nicht stattfinden. Was ist mit Trypsin? Trypsin

hydrolysiert sehr ähnlich, erkennt aber nur stark basische Aminosäuren wie Lysin und

Arginin. In diesem Fall haben Sie also die basische Aminosäure, eine basische Aminosäure bedeutet Amino

Säuren mit einer sehr stark basischen Seitenkette sprechen wir hier nicht von Histidin. ich sagte

dass Histidin zwar in die basische Aminosäure eingeordnet wird, aber seine Basizität viel geringer ist

im vergleich zu arginin und lysin ok.

Wenn es also eine basische Aminosäure gibt, findet auch die Hydrolyse statt, aber diesmal ist die

Enzym, das benötigt wird, ist Trypsin ok. Trypsin hydrolysiert also wieder die Amidbindung am

Carboxy-Ende einer basischen Aminosäure, Pepsin hingegen hat ein viel breiteres

Spezifität kann es tatsächlich einige der Aminosäuren hydrolysieren. Pepsin ist also

im Allgemeinen nicht verwendet, um das Protein in kleinere Stücke zu schneiden. Kommen wir nun zur nächsten Seite.

Also, der nächste Punkt, bevor ich auf ein anderes Thema eingehe, lass mich zuerst ein Problem lösen, das

basierend auf dem, was wir bisher gelernt haben.

Ich habe hier einige Bilder, die Ihnen zeigen, was Trypsin ist und wie es aussieht

mögen. Dies ist also die Kristallstruktur von Trypsin und diesem Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin

sind essentielle Enzyme für die Nahrungsverdauung. Wenn wir also ein Essen zu uns nehmen, das viel enthält

Proteine ​​müssen diese Proteine ​​in kleinere Fragmente zerlegt werden und schließlich

in Aminosäuren. Damit es über den Darm aufgenommen wird und dann sind sie es wieder

verwendet, um die verschiedenen Proteine ​​​​zu machen, die wir in unserem Körper benötigen.

Zuerst gibt es also einen Katabolismus, der Katabolismus baut die großen Moleküle ab. Also, wir

eiweißhaltige Nahrung zu sich nehmen und diese Proteine ​​werden mit Hilfe von Trypsin hydrolysiert,

Chymotrypsin und Pepsin schließlich zu den einzelnen Aminosäuren, die dann

absorbiert und dann vom System verwendet. Nun, Trypsin sieht so aus und hat es

Spezifität, da es basische Aminosäuren, Lysin und Arginin stark erkennt.

Dann haben Sie Chymotrypsin und das ist die Kristallstruktur von Chymotrypsin. Was ist das?

tut? Es erkennt nur die aromatischen Aminosäuren. Die aromatischen Aminosäuren haben eine große

hydrophobe Seitenkette. Die Frage ist also, warum sie bestimmte Aminosäuren erkennen

Wenn Sie Enzymchemie lernen, werden wir sehen, dass die

Molekül (prospektives Substrat) geht hinein und es gibt eine große hydrophobe Tasche

wobei die aromatischen Gruppen zuerst durch schwache Wechselwirkungen binden, hydrophob

Wechselwirkungen und dann geht die Hydrolyse oder die Reaktion weiter.

Bei Trypsin muss es eine Tasche geben, die negativ geladen ist und erkennt

basische Aminosäuren, die beim normalen pH-Wert von 7,2 positiv geladen sind. Das wird also gehen

und dort binden und so kommt die Spezifität.

Und dann haben Sie Pepsin, Pepsin ist das andere, dessen Selektivität etwas breiter ist, es

erkennt andere Peptidbindungen. Obwohl hier nur Phenylalanin geschrieben wird,

Tryptophan und Tyrosin, also die aromatische Aminosäure. Aber ich glaube später war es so

festgestellt, dass es sogar andere hydrolysieren kann, da es sogar andere Aminosäuren erkennen kann, die

sind nicht nur aromatisch hydrophob.

Denn hydrophobe Gruppen gehören nicht nur zu den aromatischen Gruppen, sondern sind auch in

Leucin, Isoleucin, Valin, die aliphatische hydrophobe Gruppen aufweisen. Also, für Pepsin ist es

Die Spezifität ist etwas geringer, deshalb verlassen sich die Menschen nicht so sehr auf Pepsin.

Nun, ich habe dir gesagt, dass wenn du das Essen nimmst, es verdaut und in Fragmente zerlegt werden muss

kleinere Aminosäuren und dann werden diese Aminosäuren absorbiert und verwendet, um die

Ich denke, mit dieser Klassifizierung bedeutet dies, dass die Frage ist, ob wir unsere

Aminosäuren im Körper oder nicht.. Und Sie wissen, dass es eine Klassifizierung von Amino gibt

Säuren basierend darauf, ob wir die Aminosäuren in unserem Körper herstellen können oder nicht. Und,

Wenn die Aminosäuren im Körper nicht biosynthetisiert werden können, werden diese Aminosäuren genannt

Es gibt 10 essentielle Aminosäuren, die über die Nahrung zugeführt werden müssen und der Rest

10, die wir im Körper vorbereiten können. Vielleicht wissen Sie das, das ist das Wesentliche

Aminosäuren können im Körper nicht gebildet werden, sie müssen unbedingt über die Nahrung aufgenommen werden.

Und die anderen sind nicht-essentielle Aminosäuren, sie können normal genug hergestellt werden

Menge bei Erwachsenen und Kindern. Das ist also eine andere Art der Klassifikation von Amino

Lassen Sie uns nun ein Problem lösen. Lassen Sie mich noch einmal daran erinnern, dass dieses Trypsin oder Chymotrypsin

und sogar anderen Proteasen gelang es nicht, die Bindung zu brechen (auch wenn es eine Aminosäure von

ihre Wahl, die sie erkennen), wenn ein Prolin daneben liegt. Und der Grund

ist, dass Prolin eine sekundäre Aminogruppe hat, die die Struktur an dieser Stelle verzerrt.

Daher können Enzyme die von ihnen bevorzugte Seitenkette der Aminosäure nicht aufnehmen,

so stoppt Prolin die Hydrolyse an diesem Punkt. Gibt es eine chemische Methode, um

selektiv eine Peptidbindung spalten? Die Antwort ist ja, es wurde ein Reagenz verwendet

entwickelt und das heißt Bromcyan.

Bromcyan ist ein sehr einfaches Reagens mit der Formel CNBr. Cyanogen

Bromid ist sehr spezifisch beim Aufbrechen der Bindungspeptidbindung, die nur mit

Methionin. Es erkennt also nur eine Aminosäure. Und was ist die Reaktion, die dauert?

hier platzieren? Die Chemie, die stattfindet, ist zuallererst verbunden, was bedeutet, dass Sie

Um es ganz klar zu sagen, wenn es Methionin ist, ist der Code M und wenn es NH ist, dann ist dies die Bindung

die durch Bromcyan gespalten wird.

Versuchen wir nun, den Mechanismus zu zeichnen, den der Mechanismus hier in den Folien geben könnte,

Ich kann es hier zeigen. Siehe, dies ist ein Peptid in der gezeigten erweiterten Form. Und

Wo ist das Methionin? Dies ist das Methionin mit der Seitenkette ist CH2CH2 und dann

KMU. Es ist eine sehr wichtige Aminosäure, von der Sie später erfahren werden, dass dieses Methionin eine

ausgeprägte Rolle. Wenn wir Methionin in unserem Körper nicht herstellen können, wird unsere Proteinsynthese

Zusammenbruch. Aber das ist im Moment nicht das Problem, wir versuchen zu sehen, wie Cyan

Bromid ist in der Lage, die mit Methionin assoziierte Peptidbindung zu spalten.

Dies ist also Ihr Methionin-Teil und dies ist die Peptidbindung. Und jetzt, wie Sie behandeln

Bromcyan, wissen Sie, in Bromcyan ist dieser Kohlenstoff hochgradig elektrophil

flankiert von zwei elektronegativen Atomen. Es greift also dieses Bromcyan an,

insbesondere die Kohlenstoff- und Bromblätter, da dies hier eine gute Abgangsgruppe ist. So,

das Brom verlässt und sobald Brom so abblättert, erhält man eine Art, die so ist.

S Methyl war schon da und jetzt S, das an ein Cyanid und das Bromid gebunden wird

Ionenblätter aus dem Bromcyan. Aber was Sie dabei geschaffen haben, ist ein

Sulfoniumion, wobei Schwefel eine Plusladung hat.

Und was wird nun passieren, wenn Sie diese Sulfonium-Einheit gemacht haben?

sehr gute Abgangsgruppe jetzt. Was will der Schwefel jetzt tun? Schwefel wird wollen

brechen diese Bindung. Also, wie wird es passieren? Es wird von einem der benachbarten passieren

Befindet sich also ein nukleophiles Zentrum in der Nähe, das diesen Kohlenstoff angreifen kann, und wenn die Größe

des Rings ist durchaus angemessen, das ist auch wichtig, wenn es einen entsprechenden gibt

Nucleophil, das dieses Kohlenstoffatom angreift, aber nur einen 4-Ring oder einen 3 .-Ring bilden kann

Gliederring (die gespannt sind), dann kann das nicht passieren. Was passiert in diesem Fall

ist, dass es ein nukleophiles Zentrum gibt und das ist im Grunde dieser Stickstoff und dieses Amid

Zwischen diesen beiden steht nun das einsame Elektronenpaar des Stickstoffs in Konjugation mit dem

Carbonyl. Das heißt, der Sauerstoff hat den größeren Anteil an der negativen Ladung

zwischen Stickstoff und Sauerstoff. Also schreibst du es einfach anders, um es zu zeigen

eine weitere Bestätigung, die das Carbonyl auf dieser Seite bedeutet, und dies ist das gleiche Peptid

Bindung, die in einer anderen Bestätigung geschrieben ist, nur um Ihnen zu zeigen, was hier passiert. Wenn

Wenn du so schreibst, dann siehst du, dass dieser Sauerstoff ziemlich nahe an diesem Kohlenstoff ist, der ist

leidet jetzt unter dem Elektronenmangel, der durch den positiv geladenen Schwefel verursacht wird

Schwefel will verschwinden und nimmt die gebundenen Elektronen mit.

Also, was wird jetzt passieren? Unterstützt wird das Ganze durch den Stickstoff, Wasserstoff

Ein einsames Paar fließt hier hinein und dann wird der Sauerstoff negativ, der den Kohlenstoff angreift und

das geht ab. Das Molekül, das schließlich herauskommt, ist dieses CH3SCN als Nebenprodukt.

Die Frage ist nun, was mit unserem Protein passiert. Das Protein liegt jetzt in dieser Iminiumform vor

der Stickstoff mit einer Plusladung und dann wird dies nicht sehr stabil sein.

Nun kommt Wasser und greift diesen Kohlenstoff an und dann kommt es schließlich zur Hydrolyse. Also das

Hydrolyse führt schließlich zu einem cyclischen 5-gliedrigen Lacton und dieses Lacton stammt von

Und was war das Ergebnis? Das Ergebnis ist, dass diese Peptidbindung, mit der wir

begonnen hat, ist das Peptid jetzt weg, die Peptidbindung ist nicht mehr da. Und du hast ein neues

Peptid, das frei davon ist, von dieser linken Seite, was auch immer hier residiert, was auch immer

Das sei die Anzahl der Aminosäuren hier, das ist weg. Der Methionin-Anteil wird also umgewandelt

zum N-terminalen Peptidfragment. Dies ist also eine sehr wichtige Reaktion. Cyanogen

Bromid ist nur für Methionin sehr spezifisch. Dieses Lacton heißt jetzt jedoch

Homoserinlacton. Warum heißt es Homoserinlacton? Was ist Serin?

Serin ist eine α-Aminosäure und dann gibt es ein CH2 und dann ein OH. Was ist in diesem Fall

Ereignis? Es gibt ein CH2, das Serin ist, dann hast du noch ein CH2, also das gibt dir

das höhere Homolog von Serin und dann haben Sie den Sauerstoff.

Es ist also im Grunde Homoserin, das in das Lacton umgewandelt wird. Also, letztendlich ist es

wird ein Homoserinlacton

. Wenn also dieser gebildet wird, dann wissen Sie, dass sich an dieser Position ein Methionin befindet und die

Rest des Fragments, d. h. der andere Peptidteil vom C-terminalen Ende, der

Die Bromcyan-Reaktion funktioniert jedoch nicht, wenn die zweite Aminosäure

ist zufällig ein Serin. Sie können hier sehen, dass dies Serin ist und dies Ihr Methionin war.

Die erste Reaktion läuft problemlos ab, das Brom geht so raus, das bekommt man

Sulfoniumion. Nun kommt im nächsten Schritt eine Peptidbindung Sauerstoff und greift diese an

Kohlenstoff, der Schwefel verlässt die Chemie sehr ähnlich wie früher.

Aber jetzt, wenn Sie nur diese ganze Route entlanggehen, werden Sie sehen, dass Sie letztendlich

am Ende nicht beim Homoserinlacton, sondern beim Homoserin selbst.

Das heißt, Sie brechen hier nicht die Peptidbindung. Also, obwohl es mit reagiert hat

Cyanogenbromid, der ultimative Effekt ist, dass Ihr Methionin in a . umgewandelt wird

Homoserin, das das Endprodukt von jedem ist. Diesen Mechanismus können Sie selbst ausprobieren,

aber es ist dem früheren sehr ähnlich.

Aber ich überlasse es Ihnen als Problem, dass ich den Mechanismus nicht teilen werde

Folie gerade jetzt diese Folie zeigt, wie es letztendlich ins Homoserin geht. So,

Ich wiederhole, wenn es nach Methionin ein Serin gibt, dann passiert dieses Methionin

wird zu Homoserin und das ist das Endprodukt und es kommt zu keinem Bruch eines Peptids

Bindung. Wenn es also keinen Bruch gibt, wird es jetzt wirklich schwierig zu sagen, ob es da ist

war ein Methionin vorhanden oder nicht.

Die Reaktion schlägt auch fehl, wenn nach Methionin ein Cystein ist, was passiert mit Cystein?

Sie können eine sehr ähnliche Art von Reaktion wie Methionin erwarten. Wenn ein Cystein vorhanden ist,

Was wird passieren? Wird Cystein auch mit Bromcyan reagieren und schließlich

wird auch die Peptidbindung brechen? Nein, tut es nicht. Was passiert ist, dass das Cystein

auf jeden Fall reagieren, es hat einen SH, es reagiert mit dem Cyanogenbromid. Und so bildet es SCN

und das Bromidion verlässt.

Das Problem ist jetzt, dass der Schwefel keine positive Ladung hat, weil er früher

hatte den Wasserstoff in Methionin, es hat ein Me, aber in Ihrem Cystein ist es SH. Also, die

Hier geht Wasserstoff verloren und somit hat Schwefel keine positive Ladung. Es ist also kein

in diesem Fall eine gute Abgangsgruppe und daher ist das Endergebnis, dass das Cyanid

hydrolysiert. Wenn also das Cyanid hydrolysiert wird, bekommst du Isocyansäure und du bekommst zurück

Das Serin reagiert also mit Bromcyan und das Bromcyan ist schließlich

in diese Isocyansäure umgewandelt. Isocyansäure ist das Endprodukt, aber es gibt keine

Spaltung einer beliebigen Peptidbindung. Das ist also ein chemisches Reagenz, über das wir sprechen.

Es gibt also eine chemische Bruchmethode. Jetzt wissen wir also, wie man das Protein spaltet

in kleinere Stücke durch die Verwendung von Enzymen wie Trypsin oder Chymotrypsin. Oder Sie können a . verwenden

chemisches Reagenz, wenn Sie wissen möchten, ob Methionin vorhanden ist oder nicht oder wie

viele Methionine sind vorhanden, all dies kann durch Behandlung mit Cyanogenbromid erfolgen.

So funktioniert die ganze Maschinerie. Heute hat die Proteinsequenzierung

automatisiert werden, es gibt eine Maschine, die Sie programmieren, und alles wird erledigt.

Zuerst wird es eine Verdauung mit Trypsin oder Chymotrypsin sein und wir nennen es tryptisch

Verdauung oder chymotryptische Verdauung. Und dann wird es getrennt, die Stücke werden sein

getrennt und es wird direkt zum Aminosäureanalysator geleitet. Und dann mach den Edman

Verschlechterung und letztendlich werden die Daten auf dem Computerbildschirm erscheinen, die diese sind

Und schließlich können Sie durch den Einsatz eines Bioinformatik-Tools letztendlich feststellen, was die

Fragmente, womit bestimmst du die Befestigung der einzelnen Fragmente


Diskussion

Frühere Studien zur Chromatin-3D-Karte in Pflanzen konzentrierten sich weitgehend auf die lokalen Chromatinstrukturen. Der jüngste Bericht über interchromosomale Interaktionen bei Weizen wurde hauptsächlich mit Transkriptionsregulationen in Verbindung gebracht [3]. Wir haben hier den Mechanismus untersucht, der die Struktur höherer Ordnung sowohl auf Chromosomen- als auch auf Subgenomebene in Weichweizen beeinflusst. Die Ergebnisse haben unser Verständnis der Auswirkungen des genetischen Sequenzkontexts auf Chromatinstrukturen höherer Ordnung verbessert, die die Polyploidiestabilität und die Evolution des Pflanzengenoms beeinflussen können.

Auswirkungen von homologievermittelten interchromosomalen Interaktionen

Eine stabile Subgenom-Vererbung ist ein grundlegendes Merkmal polyploider Arten [40, 41]. Neben der bekannten Unterdrückung der homöologen Paarung durch die Ph1 Locus [42,43,44] kann es zusätzliche Mechanismen geben, die die erhöhte Affinität für Weizenchromosomen im selben Subgenom fördern. Wir stellten fest, dass die hohe Sequenzhomologie, die mit subgenom-biased TEs verbunden ist, zur hohen Häufigkeit von Interaktionen innerhalb von Subgenomen beiträgt. In addition to promoting within-subgenome links, homology-mediated inter-chromosome interactions are supported by or can help explain multiple genetic and cytological phenomena at the molecular level. First, the abundant interactions between subgenomes A and B may be due to the substantial genetic communication that developed during the relatively long co-existence period following tetraploidization. Second, the introgressed 1RS fragment has few inter-chromosomal interactions, likely because of the minimal genetic exchange with wheat chromosomes. Third, the Rabl chromosomal configuration has been detected in barley and wheat as well as in other crops with large genomes [28, 29]. An examination of Hi-C matrices indicated that the strong signal along the diagonal is associated with the centromere regions (Fig. 1a, c), implying in wheat cells with Rabl configuration, a major driving force of chromosome folding is likely derived from the centromere. The high density of TEs surrounding centromeres and the inter-chromosomal interactions within subgenomes may facilitate the formation of the Rabl structure. Fourth, the recent finding that inter-chromosomal interactions are more abundant than intra-chromosomal interactions in the autotetraploid species Arabidopsis [45] may be due to a relatively high inter-chromosomal sequence similarity.

Impact of TEs on higher-order subgenome stability

We revealed a previously uncharacterized role for subgenome-biased TEs related to within-subgenome communication in a hexaploid plant species (wheat). The canonical roles of TEs were previously confirmed to mainly involve changing gene and chromosome structures, developing new regulatory functions, and altering the accompanying epigenetic status [46]. In support of our findings, a recent study in mammals proved that TEs contribute to many loop anchors, some of which help maintain conserved higher-order chromosomal structures [47]. Furthermore, we observed a similar but more prominent pattern in human, where the location of Alu elements, the most proliferative retrotransposon in primates [48], is highly correlated with inter-chromosome interactions (Additional file 2: Supplemental Fig. 5). This is consistent a recent study in metazoan reporting the 3D folding correlated with the clustering of similar repetitive elements [49]. Our findings also raise an interesting question. Previous studies suggested that TEs in polyploid species can mediate inter-element recombinations, ultimately leading to rediploidization [46]. However, our data suggest the subgenome-biased TEs help promote the higher-order subgenome affinity in allohexaploid wheat. Thus, how the chromosomes of a wheat subgenome maintain their structural stability in the face of the high frequency of within-subgenome interactions should be determined. It remains unclear whether there is a mechanism restricting the degree of within-subgenome interactions to balance the maintenance of higher-order chromosomal structures and the sequence stability of the interacting chromosomes.


Das große Bild


So, which method for library quantitation is right for you? Your answer will depend on a number of factors that are specific to your situation, including your laboratory&rsquos preferred DNA quantitation method, the tools you have available, your source material, and the size and scope of your experiment. No matter which platform you&rsquoll be sequencing on, it is important to accurately determine the amount of sequence-ready DNA present. As we&rsquove described, accurate quantitation makes a meaningful differ- ence in the quality of the data you&rsquoll create and the overall value of your experiment, by ensuring generation of optimal cluster densities and the equivalent representation of multiplexed libraries when pooling.

Using a qPCR-based approach, as we&rsquove just reviewed, ensures the most accurate quantitation, providing optimal conditions for Illumina&rsquos sequencing chemistries. To make NGS library quantitation more accurate and reproducible, New England Biolabs® (NEB®) offers the NEBNext Library Quant Kit for Illumina. This qPCR-based kit is compatible with a broad range of library insert sizes and GC content, and has a user-friendly workflow.


The purpose of these two steps is to clear water of the small particles that cause it to be turbid or cloudy. Turbidity renders the water hard to disinfect. The water is rapidly agitated to disperse coagulant chemicals throughout it. The small particles, including many bacteria, begin to form large clumps called flocs or floccules. In flocculation, the water is mixed gently so that these clumps combine and precipitate out further.

The water and flocs are pumped into sedimentation basins. Here, the flocs settle beneath the water so that they can be removed. About 85 to 90 percent of the suspended particles responsible for turbidity are removed at this point, including large amounts, but not all, of the bacteria.


Zhe Liang and Qian Zhang contributed equally to this work.

Mitgliedschaften

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China

Zhe Liang, Qian Zhang, Guihua Hu, Pingxian Zhang, Yifan Wang, Liwen Yang & Xiaofeng Gu

Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 69120, Heidelberg, Germany

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101, China

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Beiträge

Z.L. and X.G. konzipiert und gestaltet die Studie. Z.L., Q.Z., Y.Z., and G.H. performed the experiments. Z.L., C.J., P.Z., Y.W., L.Y., and X.G. analyzed data. Z.L. and X.G. wrote the paper. The authors read and approved the final manuscript.

Korrespondierender Autor


Summary: The ATAC-Seq Method Has Changed the Way Researchers Start Doing Epigenetics

When first getting started in the field of epigenetics, the vast variety of methods that are out there can be overwhelming. To pick one approach to tackle your biological question might not be so obvious or easy. Methods like DNase-Seq, FAIRE-Seq, DamID, Hi-C, or ChIP-Seq require millions of cells and often a fair amount of optimization, and in the end, they may only deliver a limited amount of information, leaving you with an incomplete picture of the epigenomic landscape in your samples.

ATAC-Seq has changed the way scientists can approach getting started with epigenetics. The ATAC-Seq protocol requires only about 50,000 cells as starting material, and with its relatively short two-step protocol, it is an attractive method to start your epigenetic journey.

Whether you want to analyze the state of the chromatin in your sample or compare the chromatin state before and after a special treatment, ATAC-Seq allows you to investigate genome-wide chromatin changes and can offer guidelines about which epigenetic modification or transcription factor should be studied next in the follow-up experiments and which method should be used to study them.

ATAC-Seq has made it easier and faster than ever to study the chromatin landscape and take your first steps into the world of epigenetics.

Contact us if you are interested in learning more about ATAC-Seq, how our service works, or to obtain a quote.

Über den Autor

Stefan Dillinger, Ph.D.

Stefan was born in the Free State of Bavaria, Germany. After studying biochemistry in Ulm and Regensburg, he got his Ph.D. in the field of epigenetics, studying the distribution of heterochromatin around nucleoli during cellular senescence. As a graduate student he started his own German science podcast &ldquoThe Random Scientist&rdquo and is now the host of Active Motif&rsquos Epigenetics Podcast. When Stefan is not working at Active Motif or recording podcasts, he is a passionate runner (he finished the New York City Marathon in 3 hours 21 minutes!!) and loves to spend time with his wife and son.

Contact Stefan on LinkedIn with any questions, or to get running advice.

What are your favorite recent epigenetics breakthroughs? We&rsquod love to hear from you! Please contact us at [email protected] or on Twitter (@activemotif) to share your thoughts and feedback! We&rsquore also looking for science writers to contribute to MOTIFvations, so if you&rsquore an established science communicator or just want to get started, please reach out &ndash there might be a story we can collaborate on!


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

MOE Key Laboratory of Bioinformatics Bioinformatics Division and Center for Synthetic & Systems Biology, TNLIST School of Medicine, Tsinghua University, Beijing, 100084, China

Zhengyu Liang, Yanjian Li, Michael Q. Zhang & Yang Chen

MOE Key Laboratory of Bioinformatics Bioinformatics Division and Center for Synthetic & Systems Biology, TNLIST Department of Automation, Tsinghua University, Beijing, 100084, China

Guipeng Li, Zejun Wang, Mohamed Nadhir Djekidel & Yang Chen

Medi-X Institute, SUSTech Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, 518055, China

School of Mathematical Sciences, Peking University, Beijing, 100871, China

Department of Biological Sciences, Center for Systems Biology, The University of Texas, Dallas 800 West Campbell Road, RL11, Richardson, TX, 75080-3021, USA


Schau das Video: How it Works: Proximo Hi-C Genome Scaffolding (Kann 2022).