Information

Warum erfordern einige Protokolle das Vorwärmen eines flüssigen Mediums vor dem Beimpfen?

Warum erfordern einige Protokolle das Vorwärmen eines flüssigen Mediums vor dem Beimpfen?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

In diesem Protokoll für die Präparation kompetenter E. coli-Zellen heißt es beispielsweise:

Ausplattieren von 10 ul E. coli BL21(DE3)-Zellen auf einer LB-Agarplatte; über Nacht (12 Stunden) inkubieren.

Bereiten Sie 500 ml SOB-Medium vor, damit es am Vortag im Inkubator bei 37 Grad Celsius vorgewärmt werden kann.

Wählen Sie eine einzelne ausgewählte Kolonie und inokulieren Sie in 5 ml SOB-Medium und wachsen Sie 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 250 U/min in einem Schüttler.

Beimpfen Sie 500 ml vorgewärmtes SOB-Medium mit 5 ml der frischen Übernachtkultur.

und dann im Protokoll für die Überexpression von Proteinen nach der Transformation dieser Zellen, folge ich im Grunde ähnlichen Schritten wie oben, aber diesmal ohne das groß angelegte flüssige Inokulationsmedium vorzuwärmen. Warum ist das so?


Es ist, weil E coli BL21(DE3) sind kompetente Zellen. Der Kompetente ist hier der Schlüssel, da die Zellen chemisch behandelt wurden, so dass die Transfektion durch Hitzeschock mit hoher Effizienz durchgeführt werden kann.

Dies bedeutet, dass diese Bakterien aufgrund der chemischen Behandlung sehr empfindlich sind und daher sowohl gegenüber mechanischen als auch thermischen Schocks sehr empfindlich sind.

Das Vorwärmen des Mediums vermeidet einfach eine Beschädigung der Zellen und maximiert die Wachstumsrate.


Impföse

SUSAN J. KARCHER, in Molekularbiologie, 1995

Verfahren

Halten Sie den Draht einer Impföse in die Flamme eines Bunsenbrenners, bis der Draht hellrot ist. Entfernen Sie die Schlaufe von der Flamme und lassen Sie die Schlaufe abkühlen. Um sicherzustellen, dass die Schlinge kühl ist, berühren Sie eine saubere, sterile Oberfläche, z. B. den Agar in einer Agarplatte oder den Innendeckel einer sterilen Petrischale. Siehe Abbildung 1.2.

Abbildung 1.2. Die Verwendung einer Impföse zum Ausstreichen einzelner Kolonien. Nummerierte Linien zeigen die Reihenfolge und Richtung des Ausstreichens mit der Impföse.

Nehmen Sie mit der geflammten Schlaufe eine kleine Menge Bakterien auf – entweder von Bakterien, die auf einer Platte wachsen, oder von Bakterien in Flüssigkultur.

Verteilen Sie die Bakterien auf einer neuen Agarplatte. Achten Sie darauf, die Agaroberfläche nicht mit der Schlaufe zu beschädigen. Verteilen Sie die Bakterien in einem Streifen über die Platte und bewegen Sie die Schleife drei- oder viermal über die Oberfläche des Agars hin und her.

Flamme die Schlaufe erneut. Wenn die Schlaufe abgekühlt ist, bewegen Sie die Schlaufe einmal durch den Bakterienstreifen, der gerade auf der Platte entstanden ist. Ziehen Sie die Schlaufe wieder über einen neuen Bereich der Platte hin und her.

Wiederholen Sie das Abflammen und Ausstreichen drei- oder viermal, wobei Sie jedes Mal den vorherigen Streifen nur einmal durchlaufen, um Bakterien aufzunehmen und auf einen neuen Teil der Platte zu streichen.

Inkubieren Sie die Platte umgedreht - mit dem agarhaltigen Teil der Platte nach oben - bei 37 ° C über Nacht.

Am nächsten Morgen sollten in den letzten Strichen auf der Platte einzelne Kolonien sichtbar sein. Wenn keine einzelnen Kolonien vorhanden sind, wiederholen Sie den Vorgang, bis einzelne Kolonien leicht erhalten werden. Mit ein wenig Übung wird diese Methode konsequent einzelne Kolonien ergeben.

Sobald dieses Ausstrichverfahren erlernt ist, ist es möglich, mehrere Kolonien für einzelne Kolonien auf derselben Agarplatte auszustreichen. Dies reduziert die Anzahl der benötigten Agarplatten. Es ist hilfreich, die Platte in Abschnitte zu unterteilen, indem Sie die Platte mit einem Permanentmarker markieren. Der erfahrene Mikrobiologe kann problemlos 8 bis 12 verschiedene Kolonien für einzelne Kolonien auf derselben Platte ausstreichen.

Agarplatten werden kopfüber mit dem agarhaltigen Teil der Platte nach oben inkubiert, damit beim Erwärmen der Platte entstehendes Kondenswasser nicht auf die Agaroberfläche tropft. Kondensationstropfen auf der Agaroberfläche würden die Bakterienschlieren verschmieren. Im Allgemeinen sollten kühl gelagerte Platten vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden. Dadurch wird die Kondensation minimiert. Platten können in einem 37 °C Inkubator schnell erwärmt werden.


BHI-Brühe: Zusammensetzung, Zubereitung, Verwendung

Brain Heart Infusion (BHI)-Bouillon ist ein flüssiges Allzweckmedium, das für die Kultivierung und Erhaltung einer Vielzahl von anspruchsvollen und nicht anspruchsvollen Mikroorganismen verwendet wird, einschließlich aerober und anaerober Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen aus einer Vielzahl von klinischen und nicht- klinische Proben.

Das ursprüngliche BHI wurde von Rosenow hergestellt, bei dem er Dextrosebrühe mit Kalbshirngewebe versetzte, um Streptokokken zu züchten. Gegenwärtig sind verschiedene Modifikationen von BHI-Brühe basierend auf der beabsichtigten Verwendung im Handel erhältlich.

Prinzip

Das Medium enthält Proteosepepton und Infusionen aus Kalbshirn und Rinderherz, die als Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, essentielle Wachstumsfaktoren, Aminosäuren und Vitamine dienen. Traubenzucker wird als Energiequelle verwendet. Dinatriumphosphat hilft bei der Aufrechterhaltung der Pufferwirkung des Mediums, während Natriumchlorid das osmotische Gleichgewicht des Mediums aufrechterhält.

Komposition von Brain Heart Infusion (BHI) Brühe

  1. 37,0 g in 1 Liter destilliertem Wasser suspendieren.
  2. Bei Bedarf erhitzen, um das Medium vollständig aufzulösen.
  3. Nach Belieben in Flaschen oder Tuben abfüllen. Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 Ibs (121 ° C) für 15 Minuten.
  4. Beschriften Sie die Seite jedes Röhrchens mit dem Herstellungsdatum und der Chargennummer.
  5. Bewahren Sie das Kulturmedium bei 2-8 °C in Plastikbeuteln versiegelt auf, um das Risiko einer Kontamination zu verringern.

HINWEIS: Die Zusammensetzung und Methode zur Vorbereitung der Medien variiert je nach Hersteller. Bitte beachten Sie die Hinweise des Herstellers.

Lagerbedingungen und Haltbarkeit

Dehydratisiertes Medium kann bei 10-30°C gelagert und vor dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. Vorbereitetes Medium in Röhrchen oder Flaschen muss im Dunkeln und unter 20°C gelagert werden.

Verfahren zur Verwendung:

  1. Lassen Sie das Medium sich vor der Inokulation auf Raumtemperatur einstellen.
  2. Inokulieren Sie die Brühe leicht mit der Testprobe oder mit dem interessierenden Organismus (für aerobe und andere)
  3. Bei anaeroben Organismen vor der Inokulation die Brühe vorreduzieren, indem die Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur in eine anaerobe Umgebung gestellt und dann leicht inokuliert werden.
  4. Inkubieren Sie die Röhrchen
    1. Bei aeroben Organismen aerob bei 35 °C mit losen Kappen inkubieren.
    2. Für anspruchsvolle Organismen wie Haemophilus-Arten inkubieren in einer CO2-angereicherten Atmosphäre bei 35 °C mit alose Kappe.
    3. Bei anaeroben Organismen Röhrchen anaerob bei 35 °C mit losen Deckeln inkubieren.
    1. Bei Aerobic und anderen, die Röhrchen nach 24 Stunden und nach 48 Stunden untersuchen. Röhrchen bei Bedarf weitere 24 Stunden inkubieren.
    2. Bei anaeroben Kulturen die Röhrchen nach 48 Stunden untersuchen.

    Interpretation der Ergebnisse: Nach der Inkubationszeit die Röhrchen auf Trübung untersuchen, die auf Wachstum hindeutet. Falls gewünscht, kann dann eine Schleife der Kulturbrühe auf einem geeigneten festen Medium zur Beobachtung subkultiviert werden Koloniemorphologie und weitere Tests können von den isolierten Kolonien durchgeführt werden.


    EINLEITUNG

    Die Zellform war eine der ersten bekannten Eigenschaften von Bakterien, aber wie Bakterien ihre unterschiedlichen Formen beibehalten, war bis vor kurzem eine weitgehend undurchdringliche Frage. Bei den meisten Bakterien behält der beutelförmige Peptidoglycan (PG)-Sackulus (allgemein als Zellwand bezeichnet), ein einzelnes netzartiges Molekül, das die Zytoplasmamembran umgibt, die Zellform bei (Höltje, 1998). PG-Untereinheiten, Muropeptide, bestehen aus n-Acetylglucosamin (GlcNAc) verbunden mit n-Acetylmuraminsäure (MurNAc) mit einem angehängten kurzen Peptidstamm an der Lactyleinheit und werden durch eine Muramidase wie Lysozym aus dem PG-Sacculus freigesetzt (Vollmer, Blanot & de Pedro, 2008). Der PG-Vorläufer wird im Zytoplasma schrittweise synthetisiert, bevor er über die Zytoplasmamembran zur periplasmatischen Seite gedreht und in den Sacculus eingebaut wird (Barreteau et al., 2008). PG-Stränge werden durch Glycosyltransferasen erzeugt, die die Bildung von β 1-4-Bindungen zwischen Disacchariden katalysieren. Diese Stränge sind durch die Wirkung von Transpeptidasen miteinander verbunden, um ein Netzwerk zu bilden, die Stammpeptide benachbarter PG-Stränge vernetzen (Sauvage, Kerff, Terrak, Ayala & Charlier, 2008).

    Helicobacter pylori ist ein spiralförmiges Gram-negatives Bakterium mit minimaler genetischer Redundanz, das ein nützliches Modellsystem ist, um die Form von Bakterienzellen zu untersuchen (Tomb et al., 1997). In der PG von H. pylori und vielen anderen Gram-negativen Bakterien besteht der kurze Peptidstamm aus L-Alanin, D-Glutaminsäure, meso-Diaminopimelinsäure, D-Alanin bzw. D-Alanin von Position 1 bis 5 (Vollmer et al. , 2008). In H. pylori, sind die einzigen nachweisbaren Querverbindungen zwischen Position 3 an einem Stamm und Position 4 an einem anderen, obwohl auch andere Bakterien Querverbindungen zwischen Position 3 und 3 erzeugen können (Costa et al., 1999 Sycuro et al., 2010).

    Bakterien müssen die charakteristische Form ihrer Zellwand, die eine dynamische Struktur darstellt, treu beibehalten. Damit Bakterien wachsen können, müssen PG-Crosslinks aufgebrochen werden, um Platz für das Einfügen neuer PG-Stränge zu schaffen (Singh, SaiSree, Amrutha & Reddy, 2012). Ein Mechanismus zur Erhaltung der Zellform ist die Regulierung, wo PG-Vorläufer in den Sacculus eingebaut werden (Caccamo & Brun, 2018 Shi, Bratton, Gitai & Huang, 2018 Taylor, Sichel & Salama, 2019). Zusammen mit den Fortschritten in der Mikroskopie hat die Entwicklung von Sonden zur metabolischen Markierung der Zellwand ein gesteigertes Verständnis und Interesse an der Erhaltung der Form von Bakterienzellen ermöglicht.

    Innerhalb des letzten Jahrzehnts haben eine Handvoll Sonden, die eine metabolische Fluoreszenzmarkierung von PG ermöglichen, das Feld revolutioniert. Die verfügbaren Sonden zur Markierung von PG werden durch verschiedene Schritte des PG-Metabolismus eingebaut, was die Interpretation dieser Markierungen beeinflusst. Die erste dieser entwickelten Sonden war D-Ala, funktionalisiert entweder mit einer fluoreszierenden oder klickbaren Einheit (Kuru et al., 2012 Siegrist et al., 2013). Diese Sonden können durch die Wirkung von Transpeptidasen eingebaut werden (Kuru et al., 2019). Kurz darauf wurden klickbare D-Ala-D-Ala-Dipeptidsonden entwickelt, die in PG eingebaut werden können. Diese werden wahrscheinlich durch die zytoplasmatischen Schritte der PG-Vorläufersynthese eingebaut (Kuru et al., 2019 Liechti et al., 2014). Während D-Aminosäuresonden sehr nützlich sind, um den PG-Metabolismus in einem weiten Bereich von Bakterien zu untersuchen, gibt es bei dieser Sondenklasse einige wesentliche Einschränkungen. Da D-Aminosäuresonden den Peptidstamm von Muropeptiden markieren, können sie entfernt werden, wenn das PG nach der Synthese modifiziert wird, selbst wenn der Rest des Muropeptids zurückbleibt. Außerdem markieren die D-Ala-Sonden, die an Stellen der Vernetzungsaktivität eingebaut sind, sowohl Stellen der neuen PG-Synthese als auch Stellen der Modifikation von etabliertem PG durch Vernetzung.

    Kürzlich wurde eine mit einem klickbaren Griff modifizierte MurNAc-Sonde entwickelt (Liang et al., 2017). Da diese Sonde durch die zytoplasmatischen Schritte der Muropeptid-Synthese eingebaut wird, berichtet sie nur über Stellen der neuen PG-Synthese. Da sich die Markierung auf dem Zuckerrückgrat des PG befindet, wird die Markierung darüber hinaus nur unter Entfernung des gesamten Muropeptids entfernt, was dies zu einem viel einfacheren Reporter der PG-Synthese macht. Die Verwendung dieser Sonde erfordert die Anwesenheit von PG-Recycling-Enzymen, die UDP zu MurNAc hinzufügen können, dem Substrat, das für die Muropeptid-Biogenese verwendet wird. Die Recyclingenzyme AmgK und MurU von Pseudomonas putida kann im zu markierenden Organismus exprimiert werden, wenn diese Recyclingaktivität nicht nativ vorhanden ist.

    Dieser Artikel konzentriert sich hauptsächlich auf 2-Alkinmuraminsäure (MurNAc-alk), wobei einige Vergleiche mit D-Ala-alk enthalten sind. Vor unserer Arbeit (Taylor et al., 2020) wurde MurNAc-alk hauptsächlich für die spärliche Markierung der gesamten Zellwand verwendet, um den Einbau der Sonde in PG zu überprüfen und als Methode zur Erzeugung von markiertem PG für nachgeschaltete Experimente zu dienen ( DeMeester et al., 2018 Aktuelle Protokolle Artikel: DeMeester et al., 2019 Liang et al., 2017).

    Unser Interesse bestand darin, das Muster der neuen PG-Inkorporation als H. pylori wächst und um festzustellen, ob H. pylori verwendet die räumliche Regulierung des Wachstums, um die Helixform beizubehalten. Um dieses Ziel zu erreichen, waren merkliche Modifikationen an früheren MurNAc-alk-Markierungs- und Syntheseprotokollen erforderlich. Da PG während seiner Reifung modifiziert wird, brauchten wir nur für einen kleinen Bruchteil der Verdopplungszeit die Label-Inkorporation.

    Wir mussten sowohl unsere experimentellen Ziele als auch H. pylori Physiologie bei der Entscheidung, wie markierte Zellen am besten abzubilden sind. Unsere Frage, wo die PG-Synthese stattfindet H. pylori ist von Natur aus eine dreidimensionale Frage, wenn man die helikale Form des Organismus bedenkt. Wir mussten Bilder von Zellen sammeln, die von ausreichender Qualität waren, um geographische Landmarken auf der Zelle rechnerisch zu identifizieren und zu bestimmen, wie sich die Menge des PG-Einbaus zu diesen Landmarken verhält. H. pylori Zellen haben im Durchschnitt einen Durchmesser von 0,45 µm und eine Länge von 2,5 µm mit einem Helixdurchmesser von 0,3 µm (Taylor et al., 2020). Angesichts dieser Dimensionen und der Auflösungsgrenzen der Lichtmikroskopie haben wir uns auf superauflösende Mikroskopie, insbesondere 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), verlassen, um subzelluläre Details des PG-Einbaus aufzuklären. SIM ist für die Verwendung einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen geeignet, funktioniert jedoch am besten, wenn die Markierung hell und fotostabil ist. Da die SIM-Bildgebung die Aufnahme mehrerer Bilder pro Z-Scheibe erfordert und Proben leicht driften können, ist es außerdem ratsam, ein möglichst helles Signal anzustreben, um die Bildgebungszeit zu verkürzen und eine optimale Bildqualität zu gewährleisten. Um mit einem kurzen Markierungspuls ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, markierten wir Zellen mit einer viel höheren Konzentration an MurNAc-alk als zuvor für die Markierung ganzer Zellen verwendet wurde.

    Es gab mehrere Anforderungen an die Probenvorbereitung, die die Schaffung eines Werkzeugs zum sorgfältigen Anbringen von fixierten Zellen an sauberen Deckgläsern erforderten. Wir mussten die 3D-Geometrie für die subzelluläre Analyse beibehalten, daher war es wichtig, das Austrocknen der Zellen bei jedem Schritt während der Probenvorbereitung zu verhindern. Da SIM am besten für die Bildgebung in der Nähe des Deckglases geeignet ist und wir Hunderte von einzelnen, gut getrennten Zellen pro Objektträger abbilden und analysieren mussten, mussten wir auch reproduzierbar eine optimale Zelldichte auf dem Deckglas erzielen. Inspiriert von Zytozentrifugen verwendeten wir leicht zugängliche Materialien, um eine versiegelte Kammer über dem Deckglas zu erzeugen, die in einer Ausschwing-Tischzentrifuge mit 96-Well-Platten zentrifugiert werden konnte. Das Aufbringen von fixierten Zellen auf dem Deckglas ermöglicht es uns auch, das Startkulturvolumen und damit die erforderliche Sondenmenge zu minimieren. Somit können wir aus einer verdünnten Zellsuspension eine akzeptable Zelldichte auf dem Deckglas erreichen. Außerdem kann die Anzahl der erforderlichen Zentrifugationen reduziert werden, da die Markierungsschritte nach der Fixierung und Permeabilisierung auf dem Deckglas statt in Suspension durchgeführt werden können.

    Diese Protokolle können als Ausgangspunkt für die Kurzpulsmarkierung von PG in anderen Organismen verwendet werden, um eine neue PG-Synthese abzubilden. Basic Protocol 1 skizziert die Synthese von hochreinem MurNAc-alk. Basic Protocol 2 demonstriert ein Verfahren zum Nachweis von Muropeptiden mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und wie dieses verwendet werden kann, um den Einbau von MurNAc-alk in das PG nachzuweisen. Support Protocol 1 wird verwendet, um zu wachsen H. pylori Zellen in Flüssigkultur. Support Protocol 2 wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Stamm exogenes MurNAc verwenden kann. Support Protocol 3 wird verwendet, um festzustellen, ob SDS vollständig aus der PG-Präparation entfernt wurde, bevor mit dem nächsten Schritt von Basic Protocol 2 fortgefahren wird zur Bildgebung zuverlässig auf einem Deckglas befestigt. Basic Protocol 3 wird verwendet, um eine kurze Pulsmarkierung der Zellwandsynthese mit MurNAc-alk oder D-Ala-alk durchzuführen und hochwertige Objektträger dieser Zellen herzustellen. Basic Protocol 4 weist den Benutzer an, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung am Mikroskop DeltaVision OMX mit den Objektträgern aus Basic Protocol 3 durchgeführt wird.

    1: ALTERNATIVE SYNTHESE VON MURNAC-ALK (DIREKTKUPPLUNG)

    MurNAc-alk (Abb. 1C) ist eine der bequemsten und relevantesten Verbindungen, die für Markierungstechniken für bakterielle Peptidoglycan (PG) verwendet werden (DeMeester et al., 2019 Zhang, Wang, Yang, & Hang, 2020).

    Als Muraminsäure-Analogon kann diese Sonde effektiv (metabolisch) in die bakterielle Zellwand einer Vielzahl von Mikroorganismen eingebaut werden. Darüber hinaus ermöglicht seine zentrale Alkineinheit eine empfindliche Fluoreszenzvisualisierung der markierten Strukturen durch eine einfache und zugängliche Klickreaktion.

    Daher haben wir zusätzlich zu dem zuvor veröffentlichten Syntheseprotokoll (DeMeester et al., 2019 ) einen zweiten Reaktionsweg entwickelt, um diese essentielle Sonde zu erzeugen (Abb. 1). Diese alternative Methode, die ebenfalls Muraminsäure (Abb. 1A) als Substrat verwendet, besteht aus einer Kupplungsreaktion mit der freien Säure 4-Pentinsäure (Abb. 1B), katalysiert durch 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimidhydrochlorid (EDC). Außerdem sind basische Bedingungen und ein polares binäres Lösungsmittelsystem erforderlich. Am Ende dieses Protokolls hat der Benutzer gereinigtes MurNAc-alk erzeugt, das verwendet werden kann, um PG in zu markieren H. pylori und andere Bakterien.

    Materialien

    • Muraminsäure (Abb. 1A Präparation: DeMeester et al., 2019, Liang et al., 2017 oder Brown et al., 2021 oder bezogen von MilliporeSigma, Kat.-Nr. M2503)
    • 4-Pentinsäure (Abb. 1B MilliporeSigma, Kat.-Nr. 232211)
    • 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC Chem-Impex International, Kat.-Nr. 00050)
    • Natriumcarbonat (Na2CO3 Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. Nein. S263-500)
    • Tetrahydrofuran (THF MilliporeSigma, Kat.-Nr. 186562)
    • Entionisiertes H2O (dH2Ö)
    • Dichlormethan (DCM Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. D37-20)
    • Ethylacetat (EtOAc Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 124-20)
    • Methanol (MeOH Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. A412-20)
    • P-Anisaldehyd-Färbung (siehe Rezept)
    • Celite (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. C212-500)
    • Kieselgel, Standardqualität, 60 Å, 40-63 µm (Sorbtech, Kat.-Nr. 30930M)
    • 10-ml-Rundkolben
    • Rotationsverdampfer
    • 5-ml-Sammelröhrchen
    • Chromatographiesäule aus Glas (oder Pipette mit Wattebausch)
    • Rohrständer
    • DC-Platten
    • TLC-Spotting-Kapillarröhrchen
    • DC-Kammer
    • Pinzette

    Mischung A vorbereiten

    1. Zugabe von 4-Pentinsäure [Abb. 1B 43,2 mg, 0,4404 mmol, 1,1 Äquivalente (Äq.)] in einen 10-ml-Rundkolben.

    2. EDC (92,8 mg, 0,4841 mmol, 1,2 Äq.) zugeben.

    3. Zum Schluss 2 ml THF zu beiden Feststoffen zugeben.

    4. Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden.

    Diese Mischung erscheint entweder als trübe Lösung oder als cremefarbene Suspension.

    Mischung B vorbereiten

    5. Muraminsäure (Abb. 1A 100 mg, 0,3981 mmol) in einen 10-ml-Rundkolben geben.

    6.Na . hinzufügen2CO3 (127,2 mg, 1,201 mmol, 3 Äq.).

    7. Diese Feststoffe in 2 ml dH . auflösen2Ö.

    8. Rührreaktion bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden.

    Aufgrund der hohen Löslichkeit dieser Verbindungen in Wasser ist Mischung B immer eine gelbliche Lösung.

    Kupplungsreaktion durchführen

    9. Füge Mischung B (wässrige basische Muraminsäurelösung) zu Mischung A (aktivierte 4-Pentinsäure) hinzu. 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren.

    10. Überwachen Sie die Reaktion durch LC/MS (ESI pos [M + 23] + = 354) und durch TLC (4:5 MeOH/EtOAc, RF = 0,39, Erkennung durch P-Anisaldehyd-Färbung).

    Typischerweise wird die Reaktion nach 1-2 Stunden aufgearbeitet, um einen wahrscheinlichen Produktabbau zu vermeiden.

    Nach Beendigung verdampfe THF unter reduziertem Druck ohne Erhitzen unter Verwendung eines Rotationsverdampfers.

    11. Wasche die resultierende wässrige Phase dreimal mit DCM (3 × 1 ml).

    Dieser Schritt soll die verbleibende 4-Pentinsäure und das EDC aus dem Reaktionsrohstoff extrahieren.

    12. Rohöl lyophilisieren, um einen cremefarbenen Feststoff zu erhalten.

    1. Verwenden Sie eine Trockenladetechnik. Lösen Sie Rohöl in MeOH auf und verwenden Sie das vierfache Gewicht von Celite im Vergleich zum Gewicht von Rohöl.
    2. Verwenden Sie eine Menge Kieselgel, die mindestens das 30-fache des Rohmaterialgewichts beträgt. (In Bezug auf das Volumen, Kieselsäuremenge in ml = Masse des Rohprodukts × 60 ml.)
    3. Wenden Sie einen langsamen Gradienten von 2:8 MeOH/EtOAc bis 4:5 MeOH/EtOAc an.

    Sammeln Sie das Produkt basierend auf der DC-Kontrolle (4:5 MeOH/EtOAc, RF = 0,39, erkannt von P-Anisaldehyd-Färbung).

    Die überschüssige 4-Pentinsäure eluiert zuerst (RF = 0.8) und dann das Produkt (RF = 0.39).

    14. Gesammelte Fraktionen lyophilisieren, um einen weißen Feststoff zu erhalten (46,3 mg, Ausbeute = 35%, siehe NMR-Spektren, Abb. 2).

    1 H-NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,34 (d, J = 3,0 Hz, H1α), 4,45 (d, J = 7,81 Hz, H1β), 4,36-4,32 (m, CH-Propion), 3,76-3,74 (dd, J = 2,44 Hz, H6a), 3,69-3,57 (m, H6b, H4, H3), 3,53-3,51 (dd, H2), 3,42-3,36 (m, H5), 2,42-2,38 (m, Methylen neben Amid und Methylen neben Alkin), 2,15- 2,13 (m, CH-Alkin), 1,30-1,26 (bd, CH3 Propionsäure). Verhältnis α/β = 3. 13 C-NMR (151 MHz, CD3OD) 173,08 (Carbonyl), 97,09 (C1β), 90,38 (C1α), 82,35 (C quaternäres α), 82,19 (C quaternäres β), 77,54 (CH propionisch), 77,02 (C3), 72,12 (C4), 71,25 ( C5), 68,78 (CH-Alkin β), 68,69 (CH-Alkin α), 61,07 (C6), 56,59 (C2β), 54,53 (C2α), 34,74 (CH2 benachbart zum Amid), 18,71 (CH3 Propionsäure β), 18.62 (CH3 Propionsäure α), 14.18 (CH2 neben dem Alkin α), 14.11 (CH2 neben dem Alkin β).

    Wir stellen fest, dass die Ausbeuten durch Verwendung größerer Mengen an Ausgangsmaterial deutlich verbessert werden können. Bei Verwendung von 0,5 g Muraminsäure erreicht die Ausbeute 40% ± 5%. Da ~30% der anfänglichen Menge an Muraminsäure zur Verwendung in einer zweiten Reaktion zurückgewonnen werden können, wird die Gesamtausbeute noch höher sein.

    1: WACHSEN HELICOBACTER PYLORI IN DER FLÜSSIGKULTUR

    Dieses Protokoll weist den Benutzer an, wie er zuverlässig eine robuste Kultur von H. pylori ausgehend von einem gefrorenen Vorrat. Die mitgelieferten Berechnungen sind hilfreich für die Planung von Experimenten, da der Benutzer Zellen animpfen kann, um am nächsten Tag zu einer gewünschten Zeit fertig zu sein. Der Benutzer muss wahrscheinlich mehrere Iterationen durchlaufen, um die genaue Verdopplungszeit der unter diesen Bedingungen angebauten Sorte zu bestimmen.

    Materialien

    • Helicobacter pylori, −80°C Gefriergut (Stamm G27, oder alternativ J99, ATCC ® 700824 ™ )
    • Pferdeblutplatten (siehe Rezept)
    • BB10 (siehe Rezept)
    • Sterile Holzstäbchen
    • Impfösen
    • 50-ml-Kulturkolben mit Schikanen mit Deckel
    • Trigas-Inkubator mit Schüttler (Sanyo O2/CO2 Inkubator 10% O2, 10% CO2, N2 ausbalancieren)
    • Spektrophotometer
    • Küvetten

    1. Entfernen Sie eine kleine Menge H. pylori Gefrierbrühe mit einem sterilen Holzstäbchen. Eine Pferdeblut-Agarplatte aus dem Gefriervorrat beimpfen. Sobald die Flüssigkeit in die Platte eingedrungen ist, drehen Sie die Platte um und legen Sie sie in einen Trigas-Inkubator, der auf 10 % CO . eingestellt ist2, 10% O2, 37ºC für 24-72 Stunden, bis Wachstum auftritt. Wenn Sie nicht bereit sind, eine Flüssigkultur für die Markierung zu beginnen, führen Sie täglich eine Passagekultur auf Pferdeblutplatten durch.

    2. Um eine Flüssigkultur von zu starten H. pylori, am Morgen des Tages vor der Verwendung der Zellen ein kleines Stück Kulturwachstum mit niedriger Dichte von der Pferdeblutplatte entnehmen und damit 10 ml BB10 in einer kleinen Kulturflasche mit Schikanen beimpfen. Kultivieren Sie die Kultur im Trigas-Inkubator unter Schütteln bei 150-200 U/min.

    3. Am Abend des Vortages der Zellen 1 ml BB10 in eine Küvette und 1 ml Flüssigkultur in eine andere pipettieren. Leeren Sie das Spektrophotometer mit der Küvette von BB10 und lesen Sie dann die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Flüssigkultur.

    Wenn OD600 >1,5, Probe 1:10 verdünnen und erneut ablesen, um sicherzustellen, dass Sie sich innerhalb des linearen Bereichs des Spektralfotometers befinden.

    4. Berechnen Sie das Inokulum in µl:

    • V = Kulturvolumen über Nacht (10 ml)
    • ODEtikett = Ziel-OD600/ml Markierungskultur (0,4 OD600/ml)
    • ODImpfmittel = gemessener OD600/ml Flüssigkultur zum Animpfen (Ziel 0,1-1,0)
    • T = gewünschte Anzahl von Stunden zwischen dem Animpfen der Kultur und dem Bereithalten der Kultur für die Markierung (Ziel 12-18 Stunden)
    • DT = Verdopplungszeit in Stunden (∼2,1 Stunden für LSH100 unter diesen Bedingungen werden Ihre Stamm- und Wachstumsbedingungen wahrscheinlich variieren).

    5. Inokulieren Sie 10 ml BB10 in einem kleinen Kulturkolben mit Schikanen mit dem in Schritt 4 berechneten Volumen der Impfkultur. Wachsen Sie über Nacht im Trigas-Inkubator unter Schütteln bei 150-200 U/min.

    Beispieldaten

    Nach erfolgreichem Befolgen dieses Protokolls sollte der Benutzer eine Kultur von ausschließlich stäbchenförmigen (meist helikalen Stäbchen, obwohl die morphologischen Parameter von Zelle zu Zelle variieren) haben. H. pylori Zellen ohne kokkoide Zellen (siehe Abb. 3). Einige schwimmende Zellen sollten beobachtet werden, wenn frische Zellen in Suspension mit Phasenkontrastmikroskopie (mindestens 400-fache Vergrößerung) betrachtet werden. Es dürfen keine kontaminierenden Organismen vorhanden sein. Die Kultur sollte ungefähr zum berechneten Zeitpunkt die Zieldichte erreichen. Große Abweichungen weisen auf ein Problem mit den Kultur- oder Wachstumsbedingungen hin und das Problem bzw. die Probleme sollten diagnostiziert werden.

    2: FOSFOMYCIN-RETTUNGSASSAY

    Dieses Protokoll wird verwendet, um zu verifizieren, dass ein interessierender Stamm in der Lage ist, exogen bereitgestelltes MurNAc zu verwenden. In diesem Protokoll wird der Benutzer wachsen H. pylori in Flüssigkultur unter mehreren verschiedenen Bedingungen, um zu bestimmen, ob die Zugabe von MurNAc zu mit Fosfomycin behandelten Zellen hilft, das Wachstum zu retten. Reihenverdünnungen jeder Kultur werden ausplattiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach 12 Stunden zu bestimmen. Eine teilweise Wachstumsrettung weist darauf hin, dass der Stamm für die Markierung mit MurNAc-alk geeignet sein sollte (detailliert in Basic Protocol 3).

    Materialien

    • Flüssigkultur von Wildtyp Helicobacter pylori (aus Support-Protokoll 1)
    • Flüssigkultur von Helicobacter pylori Expression von AmgK und MurU (aus Support Protocol 1)
    • BB10 (siehe Rezept)
    • MurNAc (MilliporeSigma, Kat.-Nr. A3007), 200 mg/ml in bidestilliertem Wasser (ddH2Ö)
    • Fosfomycin (MilliporeSigma, Kat.-Nr. 34089), 7,5 mg/ml in ddH2Ö
    • 70% Ethanol
    • 50-ml-Kulturkolben mit Schikanen
    • Trigas-Inkubator mit Schüttler (Sanyo O2/CO2 Inkubator 10% O2, 10% CO2, N2 ausbalancieren)
    • Spektrophotometer
    • Küvetten
    • Sterile, unbehandelte 96-Well-Platten mit flachem Boden
    • 5-ml-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden
    • Dan Kar Corp 48 Zinken-Frogger (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. NC9843368)
    • Steriler Reagenzienbehälter
    • Mehrkanalpipetten

    1. Bereiten Sie, wie in Begleitprotokoll 1 beschrieben, eine Flüssigkultur von H. pylori 0,35-0,50 OD . zu erreichen600/ml bis zum Morgen, an dem der Rescue-Assay durchgeführt werden soll.

    2. Kontrollieren Sie die Kulturdichte mit dem Spektralfotometer. Wenn die Kultur zwischen 0,35-0,5 OD . liegt600/ml, fahren Sie mit der Beschriftung fort. Wenn OD600 >0,5, Kultur verdünnen und für mindestens eine Verdoppelung wachsen lassen, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in der frühen/mittleren logarithmischen Phase befinden.

    3. Legen Sie den Frogger mit der Spitze nach unten in einen kleinen offenen Behälter mit 70 % Ethanol.

    4. Machen Sie 1 ml jeder Kultur, verdünnt auf 0,002 OD600/ml in BB10.

    5. Beschriften Sie acht 5-ml-Polystyrol-Röhrchen mit Rundboden 1-8. 200 µl verdünnte Wildtypkultur in die Röhrchen 1-4 geben. 200 µl verdünnte AmgK MurU-Kultur in die Röhrchen 5-8 geben.

    Siehe Abbildung 4 für eine schematische Anleitung zum experimentellen Aufbau in diesem Protokoll.

    6. 1,33 µl 7,5 mg/ml Fosfomycin (Endkonzentration = 50 µg/ml) in die Röhrchen 2, 4, 6 und 8 geben.

    7. 4 μl 200 mg/ml MurNAc (Endkonzentration = 4 mg/ml) in die Röhrchen 3, 4, 7 und 8 geben.

    8. Bewegen Sie jedes Röhrchen vorsichtig zehnmal, um es zu mischen.

    9. Nehmen Sie den Frogger aus dem Ethanol, schütteln Sie überschüssiges Ethanol vorsichtig ab und führen Sie den Frogger durch eine Bunsenbrennerflamme, um sich zu entzünden und verbleibendes Ethanol zu entfernen. Nachdem die Flammen erloschen sind, stellen Sie den Frogger vorsichtig auf eine offene Blutplatte, um schwache Vertiefungen in einem Gitter auf der Platte zu markieren. Es ist kein zusätzlicher Druck über das Gewicht des Frggers hinaus erforderlich.

    ACHTUNG: Es ist äußerst wichtig darauf zu achten, dass kein brennendes Ethanol aus dem Fläschchen tropft und dass der offene Behälter mit Ethanol von den Flammen ferngehalten wird. Stellen Sie sicher, dass sich keine losen Papiere oder andere brennbare Materialien über, unter oder in der Nähe der Flamme befinden. Die Flamme des Frggers kann sich vertikal über mehrere Zoll erstrecken. Warten Sie weitere 5 s, nachdem Sie glauben, dass das gesamte Ethanol abgebrannt ist, um sicherzustellen, dass die Verbrennung tatsächlich abgeschlossen ist. Stellen Sie vor dem Anzünden des Ethanols sicher, dass Sie einen Plan bereithalten, falls das Ethanolgefäß versehentlich in Brand gesteckt wird.

    10. Machen Sie zunächst eine zweifache Verdünnung in Reihe A, Spalten 1-8 in einer 96-Well-Platte. Dazu 20 µl BB10 in die Spalten 1-8 der Reihe A pipettieren. Anschließend 20 µl jeder Kultur in die entsprechend nummerierte Vertiefung in Reihe A pipettieren und zum Mischen zehnmal auf- und abpipettieren.

    11. Um eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen in der 96-Well-Platte herzustellen, geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 180 µl BB10 in die Reihen B-F, Spalten 1-8. Zum Mischen mit einer Mehrkanalpipette zehnmal in Spalte A auf- und abpipettieren, dann 20 µl jeder zweifachen Verdünnung in Reihe A in die entsprechend nummerierte Spalte in Reihe B überführen. Mit einer Mehrkanalpipette auf 20 µl aufpipettieren und zehn Mal in Reihe B zum Mischen, dann 20 µl von Reihe B nach Reihe C übertragen. Zum Mischen zehn Mal auf und ab pipettieren, dann die Spitzen auswerfen. Mit frischen Spitzen Reihe C weitere zehn Mal mischen, dann 20 µl von Reihe C auf Reihe D übertragen. Für jede Reihe wiederholen und am Ende 20 µl in Reihe F zugeben und mischen.

    Es ist entscheidend, die Pipettenspitzen zwischen den Reihen der Zehnfach-Verdünnungsserie zu wechseln. H. pylori haftet leicht an Pipettenspitzen, so dass die Verwendung derselben Spitzen für mehrere Verdünnungsschritte nicht zu einer zehnfachen Verdünnung führt.

    12. Verwenden Sie die Einkerbungen auf der Blutplatte, die vom Frogger als Anhaltspunkt gemacht wurden, 2 μl jeder Verdünnung so auf die Platte auftragen, dass sich die Verdünnungen von Kultur 1 in der oberen Reihe befinden, die konzentrierteste Verdünnung links und die am wenigsten konzentrierte Verdünnung rechts. Wiederholen Sie in den Reihen 2-8 für die Kulturen 2-8.

    13. Lassen Sie alle Flecken vollständig trocknen und legen Sie dann die Platte umgedreht in den Trigas-Inkubator, um 3-5 Tage lang wachsen zu lassen, bis deutliche Kolonien bei den niedrigeren Verdünnungen sichtbar sind.

    14. Röhrchen unter Schütteln im Trigas-Inkubator 12 Stunden lang inkubieren.

    16. Sobald deutliche Kolonien sichtbar sind, fotografieren Sie die Platte, um die Ergebnisse aufzuzeichnen. Siehe Beispieldaten in Abbildung 5.

    2: MASSENSPEKTROMETRIE (MS) ANALYSE ZUR BESTIMMUNG DER INkorporation von MURNAC-ALK IN DAS PEPTIDOGLYCAN OF H. PYLORI

    Dieses Protokoll weist den Benutzer an, wie die PG-Untereinheiten (Muropeptide) zu bestimmen sind, die von MurNAc-alk markiert sind. Da MurNAc-alk in PG-Vorläufer im Zytoplasma eingebaut wird, ist das anfänglich markierte Muropeptid im PG das Pentapeptid, aber andere markierte Spezies können durch Modifikation und/oder Vernetzung dieser anfänglich markierten Pentapeptide erzeugt werden. H. pylori Mit MurNAc-alk markierte Zellwände werden gereinigt, verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Dieses Protokoll bietet sowohl ein Mittel zum Bestimmen, welche Muropeptide innerhalb der Zelle über einen bestimmten Markierungszeitraum markiert sind, als auch eine eindeutige Validierung, dass MurNAc-alk das PG erfolgreich markiert.

    Materialien

    • Startflüssigkeit H. pylori Kultur bekannter Dichte (siehe Schritte 1-3 von Support Protocol 1)
    • BB10 (siehe Rezept)
    • MurNAc-alk (aus Basic Protocol 1), 200 mg/ml Vorratslösung in ddH2O oder D -Ala-alk (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. AC441221000), 100 mM Vorrat in ddH2Ö
    • PBS
    • 8% Lösung von HPLC Elektrophorese-grade SDS (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. BP166-500) in ddH2Ö
    • 0,5% (w/v) Methylenblau (MilliporeSigma, Kat.-Nr. M9140)
    • 0,2 % (w/v) Natriumazid (MilliporeSigma, Kat.-Nr. 71289)
    • 0,7 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2 (siehe Rezept)
    • 10 mM Tris·Cl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (siehe Rezept)
    • 3,2 M Imidazol (siehe Rezept)
    • 10 mg/ml α-Amylase in 10 mM Tris·Cl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (siehe Rezept)
    • 10 mg/ml Pronase E (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 50-146-956) in 10 mM Tris·Cl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (siehe Rezeptur)
    • 10 % Ameisensäure (v/v), LC-MS-Qualität (MilliporeSigma, Kat.-Nr. 5.33002)
    • Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure (VWR, Kat.-Nr. 85960.320)
    • Acetonitril mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure (VWR, Kat.-Nr. 84866.320)
    • 50 mM Ammoniumformiat-Puffer, pH 4,8 (siehe Rezeptur)
    • 0,5 mg/ml Cellosyl (freundliche Schenkung von Hoechst, Frankfurt am Main, Deutschland) in 10 mM Ammoniumformiat-Puffer, pH 4,8 (siehe Rezeptur)
    • 500-ml-Kulturkolben mit Schikanen mit Deckel
    • Trigas-Inkubator mit Schüttler (Sanyo O2/CO2 Inkubator 10% O2, 10% CO2, N2 ausbalancieren)
    • Spektrophotometer
    • Tischzentrifuge
    • Zwei Kristallisationsschalen (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 50-121-5014)
    • 50-ml-Kolben
    • Aluminiumfolie
    • Zwei rundummantelte Bleiflaschenringe
    • Konische 50-ml-Röhrchen
    • Glasstäbe
    • Vortexmixer
    • Zwei P1000 Pipetten
    • Konische 15-ml-Fläschchen
    • Ultrazentrifuge
    • Ultrazentrifugenröhrchen
    • 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
    • Speedvac Vakuumkonzentrator (Thermo Fisher Scientific)
    • Thermomixer (Eppendorf)
    • HPLC-System (NanoACQUITY UPLC, Waters)
    • HPLC-Probenschleife, 2 µl (Waters, Kat.-Nr. 430001264)
    • ACE Ultracore 2.5 super C18, 0,5-×150-mm-Microbore-Säule (VWR, Kat.-Nr. CORE-25A-15005)
    • Impact II QTOF LC-MS/MS-System (Bruker)
    • Trockenheizblock (Dri-Block, Techne, Cole-Parmer)
    • Compass DataAnalysis™-Software (Bruker)
    • ChemDraw™-Softwarepaket (Perkin Elmer)

    1. Aufschlussprotokoll: Inokulum der Flüssigkeit berechnen H. pylori Kultur in ml unter Verwendung der folgenden Gleichung:

    • V = Kulturvolumen über Nacht (330 ml)
    • ODEtikett = Ziel-OD600/ml Markierungskultur (1,0 OD600/ml)
    • ODImpfmittel = gemessener OD600/ml Flüssigkultur zum Animpfen (Ziel 0,1-1,0)
    • Oder einfacher,
    • (5.16)/(ODImpfmittel)

    2. Geben Sie 330 ml BB10 in eine sterile 500-ml-Flasche. Füge das berechnete Volumen der Flüssigkultur hinzu H. pylori berechnet (in ml) aus Schritt 1. 20,625 mg MurNAc-alk (103,1 µl der 200 mg/ml Stammlösung 62,5 µg/ml Endkonzentration) oder 33 mg D-Ala-alk (2,92 ml der 100 mM Stammlösung 100 µg .) zugeben /ml Endkonzentration). Mischen und in drei 500-ml-Kulturkolben mit Schikanen aliquotieren.

    Beachten Sie, dass in früheren Zellformpublikationen H. pylori-Zellen für PG-Präparate eher von Agarplatten als von Flüssigkulturen geerntet wurden. Eine Folge der Analyse von PG aus auf Platten gezüchteten Zellen ist, dass eine größere Verteilung von Wachstumsphasen in der Population vorhanden ist, einschließlich eines bemerkenswerten Anteils von Zellen in der Nähe oder in der stationären Phase. Ältere Kulturen von H. pylori weisen eine höhere Dipeptidzusammensetzung auf (Costa et al., 1999), so dass die aus Flüssigkulturen erhaltenen PG-Zusammensetzungsergebnisse am besten mit neueren Veröffentlichungen verglichen werden, die auch flüssige H. pylori-Kulturen verwendet haben.

    3. Zur Herstellung der negativen Kontrollkultur 330 ml BB10 und das berechnete Volumen der Flüssigkultur hinzufügen H. pylori berechnet (in ml) von Schritt 1 bis zu einer zweiten sterilen 500-ml-Flasche. Mischen und in drei 500-ml-Kulturkolben mit Schikanen aliquotieren.

    4. Überprüfen Sie die OD der Kultur. Sobald Kulturen 1 OD . erreichen600/ml, Flaschen auf Eis stellen.

    Hier wird eine höhere Kulturdichte als in Basic Protocol 3 verwendet, um einen Kompromiss zwischen der Wachstumsphase und der Menge der pro ml Kultur geernteten Zellen und damit der benötigten Menge an MurNAc-alk zu finden.

    5. Geben Sie 6 ml einer 8 %igen SDS-Lösung in einen 50-ml-Kolben, fügen Sie einen kleinen Rührstab hinzu und bedecken Sie die Oberseite des Kolbens mit Aluminiumfolie. Stechen Sie ein kleines Loch in die Oberseite der Folie (Abb. 6A). Eine Kristallisationsschale auf die Heizplatte stellen, Kolben in die Kristallisationsschale stellen und den Kolben mit einem abgedeckten Blei-Kolbenring beschweren. Geben Sie Wasser in die Kristallisationsschale bis etwa zur Mitte des Kulturkolbens (Abb. 6B). Fügen Sie Aluminiumfolie mit einem Loch in der Mitte über der Oberseite der Kristallisationsschale hinzu, um das Entweichen von Dampf zu minimieren. Die Oberseite des Kolbens sollte über die Aluminiumfolie hinausragen (Abb. 6C). Schalten Sie die Kochplatte und den Rührer ein und beginnen Sie, das Wasser zum Kochen zu bringen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine zweite Einrichtung zum Lysieren des zweiten Zellensatzes vorzunehmen.

    Achten Sie darauf, den oberen Teil des Kolbens sehr fest mit der Aluminiumfolie zu verschließen, um die Verdunstung zu minimieren.

    6. Beginnen Sie mit der Zellernte, indem Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen pro Probe (insgesamt vier) füllen und in einer Tischzentrifuge bei 2.400 × zentrifugieren g bei 4°C für 10 min. Überstand abgießen und Zentrifugation wiederholen, bis das gesamte Kulturvolumen für die markierte Kultur und die experimentelle Kontrolle verarbeitet wurde.

    7. Einen Glasstab für die markierten Zellen und einen Glasstab für die Negativkontrolle beiseite legen. Mit dem entsprechenden Stab jedes Pellet im Restmedium resuspendieren. Zum Resuspendieren halten Sie das Ende des Stabes vorsichtig mit Daumen, Zeiger und optional Mittelfinger einer Hand und halten mit der anderen Hand das konische 50-ml-Röhrchen an einem laufenden Vortex-Mischer. Bewegen Sie den Stab im Boden des Röhrchens auf und ab und stellen Sie die Geschwindigkeit des Vortex-Mischers ein, bis der Stab leicht um die Seiten des Röhrchens herumwirbelt. Bewegen Sie den Glasstab mit dem wirbelnden Glasstab im Röhrchen auf und ab, um das Pellet so zu verteilen, dass keine einzelnen Zellbrocken zurückbleiben.

    Dies kann etwas Übung erfordern, um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie man die Rute am besten hält. Dieses Verfahren wird auch verwendet, um Sacculi-Pellets nach der Ultrazentrifugation in späteren Schritten zu resuspendieren. Bei Escherichia coli-Zellen können geerntete Zellpellets durch Auf- und Abpipettieren leicht resuspendiert werden. H. pylori-Zellen neigen jedoch dazu, sowohl aneinander zu verklumpen als auch an Pipettenspitzen zu kleben. Daher ist das Glasstab-Resuspensionsverfahren viel einfacher.

    8. Beginnen Sie mit der Konsolidierung markierter Zellpellets in einem Röhrchen und der Negativkontroll-Zellpellets in einem Röhrchen. Verwenden Sie zwei P1000-Pipetten, eine zum Pipettieren von PBS und eine zum Übertragen von Zellaufschlämmungen. Übertragen Sie die Zellsuspension von einem konischen Röhrchen in das andere. Anschließend 1 ml PBS mit der PBS-Pipette in das entleerte Fläschchen pipettieren und die Wände des Fläschchens mit der Zellsuspensionspipette waschen. Wiederholen, bis das Volumen der gesammelten Zellsuspension 6 ml erreicht.

    9. Bewahren Sie die Zellsuspension auf Eis auf. Mit einer Pasteurpipette langsam Zellsuspension in das kochende SDS geben. Nachdem die gesamte Zellkultur in den Kolben mit SDS pipettiert wurde, lassen Sie die Zellen im kochenden SDS sitzen und rühren Sie 30 min.

    Nehmen Sie jeweils nur 1 ml Suspension auf, damit der Rest der Kultur kalt bleibt. Stecken Sie das Ende der Pasteurpipette in das kleine Loch in der Folie oben auf der SDS-Flasche.Fügen Sie die Suspension in winzigen kräftigen Spritzern (mehrere Spritzer pro ml) hinzu, so dass die Zellsuspension schnell in der SDS-Lösung dispergiert wird (jeder Spritzer wird innerhalb weniger Sekunden dispergiert). Warten Sie, bis die vorherige Zugabe vollständig dispergiert ist, bevor Sie weitere Zellen hinzufügen. Am Ende dieses Vorgangs sollte die Flüssigkeit eine goldene Farbe haben. Beachten Sie, dass die Färbung je nach geernteter Bakterienart variiert, aber die endgültige Suspension sollte unabhängig von der Farbe klar sein. Wenn die SDS-Lösung zu sprudeln beginnt, fügen Sie einige Tropfen kaltes ddH . hinzu2O, die Hitze und/oder Geschwindigkeit des Rührstabs verringern.

    10. Wiederholen Sie Schritt 9 für den zweiten Zellensatz mit der zweiten SDS-Flasche.

    11. Nachdem jeder Kolben mit dem Kochen fertig ist, entfernen Sie die Kolben und kühlen Sie auf Raumtemperatur ab. Jedes in ein konisches 15-ml-Fläschchen überführen und bei 4 °C lagern.

    Diese Proben können bei Bedarf monatelang bei 4 °C ohne Abbau der Probe gelagert werden. Die Sacculi setzen sich schließlich ab und können als sehr schwaches klares Pellet sichtbar sein.

    12. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Satz Zellen mit dem zweiten SDS-Fläschchen.

    13. Platziere eine Flasche ddH2O in einem 60°C Wasserbad.

    14. Stellen Sie die konischen Fläschchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad von 80 °C, um das SDS wieder aufzulösen. Dann auf Raumtemperatur abkühlen.

    15. Zum Mischen jeder Zellsuspension pipettieren, dann jede in ein offenes Ultrazentrifugenröhrchen überführen. Balancieren Sie die beiden Röhrchen bis auf 0,01 g voneinander ab und füllen Sie die Röhrchen ausreichend, um ein Zusammenfallen zu verhindern (innerhalb von 2-3 mm vom oberen Rand).

    Fast die gesamte, wenn nicht die gesamte Zellsuspension sollte in das Ultrazentrifugenröhrchen passen. Wenn etwas übrig bleibt, kann es entsorgt werden. Röhren können mit ddH . aufgefüllt werden2O wenn mehr Volumen benötigt wird. Beachten Sie, dass wir eine größere Ultrazentrifuge (Röhrchenvolumen 12 ml) für die ersten Waschgänge und eine kleinere Ultrazentrifuge (Röhrchenvolumen ∼3 ml) für Waschgänge nach dem Verdau mit α-Amylase und Pronase E verwenden, da die Pellets danach deutlich schrumpfen Schritt. Es ist akzeptabel, alle Waschvorgänge in den kleineren Röhrchen durchzuführen, dies erhöht jedoch die Anzahl der durchzuführenden Waschvorgänge.

    16. Ultrazentrifuge 60 min bei 28 °C bei 133.907 × g.

    Wir verwenden eine Beckman-Coulter Optima L-90K Ultrazentrifuge mit einem SW41 Rotor. Zentrifugationsschritte sollten warm durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass SDS nicht ausfällt. Größe und Aussehen des Pellets variieren je nach SDS-Konzentration. Die hohe SDS-Konzentration führt im Allgemeinen zu einem viel kleineren Pellet, das nach dem folgenden Waschen größer ist. Sei nicht beunruhigt. Bevor Sie eine Ultrazentrifuge zum ersten Mal verwenden, lassen Sie sich außerdem schulen, um sicherzustellen, dass Sie dieses Gerät richtig verwenden.

    17. Nach der ersten Ultrazentrifugation den Überstand abpipettieren und eine kleine Menge über dem Pellet belassen.

    PG-Pellets von H. pylori sind mit 4% SDS sehr locker, aber in allen nachfolgenden Waschschritten in diesem Protokoll viel robuster. E. coli-Pellets sind selbst bei 4 % SDS robust. Der Überstand sollte in ein kleines Becherglas pipettiert oder in späteren Schritten dekantiert werden, um eine Rückgewinnung zu ermöglichen, falls das Pellet während der Entfernung des Überstands zerstört wird oder verloren geht. In diesem Fall den Überstand erneut ultrazentrifugieren. Siehe Fig. 7 für Bilder, wie die Pellets aussehen sollten (Fig. 7A) nach dem Entfernen des Überstands, (Fig. 7B) während der Resuspension mit dem Glasstab und (Fig. 7C) nach dem anfänglichen Aufbrechen des Pellets.

    18. Pellet mit einem sauberen Glasstab resuspendieren. Zuerst nur mit dem Stab vortexen (den Stab beim Vortexen auf und ab bewegen wie in Schritt 7), dann langsam ein oder zwei Tropfen ddH . hinzufügen2O (60°C) und mit dem Stab wie zuvor vortexen. Fahren Sie mit der Zugabe und dem Vortexen fort, bis einige Milliliter hinzugefügt wurden und kein Wasser mehr sicher zugegeben werden kann, ohne dass die Gefahr besteht, dass Proben verloren gehen. Spülen Sie den Glasstab mit Wasser in das Ultrazentrifugenröhrchen, um Probenverlust zu vermeiden, und geben Sie es in ein beschriftetes konisches 15-ml-Fläschchen zurück. Füllen Sie den Rest des Zentrifugenröhrchens mit Wasser (bis auf 2-3 mm vom oberen Rand) und balancieren Sie auf 0,01 g. Rückkehr ddH20 bis 60°C.

    Für eine Tagespause Natriumazid (0,02 % Endkonzentration) zugeben und bei 4 °C lagern. Versiegeln Sie offene Ultrazentrifugenröhrchen mit Parafilm. Ersetzen Sie am nächsten Tag Parafilm durch Aluminiumfolie und erhitzen Sie alle Proben, die noch SDS enthalten, in einem Wasserbad von 80 ° C für 30 Minuten, um SDS wieder aufzulösen.

    19. Wiederholen Sie die Ultrazentrifugations- und Waschschritte ungefähr drei- bis viermal, um das SDS vollständig zu entfernen.

    Sie können die vollständige Entfernung von SDS früher überprüfen. Die Anzahl der erforderlichen Waschschritte hängt vom Waschvolumen ab (bestimmt durch Ultrazentrifuge und entsprechendes Röhrchen). Nachdem die erste Waschung abgeschlossen ist, kann der Überstand in allen folgenden Waschschritten aus dem Röhrchen dekantiert und nicht herauspipettiert werden.

    20. Verwenden Sie Support Protocol 3 (Hayashi-Test), um zu überprüfen, ob alle Sicherheitsdatenblätter aus der Probe entfernt wurden. Fahren Sie mit Schritt 21 fort, sobald das SDS von jeder Probe entfernt wurde.

    Wenn eine Probe vor der zweiten SDS-frei ist, verwenden Sie Wasser in einem Leerröhrchen, um die verbleibende Probe auszugleichen. Die Minimierung der Anzahl der Waschschritte für jede Probe minimiert den PG-Verlust.

    21. Sacculi in 900 &mgr;l 10 mM Tris·Cl mit 10 mM NaCl, pH 7,0, resuspendieren.

    Um eine quantitative Übertragung zu erreichen, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie zuerst das Pellet allein (mit einem Glasstab) vortexen, dann ein bis zwei Tropfen Lösung aus einer Pipettenspitze mit 900 µl Lösung hinzufügen und erneut mit dem Glasstab vortexen. Legen Sie die Pipette mit der Lösung vorsichtig beiseite. Übertragen Sie das PG-Material mit einer anderen 1-ml-Pipettenspitze in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Werfen Sie die Spitze nicht aus. Legen Sie diese andere Pipette mit der Spitze vorsichtig beiseite. Mit der Hälfte der restlichen Lösung in der Pipettenspitze den Glasstab in das Ultrazentrifugenröhrchen spülen und den Rest der Lösung in der Pipette wieder beiseite stellen. Legen Sie den Glasstab wieder in seinen Behälter. Pipettieren Sie die Lösung mit der Pipettenspitze, die zum Übertragen der Sacculi verwendet wurde, an den Seiten des Ultrazentrifugenröhrchens, um sie zu spülen. Anschließend die gesamte Flüssigkeit in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Bewahren Sie die Pipettenspitze trotzdem auf. Den Rest der Lösung in das Ultrazentrifugenröhrchen pipettieren. Spülen Sie dann mit der zum Transfer verwendeten Spitze erneut die Wände des Ultrazentrifugenröhrchens und überführen Sie diese Flüssigkeit in das Mikrozentrifugenröhrchen.

    22. 100 µl 3,2 M Imidazol, pH 7,0 und 15 µl α-Amylase (10 mg/ml) zugeben, kurz vortexen und 2 h bei 37 °C inkubieren.

    Dies baut das hochmolekulare Glykogen ab, das in den Sacculi eingeschlossen ist.

    23. 20 µl Pronase E (10 mg/ml) zugeben und 1 Stunde bei 60 °C inkubieren.

    Dadurch werden die kovalent gebundenen Lipoproteine ​​freigesetzt, die in H. pylori nicht vorhanden sein sollten, aber dieser Schritt ist für andere Bakterien notwendig und wird daher der Einheitlichkeit wegen eingeschlossen. Beachten Sie, dass Pronase E 2 Stunden bei 60 °C vorinkubiert werden muss, um ein kontaminierendes Enzym abzubauen, das mit ihm geliefert wird. Sie können Aliquots vorinkubieren und dann bei -20 °C lagern.

    24. 500 µl 8% SDS zugeben und 15 min auf dem Heizblock kochen.

    Alternativ können die Proben 30 min bei 80°C inkubiert werden. Achten Sie darauf, dass die Kappen abspringen. In diesem Stadium kann das PG-Präparat über Nacht oder am Wochenende bei 4°C ohne Zugabe von Natriumazid gelagert werden.

    25. Übertragen Sie das Material quantitativ in Ultrazentrifugenröhrchen und entfernen Sie SDS erneut durch Ultrazentrifugation, gefolgt von Waschen mit 60°C-Wasser wie oben beschrieben.

    Mit einer Tisch-Ultrazentrifuge kann der Röhrchenausgleich durchgeführt werden, indem gleiche Volumina angeschaut werden. Wir haben einen TLA 100.3 Festwinkelrotor verwendet. Achten Sie darauf, die Röhrchen nicht zu voll zu füllen, um sicherzustellen, dass die Probe nicht im Festwinkelrotor verloren geht, aber fügen Sie genügend Volumen hinzu, um die Röhrchen während der Ultrazentrifugation zu stützen (befüllen Sie so, dass die Seite der Flüssigkeit, die dem Röhrchenrand am nächsten ist, 3 -4 mm unter dem Rand).

    26. Isolierte PG-Sacculi in 100 µl 20 mM Ammoniumformiat, pH 4,8 suspendieren, 10 µg 0,5 mg/ml Cellosyl zugeben und über Nacht bei 37 °C auf einem Thermomixer (Eppendorf) bei 900 U/min inkubieren.

    Probenvorbereitung für LC-MS

    27. Nach dem Aufschluss die Proben 10 min bei 100 °C in einen trockenen Wärmeblock legen und dann bei Raumtemperatur 15 min bei 15.000 × zentrifugieren g. Überstand entnehmen und in ein sauberes Röhrchen geben.

    Bei herkömmlichen Muropeptid-Herstellungsverfahren werden die freigesetzten Muropeptide schließlich mit einem Reduktionsmittel (Natriumborhydrid/Tetramethylammoniumborhydrid) behandelt, um die Anomerisierung durch Reduktion der Aldehydgruppe der Muraminsäure (an der Zuckerkohlenstoffposition 1) zu entfernen. Die Reduktion wird verwendet, um die Bildung von Anomer-bezogenen chromatographischen Artefakten wie Peak-Aufspaltung zu verhindern (siehe Fig. 10D). Leider scheint der Reduktionsschritt (in unseren Händen) die MurNAc-alk-Markierung zu degradieren oder zu modifizieren, und so wird dieser Schritt in unserem Protokoll ausgelassen.

    28. Überstandsproben mit einem Vakuumkonzentrator trocknen.

    29. Mit MurNAc-alk markierte Aufschlüsse in 1 % Ameisensäure (20-50 µl destilliertes Wasser plus ein Zehntel Volumen 10 % Ameisensäure) unter Vortexen für 5 Minuten resuspendieren.

    Manchmal ist es schwierig, das gesamte Muropeptid-Pellet vollständig zu resuspendieren. Proben können durch Zentrifugation (nächster Schritt) geklärt werden.

    30. Zentrifugieren bei 15.000 × g für 3min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.

    Die Proben sind nun bereit für die Elektrospray-Massenspektrometrie-Analyse, wie unten beschrieben.

    LC-MS-Setup

    Bereiten Sie für die empfindliche LC-MS/MS-Analyse eine Mikrobohrungs-HPLC-Auflösungssäulenanordnung vor, die auf einem 6-Port-Auswahlventil und einer 2-µl-Injektionsschleife basiert. Jedes moderne HPLC-System, das mit einem solchen Schaltventil ausgestattet ist, kann in der im Schema in 8 gezeigten Anordnung konfiguriert werden. HPLC erfordert die Konfiguration eines 6-Port-Ventils für Injektionen mit niedrigem/Sub-Mikroliter-Volumen. Um die Trennleistung der Microbore-Säule aufrechtzuerhalten, sind Zielinjektionsvolumina von 0,1-0,2 µl erforderlich. Geeignet ist ein HPLC-System, das mit einer Injektionsschleife von 2 µl (oder weniger) ausgestattet ist. Wenn ein solches Setup nicht verfügbar ist, sollte eine Anpassung des HPLC-Gradienten und der Flussrate (unten) an eine Säule mit größerem Durchmesser und ein größeres Injektionsvolumen möglich sein.

    HPLC-Bedingungen

    Verwenden Sie für Puffer A 0,1% Ameisensäure in Wasser (VWR). Verwenden Sie für Puffer B 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (VWR).

    31. Verwenden Sie die folgenden Microbore-RP-HPLC-Bedingungen: 0 % Puffer B für 3 min, Anstieg auf 1,5 % B bei 20 min, dann auf 3,0 % B bei 35 min, Rampengradient auf 15 % B bei 45 min, dann 50 % B bei 50 min, gefolgt von 2 min bei 85 % B und schließlich 15 min Re-Äquilibrierung bei 0 % B.

    32. Stellen Sie die HPLC-Flussrate auf 20 µl/min und die Temperatur der Microbore-Säule auf 35 °C ein.

    33. Probe 1:5 (v/v) mit Puffer A verdünnen und dann 10 µl in ein Autosamplerfläschchen geben. Injizieren Sie direkt (normalerweise 0,2 µl) auf die Microbore-HPLC-Säule, die wie in Abbildung 8 gezeigt konfiguriert ist.

    Muropeptide haben ziemlich hydrophile Eigenschaften. In Gegenwart eines geringen Prozentsatzes an organischem Lösungsmittel eluieren sie in der Reihenfolge zunehmender Hydrophobie und Größe.

    MS-Bedingungen

    Massenspektrometer können ziemlich kompliziert zu programmierende Instrumente für die LC-MS/MS-Analyse sein. Für unerfahrene Benutzer empfehlen wir dringend, sich an einen erfahrenen Betreiber oder Dienstanbieter zu wenden. Die folgenden Geräteeinstellungen sollten genügend Details für die Datenerfassung liefern.

    34. Direktes Microbore-Säuleneluat zum Massenspektrometer über eine Apollo-Elektrospray-Ionenquelle (Bruker). Typische Einstellungen für die Ionenquelle sind Kapillarspannungs- und Temperatureinstellungen von 3.200 V bzw. 150°C zusammen mit einem Trockengasfluss von 5 l/min und einem Verneblerdruck von 0,6 bar.

    35. Sammeln Sie MS-Daten im Positiv-Ionen-Modus über den Bereich von 50-2.000 m/z bei einer Spektralfrequenz von 2 Hz.

    36. Führen Sie bei jedem Scan die MS/MS-Akquisition an den obersten fünf intensiven Vorläufern durch (schließen Sie diese Ionen nach zwei MS/MS-Ereignissen aus). Die bevorzugten Ladungszustände werden auf +1 bis +4 eingestellt (unbestimmte Ladungszustände sind ausgeschlossen) und die Abtastrate wird von 0,5 Hz bei niedrigen Ionenzählungen (10.000) bis 5,0 Hz für intensive Ionenzählungen (500.000) variiert.

    37. Die resultierenden MS-Spektraldaten können zur Analyse mit der Compass DataAnalysis ™ -Software (Bruker) geöffnet werden.

    Datenanalyse: Beispieldaten

    Dieser Abschnitt gibt einen Überblick darüber, wie MS-Datendateien manipuliert werden, um Ionenchromatogrammspuren zu extrahieren und MS/MS-Daten zu interpretieren, um Muropeptidstrukturen zu bestätigen. Dies lässt sich am besten anhand einiger ausgearbeiteter Beispiele (unten) erklären.

    38. Für die Zwecke dieses Protokolls werden wir veranschaulichen, wie man genaue Masse- und Fragmentierungsmuster mit Strukturmodellen verknüpft, um die Identität für ein beispielhaftes Monomer und ein Dimer-Muropeptid zu bestätigen.

    Verwenden Sie das ChemDraw ™ -Softwarepaket (Perkin Elmer), um die Strukturen der vorhergesagten MurNAc-Alkin-markierten Muropeptide wie in Abbildung 9 gezeigt zu modellieren. Bestätigen Sie dann die Strukturmodelle mithilfe der MS-Datenmanipulation mit der Compass DataAnalysis ™ -Software (Bruker) wie abgebildet.

    Dieses Beispiel zeigt die Bestätigung des Vorhandenseins und der Identität von zwei mutmaßlichen MurNAc-Alkin-markierten Muropeptiden in Cellosyl-Verdauungsprofilen der H. pylori AmgK- und MurU (KU)-Stamm (rdxA::amgKmurU) Zellwand, die in Gegenwart von Fosfomycin gezüchtet und mit MurNAc-Alkin ergänzt wurde. Der Kontrollverdau wird ohne Zugabe von MurNAc-Alkin gezüchtet.

    39. Fig. 9 veranschaulicht die vollständigen Strukturen und MS/MS-Fragmentierungspunkte für die vorhergesagten modifizierten MurNAc-Alk-Pentapeptid (Monomer) und MurNAc-Alk-Pentapeptid-Tetrapeptid (Dimer)-Muropeptide. Die berechneten theoretischen Massen sind 1048,44 bzw. 1969,83 Da, wobei erwartet wird, dass einfach [M + H] + (Monomer) und doppelt [M + 2H] 2+ (Dimer) geladene Ionen beobachtet werden bei m/z = 1049,45 (1 + ) bzw. 985,92 (2 + ) (ChemDraw TM ).

    40. Die ersten beispielhaften Massenspektraldaten sind für das MurNAc-alk-Pentapeptidmonomer, dessen Struktur in 9A dargestellt ist. Laden Sie gekennzeichnete und nicht gekennzeichnete (Kontroll-) MS-Datendateien in Compass DataAnalysis. Anfängliche MS-Ionenspuren für den unmarkierten Zellwandverdau und den MurNAc-alk-markierten Zellwandverdau sind in 10A bzw. 10C gezeigt.

    Beachten Sie, wie die Spuren im Wesentlichen identisch zu sein scheinen. Dies liegt daran, dass die Alkinmarkierung nur als kleiner Prozentsatz des gesamten MurNAc während der Zellwandsynthese eingebaut wird. Daher sehen oberflächlich alle Spuren gleich aus, weshalb wir nach vorhergesagten modifizierten Muropeptidmassen, wie sie in ChemDraw ™ bestimmt wurden, „suchen“ müssen.

    41. Fig. 10A-D veranschaulicht vier Ionenchromatogramme, die eine Muropeptid-LC-MS-Analyse darstellen, die nach den in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Verdau- und LC-MS-Bedingungen durchgeführt wurde. Wie bereits erwähnt, repräsentieren die Spuren A und C in Abbildung 10 Gesamtionenchromatogrammspuren (TICs) für die H. pylori KU-Stamm PG verdaut, die in Abwesenheit (A) und Gegenwart (C) von MurNAc-Alkin gezüchtet wurden.

    42. Die Spuren B und D in Abbildung 10 stellen „extrahierte“ Ionenchromatogramme (XICs) dar, die von A bzw. C entnommen wurden. Stellen Sie die DataAnalysis ™ -Software so ein, dass das erwartete 1 + -Ion des MurNAc-Alkin-Pentapeptids at . überwacht wird m/z = 1049,45 ± 0,1 (Abb. 9A).

    Beachten Sie das Fehlen des erwarteten Ionensignals in Spur B und das Vorhandensein eines großen Ionenpeaks bei etwa 33 min in D (schwarzer Pfeil).

    43. Abbildung 10E zeigt das Massenspektrum des Peaks bei ∼33 min in D, das die Anwesenheit eines Ions bei . bestätigt m/z = 1049,46 wie erwartet.

    Das Vorhandensein eines zweiten Peaks mit niedrigerer Intensität (∼29 min) ist etwas, das wir häufig bei nicht reduzierten Muropeptiden beobachten. Wir vermuten, dass dies ein Merkmal des anomeren Kohlenstoffs ist, da die Muropeptid-Reduktion solche Chromatogramme in nur einen einzigen Peak auflöst.

    44. Um zu bestätigen, dass das Ion bei m/z = 1049,46 ist tatsächlich das erwartete MurNAc-alk-Pentapeptid-Muropeptid, siehe das MS/MS-Fragmentierungsspektrum für dieses Ion. Abbildung 11 zeigt das MS/MS-Spektrum, das aus der Fragmentierung des Stammions bei erhalten wurde m/z = 1049,46, das bei ∼33 min eluierte. Wir listen reichlich Fragmentionen auf (m/z markiert), die zur positiven Identifizierung des MurNAc-Alkin-Pentapeptids in Tabelle 1 beigetragen haben.

    Fragmentionenstrukturen können mit dem ChemDraw ™ -Softwarepaket modelliert und verifiziert werden.

    MS/MS-Spektrum von m/z = 1049,46 Ionen.


    Bestätigung der MurNAc-alk-Pentapeptid-Muropeptid-Struktur, wie in Abbildung 9A dargestellt

    Ionenspitze Beobachtet m/z Ionenfragment mit
    1 516.24 [A bis C] +
    2 302.14 [E bis F] +
    3 605.29 [C bis H] +
    4 445.20 [A+B] +
    5 462.23 [E bis H] +
    6 333.18 [F bis H] +
    7 373.18 [E bis G] +
    8 739.33 [B bis G – H2O] +
    9 828.38 [B bis H – H2O] +
    10 668.29 [B bis F – H2O] +

    MS/MS-Spektrum von m/z = 1049,46 Ionen.

    45. Tabelle 1 veranschaulicht die Zuordnung der Top-Ten-Ionenpeaks in Fig. 11 (absteigende Intensität), was die modifizierte MurNAc-Alk-Pentapeptid-(Monomer)-Struktur wie in Fig. 9A vorhergesagt bestätigt.

    Beachten Sie, wie alle Ionenfragmentierungen über die Peptid- und glycosidischen Bindungen hinweg stattgefunden haben, die die Untereinheiten verbinden. Wasserverlust (δ = 18) ist bei Peptidoglycan während der MS/MS-Fragmentierung nicht ungewöhnlich.

    46. ​​Die zweiten beispielhaften Massenspektraldaten sind für die MurNAc-Alk-Pentapeptid-Tetrapeptid-Dimer-Muropeptid-Struktur, die in 9B dargestellt ist. Laden Sie erneut die beiden MS-Datendateien. Die anfänglichen TIC-Ionenspuren für den unmarkierten Zellwandverdau und den MurNAc-alk-markierten Zellwandverdau sind unten in 12A bzw. C gezeigt.

    Beachten Sie noch einmal, wie diese TIC-Spuren im Wesentlichen identisch zu sein scheinen, aus dem gleichen Grund des zuvor beschriebenen geringen prozentualen Einbaus von Tags.

    47. Fig. 12A-D zeigt erneut vier Ionenchromatogramme, die die DataAnalysis TM -Softwareanalyse von Muropeptid-LC-MS-Daten darstellen, die nach Zellwandverdau und Muropeptid-LC-MS-Trennung erfasst wurden. Spuren A und C in Abb. 12 stellen Gesamtionenchromatogramme für die H. pylori KU-Stamm PG verdaut, die in Abwesenheit (A) und Gegenwart (C) von MurNAc-Alkin gezüchtet wurden.

    48. Spuren B und D in Abb. 12 sind extrahierte Ionenchromatogramme von A bzw. C, wobei die DataAnalysis ™ -Software eingestellt wurde, um das erwartete 2+-Ion des MurNAc-Alkin-Pentapeptid-Tetrapeptids at . zu überwachen m/z = 985.92 ± 0.1 (Fig. 9B).

    Beachten Sie wiederum das Fehlen des erwarteten Ionensignals in Spur B und das Vorhandensein eines großen Ionenpeaks bei etwa 40 min in D (schwarzer Pfeil).

    49. Abbildung 12E zeigt das Massenspektrum des Peaks, der etwa 40 min in D eluiert, was die Anwesenheit eines Ions bei . bestätigt m/z = 985,93 wie erwartet.

    50. Verwenden Sie noch einmal das MS/MS-Spektrum, das aus der Fragmentierung des Elternions bei erhalten wurde m/z = 985,93 (Eluierung ca. 40 min), um die Identität zu bestätigen, wie in Abbildung 13 gezeigt.m/z markiert), die zur positiven Identifizierung des MurNAc-Alkin-Pentapeptid-Tetrapeptids beigetragen haben, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

    MS/MS-Spektrum von m/z = 985,93 Ion.


    Bestätigung der MurNAc-alk-Pentapeptid-Tetrapeptid-Muropeptid-Struktur, wie in Abbildung 9B dargestellt

    Ionenspitze Beobachtet m/z Ionenfragment mit
    1 204.09 [A] + oder [O] +
    2 516.24 [C bis F (+ I oder G)] +
    3 676.33 [C zu I] +
    4 302.14 [E bis F] +
    5 817.37 [C bis F + I bis K] +
    6 977.46 [C bis K] +
    7 1120.51 [C bis M] +
    8 445.20 [C bis F] +
    9 1305.58 B [C bis N – H2O] +
    10 1547.68 C [B bis N – H2O] +

    MS/MS-Spektrum von m/z = 985,93 Ion.

    Unverändert n-Acetylmuraminsäure.

    +1 geändert n-Acetylmuraminsäure.

    51. Tabelle 2 zeigt die Zuordnung der Top-Ten-Ionenpeaks in 13 (absteigende Intensität), was die modifizierte MurNAc-Alk-Pentapeptid-Tetrapeptid-(Dimer)-Struktur wie in 9B vorhergesagt bestätigt.

    Beachten Sie erneut, wie die intensiven Ionen aus Fragmentierungen bestehen, die über die Peptid- und glycosidischen Bindungen hinweg stattgefunden haben, die die Untereinheiten verbinden, wodurch die in 9B vorhergesagte Struktur bestätigt wird.

    52. Wiederholen Sie abschließend den obigen Prozess der Modellierung vorhergesagter Strukturen in ChemDraw ™ , verwenden Sie die berechneten Ionenmassen, um Rohdatendateien (markierte versus unmarkierte Kontrolle) mit DataAnalysis ™ zu durchsuchen und schließlich alle vorhergesagten Ionenidentitäten durch Inspektion der MS/MS-Fragmentierung zu bestätigen Spektrum von jedem und Anwendung der Regeln für die erwartete Ionenfragmentierung über Peptid- und glycosidische Bindungen, bis Sie genügend schlüssige Beweise haben, um die Markierung des Tags zu beweisen.

    3: HAYASHI-TEST ZUR BESTIMMUNG, OB SDS IM ÜBERSTAND VON PEPTIDOGLYCAN-PRÄPARATIONEN VORHANDEN IST

    Hier führt der Benutzer einen kolorimetrischen Assay mit dem Überstand jeder Peptidoglycan-Zubereitung nach dem Waschen durch, um zu bestimmen, ob das gesamte SDS aus der Probe entfernt wurde (Hayashi, 1975). Die Probe ist SDS-frei, wenn die blaue Farbe nur in der oberen Schicht vorhanden ist und die untere (Chloroform) Schicht klar oder leicht rosa getönt ist.

    Materialien

    • 335 µl Überstandsprobe nach Zentrifugation (siehe Basisprotokoll 2)
    • 0,5% Methylenblau
    • 0,7 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2
    • Chloroform
    • 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
    • Vortexer

    1. Eine 335-µl-Probe des Überstands nach der Zentrifugation, 7 µl 0,5% Methylenblau und 170 µl 0,7 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und mischen.

    2. 1 ml Chloroform zugeben, verschließen und mit einem Vortex-Mischer 30 s lang mischen.

    Dunkel gelagertes Chloroform muss verwendet werden, da der Test andernfalls anzeigen kann, dass SDS noch vorhanden ist, wenn es bereits erfolgreich entfernt wurde. Möglicherweise müssen Sie das Röhrchen vor dem Vortexen von Hand umdrehen und/oder schütteln, damit sich die Schichten richtig mischen.

    3. Röhrchen 30 s ruhen lassen oder kurz zentrifugieren, um die Phasen zu trennen.

    4. Suchen Sie sofort nach Verfärbungen in der (unteren) Chloroformschicht. Das Auftreten einer blauen Farbe in der Chloroformschicht zeigt das Vorhandensein von SDS an. Wenn die Chloroformschicht klar oder rosa getönt ist, wurde das SDS erfolgreich entfernt.

    Schließlich wird die untere Phase blau, auch wenn das gesamte SDB aus der Probe entfernt wurde. Ein zu spätes Lesen des Tests kann fälschlicherweise anzeigen, dass das Sicherheitsdatenblatt noch vorhanden ist.

    Beispieldaten

    Am Ende dieses Protokolls haben die Benutzer festgestellt, ob SDS vollständig aus ihrer Peptidoglycan-Zubereitung entfernt wurde. Wenn dies der Fall ist (Abb. 14, Proben 1-3), kann der Benutzer mit dem nächsten Schritt des Basisprotokolls 1 fortfahren. Falls nicht (Abb. 14, Probe 4), wiederholen Sie den Waschschritt und den anschließenden Hayashi-Test, bis alle Sicherheitsdatenblätter vorliegen Wurde entfernt.

    4: ERSTELLEN VON BENUTZERDEFINIERTEN ZYTOZENTRIFUGENEINHEITEN ZUR VERWENDUNG IN EINER SCHWINGBECHER-TISCHZENTRIFUGE

    Hier erstellt der Anwender Zytozentrifugeneinheiten, die in einer Standard-Tisch-Ausschwingzentrifuge für 96-Well-Platten verwendet werden können. Der Benutzer schneidet die benötigten Teile mit einer mitgelieferten Schablone aus und baut vier obere und vier untere Einheiten mit Sekundenkleber zusammen. Tragen Sie Handschuhe und achten Sie darauf, die Haut nicht zu verkleben. Verwenden Sie Sekundenkleber in einem gut belüfteten Bereich.

    HINWEIS: Die Vorlage sollte mit einer Größe von 100 % gedruckt werden, um die Komponenten in der richtigen Größe zu schneiden, um die oben beschriebenen Zytozentrifugeneinheiten herzustellen (siehe ergänzende Abbildung 1, Hintergrundinformationen).

    Materialien

    • Benötigte Materialien für vier Zytozentrifugeneinheiten:
      • Sekundenkleber
      • Zwei Lagen Dichtungsgummi: 6 Zoll × 6 Zoll × 1/16 Zoll.
      • Tenura rutschfeste Silikonrolle
      • Vier 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
      • Eine Platte aus 1,3 mm dickem Plexiglas
      • Schere
      • Präparierschere
      • Rasierklinge oder Exacto-Messer
      • Schutzbrille
      • Gerade Kante für eine Schnittführung
      • Wegwerf Handschuhe
      • Vorlagen 1 und 2 (siehe Hintergrundinformationen), gedruckt in 100 % Größe

      1. Schneiden Sie die Teile aus der Gummidichtung (Abb. 15A). Schneiden Sie mit einer Rasierklinge, einem Exacto-Messer oder einer Schere vier 1 Zoll × 3 Zoll große Gummidichtungsunterteile (Vorlage 1, Teil A) aus.

      2. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge, einem Exacto-Messer oder einer Schere vier 1 Zoll × 1 Zoll große Gummidichtungsstücke ab. Schneiden Sie mit der Präparierschere ein Loch mit einem Durchmesser von 5/16 Zoll in die Mitte jedes Teils (Schablone 1, Teil B).

      3. Schneiden Sie mit der Präparierschere 32 Gummidichtungskreise mit einem Durchmesser von 5/8 Zoll aus. Schneiden Sie dann ein Loch mit einem Durchmesser von 10,8 mm (oder dem Außendurchmesser der flachen Seite Ihres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens) in die Mitte von jedes dieser Teile (Vorlage 1, Teil C).

      4. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge, einem Exacto-Messer oder einer Schere zwölf 1 Zoll × 1 Zoll und acht 5/8 Zoll × 5/8 Zoll Gummidichtungsstücke ab (Vorlage 1, Stück D bzw. E).

      5. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einem Exacto-Messer und einem Lineal als Führung vier 1 Zoll × 1 Zoll große Quadrate aus dem 1,3 mm dicken Plexiglas (Vorlage 2, Teil A) und entfernen Sie die Schutzbeschichtung, falls vorhanden ( Abb. 15B).

      Um das Plexiglas zu schneiden, ritzen Sie das Plexiglas mit der Klinge tief ein. Dies erfordert mehrere Durchgänge der Klinge. Ritzen Sie zuerst die äußeren Kanten des Rechtecks ​​aus Quadraten. Sobald diese Kanten bis zu einer Tiefe von mindestens der Hälfte der Dicke des Plexiglases angeritzt sind, biegen Sie das Plexiglas vorsichtig an den Kerblinien, bis es einrastet. Tragen Sie beim Zerbrechen des Plexiglases eine Schutzbrille und Handschuhe. Wenn das Plexiglas an der falschen Stelle einrastet, wiederholen Sie den Vorgang und ritzen Sie tiefer. Nachdem Sie das Rechteck aus der Plexiglasplatte geschnappt haben, wiederholen Sie den Ritz- und Schnappvorgang für jedes der Quadrate innerhalb des Rechtecks. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Plexiglas einritzen und brechen, um Schnittwunden zu vermeiden.

      6. Um die Oberseiten (Video 1, Hintergrundinformationen) zu machen, schneiden Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig vier 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen an der Stelle ab, an der sich die Wände zu verjüngen beginnen, um die Spitze am Boden des Röhrchens zu bilden, so dass die der geradewandige zylindrische Teil des Röhrchens und die Kappenvorrichtung bleiben (Fig. 15C).

      7. Schrauben Sie acht Gummidichtungsringe (Schablone 1, Stück C) auf den Boden jedes abgeschnittenen Zentrifugenröhrchens. Drücken Sie den Ringstapel zusammen und schieben Sie den Ringstapel an den Boden des Röhrchens (Abb. 16A-D und Video 1).


      Unterschiede in einem echten Labor:

      In einer realen Laborumgebung gibt es einige wichtige Schritte, die in einem virtuellen Labor nicht unbedingt anwendbar sind:

      1. Tragen Sie immer Handschuhe und Laborkittel.
      2. Binden Sie Ihr Haar richtig zusammen, um eine Kontamination durch die Kultur, mit der Sie arbeiten, zu vermeiden.
      3. Wenn Sie das Labor betreten, schalten Sie die Abluftventilatoren ein.
      4. Schalten Sie die Lichter des laminaren Luftstroms und des Gebläses ein. Bereiten Sie Ihren Arbeitsplatz (Laminar Air Flow Cabinet) oder Labortisch vor, indem Sie den Bereich mit Desinfektionsmittel abwischen.
      5. Stellen Sie die Flamme des Bunsenbrenners richtig ein. Die richtige Flamme ist ein kleiner blauer Kegel, sie ist weder eine große Wolke noch orange.
      6. Beschriften Sie alle Röhrchen und Platten immer mit:
        1. Der Name des Organismus
        2. Die Art der Medien
        3. Ihre Initialen
        4. Das Datum
      7. Achten Sie beim Abflammen der Impföse darauf, dass jedes Metallsegment orange/rotglühend glüht, bevor Sie das nächste Segment in die Flamme schieben.
      8. Legen Sie die Schlinge nach dem Abflammen nicht ab, blasen Sie nicht darauf, berühren Sie sie nicht mit den Fingern oder berühren Sie keine andere Oberfläche als Ihre Inokulums. Wenn Sie mit der Spitze eine andere Oberfläche berühren oder darauf blasen, müssen Sie die Schlaufe erneut entzünden, bevor Sie mit Ihrem Experiment fortfahren.
      9. Lassen Sie Ihre Schleife abkühlen, bevor Sie versuchen, Ihren Organismus aufzunehmen, um das Abtöten des Inokulums zu vermeiden.
      10. Wenn Sie die Kappen von Röhrchen entfernen, halten Sie die Kappen immer in der Hand. Stellen Sie sie niemals auf den Tisch, da sie Verunreinigungen aufnehmen könnten.
      11. Behandeln Sie offene Rohre immer schräg in der Nähe der Flamme des Brenners und lassen Sie sie niemals direkt nach oben zeigen, da Luft- oder andere Umweltorganismen in das Rohr fallen und eine Kontamination verursachen könnten.
      12. Öffnen Sie den Deckel der Platte weit genug (45 Grad), um eine Impföse einzuführen und nur so lange, wie es für die Gewinnung von Inokulums erforderlich ist.
      13. Drehen Sie die Platte um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn und überqueren Sie die vorherigen Streifen, um einige Bakterien aufzunehmen und in den nächsten Quadranten zu verteilen (Wiederholen Sie in allen vier Quadranten).
      14. Vorsichtig ausstreichen, um den Agar nicht zu zerkratzen.
      15. Sobald die Impfung abgeschlossen ist, flammen Sie Ihre Schlinge oder Nadel ab. Legen Sie niemals ein kontaminiertes Werkzeug auf Ihre Werkbank.
      16. Drehen Sie die beimpfte Petriplatte auf den Kopf, während Sie sie im Inkubator aufbewahren.
      17. Entsorgen Sie alle kontaminierten Materialien ordnungsgemäß, bringen Sie Ihre Verbrauchsmaterialien an die richtigen Lagerorte und räumen Sie Ihren Arbeitsbereich auf.
      18. Desinfizieren Sie Ihren Arbeitsbereich immer, wenn Sie fertig sind.
      19. Schalten Sie den Bunsenbrenner aus und vergewissern Sie sich, dass das Sicherheitsventil der Gasflasche angezogen ist.
      20. Schalten Sie den Laminar-Air-Flow und die Abluftventilatoren aus, bevor Sie das Labor verlassen.
      21. Achten Sie auf richtiges Händewaschen, bevor Sie das Labor verlassen.

      Leider erfordert dieses virtuelle Labor den Adobe Flash Player. Bitte beachten Sie zusätzliche Informationen, falls dies auf Ihrem Computer nicht funktioniert

      Auf GNU/Linux-Rechnern lesen Sie bitte die entsprechende Online-Hilfe. Zum Beispiel,


      D. PRIMÄRE UND KONTINUIERLICHE ZELLKULTUREN

      Zellkulturen stellen im Allgemeinen nur wenige biologische Gefahren im Labor dar, was durch ihre extrem breite Verwendung und die seltenen Fälle von übertragbaren Infektionen auf das Laborpersonal belegt wird. Primäre Zellkulturen, die mit Geweben von infizierten Menschen oder Tieren initiiert wurden, sind anerkannte Gefahren. Daher können Makaken und möglicherweise andere Affen der Alten Welt latente Herpesvirus-Simien (B-Virus)-Infektionen und stellen eine Gefahr für das Personal dar, das diese Tiere und deren Gewebe handhabt. In den letzten 30 Jahren sind mindestens 24 dokumentierte Fälle von Infektionen bei Labormitarbeitern aufgetreten, die mit primären Zellkulturgeweben (z. B. primären Nierenzellen von Rhesusaffen) umgehen [ 46 ]. Ein besonders bemerkenswerter Fall der Laborinfektion einer Reihe von Arbeitern durch einen zufälligen Erreger von Affen ereignete sich 1967 in Marburg und Frankfurt, Deutschland, sowie in Jugoslawien. Labormitarbeiter, die Gewebe und Zellkulturen von afrikanischen Grünen Meerkatzen verarbeiteten, entwickelten eine akute fieberhafte Erkrankung. Sieben Todesfälle ereigneten sich unter 31 dokumentierten Fällen aufgrund eines bisher unbekannten Virus, das später als Marburg-Virus bezeichnet wurde. Bei Labormitarbeitern ist es seit diesen Vorfällen nicht mehr aufgetreten[ 115 ]. Gewebe von Mäusen, die mit dem Virus der lymphozytären Choriomeningitis (LCM) infiziert sind, oder von Hühnern, die das Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) tragen, stellen ebenfalls potenzielle Gefahren dar, aber solche Laborinfektionen wurden nicht berichtet. Natürlich stellen primäre Zellkulturen, die von mit gefährlichen Erregern (z. B. HIV) infizierten Menschen hergestellt wurden, eine Infektionsgefahr dar, und solche Gewebe müssen mit den Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden, die für bekannte oder vermutete Infektionserreger erforderlich sind (siehe Anhang A).

      Kontinuierliche Zellkulturen stellen im Labor kein wirklich dokumentiertes Risiko dar, es sei denn, sie werden sorglos mit einem Infektionserreger kontaminiert. Alle kontinuierlichen Zelllinien sollten regelmäßig auf Kontamination mit Infektionserregern überwacht werden, und es sollte betont werden, dass alle Nährmedien oder andere Reagenzien, die Inhaltsstoffe biologischen Ursprungs enthalten können, so behandelt werden müssen, als ob sie potenziell infektiöse Stoffe enthalten würden.


      Arten von Medien:

      Das Wachstum von Mikroorganismen benötigt Nährstoffe und Umgebungsbedingungen. Im Labor hergestellte Nährpräparate, die für das Wachstum des Organismus verwendet werden, werden als Medien (Singular: Medium) bezeichnet. Drei physikalische Formen werden verwendet: flüssige Medien oder Brühe, halbfeste Medien und feste Medien. Flüssige Medien wie Nährbrühe, tryptische Sojabrühe oder Hirn-Herz-Infusionsbrühe können verwendet werden, um eine große Anzahl von Mikroorganismen in Fermentationsstudien und für biochemische Tests zu vermehren. Halbfeste Medien können auch in Fermentationsstudien, zur Bestimmung der bakteriellen Motilität und zur Förderung des anaeroben Wachstums verwendet werden. Feste Medien wie Nähragar oder Blutagar werden für das Oberflächenwachstum von Mikroorganismen verwendet, um das Aussehen von Kolonien zu beobachten, (2) für Reinkulturisolierungen, (3) Chargenlagerung von Kulturen und (4) zur Beobachtung spezifischer biochemischer Reaktionen. Im verflüssigten Zustand können feste Medien entweder in ein Reagenzglas oder eine Petrischale (Schale) gegossen werden, und wenn der Agar in eine Petrischale gegossen wird, wird die Platte als Agarplatte bezeichnet.


      REAGENZIEN UND LÖSUNGEN

      Hygromycin B Vorrat, 200 mg/ml

      • 1 g Hygromycin B (z. B. Apollo Scientific)
      • 5 ml entionisiertes destilliertes Wasser
      • Bei 4°C bis zu 1 Monat lagern

      KCl (0,6 M), CaCl2 (50 mM) Lösung (KCl/CaCl .)2)

      • 4,47 g KCl
      • 0,74 g CaCl2·2H2Ö
      • 100 ml entionisiertes destilliertes Wasser
      • Sterilisieren durch Autoklavieren
      • Bei Raumtemperatur unbegrenzt lagern

      Stellen Sie sicher, dass das Volumen während des Autoklavierens nicht reduziert wird und die Flaschen nach dem Autoklavieren verschlossen sind, um ein Verdunsten zu verhindern.

      KCl/Zitronensäurelösung

      • Zu ∼50 ml entionisiertem destilliertem Wasser fügen Sie hinzu:
      • 8,2 g KCl
      • 2,1 g Zitronensäure-Monohydrat
      • pH mit 1,1 M KOH . auf 5,8 einstellen
      • Volumen mit entionisiertem destilliertem Wasser auf 100 ml bringen
      • Bis zu 2 Wochen bei 4°C lagern

      Das Einstellen des pH erfordert ein beträchtliches Volumen von 1,1 M KOH.

      Vorsichtig durch Autoklavieren sterilisieren, um eine längere Lagerung bei Raumtemperatur zu ermöglichen.

      Da die Molarität dieser Lösung wichtig ist, muss die Flasche mit Parafilm versiegelt werden, um ein Verdunsten zu verhindern.

      PEG-Lösung

      400 g PEG 4000 (durchschnittliches Molekulargewicht 4000) zu ∼800 ml KCl/CaCl . hinzufügen2 (siehe Rezept). Verschließen Sie die Flasche und mischen Sie durch Umdrehen. Das PEG wird sich langsam auflösen. Nachdem das PEG vollständig aufgelöst ist, bringen Sie das Volumen mit KCl/CaCl . auf 1 l2. Sterilisieren durch Autoklavieren. Bei Raumtemperatur unbegrenzt lagern. Unmittelbar vor Gebrauch schütteln und sterilfiltrieren mit einem spritzenbetriebenen 0,22-µm-PVDF-Filter in eine kleine sterile, saubere, reinigungsmittelfreie Durchstechflasche, um PEG-Ausfällungen nach der Lagerung zu vermeiden.

      Die endgültige Lösung beträgt 0,6 M in Bezug auf KCl, 50 mM in Bezug auf CaCl2und 40% (w/v) bezüglich PEG. Stellen Sie sicher, dass die Flaschen nach dem Autoklavieren verschlossen sind, um eine Verdunstung zu verhindern.

      Lagern Sie die PEG-Lösung nicht bei 4 °C, da unter diesen Bedingungen PEG ausfällt. PEG-Präzipitat kann Protoplasten zerstören, wodurch die Transformationseffizienz verringert wird.

      Protoplastische Lösung

      • 10,0 g VinoTaste Pro (Lamothe-Abiet)
      • 100 ml KCl/Zitronensäurelösung (siehe Rezept)
      • Filtersterilisation mit einem spritzenbetriebenen 0,22-µm-PVDF-Filter
      • Nach der Filtration und innerhalb von 30 min vor Gebrauch mit 100 ml SAB Flüssigmedium mischen (siehe Rezept)

      VinoTaste Pro wird kommerziell für die Weinherstellung hergestellt. Es enthält als Schlüsselenzyme Polygalacturonase und β1,3-Glucanase.

      Um eventuell im Filter vorhandene Reinigungsmittelrückstände zu entfernen, entsorgen Sie etwa den ersten Milliliter Lösung, die durch den Filter austritt.

      SAB flüssiges Medium

      • 30 g SAB Flüssigmedium Pulver (z. B. Oxoid)
      • 1 L entionisiertes destilliertes Wasser
      • Sterilisieren durch Autoklavieren
      • Bei Raumtemperatur bis zu einigen Monaten lagern

      YPS/Hygromycin B-Selektionsplatten

      • 20 g Hefeextrakt
      • 0,606 g Trisbase
      • 5,0 g Bacto-Pepton
      • 342,3 g Saccharose
      • 15 g Agar (Technische Nr. 1)
      • 1 L entionisiertes destilliertes Wasser
      • pH-Wert mit Zitronensäure auf 6 einstellen
      • Sterilisieren durch Autoklavieren und anschließendes Abkühlen auf ∼50°C
      • 1 ml 200 mg/ml Hygromycin B (siehe Rezept) zugeben und gut mischen
      • Gießen Sie 4 ml/Well in sterile 6-Well-Flachboden-Zellkulturplatten
      • Bei 4°C bis zu einigen Wochen lagern

      Es ist wichtig, das Medium vor der Zugabe von Hygromycin B abzukühlen, da eine höhere Temperatur zu einem Abbau von Hygromycin B führen kann.

      Wir empfehlen, Platten unmittelbar nach dem Autoklavieren zu gießen, da das Umschmelzen von erstarrtem YPS-Medium problematisch und zeitaufwändig sein kann.

      Lassen Sie den Agar erstarren, bevor Sie die Platten zur Lagerung in eine versiegelte Schachtel legen.

      Für ein Hochdurchsatz-Setup ist es wichtig, alle Wells und Platten für die anschließende Transformation entsprechend vorzubeschriften (d. h. Platte 1: A1, A2, …). Für eine Transformation einer 96-Well-Platte werden 16 Selektionsplatten benötigt. Platten am besten 1 bis 2 Tage vor der Verarbeitung vorbereiten, damit die Oberfläche trocknen kann.


      Aseptische Technik in der Umweltwissenschaft

      Die aseptische Technik ist eine grundlegende Fähigkeit, die auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie weit verbreitet ist und ein Gleichgewicht zwischen Achtsamkeit und Praxis im Labor erfordert. Die richtige Anwendung dieser Technik verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen oder Pilzkontamination von Reagenzien, Kulturmedien und Umweltproben. Eine aseptische Technik ist auch wichtig, um die Datenintegrität zu gewährleisten und die Reinheit von Kulturbibliotheken zu erhalten, die aus sehr seltenen und schwer zu kultivierenden Isolaten bestehen können. Zu den Kontaminationsquellen in der Laborumgebung gehören luftgetragene Mikroorganismen (einschließlich solcher, die an Staub- und Flusenpartikeln haften), Mikroben, die auf dem Labortisch oder auf unsterilisierten Glaswaren oder Geräten vorhanden sind, und Mikroben, die vom Körper und Haar des Forschers übertragen werden. Der Einsatz der aseptischen Technik ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die das Potenzial für die Übertragung von Mikroorganismen auf Forscher verringert, was insbesondere bei der Arbeit mit Krankheitserregern wichtig ist.

      Grundsätze

      Das Ziel der Verwendung aseptischer Techniken besteht darin, eine sterile Arbeitsumgebung, Ausrüstung und Reagenzien zu schaffen und aufrechtzuerhalten, um so die Kontamination biologischer Proben zu minimieren. Dazu können der Arbeitsbereich und einige Werkzeuge mit Chemikalien wie 70%igem Ethanol und verdünnter Bleiche desinfiziert werden. Es ist auch wichtig, dass der Forscher persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille trägt.

      Medien und Reagenzien können mit Filtersterilisationsapparaten mit 0,22-µm-Filtern sterilisiert werden, die die meisten Mikroorganismen wie Bakterien effektiv entfernen. Alternativ können viele Reagenzien und Geräte auch bei hoher Hitze sterilisiert werden. Zum Beispiel können Mikroben auf oder in Werkzeugen, Glaswaren und flüssigen Medien in einem Autoklaven, einer Kammer, die den Inhalt durch Einwirkung von Hochtemperatur-Druckdampf sterilisiert, durch Hitze abgetötet werden. Darüber hinaus können einige Werkzeuge mit einer Flammenquelle, z. B. einem Bunsenbrenner, hitzesterilisiert werden.

      Die Verwendung einer Flammenquelle ist auch eine der gebräuchlichsten Methoden, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme verursacht Luftkonvektion, wodurch ein Aufwind erzeugt wird, der alle luftgetragenen Verunreinigungen aus der Nähe des Brenners hebt und ein “steriles Feld” erzeugt, in dem aseptische experimentelle Arbeiten durchgeführt werden können.

      Abonnement erforderlich. Bitte empfehlen Sie JoVE Ihrem Bibliothekar.

      Verfahren

      1. Vorbereitung für aseptische Arbeiten

      1. Besorgen und tragen Sie die folgenden PSA-Artikel: Laborkittel, Latex- oder Nitrilhandschuhe (ohne Risse oder Löcher) und Schutzbrille (Abbildung 1). Zur Sicherheit bei offenem Feuer lange Haare zurückbinden.

        Abbildung 1: PSA: Ein Laborkittel, Latexhandschuhe und eine Schutzbrille.
      2. Ein zweiter wichtiger Aspekt der aseptischen Technik ist die ordnungsgemäße Sterilisation und Lagerung der im Labor zu verwendenden Medien/Reagenzien. Bereiten Sie eine flüssige Brühe vor (z.B., tryptische Sojabrühe) und Agar-basierte Medien (z.B., R2A) durch Abwiegen der richtigen Menge getrockneten Grundpulvers, das der entsprechenden Menge entionisiertem Wasser zugesetzt wird. 
      3. Für das Nährmedium das Pulver auf einer heißen Platte bei geringer Hitze auflösen und die Flüssigkeit entweder in 100-ml-Volumina in Glaskolben mit Schraubverschluss oder in 10-ml-Volumina in Reagenzgläser mit Schraubverschluss geben. Rühren Sie das Agarose-Medium mit einem Magnetrührstäbchen auf dem Heizplattenrührer, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat. 
      4. Bringen Sie Autoklavierband auf den Behältern an und autoklavieren Sie die Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers (z.B., 20 min bei 121 °C) (Abbildungen 2 und 3). Beachten Sie, dass die Farbe der Streifen auf dem Autoklavenband von weiß (vor dem Autoklaven) zu schwarz (nach dem Autoklaven) wechseln sollte. Obwohl die Farbänderung im Allgemeinen anzeigt, dass die Sterilisation erfolgreich war, können Sterilitätsprüfungen mit Sporenstreifen-Kits durchgeführt werden, um den Autoklavierprozess zu überprüfen.

        Abbildung 2: Auf das Material aufgebrachtes Autoklavenband.

        Figur 3:Beachten Sie die Farbänderung der Streifen auf dem Autoklavenband von weiß (vor dem Autoklaven) zu schwarz (nach dem Autoklaven).
      5. Kühlen Sie die flüssigen Brühen auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie dann bei Raumtemperatur oder gekühlt bei 4 °C  .
      6. Kühlen Sie das Agarose-Medium ab, indem Sie den Behälter in ein Wasserbad stellen, das auf . eingestellt ist

      2. Bakterientransfer: Von Petriplatte zu Petriplatte

      1. Ein Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petriplatte, die das Wachstum eines kultivierten Isolats zeigt, auf eine andere, sterile Petriplatte, die ein Nährmedium auf Agarbasis enthält.
      2. Öffnen Sie zunächst die Petrischale mit der reinen Bakterienkultur leicht und klopfen Sie die heiße, sterilisierte Impföse vorsichtig auf die Agaroberfläche. 
      3. Eine isolierte Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impföse entnehmen und die Petriplatte schließen.
      4. Zur Isolierung einen Ausstrich mit einer frischen Petrischale mit Nährmedium bei leicht geöffnetem Deckel durchführen. 
      5. Für jeden Teil des Isolierstreifens (insgesamt 3 pro Platte) die Impföse unmittelbar vor der Verwendung flammensterilisieren. Flammensterilisieren Sie die Schleife auch unmittelbar nach dem letzten Ausstrich, um eine Kontamination der Tischoberfläche zu vermeiden und als Rücksicht auf andere im Labor, die die Impfschleifen später verwenden oder damit in Kontakt kommen könnten.
      6. Legen Sie die ausgestrichenen Platten in einen Inkubator für das Wachstum über Nacht.

      3. Bakterientransfer: Von der Kulturbrühe auf die Petriplatte

      1. Ein zweites Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Nährlösungskultur, die Wachstum zeigt, wie im Allgemeinen durch Trübung beobachtet, auf eine sterile Petrischale, die Wachstumsmedium enthält.
      2. Entfernen Sie die Kappe vom Reagenzglas (oder Kolben) mit der reinen Bakterienkultur und führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3x durch den heißesten Teil der Flamme. Um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Kappe nicht auf die Tischplatte.
      3. Senken Sie die sterilisierte Impföse vorsichtig in das Röhrchen/Kolben und drücken Sie sie zum Abkühlen vorsichtig gegen die Seite des Behälters, bevor Sie sie in die Kulturbrühe einführen.
      4. Entfernen Sie eine Schleife voll Brühekultur (Abbildung 5) und setzen Sie die Kappe sofort wieder auf.

        Abbildung 5:Eine Schleife voll Brühekultur.
      5. Zur Isolierung einen Ausstrich mit einer frischen Petrischale mit Nährmedium bei leicht geöffnetem Deckel durchführen. 
      6. Für jede Portion des Ausstrichs (insgesamt 3 pro Platte) die Impföse unmittelbar vor der Verwendung flammensterilisieren. Flammensterilisieren Sie die Schleife auch unmittelbar nach dem letzten Ausstrich, um eine Kontamination der Tischoberfläche zu vermeiden und als Rücksicht auf andere im Labor, die die Impfschleifen später verwenden könnten.
      7. Legen Sie die ausgestrichenen Platten zur Isolierung in einen Inkubator für das Wachstum über Nacht.

      4. Bakterientransfer: Von der Petrischale mit Wachstum zu sterilem Flüssigmedium

      1. Ein drittes Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petriplatte, die einen isolierten Kulturstreifen enthält, in ein Röhrchen/Kolben mit sterilem flüssigem Wachstumsmedium.
      2. Öffnen Sie die Petrischale mit der reinen Bakterienkultur leicht und kühlen Sie die heiße Impföse durch leichtes Klopfen auf die Agaroberfläche ab. 
      3. Eine isolierte Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impföse entnehmen und die Petriplatte schließen.
      4. Entfernen Sie die Kappe vom Reagenzglas (oder Kolben), das das sterile flüssige Wachstumsmedium enthält, und führen Sie die Öffnung des Behälters 2 bis 3 Mal durch den heißesten Teil der Flamme. Um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Kappe nicht auf die Tischplatte.
      5. Senken Sie die extrahierte Kolonie vorsichtig in das flüssige Nährmedium und bewegen Sie die Schlinge vorsichtig, um die Bakterien freizusetzen. Tauschen Sie die Kappe sofort aus.
      6. Flammensterilisieren Sie die Impföse, um eine Kontamination der Tischoberfläche zu vermeiden und als Rücksicht auf andere im Labor, die die Impfösen später verwenden könnten.
      7. Stellen Sie den Kolben zum Wachstum über Nacht in einen Inkubator.
      8. Nehmen Sie den Kolben am nächsten Tag aus der Inkubation. Führen Sie eine Verdünnungsreihe durch, um die Kultur zu zählen.
      9. Die Verdünnungen aus der Serie auf Agarose-Kulturmedien plattieren und die Platten über Nacht inkubieren.
      10. Entfernen Sie die Platten am nächsten Tag und beobachten Sie sie auf Verunreinigungen.

      5. Bakterientransfer: Von der Kulturbrühe zum sterilen flüssigen Wachstumsmedium

      1. Ein viertes Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Nährlösungskultur, die Wachstum zeigt, in ein Röhrchen/Kolben, das/der steriles flüssiges Wachstumsmedium enthält.
      2. Entfernen Sie die Kappe vom Reagenzglas (oder Kolben) mit der reinen Bakterienkultur und führen Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch den heißesten Teil der Flamme. Um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Kappe nicht auf die Tischplatte.
      3. Senken Sie die Impföse vorsichtig in das Röhrchen/Kolben und drücken Sie sie kurz vor dem Einsetzen in die Kulturbrühe zum Abkühlen leicht gegen die Seite des Behälters.
      4. Entfernen Sie eine Öse voll Kulturbrühe und setzen Sie die Kappe sofort wieder auf.
      5. Entfernen Sie die Kappe vom Reagenzglas (oder Kolben), das das sterile flüssige Wachstumsmedium enthält, und führen Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch den heißesten Teil der Flamme. Um eine Kontamination zu vermeiden, legen Sie die Kappe nicht auf die Tischplatte.
      6. Senken Sie die extrahierte Schleife vorsichtig in das sterile flüssige Nährmedium und bewegen Sie die Schleife vorsichtig, um die Bakterien freizusetzen. Tauschen Sie die Kappe sofort aus.
      7. Die Impföse flammsterilisieren (Abbildung 6), um eine Kontamination der Tischoberfläche zu vermeiden und als Rücksichtnahme auf andere im Labor, die die Impfösen später verwenden können.

        Abbildung 6: Beim Sterilisieren mit einem Bunsenbrenner wird die Impföse rotglühend.
      8. Stellen Sie den Kolben zum Wachstum über Nacht in einen Inkubator.
      9. Nehmen Sie den Kolben am nächsten Tag aus der Inkubation. Führen Sie eine Verdünnungsreihe durch, um die Kultur zu zählen.
      10. Die Verdünnungen aus der Serie auf Agarose-Kulturmedien plattieren und die Platten über Nacht inkubieren.
      11. Entfernen Sie die Platten am nächsten Tag und beobachten Sie sie auf Verunreinigungen.

      Die aseptische Technik ist eine grundlegende Fähigkeit in der Mikrobiologie und hat entscheidende Anwendungen in der Umweltforschung.

      Wenn mikrobiologische Kulturen kontaminiert sind, könnten der Zeit-, Arbeits- und Finanzaufwand eines Labors für die "Reinigung" oder den Austausch der Kulturen, insbesondere seltener Isolate aus einzigartigen Umgebungen, sehr hoch und unerschwinglich sein, und einige Proben kann unersetzlich sein.

      Die richtige Anwendung aseptischer Techniken verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen und Pilzkontamination von Reagenzien, Kulturmedien und Umweltproben und vermeidet auch eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Es ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die die potenzielle Übertragung von Mikroben auf den Experimentator verringert, was besonders bei der Arbeit mit Krankheitserregern wichtig ist.

      In diesem Video werden die Prinzipien der Asepsis, einige wichtige Techniken zur Aufrechterhaltung steriler Reagenzien und Kulturen und schließlich einige ihrer Anwendungen in der Umweltwissenschaft vorgestellt.

      Das Ziel der Verwendung aseptischer Techniken besteht darin, eine sterile Arbeitsumgebung, Ausrüstung und Reagenzien zu schaffen und aufrechtzuerhalten, um so die Kontamination biologischer Proben zu minimieren. Häufige Kontaminationsquellen sind luftgetragene Mikroorganismen, Mikroben, die auf dem Labortisch oder der Ausrüstung vorhanden sind, und solche aus Haar, Körper und Kleidung des Forschers.

      Zwei Arten von Mitteln sind von zentraler Bedeutung, um Kontaminationen im Labor zu entfernen oder zu verhindern: Desinfektionschemikalien und Hitze. Lösungen wie 70 % Ethanol und verdünntes Bleichmittel werden häufig verwendet, um Geräte, Arbeitsflächen und Handschuhe von Experimentatoren zu desinfizieren, bevor aseptische Arbeiten durchgeführt werden.

      Gleichzeitig können Mikroben auf oder in Werkzeugen, Glaswaren und flüssigen Medien in einem Autoklaven, einer Kammer, in der der Inhalt durch Hochtemperatur-Druckdampf sterilisiert wird, durch Hitze abgetötet werden. Darüber hinaus können Werkzeuge wie Glasstäbe, die zum Auftragen von Beschichtungen verwendet werden, und Impfösen aus Metall unter Verwendung einer Flammenquelle, wie einem Bunsenbrenner, hitzesterilisiert werden.

      Die Verwendung einer Flammenquelle ist auch eine der gebräuchlichsten Methoden, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme verursacht Luftkonvektion, wodurch ein Aufwind erzeugt wird, der alle luftgetragenen Verunreinigungen aus der Nähe des Brenners hebt und ein „steriles Feld“ erzeugt, in dem aseptische experimentelle Arbeiten durchgeführt werden können.

      Nachdem Sie nun die Prinzipien der aseptischen Techniken und ihre Bedeutung verstanden haben, gehen wir ein Protokoll zur Schaffung einer aseptischen Arbeitsumgebung, zur Herstellung steriler Nährmedien und zur aseptischen Übertragung von Bakterien zwischen verschiedenen Kulturbedingungen durch.

      Vor Beginn aseptischer Arbeiten ist es für den Experimentator wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung oder PSA anzulegen. Dadurch soll sowohl eine Kontamination der Proben und Laborkulturen durch den Experimentator als auch die Übertragung potenziell pathogener Keime auf den Forscher verhindert werden. Zu den PSA-Artikeln gehören ein Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille.

      Der nächste Schritt besteht darin, die zur Kultivierung der mikrobiellen Proben zu verwendenden Wachstumsmedien richtig zu sterilisieren und zu lagern. Wiegen Sie zuerst die richtige Menge an festen Medienkomponenten ab und fügen Sie sie in einem autoklavierbaren Behälter zu dem richtigen Volumen des vom Hersteller angegebenen flüssigen Lösungsmittels, wie z , und die festen Mediumkomponenten bei schwacher Hitze und Rühren auflösen.

      Schließen Sie die mittleren Behälter. Wenn Sie ein Glasgefäß mit Schraubverschluss verwenden, achten Sie darauf, den Verschluss nicht vollständig festzuziehen, da sich die Luft in den Gefäßen durch die Erwärmung beim Autoklavieren ausdehnt und entweichen muss. Ohne Entweichen könnte das Gas zum Bersten des Gefäßes führen. Legen Sie ein Stück Autoklavierband auf die Gefäße und autoklavieren Sie die Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers, z. B. 20 Minuten bei 121 °C. Stellen Sie nach dem Autoklavieren sicher, dass die Streifen auf den Autoklavenbändern schwarz geworden sind, was anzeigt, dass die richtige Temperatur erreicht wurde.

      Lassen Sie flüssige Nährmedien auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie je nach Bedarf bei Raumtemperatur oder gekühlt. Lassen Sie feste Nährmedien auf Agarbasis auf etwa 50 °C abkühlen und gießen Sie sie dann in sterile Petrischalen. Lassen Sie den Agar abkühlen und erstarren, bevor Sie ihn bei der entsprechenden Temperatur lagern.

      Bei Medien, die aufgrund von wärmeempfindlichen Komponenten nicht autoklaviert werden können, filtern Sie die Sterilisation mit einem 0,22-μm-Filter.

      Eine Kerntechnik in der mikrobiologischen Arbeit ist der aseptische Transfer von Bakterienkulturen zwischen verschiedenen Wachstumsmedien, sowohl fest als auch flüssig. Reinigen Sie die Labortischoberfläche vor Beginn mit einem Desinfektionsmittel. Dies verringert das Risiko einer Kontamination von Kulturen oder sterilen Medien.

      Beim Übertragen von Bakterienkulturen wird üblicherweise ein Werkzeug verwendet, das als Impföse bezeichnet wird und vor der Verwendung durch Erhitzen in einer Flamme sterilisiert werden muss.

      Schalten Sie eine Flammenquelle ein. Führen Sie die Impföse langsam durch die Flammenspitze. Die Schleife wird rotglühend. Um eine Bakterienkolonie von einer festen Agarplatte zu übertragen, öffnen Sie die Petrischale leicht und klopfen Sie die heiße Impföse vorsichtig auf einen leeren Teil der Agaroberfläche, um eine Hitzeabtötung der Bakterien zu vermeiden. Kratzen Sie eine einzelne Kolonie mit der Impföse ab und schließen Sie die Platte.

      Um Bakterien aus einem flüssigen Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie die Kappe vom Kulturbehälter. Um eine Kontamination zu vermeiden, vermeiden Sie es, die Kappe auf den Tisch zu legen. Führen Sie die Mündung des Behälters 2-3 Mal durch den heißesten Teil der Flamme. Berühren Sie dann die heiße, sterilisierte Impföse vorsichtig auf der Innenseite des Behälters und lassen Sie ihn abkühlen, bevor Sie ihn in die Kulturbrühe einführen. Entfernen Sie eine Schleife der Kultur und schließen Sie sofort die Kappe.

      Um die erhaltenen Bakterien in ein steriles Nährmedium zu überführen, entfernen Sie die Kappe von einem Behälter mit der sterilen Brühe und führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch die Flamme. Senken Sie dann die Impföse vorsichtig in das Medium und rühren Sie vorsichtig, um die Bakterien freizusetzen. Schließen Sie sofort die Kappe. Sterilisieren Sie die Impföse nach Gebrauch.

      Wenn Sie Bakterien auf eine sterile Agarplatte übertragen, öffnen Sie den Deckel einer frischen Petrischale mit ungeimpftem Agar. Streichen Sie die Impföse mit der Bakterienkultur hin und her über einen Sektor des Agars. Sterilisieren Sie die Schlaufe und kühlen Sie sie ab, indem Sie einen leeren Teil des Agars berühren, dann einen weiteren Strich auf dem Agar in einem stumpfen Winkel zum ersten Strich machen. Achten Sie darauf, den ersten Strich bei den ersten 1-2 Hüben zu kreuzen, aber vermeiden Sie es, den ersten zu berühren Streifen bei nachfolgenden Schlägen. Wiederholen Sie die Sterilisation und das Ausstreichen noch 2 Mal. Schließen Sie die Petrischale und sterilisieren Sie die Impföse.

      Nach der Beimpfung sollte die Brühe oder Agarplatte bei der idealen Wachstumstemperatur für den jeweiligen Mikroorganismus inkubiert werden, um eine lebensfähige Kultur zu erhalten. Auf festem Medium wäre ein Rasen oder ein kontinuierlicher Bakterienstrang auf dem Agar sichtbar, der von den ersten beiden Strähnen bedeckt ist, aber einzelne Kolonien sollten auf dem letzten Streak erhalten werden. Schlechte aseptische Techniken würden zum Wachstum von Schimmel und anderen Verunreinigungen auf der Platte führen.

      Aseptische Techniken sind bei vielen Experimenten mit mikrobiellen Proben aus der Umgebung wichtig. In dieser Studie isolierten die Forscher Bakteriophagen, bei denen es sich um bakterieninfizierende Viren handelt, aus dem gewöhnlichen Bodenbakterium Arthrobacter. Arthrobacter Kulturen wurden zuerst unter aseptischen Bedingungen gezüchtet. Bodenproben wurden dann gewaschen und in Phagenpuffer filtriert, und die Phagenlösung wurde mit der Bakterienkultur vermischt und auf Agarplatten ausplattiert. Auf dem Teller bildete sich ein Bakterienrasen, aber an Stellen, an denen das Virus die Bakterien infiziert und abgetötet hatte, bildeten sich Lichtungen oder „Plaques“. Phagen könnten dann aus diesen Plaques für weitere Untersuchungen gereinigt werden.

      Abgesehen von der Verwendung von Bunsenbrennern können aseptische Arbeitsumgebungen auch in speziellen Arbeitsstationen, den sogenannten Laminar-Flow-Hauben, aufrechterhalten werden, die einen gerichteten Luftstrom und Filter verwenden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Hier arbeiteten Wissenschaftler in einer Strömungshaube, um potenziell pathogene Bakterien und Viren aus Wasserproben zu isolieren. Diese Isolate wurden dann zusammen mit Amöben kultiviert. Da Amöben normalerweise Bakterien fressen oder „phagozytieren“, können alle Bakterien, die der Amöbenverdauung widerstehen und in diesen Organismen verbleiben, möglicherweise auch in menschlichen Zellen lebensfähig bleiben und Krankheiten verursachen.

      Schließlich erlauben sterile Bedingungen eine detaillierte Untersuchung ökologischer Mechanismen wie der Bildung von Wurzelknollen in Hülsenfrüchten – mit Bakterien gefüllte Organe, die atmosphärischen Stickstoff in Ammoniak „fixieren“, das von der Pflanze für das Wachstum verwendet wird. Die Forscher haben hier „Mikrokosmen“ geschaffen, um den Nodulationsprozess unter Verwendung von gekerbten Petriplatten mit Pflanzenwachstumsmedium zu untersuchen, Setzlinge hineinzusetzen und die Setzlinge mit knötchenbildenden Rhizobienbakterien zu inokulieren. Die aseptische Umgebung der Durchflusshaube verhindert eine Kontamination der Kulturen mit anderen Bakterien oder Pilzen.

      Sie haben sich gerade das Video von JoVE über aseptische Techniken in der Umweltwissenschaft angesehen. Sie sollten jetzt verstehen, warum aseptische Arbeitsbedingungen wichtig sind, wie man mikrobiologische Experimente aseptisch durchführt und einige Anwendungen aseptischer Techniken in der Umweltforschung. Wie immer danke fürs Zuschauen!

      Abonnement erforderlich. Bitte empfehlen Sie JoVE Ihrem Bibliothekar.

      Ergebnisse

      Das Ergebnis des Verfahrens zeigt eine korrekte aseptische Technik und eine schlechte aseptische Technik. Abbildung 7 illustriert die Kontamination, die durch schlechte aseptische Technik beim Gießen von Agaroseplatten entstehen kann (obere Platte: steriles Medium untere Platten: kontaminierte Medien).


      Abbildung 7: Kontamination, die durch schlechte aseptische Technik beim Gießen von Agaroseplatten entstehen kann. Obere Platte: steriles Medium Untere Platten: kontaminierte Medien.

      Abonnement erforderlich. Bitte empfehlen Sie JoVE Ihrem Bibliothekar.

      Bewerbungen und Zusammenfassung

      Neben der Verwendung von Bunsen-Brennern können aseptische Arbeitsumgebungen auch in speziellen Arbeitsstationen, den sogenannten Laminar-Flow-Hauben, aufrechterhalten werden, die einen gerichteten Luftstrom und Filter verwenden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.

      Die ordnungsgemäße Anwendung der aseptischen Technik ist für Umweltmikrobiologen bei der Probenahme im Feld und im Labor bei der Arbeit mit Medien, Reagenzien und kultivierten Isolaten von entscheidender Bedeutung.  Eine schlechte aseptische Technik im Feld kann dazu führen, dass Mikroorganismen vom Techniker auf kritischen Umweltproben sowie die Kreuzkontamination von Mikroben von einer Probe zur anderen. Solche Ereignisse sind zum Beispiel bei mikrobiellen Ökologiestudien von Bedeutung, die darauf abzielen, Bakterien- und Pilzpopulationen zu identifizieren und zu vergleichen, die in einem bestimmten Biom vorhanden sein können. Die Kontamination solcher Proben kann zu einem Verlust der Datenintegrität führen. Eine aseptische Technik ist auch für die Pflege von Laborkulturisolaten von entscheidender Bedeutung, die aus Feldprobennahmen oder aus etablierten Mikroben- und Zellkulturlagern stammen. Der Zeit-, Arbeits- und Finanzaufwand, der von einem Labor benötigt würde, um kontaminierte Kulturen zu „säubern“ oder zu ersetzen, insbesondere seltene Isolate aus einzigartigen Umgebungen, könnten sehr hoch und unerschwinglich sein, wie es bei einigen Isolaten der Fall sein kann unersetzlich.

      Abonnement erforderlich. Bitte empfehlen Sie JoVE Ihrem Bibliothekar.

      Transkript

      Die aseptische Technik ist eine grundlegende Fähigkeit in der Mikrobiologie und hat entscheidende Anwendungen in der Umweltforschung.

      Wenn mikrobiologische Kulturen kontaminiert sind, könnten der Zeit-, Arbeits- und Finanzaufwand, der von einem Labor benötigt würde, um die Kulturen zu "säubern" oder zu ersetzen, sehr hoch und unerschwinglich sein, und einige Proben können unersetzlich.

      Die richtige Anwendung aseptischer Techniken verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen und Pilzkontamination von Reagenzien, Kulturmedien und Umweltproben und vermeidet auch eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Es ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die die potenzielle Übertragung von Mikroben auf den Experimentator verringert, was insbesondere bei der Arbeit mit Krankheitserregern wichtig ist.

      In diesem Video werden die Prinzipien der Asepsis, einige wichtige Techniken zur Aufrechterhaltung steriler Reagenzien und Kulturen und schließlich einige ihrer Anwendungen in der Umweltwissenschaft vorgestellt.

      Das Ziel der Verwendung aseptischer Techniken besteht darin, eine sterile Arbeitsumgebung, Ausrüstung und Reagenzien zu schaffen und aufrechtzuerhalten, um so die Kontamination biologischer Proben zu minimieren. Häufige Kontaminationsquellen sind luftgetragene Mikroorganismen, Mikroben, die auf dem Labortisch oder der Ausrüstung vorhanden sind, und solche aus Haar, Körper und Kleidung des Forschers.

      Zwei Arten von Mitteln sind von zentraler Bedeutung, um Verunreinigungen im Labor zu entfernen oder zu verhindern: desinfizierende Chemikalien und Hitze.Lösungen wie 70 % Ethanol und verdünntes Bleichmittel werden häufig verwendet, um Geräte, Arbeitsflächen und Handschuhe von Experimentatoren zu desinfizieren, bevor aseptische Arbeiten durchgeführt werden.

      Gleichzeitig können Mikroben auf oder in Werkzeugen, Glaswaren und flüssigen Medien in einem Autoklaven, einer Kammer, in der der Inhalt durch Hochtemperatur-Druckdampf sterilisiert wird, durch Hitze abgetötet werden. Darüber hinaus können Werkzeuge wie Glasstäbe, die zum Auftragen von Beschichtungen verwendet werden, und Impfösen aus Metall unter Verwendung einer Flammenquelle, wie einem Bunsenbrenner, hitzesterilisiert werden.

      Die Verwendung einer Flammenquelle ist auch eine der gebräuchlichsten Methoden, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme verursacht Luftkonvektion, wodurch ein Aufwind erzeugt wird, der alle luftgetragenen Verunreinigungen aus der Nähe des Brenners hebt und ein "steriles Feld" erzeugt, in dem aseptische experimentelle Arbeiten durchgeführt werden können.

      Nachdem Sie nun die Prinzipien der aseptischen Techniken und ihre Bedeutung verstanden haben, gehen wir ein Protokoll zur Schaffung einer aseptischen Arbeitsumgebung, zur Herstellung steriler Nährmedien und zur aseptischen Übertragung von Bakterien zwischen verschiedenen Kulturbedingungen durch.

      Vor Beginn aseptischer Arbeiten ist es für den Experimentator wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung oder PSA anzulegen. Dadurch soll sowohl eine Kontamination der Proben und Laborkulturen durch den Experimentator als auch die Übertragung potenziell pathogener Keime auf den Forscher verhindert werden. Zu den PSA-Artikeln gehören ein Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille.

      Der nächste Schritt besteht darin, die zur Kultivierung der mikrobiellen Proben zu verwendenden Wachstumsmedien richtig zu sterilisieren und zu lagern. Wiegen Sie zuerst die richtige Menge an festen Medienkomponenten ab und fügen Sie sie in einem autoklavierbaren Behälter zu dem richtigen Volumen des vom Hersteller angegebenen flüssigen Lösungsmittels, wie z , und die festen Mediumkomponenten bei schwacher Hitze und Rühren auflösen.

      Schließen Sie die mittleren Behälter. Wenn Sie ein Glasgefäß mit Schraubverschluss verwenden, achten Sie darauf, den Verschluss nicht vollständig festzuziehen, da sich die Luft in den Gefäßen durch die Erwärmung beim Autoklavieren ausdehnt und entweichen muss. Ohne Entweichen könnte das Gas zum Bersten des Gefäßes führen. Legen Sie ein Stück Autoklavierband auf die Gefäße und autoklavieren Sie die Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers, z. B. 20 min bei 121 °C. Stellen Sie nach dem Autoklavieren sicher, dass die Streifen auf den Autoklavenbändern schwarz geworden sind, was anzeigt, dass die richtige Temperatur erreicht wurde.

      Lassen Sie flüssige Nährmedien auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie je nach Bedarf bei Raumtemperatur oder gekühlt. Feste Nährmedien auf Agarbasis auf ca. 50 °C abkühlen lassen und dann in sterile Petrischalen gießen. Lassen Sie den Agar abkühlen und erstarren, bevor Sie ihn bei der entsprechenden Temperatur lagern.

      Bei Medien, die aufgrund hitzeempfindlicher Komponenten nicht autoklavierbar sind, filtersterilisieren mit einem 0,22-μm-Filter.

      Eine Kerntechnik in der mikrobiologischen Arbeit ist der aseptische Transfer von Bakterienkulturen zwischen verschiedenen Wachstumsmedien, sowohl fest als auch flüssig. Reinigen Sie die Labortischoberfläche vor Beginn mit einem Desinfektionsmittel. Dies verringert das Risiko einer Kontamination von Kulturen oder sterilen Medien.

      Beim Übertragen von Bakterienkulturen wird üblicherweise ein Werkzeug verwendet, das als Impföse bezeichnet wird und vor der Verwendung durch Erhitzen in einer Flamme sterilisiert werden muss.

      Schalten Sie eine Flammenquelle ein. Führen Sie die Impföse langsam durch die Flammenspitze. Die Schleife wird rotglühend. Um eine Bakterienkolonie von einer festen Agarplatte zu übertragen, öffnen Sie die Petrischale leicht und klopfen Sie die heiße Impföse vorsichtig auf einen leeren Teil der Agaroberfläche, um eine Hitzeabtötung der Bakterien zu vermeiden. Kratzen Sie eine einzelne Kolonie mit der Impföse ab und schließen Sie die Platte.

      Um Bakterien aus einem flüssigen Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie die Kappe vom Kulturbehälter. Um eine Kontamination zu vermeiden, vermeiden Sie es, die Kappe auf den Tisch zu legen. Führen Sie die Mündung des Behälters 2-3 Mal durch den heißesten Teil der Flamme. Berühren Sie dann die heiße, sterilisierte Impföse vorsichtig auf der Innenseite des Behälters und lassen Sie ihn abkühlen, bevor Sie ihn in die Kulturbrühe einführen. Entfernen Sie eine Schleife der Kultur und schließen Sie sofort die Kappe.

      Um die erhaltenen Bakterien in ein steriles Nährmedium zu überführen, entfernen Sie die Kappe von einem Behälter mit der sterilen Brühe und führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch die Flamme. Senken Sie dann die Impföse vorsichtig in das Medium und rühren Sie vorsichtig, um die Bakterien freizusetzen. Schließen Sie sofort die Kappe. Sterilisieren Sie die Impföse nach Gebrauch.

      Wenn Sie Bakterien auf eine sterile Agarplatte übertragen, öffnen Sie den Deckel einer frischen Petrischale mit ungeimpftem Agar. Streichen Sie die Impföse mit der Bakterienkultur hin und her über einen Sektor des Agars. Sterilisieren Sie die Schlaufe und kühlen Sie sie ab, indem Sie einen leeren Teil des Agars berühren, dann einen weiteren Strich auf dem Agar in einem stumpfen Winkel zum ersten Strich machen. Achten Sie darauf, den ersten Strich bei den ersten 1-2 Hüben zu kreuzen, aber vermeiden Sie es, den ersten zu berühren Streifen bei nachfolgenden Schlägen. Wiederholen Sie die Sterilisation und das Ausstreichen noch 2 Mal. Schließen Sie die Petrischale und sterilisieren Sie die Impföse.

      Nach der Beimpfung sollte die Brühe oder Agarplatte bei der idealen Wachstumstemperatur für den jeweiligen Mikroorganismus inkubiert werden, um eine lebensfähige Kultur zu erhalten. Auf festem Medium wäre ein Rasen oder ein kontinuierlicher Bakterienstrang auf dem Agar sichtbar, der von den ersten beiden Strähnen bedeckt ist, aber einzelne Kolonien sollten auf dem letzten Streak erhalten werden. Schlechte aseptische Techniken würden zum Wachstum von Schimmel und anderen Verunreinigungen auf der Platte führen.

      Aseptische Techniken sind bei vielen Experimenten mit mikrobiellen Proben aus der Umgebung wichtig. In dieser Studie isolierten die Forscher Bakteriophagen, bei denen es sich um bakterieninfizierende Viren handelt, aus dem gewöhnlichen Bodenbakterium Arthrobacter. Arthrobacter-Kulturen wurden zunächst unter aseptischen Bedingungen gezüchtet. Bodenproben wurden dann gewaschen und in Phagenpuffer filtriert, und die Phagenlösung wurde mit der Bakterienkultur vermischt und auf Agarplatten ausplattiert. Auf dem Teller bildete sich ein Bakterienrasen, aber an den Stellen, an denen das Virus die Bakterien infiziert und abgetötet hatte, bildeten sich Lichtungen oder "Plaques". Phagen könnten dann aus diesen Plaques für weitere Untersuchungen gereinigt werden.

      Neben der Verwendung von Bunsen-Brennern können aseptische Arbeitsumgebungen auch in speziellen Arbeitsstationen, den sogenannten Laminar-Flow-Hauben, aufrechterhalten werden, die einen gerichteten Luftstrom und Filter verwenden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Hier arbeiteten Wissenschaftler in einer Strömungshaube, um potenziell pathogene Bakterien und Viren aus Wasserproben zu isolieren. Diese Isolate wurden dann zusammen mit Amöben kultiviert. Da Amöben normalerweise Bakterien fressen oder "phagozytieren", können alle Bakterien, die der Amöbenverdauung widerstehen und in diesen Organismen verbleiben, möglicherweise auch in menschlichen Zellen lebensfähig bleiben und Krankheiten verursachen.

      Sterile Bedingungen ermöglichen schließlich eine detaillierte Untersuchung ökologischer Mechanismen wie der Bildung von Wurzelknollen in Hülsenfrüchten – bakteriengefüllte Organe, die atmosphärischen Stickstoff in Ammoniak „fixieren“, das von der Pflanze für das Wachstum verwendet wird. Forscher haben hier "Mikrokosmen" geschaffen, um den Nodulationsprozess zu untersuchen, indem sie gekerbte Petriplatten mit Pflanzenwachstumsmedium verwendeten, Setzlinge hineinsetzten und die Setzlinge mit knötchenbildenden Rhizobienbakterien inokulierten. Die aseptische Umgebung der Durchflusshaube verhindert eine Kontamination der Kulturen mit anderen Bakterien oder Pilzen.

      Sie haben sich gerade das Video von JoVE über aseptische Techniken in der Umweltwissenschaft angesehen. Sie sollten jetzt verstehen, warum aseptische Arbeitsbedingungen wichtig sind, wie man mikrobiologische Experimente aseptisch durchführt und einige Anwendungen aseptischer Techniken in der Umweltforschung. Wie immer danke fürs Zuschauen!


      Gewinnung einer Reinkultur von Mikroorganismen: 6 Methoden

      Die folgenden Punkte heben die sechs wichtigsten Methoden hervor, die zur Gewinnung einer Reinkultur von Mikroorganismen verwendet werden. Die Methoden sind: 1. Streak Plate-Methode 2. Platten gießen Methode 3. Spread-Plate-Methode 4. Serielle Verdünnungsmethode 5. Methoden zur Einzelzellisolierung 6. Anreicherungskulturmethode.

      1. Streak-Platten-Methode:

      Diese Methode wird am häufigsten verwendet, um Reinkulturen von Bakterien zu isolieren. Eine kleine Menge Mischkultur wird auf die Spitze einer Impföse/-nadel gegeben und über die Oberfläche des Agarmediums ausgestrichen (Abb. 16.13). Die aufeinanderfolgenden Strähnen “verdünnen” das Inokulum ausreichend und die Mikroorganismen werden voneinander getrennt.

      In der Regel empfiehlt es sich, eine zweite Platte mit derselben Schlaufe/Nadel ohne erneute Beimpfung auszustreichen. Diese Platten werden inkubiert, um das Wachstum von Kolonien zu ermöglichen. Das Schlüsselprinzip dieser Methode besteht darin, dass durch Ausstreichen ein Verdünnungsgradient über die Oberfläche der Petriplatte aufgebaut wird, während sich Bakterienzellen auf der Agaroberfläche ablagern.

      Aufgrund dieses Verdünnungsgradienten findet kein konfluentes Wachstum auf dem Teil des Mediums statt, in dem sich wenige Bakterienzellen ablagern. Vermutlich ist jede Kolonie die Nachkommenschaft einer einzelnen mikrobiellen Zelle und repräsentiert somit einen Reinkulturklon. Solche isolierten Kolonien werden separat unter Verwendung einer sterilen Impföse/-nadel aufgenommen und erneut auf frisches Medium ausgestrichen, um die Reinheit sicherzustellen.

      2. Platten gießen Methode:

      Bei dieser Methode werden verdünnte Proben, die mit geschmolzenem Agarmedium vermischt sind, ausplattiert (Abb. 16.14). Das Hauptprinzip besteht darin, das Inokulum in aufeinanderfolgenden Röhrchen zu verdünnen, die verflüssigtes Agarmedium enthalten, um eine gründliche Verteilung der Bakterienzellen innerhalb des Mediums zu ermöglichen.

      Hier wird die gemischte Bakterienkultur direkt in Röhrchen verdünnt, die geschmolzenes Agarmedium enthalten, das im flüssigen Zustand bei einer Temperatur von 42-45°C gehalten wird (Agar erstarrt unter 42°C). Die Bakterien und das geschmolzene Medium werden gut vermischt.

      Der Inhalt jedes Röhrchens wird in separate Petrischalen gegossen, erstarren gelassen und dann inkubiert. Bei der Entwicklung von Bakterienkolonien stellt man fest, dass sich sowohl innerhalb des Agarmediums (Untergrundkolonien) als auch auf dem Medium (Oberflächenkolonien) isolierte Kolonien entwickeln. Diese isolierten Kolonien werden dann mit einer Impföse aufgenommen und auf eine andere Petriplatte ausgestrichen, um die Reinheit zu gewährleisten.

      Die Plattengussmethode hat folgende Nachteile:

      (i) Zum Aufnehmen von unterirdischen Kolonien müssen sie aus dem Agarmedium ausgegraben werden, wodurch andere Kolonien gestört werden, und

      (ii) Die zu isolierenden Mikroben müssen in der Lage sein, einer vorübergehenden Exposition gegenüber der Temperatur von 42-45°C des Flüssigagarmediums standzuhalten, daher erweist sich diese Technik als ungeeignet für die Isolierung von psychrophilen Mikroorganismen.

      Das Gießplattenverfahren wird jedoch neben der Verwendung bei der Isolierung von Reinkulturen auch zur Bestimmung der Anzahl der in einer Kultur vorhandenen lebensfähigen Bakterienzellen verwendet.

      3. Spread-Plate-Methode:

      Bei dieser Methode (Abb. 16.15) wird die Mischkultur oder die Mikroorganismen nicht im Schmelzagarmedium verdünnt (im Gegensatz zur Plattengussmethode), sondern in einer Reihe von Röhrchen mit steriler Flüssigkeit, normalerweise Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung, verdünnt.

      Ein Tropfen der so verdünnten Flüssigkeit aus jedem Röhrchen wird auf die Mitte einer Agarplatte gegeben und mit einem sterilisierten gebogenen Glasstab gleichmäßig über die Oberfläche verteilt. Das Medium wird nun inkubiert.

      Wenn sich die Kolonien auf den Agarmediumplatten entwickeln, stellt man fest, dass es einige Platten gibt, auf denen gut isolierte Kolonien wachsen. Dies geschieht als Folge der Trennung einzelner Mikroorganismen durch Verteilen des Tropfens der verdünnten Flüssigkeit auf dem Medium der Platte.

      Die isolierten Kolonien werden aufgenommen und auf frisches Medium übertragen, um die Reinheit sicherzustellen. Im Gegensatz zum Gießplattenverfahren entwickeln sich bei diesem Verfahren nur Oberflächenkolonien und die Mikroorganismen müssen der Temperatur des geschmolzenen Agarmediums nicht standhalten.

      4. Serielle Verdünnungsmethode:

      Wie bereits erwähnt, wird dieses Verfahren üblicherweise verwendet, um Reinkulturen jener Mikroorganismen zu erhalten, die noch nicht erfolgreich auf festen Medien kultiviert wurden und nur in flüssigen Medien wachsen.

      Ein Mikroorganismus, der in einer Mischkultur vorherrscht, kann durch eine Reihe von Verdünnungen in reiner Form isoliert werden. Das Inokulum wird einer seriellen Verdünnung in einem sterilen flüssigen Medium unterzogen, und eine große Anzahl von Röhrchen mit sterilem flüssigem Medium wird mit Aliquots jeder aufeinanderfolgenden Verdünnung beimpft.

      Das Ziel dieser Verdünnung besteht darin, eine Reihe von Röhrchen mit einer Mikrobensuspension zu beimpfen, die so verdünnt ist, dass einige Röhrchen das Wachstum nur einer einzelnen Mikrobe aufweisen. Nehmen wir der Einfachheit halber an, wir haben eine Kultur mit 10 ml Flüssigmedium, die 1.000 Mikroorganismen enthält (Abb. 16.16.), d. h. 100 Mikroorganismen/ml Flüssigmedium.

      Wenn wir 1 ml dieses Mediums entnehmen und mit 9 ml frischem sterilem Flüssigmedium mischen, hätten wir dann 100 Mikroorganismen in 10 ml oder 10 Mikroorganismen/ml. Wenn wir 1 ml dieser Suspension zu weiteren 9 ml hinzufügen. von frischem, sterilem Flüssigmedium würde jeder ml nun einen einzelnen Mikroorganismus enthalten.

      Wenn dieses Röhrchen mikrobielles Wachstum zeigt, besteht eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit, dass dieses Wachstum auf die Einführung eines einzelnen Mikroorganismus in das Medium zurückzuführen ist und die Reinkultur dieses Mikroorganismus darstellt.

      5. Methoden zur Einzelzellisolierung:

      Auf diese Weise wird aus der Mischkultur eine einzelne Zelle der gewünschten Art herausgepickt und wachsen gelassen.

      Folgende zwei Methoden sind im Einsatz:

      ich. Kapillarpipettenmethode:

      Mehrere kleine Tropfen eines geeignet verdünnten Kulturmediums werden mit einer sterilen Pipette, die auf eine Kapillare gezogen wird, auf ein steriles Deckglas gegeben. Dann untersucht man jeden Tropfen unter dem Mikroskop, bis man einen solchen Tropfen findet, der nur einen Mikroorganismus enthält. Dieser Tropfen wird mit einer sterilen Kapillarpipette auf frisches Medium entfernt. Der einzelne im Tropfen vorhandene Mikroorganismus beginnt sich zu vermehren, um eine Reinkultur zu ergeben (Abb. 16.17).

      ii. Mikromanipulator-Methode:

      Es wurden Mikromanipulatoren gebaut, die es erlauben, eine einzelne Zelle aus einer Mischkultur herauszupicken. Dieses Instrument wird in Verbindung mit einem Mikroskop verwendet, um eine einzelne Zelle (insbesondere Bakterienzelle) aus einem hängenden Tropfenpräparat zu entnehmen. Der Mikromanipulator verfügt über Mikrometereinstellungen, mit denen seine Mikropipette nach rechts und links, vor und zurück sowie nach oben und unten bewegt werden kann.

      Eine Reihe von hängenden Tropfen einer verdünnten Kultur wird mit einer Mikropipette auf ein spezielles steriles Deckglas gegeben. Nun wird ein hängender Tropfen gesucht, der nur eine einzige Mikroorganismenzelle enthält.

      Diese Zelle wird durch leichtes Absaugen in die Mikropipette gezogen und dann in einen großen Tropfen sterilen Mediums auf einem anderen sterilen Deckglas überführt. Wenn die Anzahl der Zellen in diesem Tropfen infolge der Vermehrung ansteigt, wird der Tropfen in ein Kulturröhrchen mit einem geeigneten Medium überführt. Dies ergibt eine Reinkultur des benötigten Mikroorganismus.

      Die Vorteile dieser Methode sind, dass man ziemlich sicher sein kann, dass die Kulturen aus einer einzelnen Zelle stammen und man Stämme mit in der Art erhalten kann. Die Nachteile sind, dass die Ausrüstung teuer ist, ihre Handhabung sehr mühsam ist und eine erfahrene Bedienungsperson erforderlich ist. Aus diesem Grund ist diese Methode der Anwendung in hochspezialisierten Studien vorbehalten.

      6. Methode der Anreicherungskultur:

      Im Allgemeinen wird es verwendet, um diejenigen Mikroorganismen zu isolieren, die in relativ geringer Zahl vorhanden sind oder die im Vergleich zu den anderen in der Mischkultur vorhandenen Arten langsame Wachstumsraten aufweisen.

      Die Anreicherungskulturstrategie bietet eine speziell entworfene kulturelle Umgebung, indem ein spezifischer Nährstoff in das Medium aufgenommen und die physikalischen Bedingungen der Inkubation modifiziert werden. Das Medium bekannter Zusammensetzung und spezifischer Inkubationsbedingungen begünstigt das Wachstum der gewünschten Mikroorganismen, ist jedoch für das Wachstum anderer Arten von Mikroorganismen ungeeignet.


      Schau das Video: Das ethische Dilemma # Stefan Vogt # Corona und die 3Gs - Gesundheit, Glaube und Gewissensfreiheit (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Terika

    Ja, das Leben ist eine gefährliche Sache

  2. Parnall

    Ich gratuliere der Idee großartig und zeitgemäß

  3. Ambrosio

    Stimmt zu, sehr nützliches Zimmer

  4. Maugrel

    Welche Worte notwendig ... großartig, die bemerkenswerte Idee

  5. Alhsom

    Nun, was dann?



Eine Nachricht schreiben