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HIV und Wirksamkeit des Inhibitorcocktails gegenüber einem einzelnen Inhibitor

HIV und Wirksamkeit des Inhibitorcocktails gegenüber einem einzelnen Inhibitor


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Ich suche nach Klärung der Antwort auf diese Frage. Es ist in meinem Biochemie-Kurs, aber ich dachte, das ist mehr Biologie als Chemie, also frage ich es hier.

Die Frage ist:

Eine der wirksamsten Behandlungen für HIV-positive Personen war die Einnahme von Protease-Inhibitor-Cocktails. Für die Reifung des Virus sind bestimmte Proteasen erforderlich, und diese Inhibitoren verhindern, dass sie funktionieren. Ein Cocktail von Hemmstoffen bedeutet, dass mehrere Hemmstoffe gleichzeitig eingesetzt werden. Warum sollte ein Cocktail wirksamer sein als ein einzelner Inhibitor?

Meine Antwort darauf ist, dass es mehr als eine Mutation des Virus geben könnte und mit jeder Mutation eine Variation der spezifischen Protease. Der Protease-Cocktail würde sich also gegen ein breiteres Spektrum des mutierten Virus verteidigen.

Ist das richtig? Gibt es eine Antwort, die die Beschreibung von Epitopen beinhalten könnte?


Ihre Antwort ist richtig. HIV-1 kodiert für eine einzelne homodimere Asparaginprotease, wobei jedes Monomer das klassische Asp-Thr-Gly-Motiv enthält und das aktive Zentrum des Dimers mit den beiden monomeren aktiven Zentren gebildet wird, wodurch eine Spalte entsteht, in der die Proteolyse stattfindet. Darin wirkt Wasser als Nukleophil in Verbindung mit dem Asparaginsäurerest, um die Peptidbindung im Zielprotein zu hydrolysieren.

WikiMedia: Aspartyl-Protease-Mechanismus.png">

WikiMedia: HIV-replication-cycle.svg

Protease-Inhibitoren wirken, indem sie in der Bindungsspalte "kleben", wodurch das Aspartat verdeckt und die Bindung der Zielproteine ​​verhindert wird. Diese niedermolekularen Inhibitoren sind jedoch sehr spezifisch für HIV-1 und die Aminosäurereste, die die Bindungsspalte bilden, andernfalls könnten sie möglicherweise eine oder mehrere der vielen Aspartyl-Proteasen hemmen, die unser Körper auf natürliche Weise produziert. Während es nicht sehr wahrscheinlich ist, dass eine destruktive Mutation im Asp-Thr-Gly-Motiv zu einem replikationskompetenten Virus führen würde, können andere konservativere Mutationen in der Bindungsspalte auftreten, die es dem Ziel immer noch ermöglichen, zu binden und gespalten zu werden. Abhängig vom genauen verwendeten Protease-Inhibitor kann jedoch eine einzelne Mutation, selbst wenn sie konservativ ist, immer noch ausreichen, um die Bindungseffizienz des Inhibitors dramatisch zu verringern und es der Protease zu ermöglichen, ihre Funktionsfähigkeit teilweise oder vollständig aufrechtzuerhalten. Aus diesem Grund werden Cocktails von Inhibitoren verwendet: Sie sind für ihre Bindung jeweils von unterschiedlichen Aminosäuren abhängig. Wenn also irgendwann Mutationen auftreten, die die Aktivität eines Inhibitors beeinträchtigen, können andere dennoch unbeeinflusst bleiben. Evolutionär gesehen üben die Inhibitoren einen enormen Selektionsdruck auf das Virus aus, was in Kombination mit dem von Natur aus "schlampigen" Replikationsprozess von HIV-1 dazu führt, dass in relativ kurzer Zeit Mutanten auftauchen.

Es gibt zwei Arten von Epitopen im adaptiven Immunsystem: solche, die von Antikörpern und B-Zellen erkannt werden, und solche, die von T-Zellen erkannt werden, wenn sie im Kontext von MHC präsentiert werden. Antikörper-Epitope finden sich in der Regel auf der Oberfläche eines Erregers oder einer erreger-infizierten Zelle (im Zusammenhang mit Infektionskrankheiten), als Proteine ​​oder andere Verbindungen, die eine Immunantwort auslösen können und sich nur vollständig im Erreger befinden oder infiziert sind Zelle stehen nicht für die Bindung zur Verfügung. T-Zell-Epitope hingegen sind lineare Peptidfragmente (und manchmal andere Moleküle, wie Glykolipide), die durch interne Prozessierung in der Antigen-präsentierenden Zelle erzeugt werden, und sind normalerweise ziemlich repräsentativ für den vollständigen Inhalt der Zelle, nativ und fremd. Native Epitope erzeugen im Allgemeinen keine Immunantworten - wenn sie dies tun, tritt Autoimmunität auf. Fremde Epitope werden von zirkulierenden T-Zellen erkannt und helfen, eine Immunantwort gegen die infizierten Zellen auszulösen. (Als Randbemerkung, da HIV-1 eine Untergruppe von T-Zellen infiziert, ist dies eine Möglichkeit für sie, der Immunerkennung zu entgehen). Mutationen im Protease-Protein können einige der von ihm produzierten Epitope beeinflussen, aber diese Mutationen erhöhen die Sichtbarkeit des Immunsystems genauso wahrscheinlich wie sie verringern, so dass es insgesamt keinen Nettogewinn oder -verlust gibt.


Laut Wikipedia:

HIV-Protease-Inhibitoren sind peptidähnliche Chemikalien, die die Wirkung der Aspartyl-Protease des Virus kompetitiv hemmen. Diese Medikamente verhindern die proteolytische Spaltung von HIV-Gag- und Pol-Polyproteinen, die wesentliche strukturelle und enzymatische Komponenten des Virus enthalten. Dies verhindert die Umwandlung von HIV-Partikeln in ihre reife infektiöse Form.

Konkurrenzhemmung bedeutet, dass sie die Umwandlung nur verlangsamt, aber nicht stoppt. Beim Aufbau eines Virus sprechen wir von einem mehrstufigen Prozess. Durch die Verwendung mehrerer Inhibitoren verlangsamen wir mehrere Schritte in diesem Prozess. Es ist also viel effektiver, als nur einen einzigen Inhibitor zu verwenden, um nur einen einzigen Schritt im Prozess zu verlangsamen…


Wie wirken Protease-Inhibitoren?

Proteasehemmer sind antivirale Medikamente. Sie unterbrechen die Art und Weise, wie HIV eine gesunde Zelle verwendet, um mehr Viren zu produzieren. Wenn HIV in eine gesunde Zelle eindringt, besteht sein einziges Ziel darin, mehr Viren zu erzeugen, um andere gesunde Zellen zu infizieren. Es tut dies, indem es die Zelle dazu bringt, bestimmte Proteine ​​​​zu produzieren, die das Virus verwenden kann, um sich selbst zu kopieren. Zwei der vom Virus verwendeten Proteine ​​sind die reverse Transkriptase und die Protease. Das Ziel des Protease-Inhibitors besteht darin, die Protease daran zu hindern, beim Aufbau eines neuen Virus zu helfen.

Das obige Diagramm zeigt, wie das Virus in die Zelle eindringt (1), die Zelle neue Proteine ​​​​bildet (2-3), die Proteine ​​​​ein neues Virus bilden (4) und die Zelle das neue Virus freisetzt, um andere Zellen zu infizieren (5). Es zeigt auch einige Schritte im Prozess, die durch Protease-Inhibitoren und andere antivirale Medikamente (Reverse-Transkriptase-Inhibitoren) unterbrochen werden können, die zusammen mit Protease-Inhibitoren eingenommen werden.

Was können Proteasehemmer bewirken?

Proteasehemmer sind die stärksten bisher erhältlichen Anti-HIV-Medikamente. Obwohl viele verschiedene Faktoren beeinflussen, wie gut ein Medikament bei einer Person wirkt, hatten einige Menschen, die Proteasehemmer eingenommen haben, die folgenden Vorteile:

Erhöhung der CD4 (t-Zellen)-Zahlen, die bei der Bekämpfung von Infektionen helfen können

Abnahme der Virusmenge im Blut (Viruslast), was den Krankheitsprozess verlangsamen kann

Gefühl einer verbesserten allgemeinen Gesundheit und Fähigkeit, mehr ihrer üblichen Aktivitäten zu verrichten (z. B. Arbeit, Reisen, Kontakte knüpfen)

Die Forscher sind sich nicht sicher, wie lange Protease-Inhibitoren bei einer mit HIV infizierten Person wirken, aber sie haben in Studien vielversprechende Ergebnisse gesehen. Sie hoffen, dass die Menschen aufgrund der Vorteile dieser neuen Medikamente ein längeres und gesünderes Leben führen werden.

Ist das ein Heilmittel?

Proteasehemmer werden nicht als Heilmittel bezeichnet, da die Forscher noch nicht wissen, wie gut sie bei verschiedenen Menschen wirken. Bei einigen Menschen ist die Viruslast auf ein Niveau gesunken, das für aktuelle Tests zu niedrig ist. Obwohl das Virus in ihrem Blut nicht nachweisbar ist, glauben Ärzte, dass HIV immer noch in ihrem Körper ist und dass es sich schnell vermehren würde, wenn sie die Einnahme des Proteasehemmers abbrechen. Bei anderen Menschen wirken Proteasehemmer möglicherweise nicht so gut oder der Nutzen hält möglicherweise nicht an. Klinische Studien werden derzeit helfen, Fragen zu beantworten, wo sich HIV "versteckt" und warum Menschen mit Proteasehemmern unterschiedliche Ergebnisse erzielen.

Welchen Proteasehemmer nehme ich?

Es gibt fünf zugelassene Protease-Inhibitoren: Ritonavir (Norvir) und Nelfinavir (Viracept) sind für Erwachsene und Kinder bestimmt, während indinavir (Crixivan) und die beiden Formen von Saquinavir (Invirase und Fortovase) sind nur für Erwachsene zugelassen. Invirase wurde 1995 zugelassen und Fortovase, eine neue, stärkere Form von Saquinavir wurde 1997 zugelassen. Das Unternehmen, das beide Medikamente herstellt, wird Invirase auch weiterhin Menschen zur Verfügung stellen, die diese Form bereits einnehmen Saquinavir bis Frühjahr 1998. Danach steht es ihnen im Rahmen eines eingeschränkten Vertriebsprogramms zur Verfügung. Eine Entscheidung über das einzunehmende Medikament sollte mit einem Arzt getroffen werden, der Ihren individuellen Zustand kennt und über medizinische Kenntnisse der HIV-Erkrankung verfügt. Indem Sie sich über die verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten informieren, können Sie mit Ihrem Arzt über die Risiken und Vorteile verschiedener Medikamentenkombinationen sprechen.


Warnsignale für die Wirksamkeit des HIV-Wundermittels in Subsahara-Afrika aufgrund genetischer Mutationen

Dolutegravir, die derzeitige Erstlinienbehandlung für HIV, ist in Subsahara-Afrika möglicherweise nicht so wirksam wie erhofft, schlägt eine neue Studie vor, die am Welt-AIDS-Tag veröffentlicht wurde. Die Studie stellt fest, dass dieses sogenannte „Wundermittel“ bei Patienten, die gegen ältere Medikamente resistent sind, möglicherweise weniger wirksam ist.

Während HIV sich selbst kopiert und repliziert, kann es Fehler oder ‘Mutationen’ in seinem genetischen Code (seiner RNA) entwickeln. Während ein Medikament das Virus anfänglich möglicherweise unterdrücken oder sogar abtöten kann, können bestimmte Mutationen es dem Virus ermöglichen, eine Resistenz gegen seine Wirkungen zu entwickeln. Wenn sich ein mutierter Stamm innerhalb einer Population ausbreitet, kann dies bedeuten, dass einst wirksame Medikamente nicht mehr in der Lage sind, Menschen zu behandeln.

Die HIV-Behandlung besteht normalerweise aus einem Medikamentencocktail, der eine Art von Medikament enthält, das als nicht-nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Hemmer (NNRTI) bekannt ist. In den letzten Jahren hat HIV jedoch begonnen, Resistenzen gegen NNRTIs zu entwickeln. In weiten Teilen Afrikas südlich der Sahara sind zwischen 10 und 15 % der Patienten mit einem gegen diese Medikamente resistenten HIV-Stamm infiziert. Wenn ein Patient mit einem NNRTI-resistenten Stamm infiziert ist, besteht für ihn ein zwei- bis dreifach erhöhtes Risiko, dass die medikamentöse Therapie versagt.

Im Jahr 2019 begann die Weltgesundheitsorganisation, Dolutegravir als bevorzugte Erstlinienbehandlung für HIV in den meisten Bevölkerungsgruppen zu empfehlen. Dolutegravir wurde als „Wundermittel“ bezeichnet, weil es sicher, wirksam und kostengünstig war und Wissenschaftler in klinischen Studien keine Arzneimittelresistenz dagegen festgestellt hatten. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den Erfolg von Dolutegravir gegen zirkulierende HIV-Stämme in Subsahara-Afrika.

In einer heute (1. Dezember 2020) veröffentlichten Studie in Naturkommunikation, untersuchte ein internationales Forscherteam aus Südafrika, Großbritannien und den USA den genetischen Code von HIV, um festzustellen, ob Mutationen der Arzneimittelresistenz bei 874 mit HIV lebenden Freiwilligen den Behandlungserfolg beeinflussten. Die Personen wurden in eine klinische Studie für Personen aufgenommen, die eine HIV-Behandlung einleiten, um zwei Medikamentenschemata zu vergleichen: Efavirenz, ein NNRTI und eine vorherige Erstlinientherapie in der Region, und Dolutegravir.

Das Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob eine Arzneimittelresistenz gegen Efavirenz vor Beginn der Behandlung den Behandlungserfolg (Unterdrückung des Virus im Blut) in den ersten beiden Behandlungsjahren mit beiden dieser beiden Schemata beeinflusst.

Erwartungsgemäß reduzierte das Vorliegen von Arzneimittelresistenzen die Erfolgschancen der Behandlung bei Personen, die Efavirenz einnahmen, erheblich und unterdrückte das Virus über 96 Wochen bei 65 % der Teilnehmer im Vergleich zu 85 % der nicht resistenten Personen. Unerwarteterweise galt das gleiche Muster jedoch für Personen, die Dolutegravir-basierte Behandlungen erhielten: 66 % der Patienten mit Efavirenz-Resistenzmutationen blieben über 96 Wochen supprimiert, verglichen mit 84 % der Patienten ohne Mutationen. Diese Beziehungen galten auch nach Berücksichtigung anderer Faktoren, wie z. B. der Therapietreue.

“Wir erwarteten, dass Efavirenz bei Patienten mit HIV-resistenten NNRTI-Stämmen weniger wirksam sein würde,”, sagte Dr. Mark Siedner, Fakultätsmitglied am Africa Health Research Institute in KwaZulu-Natal, Südafrika und am Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts . “Völlig überrascht hat uns, dass Dolutegravir – eine andere Medikamentenklasse, die im Allgemeinen bei Resistenzen wirksam ist – auch bei Menschen mit diesen resistenten Stämmen weniger wirksam wäre.

“Wir arbeiten jetzt daran, herauszufinden, ob dies am Virus oder an den Teilnehmern lag – zum Beispiel, wenn Menschen mit Resistenzen ihre Pillen seltener regelmäßig einnehmen. So oder so, wenn dieses Muster zutrifft, könnte es weitreichende Auswirkungen auf unsere Vorhersagen zur langfristigen Behandlungskontrolle für Millionen von Menschen haben, die Dolutegravir in der Region einnehmen.”

Professor Ravi Gupta vom Department of Medicine der University of Cambridge sagte: „Dies ist eine große Sorge. Dolutegravir wurde sehr viel als „Wundermittel“ angesehen, aber unsere Studie deutet darauf hin, dass es bei einer erheblichen Anzahl von Patienten, die gegen eine andere wichtige Klasse antiretroviraler Arzneimittel resistent sind, möglicherweise nicht so wirksam ist.”

Die Forscher sagen, es sei nicht klar, warum Efavirenz-resistente Mutationen die Anfälligkeit von Dolutegravir beeinflussen sollten, obwohl eine Hypothese ist, dass Integrase-Inhibitoren wie Dolutegravir das Virus dazu bringen, sich schneller zu replizieren und zu mutieren, was wiederum in einem evolutionären Wettrüsten eine Resistenz gegen das neue Medikament entwickelt . Alternativ könnte es an einer schlechten Adhärenz von Behandlungsschemata liegen, obwohl die Analyse die Adhärenz durch zwei unabhängige Methoden berücksichtigte. Weitere Forschung ist erforderlich, um herauszufinden, warum.

Professor Gupta fügte hinzu: “Dies zeigt, dass wir dringend Point-of-Care-Tests priorisieren müssen, um Menschen mit HIV-Resistenz, insbesondere gegen Efavirenz, zu identifizieren und die Therapietreue genauer und genauer zu überwachen. Die Entwicklung solcher Tests befindet sich in einem fortgeschrittenen Stadium, aber es fehlt an Investitionen von Geldgebern und philanthropischen Spendern. Wir brauchen dringend Agenturen und Einzelpersonen, die vorankommen und diese Programme unterstützen.

“Außerdem müssen wir einen breiten Zugang zur Überwachung der Viruslast ermöglichen, damit wir diejenigen finden, die Probleme haben, ihnen geeignetere Therapien geben und das Auftreten von Resistenzen begrenzen können, wenn die Therapie bei Patienten versagt.”

Referenz: “Reduzierte Wirksamkeit von HIV-1-Integrase-Inhibitoren bei Patienten mit Arzneimittelresistenzmutationen in der reversen Transkriptase” von Mark J. Siedner, Michelle A. Moorhouse, Bryony Simmons, Tulio de Oliveira, Richard Lessells, Jennifer Giandhari, Stephen A. Kemp, Benjamin Chimukangara, Godspower Akpomiemie, Celicia M. Serenata, Willem DF Venter, Andrew Hill und Ravindra K. Gupta, 1. Dezember 2020, Naturkommunikation.
DOI: 10.1038/s41467-020-19801-x

Die Studie wurde von Forschern durchgeführt an: dem Africa Health Research Institute, University of KwaZulu-Natal, University of Witwatersrand, KwaZulu-Natal Research Innovation and Sequencing Platform und dem Center for the AIDS Program of Research in South Africa (CAPRISA), in Südafrika die University of Cambridge, die University of Liverpool und das Imperial College London in Großbritannien sowie das Massachusetts General Hospital und die Harvard Medical School, USA.

Die Forschung wurde von USAID, Unitaid, dem South African Medical Research Council (SAMRC) unterstützt, wobei das Prüfpräparat von ViiV Healthcare und Gilead Sciences sowie von Wellcome und den National Institutes of Health gespendet wurde.


Welche Arten von HIV-Medikamenten gibt es?

Die Behandlung von HIV beinhaltet die Einnahme von Medikamenten, die die Menge des Virus im Körper reduzieren. Dies wird als antiretrovirale Therapie bezeichnet. Zwei weitere Optionen, PEP und PrEP, können HIV verhindern.

HIV ist eine Virusart, die als Retrovirus bezeichnet wird. Bei einer Person mit HIV reduziert eine antiretrovirale Therapie die Menge des Virus im Körper auf sehr niedrige Werte. Wenn die Werte so niedrig sind, dass Ärzte sie für nicht nachweisbar halten, kann das Virus den Körper nicht mehr schädigen oder auf andere übertragen.

Die Centers for Disease Control and Protection (CDC) empfehlen jedem mit HIV eine konsequente Behandlung mit antiretroviraler Therapie, unabhängig davon, wie lange er es schon hat oder wie er sich aktuell verhält.

Bis heute hat die Food and Drug Administration (FDA) mehr als 20 Medikamente zur Behandlung von HIV zugelassen.

Im Vergleich zu früheren Medikamenten sind moderne Medikamente, die in der antiretroviralen Therapie verwendet werden, wirksamer, weniger toxisch und einfacher einzunehmen, wie es empfohlen wird. Sie verursachen auch weniger und weniger schwere Nebenwirkungen.

Dieser Artikel beschreibt die Medikamente, die die FDA zur Behandlung und Vorbeugung von HIV zugelassen hat, sowie deren mögliche Nebenwirkungen. Wir schauen uns auch an, wie Gesundheitsdienstleister eine geeignete HIV-Therapie auswählen.

Ziel der antiretroviralen Therapie ist es, die Viruslast bzw. die Virusmenge im Blut einer Person auf ein nicht nachweisbares Maß zu senken. Wenn die Viruslast abnimmt, deutet dies darauf hin, dass die Behandlung wirkt.

Nicht nachweisbare Mengen des Virus können das Immunsystem nicht schädigen oder an andere weitergeben. Um den HIV-Spiegel nicht nachweisbar zu halten, ist es wichtig, die Medikamente konsequent wie verordnet einzunehmen und regelmäßige Kontrollen zu besuchen.

Verschiedene Klassen antiretroviraler Medikamente greifen HIV in verschiedenen Stadien seines Lebenszyklus an – den Stadien, in denen es sich repliziert und im Körper ausbreitet.

Im Folgenden erfahren Sie mehr über die verschiedenen Arten von antiretroviralen Medikamenten, die derzeit von der FDA zugelassen sind.

Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Hemmer (NRTIs) verhindern die Replikation von HIV, indem sie ein Enzym namens Reverse Transkriptase blockieren. Dies reduziert die Viruslast von HIV im Körper einer Person.


Materialen und Methoden

Konstruktion des Protease-Gens

Das 3X-Protease (L63P, V82T, I84V)-Gen wurde unter Verwendung von ortsgerichteter Standardmutagenese einer synthetischen Proteasevariante konstruiert. Die N-terminale kodierende Sequenz von HXB2 wurde durch eine synthetische Gensequenz mit den (neutralen) Polymorphismen V3I, K14R und S37N ersetzt. Die Protease-Variante beinhaltete auch eine zusätzliche Substitution von Q7K, um eine Autoproteolyse zu verhindern (Rose et al. 1993).

Protease-Expression und -Reinigung

Das für HIV-Protease kodierende Gen wurde in das Plasmid pXC34 (ATCC) kloniert, das ein λ . enthält PL Promotor (Cheng und Patterson 1992). Die Protease wurde durch Hitzeinduktion in Escherichia coli TAP 106-Zellen unter Verwendung dieses Plasmids. Zellen aus 12 l Fermentation wurden lysiert und das Protein wurde von Einschlusskörperchen gereinigt (Hui et al. 1993). Das Einschlusskörper-Zentrifugationspellet wurde in 50% Essigsäure gelöst, gefolgt von einer weiteren Zentrifugationsrunde, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Größenausschlusschromatographie wurde verwendet, um Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht von der gewünschten Protease zu trennen. Dies wurde auf einer 2,1-l-Sephadex G-75 superfine (Sigma Chemical)-Säule durchgeführt, die mit 50% Essigsäure äquilibriert war. Das Protein wurde in 10 mM Ameisensäure rückgefaltet (Todd et al. 1998). Eine abschließende Reinigung wurde mit einer Pharmacia Superdex 75 FPLC-Säule durchgeführt, die mit 0,05 M Natriumacetat bei pH 5,5, 5 % Ethylenglycol, 10 % Glycerin und 5 mM DTT äquilibriert war.

Synthese von Inhibitoren

Die Synthese und Herstellung der in dieser Studie verwendeten Protease-Inhibitoren sind in Abbildung 1b ▶ gezeigt. Die vorletzten Piperazine (Verbindung I in Fig. 1b ▶) wurden gemäß dem Verfahren hergestellt, das im US-Patent 5,436,067 von Merck & Co., Inc. veröffentlicht wurde. T-Amylamin wurde bei der Herstellung von t-Butylamin ersetzt das Piperazinamid zur Synthese der Vorstufe von XN1336�. Bei den Vorläufern von XN1336� und XN1336� ersetzte (S)-3-Phenylbuttersäure (von Fluka bezogen) Hydrozimtsäure zur Herstellung von Verbindung I (Abb. 1b ▶). Die Herstellung der Endprodukte erfolgte durch reduktive Alkylierung von Verbindung I entweder mit Pyridin-3-carboxaldehyd (XN1336�, XN1336�) oder Piperonal (807�𠄴, XN1336�) in Gegenwart von Natriumtriacetoxyborhydrid, wie beschrieben (Abdel-Magid et al. 1996). Die Endprodukte wurden durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicaplatten und 10 % Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Strukturen und Reinheiten wurden durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR und Massenspektroskopie ohne Anzeichen einer Hydratation bestätigt.

Kristallisation und Datensammlung

Kristalle wurden mit einem drei- bis fünffachen molaren Überschuss an Inhibitor gegenüber Protease aufgebaut, der eine ubiquitäre Bindung gewährleistet. Die Endkonzentration der Protease betrug ungefähr 2 mg/ml in 0,05 M Natriumacetat bei pH 5,5, 5 % Ethylenglycol, 10 % Glycerin, 5 mM DTT. Gleiche Volumina der Inhibitor-Protein-Mischung und der Reservoirlösung wurden kombiniert, um hängende Tropfen von 5 μL herzustellen. Die Reservoirlösung bestand aus 126 mM Phosphatpuffer bei pH 6,2, 63 mM Natriumcitrat und Ammoniumsulfat in einem Bereich von 27� % (Silva et al. 1996). Kristalle wurden bei Umgebungstemperatur gezüchtet und waren innerhalb von 24� Stunden sichtbar. Die Datenerhebung erfolgte bei Raumtemperatur auf einem R-AXIS-IV Speicherfoliensystem. Die Daten wurden mit den Programmen DENZO und SCALEPACK (Otwinowski 1993) verkleinert und skaliert. Kristalle sowohl des Indinavir- als auch des Indinavir-Analog-Protease-Komplexes waren vom P212121 Raumgruppe mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit.

Raffinesse

Zur Verfeinerung der Strukturen wurde das Programm CNS [Crystallography and NMR System (Brunger et al. 1998)] verwendet. Als Modell zur Auflösung der 3X-Protease-Indinavir-Struktur durch molekularen Ersatz diente der Wildtyp-HIV-1-Protease-Indinavir-Komplex (1HSG) (Chen et al. 1994). Der 3X-Protease-Indinavir-Komplex wurde wiederum als Modell zur Verfeinerung der entsprechenden 3X-Protease XN1336�-Struktur verwendet. Das Modell, das zur Verfeinerung des nachfolgenden Indinavir-Analogons 3X-Protease 807�𠄴 verwendet wurde, war eine hochauflösende, gut verfeinerte Substrat–Protease-Struktur, die kürzlich in unserem Labor gelöst wurde (M. Prabu-Jeyabalan, E. Nalivaika und CA Schiffer, unveröffentlicht), mit dem gleichen P212121 Raumgruppe. Die Struktur des 3X-Protease 807�𠄴 Komplexes wurde dann als Modell verwendet, um die Struktur des 3X-Protease XN1336� Komplexes zu verfeinern. Für jede Struktur wurde eine anfängliche Verfeinerung des starren Körpers mit einer Auflösung von 4Å durchgeführt, wobei anschließend Differenz-Fourier-Elektronendichtekarten (Fo − Fc und 2Fo − Fc) berechnet wurden. Für den Modellbau wurde das Programm CHAIN ​​(Sack 1988) verwendet. Positions- und B-Faktor-Verfeinerungen wurden durchgeführt, und die Differenz-Fourier-Elektronendichtekarte (Fo − Fc) zeigte eindeutig die Positionen der Inhibitoren. Die Auflösungsgrenzen wurden schrittweise in gleichen Schritten erweitert, um die höchstmögliche Auflösung zu erreichen. Lösungsmittelmoleküle wurden manuell an Positionen zugegeben, die durch die Elektronendichte angezeigt wurden. Zur Kreuzvalidierung wurden R-freie Werte überwacht und simulierte getemperte Omit-Maps verwendet, um die Verzerrung des Modells zu verringern. Die stereochemischen Parameter der Endstrukturen wurden mit den Programmen PROCHECK (Laskowski et al. 1993) und WHATIF (Vriend 1990 Hooft et al. 1996) analysiert. Auf den Ramachandran-Karten gab es keine Ausreißer. Die kristallographischen und Verfeinerungsstatistiken sind in Tabelle 1 gezeigt ​ 1. . Komplexe wurden mit dem α-Kohlenstoffrückgrat der relativ immobilen (Rose et al. 1998) terminalen Domäne all dieser Strukturen (Reste 1𠄹 und 86�) mit dem Programm MIDAS (Ferrin et al. 1988) überlagert. Die Koordinaten wurden in der Proteindatenbank 1K6C, 1K6P, 1K6T und 1K6V für die Komplexe 3X-Protease Indinavir, 807�𠄴, XN 1336� bzw. XN1336� hinterlegt.

Assays zur Proteasehemmung

Die Hemmung der dreifach mutierten Protease durch die verschiedenen Inhibitoren wurde bestimmt. Aktivitätsassays wurden bei 37ଌ mit dem Substrat AcSQNYPVV-NH2 (Sigma) durchgeführt. Für alle Experimente wurden konstante Konzentrationen von Protease, 0,05 mg/ml, und Substrat, 492 μM, verwendet. Die Inhibitorkonzentrationen wurden von 0,0𠄰,80 μM variiert. Für jede Inhibitorkonzentration wurden Aliquote der Reaktionsmischung in 15-Minuten-Intervallen entnommen, mit gleichen Volumina kalter Trichloressigsäure gequencht und durch Umkehrphasen-HPLC untersucht (Moore et al. 1989). Der Prozentsatz der verbleibenden Aktivität für jede Inhibitorkonzentration wurde aufgetragen und IC50s wurden erhalten (Abb. 4 ▶).

Thermodynamische Bindungsassays

Ein isothermes Titrationskalorimeter, ein VP-ITC (MicroCal Inc.), wurde verwendet, um die Bindungsenergien von Inhibitoren zu messen. Zwanzig bis vierundzwanzig 10�-μl Injektionen von 0,2 mM Inhibitor wurden in 29 μM Wildtyp-HIV-1-Protease und 22,7 μM 3X-Protease HIV-1-Protease bei 20ଌ durchgeführt. Der Puffer, in dem sowohl Proteine ​​als auch der Inhibitor suspendiert waren, war 10 mM Natriumacetat, 2,0 % DMSO und 2 mM TCEP bei pH 5,0. Verdünnungswärmen wurden von den entsprechenden Reaktionswärmen abgezogen, um die Wärme allein aufgrund der Bindung des Liganden an das Enzym zu erhalten. Die Daten wurden mit dem MicroCal Origin-Softwarepaket verarbeitet und analysiert.


Wichtige Punkte

Bisher wurden Inhibitoren gegen HIV-1 entwickelt, um den viralen Reverse-Transkriptase- und Protease-Enzymen zu antagonisieren. Es bestehen jedoch Bedenken hinsichtlich sowohl der Langzeitwirkung der Protease-Inhibitoren als auch der Fähigkeit von HIV-1, eine Resistenz gegen diese Medikamente zu entwickeln.

Neue Versuche, die HIV-1-Infektion zu blockieren, wurden diversifiziert, um viele Schritte im viralen Lebenszyklus von HIV-1 zu berücksichtigen, die für die Infektion entscheidend sind. Dazu gehören Virus-Zell-Anheftung, Viruseintritt und Virus-Enthüllung. Die reverse Transkription viraler cDNA, der Kernimport und die Integration in das Genom der Wirtszelle sind ebenfalls potentielle Hemmungsstellen.

Antagonisten des viralen Eintritts befinden sich derzeit in klinischen Studien am Menschen oder stehen kurz davor, diese Inhibitoren richten sich sowohl gegen die viralen Glykoproteine, die mit Rezeptoren interagieren, als auch gegen Co-Rezeptoren auf der Wirtszellmembran. Das Design von Post-Entry-Inhibitoren bleibt problematisch, da zu den fortgeschritteneren Inhibitoren Agonisten des Integrase-Enzyms gehören, das die virale cDNA-Integration in das Genom der Wirtszelle vermittelt.

Das Design neuer viraler Eintrittsinhibitoren berücksichtigt auch die Fluchtwege, die das sich entwickelnde HIV-1-Virus als Reaktion auf die Hemmung seines normalen Eintrittsweges einnimmt. Es wird vorausgesagt, dass der erfolgreichste therapeutische Ansatz ein ?Cocktail? von Inhibitoren, die die Infektion an mehreren Stellen blockieren, einschließlich der potenziellen Fluchtwege.


Abstrakt

Der potente neue antivirale Inhibitor TMC-114 (UIC-94017) der HIV-1-Protease (PR) wurde mit drei PR-Varianten untersucht, die die Einzelmutationen D30N, I50V und L90M enthalten, die Resistenz gegen die wichtigsten klinischen Inhibitoren bieten. Die Hemmkonstanten (Kich) von TMC-114 für Mutanten PRD30N, PRI50V, und PRL90M waren 30-, 9- bzw. 0,14-fach relativ zum Wildtyp-PR. Die molekulare Grundlage für die Hemmung wurde mit hochauflösenden (1.22−1.45 Å) Kristallstrukturen von PR-Mutantenkomplexen mit TMC-114 analysiert. In PRD30N, hat der Inhibitor eher eine wasservermittelte Wechselwirkung mit der Seitenkette von Asn30 als die bei PR beobachtete direkte Wechselwirkung, was mit der relativen Hemmung übereinstimmt. Ähnlich in PRI50V der Inhibitor verliert günstige hydrophobe Wechselwirkungen mit der Seitenkette von Val50. TMC-114 hat zusätzliche Van-der-Waals-Kontakte in PRL90M Struktur im Vergleich zur PR-Struktur, was zu einer engeren Bindung des Inhibitors führt. Die beobachteten Veränderungen der PR-Struktur und -Aktivität werden in Bezug auf das Potenzial zur Entwicklung resistenter Mutanten bei Exposition gegenüber TMC-114 diskutiert.

Department of Biology, Molecular Base of Disease, Georgia State University.

Department of Chemistry, Molecular Base of Disease, Georgia State University.

Fakultät für Informatik, Georgia State University.

Korrespondierender Autor. Telefon: 404-651-0098. Fax: 404-651-2509. E-Mail: [E-Mail protected]

Abkürzungen: PR, Protease HIV-1, humanes Immunschwächevirus Typ 1 HAART, hochaktive antiretrovirale Therapie AIDS, erworbenes Immunschwächesyndrom PI, Proteasehemmer THF, Tetrahydrofuran.


Resultate und Diskussionen

Zuvor Eckert et al. (8) nutzten spiegelbildliches Phagen-Display, um eine erste Generation von D-Peptiden zu entdecken, die spezifisch an die hydrophobe Tasche des gp41-N-Trimers binden und den Eintritt von HIV-1 hemmen (IC50 = 11–270 μM, HXB2-Stamm). Kurz gesagt, beim Spiegelbild-Phagen-Display (31) wird das gewünschte natürliche Ziel synthetisch mit D-Aminosäuren hergestellt und zum Screenen auf Bindung von L-Peptiden verwendet, die auf Phagen präsentiert werden. Durch Symmetrie binden D-Peptid-Versionen der Phagenpeptide an das natürliche L-Target. Diese Phagenbibliothek enthielt 10 randomisierte Reste (10-mer-Bibliothek) flankiert von Cysteinen (CX10C). Aufgrund der enormen möglichen Sequenzvielfalt dieser Bibliothek wurde nur eine von 3 × 10 6 möglichen Sequenzen gescreent, und wir schlossen daher, dass wahrscheinlich noch wirksamere D-Peptid-Inhibitoren entdeckt werden müssen.

Wichtig ist, dass eine Konsensussequenz ( C X5 EW X WLC) wurde aus dem ursprünglichen Phagenscreen identifiziert, der es uns ermöglichte, eine eingeschränkte Bibliothek zu entwickeln, in der die Konsensusreste (unterstrichen) fixiert wurden, während die anderen sechs Positionen randomisiert wurden. Diese Einschränkung ermöglichte es uns, eine umfassende Bibliothek zu konstruieren, die alle möglichen Sequenzen umfasste. Wie erwartet identifizierte das Phagen-Display-Screening dieser Bibliothek eine Familie von D-Peptiden mit einer verbesserten durchschnittlichen Wirksamkeit gegenüber den ursprünglichen D-Peptiden (~4-fache Daten nicht gezeigt). Überraschenderweise war eines der stärksten identifizierten D-Peptide (2K-PIE1) ein 8-mer (d. h. es fehlten zwei der randomisierten Reste, CX3EWXWLC). Dieser Phagenklon (PIE1-ϕ) war nicht absichtlich Teil der Bibliothek und entstand wahrscheinlich aus einem sehr seltenen Replikationsfehler. Die Auswahl dieser Sequenz trotz ihrer sehr geringen Prävalenz in der ursprünglichen Bibliothek deutete darauf hin, dass die 8-mer-Familie eine reichere Quelle für feste Binder sein könnte als die 10-meren.

Kristallstruktur des IQN17:2K-PIE1-Komplexes.

Um die Wechselwirkung von 2K-PIE1 mit seinem Target besser zu verstehen, haben wir die Kristallstruktur seines Komplexes mit dem gp41-N-Trimer-Taschenmimetikum IQN17 (8) bestimmt (Abb. 2). Die Struktur wurde bei 1.7 Å durch molekularen Austausch gelöst und enthält zwei IQN17-Untereinheiten und zwei 2K-PIE1-Inhibitoren in der asymmetrischen Einheit. Eine kristallographische dreizählige Achse erzeugt zwei Trimere aus den beiden unabhängigen Untereinheit-Inhibitor-Komplexen [siehe Hintergrundinformationen (SI) Tabelle 3 und SI-Text für eine Beschreibung der Datenerhebungs- und Verfeinerungsstatistik]. Die Elektronendichte zeigt deutlich eine Reihe wichtiger Eigenschaften des Inhibitors, einschließlich der wichtigsten taschenbindenden Reste (dTrp10, dTrp12 und dLeu13) und der Disulfidbrücke zwischen dCys5 und dCys14 (Abb. 2 B).

Strukturanalyse des IQN17:2K-PIE1-Inhibitorkomplexes. (EIN) IQN17, bestehend aus IQ (orange) und gp41 (N17, grau) Segmenten, mit Inhibitoren (grün, gelb und lila) in den kanonischen gp41 Bindungstaschen. Der Purpurinhibitor ist in dieser Ansicht meist verdeckt. (B) Karte auslassen für 2K-PIE1 konturiert bei 3,0 × rmsd. Fünf der acht Taschenreste (grau, HXB2-Nummerierung), die hydrophobe Kontakte mit 2K-PIE1 (grün) herstellen, sind gezeigt. Zwei Wasserstoffbrücken (schwarz) an der Bindungsgrenzfläche sind ebenfalls gezeigt. (C) Überlagerung von D10-p1 (Schiefer) und 2K-PIE1 (grün) überlagert durch Ausrichtung der IQN17-Trimere. Intramolekulare Disulfidbindungen (durchgehend gelb) sind ebenfalls gezeigt. (D) Eine Plattenansicht durch das Zentrum von 2K-PIE1 (grün) zeigt einen intakten hydrophoben Kern (schwarz), der Wasser ausschließt. (E) Eine ähnliche Ansicht von D10-p1 (Schiefer) zeigt das Vorhandensein mehrerer Wassermoleküle (rot) in seinem Kern, die fast einen Wasserkanal bilden. (F) End-on-Ansicht des Komplexes (gleiche Farbgebung wie EIN), bei dem die letzten drei Reste von IQN17 von der Oberfläche entfernt wurden. Diese Ansicht veranschaulicht das Packen des Inhibitors in die tiefe hydrophobe Tasche. dK2 (blue), equivalent to the N-terminal Lys in PIE7 used for cross-linking, is highlighted.

Comparison of our 2K-PIE1 and the previously reported D10-p1 (8) structure, both of which were determined in complex with IQN17, reveals a striking similarity in the pocket-binding interface (Fig. 2 C). The inhibitors' pocket-binding residues dTrp10, dTrp12, and dLeu13 (2K-PIE1 numbering), which contribute ≈60% of the binding surface, are nearly superposable (Fig. 2 C). The essentially identical binding interfaces and buried solvent-accessible surface areas (475 Å 2 for 2K-PIE1 vs. 469 Å 2 for D10-p1) are surprising in light of 2K-PIE1's significantly improved potency over D10-p1 and suggest that binding of these inhibitors depends significantly on factors remote from the direct contact surface.

Overall, the comparison suggests that the improved potency and binding (see below) of 2K-PIE1 is a consequence of its reduced size (10-mer to 8-mer), which creates a more compact D-peptide with better packing while maintaining the pocket-binding interface. One major difference between the inhibitors is the path of the backbone distal to the pocket interface (Fig. 2 C). dPro8 in 2K-PIE1 appears to facilitate the turn required for circularization, possibly allowing other residues to adopt more relaxed conformations. In support of this idea, a Pro in this position appears to be a better solution for 8-mers than other residues (see below). The more compact structure of 2K-PIE1 vs. D10-p1 (volume is 1,556 vs. 1,858 Å 3 , excluding N-terminal Lys residues) allows it to form a better-packed hydrophobic core (Fig. 2 D und E) that excludes the water molecules seen in the core of D10-p1 (Fig. 2 E).

Phage Display of an 8-mer Library.

The surprising emergence of 2K-PIE1 from a 10-mer library and its apparent structural advantages motivated us to perform a dedicated screen of 8-mer sequences. We generated a comprehensive 1.5 × 10 8 member 8-mer phage library of the form CX4WXWLC (3.4 × 10 7 possible sequences). Our mirror-image target was the second-generation trimeric pocket mimic IZN17 (12).

For this screen, we used solution-phase phage display (32) combined with a soluble competitor to increase selection pressure (see SI-Text for additional details). Several sequences were identified after six rounds of phage display and characterized in a phage clone binding assay (SI Fig. 5).

Potency of D-Peptides Against HXB2 Entry.

D-peptide versions of the best phage clones (PIE2, PIE7, and PIE8-ϕ) were synthesized and tested against the standard HIV-1 laboratory strain HXB2 in a single-cycle viral infectivity assay (Table 1 and Fig. 3 EIN). As expected from the phage binding data, PIE7 is the most potent inhibitor (IC50 = 620 nM) and is ≈15-fold more potent than the best first-generation D-peptide (D10-p5).

D-peptide binding and neutralization

Representative viral entry inhibition data. Each point represents the average of quadruplicate measurements normalized to uninhibited control. Error bars represent the SEM. (EIN) IC50 curves for various inhibitors against HXB2. (B) IC50 curves for PIE7 and (PIE7)3 against JRFL, BaL, and HXB2.

The importance of optimizing residues that do not directly contact the pocket is highlighted by several pairwise comparisons (using 2K-PIE1 numbering) between peptides in Table 1 and SI Fig. 5. For example, PIE7 differs from PIE2 only at residue 11, for which Gln is preferred over Arg. Similarly, PIE7 differs from PIE8 only at residue 8, where Pro is preferred.

It was previously noted that introduction of Lys residues at the N terminus of D-peptides, required for solubility, adversely affects potency (8). 2K-PIE2 is ≈2-fold less potent than PIE2 (Table 1). Because 1K versions of our second-generation D-peptides have good solubility and improved potency, we decided to make 1K the standard N terminus of our second-generation D-peptides (all second-generation peptides have a single N-terminal Lys unless otherwise labeled).

Crystal Structure of the IQN17:PIE7 Complex.

In an attempt to understand the source of PIE7's improved affinity compared with 2K-PIE1, we determined two independent crystal structures of PIE7 in complex with IQN17 at 2.0-Å and 1.66-Å resolution (see SI Table 3 and SI-Text for a description of data collection and refinement statistics). A comparison of 2K-PIE1 and PIE7 reveals several interesting differences (Fig. 4). First, an intramolecular polar contact between the hydroxyl of dSer7 and the carbonyl of dGly3 in 2K-PIE1 is lost in PIE7 but is replaced with a new interaction between the side chain carboxylate of dAsp6 and the amide of dGly3. Second, new hydrophobic interactions are created in PIE7 between the ring carbons of dTyr7 and the pocket residue Trp-571 (SI Fig. 6EIN ). Third, the carbonyl of dLys2 of PIE7, although somewhat flexible in orientation, forms a direct hydrogen bond with the ε nitrogen of Trp-571 in some of the structures. This interaction is water-mediated in 2K-PIE1. Fourth, in some of the structures the hydroxyl of dTyr7 in PIE7 forms a new water-mediated hydrogen bond with the pocket residue Gln-575. This interaction cannot be formed in the 2K-PIE1 structure. These subtle changes expand PIE7's pocket binding interface and may account for the enhanced potency of PIE7.

Structural analysis of the IQN17:2K-PIE1 and IQN17:PIE7 inhibitor complexes. Shown is a comparison of unique polar contacts observed in the 2K-PIE1 (EIN) and PIE7 (B) costructures (described in the text).

Multimeric D-Peptides.

Based on the trimeric nature of gp41, we predicted that multimeric D-peptides would have significantly improved affinity for the N-trimer and enhanced antiviral potency. To test this idea, we used a bis(NHS ester)PEG cross-linker to dimerize PIE7 via its unique primary amine (N-terminal Lys) (Fig. 2 F). The length of the PEG spacer (35 Å) was chosen to cover, with slack, the distance between the N-termini of neighboring D-peptides in the crystal structures. To construct the PIE7 trimer, we used two of the same cross-linker to connect a central 2K-PIE7 to two flanking PIE7s. PEG is an ideal material for cross-linking because it is highly flexible, very soluble, nonimmunogenic, and has been used in several approved therapeutic peptides and proteins (33).

The resulting dimeric and trimeric inhibitors, (PIE7)2 and (PIE7)3, have IC50 values of 1.9 nM and 250 pM (Table 1 and Fig. 3 EIN) against HXB2, respectively. This dramatic gain in potency is a 325- and 2,500-fold improvement over the PIE7 monomer, respectively. To control for possible nonspecific effects of the PEG moiety, we reacted mono(NHS ester)PEG with PIE7 to generate PEG-PIE7. Addition of this PEG group caused a modest ≈1.5-fold reduction in potency against HXB2. Therefore, the improved potency of the oligomers cannot be attributed to an interaction of the PEG with virus, cells, or the D-peptide but is a genuine avidity effect caused by multiple D-peptides binding to the N-trimer.

Surface Plasmon Resonance (SPR) Characterization.

To determine whether the improved potency of our second-generation D-peptides stems from optimization of affinity for the pocket, we characterized the binding properties of the D-peptides to an immobilized N-trimer mimic (IZN36) using SPR (Table 1). The rank order of measured K D values correlated well with antiviral IC50 values, indicating that D-peptide binding to a pocket mimic in vitro is a good predictor of antiviral potency.

The PIE7 monomer and multimers had similar rapid association rates, but the dimer and trimer (data not shown) showed dramatically slowed dissociation rates compared with the monomer (SI Fig. 7). The trimer's binding to the pocket was too tight (low to mid pM) to measure accurately by SPR (the value reported in Table 1 is approximate and likely underestimates the trimer's true affinity). Interestingly, the trimer's potency against HXB2 did not improve as much as expected from its K D, suggesting that trimer potency against HXB2 may have reached a potency limit imposed by association kinetics, as has been reported for another entry inhibitor, 5-helix (34). This kinetic limitation is expected because the exposed N-trimer has an ≈10- to 20-min lifetime in the gp41 prehairpin intermediate (4–6), similar to the time required for binding of our peptides at mid to high pM concentrations.

D-Peptide Inhibitors Are Also Active Against Primary HIV-1 Strains.

HXB2 is a widely used laboratory-adapted HIV-1 strain that is typically more sensitive to entry inhibitors than primary (clinical) HIV-1 strains. Here we report D-peptide inhibitory data against primary strains (standard clade B strains BaL and JRFL). The most potent first-generation D-peptide, D10-p5, showed little or no inhibitory activity against JRFL and modest activity against BaL (Table 1). In contrast, PIE7 inhibits both JRFL (IC50 = 24 μM) and BaL (IC50 = 2.2 μM) entry, although ≈40- and ≈4-fold less potently than HXB2 entry, respectively (Table 1). Similar differences in potency between JRFL and HXB2 have been reported for other entry inhibitors that target the pocket region (18) (e.g., the C-peptide inhibitor C37) (Table 1). Interestingly, Fuzeon, which does not bind to the pocket, shows only a small loss of activity against JRFL (Table 1). Despite the relative insensitivity of JRFL to the PIE7 monomer, the PIE7 trimer is a moderately potent inhibitor of this strain (IC50 = 220 nM) and an extremely potent inhibitor against BaL (IC50 = 650 pM).

Possible Sources of JRFL's Relative Insensitivity to Inhibition by PIE7.

Compared with the sequence of the BaL and HXB2 pocket region (N17), JRFL has the conservative L565M substitution (Table 2, highlighted). All other pocket residues that contact our D-peptides are >97% identical in the >5,000 clade A, B, and C HIV-1 strains from the Los Alamos National Laboratory HIV sequence database (www.hiv.lanl.gov). Residue 565 is Leu or Met in ≈99% of these strains. Our crystal structures show that the D-peptide C-terminal Ala interacts with the L565 equivalent position of IQN17 in each of the available crystal structures (e.g., Fig. 2 B ). Residue 580 (Table 2, highlighted) does not contact the pocket.

Pocket region (N17) alignment

The L565M substitution might affect binding of our D-peptides to the JRFL pocket. To test this possibility, we measured binding of PIE7 to JRFL and HXB2 versions of IZN36 by SPR and observed an ≈4-fold increase in K D for binding to the JRFL pocket (data not shown). Another possible contributing factor to JRFL's relative insensitivity is the reduced steric accessibility of JRFL's N-trimer region compared with HXB2 (35), which may explain why PEG-PIE7 has ≈4-fold lower potency than PIE7 against JRFL (vs. a 1.5-fold difference against HXB2) (Table 1). These differences in inhibitor binding caused by the L565M substitution or reduced steric accessibility do not appear to fully account for the ≈40-fold reduction in potency against JRFL. Therefore, an unknown complex factor (e.g., kinetics) is also likely to be involved.

Third Generation D-Peptides.

Although our second-generation multimeric D-peptides are sufficiently potent to begin preclinical studies, the ideal D-peptide for clinical use will require further optimization to improve potency against challenging strains like JRFL. Our current results suggest several straightforward strategies to further improve D-peptide potency and achieve this goal. First, we predict that optimization of the cross-linker length and connectivity in our multimeric D-peptides will strengthen avidity. In our initial strategy, we connected the N termini of monomers (N–N) via the existing N-terminal Lys in PIE7. From the crystal structures, it is apparent that C–C or C–N linkages could be significantly shorter than our current N–N linkage. Second, our structures show that flanking residues (those outside the disulfide bond) present on the phage (and peptides) make important interactions with the pocket. Optimization of these residues in the context of the PIE7 core sequence by phage display will likely provide further improvements in potency.

Third, it is possible that 8-mers are not the most optimal length for these D-peptides. Modeling one or two residue deletions from the 2K-PIE1 structure indicates that 7-mers are still long enough to present the WXWL binding motif to the pocket and maintain the disulfide bond, whereas 6-mers are not (data not shown). Screening of a naïve 7-mer library (CX7C) again identified the WXWL consensus motif and confirmed that 7-mers can bind the pocket and inhibit HIV entry (B.D.W., Y. Shi, and M.S.K., unpublished results). Future phage display screening will ultimately determine which geometry is most optimal for high-affinity pocket binding. Fourth, the crystal structure of PIE7 (our best current monomer) is a valuable platform for rational design using nonnatural amino acid derivatives. For example, PIE7's dTyr7 hydroxyl is not optimally positioned to make direct hydrogen bonds with the pocket. It may be possible to stabilize the complex by extending the position of the dTyr7 hydroxyl by one or two carbons.

Finally, it is important to note that the avidity of our multimers predicts that small improvements in the potency of monomers will result in geometric improvements in the corresponding dimers and trimers, up to the potency limit imposed by association kinetics. We also predict that it will be beneficial to “overengineer” future D-peptides to improve affinity even after reaching this potency limit. Such inhibitors will not show improved potency, but will have a reserve of binding energy that acts as a “resistance capacitor” to defend against potential resistance mutations [i.e., resistance mutations that moderately affect binding would have no effect on potency, as has been reported for the entry inhibitor 5-helix (34)]. Of particular importance, this property will discourage the stepwise accumulation of multiple subtle mutations that combine to confer resistance. Individual mutations would have no effect on inhibitor potency and would not confer a growth advantage in the presence of inhibitors. This resistance capacitor would be especially beneficial for trimeric inhibitors, because resistance mutations would simultaneously affect all three pockets. As a further defense against the development of resistance, our trimeric D-peptides could also be constructed by using three different D-peptide sequences, each with a distinct resistance profile. Such a heterotrimer would present a significant additional barrier to the development of resistance.

Potential Uses of D-Peptides.

Our D-peptides target the highly conserved gp41 hydrophobic pocket region and will likely have an improved resistance profile compared with Fuzeon (25), which targets a less well conserved region of gp41. Further studies of our D-peptides against panels of viruses from diverse HIV-1 clades and in vitro selections for resistance mutations will be required to determine the breadth of their activity and predict susceptibility to resistance mutations. Because the hydrophobic pocket is not targeted by Fuzeon or other entry inhibitors currently in advanced clinical trials (e.g., BMS-378806, PRO 542, Vicriviroc, and Maraviroc), our D-peptides should be additive (or possibly synergistic) with these inhibitors and could form part of a emerging entry inhibitor “cocktail,” similar to the mixtures of HIV-1 protease and reverse transcriptase inhibitors currently used in highly active antiretroviral therapy.

D-peptides represent a new class of drugs that have not been extensively tested in vivo. Because D-peptides are not degraded by proteases they have the potential for oral bioavailability (29, 30), extended persistence in circulation (28), reduced immunogenicity (36), long shelf life, and use in harsh mucosal environments as a topical prophylactic microbicide. The D-peptides reported here are now sufficiently potent for preclinical studies, which will ultimately determine whether these theoretical advantages translate into a valuable new class of agents for the prevention and treatment of HIV/AIDS. These results also suggest that D-peptides may be useful for diverse applications against other therapeutic targets.


Einführung

HIV-1 drug resistance mutations rendering the Highly Active Anti-Retroviral Therapy (HAART) cocktail [1] ineffective have been increasingly reported. Currently, the HAART cocktail consists of reverse transcriptase (RT) inhibitors (RTIs), protease inhibitors, and integrase inhibitors. Together they work to interfere with virus replication, maturation, and viral genome integration, respectively [2]. Of these three enzymatic drug targets, only the RTIs have two classifications based on their modus operandi as nucleoside RT inhibitors (NRTIs) and non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). The NNRTIs functions non-competitively, binding to an allosteric site to cause structural changes to the RT polymerase active site, whereas the NRTIs directly compete in the active site with nucleotides during the incorporation to terminate the reverse-transcription process [3]. Given that the NRTIs work competitively, NRTI drugs are generally nucleotide analogs, and thus limited in structure. On the other hand, the NNRTI allosteric inhibitors that distantly influence the RT polymerase active site, is open to a wider scope of ligand structures.

NNRTIs were first discovered [4,5] through multiple compound library screening [6], in which the two derivatives ‘HEPT’ and ‘TIBO’ were found to selectively inhibit HIV-2 replication in vitro. Many NNRTIs were later developed [7] using these two derivatives as study templates. Although the first NNRTI drug (nevirapine or NVP) was approved in 1991 [8], its RT inhibition mechanism of affecting RT flexibility was only recently reported [9]. Another NNRTI, efavirenz (EFZ), binds to the p66 subunit of HIV-RT and restricts the motions and conformational changes of the RT thumb that is necessary for DNA polymerization. In general, the NNRTIs distort the polymerase primer grip, thereby inhibiting the proper positioning of the primer at the 3′-end polymerase active site [10]. Due to the distal effects, the mechanism is deemed to be allostery [9,11]. Further using hydrogen exchange MS, Seckler et al. [9] revealed an allosteric network in EFZ-bound RT structure involving both RT subunits p66 and p51, demonstrating that p51 also underwent substantial conformational changes in addition to p66 in order to trigger allosteric couplings upon NNRTI binding.

To overcome NNRTIs, the viral RT was found to gain mutations that changed the physicochemical properties of the drug-binding pocket [12,13] and/or to disrupt the allosteric mechanism [11]. Given the limited NNRTI options in HAART, there remains a need to extend the effectiveness of the available NNRTIs by delaying the onset of cross-resistance. Further taking advantage of the allosteric coupling, there is a need to identify new druggable pockets, to which future drugs can be designed to synergistically inhibit RT function.

Our paper aims to address these two goals by using the latest reported clinical NNRTI resistant mutations [14] for integration into RT structures as study models. We sought to study the NNRTI drug-resistance mutations in cross-resistance by analyzing structural correlation-based networks of the mutant RT–NNRTI complex structures. In addition, we searched for additional allosteric pockets that influenced the polymerase active site that are comparable with the known NNRTI allosteric pocket. The identification of such new pocket(s) is important for the advent of new NNRTIs, particularly in the context of WHO guidelines on NNRTI drug resistance [15,16].


Warning signs over effectiveness of HIV 'wonder drug' in sub-Saharan Africa

Dolutegravir, the current first-line treatment for HIV, may not be as effective as hoped in sub-Saharan Africa, suggests new research published on World AIDS Day. The study finds that this so-called 'wonder drug' may be less effective in patients resistant to older drugs.

As HIV copies itself and replicates, it can develop errors, or 'mutations', in its genetic code (its RNA). While a drug may initially be able to supress or even kill the virus, certain mutations can allow the virus to develop resistance to its effects. If a mutated strain begins to spread within a population, it can mean once-effective drugs are no longer able to treat people.

HIV treatment usually consists of a cocktail of drugs that includes a type of drug known as a non-nucleoside reverse-transcriptase inhibitor (NNRTI). However, in recent years, HIV has begun to develop resistance to NNRTIs. Between 10% and 15% of patients in much of sub-Saharan Africa are infected by a strain of HIV resistant to these drugs. If a patient is infected with an NNRTI-resistant strain, they are at a two- to three-fold increased risk of the drug regimen failing.

In 2019, the World Health Organization began to recommend dolutegravir as the preferred first-line treatment for HIV in most populations. Dolutegravir was dubbed a 'wonder drug' because it was safe, potent and cost-effective and scientists had seen no drug resistance against it in clinical trials. However, there is little data on the success of dolutegravir against circulating strains of HIV in sub-Saharan Africa.

In a study published today in Naturkommunikation, an international team of researchers from South Africa, the UK and the USA examined the genetic code of HIV to determine if drug resistance mutations in 874 volunteers living with HIV affected their treatment success. The individuals were enrolled in a clinical trial for people initiating HIV treatment to compare two drug regimens: efavirenz, an NNRTI and prior first-line therapy in the region, and dolutegravir.

The goal of this study was to determine whether drug resistance to efavirenz prior to starting treatment affected treatment success (suppression of the virus in the blood) over the first two years of therapy with both of these two regimens.

As expected, the presence of drug resistance substantially reduced the chances of treatment success in people taking efavirenz, successfully suppressing the virus over 96-weeks in 65% of participants compared to 85% of non-resistant individuals. However, unexpectedly, the same pattern was true for individuals taking dolutegravir-based treatments: 66% of those with efavirenz resistance mutations remained suppressed over 96-weeeks compared to 84% of those without the mutations. These relationships held true after accounting for other factors, such as treatment adherence.

"We fully expected efavirenz to be less effective among patients HIV strains resistant to NNRTIs," said Dr Mark Siedner, faculty member at the Africa Health Research Institute in KwaZulu-Natal, South Africa and Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts. "What took us completely by surprise was that dolutegravir -- a different class of drug which is generally effective in the face of drug resistance -- would also be less effective in people with these resistant strains.

"We are working now to tease out if this was due to the virus or the participants -- for instance, if people with resistance are less likely to take their pills regularly. Either way, if this pattern holds true, it could have far reaching impacts on our predictions of long-term treatment control for millions of people taking dolutegravir in the region."

Professor Ravi Gupta from the Department of Medicine at the University of Cambridge said: "This a huge concern. Dolutegravir was very much seen as a 'wonder drug', but our study suggests it might not be as effective in a significant number of patients who are resistant to another important class of antiretroviral drugs."

The researchers say it is not clear why efavirenz-resistant mutations should affect susceptibility of dolutegravir, though one hypothesis is that integrase inhibitors such as dolutegravir push the virus to replicate and mutate faster, in turn developing resistance to the new drug in an evolutionary arms race. Alternatively, it could be due to poor adherence to treatment regimens, even though the analysis accounted for adherence by two independent methods. Further research is needed to find out why.

Professor Gupta added: "What this shows is that we urgently need to prioritise point of care tests to identify people with drug resistance HIV, particularly against efavirenz, and to more closely and accurately monitor treatment adherence. The development of such tests is at an advanced stage, but there a lack of investment from funders and philanthropic donors. We urgently need agencies and individuals to step forward and help support these programmes.

"In addition, we need to provide widespread access to viral load monitoring so that we can find those who are struggling, get them on more appropriate regimens, and limit the emergence of resistance when patients are failing therapy."