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Was ist der Zweck von Y-förmigen Adaptern bei der Illumina-Sequenzierung?

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Y-Adapter unterschiedliche Sequenzen, die an die 5'- und 3'-Enden jedes Moleküls in einer Bibliothek angelagert werden sollen.

Die Arme des Y sind einzigartig und der mittlere Teil, der mit dem DNA-Fragment verbunden ist, ist komplementär.

Was sind die Vorteile davon?

Meine Meinung zu voll komplementären Adaptern (ADAPTER1 - - - - - ADAPTER1) ist folgende:

– Beim Primer-Annealing würde der Primer wiederum an den Anfang UND das Ende des DNA-Fragments binden und somit die Synthese nicht bis zum Ende fortsetzen. Daher hätte der nächste Primer keine Matrize, um am Anfang des Fragments zu binden…

Y-förmige Adapter ermöglichen auch eine Paired-End-Sequenzierung. Fragmente haben an jedem Ende eine einzigartige Sequenz, die es dem ersten "Lauf" ermöglicht, eine Seite aller Moleküle zu sequenzieren, dann die Rückseite zu synthetisieren und diese zu sequenzieren.

Bin ich auf dem richtigen Weg?


Normalerweise, wenn Sie zwei einzigartige Adapter, sagen wir A & B, an beiden Enden unbekannter Insertsequenzen benötigen, ist die Ligation am kohäsiven Ende schwierig, da die Insertsequenzen "unbekannt" sind. Sie müssen also in einer Reaktion mit unbekannten Inserts + Adapter A + Adapter B eine stumpfe Adapterligation durchführen. Dies kann zu 3 möglichen Versionen des Insert-ligierten Produkts führen: A-Insert-A, B-Insert-B und A-Einsatz-B, darunter nur A-Einsatz-B ist das einzige gewünschte Produkt.

1) Ligation von A-tailed Inserts mit Y-Adaptern gibt Ihnen 100% A-Einsatz-B.

2) Weisen wir dem Insert nun eine Direktionalität zu - sagen wir von Basis 1 bis Basis 400. Nach der Y-Adapter-Ligation haben Sie 2 Arten von Insert-ligierten Produkten pro Insert: A-Einfügen (1-->400)-B und A-Einfügen (400 --> 1)-B, die beide sehr nützlich sind. Jeder erzeugt einen separaten klonalen Cluster und Sie erhalten Sequenzinformationen beginnend bei Base 1 und Base 400 des Inserts, da das Instrument bei der Single-Read-Sequenzierung immer von Adapter A sequenziert dem gleichen Insert, muss man Paired-End-Sequenzierung durchführen.


NGS-Adapter

Sind Sie verwirrt über die Kontamination in Ihren NGS-Oligos?

Machen Sie sich Sorgen um die Effizienz des Bibliotheksbaus in Ihrem NGS-Experiment?

Kennen Sie die hohen Qualitätsstandards von NGS-Oligos?

Next-Generation Sequencing (NGS) wird aufgrund der Hochdurchsatz-Sequenzierung, der hohen Genauigkeit und der Fülle der gesammelten Informationen in vielen Bereichen der klinischen Diagnostik, einschließlich genetischer Erkrankungen und Krebs, nicht-invasiver pränataler Tests (NIPT) und Präzisionsmedizin, weit verbreitet eingesetzt. Dementsprechend gehen die hohen Qualitätsstandards von NGS-Oligos über Reinheit und Genauigkeit hinaus, die normalerweise auf Standard-Oligos angewendet werden. Darüber hinaus müssen auch andere Standards berücksichtigt werden, die die NGS-Ergebnisse beeinflussen, wie z. B. Kreuzkontamination und genaue Quantifizierung.

GenScript bietet NGS-Adapter für die Vorbereitung von Ligations- und Tagmentationsbibliotheken, die mit Illumina Truseq und Nextera kompatibel sind. Wir bieten On-Shelf-Unique-Dual-Index (UDI)-Adapterpaare und benutzerdefinierte Adapter für Ihre Sequenzierungsplattform. Unsere strenge Qualitätskontrolle garantiert eine viel geringere Kreuzkontaminationsrate als der Industriestandard.


Sequenzierung der nächsten Generation für Anfänger

Diese Ressourcen decken wichtige Themen der Next-Generation-Sequencing (NGS) für Anfänger ab. Wir führen Sie durch den Arbeitsablauf, die Tutorials und die Planung Ihres ersten Experiments.

Die weltweite Wirkung von NGS

Die Sequenzierung der nächsten Generation revolutioniert die Forschung und ermöglicht Experimente, die zuvor nicht möglich waren.

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Vorteile der Sequenzierung der nächsten Generation

Vergleichen Sie NGS mit anderen Technologien und sehen Sie, ob es für Sie und Ihre Forschungsziele geeignet ist.

NGS vs. Sanger-Sequenzierung

Lernen Sie die wichtigsten Unterschiede zwischen den Technologien kennen und sehen Sie, wann NGS eine effektivere Option sein kann.

NGS vs. qPCR

Entdecken Sie, wie NGS im Vergleich zu qPCR eine höhere Erkennungsleistung bietet, was es zu einer nützlichen Methode zur Quantifizierung von Variationen macht.

NGS vs. Microarrays

Finden Sie heraus, warum die RNA-Sequenzierung mit NGS einen großen Dynamikbereich und eine hohe Sensitivität für den Nachweis neuer Transkripte bietet.

So funktioniert NGS

Der grundlegende Sequenzierungsprozess der nächsten Generation umfasst das Fragmentieren von DNA/RNA in mehrere Teile, das Hinzufügen von Adaptern, das Sequenzieren der Bibliotheken und das erneute Zusammensetzen zu einer genomischen Sequenz. Im Prinzip ähnelt das Konzept der Kapillarelektrophorese. Der entscheidende Unterschied besteht darin, dass NGS Millionen von Fragmenten massiv parallel sequenziert, was die Geschwindigkeit und Genauigkeit verbessert und gleichzeitig die Kosten für die Sequenzierung reduziert.

So funktioniert NGS

Ihr NGS-Workflow

Vorbereiten
Reihenfolge
Analysieren

Die Sequenzierung der nächsten Generation umfasst drei grundlegende Schritte: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse. Finden Sie Ressourcen, die Ihnen bei der Vorbereitung auf jeden Schritt helfen, und sehen Sie sich einen beispielhaften Arbeitsablauf für die mikrobielle Gesamtgenomsequenzierung an, eine gängige NGS-Anwendung.

NGS-Tutorials für Anfänger

Der Einstieg in NGS kann einfacher sein, als Sie erwarten. Sehen Sie sich unsere kostenlosen Tutorials für jeden der wichtigsten Schritte im Workflow an. Möchten Sie eine personalisierte Schulung für Ihr Labor, die von Angesicht zu Angesicht oder virtuell durchgeführt wird? Auch das bieten wir an.

Planung eines NGS-Budgets

Die Kosten für NGS sind in den letzten Jahren dramatisch gesunken, sodass Labore jeder Größe die Sequenzierung in ihre Studien einführen können. Bei der Budgetplanung sind einige Faktoren zu berücksichtigen, z. B. die Laborausstattung und das Probenvolumen.

Erste Schritte mit NGS-Grundlagen

Beginnen wir mit einem detaillierten Überblick über die wichtigsten Schritte im Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation.

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Zusätzliche Ressourcen

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Glossar der Next-Generation-Sequenzierung

Hier finden Sie Definitionen für gängige Begriffe und Illustrationen wichtiger Konzepte in NGS.

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Innovative Technologien

Unser Ziel bei Illumina ist es, innovative Technologien auf die Analyse genetischer Variation und Funktion anzuwenden und damit Studien zu ermöglichen, die noch vor wenigen Jahren undenkbar waren. Für uns ist es geschäftskritisch, innovative, flexible und skalierbare Lösungen zu liefern, um die Bedürfnisse unserer Kunden zu erfüllen. Als globales Unternehmen, das großen Wert auf kollaborative Interaktionen, schnelle Bereitstellung von Lösungen und höchste Qualität legt, sind wir bestrebt, diese Herausforderung zu meistern. Die innovativen Sequenzierungs- und Array-Technologien von Illumina treiben bahnbrechende Fortschritte in der Life-Science-Forschung, der translationalen Genomik und Verbrauchergenomik sowie der Molekulardiagnostik voran.


Bioinformatische und biostatistische Methoden zur DNA-Methylom-Analyse von Fettleibigkeit

Sarah Amandine Caroline Voisin , in Computergestützte Epigenetik und Krankheiten , 2019

Welche Software und Datensätze sollte ich verwenden, um DNA-Methylierungsdaten im Zusammenhang mit Fettleibigkeit zu analysieren?

Unabhängig von der gewählten DNA-Methylierungstechnik (RRBS, Illumina-Arrays, MeDIP-seq, Me-DIP-Chip usw.) ermöglichten die jüngsten koordinierten Bemühungen der Bioinformatik-Community die Vorverarbeitung, Filterung, Normalisierung und Durchführung aller Arten von statistischen Analysen von DNA-Methylierungsdaten mit der Statistiksoftware R. Im Jahr 2003 wurde das Open-Source-Projekt Bioconductor ins Leben gerufen mit dem Ziel, Werkzeuge für die Analyse und das Verständnis von genomischen Hochdurchsatzdaten unter Verwendung der Programmiersprache R bereitzustellen. Es erwies sich als äußerst erfolgreich und ist heute die führende Plattform für die Analyse von DNA-Methylierungsdaten, sei es im Zusammenhang mit Adipositas oder in anderen Krankheitskontexten [15] . Von den 1473 Paketen, die jetzt auf der Website [16] sind, enthalten 68 Algorithmen zur Vorverarbeitung und Analyse von DNA-Methylierungsdaten. Die exzellente Übersicht von Teschendorff und Relton beschrieb diese Algorithmen und Softwarepakete für nachgelagerte Analysen von DNA-Methylierungsdaten im Detail, einschließlich Algorithmen zur Zelltyp-Dekonvolution, Merkmalsauswahl sowie Pathway-, integrative und System-Level-Analyse [17] .

Es ist fair zu sagen, dass es keinen Goldstandard für die Vorverarbeitung von DNA-Methylierungsdaten von Illumina-Beadchips gibt, aber es gibt einige wichtige Schritte, die umgesetzt werden sollten, um die Validität der Ergebnisse zu erhöhen. Zunächst ist es wichtig, eine Logit-Transformation von β-Werten, die den Methylierungsprozentsatz bei einem gegebenen CpG darstellen, in M-Werte durchzuführen. β-Werte reichen von 0 (kein Allel ist methyliert) bis 1 (alle Allele sind methyliert) und sind notorisch heteroskedastisch, wenn sie nahe 0 und 1 liegen. Dies ist ein Problem für die meisten statistischen Tests, die von Homoskedastizität ausgehen, aber dies kann vermieden werden durch unter Verwendung von M-Werten, definiert als M = log 2 ( β 1 − β ), da M-Werte näherungsweise homoskedastisch sind [18] . Die meisten Studien führen ihre Analysen mit M-Werten durch und berichten ihre Ergebnisse mit β Werte, da β Werte haben eine einfachere biologische Interpretation. Zweitens ist es von größter Bedeutung, die beiden unterschiedlichen Sondendesigns auf den Illumina HumanMethylation 450k- und EPIC-Chips zu berücksichtigen, die als Typ-I- und Typ-II-Designs bezeichnet werden. Speziell, β Werte von Typ-II-Sonden sind weniger genau und reproduzierbar als Typ-I-Sonden und zeigen unterschiedliche Verteilungen [19] . Es ist möglich, diesem Unterschied im Sondendesign Rechnung zu tragen, indem entweder die beiden Sondentypen getrennt analysiert werden oder die Methylierungswerte direkt mit Peak-basierter Korrektur (PBC) [19] normalisiert werden, Beta-Mixture Quantile (BMIQ) Normalisierung [20 ] oder Regression on Correlated Probes (RCP) [21]. Es gibt nur geringfügige Leistungsunterschiede zwischen diesen Methoden, aber RCP scheint sie alle zu übertreffen und rechnerisch effektiv zu sein [21] . Schließlich werden Proben häufig auf verschiedenen Platten und an verschiedenen Stellen auf den Platten untersucht, was bekannte Batch-Effekte mit sich bringt, die dramatische Auswirkungen auf die nachgeschaltete Analyse haben könnten, wenn die Probenverteilung auf den Platten zwischen den Gruppen ungleich ist. Es ist möglich, diesen Batch-Effekt zu kompensieren, indem entweder die Plattennummer und der Ort auf der Platte als Kovariaten in der statistischen Analyse hinzugefügt werden oder indem die Methylierungsdaten mit empirischen Bayes-Methoden (ComBat) normalisiert werden [22] , Surrogatvariablenanalyse ( SVA) [23] , funktionale Normalisierung [24] , Unerwünschte Variation entfernen (RUVm) [25] und BEclear [26] . ComBat ist eine sehr beliebte Methode, die einfach zu implementieren ist, aber RUVm ist besonders nützlich für die Analyse von sehr „chaotischen“ Datensätzen, wie beispielsweise solchen, die versuchen, Proben aus mehreren Labors/Studien zu kombinieren [25] .

Wissenschaftler sollten sich bemühen, mehrere Datensätze aus verschiedenen Studien zu kombinieren oder ihre Ergebnisse in verschiedenen Kohorten zu replizieren, um ihre Ergebnisse zu stärken. DNA-Methylierungsdaten sind nicht so sensibel wie genetische Daten und werden leichter in der wissenschaftlichen Gemeinschaft geteilt. Immer mehr Zeitschriften fordern nun Autoren auf, ihre rohen und verarbeiteten DNA-Methylierungsdaten in Open-Access-Repositorien zu hinterlegen, bevor eine Veröffentlichung akzeptiert wird. Die Plattformen Gene Expression Omnibus (GEO) [27] und ArrayExpress [28] enthalten mehrere Tausend DNA-Methylierungsdatensätze beim Menschen, die für Forschungsgruppen, die an DNA-Methylierungsdaten arbeiten, einen wertvollen und wenig genutzten Schatz darstellen. Beispielsweise verwendete eine große epigenomweite Assoziationsstudie (EWAS) des Body-Mass-Index [14] einen Datensatz aus der GEO-Datenbank, um gewebeübergreifende Korrelationsanalysen durchzuführen in mehreren Geweben. Es kann jedoch schwierig sein, phänotypische Daten zu Proben zu erhalten, die auf solchen Open-Access-Plattformen hinterlegt sind, da Autoren dazu neigen, beim Hochladen von Datensätzen nur ein Minimum an phänotypischen Informationen zu teilen. Es wird dann zu einer entmutigenden Aufgabe, jeden Autor jedes Datensatzes zu kontaktieren, und es sollten Anstrengungen unternommen werden, um diese phänotypischen Informationen zugänglicher zu machen.


NGS-Workflow-Schritte

Der Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation umfasst drei grundlegende Schritte: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse. Lernen Sie die Grundlagen der einzelnen Schritte kennen und erfahren Sie, wie Sie Ihren NGS-Workflow planen.

Vorbereitung auf den NGS-Workflow

Isolieren und reinigen Sie Ihre Nukleinsäure, bevor Sie mit dem Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation beginnen. Einige DNA-Extraktionsmethoden können Inhibitoren einführen, die die enzymatischen Reaktionen, die im NGS-Workflow auftreten, negativ beeinflussen können. Verwenden Sie für beste Ergebnisse ein Extraktionsprotokoll, das für Ihren Probentyp optimiert ist. Konvertieren Sie für RNA-Sequenzierungsexperimente RNA durch reverse Transkription in cDNA.

Nach der Extraktion erfordern die meisten NGS-Workflows einen QC-Schritt. Wir empfehlen die Verwendung von UV-Spektrophotometrie für die Reinheitsbewertung und fluorometrische Methoden für die Nukleinsäurequantifizierung.

Schritt 1 im NGS-Workflow: Bibliotheksvorbereitung

Die Bibliotheksvorbereitung ist entscheidend für den Erfolg Ihres NGS-Workflows. Dieser Schritt bereitet DNA- oder RNA-Proben so vor, dass sie mit einem Sequenzer kompatibel sind. Sequenzierungsbibliotheken werden typischerweise erstellt, indem DNA fragmentiert und an beiden Enden spezialisierte Adapter hinzugefügt werden. Im Illumina-Sequenzierungsworkflow enthalten diese Adapter komplementäre Sequenzen, die es den DNA-Fragmenten ermöglichen, an die Fließzelle zu binden. Fragmente können dann amplifiziert und gereinigt werden.

Um Ressourcen zu sparen, können mehrere Bibliotheken zusammengelegt und im selben Lauf sequenziert werden – ein Vorgang, der als Multiplexing bezeichnet wird. Während der Adapterligation werden jeder Bibliothek eindeutige Indexsequenzen oder „Barcodes“ hinzugefügt. Diese Barcodes werden verwendet, um bei der Datenanalyse zwischen den Bibliotheken zu unterscheiden.

Ressourcen zur Bibliotheksvorbereitung

Hier finden Sie Anleitungen zur Bibliotheksquantifizierung und Qualitätskontrolle.

Erfahren Sie, wie Sie bei der Reinigung von DNA/RNA Kontaminationen vermeiden.

Schritt 2 im NGS-Workflow: Sequenzierung

Während des Sequenzierungsschritts des NGS-Workflows werden Bibliotheken auf eine Fließzelle geladen und auf dem Sequenzer platziert. Die Cluster von DNA-Fragmenten werden in einem Prozess namens Cluster-Generierung amplifiziert, was zu Millionen von Kopien einzelsträngiger DNA führt. Bei den meisten Illumina-Sequenzierungsinstrumenten erfolgt das Clustering automatisch.

In einem Prozess, der als Sequenzierung durch Synthese (SBS) bezeichnet wird, binden chemisch modifizierte Nukleotide durch natürliche Komplementarität an den DNA-Matrizenstrang. Jedes Nukleotid enthält ein fluoreszierendes Tag und einen reversiblen Terminator, der den Einbau der nächsten Base blockiert. Das Fluoreszenzsignal zeigt an, welches Nukleotid hinzugefügt wurde, und der Terminator wird gespalten, damit die nächste Base binden kann.

Nach dem Lesen des Vorwärts-DNA-Strangs werden die Reads weggewaschen und der Vorgang wiederholt sich für den Rückwärtsstrang. Diese Methode wird Paired-End-Sequenzierung genannt.

Sequenzierung durch Synthesetechnologie

Schritt 3 im NGS-Workflow: Datenanalyse

Nach der Sequenzierung identifiziert die Gerätesoftware Nukleotide (ein Vorgang, der als Basenaufruf bezeichnet wird) und die vorhergesagte Genauigkeit dieser Basenaufrufe. Während der Datenanalyse können Sie Ihre Sequenzierungsdaten in ein Standardanalysetool importieren oder eine eigene Pipeline einrichten.

Heute können Sie mit intuitiven Datenanalyse-Apps NGS-Daten ohne Bioinformatik-Schulung oder zusätzliches Laborpersonal analysieren. Diese Tools bieten Sequenzabgleich, Variantenaufruf, Datenvisualisierung oder Interpretation.

Erfahren Sie mehr über Datenanalyse

Starten Sie Ihren NGS-Workflow

Sie möchten schneller starten? Wenden Sie sich über unseren Workflow Design and Evaluation Service an Experten für experimentelles Design.* Wir helfen Ihnen, einen für Sie passenden NGS-Workflow zu entwerfen, Ihre Proben zu verarbeiten und Ihren ersten NGS-Datensatz zu generieren.

*Nicht verfügbar in den Ländern Asiens und Südpazifik.

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Mikrobielle Sequenzierung des gesamten Genoms

Die mikrobielle Sequenzierung des gesamten Genoms kann verwendet werden, um Krankheitserreger zu identifizieren, Genome zu vergleichen und antimikrobielle Resistenzen zu analysieren. Unser vorgestellter NGS-Workflow für diese Anwendung beschreibt die empfohlenen Schritte. Der gesamte Workflow verläuft von der DNA zu den Daten in weniger als 24 Stunden.

DNA-Isolierung

Verwenden Sie ein Extraktionskit, um DNA aus mikrobiellen Kolonien zu isolieren, ohne Inhibitoren einzuführen. Wir empfehlen die Verwendung von Glasperlen. Beurteilen Sie die Reinheit mit UV-Spektrophotometrie und quantifizieren Sie DNA mit fluorometrischen Methoden.

Bibliotheksvorbereitung

Bereiten und quantifizieren Sie Bibliotheken gemäß dem im Illumina DNA Prep Guide aufgeführten Protokoll. Sie können auch eine optionale Bibliotheksqualitätsprüfung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer oder Advanced Analytical Fragment Analyzer durchführen. Du brauchst:

2,5 Stunden
Geschätzter DNA-Input: 1–500 ng

Sequenzierung

Sequenzbibliotheken in einem 2 × 150 bp-Lauf nach dem im iSeq 100-Systemhandbuch aufgeführten Protokoll. Du brauchst:

19,5 Stunden
Geschätzte Ausgabe: 1,2 Gb pro 2 × 150 bp-Lauf
Proben pro Lauf: 4–5 Proben unter Annahme von 5 Mb bei 50-facher Abdeckung

Datenanalyse

Analysieren Sie Daten mit der BWA Aligner-App und visualisieren Sie Daten mit der Integrative Genomics Viewer-App in BaseSpace Sequence Hub. Du brauchst:


CD Genomics Blog

Erkunden Sie den von uns entwickelten Blog, einschließlich genomischer Bildung, genomischer Technologien, genomischer Fortschritte sowie Neuigkeiten und Ansichten zur Genomik.

Prinzip und Arbeitsablauf von Illumina Next-Generation Sequencing

Illumina, 1998 in San Diego, CA, gegründet, ist ein führendes Unternehmen im Bereich der Sequenzierung. Im Jahr 2006 erwarb Illumina Solexa, bekam die Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation und entwickelte sie zu einer Mainstream-Technologie auf dem Markt. Es bietet derzeit Sequenzierungssysteme wie MiSeq, HiSeq 2500, HiSeq 3000, HiSeq 4000, HiSeq X Ten, HiSeq X five, NextSeq 550.

Illumina NGS-Anwendungen

Das Kernprinzip von Illumina NGS

Die Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode von Illumina basiert auf Sequencing-by-Synthesis (SBS) und reversiblen Farbstoff-Terminatoren, die die Identifizierung einzelner Basen ermöglichen, wenn sie in DNA-Stränge eingeführt werden.

Der Arbeitsablauf von Illumina NGS

Schritt 1. Bibliotheksvorbereitung

Durch Ultraschallfragmentierung wird die genomische DNA zu DNA-Fragmenten mit einer Länge von 200-500bp. Die 5’- und 3’-Adapter werden an die beiden Enden dieser kleinen Segmente hinzugefügt, „Tagmentation“ kombiniert die Fragmentierungs- und Ligationsreaktionen in einem einzigen Schritt, was die Effizienz des Bibliotheksvorbereitungsprozesses erheblich erhöht. Adaptor-ligierte Fragmente werden dann PCR-amplifiziert und gelgereinigt. Die Sequenzierungsbibliothek wird konstruiert.

Abbildung 1. Der 1. Schritt: Bibliotheksvorbereitung

Schritt 2. Cluster-Generierung

Die Fließzelle ist ein Kanal zur Adsorption mobiler DNA-Fragmente, und sie ist auch ein Reaktorbehälter für die Kernsequenzierung – die gesamte Sequenzierung findet hier statt. Die DNA-Fragmente in der Sequenzierungsbibliothek heften sich zufällig an die Spuren auf der Oberfläche der Fließzelle, wenn sie diese passieren. Jede Fließzelle hat 8 Bahnen, jede Bahn hat eine Reihe von Adaptern, die an der Oberfläche befestigt sind, die den Adaptern entsprechen können, die an den Enden des DNA-Fragments im Bauprozess hinzugefügt wurden, weshalb die Fließzelle die DNA nach dem Bau adsorbieren kann. und kann die Amplifikation der Brücken-PCR auf der Oberfläche der DNA unterstützen. Theoretisch besteht zwischen diesen Fahrspuren keine gegenseitige Beeinflussung.

Die Brücken-PCR wurde unter Verwendung der Adapter auf der Fließzellenoberfläche als Matrize durchgeführt, nach kontinuierlichen Amplifikations- und Mutationszyklen wird jedes DNA-Fragment schließlich in Bündeln an ihren jeweiligen Stellen geclustert, von denen jedes viele Kopien einer einzelnen DNA-Matrize enthält.

Der Zweck dieses Prozesses besteht darin, die Signalintensität der Base zu verstärken, um die Signalanforderungen für die Sequenzierung zu erfüllen. Wenn die Clustergenerierung abgeschlossen ist, sind diese Vorlagen für die Sequenzierung bereit.

Abbildung 2. Der 2. Schritt: Cluster-Generierung

Schritt 3. Sequenzierung

Die Sequenzierungsmethode basiert auf Sequencing-by-Synthesis (SBS). Dem Reaktionssystem wurden DNA-Polymerase, Konnektorprimer und 4 dNTP mit basenspezifischen Fluoreszenzmarkern zugesetzt. Die 3′-OH dieser dNTP werden durch chemische Methoden geschützt, wodurch sichergestellt wird, dass während des Sequenzierungsprozesses jeweils nur eine Base hinzugefügt wird. Alle nicht verwendeten freien dNTP und DNA-Polymerase werden nach Beendigung der Synthesereaktion eluiert.

Dann wird die für die Fluoreszenzanregung benötigte Pufferlösung zugegeben, das Fluoreszenzsignal wird durch einen Laser angeregt und das Fluoreszenzsignal wird durch eine optische Ausrüstung aufgezeichnet.

Schließlich wird das optische Signal durch Computeranalyse in eine Sequenzierungsbasis umgewandelt. Wenn das Fluoreszenzsignal aufgezeichnet wird, wird ein chemisches Reagens hinzugefügt, um das Fluoreszenzsignal zu löschen und die dNTP 3′-OH-Schutzgruppe zu entfernen, damit die nächste Sequenzierungsreaktion durchgeführt werden kann.

Abbildung 3. Der 3. Schritt: Sequenzierung

Schritt 4. Ausrichtung und Datenanalyse

Die neu identifizierten Sequenz-Reads werden mit einem Referenzgenom abgeglichen, dann sind viele Variationen der bioinformatischen Analyse möglich, wie z.

Abbildung 4. Der vierte Schritt: Ausrichtung und Datenanalyse.

Das Obige ist eine Übersicht über die Chemie von Illumina NGS, die SBS-Technologie ermöglicht die Single-End- und Two-End-Sequenzierung und verbessert die Fähigkeit, jedes Genom vollständig zu identifizieren.


Inhalt

Die Sequenzierungstechnologie von Illumina funktioniert in drei grundlegenden Schritten: Amplifizieren, Sequenzieren und Analysieren. Der Prozess beginnt mit gereinigter DNA. Die DNA wird fragmentiert und Adapter hinzugefügt, die Segmente enthalten, die als Referenzpunkte während der Amplifikation, Sequenzierung und Analyse dienen. Die modifizierte DNA wird auf eine Fließzelle geladen, wo Amplifikation und Sequenzierung stattfinden. Die Durchflusszelle enthält Nanowells, die Fragmente verteilen und bei Überfüllung helfen. [6] Jedes Nanowell enthält Oligonukleotide, die einen Ankerpunkt für die Anheftung der Adapter bieten. Sobald die Fragmente angefügt sind, beginnt eine Phase namens Cluster-Generierung. Dieser Schritt macht etwa tausend Kopien jedes DNA-Fragments und wird durch Brückenamplifikations-PCR durchgeführt. Als nächstes werden Primer und modifizierte Nukleotide auf den Chip gewaschen. Diese Nukleotide haben einen reversiblen 3'-Fluoreszenzblocker, sodass die DNA-Polymerase jeweils nur ein Nukleotid an das DNA-Fragment anfügen kann. [6] Nach jeder Syntheserunde nimmt eine Kamera ein Bild des Chips auf. Ein Computer ermittelt anhand der Wellenlänge des fluoreszierenden Tags, welche Base hinzugefügt wurde und zeichnet sie für jeden Fleck auf dem Chip auf. Nach jeder Runde werden nicht eingebaute Moleküle weggespült. Ein chemischer Deblockierungsschritt wird dann verwendet, um die 3’-fluoreszierende terminale Blockierungsgruppe zu entfernen. Der Prozess wird fortgesetzt, bis das vollständige DNA-Molekül sequenziert ist. [5] Mit dieser Technologie werden Tausende von Stellen im gesamten Genom gleichzeitig durch massive parallele Sequenzierung sequenziert.

Genomische Bibliothek Bearbeiten

Nachdem die DNA gereinigt wurde, muss eine DNA-Bibliothek, eine genomische Bibliothek, erzeugt werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, eine genomische Bibliothek zu erstellen: Sonifikation und Tagmentation. Bei der Tagmentation schneiden Transposasen die DNA zufällig in Fragmente zwischen 50 und 500 bp und fügen gleichzeitig Adapter hinzu. [6] Eine genetische Bibliothek kann auch erzeugt werden, indem man die genomische DNA mittels Sonifikation fragmentiert. Bei der Sonifikation wird die DNA mithilfe von Ultraschallwellen in ähnliche Größen fragmentiert. Rechte und linke Adapter müssen nach der Beschallung durch T7-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase angebracht werden. Stränge, die keine ligierten Adapter aufweisen, werden weggespült. [7]

Adapter Bearbeiten

Adapter enthalten drei verschiedene Segmente: die zum festen Träger komplementäre Sequenz (Oligonukleotide auf der Fließzelle), die Strichcodesequenz (Indizes) und die Bindungsstelle für den Sequenzierungsprimer. [6] Indizes sind normalerweise sechs Basenpaare lang und werden während der DNA-Sequenzanalyse verwendet, um Proben zu identifizieren. Indizes ermöglichen die gemeinsame Bearbeitung von bis zu 96 verschiedenen Proben, dies wird auch als Multiplexing bezeichnet. Während der Analyse gruppiert der Computer alle Lesevorgänge mit demselben Index. [8] [9] Illumina verwendet einen „Sequenz durch Synthese“-Ansatz. [9] Dieser Prozess findet in einer acrylamidbeschichteten Glasflusszelle statt. [10] Die Flusszelle hat Oligonukleotide (kurze Nukleotidsequenzen), die den Boden der Zelle bedecken, und sie dienen als fester Träger, um die DNA-Stränge während der Sequenzierung an Ort und Stelle zu halten. Beim Waschen der fragmentierten DNA über die Fließzelle bindet der geeignete Adapter an den komplementären festen Träger.

Brückenverstärkung Bearbeiten

Nach dem Anhängen kann die Cluster-Generierung beginnen. Das Ziel ist es, Hunderte von identischen DNA-Strängen zu erzeugen. Einige werden der vordere Strang sein, der Rest, der umgekehrte. Aus diesem Grund werden rechte und linke Adapter verwendet. Cluster werden durch Brückenverstärkung erzeugt. DNA-Polymerase bewegt sich entlang eines DNA-Strangs und erzeugt seinen komplementären Strang. Der ursprüngliche Strang wird weggewaschen, sodass nur der umgekehrte Strang übrig bleibt. An der Spitze des reversen Strangs befindet sich eine Adaptersequenz. Der DNA-Strang biegt sich und bindet an das Oligo, das komplementär zur oberen Adaptersequenz ist. Polymerasen heften sich an den Rückwärtsstrang, und sein komplementärer Strang (der mit dem Original identisch ist) wird hergestellt. Die nun doppelsträngige DNA wird denaturiert, so dass jeder Strang separat an eine an der Fließzelle verankerte Oligonukleotidsequenz anlagern kann. Einer wird der Rückwärtsstrang sein, der andere der Vorwärtsstrang. Dieser Prozess wird Brückenverstärkung genannt und findet gleichzeitig für Tausende von Clustern in der gesamten Fließzelle statt. [11]

Klonverstärkung Bearbeiten

Immer wieder verbiegen sich DNA-Stränge und heften sich an den festen Träger. DNA-Polymerase synthetisiert einen neuen Strang, um ein doppelsträngiges Segment zu erzeugen, das denaturiert wird, so dass alle DNA-Stränge in einem Bereich aus einer einzigen Quelle stammen (klonale Amplifikation). Die klonale Amplifikation ist für die Qualitätskontrolle wichtig. Wenn sich herausstellt, dass ein Strang eine ungerade Sequenz hat, können Wissenschaftler den umgekehrten Strang überprüfen, um sicherzustellen, dass er das Komplement der gleichen Kuriosität hat. Die Vorwärts- und Rückwärtsstränge dienen als Kontrollen zum Schutz vor Artefakten. Da die Illumina-Sequenzierung DNA-Polymerase verwendet, wurden Basensubstitutionsfehler beobachtet [12], insbesondere am 3'-Ende. [13] Paired-End-Reads in Kombination mit der Cluster-Generierung können bestätigen, dass ein Fehler aufgetreten ist. Die Reverse- und Forward-Stränge sollten zueinander komplementär sein, alle Reverse-Reads sollten zueinander passen und alle Forward-Reads sollten zueinander passen. Wenn ein Lesevorgang seinen Gegenstücken (mit denen es ein Klon sein sollte) nicht ähnlich genug ist, ist möglicherweise ein Fehler aufgetreten. In einigen Laboranalysen wurde ein Mindestschwellenwert von 97% Ähnlichkeit verwendet. [13]

Sequenz durch Synthese Bearbeiten

Am Ende der klonalen Amplifikation werden alle Rückwärtsstränge aus der Fließzelle gewaschen, so dass nur Vorwärtsstränge übrig bleiben. Ein Primer bindet an die Adaptor-Primer-Bindungsstelle des Vorwärtsstrangs, und eine Polymerase fügt dem DNA-Strang ein fluoreszenzmarkiertes dNTP hinzu. Da der Fluorophor als Blockierungsgruppe fungiert, kann pro Runde nur eine Base hinzugefügt werden, jedoch ist die Blockierungsgruppe reversibel. [6] Unter Verwendung der Vierfarbenchemie hat jede der vier Basen eine einzigartige Emission, und nach jeder Runde zeichnet die Maschine auf, welche Base hinzugefügt wurde. Sobald die Farbe aufgezeichnet ist, wird das Fluorophor weggewaschen und ein weiteres dNTP wird über die Fließzelle gespült und der Vorgang wird wiederholt. dATPs, dTTPs, dGTPs und dCTPs werden separat über die Zelle gespült, damit jedes Nukleotid identifiziert werden kann.

Beginnend mit der Einführung des NextSeq und später des MiniSeq führte Illumina eine neue Zweifarben-Sequenzierungschemie ein. Nukleotide werden entweder durch eine von zwei Farben (rot oder grün), keine Farbe ("schwarz") oder durch die Kombination beider Farben (erscheinend orange als Mischung aus Rot und Grün) unterschieden.

Nachdem der DNA-Strang gelesen wurde, wird der gerade hinzugefügte Strang weggewaschen. Dann bindet der Index-1-Primer, polymerisiert die Index-1-Sequenz und wird weggewaschen. Der Strang bildet wieder eine Brücke und das 3'-Ende des DNA-Strangs heftet sich an ein Oligo auf der Fließzelle. Der Index-2-Primer bindet, polymerisiert die Sequenz und wird weggewaschen.

Eine Polymerase sequenziert den komplementären Strang oben auf den gewölbten Strang. Sie trennen sich und das 3'-Ende jedes Strangs wird blockiert. Der Vorwärtsstrang wird weggewaschen, und der Prozess der Sequenzierung durch Synthese wiederholt sich für den Rückwärtsstrang.

Datenanalyse Bearbeiten

Die Sequenzierung erfolgt für Millionen von Clustern gleichzeitig, und jeder Cluster hat

1.000 identische Kopien eines DNA-Inserts. [12] Die Sequenzdaten werden analysiert, indem Fragmente mit überlappenden Bereichen, sogenannte Contigs, gefunden und aneinander gereiht werden. Wenn eine Referenzsequenz bekannt ist, werden die Contigs dann zur Variantenidentifikation mit dieser verglichen.

Dieser stückweise Prozess ermöglicht es Wissenschaftlern, die vollständige Sequenz zu sehen, obwohl nie eine unfragmentierte Sequenz ausgeführt wurde, da die Leselängen von Illumina nicht sehr lang sind [13] (HiSeq-Sequenzierung kann Leselängen von etwa 90 bp erzeugen [8] ), kann es ein Kampf, um kurze Tandem-Wiederholungsbereiche aufzulösen. [8] [12] Auch wenn die Sequenz de novo ist und keine Referenz existiert, können wiederholte Bereiche eine Menge Schwierigkeiten bei der Sequenzzusammenstellung verursachen. [12] Zusätzliche Schwierigkeiten sind Basensubstitutionen (insbesondere am 3'-Ende von Reads [13] ) durch ungenaue Polymerasen, chimäre Sequenzen und PCR-Bias, die alle dazu beitragen können, eine falsche Sequenz zu erzeugen. [13]

Diese Technik bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Sequenzierungsmethoden wie der Sanger-Sequenzierung. Die Sanger-Sequenzierung erfordert zwei Reaktionen, eine für den Vorwärtsprimer und eine andere für den Rückwärtsprimer. Im Gegensatz zu Illumina verwendet die Sanger-Sequenzierung fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs), um die Sequenz des DNA-Fragments zu bestimmen. ddNTPs fehlt die 3'-OH-Gruppe und beendet die DNA-Synthese dauerhaft. [6] In jedem Reaktionsröhrchen werden dNTPs und ddNTPs zusammen mit DNA-Polymerase und Primern hinzugefügt. Das Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs ist von Bedeutung, da die Matrizen-DNA vollständig synthetisiert werden muss und ein Überschuss an ddNTPs mehrere Fragmente der gleichen Größe und Position der DNA-Matrize erzeugt. Wenn die DNA-Polymerase ein ddNTP hinzufügt, wird das Fragment terminiert und ein neues Fragment synthetisiert. Jedes synthetisierte Fragment ist ein Nukleotid länger als das letzte. Nach vollständiger Synthese der DNA-Matrize werden die Fragmente durch Kapillarelektrophorese getrennt. Am Boden des Kapillarröhrchens regt ein Laser die fluoreszenzmarkierten ddNTPs an und eine Kamera erfasst die emittierte Farbe.

Aufgrund des automatisierten Charakters der Illumina-Farbstoffsequenzierung ist es möglich, mehrere Stränge gleichzeitig zu sequenzieren und schnelle Sequenzierungsdaten zu erhalten. Bei der Sanger-Sequenzierung kann jeweils nur ein Strang sequenziert werden und ist relativ langsam. Illumina verwendet nur DNA-Polymerase im Gegensatz zu mehreren teuren Enzymen, die für andere Sequenzierungstechniken (d. h. Pyrosequenzierung) erforderlich sind. [14]

Die Illumina-Sequenzierung wurde verwendet, um Transkriptome der Süßkartoffel [15] und der Gattung Gymnosperm zu erforschen Taxus. [16]


Das Mikrobiom bei Infektionskrankheiten

Gezielte metagenomische Sequenzierung

Gezielte metagenomische Sequenzierung ist die DNA-Sequenzierung einer spezifisch amplifizierten Region des Genoms. Die 16S rRNA- und 18S rRNA-Gene sind die am häufigsten verwendeten Ziele für Bakterien/Archaea bzw. Eukaryoten. Anhand der Diversität ribosomaler RNA-Sequenzen kann man die Struktur des Mikrobioms in Bezug auf Präsenz und relative Häufigkeit untersuchen. Der konventionelle Ansatz beinhaltet das Klonen von Genen voller Länge nach der PCR (mit Primern, die das Zielgen aus einer Vielzahl von Mikroorganismen amplifizieren), gefolgt von einer Sequenzierung. Der in der Vergangenheit verwendete (kapillarbasierte) Sequenzierungsansatz von Sanger wurde durch Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation (NGS) ersetzt. 16

16S rRNA-Gen

16S-rRNA-Gene haben konservierte und variable Regionen ( 8-3ai ), wobei konservierte Bereiche die phylogenetische Verwandtschaft zwischen Spezies widerspiegeln (und als Stellen für das PCR-Priming verwendet werden) und hoch variable Regionen, die Unterschiede zwischen Spezies widerspiegeln. Kapillarbasierte Sequenzierung (Erzeugung

750 bp Leselänge) erfordert 2–3 Lesevorgänge, um das gesamte Gen abzudecken (

1,6 KB). Dieser Ansatz ist zwar sehr genau (aufgrund der Fähigkeit, die volle Länge des 16S-rRNA-Gens zu erfassen), jedoch kostspielig, zeitaufwendig, materialineffizient und arbeitsintensiv. NGS-Plattformen (wie 454/Roche, Ion-Torrent und Illumina) produzieren viel tiefere Stichproben der mikrobiellen Gemeinschaften und senken gleichzeitig die für die Datengenerierung erforderlichen Kosten. Die 400-500 bp Leselänge der 454/Roche-Plattform hat eine sehr geringe Fehlerrate und kann auch bis zu drei der neun hypervariablen Regionen (z. B. V1 bis V3 oder V3 bis V5) abdecken. Insgesamt können 96 Proben pro Region profiliert werden, insgesamt 192 Proben pro Lauf, und

5000 Lesevorgänge pro Probe. Obwohl die Sensitivität (in Bezug auf die Fähigkeit, Taxa auf der niedrigsten taxonomischen Ebene zu identifizieren) dieses Ansatzes nicht so hoch ist wie die der Volllängen-16S-rRNA-Gensequenzierung, hat die Pyrosequenzierung unser Verständnis des Mikrobioms erheblich verbessert. Ein kostengünstiger, skalierbarer Ansatz mit hohem Durchsatz zur Probenahme mikrobieller Gemeinschaften wird durch beide Ion-Torrent-Sequenzer (Ion PGM TM Sequencer und Ion Proton ™ ) ermöglicht, die bis zu 400 bp Sequenz-Reads generieren können, 17,18 und die Illumina MiSeq-Plattform 19, die gepaarte Lesevorgänge mit 250–300 bp generieren kann. Die MiSeq-Plattform ist auch in der Lage, eine einzelne Region abzutasten, die von einem einzelnen Read abgedeckt wird, oder bis zu drei Regionen, was die Montage der gepaarten Reads erfordert. In einem einzigen MiSeq-Lauf können insgesamt 384 Proben mit

20 000 Reads pro Sample (im Durchschnitt insgesamt 7 Millionen assemblierte Reads). Es sollte beachtet werden, dass Primer, die entworfen sind, um bestimmte variable Regionen einzufangen ( 8-3 ), bestimmte taxonomische Kladen unterrepräsentieren können. Um diese Verzerrung durch Primerpaare zu quantifizieren und zu charakterisieren, haben Studien sogenannte „Mock“-Gemeinschaften konstruiert, in denen die Zusammensetzung der Bakterienarten und ihre Repräsentation bekannt sind. 20

Die 16S-Sequenzanalyse umfasst die analytische Verarbeitung (Trimmen, Screening und Alignment von Sequenzen), gefolgt von einem mikrobiellen Profiling durch Vergleiche mit 16S-rRNA-Sequenzen in öffentlichen Datenbanken oder aus operationellen taxonomischen Einheiten (OTU) (siehe Abbildung 8-2 ) unter Verwendung der Häufigkeitsverteilung von Sequenzen in Behältern gefunden werden (unter Verwendung eines akzeptierten Schwellenwerts von 3 % Unähnlichkeitsgrad für Arten und 5 % für Gattungen). Die gewählte taxonomische Tiefe ist häufig situationsabhängig. Zu den ökologischen Parametern, die Gemeinschaften definieren, gehören Reichtum, Vielfalt und Gleichmäßigkeit. Reichtum berücksichtigt die Anzahl einzigartiger Bakterien in einer Gemeinschaft, und Vielfalt spiegelt den Reichtum und die relative Häufigkeit von Bakterien in der Population wider (z. Evenness steht für die Gleichberechtigung der Gemeinschaft und basiert auf der Bewertung von Reichtum und Vielfalt (z. B. Shannon-Gerechtigkeitsindex). After determining ecological parameters, comparisons within and between groups (α and β diversity, respectively) are performed, and the level of saturation within the studied cohort per microbiome is determined (γ diversity) ( Figure 8-2 ).

18S rRNA Gene

Similar to the bacterial 16S rRNA genes, the eukaryotic 18S rRNA gene has conserved and variable regions. 18S rRNA gene sequences and their associated transcribed spacers (internal transcribed spacer ITS) 21,22 are used to classify fungi and eukaryotes. 23,24 ITS includes ITS1 (located between 18S and 5.8S rDNA) and ITS2 (between 5.8S and 28S rDNA Figure 8-3aii ). The variability in ITS1 and ITS2 is greater than 18S rDNA gene variability, so it is used to identify fungi and lower eukaryotes at species and subspecies levels. Co-sequencing of both 18S rDNA and ITS (e.g. ITS1-5.8S-ITS2) can provide more comprehensive classification of the eukaryotic components of the human microbiome. Selection for the amplification of the target region must be performed carefully because of primer biases (e.g., reference 25 ).

There is no current agreement as to the optimal regions to be amplified and sequenced. It is often a balance between finding primers that best amplify a determinative region, at the risk of losing the ability to more broadly characterize a bacterial and fungal/eukaryotic biomass. Targeted co-sequencing of the bacterial 16s rRNA and eukaryotic 18S rRNA genes 26–28 has been shown to efficiently characterize the microbiota on different habitats of the human body.


Ergebnisse

We used five methods that take advantage of iTru or iNext indexing primers developed in Adapterama I in six exemplar amplicon sequencing projects. These projects illustrate the range of methodological approaches that can be used to overcome challenges of amplicon library preparation and fulfill most of the characteristics of an ideal amplicon library preparation system.

In all but one project (Table 4, project 1), we designed fusion primers to generate amplicons that can be amplified by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers to create full-length Illumina TruSeq (or Nextera) libraries. The indexed fusion primers utilize 20 (i.e., 8 + 12) internal identifying sequences with an edit distance ≥ 3 (Table 1) to create up to 96 internally dual-indexed amplicon libraries which were used individually or pooled for additional outer indexing by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers. Sequential PCRs that start with internally indexed primers create quadruple-indexed amplicon libraries that achieve our design goals of cost reduction, facilitation of large-scale multiplexing, increased base-diversity for Illumina sequencing, and maximization of efficiency of library preparation.

In our project characterizing the blood meals of kissing bugs (Table 4, project 1), we obtained an average of 116,902 reads for each sample and identified a total of five unique vertebrate species as the source of the blood meals. In our project identifying fungal pathogens in tree tissues (Table 4, project 2), we obtained an average of 436,825 reads per pool (i.e., 96 samples) and characterized the diverse fungal communities found in these samples. In our project characterizing plethodontid salamander communities from environmental DNA samples (Table 4, project 3), we obtained an average of 163,555 reads for each PCR replicate and identified reads matching 6/7 species expected to be present in the streams. In our project comparing basal DNA methylation of p21 (Table 4, project 4), we obtained approximately 10,000 reads per sample and detected differences in methylation of CpG sites between embryonic kidney cells and human proximal tubule cell (Kolli et al., 2019). In our project characterizing bacterial gut microbiomes (Table 4, project 5), we rarified to 15,000 quality-filtered reads per sample and identified an average of 3,847 OTUs per sample. In our project focused on the fine-scale population genetic analysis of Glyzinien (Table 4, project 6), we obtained an average of 1,697 reads per sample and discovered little evidence of population structure among samples. Variation in the average number of reads among projects reflects the intentional allocation of reads when pooling with genomic libraries for sequencing for example, we pooled plates of libraries for the fungal pathogen project in relative quantities intended to generate approximately 4,000 reads per sample. Variation in the number of reads among samples within a given project likely reflects quantification error and variation in input DNA quantity and quality. Full results and associated figures for each project are detailed in File S3.

Figure 4: Total cost of experiments across the five methods given a number of samples.

(EIN) Method 1 Method 2 Method 3 Method 4 Method 5
iTru buy-in $500 $500 $500 $500 $500
Oligo buy-in $103 $460 $290 $40 $445
Library Cost per sample $18.86 Variable Variable $4.44 Variable
Fixed cost $18.86 $3.12 $1.39 $4.44 $1.39
Variable cost $4.07 $17.52 $4.07
(B) Library Cost per Sample for the given # of samples
# samples 1 $18.86 $7.19 $18.91 $4.44 $5.46
2 $18.86 $5.16 $10.15 $4.44 $3.43
8 $18.86 $3.63 $3.58 $4.44 $1.90
12 $18.86 $3.46 $2.85 $4.44 $1.73
24 $18.86 $3.29 $2.12 $4.44 $1.56
48 $18.86 $3.20 $1.75 $4.44 $1.47
96 $18.86 $3.16 $1.57 $4.44 $1.43
(C) Total experiment cost for given # of samples or plates (96 samples per plate)
# samples 1 $621.86 $967.19 $808.91 $544.44 $950.46
2 $640.72 $970.31 $810.30 $548.87 $951.85
8 $753.87 $989.03 $818.64 $575.48 $960.19
12 $829.31 $1,001.50 $824.20 $593.22 $965.75
24 $1,055.62 $1,038.94 $840.87 $646.45 $982.43
48 $1,508.24 $1,113.80 $874.23 $752.90 $1,015.78
96 $2,413.48 $1,263.53 $940.94 $965.80 $1,082.49
# plates 2 $4,223.96 $1,567.06 $1,091.87 $1,391.60 $1,219.98
3 $6,034.44 $1,870.59 $1,242.81 $1,817.40 $1,357.47
4 $7,844.92 $2,174.12 $1,393.74 $2,243.20 $1,494.95
5 $9,655.40 $2,477.66 $1,544.68 $2,669.00 $1,632.44

The costs associated with each method vary significantly, and which approach has the lowest cost depends on the number of samples processed (Fig. 4: note axis scales are not linear Table 5 File S6). In all cases, we present the costs associated with targeting a single locus for projects targeting multiple loci, these numbers can be adjusted to estimate the costs of purchasing necessary primers (i.e., locus-specific primers or fusion primers) and for more complicated pooling schemes. Methods 1 and 4 have the lowest buy-in cost, but the cost of library preparations are fixed, rather than decreasing as the number of samples increases. The constant cost per sample is due to the need for individual second round PCRs (e.g., iTru5/7). The other methods allow pooling of samples prior to second round PCR, which reduces costs. Because Method 1, with no use of fusion primers (non-indexed/indexed), has the highest library preparation costs per sample, it quickly becomes the most expensive method, more than doubling the cost of most other methods with as few as 96 samples. Method 4 remains economically reasonable for processing one or two plates of samples but becomes less reasonable as more plates of samples are used. Method 2 is never economically best, but it is sometimes necessary to achieve sufficient amplification to construct the desired libraries. Thus, Method 2 is only viable when the other methods fail. Method 3 has a moderate buy-in cost and the second-lowest cost per sample for large numbers of samples. Also, Method 3 has the lowest cost when ≤11 plates of samples will be processed, though the cost is very similar to Method 5 after ≥2 plates of samples are processed. Method 5 has the second highest buy-in costs, but the lowest costs per sample when large numbers of samples are processed. Method 5 is optimal when >12 plates of samples are processed. Because Methods 3 and 5 are similar in cost after a few plates of samples are processed, other considerations, such as workflow and personnel costs, are likely to drive decisions about the optimal method rather than the costs of reagents.


Supplementary Figure 1

Sequences of adapters, amplification and sequencing primers. Adapter sequences of a regular single-indexed Illumina multiplex library (as obtained using Illumina's TruSeq DNA sample preparation kit, cat. no. FC-121-2001/2002, or following the protocol provided in ref. 21 of the main text) are shown on top. Libraries prepared from single-stranded DNA differ by a deletion of 5 bp in the P5 adapter. Both library types are compatible with double-indexed sequencing (see ref. 22 of the main text for details). Amplification and sequencing primers are indicated by arrows. Primers with prefix 'IS' are further described in ref. 21 of the main text. (PDF 364 kb)

Supplementary Figure 2

Characterization of two DNA libraries prepared with and without uracil removal from a Neanderthal DNA extract (panels on the right and left, respectively). A) Fragment length distributions of the amplified libraries obtained from chip electrophoresis using the Bioanalyzer 2100. B) Fragment size distributions obtained from sequencing (the fraction of mapped sequences is indicated by a dotted line). C) Frequency of C to T substitutions around 5′and 3′ends of Neanderthal sequences. D) Average GC-content of Neanderthal sequences as a function of fragment size. (PDF 397 kb)

Supplementary Figure 3

Quality control of single-stranded adapter oligonucleotide CL78. From two independently synthesized batches of the oligonucleotide, 10 pmol were loaded onto a 10% denaturing polyacrylamide gel, next to a size marker (lane 1 20/100 ladder). The gel was run for 35 min at 200V and stained with SybrGold dye. While no impurities were detected in the first batch (lane 2), the second batch (lane 3) is dominated by a double-length artifact, representing an extreme example of poor oligonucleotide synthesis quality. (PDF 197 kb)

Supplementary Figure 4

Determining the optimal cycle number for indexing PCR using the qPCR amplification plots. Shown are the amplification plots obtained from quantifying the libraries prepared in the experiment described in 'Anticipated results'. The saturation phase of PCR starts after cycle 18 (sample libraries, red and blue) and cycle 23 (blank library, green), respectively. Assuming full amplification efficiency (i.e. a doubling of library molecules in each cycle), the optimal cycle number for indexing PCR can be determined as follows by correcting for differences in reaction volumes and the amount of template DNA: (i) qPCR was performed in 25 μl reactions, whereas indexing PCR is performed in 100 μl volume. Thus, 2 cycles should be added to allow for 4 times more end product. (ii) One microliter of a 1:20 library dilution was used for measurement, whereas 24 μl of the library are used for indexing PCR (480 times as much). This corresponds to 8.9 (rounded 9) cycles that should be deducted. Thus, 11 and 16 were estimated to be the optimal cycle numbers for indexing PCR. (PDF 278 kb)

Supplementary Table 1

Program settings of Cooling-ThermoMixer MKR13 recommended for single-stranded library preparation. The device may also be used to replace the vortexer in bead resuspension steps (use 'short mix' button). (PDF 255 kb)

Supplementary Table 2

P5 and P7 indexing primers. An identical set of P7 indexing primers was published before in ref. 21 of the main text. (PDF 331 kb)


Schau das Video: 454 Sequencing (Kann 2022).


Bemerkungen:

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