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E5. DNA-bindende Medikamente - Biologie

E5. DNA-bindende Medikamente - Biologie


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Die meisten heute verwendeten Medikamente binden an spezifische Proteine ​​und stören die Aktivität des Proteins. Stuart Schreiber von Harvard ist auf diesem Gebiet führend.

Eine andere Möglichkeit, die spezifische Gentranskription zu hemmen, besteht darin, eine kleine einzelsträngige DNA an die dsDNA zu binden, um eine Tripelhelix zu bilden. Das einzelsträngige DNA-Molekül kann an exponierte H-Bindungs-Donoren und -Akzeptoren von Basen binden, die nicht an Watson-Crick-H-Brücken-Wechselwirkungen zwischen komplementären Basen in der ds-DNA beteiligt sind.

Abbildung: Tripelhelix

Der Einzelstrang bindet an solche Donoren, die im Haupt-Hain der dsDNA zugänglich sind.

Peptid-Nukleinsäure-Analoga, wie unten gezeigt, sind vielversprechende neue Medikamente. Sie sind weniger geladen als Nukleinsäuren (können also leichter eine Membran passieren) und sind resistent gegen Spaltung durch Proteasen und Nukleasen. Man könnte sich vorstellen, dass sie an bestimmte Nukleotidsequenzen binden und Prozesse wie DNA-Replikation und Transkription hemmen.

Transkriptionsfaktoren, die im Allgemeinen durch genetische Ereignisse oder vorgeschaltete Signalwege aktiviert werden, sind Schlüsselregulatoren des Zellzustands. Aufgrund der ausgedehnten Protein-Protein-Schnittstellen und des allgemeinen Fehlens von hydrophoben Taschen, die Protein:Protein-Wechselwirkungen, die für die Transkriptionsregulation erforderlich sind, hemmen könnten, war es schwierig, Medikamente zu entwickeln, die an Transkriptionsfaktoren binden und deren Aktivität modulieren. Möllering et al. berichten über eine erfolgreiche Entwicklung eines direkt wirkenden Antagonisten eines onkogenen Transkriptionsfaktors, NOTCH1. Dieser Antagonist besteht aus zelldurchlässigen stabilisierten α-helikalen Peptiden, SAHMs, die durch Zugabe von zwei nichtnatürlichen Alkenylaminosäuren zu einer stabilen Helix "gestapelt" wurden, die das Peptid durch Ringschluss sterisch in einer alpha-Helix zurückhalten. Die Helix ahmte eine Protein:Protein-Schnittstellenregion im ternären Komplex von DNA:NOTCH1:MAML1 (einem Coaktivatorprotein) nach. Die Peptide antagonisierten die NOTCH-Signalgebung und die Zellproliferation in Zellen der akuten lymphoblastischen T-Zell-Leukämie (T-ALL).


DNA-Bindungslaborstruktursammlung

DNA-Bindungslaborstruktursammlung

Die DNA-Bindungslabor-Struktursammlung ist eine eigenständige Laboraktivität mit einer Reihe von "unbekannten Strukturen", die die Schüler erkunden, um mehr über die DNA-Struktur und die Wechselwirkungen zwischen DNA und anderen Molekülen zu erfahren. Dieses Labor ist sowohl für Gymnasiasten als auch für College-Studenten geeignet.

Viele grundlegende Schritte in der Biologie beginnen, wenn Proteine ​​an DNA binden. Proteine ​​kopieren DNA, schneiden DNA, reparieren DNA, verwenden DNA als Vorlage, um RNA herzustellen, wickeln DNA in Strukturen ein, die ihr helfen, in den Zellkern zu passen, und binden an DNA, um all diese Prozesse zu kontrollieren. Auch andere Moleküle wie Anti-Tumor-Medikamente oder Antibiotika können DNA binden. Manchmal blockieren diese anderen Moleküle Aktivitäten wie die DNA-Replikation und -Transkription. Manchmal verursachen sie Probleme und führen zu Krankheiten wie Krebs.

In diesem Labor für digitale Biologie arbeiten die Studenten mit molekularen Strukturen, um die großen und kleinen Furchen in der DNA zu identifizieren und zu sehen, wie es aussieht, wenn Proteine ​​oder Medikamente an diese Regionen binden. Mit dem Molecule World DNA Binding Lab können Sie Ihrem Klassenzimmer-Toolkit molekulare Modellierung hinzufügen.

Ein Satz unbekannter Strukturen bietet ein Werkzeug zur Beurteilung, indem jeder Schüler eine andere Struktur untersuchen und bestimmen kann, ob ein Protein oder Medikament an die große Furche, die kleine Furche oder beides bindet, und ein Bild aufnehmen, um es als Beweis vorzulegen, um ihre Schlussfolgerung zu untermauern .

***Wir haben diese App durch eine Sammlung von Strukturen ersetzt, die in Molecule World verwendet werden können. Gehe zum DNA-Bindungslabor-Struktursammlung um den Satz der DNA-Strukturen herunterzuladen und die Laboranweisungen zu erhalten.


Kleinmolekül-Interaktion mit einer G-Quadruplex-Struktur aus fünf Guanin-Trakten des menschlichen MYC-Promotors

Es ist allgemein anerkannt, dass die DNA neben der Watson-Crick-Doppelhelix auch andere biologisch relevante Strukturen annehmen kann. Ein aktuelles wichtiges Beispiel ist die Guanin-Quadruplex (G-Quadruplex)-Struktur, die von Guanin-Trakten gebildet wird, die sich in der MYC- (oder c-myc)-Promotorregion befinden und die Transkription des MYC-Onkogens reguliert. Die Stabilisierung dieses G-Quadruplex durch Liganden, wie das kationische Porphyrin TMPyP4, verringert den Transkriptionsspiegel von MYC. Hier berichten wir über die erste Struktur eines DNA-Fragments mit fünf Guanin-Trakten aus dieser Region. Eine ungewöhnliche G-Quadruplex-Faltung, die aus NMR-Restraints unter Verwendung eindeutiger modellunabhängiger Resonanzzuordnungsansätze abgeleitet wurde, umfasst einen Kern aus drei gestapelten Guanin-Tetraden, die aus vier parallelen Guanin-Trakten mit allen Anti-Guaninen und einem syn-Guanin am 3'-Ende mit Snapback gebildet werden. Wir haben die Struktur des zwischen diesem G-Quadruplex und TMPyP4 gebildeten Komplexes bestimmt. Diese strukturellen Informationen, kombiniert mit Details der Interaktion mit kleinen Molekülen, bieten eine Plattform für das Design von Krebsmedikamenten, die auf Sequenzen des Multi-Guanin-Trakts abzielen, die in MYC und anderen onkogenen Promotoren sowie in Telomeren vorkommen.

Interessenkonflikt-Erklärung

ERKLÄRUNG ZU WETTBEWERBLICHEN INTERESSEN

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Figuren

NMR-Studie der MEIN C…

NMR-Studie der MEIN C Guanin-reiche Sequenzen des Promotors. ( ein ) Die 600…

Struktur der Pu24I Quadruplex.…

Struktur der Pu24I Quadruplex. ( ein ) Stereoansicht von acht überlagerten…

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Interaktion zwischen den Pu24I Quadruplex und verschiedene Liganden, wie durch NMR überwacht. (…

NMR-Studie der Pu24I…

NMR-Studie der Pu24I –TMPyP4-Komplex. ( ein ) Die Struktur von…

Sechs überlagerte raffinierte Strukturen aus…

Sechs überlagerte verfeinerte Strukturen des Pu24I Quadruplex-TMPyP4-Komplex. ( ein ) Seite…


Inhalt

Beim Menschen ist die TP53 Gen befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 (17p13.1). [8] [9] [10] [11] Das Gen umfasst 20 kb, mit einem nicht-kodierenden Exon 1 und einem sehr langen ersten Intron von 10 kb. Die kodierende Sequenz enthält fünf Regionen, die einen hohen Konservierungsgrad in Vertebraten zeigen, hauptsächlich in den Exons 2, 5, 6, 7 und 8, aber die in Wirbellosen gefundenen Sequenzen zeigen nur entfernte Ähnlichkeit mit Säuger-TP53. [fünfzehn] TP53 Orthologe [16] wurden bei den meisten Säugetieren identifiziert, für die vollständige Genomdaten verfügbar sind.

Menschliches TP53-Gen Bearbeiten

Beim Menschen beinhaltet ein häufiger Polymorphismus die Substitution eines Arginins durch ein Prolin an der Codonposition 72. Viele Studien haben einen genetischen Zusammenhang zwischen dieser Variation und der Anfälligkeit für Krebs untersucht, die Ergebnisse waren jedoch umstritten. So konnte beispielsweise eine Metaanalyse aus dem Jahr 2009 keinen Zusammenhang für Gebärmutterhalskrebs aufzeigen. [17] Eine Studie aus dem Jahr 2011 ergab, dass die TP53 Die Prolin-Mutation hatte einen tiefgreifenden Einfluss auf das Risiko für Bauchspeicheldrüsenkrebs bei Männern. [18] Eine Studie an arabischen Frauen ergab, dass Prolin-Homozygotie bei TP53 Codon 72 ist mit einem verringerten Brustkrebsrisiko verbunden. [19] Eine Studie legte nahe, dass TP53 Codon 72-Polymorphismen, MDM2 SNP309 und A2164G können gemeinsam mit der Anfälligkeit für nicht-oropharyngealen Krebs in Verbindung gebracht werden und dass MDM2 SNP309 in Kombination mit TP53 Codon 72 kann die Entwicklung von nicht-oropharyngealem Krebs bei Frauen beschleunigen. [20] Eine Studie aus dem Jahr 2011 ergab, dass TP53 Codon-72-Polymorphismus war mit einem erhöhten Lungenkrebsrisiko verbunden. [21]

Metaanalysen aus dem Jahr 2011 fanden keine signifikanten Assoziationen zwischen TP53 Codon-72-Polymorphismen und sowohl das Darmkrebsrisiko [22] als auch das Endometriumkarzinomrisiko. [23] Eine Studie aus dem Jahr 2011 an einer brasilianischen Geburtskohorte fand einen Zusammenhang zwischen dem nicht mutierten Arginin TP53 und Personen ohne Krebs in der Familienanamnese. [24] Eine weitere Studie aus dem Jahr 2011 ergab, dass der p53-homozygote (Pro/Pro)-Genotyp mit einem signifikant erhöhten Risiko für Nierenzellkarzinome verbunden war. [25]

  1. eine saure N-terminale Transkriptionsaktivierungsdomäne (TAD), auch als Aktivierungsdomäne 1 (AD1) bekannt, die Transkriptionsfaktoren aktiviert. Der N-Terminus enthält zwei komplementäre transkriptionelle Aktivierungsdomänen, eine größere an den Resten 1–42 und eine untergeordnete an den Resten 55–75, die spezifisch an der Regulation mehrerer pro-apoptotischer Gene beteiligt sind. [26]
  2. Aktivierungsdomäne 2 (AD2) wichtig für die apoptotische Aktivität: Reste 43–63. reiche Domäne, die für die apoptotische Aktivität von p53 durch Kernexport über MAPK wichtig ist: Reste 64–92.
  3. zentrale DNA-bindende Kerndomäne (DBD). Enthält ein Zinkatom und mehrere Arginin-Aminosäuren: Reste 102–292. Diese Region ist für die Bindung des p53-Corepressors LMO3 verantwortlich. [27] (NLS)-Domäne, Reste 316–325.
  4. Homo-Oligomerisierungsdomäne (OD): Reste 307–355. Tetramerisierung ist essentiell für die Aktivität von p53 in vivo. an der Herunterregulierung der DNA-Bindung der zentralen Domäne beteiligt: ​​Reste 356–393. [28]

Mutationen, die p53 bei Krebs deaktivieren, treten normalerweise in der DBD auf. Die meisten dieser Mutationen zerstören die Fähigkeit des Proteins, an seine Ziel-DNA-Sequenzen zu binden, und verhindern somit die transkriptionelle Aktivierung dieser Gene. Als solche sind Mutationen in der DBD rezessive Mutationen mit Funktionsverlust. Moleküle von p53 mit Mutationen in der OD dimerisieren mit Wildtyp-p53 und hindern sie daran, die Transkription zu aktivieren. Daher haben OD-Mutationen einen dominanten negativen Einfluss auf die Funktion von p53.

Wildtyp-p53 ist ein labiles Protein, das gefaltete und unstrukturierte Regionen umfasst, die auf synergistische Weise funktionieren. [29]

DNA-Schäden und -Reparatur Bearbeiten

p53 spielt über mehrere Mechanismen eine Rolle bei der Regulation oder dem Fortschreiten des Zellzyklus, der Apoptose und der genomischen Stabilität:

  • Es kann DNA-Reparaturproteine ​​aktivieren, wenn die DNA beschädigt wurde. Daher kann es ein wichtiger Faktor beim Altern sein. [30]
  • Es kann das Wachstum stoppen, indem es den Zellzyklus am G1/S-Regulationspunkt bei der Erkennung von DNA-Schäden hält – wenn es die Zelle lange genug hier hält, haben die DNA-Reparaturproteine ​​Zeit, den Schaden zu beheben, und die Zelle kann weiterlaufen der Zellzyklus.
  • Es kann Apoptose (d. h. den programmierten Zelltod) einleiten, wenn sich eine DNA-Schädigung als irreparabel erweist.
  • Es ist essentiell für die Seneszenzreaktion auf kurze Telomere.

WAF1/CIP1 kodiert für p21 und Hunderte anderer Downstream-Gene. p21 (WAF1) bindet an die G1-S/CDK (CDK4/CDK6, CDK2 und CDK1)-Komplexe (für den G1/S-Übergang im Zellzyklus wichtige Moleküle) und hemmt deren Aktivität.

Wenn p21(WAF1) mit CDK2 komplexiert wird, kann die Zelle nicht mit der nächsten Zellteilungsstufe fortfahren. Ein mutiertes p53 bindet DNA nicht mehr effektiv, und folglich steht das p21-Protein nicht mehr als "Stoppsignal" für die Zellteilung zur Verfügung. [31] Studien an humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) beschreiben häufig die nicht funktionelle p53-p21-Achse des G1/S-Checkpoint-Wegs mit anschließender Relevanz für die Zellzyklusregulation und die DNA-Schadensantwort (DDR). Wichtig ist, dass p21-mRNA nach der DDR in hESCs eindeutig vorhanden und hochreguliert ist, aber das p21-Protein ist nicht nachweisbar. In diesem Zelltyp aktiviert p53 zahlreiche microRNAs (wie miR-302a, miR-302b, miR-302c und miR-302d), die direkt die p21-Expression in hESCs hemmen.

Das p21-Protein bindet direkt an Cyclin-CDK-Komplexe, die den Zellzyklus vorantreiben und deren Kinaseaktivität hemmen, wodurch ein Zellzyklusarrest verursacht wird, um eine Reparatur zu ermöglichen. p21 kann auch einen mit Differenzierung verbundenen Wachstumsstopp und einen mit zellulärer Alterung verbundenen dauerhafteren Wachstumsstopp vermitteln. Das p21-Gen enthält mehrere p53-Antwortelemente, die eine direkte Bindung des p53-Proteins vermitteln, was zu einer transkriptionalen Aktivierung des für das p21-Protein kodierenden Gens führt.

Die Wege von p53 und RB1 sind über p14ARF verbunden, was die Möglichkeit erhöht, dass sich die Wege gegenseitig regulieren. [32]

Die Expression von p53 kann durch UV-Licht stimuliert werden, was ebenfalls DNA-Schäden verursacht. In diesem Fall kann p53 Ereignisse auslösen, die zur Bräunung führen. [33] [34]

Stammzellen Bearbeiten

Der p53-Spiegel spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung von Stammzellen während der gesamten Entwicklung und für den Rest des menschlichen Lebens.

In humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) wird p53 auf einem niedrigen inaktiven Niveau gehalten. [35] Dies liegt daran, dass die Aktivierung von p53 zu einer schnellen Differenzierung von hESCs führt. [36] Studien haben gezeigt, dass das Knock-out von p53 die Differenzierung verzögert und dass das Hinzufügen von p53 eine spontane Differenzierung verursacht, was zeigt, wie p53 die Differenzierung von hESCs fördert und eine Schlüsselrolle im Zellzyklus als Differenzierungsregulator spielt. Wenn p53 in hESCs stabilisiert und aktiviert wird, erhöht es p21, um ein längeres G1 zu etablieren. Dies führt typischerweise zur Aufhebung des S-Phasen-Eintritts, was den Zellzyklus in G1 stoppt, was zur Differenzierung führt. Untersuchungen an embryonalen Stammzellen der Maus haben jedoch kürzlich gezeigt, dass die Expression von P53 nicht unbedingt zur Differenzierung führt. [37] p53 aktiviert auch miR-34a und miR-145, die dann die Pluripotenzfaktoren der hESCs unterdrücken und so die Differenzierung weiter anregen. [35]

In adulten Stammzellen ist die p53-Regulation wichtig für die Aufrechterhaltung der Stammheit in adulten Stammzellnischen. Mechanische Signale wie Hypoxie beeinflussen die p53-Spiegel in diesen Nischenzellen durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren HIF-1&agr; und HIF-2&agr;. Während HIF-1α p53 stabilisiert, unterdrückt HIF-2α es. [38] Die Unterdrückung von p53 spielt eine wichtige Rolle beim Phänotyp von Krebsstammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen und anderen Stammzellrollen und -verhalten, wie der Blastembildung. Es wurde gezeigt, dass Zellen mit verringerten p53-Spiegeln mit einer viel höheren Effizienz als normale Zellen in Stammzellen umprogrammiert werden. [39] [40] Papiere legen nahe, dass das Fehlen von Zellzyklusarrest und Apoptose mehr Zellen die Chance gibt, umprogrammiert zu werden. Es zeigte sich auch, dass erniedrigte p53-Spiegel ein entscheidender Aspekt der Blastembildung in den Beinen von Salamandern sind. [41] Die p53-Regulierung ist sehr wichtig, da sie als Barriere zwischen Stammzellen und einem differenzierten Stammzellzustand sowie als Barriere zwischen funktionellen und kanzerösen Stammzellen fungiert. [42]

Andere Bearbeiten

Abgesehen von den oben genannten zellulären und molekularen Effekten hat p53 eine Antikrebswirkung auf Gewebeebene, die durch Hemmung der Angiogenese wirkt. Wenn Tumore wachsen, müssen sie neue Blutgefäße rekrutieren, um sie zu versorgen, und p53 hemmt dies, indem es (i) mit Regulatoren der Tumorhypoxie interferiert, die auch die Angiogenese beeinflussen, wie HIF1 und HIF2, (ii) die Produktion von angiogenetischen Faktoren hemmt, und (iii) direktes Erhöhen der Produktion von Angiogenese-Inhibitoren, wie Arresten. [43] [44]

Es wurde gezeigt, dass p53 durch Regulierung des Leukämie-Hemmfaktors die Implantation in die Reproduktion von Mäusen und möglicherweise Menschen erleichtert. [45]

p53 wird als Reaktion auf unzählige Stressoren aktiviert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf DNA-Schäden (induziert durch entweder UV, IR oder chemische Mittel wie Wasserstoffperoxid), oxidativen Stress, [46] osmotischen Schock, Ribonukleotid-Depletion und deregulierte Onkogen-Expression. Diese Aktivierung ist durch zwei große Ereignisse gekennzeichnet. Erstens wird die Halbwertszeit des p53-Proteins drastisch erhöht, was zu einer schnellen Akkumulation von p53 in gestressten Zellen führt. Zweitens zwingt eine Konformationsänderung dazu, dass p53 als Transkriptionsregulator in diesen Zellen aktiviert wird. Das kritische Ereignis, das zur Aktivierung von p53 führt, ist die Phosphorylierung seiner N-terminalen Domäne. Die N-terminale Transkriptionsaktivierungsdomäne enthält eine große Anzahl von Phosphorylierungsstellen und kann als das primäre Ziel für Proteinkinasen angesehen werden, die Stresssignale übertragen.

Die Proteinkinasen, von denen bekannt ist, dass sie auf diese Transkriptionsaktivierungsdomäne von p53 abzielen, können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden. Eine erste Gruppe von Proteinkinasen gehört zur MAPK-Familie (JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK), von der bekannt ist, dass sie auf verschiedene Arten von Stress wie Membranschäden, oxidativen Stress, osmotischen Schock, Hitzeschock usw Eine zweite Gruppe von Proteinkinasen (ATR, ATM, CHK1 und CHK2, DNA-PK, CAK, TP53RK) ist am Genom-Integritäts-Checkpoint beteiligt, einer molekularen Kaskade, die verschiedene Formen von DNA-Schäden durch genotoxischen Stress erkennt und darauf reagiert. Onkogene stimulieren auch die p53-Aktivierung, die durch das Protein p14ARF vermittelt wird.

In unbelasteten Zellen werden die p53-Spiegel durch einen kontinuierlichen Abbau von p53 niedrig gehalten. Ein Protein namens Mdm2 (beim Menschen auch HDM2 genannt) bindet an p53, verhindert dessen Wirkung und transportiert es vom Zellkern zum Zytosol. Mdm2 wirkt auch als Ubiquitin-Ligase und bindet Ubiquitin kovalent an p53 und markiert so p53 für den Abbau durch das Proteasom. Die Ubiquitylierung von p53 ist jedoch reversibel. Bei Aktivierung von p53 wird auch Mdm2 aktiviert, wodurch eine Rückkopplungsschleife aufgebaut wird. p53-Spiegel können als Reaktion auf bestimmte Belastungen Oszillationen (oder wiederholte Impulse) zeigen, und diese Impulse können wichtig sein, um zu bestimmen, ob die Zellen den Stress überleben oder absterben. [47]

MI-63 bindet an MDM2 und reaktiviert p53 in Situationen, in denen die Funktion von p53 gehemmt wurde. [48]

Eine Ubiquitin-spezifische Protease, USP7 (oder HAUSP), kann Ubiquitin von p53 abspalten und es dadurch vor einem proteasomabhängigen Abbau über den Ubiquitin-Ligase-Weg schützen . Dies ist ein Mittel, mit dem p53 als Reaktion auf onkogene Insults stabilisiert wird. Es wurde auch gezeigt, dass USP42 p53 deubiquitiniert und möglicherweise für die Fähigkeit von p53 erforderlich ist, auf Stress zu reagieren. [49]

Neuere Forschungen haben gezeigt, dass HAUSP hauptsächlich im Zellkern lokalisiert ist, obwohl ein Bruchteil davon im Zytoplasma und in den Mitochondrien zu finden ist. Die Überexpression von HAUSP führt zu einer p53-Stabilisierung. Eine Erschöpfung von HAUSP führt jedoch nicht zu einer Abnahme der p53-Spiegel, sondern erhöht vielmehr die p53-Spiegel aufgrund der Tatsache, dass HAUSP Mdm2 bindet und deubiquitiniert. Es wurde gezeigt, dass HAUSP in ungestressten Zellen ein besserer Bindungspartner für Mdm2 ist als p53.

Es wurde jedoch gezeigt, dass USP10 im Zytoplasma in unbelasteten Zellen lokalisiert ist und das zytoplasmatische p53 deubiquitiniert, wodurch die Mdm2-Ubiquitinierung rückgängig gemacht wird. Nach DNA-Schädigung transloziert USP10 in den Zellkern und trägt zur Stabilität von p53 bei. Auch USP10 interagiert nicht mit Mdm2. [50]

Die Phosphorylierung des N-terminalen Endes von p53 durch die oben erwähnten Proteinkinasen unterbricht die Mdm2-Bindung. Andere Proteine ​​wie Pin1 werden dann an p53 rekrutiert und induzieren eine Konformationsänderung in p53, die die Mdm2-Bindung noch mehr verhindert. Die Phosphorylierung ermöglicht auch die Bindung von transkriptionellen Coaktivatoren wie p300 und PCAF, die dann das Carboxy-terminale Ende von p53 acetylieren, wodurch die DNA-Bindungsdomäne von p53 freigelegt wird, wodurch es ermöglicht wird, spezifische Gene zu aktivieren oder zu unterdrücken. Deacetylaseenzyme wie Sirt1 und Sirt7 können p53 deacetylieren, was zu einer Hemmung der Apoptose führt. [51] Einige Onkogene können auch die Transkription von Proteinen stimulieren, die an MDM2 binden und dessen Aktivität hemmen.

Wenn die TP53 Gen beschädigt ist, ist die Tumorsuppression stark beeinträchtigt. Personen, die nur eine funktionsfähige Kopie des erben TP53 Gen wird höchstwahrscheinlich im frühen Erwachsenenalter Tumore entwickeln, eine Störung, die als Li-Fraumeni-Syndrom bekannt ist.

Die TP53 Gen kann auch durch Mutagene (Chemikalien, Strahlung oder Viren) modifiziert werden, was die Wahrscheinlichkeit einer unkontrollierten Zellteilung erhöht. Mehr als 50 Prozent der menschlichen Tumoren enthalten eine Mutation oder Deletion des TP53 Gen. [52] Der Verlust von p53 führt zu einer genomischen Instabilität, die meistens zu einem Aneuploidie-Phänotyp führt. [53]

Die Erhöhung der p53-Menge kann als Lösung zur Behandlung von Tumoren oder zur Verhinderung ihrer Ausbreitung erscheinen. Dies ist jedoch keine brauchbare Behandlungsmethode, da sie zu vorzeitiger Alterung führen kann. [54] Die Wiederherstellung der endogenen normalen p53-Funktion ist vielversprechend. Die Forschung hat gezeigt, dass diese Wiederherstellung zur Rückbildung bestimmter Krebszellen führen kann, ohne dabei andere Zellen zu schädigen. Die Art und Weise, wie die Tumorregression auftritt, hängt hauptsächlich vom Tumortyp ab. Beispielsweise kann die Wiederherstellung der endogenen p53-Funktion in Lymphomen Apoptose induzieren, während das Zellwachstum auf ein normales Niveau reduziert werden kann. Somit bietet sich die pharmakologische Reaktivierung von p53 als praktikable Option zur Krebsbehandlung an. [55] [56] Die erste kommerzielle Gentherapie, Gendicine, wurde 2003 in China zur Behandlung von Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich zugelassen. Es liefert eine funktionelle Kopie des p53-Gens unter Verwendung eines gentechnisch veränderten Adenovirus. [57]

Bestimmte Krankheitserreger können auch das p53-Protein beeinflussen, das die TP53 Gen exprimiert. Ein solches Beispiel, das humane Papillomavirus (HPV), kodiert ein Protein, E6, das an das p53-Protein bindet und es inaktiviert. Dieser Mechanismus ermöglicht in Synergie mit der Inaktivierung des Zellzyklusregulators pRb durch das HPV-Protein E7 eine wiederholte Zellteilung, die sich klinisch als Warzen manifestiert. Bestimmte HPV-Typen, insbesondere die Typen 16 und 18, können auch zu einer Progression von einer gutartigen Warze zu einer gering- oder hochgradigen zervikalen Dysplasie führen, bei der es sich um reversible Formen von Präkanzerosen handelt. Eine über Jahre anhaltende Infektion des Gebärmutterhalses kann irreversible Veränderungen verursachen, die zu einem Carcinoma in situ und schließlich zu einem invasiven Gebärmutterhalskrebs führen. Dies resultiert aus den Wirkungen von HPV-Genen, insbesondere denen, die für E6 und E7 kodieren, die die beiden viralen Onkoproteine ​​sind, die bevorzugt zurückgehalten und bei Gebärmutterhalskrebs durch Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom exprimiert werden. [58]

Das p53-Protein wird in Zellen gesunder Menschen ständig produziert und abgebaut, was zu einer gedämpften Schwingung führt. Der Abbau des p53-Proteins ist mit der Bindung von MDM2 verbunden. In einer negativen Rückkopplungsschleife wird MDM2 selbst durch das p53-Protein induziert. Mutierte p53-Proteine ​​können MDM2 oft nicht induzieren, was dazu führt, dass sich p53 in sehr hohen Konzentrationen anhäuft. Darüber hinaus kann das mutierte p53-Protein selbst normale p53-Proteinspiegel hemmen. In einigen Fällen wurde gezeigt, dass einzelne Missense-Mutationen in p53 die Stabilität und Funktion von p53 stören. [59]

Die Unterdrückung von p53 in menschlichen Brustkrebszellen führt nachweislich zu einer erhöhten CXCR5-Chemokinrezeptor-Genexpression und aktivierter Zellmigration als Reaktion auf das Chemokin CXCL13. [60]

Eine Studie ergab, dass p53- und Myc-Proteine ​​der Schlüssel zum Überleben von Zellen der chronischen myeloischen Leukämie (CML) waren. Das Targeting von p53- und Myc-Proteinen mit Medikamenten führte bei Mäusen mit CML zu positiven Ergebnissen. [61] [62]

Die meisten p53-Mutationen werden durch DNA-Sequenzierung nachgewiesen. Es ist jedoch bekannt, dass einzelne Missense-Mutationen ein breites Spektrum von eher leichten bis sehr schweren funktionellen Auswirkungen haben können. [59]

Das große Spektrum an Krebs-Phänotypen aufgrund von Mutationen in der TP53 Gen wird auch durch die Tatsache gestützt, dass verschiedene Isoformen von p53-Proteinen unterschiedliche zelluläre Mechanismen zur Krebsprävention aufweisen. Mutationen in TP53 können zu verschiedenen Isoformen führen, ihre Gesamtfunktionalität in verschiedenen zellulären Mechanismen verhindern und dadurch den Krebsphänotyp von leicht bis schwer erweitern. Jüngste Studien zeigen, dass p53-Isoformen in verschiedenen menschlichen Geweben unterschiedlich exprimiert werden und die Mutationen mit Funktionsverlust oder Funktionsgewinn innerhalb der Isoformen gewebespezifischen Krebs verursachen können oder das Potenzial für Krebsstammzellen in verschiedenen Geweben bieten. [12] [63] [64] [65] Die TP53-Mutation beeinflusst auch den Energiestoffwechsel und erhöht die Glykolyse in Brustkrebszellen. [ Zitat benötigt ]

Die Dynamik von p53-Proteinen, zusammen mit seinem Antagonisten Mdm2, zeigt, dass die Konzentrationen von p53 in Konzentrationseinheiten als Funktion der Zeit oszillieren. Diese "gedämpfte" Schwingung ist sowohl klinisch dokumentiert [66] als auch mathematisch modelliert. [67] [68] Mathematische Modelle zeigen auch, dass die p53-Konzentration viel schneller oszilliert, sobald Teratogene wie Doppelstrangbrüche (DSB) oder UV-Strahlung in das System eingebracht werden. Dies unterstützt und modelliert das derzeitige Verständnis der p53-Dynamik, bei der DNA-Schäden die p53-Aktivierung induzieren (siehe p53-Regulierung für weitere Informationen). Aktuelle Modelle können auch nützlich sein, um die Mutationen in p53-Isoformen und ihre Auswirkungen auf die p53-Oszillation zu modellieren, wodurch de novo Gewebespezifische pharmakologische Wirkstoffforschung.

p53 wurde 1979 von Lionel Crawford, David P. Lane, Arnold Levine und Lloyd Old identifiziert, die am Imperial Cancer Research Fund (UK) der Princeton University/UMDNJ (Cancer Institute of New Jersey) und am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center arbeiten. bzw. Es wurde angenommen, dass es zuvor als Ziel des SV40-Virus existierte, einem Stamm, der die Entwicklung von Tumoren induziert. Die TP53 Das Gen aus der Maus wurde erstmals 1982 von Peter Chumakov von der Akademie der Wissenschaften der UdSSR [69] und 1983 unabhängig von Moshe Oren in Zusammenarbeit mit David Givol (Weizmann Institute of Science) kloniert. [70] [71] Der Mensch TP53 Gen wurde 1984 kloniert [8] und der Volllängenklon 1985. [72]

Aufgrund der Verwendung von mutierter cDNA nach der Reinigung von Tumorzell-mRNA wurde zunächst angenommen, dass es sich um ein Onkogen handelt. Seine Rolle als Tumorsuppressorgen wurde 1989 von Bert Vogelstein von der Johns Hopkins School of Medicine und Arnold Levine von der Princeton University enthüllt. [73] [74]

Warren Maltzman vom Waksman Institute der Rutgers University zeigte erstmals, dass TP53 auf DNA-Schäden in Form von ultravioletter Strahlung anspricht. [75] In einer Reihe von Publikationen von 1991–92 berichtete Michael Kastan von der Johns Hopkins University, dass TP53 ein wichtiger Teil eines Signaltransduktionsweges ist, der Zellen hilft, auf DNA-Schäden zu reagieren. [76]

1993 wurde p53 gewählt Molekül des Jahres vom Science-Magazin. [77]

Wie 95 % der menschlichen Gene kodiert TP53 mehr als ein Protein. 2005 wurden mehrere Isoformen entdeckt und bisher 12 humane p53-Isoformen identifiziert (p53α, p53β, p53γ, ∆40p53α, ∆40p53β, ∆40p53γ, ∆133p53α, ∆133p53β, ∆133p53γ, ∆160p53α, ∆160p53β, ∆160p53β, ). Darüber hinaus werden p53-Isoformen gewebeabhängig exprimiert und p53α wird niemals allein exprimiert. [12]

Die p53-Isoformproteine ​​voller Länge können in verschiedene Proteindomänen unterteilt werden. Ausgehend vom N-Terminus gibt es zunächst die aminoterminalen Transaktivierungsdomänen (TAD 1, TAD 2), die benötigt werden, um eine Untermenge von p53-Zielgenen zu induzieren. Auf diese Domäne folgt die prolinreiche Domäne (PXXP), wobei das Motiv PXXP wiederholt wird (P ist ein Prolin und X kann eine beliebige Aminosäure sein). Es wird unter anderem für die p53-vermittelte Apoptose benötigt. [78] Einigen Isoformen fehlt die prolinreiche Domäne, wie Δ133p53β,γ und Δ160p53α,β,γ daher vermitteln einige Isoformen von p53 keine Apoptose, was die diversifizierende Rolle der TP53 Gen. [63] Danach folgt die DNA-Bindungsdomäne (DBD), die den Proteinen eine sequenzspezifische Bindung ermöglicht. Die Carboxyl-terminale Domäne vervollständigt das Protein. Es umfasst das Kernlokalisationssignal (NLS), das Kernexportsignal (NES) und die Oligomerisationsdomäne (OD). NLS und NES sind für die subzelluläre Regulation von p53 verantwortlich. Durch die OD kann p53 ein Tetramer bilden und dann an DNA binden. Unter den Isoformen können einige Domänen fehlen, aber alle teilen sich den größten Teil der hochkonservierten DNA-bindenden Domäne.

Die Isoformen werden durch unterschiedliche Mechanismen gebildet. Die Beta- und Gamma-Isoformen werden durch mehrfaches Spleißen des Introns 9 erzeugt, was zu einem anderen C-Terminus führt. Darüber hinaus verursacht die Verwendung eines internen Promotors in Intron 4 die 133- und ∆160-Isoformen, denen die TAD-Domäne und ein Teil der DBD fehlen. Darüber hinaus trägt eine alternative Initiation der Translation bei Codon 40 oder 160 die 40p53- und ∆160p53-Isoformen. [12]

Aufgrund der isoformischen Natur von p53-Proteinen gibt es mehrere Beweisquellen dafür, dass Mutationen innerhalb der TP53 Gen, das zu mutierten Isoformen führt, sind Erreger verschiedener Krebsphänotypen, von leicht bis schwer, aufgrund einer einzelnen Mutation im TP53 Gen (siehe Abschnitt Experimentelle Analyse von p53-Mutationen für weitere Details).


Platin-Interkalator-Konjugate: von DNA-gerichteten Cisplatin-Derivaten bis hin zu Adenin-Bindungskomplexen als potenzielle Modulatoren der Genregulation

Nukleare DNA ist das zelluläre Ziel vieler Krebsbehandlungen, und DNA-gerichtete Chemotherapien spielen auch in der postgenomischen Ära eine wichtige Rolle bei der Wirkstoffforschung. Die Mehrheit der auf DNA gerichteten Antikrebsmittel bindet durch kovalente Wechselwirkungen, nicht-kovalente Interkalation oder Rillenbindung oder hybride Bindungsmodi. Die Sequenz und Regiospezifität dieser Wechselwirkungen und die daraus resultierenden strukturellen Veränderungen innerhalb des Biopolymers spielen eine wichtige Rolle im Wirkmechanismus dieser Medikamente. Vermittler der zytotoxischen Wirkung dieser Wirkstoffe sind DNA-bindende Proteine ​​und/oder DNA-verarbeitende Enzyme, die ebenfalls sequenz- und groovespezifisch mit DNA wechselwirken. Ein Hauptziel bei der Entwicklung neuer klinischer Wirkstoffe dieses Typs besteht daher darin, neue Arten von Addukten auf DNA zu produzieren, die zu beispiellosen Zelltötungsmechanismen führen können. Platin-Interkalator-Konjugate sind eine solche Klasse von Hybridmitteln, die über einen dualen DNA-Bindungsmodus wirken. Das Platinzentrum (normalerweise eine cis-DiamindichlorPt(II)-Einheit) dominiert die DNA-Adduktprofile bei den meisten dieser Spezies – das Ergebnis der Tendenz des Metalls, Quervernetzungen in Reihen aufeinanderfolgender Guaninbasen in der großen Furche der DNA zu bilden. Dieses Paradigma wurde kürzlich zum ersten Mal durch das Design von zytotoxischen Platin-Acridinylthioharnstoff-Konjugaten durchbrochen, einer Klasse von Adenin-affinen Minor-Groove-gerichteten Wirkstoffen. Dieser Aufsatz fasst die wichtigsten Fortschritte in der Chemie und Biologie von Platininterkalatoren von 1984 bis 2004 zusammen, wobei der Schwerpunkt auf dem Zusammenspiel zwischen chemischer Struktur, Mechanismus der DNA-Bindung und biologischen Eigenschaften liegt.


Methoden

Generierung von Mutanten nach einem bestimmten Mutationsverhältnis

Als Mutationsstrategie für die Nachkommengeneration haben wir einen genetischen Algorithmus (GA) verwendet. In der ersten Generation wurden 10 3 Gensequenzen zufällig generiert, jede Sequenz produzierte 10 4 Nachkommen mit einer Mutationsrate von 10 –4 . Da die Strukturmodellierung und die Dockingprozesse rechenintensiv sind, wurden die Populationsgröße und die Mutationshäufigkeit auf ein rechentechnisch überschaubares Maß reduziert. Im GA-Algorithmus wurde die Populationsgröße durch Löschen der am niedrigsten eingestuften Individuen kontrolliert, sodass nur die obersten 5% der Individuen mit Mutationen zugelassen wurden. Wenn die in Frage kommende Sequenznummer 1000 überstieg, dann wurden die obersten 1000 mutierten Sequenzen ausgewählt. Die Originalsequenzen mit den höchsten Werten wurden verwendet, um die Population zu füllen, wenn die geeignete Sequenznummer weniger als 1000 betrug. Die DNA-Sequenz jedes Individuums wurde in eine Proteinsequenz übersetzt, die dann einer Proteinstrukturmodellierung und einem molekularen Docking unterzogen wurde. Der endgültige Bewertungsscore einer Mutante wurde gemäß Gl. (1). Die genetische Evolution wurde als abgeschlossen angesehen, wenn die bestrangige Mutante eine geringere Bindungsaffinität zum Wirkstoff als zu ATP zeigte.

Berechnungen der Seitenkettenpackung

Wir verwendeten das Programm Scap (http://honig.c2b2.columbia.edu/scap/), um die Strukturen der Proteinmutanten 40,41 zu modellieren. Ein Perl-Skript wurde verwendet, um das Scap-Modul aufzurufen, mit dem Ziel, die mutierten Reste in die entsprechende Variation der Proteinstruktur umzuwandeln. Scap is used to build side chain conformations using its coordinate rotamer libraries. As we do not want the mutation to change the protein structure significantly, we chose an AMBER force field with a heavy atom model and a mixed side chain rotamer library. The other parameters were set to the default values, which allowed a relatively stable mutant protein conformation. We used the Scap program to generate structures of thousands of residue mutations.

Protein-drug docking

We used the AutoDock Vina program (http://vina.scripps.edu/index.html, version 1.1.2) to build the drug-mutant and ATP-mutant structures and calculate the binding scores 69 . Default AutoDock Vina parameters were used. The superposition module in Schrödinger 70 was used to calculate the RMSD of ATP in the crystal structure and in the mutants.

ABL structures

During the simulation, we used different ABL crystal structures for different compounds. The structure of ABL complexed with ATP was derived from the ATP-peptide conjugate complex (PDB code: 2G1T) with the protein in an inactive conformation 71 . The structure used for imatinib was 2HYY with the complexed protein in an inactive conformation 72 . The structure used for nilotinib was 3CS9 with the complexed protein in an inactive conformation 73 . For dasatinib, we used 2GQG with the complexed protein in an active conformation 48 . Ponatinib was designed for the T315I mutant. It avoids steric hindrance with the side chain of isoleucine. 3IK3 (with a T315 mutation) complexed with ponatinib was also used. The mutant protein 3IK3 adopts an inactive conformation 62 . The wide-type protein structure in this case was obtained by mutating I315 back to T315.

EGFR structures

The structure of EGFR tyrosine kinase domain in complex with ATP was derived from the thiophosphoric acid O-[(adenosyl-phospho)phosphor]-S-acetamidyl-diester complex (PDB code: 2GS6) with the protein in an active conformation 74 . The structure used for gefitinib was 4I22 with the complexed protein in an active conformation 75 .

Compounds and substrates

Imatinib (MW493.6), nilotinib (MW529.52), dasatinib (MW488.01), and ponatinib (MW532.56) were purchased from Selleck (https://www.selleck.cn/). The substrate peptide was obtained from GL Biochem (Shanghai) Ltd. and had a sequence of Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-NH2 (Directory peptide Cat # 86721).

Expression and purification of ABL and mutants

The kinase domains of human c-ABL (residues 222–500, NM_005157.5) were subcloned into the NdeIch und XhoI restriction sites of the pET-28a vector 76 . The plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells, plated on LB agar containing kanamycin (50 μg mL −1 ), and grown overnight at 37 °C. The next day, the colonies from the plates were resuspended in expression media (LB agar containing kanamycin, 50 μg mL −1 ). Cultures were grown to an OD600 of 1.2 at 37 °C and cooled for 1 h with shaking at 16 °C prior to induction for 22 h at 16 °C with 0.1 mM IPTG. Cells were harvested by centrifugation at 7000 × g at 4 °C for 15 min and stored at −80 °C. The bacterial pellet was resuspended in Buffer A [50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazole] for immediate purification using nickel ion affinity chromatography. Elution of the protein from the column was achieved using a Buffer B gradient [50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole (pH 8.0)], which increased from 0% to 100% over 15 min. The eluted protein was concentrated to 2 mL and subjected to gel filtration using an S200 column 77,78 . The buffer used for the gel filtration was Buffer C [50 mM Tris, 500 mM NaCl (pH 8.0)]. The protein was eluted at 55 min. The purity of the protein was verified by SDS-PAGE.

For the mutants, primers were designed based on the predicted mutations and synthesized by GENEWIZ. Mutations were made using the Fast Site-Directed Mutagenesis kit from TIANGEN, according to the manufacturer’s instructions, and verified by DNA sequencing. The mutant proteins were expressed and purified following the expression and purification of the wt protein.

In vitro kinase inhibition assay

To assess the ability of the drug to inhibit the wt and mutant kinases, we used the ADP-Glo Kinase Assay kit from Promega 79 , which measures the amount of ADP produced in the reaction. The inhibition rates of the drugs at different concentrations were calculated by comparing the amount of ADP produced with and without the drug. Data were analyzed using the Hill1 model in the OriginLab2018 software package.

In vitro enzyme activity assay

ITC experiments were carried out using an ITC200 instrument (Microcal Inc.). ITC has been demonstrated to directly measure the kinetics and thermodynamic parameters (k Katze, K m,h) of enzymatic reactions 80 . A one-step method was used to measure the enzymatic parameters. The BCR-ABL concentration was in the nanomolar range, with the ATP/substrate concentration at least three orders of magnitude higher than the enzyme concentration and above the K m [BCR-ABL (10 nM) and substrate (1 mM) in the cell, and ATP (1 mM) in the syringe].

The thermal change (Q) is proportional to the reaction enthalpy (Δh) and the number of moles of product (n), whereas the moles of product equal the total volume (V) multiplied by the concentration [P]:

According to Eq. (3), the Δh of the reaction can be obtained by integrating the curve of the Method 1 experiment


Result and Discussion

Experimental studies shows that the ligands (Table 2) used in this study are good antileishmanials ( 4-15 ), but docking of these compounds revealed a great variation in their binding energy. Initially, totally five poses were saved from which best pose with lowest energy was chosen for each compound. Although the predicted free energy of binding is a useful descriptor of ligand–receptor complementarity, the choice of the ‘best’ docking model was ultimately dictated by various parameters of ADME/T study. Our results show that several compounds were not following the given range limit of few ADME/T properties. These include PISA (1/4 component, i.e. carbon and attached hydrogens of the SASA range, 0–400 Å 2 ), QlogPC16 (predicted log of hexadecane/gas partition coefficient range, 4–18), QlogPo/w (predicted log of octanol/water partition coefficient range, −2 to 6), QlogS (Predicted log of aqueous solubility range, −6 to 0.5 m ). QPPMDCK (predicted apparent MDCK cell permeability range, poor < 25 nm/seconds and great > 500 nm/seconds), QPlogHERG (predicted IC50 value of blockage of HERG K+ channel range, <−5) were also found to be violated by 2, 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c) and berenil, respectively (not shown in Table 4).

S. No Compound id G score SASA FOSA FISA PISA WPSA Vol QPpolrz QPlogPC16 QPlogPoct QPlogPw QPlogPo/w QPlogS QPlogHERG PHOA Rule of five Toxizität
1 1a −5.987491 560.887 190.08 127.05 243.8 0 945.45 32.727 9.978 17.222 11.989 2.019 −4.088 −5.436 88.721 0 NEIN
2 1b −4.727568 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A NEIN
3 1c −4.637121 738.471 0 98.531 639.9 0 1291.9 49.089 16.002 22.977 14.476 4.779 6.764 −8.195 100 0 NEIN
4 2a −5.621212 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A NEIN
5 2b −6.474291 551.198 374.14 3.851 173.2 0 1002.4 34.331 8.879 13.409 6.734 3.049 −2.499 −5.046 100 0 NEIN
6 2c −5.619455 734.312 512.31 176.53 45.47 0 1196 39.575 12.012 23.791 15.36 1.983 −5.99 −5.923 67.157 1 NEIN
7 2d −5.509143 N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A N / A Hoch
8 3 −10.93399 564.425 0 266.67 297.8 0 934.31 28.302 12.334 23.996 19.586 −0.02 −2.279 −5.883 40.131 1 NEIN
9 4a −11.09014 767.378 426.04 121.51 149.4 70.47 1374.1 45.769 13.979 23.249 12.698 4.021 6.408 −5.821 100 0 NEIN
10 4b −12.05836 573.216 0 220.97 352.2 0 972.25 32.267 12.575 22.054 15.909 1.681 −3.356 −5.995 57.842 1 NEIN
11 5a −10.94681 851.379 0 125.74 624.8 100.9 1506.4 54.963 19.511 29.664 16.42 6.064 8.293 −8.614 86.713 2 NEIN
12 5b −11.71767 889.017 152.68 88.545 571.1 76.73 1632.1 58.194 19.809 29.374 16.427 6.575 8.222 −8.235 96.017 2 NEIN
13 5c −11.4314 429.265 218.29 210.98 0 0 692.77 21.571 6.541 35.538 6.102 1.414 −3.354 −3.44 57.975 1 NEIN
14 5d −11.41968 911.9 152.18 102.79 605.6 51.37 1647.7 59.149 20.27 29.734 16.805 6.506 8.509 −8.63 93.195 2 NEIN
15 5e −10.88554 603.176 0 225.4 349.5 28.32 1020.4 34.168 13.239 22.196 15.51 2.19 −4.031 −6.23 60.07 1 NEIN
16 6 −9.29 537.669 484.39 53.272 0 0 966.55 31.243 8.127 14.109 6.819 2.467 −2.056 −4.93 82.28 0 NEIN
  • SASA, total solvent accessible surface area (range, 300–1000 Å 2 ) FOSA, hydrophobic component of the SASA (range, 0–750 Å 2 ) FISA, hydrophilic component of the SASA (range, 7–330 Å 2 ) PISA, 1/4 component of the SASA (range, 0–400 Å 2 ) WPSA, weakly component of SASA (range, 0–150 Å 2 ) Volume, total solvent accessible area (range: 500–2000 Å 3 ) QPpolrz, Predicted polarizability (range, 13–70 Å 3 ) QPlogPC16, rredicted log of hexadecane/gas partition coefficient (range, 4–18) QPlogPoct, predicted log of octanol/gas partition coefficient (range, 8–43) QPlogPw, predicted log of water/gas partition coefficient (range, 5–48) QPlogPo/w predicted log of octanol/water partition coefficient (range, −2 to 6) QplogS, predicted log of aqueous solubility (range, −6 to 0.5 m ) QPlogHERG, predicted IC50 value for blockage of HERG K+ channels (range, concern below −5) PHOS, per cent human oral absorption GScore, Glide Score.
  • The values in bold are out of range from the category of drug.

Hydrophobic drugs with high partition coefficients are preferentially distributed to hydrophobic compartments such as lipid bilayers of cells while hydrophilic drugs (low partition coefficients) preferentially are found in hydrophilic compartments such as blood serum. As adequate solubility and permeability is a prerequisite for drug absorption from the gastrointestinal tract, it plays a significant role for the resulting bioavailability of orally administered drugs. By violating these properties, a compound may be associated with side-effects, high or poor solubility (QlogS) that can result in poor absorption and distribution in the body.

The interactions and other scores resulted from docking studies for each compound are summarized in Table 5. The results are briefly described in the following section.

Ligand Rezeptor Interaktion
LIG.NH (37) DT4.A.O2 (148) Hydrogen bond
LIG DA6.A Hydrophob
LIG DT7.A Hydrophob
LIG DT18.B Hydrophob
LIG DA19.B Hydrophob

Acridine and its derivatives

Acridine family includes a wide range of tricyclic molecules with various biologic properties. Considered as potential antiparasitic agents since the 1990s, numerous acridine derivatives have been synthesized and successfully assessed for their antimalarial, trypanocidal or antileishmanial properties ( 19-21 ). According to a previous study, n-[6-(acetylamino)-3-acridinyl] acetamide (compound 1c) und n-[6-(benzoylamino)-3-acridinyl] (compound 1b) benzamide demonstrated highly specific antileishmanial properties against the intracellular amastigote form of the parasite ( 12 ). But our docking score suggests that only acridine (compound 1a GScore, −5.987491) was the best with no violation of any ADME/T descriptor (Table 4). Verbindung 1c was found to violate few ADME/T properties when analyzed by QikProp.

Berberin and its derivatives:

Berberine, a quaternary alkaloid and a minor groove binder ( 23 ), has demonstrated experimental and clinical efficacies against both visceral ( 4, 6, 7 ) and cutaneous ( 4 ) leishmaniases. Despite the apparent potential of this compound as an antileishmanial drug, only Putzer ( 22 ) has described the antileishmanial activity of derivatives of berberine and failed to present any biologic or chemical data to substantiate his claims. Further, in support of this study, Vennerstrom et al. ( 9 ) suggested that tetrahydroberberine (2c) was proven less toxic and more potent against Leishmania donovani than berberine (2a), n-methyl tetrahydro berberinium iodide (2b), berberine chloride (2d). In contrast to these results, we have found major variation in the data when applied in silico automated docking calculations. Our results show that n-methyl tetrahydro berberinium iodide (compound 2b) was having the best GScore (−6.474291) among all with no violence of ADME/T parameters. When studied using ToxTree software, berberine chloride (compound 2d) was analyzed as highly toxic among the all compounds (Table 4).

Berenil

Berenil (diminazene aceturate), a minor groove binder in AT-rich domain ( 24 ), has been proven a good antileishmanial previously ( 5, 8 ). Unsere in silico docking calculation with a GScore of −10.93398 and ADME/T study with no violence of any parameters is in agreement with previous studies (Table 4).

Pentamidine and its derivatives

Pentamidine (compound 5a) is one of the few antileishmanial drugs currently available. It belongs to the diamidine class of drugs, which has been suggested to exert antiparasitic activity by binding to DNA, interfering with polyamine metabolism and disrupting of mitochondrial membrane potential ( 25 ). Typically, these dicationic molecules bind to DNA by selectively interacting with AT-rich regions of the minor groove. The complementarity of the curvature of the dicationic molecules with that of the minor groove of DNA has been considered an important determinant in the interaction of such groove binders with DNA ( 26, 27 ). Pentamidine is already in clinical use but limited by toxicity, administration by injection, and development of resistance ( 10 ). In addition to pentamidine, many of diamidine molecules –n-[2-(methylsulfanyl)-4-<5-[3-(methylsulfanyl)-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura n-2-Yl> phenyl] pyridine-2-carboximidamide (5b), 2 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c), n-(3-chloro-4-<5-[2-chloro-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura n-2-yl> phenyl) pyridine-2-carboximidamide (5d), 2 4-bis-(4-amidinophenyl)furan (5e) – exhibited promising activity against Leishmania. The antileishmanial activity of several such dicationic molecules was reported earlier ( 10, 11, 13, 28 ).

Docking studies of these compounds including pentamidine reveal that all these compounds were scored a good GScore, but only compounds 5c und 5e satisfied the ADME/T parameters’ range and other three compounds viz. 5a, 5b, 5d seemed to violate few filters.

Diindolyl methane

(3,3′)-Diindolylmethane (DIM, compound 6) is a natural compound, product of acid condensation of indole-3-carbinol (I3C), found in most cruciferous vegetables of the genus Brassica. DIM inhibits an unusual bisubunit topoisomerase I from L. donovani and has been found to interact both with free enzyme and with DNA. A study has been carried out to verify the interaction between DIM-DNA ( 15 ). Their data and our result of its in silico interaction with DNA (GScore, −9.29) and ADME/T study showed that the compound can be a future drug molecule.

Duocarmycine and its derivative

The duocarmycins bind to the minor groove of DNA and alkylate the nucleobase adenine at the N3 position ( 29 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI, analog of duocarmycin (4a), was shown to inhibit the growth of the protozoan parasites L. donovani, Leishmania mexicana, in culture ( 14 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI (4b) was also shown (Figures 1 and 2) to score a good binding energy (GScore, −12.058362), and the study of ADME/T parameters with no violence of any parameters is in agreement with the previous studies (Table 4).

Illustration of binding pocket of seco-hydroxy-aza-CBI-TMI in DNA: (A) and (B) Ligand is shown as stick and DNA residues as wire. Possible hydrogen bond is shown as yellow thick line with the atoms and distance (2.844 Å).

(A) Ligand is shown in active site pocket. Active site residues are shown as surface. (B) 2D view of the complex (generated by Poseview v1.0.0 BioSolveIT GmbH, Sankt Augustin, Germany). Hydrogen bond is shown as dashed line, and residues taking part in hydrophobic interaction are in green color. Hydrophobic interactions are shown as green line.


Experimental Section

Cytotoxicity Assay

HeLa cells were seeded on 96-well tissue culture plates at 1.0 × 10 4 cells/well. After incubation in a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 24 h at 37ଌ in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS, the cells were washed with Leibovitz’s L-15 medium and treated with TAT, E3-TAT, and E5-TAT in L-15. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium and incubated at 37ଌ for 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). Alternatively, SYTOX® Blue, a nucleic acid fluorescent stain that only penetrates cells with compromised plasma membranes, was used to measure cell-viability by fluorescence microscopy imaging.

Live Cell Assay for the Transduction of Fluorescent Imaging agents

HeLa, COS-7 and COLO 316 cells were seeded on 8-well chamber glass slide at 3.0 × 10 4 cells/well in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS and incubated for 24 h at 37ଌ in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Cells were then incubated with L-15 medium (no FBS added) and placed on an inverted epifluorescence microscope (Model IX81, Olympus, Center Valley, PA) equipped with a heating stage maintained at 37ଌ. The microscope is configured with a spinning disk unit to perform both confocal and wide-field fluorescence microscopy. Images were collected using a Rolera-MGI Plus back-illuminated EMCCD camera (Qimaging, Surrey, BC, Canada). Images were acquired using phase contrast and three standard fluorescence filter sets: CFP (Ex = 436넠 nm / Em= 480녀 nm), Texas Red (Ex = 560녀 nm / Em= 630녵 nm), and FITC (Ex = 482넵 nm / Em= 536녀 nm). Cells were co-treated with of TAT or E3/E5-TAT (2 µM) in L-15 medium containing fluorescent imaging agents at 10 µM for the fluorescent proteins EGFP, mCherry, and tdTomato (obtained as previously described) and 2.5 mg/mL for the dextrans 10 and 70 kDa anionic Dextran-fluorescein, 10 and 70 kDa neutral Dextran-tetramethylrhodamine, and 70 kDa neutral Dextran-Texas Red.[10] After incubation at 4 or 37ଌ for 15 or 60 minutes, the cells were washed with PBS 5 times and the medium was replaced with fresh L-15. The integrity of the plasma membrane of the cells was determined by addition of the cell-impermeable DNA stain SYTOX® Blue. Cells with a blue fluorescent nucleus, detected with the CFP filter set, were considered compromised or dead. The cells that were not stained by SYTOX® Blue were further confirmed to be alive by detection of active transport of intracellular endocytic vesicles. To inhibit cell surface binding of the delivery peptides, heparin sodium salt (1 mg/mL) was added during the co-incubation step. To inhibit acidification of the endolysosomal organelles, cells were pretreated with bafilomycin (200 nM) for 20 min. Cells were then co-incubated with the fluorescent macromolecules and the delivery peptides in L-15 supplemented with bafilomycin (200 nM). The fluorescence intensities within cells were measured using the SlideBook 4.2 software (Olympus, Center Valley, PA). The mean intensity within cells imaged with the FITC or Texas Red filters was measured as the total intensity of the cell divided by its area. The same protocol was used for cells with either punctate or diffuse distributions. Mean fluorescence intensities were measured over a population of 3000 cells and experiments were reproduced 3 times.

Live Cell Assay for the delivery of PAD

Cells grown on 96-well plates were treated with PAD (20 µM) and TAT (5 µM) or E5-TAT (3, 5, or 7 µM) in L-15. For the inhibition of macropinocytosis, cells were first pretreated with 50 µM of amiloride (Sigma, MO) for 30 minutes, and then with the peptides while keeping amiloride present. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium again and incubated at 37ଌ for additional 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). After 1 h incubation the cells were washed with L-15. SYTOX® Blue (5 µM) was added and cells were incubated for 15 min at 37ଌ. Cells were then placed on the microscope and images were acquired in the blue fluorescence channel for detection of SYTOX® Blue and red fluorescence channel for detection of TMR.


Structures in the collection

Typ Beschreibung Download structure
An MW Collection

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A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are shown because this structure was solved by NMR.

A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are not seen because this structure was solved by X-ray diffraction.


DNA Intercalation by Quinacrine and Methylene Blue: A Comparative Binding and Thermodynamic Characterization Study

There is compelling evidence that cellular DNA is the target of many anticancer agents. Consequently, elucidation of the molecular nature governing the interaction of small molecules to DNA is paramount to the progression of rational drug design strategies. In this study, we have compared the binding and thermodynamic aspects of two known DNA-binding agents, quinacrine (QNA) and methylene blue (MB), with calf thymus (CT) DNA. The study revealed noncooperative binding phenomena for both the drugs to DNA with an affinity one order higher for QNA compared to MB as observed from diverse techniques, but both bindings obeyed neighbor exclusion principle. The data of the salt dependence of QNA and MB from the plot of log K versus log [Na + ] revealed a slope of 1.06 and 0.93 consistent with the values predicted by theories for the binding of monovalent cations, and have been analyzed for contributions from polyelectrolytic and nonpolyelectrolytic forces. The binding of both drugs was further characterized by strong stabilization of DNA against thermal strand separation in both optical melting and differential scanning calorimetry studies. The binding data analyzed from the thermal denaturation and from isothermal titration calorimetry (ITC) were in close proximity to those obtained from spectral titration data. ITC results revealed the binding to be exothermic and favored by both negative enthalpy and positive entropy changes. The heat capacity changes obtained from temperature dependence of enthalpy indicated −146 and −78 cal/(mol·K), respectively, for the binding of QNA and MB to CT DNA. Circular dichroism study further characterized the structural changes on DNA upon intercalation of these molecules. Molecular aspects of interaction of these molecules to DNA are discussed.


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Bemerkungen:

  1. Vitilar

    Zu meinem ist das Thema ziemlich interessant. Ich schlage vor, Sie können hier oder in PM diskutieren.

  2. Floyd

    Ich kann gerade nicht an der Diskussion teilnehmen - ich bin sehr beschäftigt. Ich werde freigelassen - ich werde definitiv meine Meinung zu diesem Thema äußern.

  3. Dunleigh

    Cool

  4. Devland

    Sie liegen falsch. Ich schlage vor, darüber zu diskutieren. Schreib mir per PN.



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