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Bei der DNA-Extraktion aus Pflanzen und Algen wird kein Phenol verwendet. Wieso den?

Bei der DNA-Extraktion aus Pflanzen und Algen wird kein Phenol verwendet. Wieso den?


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Ich weiß nicht, ob hier der richtige Ort ist, um diese Frage zu stellen, aber ich habe festgestellt, dass Protokolle zur Extraktion der DNA von photosynthetischen Organismen kein Phenol verwenden. Nur CTAB / Chloroform.

Wieso den?

Weil die bakterielle oder tierische Extraktion auf Phenol:Chloroform basiert.

Dankeschön


CTAB dient zur Entfernung von Polyphenolen und Polysacchariden, die in Pflanzengeweben vorkommen. Tierische Zellen/Bakterien haben diese nicht. Sie können eine zusätzliche Phenol-Chloroform-Extraktion durchführen, wenn Sie möchten.

Siehe dieses Protokoll von Monsanto.

  1. Wiegen Sie 6 g des verarbeiteten Gewebes in ein 50 ml konisches Röhrchen, das für die Zentrifugation geeignet ist. Hinweis: Bei unverarbeitetem Gewebe kann ein Wiegen vor der Verarbeitung erfolgen, solange die gesamte verarbeitete Probe in das konische Röhrchen überführt wird.

  2. Für jede 6 g Probe 25 ml einer Lösung aus 24,25 ml, vorgewärmtem (55 °C) CTAB-Extraktionspuffer, 0,5 ml 2-Mercaptoethanol (2-ME) und 0,25 ml 10 mg/ml Proteinase K für eine Endkonzentration hinzufügen von 2% (2-ME) und 100 ug/ml (Proteinase K).

  3. Das Röhrchen 60 Minuten bei 55 °C inkubieren. Das Rohr kurz auf der Werkbank abkühlen (10 Minuten)

  4. 20 ml hinzufügen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (PCI, 25:24:1). Das Röhrchen verschließen und kräftig durch Vortexen oder Umdrehen mischen.

  5. Zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei 13.000 × g und 20–25°C, um die wässrige und organische Phase zu trennen. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen.

  6. Wiederholen Sie die Extraktion zweimal für insgesamt drei Extraktionen (Schritte 4-5).

  7. Überführe die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen und füge ungefähr 2/3 des Volumens -20 °C-Isopropanol hinzu und drehe das Röhrchen zum Mischen mehrmals vorsichtig um.

  8. Um die DNA auszufällen, stellen Sie die Röhrchen mindestens 30 Minuten und bis zu drei Tage bei -20°C.

  9. Um die DNA zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei ungefähr 13.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C.

  10. Das Pellet in 4 ml TE pH 8,0 wieder auflösen. In ein 13 ml Sarstedt-Röhrchen überführen und ca. 40 µl 10 mg/ml RNase hinzufügen, dann 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.

  11. Um die DNA zu extrahieren, fügen Sie 4 ml Chloroform:Isoamylalkohol (CIA, 24:1) hinzu. Zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei ungefähr 13.000 × g bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein sauberes Sarstedt-Röhrchen.

  12. Wiederholen Sie Schritt 11, dann fügen Sie das halbe Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Umdrehen/Pipette und fügen Sie 2 Volumen 100 % Ethanol hinzu. Durch Umdrehen/Pipette mischen und 30 Minuten bis über Nacht bei -20 °C lagern.

  13. Zentrifugieren Sie bei 13.000 × g für 20 Minuten bei 4 ° C, um die DNA zu pelletieren.


Ich habe Phenol:Chloroform viele Male für Algen-DNA- und RNA-Extraktionen verwendet. Diese Protokolle erforderten nur geringfügige Anpassungen, um sie an eine bestimmte Spezies anzupassen (einige Zellwände können jedoch extrem sein). Das allgemeine Prinzip von Phenolchloroform funktioniert bei fast jeder Probe, nachdem Sie die Zellen lysiert/pulverisiert haben. Die einzigen größeren Probleme treten auf, wenn das Gewebe extrem fettig oder voller Kohlenhydrate ist.

Ich habe auch CTAB verwendet, aber es scheint weniger universell auf Algenproben anwendbar zu sein.


Probleme bei der Isolierung von pflanzlicher genomischer DNA - (17.02.2005)

Wir haben zwei verschiedene Kits verwendet, die für andere Pflanzenarten gut funktionieren, aber mit diesem scheitern. Mit dem Kit von Nucleon sehen wir ein großes Pellet (DNA + Verunreinigungen?) und wenn wir das auf einer Elektrophorese durchführen, können wir nichts sehen

Kann jemand etwas suugieren?

Hi
Ich habe noch nie mit Pflanzen-DNA gearbeitet, aber können Sie die traditionelle Phenol/Chloroform-DNA-Extraktionsmethode verwenden? Wir hatten einige Fälle von Bakterienarten, bei denen Kits nicht funktionierten und diese Methode funktionierte.
und ein Tipp - Eppendorf stellt Röhrchen mit "Phase-Lock-Gel" her, die für Extraktionen sehr hilfreich sind - überprüfen Sie, ob sie mit der Extraktion von Pflanzen-DNA kompatibel sind.

Früher habe ich DNA und RNA aus Pittosporaceae, die sehr reich an Phenolen sind, mit einer Standard-PCI-Extraktion (Phenol:Chloroform: Isoamylalkohol) extrahiert, die sehr gut funktionierte. Für diese Extraktion verwendeten wir jedoch normalerweise den größten Teil eines Blattes (vielleicht 500 mg), an das ich mich nicht genau erinnern kann.

Das Hauptproblem war, dass oft Zucker usw. mit der DNA kopräzipitierten und zu einem riesigen Pellet führte, das schwer aufzulösen und oft verfärbte. Wiederholte Extraktionen lösten dies normalerweise.

Hallo ! Danke für eure Antworten

Wir haben es jetzt mit dem CTAB-Protokoll und Doppel-Phenol-Chloroform-Extraktionen versucht, wir haben ein schöneres, saubereres Pellet erhalten, haben aber immer noch Probleme, dies bei der Elektrophorese zu überprüfen.
Wir versuchen nun, diese DNA erneut mit NaAc und Ethanol auszufällen. Wissen Sie, ob wiederholte Fällungen die DNA weiter reinigen und Polysaccharide loswerden?

Ich hatte viele Probleme, genomische Pflanzen-DNA aufgrund von Verunreinigungen wie den von Ihnen erwähnten zu isolieren. Im Moment bin ich dabei, meine DNA zu reinigen. Ich verwende eine Sephadex G50-Säule (die gleiche Art, die wir zum Trennen von Sonden von freiem Etikett herstellen). Wenn Ihre DNA-Lösung zu viskos ist, kann es einige Umdrehungen dauern, bis die DNA herauskommt. Wenn ja, haben Sie wahrscheinlich viel Salz und einige Phenole in der zweiten Runde mitgenommen. Erstellen Sie eine neue Spalte und wiederholen Sie dies, wenn dies der Fall ist. Wenn Ihr Sephadex in TE gespeichert ist, kalibrieren Sie die Säule mit niedrigem TE. Heute war eigentlich der erste Tag, an dem ich das ausprobiert habe. Die braune Farbe ist von der Probe verschwunden und der A260/A280 ist in Ordnung. Ich habe ungefähr 25 % meiner DNA verloren. Morgen werde ich einen Restriktions-Digest durchführen, um die Einschränkbarkeit und die Fluoreszenz zu überprüfen. Ich werde die Ergebnisse posten.
Oh, und blockieren Sie die Säule nicht mit Heringssperma-DNA oder ähnlichem.

Wiederholte Stürze helfen normalerweise nicht. Wenn Sie Ihre Präzipitationen bei Raumtemperatur durchführen und nur ein paar Minuten ruhen lassen, haben die meisten Polysaccharide keine Chance, aus der Lösung zu kommen.

Leider war die Säulenreinigung nicht so erfolgreich. Meine HindIII-Verdauungen sehen etwas besser aus, aber mein EcoR1 und BamH1 sehen immer noch unterboten aus.

Ich habe keine Ideen mehr. Kann noch jemand helfen?

Es tut mir leid, dass ich die Antworten überflute, aber bei näherer Betrachtung meiner Gele denke ich, dass die Säulenreinigung mehr geholfen hat, als ich ursprünglich gedacht hatte. Ich denke, diese Methode ist vielversprechend, aber ich bin mir noch nicht sicher, wie ich den Prozess verfeinern soll. Vielleicht hat jemand ein paar Vorschläge.

Hallo Großer weißer Norden
Das ist keine wirklich gute Antwort, weil ich nicht weiß, wie man die Reinigung verbessert, aber ich habe bei meinen eigenen Vorbereitungen (bakterielle genomische DNA, ja selbst für uns ist das Leben nicht immer golden) bemerkt, dass einige "harte" Restriktionsenzyme wird gut DNA verdauen, die die meisten nicht berühren, für mich haben EcoRV, DraI und RsaI sie aufgefressen, also können Sie vielleicht einfach Ihr Qualitätsproblem umgehen.

Danke, Leahf, aber ich habe auch Probleme mit der Methylierung. Dies schränkt die Enzyme, die ich verwenden kann, wirklich ein. Außerdem brauche ich normalerweise 6 Grundschneider. Wenn Sie jedoch über zuverlässige, methylierungsunempfindliche Enzyme verfügen, die Sie verwenden, würde ich gerne davon hören.


Hintergrund

Fast alle Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren müssen in einem Labor durchgeführt werden, z. B.[1–8]. Viele systematische, phylogenetische, molekulare und verwandte Studien an Pflanzen und Pilzen verwenden DNA und/oder RNA als primäre Datenquelle[9–14]. In den meisten Fällen werden zur Extraktion der Nukleinsäuren frische Gewebe verwendet, da der Abbau und andere biochemische Prozesse unmittelbar nach der Entnahme des Gewebes aus dem Organismus oder seinem natürlichen Substrat beginnen. Dies beschränkt Studien auf Pflanzen und Pilze, die sich in der Nähe eines Forschungslabors befinden, einschließlich solcher, die in Gewächshäusern und/oder Wachstumskammern gezüchtet werden können. Es werden jedoch zahlreiche Forschungsstudien an Organismen durchgeführt, die im Feld gesammelt werden müssen.

Drei Methoden wurden entwickelt, um DNA in Pflanzenproben zu konservieren, die im Feld gesammelt wurden[15–18]. Man verwendet Kieselgel als Trockenmittel, um das Gewebe schnell zu trocknen, was den Abbau bei den meisten Proben verringert[15, 18]. Es verhindert jedoch nicht den Abbau, und die DNA-Ausbeuten sind für einige Gewebe niedrig[19]. Die zweite Methode verwendet eine gesättigte NaCl-CTAB-Lösung (d. h. Kochsalzlösung-Cetyltrimethylammoniumbromid)[18]. Der hohe Salzgehalt dehydriert das Gewebe teilweise und das CTAB kann mit Nukleinsäuren, Proteinen und Kohlenhydraten komplexieren, um die Abbauprozesse zu verlangsamen. Bei dieser Methode wurden jedoch in einigen Fällen hohe Abbaugrade festgestellt, und gelegentlich resultieren geringe DNA-Ausbeuten[19]. Die Zugabe von Ascorbat mildert einen Teil des Abbaus. Die dritte Methode verwendet ein absorbierendes Papier zur Konservierung der DNA[16]. Pflanzen- oder Pilzgewebestücke werden auf das Papier zerschlagen und dann trocknen gelassen. Später können Scheiben des Papiers für die PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Amplifikation verwendet (und wiederverwendet) werden. Obwohl dies wahrscheinlich für viele Zwecke geeignet ist, wurde über Abbau berichtet[16]. Daher können andere Mittel zur Konservierung und/oder Extraktion erforderlich sein. DNA-Extraktion an der Probenahmestelle (d. h. vor Ort) ist eine mögliche Alternative, die den Abbau minimieren und den Ertrag maximieren kann.

Der Abbau kann durch Gelelektrophorese verfolgt werden, da beim Aufbrechen der DNA die Banden mit höherem Molekulargewicht diffuser werden und kleinere DNA-Fragmente als zunehmend helle Fluoreszenzflecken gesehen werden, die sich in Regionen des Gels mit niedrigerem Molekulargewicht erstrecken, siehe z. B.[8]. Dies zeigt jedoch nur an, dass eine Spaltung der DNA-Stränge stattfindet. Gleichzeitig treten auch andere Abbauprozesse auf, die zu Verlusten von Sequenzinformationen führen[20, 21]. Die häufigsten Veränderungen sind Basenverluste durch hydrolytischen Angriff der glykosidischen Bindungen. Am häufigsten tritt eine Depurination auf, aber auch eine Depyrimidisierung erfolgt mit geringerer Geschwindigkeit. Wenn diese DNAs als Matrize für die PCR verwendet werden, wird ungefähr 75 % der Zeit eine ungenaue Base an diesen Stellen eingebaut, was zu einem möglichen Verlust der Sequenzgenauigkeit führt. Die Desaminierung von m 5 C (5-Methylcytosin, vorherrschend in rRNA-Genloci) erzeugt ein Thymidin, das während der PCR-Amplifikations- und Sequenzierungsreaktionen eher mit einem Adenosin als mit einem Guanosin paart. Die Desaminierung von Adenosin führt zur Bildung von Hypoxanthin, das sich eher mit einem Cytosin als mit einem Thymidin paart, was wiederum möglicherweise zu einem Verlust der Sequenzgenauigkeit führt. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass beschädigte DNA erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden kann, aber oft sind Fehler in den Sequenzen offensichtlich[22–24].

Ein signifikanter DNA-Abbau kann kurz nach der Entfernung von Blättern oder Pilzgewebe aus dem Körper des Primärorganismus oder Substrats beobachtet werden[8], und der RNA-Abbau ist innerhalb von Sekunden nach der Probenahme sichtbar. Einige RNAs haben Halbwertszeiten von Minuten bis Stunden, während der DNA-Abbau ein langsamerer Prozess ist. DNA in vielen Pflanzen- und Pilzarten wurde Monate bis Jahrhunderte nach dem Absterben des Organismus in getrocknetem Gewebe nachgewiesen[20, 25]. Obwohl DNA in Geweben nachgewiesen werden kann, die über lange Zeiträume getrocknet wurden (bis zu Hunderten von Jahren bei Pilzen und bis zu zehn Jahrtausenden bei Pflanzen), kann ein Abbau relativ bald nach Beginn des Absterbens der Zellen beobachtet werden[3, 8 , 10–12, 26]. Oftmals können PCR-Amplifikation und Sequenzierung aus DNA durchgeführt werden, die aus Geweben extrahiert wurde, die seit Jahrhunderten bis Jahrtausenden tot sind. Obwohl DNA vorhanden ist, nachgewiesen, extrahiert, amplifiziert und sequenziert werden kann, lange nachdem das Pflanzen- oder Pilzgewebe aus der Pflanze oder dem Basidiokarp entfernt wurde, wird sie teilweise fragmentiert und anderweitig durch abbauende Enzyme, Hydrolyse, Oxidation und andere Prozesse verändert, die oft führen zu veränderten Sequenzergebnissen[20, 21]. Diese Prozesse nehmen in heißen, feuchten Klimazonen zu und variieren je nach Art. Daher kann die Probenahme unter solchen Bedingungen an abgelegenen Feldstandorten die Verwendbarkeit der extrahierten Nukleinsäuren für molekulare Studien einschränken, es sei denn, die Extraktion wird bald nach der Probenahme fortgesetzt. Geschwindigkeit ist von größter Bedeutung, um die Extraktion hochwertiger DNA zu gewährleisten, die für genaue und reproduzierbare Ergebnisse erforderlich ist. Wenn die Proben nicht effektiv beprobt, konserviert und schnell ins Labor transportiert werden können, können die Laborgeräte und Lösungen alternativ zu den Zielproben in ihrer natürlichen Umgebung transportiert werden, um die DNA zu extrahieren vor Ort.

Es wird eine Analyse vorgestellt, die Qualität und Ausbeuten von DNA, die aus frischem Gewebe extrahiert wurde, mit der Qualität und Ausbeute von DNA vergleicht, die aus Gewebe extrahiert wurde, das 48 Stunden oder 72 Stunden lang Luft bei 21 °C ausgesetzt war (um den Transport vom Feld zum Labor zu simulieren). . Dieses Projekt wurde ins Leben gerufen, um eine Methode zu entwickeln, die die Sequenzgenauigkeit sicherstellt und verwendet werden kann, wenn andere Methoden schlechte Ergebnisse liefern. Zuerst haben wir die Feldausrüstung im Labor getestet und dann die Methode mit der Feldausrüstung unter simulierten Feldbedingungen getestet. Die gesamte Ausrüstung kann in einem Standardrucksack (Abbildung 1), in einem Auto, auf einem Motorrad (oder Fahrrad) oder mit einem Lasttier transportiert werden. Das Erhitzen der Lösungen wird erreicht, indem die Behälter in eine Pfanne mit Wasser gestellt werden, das mit einem kleinen Gaskocher, einem Lagerfeuer oder Holzkohle erwärmt wird. Alternativ können die Lösungen in ihren Behältern direkt mit einem batteriebetriebenen Heizgerät erhitzt werden (mehrere sind im Handel erhältlich). Die Zentrifugation kann entweder mit einer handbetriebenen oder batteriebetriebenen Zentrifuge durchgeführt werden. Die Batterie kann sich in einem Auto, Motorrad, einer Laterne befinden oder separat getragen werden. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert und als CTAB-Salze oder in Ethanol als Natriumsalze präzipitiert wurden, können sie unabhängig von Außentemperatur oder -bedingungen sicher ins Labor zurücktransportiert werden, ohne einen zusätzlichen Abbau zu riskieren. Später kann der Rest des Extraktionsprozesses in einem Labor durchgeführt werden.

Grundlegende Feld-DNA-Extraktionsausrüstung (a) und Rucksack (b). Die gesamte Ausrüstung, die für die Extraktion bis zur DNA-Präzipitation in Ethanol benötigt wird, ist enthalten. A.

Abgebildete Ausrüstung (von links nach rechts): Kunststoffabfallbehälter, Sezierwerkzeuge, Adapterkabel, 6 V-Batterien, Mikrozentrifugenröhrchengestelle, Versandbehälter (Chloroform-Flasche innen), Pipetten (P20, P200, P1000), batteriebetriebene Mikrozentrifuge, 100% Ethanol, 80% Ethanol, Styropor-Box (mit 2X CTAB, CTAB-Präzipitationspuffer, High-Salz-TE-Puffer, 0,1X TE, RO-Wasser), 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Abfallbehälter, Beschriftungsband, manuelle Schleifwerkzeuge, Pipettenspitzen, Handschuhe, Rucksack. Nicht abgebildet: Wärmequelle, handbetriebene Zentrifuge (normalerweise wird entweder die batteriebetriebene oder die handbetriebene Zentrifuge verwendet, siehe Abbildung 2) und batteriebetriebene Mahlwerkzeuge (siehe Abbildung 6). B. Rucksack mit der gesamten Ausrüstung und Zubehör in 1a verpackt im Inneren. Die beiden 6-V-Laternenbatterien sind in Taschen auf jeder Seite des Rucksacks zu sehen. Das Gesamtgewicht des voll beladenen Rucksacks betrug 24 lbs (ca. 10 kg). Zusätzlicher freier Platz blieb im Rucksack.


DNA-Extraktion mit hohem Molekulargewicht (HMW) &ndash Minimierung eines Engpasses für aufkommende Long-Read-Sequenzierungsanwendungen

Die Zahl der Anwendungen, die Daten verwenden, die aus der Sequenzierung langer DNA-Moleküle oder HMW-DNA generiert werden, wächst mit rasender Geschwindigkeit. Die Gewinnung von HMW-DNA als Ausgangsmaterial für diese Anwendungen war jedoch in der Vergangenheit eine Herausforderung und zeitaufwändig. Benutzer dieser aufkommenden Long-Read-Techniken sind bestrebt, eine Lösung zu finden, um hochwertige HMW-DNA mit einer schnelleren Methodik zu extrahieren, die robust und benutzerfreundlich ist. Die Vereinfachung und Beschleunigung dieses wichtigen Schritts würde es Forschern ermöglichen, ihre lang gelesenen Downstream-Anwendungen schneller und effizienter auszuführen und eine Fülle kontextbezogener genomischer Informationen mit weniger Aufwand zu erzeugen.

Evolution der DNA-Sequenzierungstechnologie

Die DNA-Sequenzierung beinhaltet traditionell das Lesen kurzer DNA-Stränge, sie ist kostengünstig und genau. Die Sanger-Sequenzierung war zwar keine strikte Short-Read-Sequenzierung, da sie individuelle Reads von mehr als 500 bp erzeugen kann, war jedoch 40 Jahre lang die tragende Säule der Sequenzierung und war entscheidend für die Herstellung der ersten Referenzsequenz für das menschliche Genom. Bei der Sequenzierung der nächsten Generation wurden Technologien eingeführt, die die parallele Sequenzierung von Millionen kurzer Stränge ermöglichten und die Möglichkeit bot, ganze Genome mit einer beispiellosen Geschwindigkeit zu sequenzieren. In der dritten Generation von Sequenzierungstechnologien entfällt durch die Sequenzierung langer DNA-Fragmente als ein einzelnes Molekül die Notwendigkeit, DNA zu fragmentieren und zu amplifizieren. Die Vorteile des Long Read Sequencing (LRS) sind zahlreich: Einzelmolekül-Sequenzierung ohne PCR-Amplifikation vermeidet den GC-Bias, der während der Amplifikation auftritt Sequenzierung DNA im nativen Zustand ermöglicht den Nachweis von Basenmodifikationen wie Methylierung und arbeitet mit einer Read-Länge von 10 kb+ erleichtert die Genommontage auf eine Weise, die dem Zusammensetzen eines Puzzles mit größeren Teilen ähnelt. Wenn Sie sich das Genom beispielsweise als Puzzle vorstellen, das Sie entweder aus 100 großen Teilen oder 10.000 kleinen Teilen zusammensetzen können, lassen sich die großen Teile viel einfacher zusammensetzen und belasten die Bioinformatik weniger. Andererseits erfordert der Aufbau eines Genoms aus kurzen Reads letztendlich mehr Sequenzierungstiefe, um eine größere Abdeckung zu bieten.

Unsere aktuellen Optionen für die HMW-DNA-Extraktion sind nicht ideal

Alles, was größer als 50 kb ist, wird als HMW-DNA angesehen, aber es gibt einen sich schnell entwickelnden Bedarf an DNA, die viel größer ist und mehrere hundert Kilobasen, sogar im Megabasenbereich. Eine der traditionell verwendeten und kostengünstigen Methoden zur Gewinnung von HMW-DNA im Megabasen-Größenbereich ist die Phenol/Chloroform-Extraktion in Verbindung mit der Ethanolfällung – ein langwieriges Verfahren, das mit gefährlichen Chemikalien arbeitet. Sie wird außerdem durch die unvermeidlichen Schwierigkeiten bei der Handhabung der HMW-DNA behindert – während des Extraktionsprozesses wird sie zu einem extrem viskosen „Klumpen“, der vor der Verwendung nur schwer wieder in Lösung gebracht werden kann. Der Prozess der Verwendung von Phenol ist auch weniger angenehm und erfordert das Arbeiten unter einer Abzugshaube, hat einen unangenehmen Geruch und ist giftig und erfordert daher eine gefährliche Entsorgung.

Es gibt neuere Methoden, die kein Phenol/Chloroform beinhalten, wie z. B. Ansätze auf der Basis von Magnetkügelchen, und diese haben auch Vor- und Nachteile. Dies hat den Vorteil der Automatisierungskompatibilität, die es ermöglicht, Experimente für einen höheren Durchsatz zu skalieren. Typische magnetische Kügelchen sind jedoch winzig, und die sehr langen DNA-Moleküle binden und wickeln sich gleichzeitig um mehrere winzige Kügelchen. Anschließendes Zentrifugieren, Vortexen oder Pipettieren kann dazu führen, dass sich die Beads trennen und die HMW-DNA schert. Obwohl sie Verbesserungen im Maßstab bieten, beträgt die Größe der DNA, die extrahiert werden kann, normalerweise etwa 100 kb.

Eine neuere Technologie, die silikabeschichtete Magnetscheiben verwendet, wurde kürzlich eingeführt und hat etwas an Fahrt gewonnen. DNA bis in den Megabasenbereich kann isoliert werden, und während die Kieselsäureschicht eine große Oberfläche für die DNA-Bindung bietet, bindet sie sehr stark an die Scheibe und ergibt eine geleeartige DNA-Schicht, die schwer zu eluieren ist (geringere Ausbeute) und anschließend schwer aufzulösen (längerer Workflow).

Wie löst NEB den Engpass bei der HMW-DNA-Extraktion?

NEB-Forscher haben einen neuartigen Ansatz entwickelt, der unter Verwendung von Glaskügelchen intakte HMW-DNA liefert. Es adressiert einige der Unzulänglichkeiten anderer Technologien. Erstens sind die Perlen groß und haben einen Durchmesser von 4 mm und sind glatt.

4mm Glasperlen für die Extraktion von HMW DNA

Die Lysechemie ist optimiert, um Nukleasen zu inaktivieren und die DNA-Integrität aufrechtzuerhalten, und die Lyse wird unter Rühren durchgeführt, um die DNA-Fragmentgröße zu kontrollieren - schnelleres Rühren liefert kleinere DNA und langsameres Rühren liefert maximal lange DNA. Nach der Lyse löst die Zugabe von Isopropanol die Ausfällung eines großen DNA-Netzes aus und das Röhrchen wird umgedreht, so dass die DNA beginnt, an den Glasperlen zu kleben und sich um sie zu wickeln, ähnlich wie Zuckerwatte sich um ihren Stab wickelt. Da sich die langen DNA-Moleküle um die großen Kügelchen winden, ist die DNA extrem leicht zu eluieren und rutscht im Grunde genommen ab. Außerdem wird die DNA in entspannter und nicht kompakter Form eingefangen, so dass sie mit relativ geringem Aufwand wieder in Lösung gehen kann, was bedeutet, dass die DNA oft noch am Tag der Extraktion verwendet werden kann. Sehen Sie sich diese Anwendungsnotiz an, in der ein Benutzer seinen Workflow um 2-3 Tage reduzieren konnte.

Die Technologie ist für die Verarbeitung von Zellen und Blut (NEB #T3050) oder Gewebe (und Bakterien und einige andere Proben) (NEB #T3060) verfügbar und überwindet die Probenbeschränkungen einiger anderer Extraktionsmethoden. Der Arbeitsablauf ist in 30 Minuten für Zellen, 60 Minuten für Blut und 90 Minuten für Gewebe und Bakterien abgeschlossen. Dieser schnelle Workflow erleichtert auch die Behebung von Problemen mit den nachgelagerten Anwendungen erheblich. Ein zukünftiger Fokus auf die Erweiterung des Repertoires an Probentypen hat für NEB-Forscher hohe Priorität, beispielsweise die Optimierung der Lysechemie zur Überwindung der durch Polysaccharide verursachten Bindungshemmung in Pflanzen, Pilzen und Algen und die Bewertung der Breite von Mikroorganismen und Wirbellosen, für die dies Ansatz kann verwendet werden, um HMW-DNA zu isolieren.

Überblick über die HMW-DNA-Extraktion mit dem Monarch für Zellen und Blut

Was machen Forscher mit langen Lesesequenzen?

Die schnelle Extraktion intakter, sehr HMW-DNA ist unerlässlich, damit Forscher keine wertvolle Zeit damit verschwenden, das Ausgangsmaterial für die ständig wachsende Palette von Technologien vorzubereiten, die eine Fülle von Genominformationen sammeln. Einige der Anwendungen basieren auf der Sequenzierung dieser sehr langen DNA-Moleküle, und einige erfordern nicht unbedingt alle Informationen, die in einem langen Sequenzierungs-Read erfasst wurden. Was also machen Forscher mit dieser enormen Menge an Sequenzinformationen?

Derzeit ermöglicht LRS eine beispiellose Rate von de novo montage einer Vielzahl von Genomen - Sequenzen, für die es keine Referenz gibt. Vor der Möglichkeit, lange Lesesequenzen durchzuführen, wurden die meisten Referenzsequenzen basierend auf kurzen Lese-Contigs zusammengestellt, gefolgt von der komplizierten Aufgabe, eine fragmentierte Referenzsequenz zusammenzustellen. Die Verwendung einer langen kontinuierlichen DNA-Strecke anstelle von kürzeren Fragmenten gibt dem Forscher viel mehr Kontextinformationen darüber, wie die Teile zusammenpassen. Zum Beispiel, Genomkartierung besteht im Wesentlichen darin, eine Chromosomenkarte zu erstellen und ein bestimmtes Gen einer Region eines Chromosoms zuzuordnen und die relativen Abstände zwischen und innerhalb von Genen auf demselben Chromosom zu bestimmen. Neuartige Isoformidentifikation ist mit langen Sequenzierungs-Reads besser bedient, da es ein ganzes Multi-Exon-Gen abdecken kann. Überlappende Exons und alternatives Spleißen können die Auflösung neuer Isoformen mit kurzen Lesevorgängen erschweren. Strukturelle Variationen wie große segmentale Translokationen oder Inversionen sind einfacher zu definieren und können mit größerer Sicherheit innerhalb des Genoms platziert werden, wenn lange, verbindungsübergreifende Sequenzabschnitte verwendet werden. Während kurze Reads Veränderungen auf einer einzelnen Nukleotidebene oder sogar kleine Indels identifizieren können, hat sich die Identifizierung größerer Sequenzvariationen als schwierig erwiesen.

Einige Anwendungen profitieren von längeren DNA-Lesevorgängen, obwohl nicht alle bei einem langen Lesevorgang erfassten Informationen verwendet werden. Genomische Phaseneinstellung, beispielsweise, bezieht sich auf die Fähigkeit, die diploide Natur des menschlichen Genoms zu berücksichtigen, wenn mütterlicherseits und väterlicherseits abgeleitete Sequenzen betrachtet werden. Haplotyp-basierte Aggregate, die aus längeren DNA-Lesevorgängen generiert werden, geben Aufschluss über Varianten auf zwei homologen Kopien einer chromosomalen Region und wie sich dies auf die Expression der Gene der Region auswirken kann. Die aus der Sequenzierung von HMW-DNA generierten Long-Read-Daten ermöglichen die kontextuelle Assoziation verschiedener Genomregionen, die auf sinnvolle Weise variabel sein können. Dies kann ein Verständnis der allelspezifischen Expression und Genotyp-Phänotyp-Assoziationen vermitteln. Darüber hinaus ermöglicht die Sequenzierung nativer Moleküle, wenn man Modifikationen auf Basisebene wie Methylierung betrachtet, deren Phasenanpassung mit genetischen Varianten, und dies hat Anwendungen bei der Erforschung der epigenetischen Vielfalt. Optisches Mapping ist eine weitere Technik, bei der nicht alle Basen sequenziert werden, sondern ein Fluorophor mit hochauflösenden, geordneten Restriktionskarten assoziiert wird, um weitreichende Informationen darüber zu erhalten, wie sie in die chromosomale Architektur passen.

Im Allgemeinen verbessert das Zusammenfügen von Genomen mit größeren, kontinuierlichen DNA-Sequenzen die Zusammenfügungskontiguität und ermöglicht ein besseres Verständnis der im Genom enthaltenen Informationen als kleinere Fragmente. Dies ist normalerweise ein Kompromiss der Gesamttiefe der Sequenzierung &ndash Short-Read-Sequenzierung ist kosteneffektiv, und eine größere Abdeckungstiefe wird normalerweise erreicht, wenn viele Reads ausgerichtet werden. Aber in Wirklichkeit sind Long- und Short-Read-Daten so miteinander verbunden, dass, auch wenn sie nicht so tief greifen, eine durch die Short-Reads erzeugte Berichterstattungstiefe vorhanden ist, die die Kontiguität der Long-Read ergänzt. Mit anderen Worten, die Stärken beider Sequenzierungsmethoden werden kombiniert.

Genome enthalten eine Fülle von Informationen, die nur darauf warten, entdeckt zu werden. Die hier diskutierten Long-Read-Sequenzierungsanwendungen sind nur einige von denen, die das Potenzial haben, spannende strukturelle, epigenetische und phänotypische Informationen zu liefern. Derzeit gibt es viel Innovation und Aufregung im Bereich der HMW-DNA-Extraktion. Die Reduzierung des Extraktionsengpasses ist ein wesentlicher Schritt, um den Weg zu ebnen, um die aufregenden neuen Technologien zu beschleunigen, die die Geheimnisse der Genome lüften.

Teilen Sie uns im Kommentarbereich mit, an welchen Samples Sie arbeiten und welche Techniken Sie einsetzen.


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Phenol-Chloroform-Extraktion - (26.09.2005 )

Vielleicht möchten Sie AquaPlasmid und AquaGenomic ausprobieren, die für die DNA-Extraktion überhaupt kein Phenol/Chlorform verwenden.

Wer weiß, wie man den Puffer 5.1 für die RNA-Extraktion vorbereitet? Muss das gesamte Reagenz RNase-frei sein? Wo können wir sie bekommen?

NUR EINE NEUE FRAGE.
BEI DER PHENOL-CHLORFORM-DNA-EXTRAKTION VERWENDEN WIR PHENOL, ABER IN FLÜSSIGER ZUSTAND.
ICH BESTELLTE PHENOL ABER DAS ANGEKOMMEN WAR IN KRISTALLZUSTAND (MERCK).
ICH KANN DAHER KEINE INFO FINDEN.

WIE SOLLTE ICH FLÜSSIGES PHENOL AUS KRISTALLFORM ZUBEREITEN?

NUR EINE NEUE FRAGE.
BEI DER PHENOL-CHLORFORM-DNA-EXTRAKTION VERWENDEN WIR PHENOL, ABER IN FLÜSSIGER ZUSTAND.
ICH BESTELLTE PHENOL, ABER DAS ANGEKOMMEN WAR IN KRISTALLZUSTAND (MERCK).
ICH KANN DAHER KEINE INFO FINDEN.

WIE SOLLTE ICH FLÜSSIGES PHENOL AUS KRISTALLFORM ZUBEREITEN?

Sie können 500 g Kristallphenol in 500 ml 1 M Tris pH 8,0 (wenn Sie eine Phenollösung für die DNA-Extraktion benötigen) oder 50 mM Natriumacetat pH 4,0 (wenn Sie saures Phenol für die RNA-Extraktion vorbereiten) auflösen. Denken Sie daran, den pH-Wert der Phenollösung vor der Verwendung zu überprüfen und diese Lösung zu entsorgen, wenn sich das Phenol rot/braun verfärbt.

zurück zum Hauptthema Phenol/Chloroform-Extraktion. wenn ich ein gereinigtes PCR-Produkt habe, das durch das Gel von allen taq und dNTPs gereinigt wird, nehme ich an. Ich gehe weiter und verdaue es und deaktiviere dann die Enzyme. Das molekulare Klonenbuch sagt Phenol/Chloroform danach und dann ligieren .. aber warum, wenn DNA bereits gereinigt ist? das führt nur zu mehr verlust.

NUR EINE NEUE FRAGE.
BEI DER PHENOL-CHLORFORM-DNA-EXTRAKTION VERWENDEN WIR PHENOL, ABER IN FLÜSSIGER ZUSTAND.
ICH BESTELLTE PHENOL, ABER DAS ANGEKOMMEN WAR IN KRISTALLZUSTAND (MERCK).
ICH KANN DAHER KEINE INFO FINDEN.

WIE SOLLTE ICH FLÜSSIGES PHENOL AUS KRISTALLFORM ZUBEREITEN?

Früher habe ich das kristalline Phenol in einem 37 ° C Wasserbad geschmolzen, dann (in der Haube) ein gleiches Volumen Tris-Cl, pH 8 hinzugefügt und gemischt, um das Phenol zu sättigen. Ziehen Sie nach der Stabilisierung der Mischung den größten Teil der obersten Schicht des überschüssigen Tris-Puffers ab und fügen Sie ein Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) hinzu, das dem ursprünglichen Volumen von Phenol entspricht (für 500 ml Phenol verwenden Sie also eine Mischung aus 480 mL Chloroform + 20 mL IAA Der IAA reduziert die Schaumneigung von Chloroform beim Mischen). Sie benötigen einen größeren Behälter für diese Mischung - alles mit Schraubverschluss ist in Ordnung (ich habe einen 2L-Erlenmeyer-Schraubverschluss verwendet), solange die endgültige Mischung in einem oder mehreren braunen Gläsern / Flaschen aufbewahrt wird (lichtempfindlicher Inhalt) . Dazu am besten die Phenol-Tris-Mischung in den größeren Behälter umfüllen, dann das Original-Phenolgefäß mit der Cl:IAA-Mischung mehrmals vorsichtig ausspülen und jeweils in den größeren Behälter abgießen. Es gibt einige Vorbehalte:
1. Dieses Zeug ist SEHR übel - besonders wenn das ätzende Phenol mit dem fettlöslich machenden Chloroform vermischt wird. Verschütten Sie es NICHT auf exponierter Haut. Tragen Sie viel Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gummischürze usw.)
2. Phenol selbst ist mit Cl:IAA gemischt rutschig, es wird tatsächlich sehr rutschig und hat die unangenehme Angewohnheit, sich beim Schütteln unter den Glasdeckeln zu schleichen. Dies kann dazu führen, dass das große Glas P:Cl:IAA fallen gelassen wird, mit vorhersehbar unangenehmen (und höchst gefährlichen) Folgen für Mensch und Laborgerät. Tragen Sie sehr "griffige" Handschuhe - Rubbermaid Geschirrspülhandschuhe haben für mich funktioniert, über den Standard-Laborhandschuhen aus Latex oder Nitril.
3. Flüssiges P:C:IAA kann bei 4C für einige Zeit (bis zu Monate) gelagert werden, sollte jedoch nicht verwendet werden, wenn das normale schwache Gelblich nachdunkelt oder rosa wird.
Ich weiß, das ist viel mehr, als Sie brauchen - aber ich habe im Laufe der Jahre festgestellt, dass zu viele Informationen fast immer besser sind als zu wenig.

Oh, und Kathy – es ist eine gute Idee, das Enzym/Salz-Material aus Ihrer Mischung zu entfernen, bevor Sie ligieren. Sie müssen es jedoch nicht immer mit Phenol extrahieren - es gibt eine Reihe guter säulenbasierter Reinigungskits von Qiagen, Promega usw. Sie sind schneller, einfacher, weniger unangenehm und haben einen geringeren Verlust.

Hi,
noch eine frage zu diesem thema:
Was ist die "beste" Methode (dh DNA-Ausbeute von höchster Qualität), wenn verfügbare Proben nur geringe DNA-Mengen enthalten (zB winzige Insekteneier oder -beine). Chloroform/Phenol, Aussalzen, Kit oder.
Vielen Dank
Hobblobin

Das heißt, wenn ich das DNA-Form-Adenovirus-Lysat mit Phenol-Chloroform (1:1) extrahieren möchte, muss ich die Phenollösung wie gesagt herstellen (500g Kristallpheno in 500 ml 1M Tris pH 8) und mit Chloroform mischen.

NUR EINE NEUE FRAGE.
BEI DER PHENOL-CHLORFORM-DNA-EXTRAKTION VERWENDEN WIR PHENOL, ABER IN FLÜSSIGER ZUSTAND.
ICH BESTELLTE PHENOL ABER DAS ANGEKOMMEN WAR IN KRISTALLZUSTAND (MERCK).
ICH KANN DAHER KEINE INFO FINDEN.

WIE SOLLTE ICH FLÜSSIGES PHENOL AUS KRISTALLFORM ZUBEREITEN?

Sie können 500 g Kristallphenol in 500 ml 1 M Tris pH 8,0 (wenn Sie eine Phenollösung für die DNA-Extraktion benötigen) oder 50 mM Natriumacetat pH 4,0 (wenn Sie saures Phenol für die RNA-Extraktion vorbereiten) auflösen. Denken Sie daran, den pH-Wert der Phenollösung vor der Verwendung zu überprüfen und diese Lösung zu entsorgen, wenn sich das Phenol rot/braun verfärbt.


Wissen

Author Adilah Ayoib gratefully acknowledges the support from the Director of Institute of Nano Electronic Engineering (INEE), Universiti Malaysia Perlis (UniMAP), the staff members and colleagues for valuable discussion and helpful comments. This work is also supported by NanoMalaysia Institute for Innovative Technology (NanoMite) Grant (9012 00006) program funded by Long Term Research Grant (LRGS), Ministry of Education, Malaysia. The views expressed in this publication are the authors’ own interpretation based on the data collected and do not reflect in any way the views of the funding agencies.


Ergebnisse

Hypovirulence and Associated Traits of Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Strain DT-8 grew slowly on potato dextrose agar (PDA) and developed colony morphology similar to that of the hypovirulent strain Ep-1PN (Fig. 1 EIN and D). The hypovirulence phenotype of strain DT-8 is even more pronounced than that of strain Ep-1PN when inoculated onto Arabidopsis thaliana (Fig. 1B) or detached leaves of Brassica napus (Fig. S1). Although strain DT-8 was able to produce sclerotia, the time required for sclerotial initiation was about 3–5 days longer than that for the normal strain and the sclerotia were randomly distributed on the colony surface. Furthermore, the size of the sclerotia produced by strain DT-8 was significantly smaller than that of the normal strain (Fig. 1C).

Hypovirulence-associated traits of strain DT-8 of S. sclerotiorum. (EIN) Abnormal colony morphology of strain DT-8 grown on a PDA plate at 20 °C for 15 days (B) hypovirulent phenotype of strain DT-8 as exhibited by infected Arabidopsis thaliana plants, which were maintained at 20 °C for 4 days postinoculation (C) small sclerotia produced by strain DT-8 on a PDA plate at 20 °C for 30 days and (D) growth rate of strain DT-8 relative to other strains, bars represent standard deviation from the mean (n = 8). The small letters on top of the bars in D indicate whether the differences are statistically significant (P < 0,05). The RNA virus-infected hypovirulent strain Ep-1PN and its sexual progeny Ep-1PNA367 (virus-free) were used as controls DT-8VF is a virus-free culture derived by hyphal tipping of strain DT-8, and showed a normal phenotype of S. sclerotiorum.

Strain DT-8 was cured of its hypovirulent phenotype either by hyphal-tip culturing or protoplast regeneration, and the cured isolates of DT-8, such as DT-8VF, regained virulence on plants comparable to that of the normal strains (e.g., strain Ep-1PNA367) and developed normal colony morphology (Fig. 1 EIN und D). Furthermore, the traits of these cured isolates can be reverted to the hypovirulence phenotype following contact with the original hypovirulent strain DT-8 (Fig. S2). Thus, strain DT-8 shows typical characteristics of virus-mediated debilitation/hypovirulence.

DNA Elements Associated with Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Virus-mediated hypovirulence in pathogenic fungi is usually caused by either double-stranded (ds) or single-stranded (ss) RNA viruses. However, several attempts to extract dsRNA from strain DT-8 were unsuccessful. The genomic DNA of strain DT-8 was extracted and resuspended in RNase A-containing TE buffer, and the DNA sample was electrophoresed on 1% agrose gel and stained with ethidium bromide. Surprisingly, besides the fungal genomic DNA, two additional DNA bands with sizes of about 2 kb [large DNA element (LDE)] and 0.3 kb [small DNA element (SDE)], respectively, were clearly observed in a stained gel (Fig. 2EIN). These two DNA elements could be digested with DNase I (active against ssDNA and dsDNA) and S1 nuclease (active against ssDNA or ssRNA) but could not be digested with either Exonuclease III (active against linear dsDNA) or Exonuclease I (active against linear ssDNA), suggesting that these elements are circular ssDNA molecules or linear ssDNA with modified 5′ and 3′ ends (Fig. S3EIN).

Genomic characteristics and particle morphology of Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1). (EIN) Total DNA extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. DNA samples were fractionated on 1.0% agarose gel. The positions of host genomic DNA, viral DNA, or the large DNA element (LDE) and defective viral DNA or small DNA element (SDE) of strain DT-8 are indicated. Lane M1, λ-Hind III-digested DNA Marker lane M2, DL2000 DNA ladder marker (TaKaRa). (B) Southern blot analysis of total nucleic acid extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. The forms of viral DNA are indicated as OC dsDNA [open circular double-stranded (ds) DNA], SC dsDNA (supercoiled dsDNA), and circular single-stranded (ss) DNA. A 379-bp DNA fragment of Rep was PCR amplified and labeled with α- 32 P dCTP and used as a probe. (C) Viral particles observed under transmission electron microscopy. Particles were purified from mycelia of strain DT-8 and negatively stained with 1% uranyl acetate. (Scale bars, 50 nm.) (D) SDS/PAGE analysis of SsHADV-1 coat protein. Samples collected from fractions corresponding to 25% sucrose of sucrose gradients were subjected to SDS/PAGE. The size of the Coomassie blue-stained protein was estimated by comparison with protein markers. (E) Agarose gel electrophoresis on 1% agarose of DNA extracted from sucrose gradient fractions containing virus particles. (F) Genome organization of SsHADV-1. Functional ORFs (coding for CP and Rep) were displayed as thick arrows. The positions of the potential stem–loop structure, large intergenic region (LIR) and small short intergenic region (SIR) were marked the stem-loop structure was shown on the right. LIR is also shown in an expanded form to indicate the elements of the bidirectional promoter.

Interestingly, strain DT-8VF, which was derived from strain DT-8, lacked the additional ssDNA elements characteristic of DT-8 (Fig. 2 EIN und B). However, after contacting the colony of strain DT-8, newly obtained isolates of strain DT-8VF contained the two ssDNA elements, and their colony morphology and virulence were as debilitated as the original strain DT-8 (Fig. S2). Thus, the ssDNA elements are likely to be associated with hypovirulence of strain DT-8.

Cloning and Sequencing of the Full-Length DNA Elements of Strain DT-8.

Full-length DNA clones of LDE were obtained by PCR amplification, confirmed by Southern blot analysis (Fig. 2B) and subjected to sequence analysis. Sequencing results showed that the full-length DNA of LDE is 2,166 nt in length and contains two large ORFs, whose expressions were confirmed by northern hybridization and RT-PCR analysis (Fig. S4 EIN und B). One ORF, whose expression codes for a putative coat protein, is located on the sense strand and the other ORF is situated on the complementary-sense strand and codes for a putative replication initiation protein (Rep) (Fig. 2F). The putative Rep has two conserved domains, namely geminivirus Rep catalytic domain (Gemini_AL1) and geminivirus Rep protein central domain (Gemini_AL1_M) with conserved motifs for rolling-circle replication (21) (Fig. 3EIN). Two intergenic regions separate the two ORFs, the large intergenic region (LIR) contains 133 nt and the small intergenic region (SIR) contains 119 nt (Fig. 2F). Both LIR and SIR also have similar characteristics to those of viruses in the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae (22). LIR has an unusual nonanucleotide TAATATT↓AT at the apex of a potential stem-loop structure, which is recognized at a specific position (↓) by the Rep during the initiation of virion DNA replication (23). Therefore, the large DNA element most likely represents a DNA viral genome.

Phylogenetic analysis of SsHADV-1. (EIN) Amino acid sequence alignment of Rep of SsHADV-1 and selected viruses from the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae. The conserved motifs (I to VII) were shaded with light gray color Asterisks indicate identical amino acid residues, and colons indicate similar residues. Conserved motif Ito VII are IRD, RCR-I, RCR-II, RCR-III, RBR, NTP Binding-A, and NTP binding-B, respectively. The Alignment was generated by using CLUSTALX (2.0). Numbers in brackets are the positions of amino acid residues that are not listed. (B) Phylograms of the Rep and CP of SsHADV-1 and selected circular ssDNA viruses in the families Geminiviridae, Nanoviridae and Circoviridae. Multiple alignments of amino acids and tentative phylogenetic trees generation were referred to the method described by Liu et al. (20). The position of SsHADV-1 is indicated by a red star. See Table S1 for abbreviations of virus names and viral protein accession numbers used for phylogenetic analysis.

Sequence analysis showed that the SDE comprises a mixture of ssDNA molecules, 236–284 nt in length, representing defective DNA derived from LDE. They lack the two ORFs but contain both LIR and SIR (Fig. S5). The short direct repeat sequences flanking LIR and SIR may represent signal nucleotides for deletion (24).

Viral Particles in Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

To confirm that LDE represents a viral genomic DNA, mycelial mass of strain DT-8 grown on a PDA plate was collected and subjected to a virus purification protocol that includes sucrose gradient centrifugation as the final step. The major band containing viral particles, which was present in the gradient region corresponding to 25–30% sucrose, was collected and the viral particles were recovered by centrifugation. Negatively stained viral particles observed with an electron microscope were nontwinned isometric particles, 20–22 nm in diameter (Fig. 2C). The viral particles were examined for coat protein (CP) and viral genomic DNA contents. A DNA band, similar in size to the LDE extracted directly from mycelia of strain DT-8, was extracted from the viral particles (Fig. 2D). Like the ssDNA form of M13 phage genomic DNA, the DNA extracted from viral particles can be digested by ssDNA nuclease S1, but not by Exonuclease I (Fig. S3B). Only one major protein with a molecular mass of about 35 kDa was resolved by SDS/PAGE analysis (Fig. 2E). The size of this isolated protein is similar to that predicted for coat protein based on DNA sequence analysis. Furthermore, N-terminal sequencing analysis further confirmed that the isolated protein was in fact the coat protein. Thus, we verified that the large DNA element in strain DT-8 represents a circular ssDNA viral genome, which we named Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1).

Sequence and Phylogenetic Analyses of SsHADV-1.

Sequence analysis of the full-length amino acid sequence of the putative Rep of SsHADV-1 showed that it shares the highest sequence identity with the Reps of chickpea chlorotic dwarf virus (25), bean yellow dwarf virus (26), and tobacco yellow dwarf virus (27) (Table S2). These three viruses that infect dicotyledonous plants belong to the genus Mastrevirus (Fig. 3EIN). Phylogenetic analysis of SsHADV-1 and selected ssDNA viruses showed that the putative Rep of SsHADV-1 clusters with members of the family Geminiviridae, but it is distinct from ssDNA viruses in the families Nanoviridae and Circoviridae (Fig. 3B). Although SsHADV-1 appears to be related to geminiviruses, it is clearly different from all documented geminiviruses. In addition to the difference in particle morphology, the genome of this fungal DNA virus has an unusual nonanucleotide and is smaller than those of plant geminiviruses in the genus Mastrevirus (24). The genome of SsHADV-1 only codes for two proteins (CP and Rep), but lacks a gene for movement protein (MP), which is a key protein of plant geminiviruses for cell-to-cell movement. Furthermore, the Rep gene on the complementary strand lacks an intron. Moreover, phylogenetic analysis of the CP of SsHADV-1 and that of viruses in the families Geminivirdae, Nanoviridae, and Circovirdae shows that SsHADV-1 CP is phylogenetically divergent because it does not cluster with any of the viruses included in this analysis (Fig. 3B). Thus, SsHADV-1 most likely belongs to a family that is phylogenetically related to the family Geminiviridae. Interestingly, we found that SsHADV-1 CP shares the highest sequence similarity with a marine putative protein (Marine_PP) encoded by a whole genome shotgun sequence (GenBank accession no.: AACY024124290) from a metagenomic data of a microbial community from Sargasso Sea (28). The percent identity and similarity of these two proteins are 37.8% and 52.6%, respectively (Fig. S6). Considering that a short gene sequence possibly coding for a viral Rep is present on the same fragment as this Marine_PP gene, this putative protein is likely of a viral origin. It is thus possible that SsHADV-1 is more closely related to the putative marine virus (most likely infecting algae) than to plant geminiviruses.

Infectivity of Purified SsHADV-1 Particles and Viral DNA Extracted Directly from Infected Mycelium.

Mycelial agar discs were taken randomly from regeneration plates of transfected S. sclerotiorum protoplasts and transferred into fresh PDA plates. Isolates Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were derived from colonies where viral DNA-transfected protoplasts were regenerated and isolates Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were derived from colonies where viral particle-infected protoplasts were regenerated. Colony morphology and hyphal growth of these four isolates were similar to those of strain DT-8 but different from the virus-free strain Ep-1PNA367 (Fig. 4EIN). Viral DNA also was extracted successfully from these cultures and confirmed with PCR amplification using the specific primers, which were designed based on the Rep sequence (Fig. 4 B und C). Thus, both purified viral particles and viral DNA-enriched fractions isolated directly from infected mycelium were able to transfect S. sclerotiorum protoplasts.

PEG-mediated protoplast transfection with purified SsHDV-1 particles and viral DNA extracted directly from infected mycelium. Colony morphology of the virus-free strain Ep-1PNA367 and its newly transfected isolates. Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were isolated from transfectants with purified viral DNA, whereas Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were isolated from transfectants with viral particles. Colonies were grown on PDA plate at 20 °C for 7 days. (B) Viral DNA extracted from transfected cultures of strain Ep-1PNA367. Lane 1, strain Ep-1PNA367 lane 2, Ep-1PNA367-NT3 lane 3, p-1PNA367-NT7 lane 4, Ep-1PNA367-PT2 lane 5, Ep-1PNA367-PT6 lane 6, strain DT-8 and lane M, λ-Hind III-digested DNA Marker. (C) Viral DNA of newly transfected cultures were confirmed by PCR amplification with primer pair designed from the Rep sequence of SsHADV-1. Lane M, DL2000 DNA ladder marker lane 1 to lane 6 are as the same as in B.

Transmission of SsHADV-1 from Strain DT-8 to a Vegetatively Incompatible Strain of S. sclerotiorum.

Vegetative incompatibility between two fungal individuals often limits the transmission of mycoviruses, and the most likely reasons are compartmentation and cell death of the fusing hyphal cells (29, 30). However, transmission of hypoviruses between two vegetatively incompatible strains has been observed previously (31). In our experiment, successful transmission of SsHADV-1 between vegetatively incompatible strains of S. sclerotiorum was confirmed by dual-culture of DT-8 and the vegetatively incompatible virulent strain Ep-1PNA367, which was labeled with hygromycin-resistance gene. Virus-infected isolates of strain Ep-1PNA367 were frequently obtained from dual culture plates (7 from 21 dual-culture plates), and all newly infected isolates of strain Ep-1PNA367 were converted to hypovirulence and showed a similar phenotype to that of strain DT-8 (Fig. S7).


Any real difference between DNA purification kits? - (May/02/2014 )

Is there any important difference between e.g. PCR clean-up, eukaryotic genomic DNA extraction, mini-, midi-, maxi- plasmid prep, gel extraction kits sold by different companies or are they all selling the same things?

There is a difference between genomic DNA preparation kits and plasmid preparation kits. The kits for PCR cleanup, gel purification, and column based plasmid kits are pretty similar in the final portion of the protocols, but differ in the sample handling early on, primarily in releasing the DNA and adjusting chemistry so that it binds. The charge-switch kits are different chemistry. I'm now a fan of magnetic bead purification for most applications.

I'm not sure whether my question was clear. Just in case, I'm asking whether there's a difference between the kits of different companies' (e.g. QIAGENs vs Promegas vs Life Technologies) kits.

Why do you prefer magnetic bead-based kits? Have you been using them long?

In general there isn't much difference, though there may well be some adjustment of the chemistry to enhance DNA extraction over the basic protocols, though these bits would be proprietary (check the MSDS they will often tell you components based on hazard).

The costs make sometimes the difference .

For DNA extraction kits I know a study where they compared several kits to extract DNA from museum species and they found quite clear differences between companies in terms of DNA yield and PCRs with this DNA (working or not). Therefore especially for difficult and unusual sources the differences can be huge, whereas for standard samples the differences might be small (and differences in results due to differently skilled users can superimpose the actual kit differences).

Generaly QIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but Q offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

Q has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. Q has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

And.. several companies have differen systems, Q has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if Q makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from Q. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

But personally I found another huge plus for Q, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but QIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

There is also this company that sells alegedly "the same colums as QIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "QIAGEN" buffers. That is also possible. 

Trof on Tue May 6 21:13:28 2014 said:

Generaly QIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

 

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but Q offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

 

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

Q has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. Q has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

 

And.. several companies have differen systems, Q has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if Q makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

 

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from Q. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

 

 

But personally I found another huge plus for Q, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but QIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

 

There is also this company that sells alegedly "the same colums as QIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "QIAGEN" buffers. That is also possible. 

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

hobglobin on Wed May 7 16:40:31 2014 said:

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

No, but I obviously should ask them to 
 
(they're are expensive, so not an option for everyone, but as said, often a "golden standard")
 
 
 

El Crazy Xabi on Thu May 8 05:39:16 2014 said:

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

Didn't they have that miraculous polymerase mixes, that can overcome many inhibitors? One company had such, especially for soil samples and other.. so you could do onsite PCR (but I don't remember which company that was). I found that very interesting, but I don't need that actually.

Q supplies "Q solution" which is 1M betaine.  They forgot to pay me this month. -)


Has anyone here done an RNA extraction?

In the lab I'm working in, I'm still in the midst of being trained. I just did my third RNA extraction and the results were horrid. I know it comes with practice, but does anyone have any helpful tips? I do RNA extractions on Brachypodium/Oryza sativa roots with the RNeasy plant mini kit, starting with grinding the roots in a mortar and pestle and then a series of washes. I try to grind the tissue up as hard as I can and get as much as I can into the collection tubes, I just can't tell if my error is in the grinding/collecting or in the washes, if I'm not being careful enough with my micro-pipetting. Thanks in advance for any helpful tips, Iɽ like to get some good RNA samples so I can move onto RT-PCRs and sequencing.
Danke schön!

[EDIT]: Just to add to this, I'm an undergraduate student doing research- so I don't really have much say in what I use/do- I have to use the plant kit and follow the protocol- just looking for tips to make the best of what I have. :)

From my experience (have done thousands of extractions in the last two years), ditch the column kits for TRIzol extractions (also use glycogen, incubate the sample in a -80 for 1-24hrs during the precipitation step, and add a second ethanol wash to the standard protocol, I can send you my modified protocol if youɽ like). Since moving to this new method I've had a 100% success rate with the last 300 samples, great specs, high yields, and no degradation. I had so many issues with the column kits (60-80% success rate with less than perfect specs) that I've given up on them.

If you want to keep using the columns try these things: Make sure you're using filtered tips for any steps involving RNA, make sure your washes are thorough (invert and roll the tubes to get the wash all over the inside and lid before a spin), and use a vac or pipette to remove washes (don't just flick it out of the collection tube).

*Edit: Here is my modified protocol, I work on human cells but there might be some additional steps for plant tissue so look at the original Thermo protocol to find out. Also, make sure you are clean around RNA and use 10% bleach or RNase Zap on your gloves/workspace/tools to inhibit any RNases before working.

Going to second this protocol. Trizol is the shit. I've also heard that linear polyacrylamide works even better than glycogen as an RNA carrier.

Extra recommendation if OP wants to keep using the columns (this protocol combines the high yield of Trizol with the easy/clean-ness of kits):

Follow /u/what_are_you_saying's protocol through step 5, then transfer the aqueous phase to an RNAse-free eppendorf tube.

Kits frequently have an "clean up RNA using our column" protocol. Use that protocol on the aqueous bit from the bullet point above.

If your kit does not have a "RNA clean up protocol", add lysis buffer/ethanol to the amounts you would normally need for a 200uL liquid sample. Do NOT add beta-mercaptoethanol or proteinase K. Add this mixture to the column and purify RNA normally according to instructions for a normal sample in the kit.

This protocol can usually get a couple ug of ultra-clean RNA even if you have an extremely small amount of starting material (like say 10 Drosophila heads).

Have you ever done extractions without glycogen? If so, do you find that the glycogen increases yield? Increases purity?

I use a column kit, I have 100% success rate, with most of my samples scoring a RIN of 10. Mouse cells here.

I'm a molecular geneticist who works on plants. I've done a lot of RNA extractions. Here's a couple thoughts.

-RNA degrades very easily and is much less stable than DNA. Spray down your work bench, pipettes, and your gloves with ethanol before you begin an extraction. Touch something else while the centrifuge is spinning? Spray your gloves again. I also like to use special "filter tips" to avoid contaminating my samples with RNases.

-It sounds like you're using a kit. Make sure you follow the directions carefully - a lot of the buffers have similar sounding names. If there are optional steps, do them. At the final step, when you are eluting your RNA out of the column, I like to take what comes out and pipette it back into the top of the column. This second wash will give you a slightly higher yield.

-It sounds like you're new in the lab - welcome! I'm sure there are some more senior people working with you who have done that protocol (not necessarily the PI, but perhaps even a post doc or a grad student). Ask them for help! Ask them to sit with you while you do the protocol and they can observe your technique and might be able to point out something you're doing incorrectly.


In Genomic Dna Isolation Why We Use 70 Percent Ethanol?

Because 70% ethanol can wash the DNA pellet at the end of DNA isolation process. The genomic or plasmid DNA isolation needs several buffers like lysis buffer, TAE buffer along with different salts and phenol, chloroform, iso-amylalcohol solution.

So at the end we have to wash the DNA pellet with 70% ethanol. 100% ethanol will dry the estimated DNA that's why 70% ethanol is used for this purpose.

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The reason why uracil is not seen in DNA is because there are certain enzymes that break it down before.

The denisities of materials is clearly visible in blood agar making it useful as a primary isolation.

1987 was the first year that DNA evidence was used to convict someone in the US. If you would like.

Something to consider: Purifying alcohol is expensive. Each time you distill it you can make it.

It does not lyse WBCs probably because RBCs do not contain nucleus and are more prone to lysis than WBCs.

Because it's what they ave to use.

Molecular biology is completely dependant on the methods of electrophoresis, this method separates DNA.

It acts as a chaotroph (at high concentrations) and will 'dehydrate' the DNA, meaning that the DNA is.

The medical field has used statistics extensively for a very long time - perhaps more than any other.

Its a preprocesser directive of c language which can be use to include a specific file..ex :#include.


Schau das Video: Isolering af DNA i løg (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Drem

    Eine Antwortanfrage - kein Problem.

  2. Maur

    Was ist der richtige Satz ... Super, tolle Idee

  3. Ward

    Ich entschuldige mich, es liegt nicht an mir.

  4. Treasigh

    Meiner Meinung nach haben Sie nicht Recht. Ich bin versichert. Ich schlage vor, es zu diskutieren. Schreiben Sie mir in PM, wir werden reden.

  5. Traian

    Es tut mir leid, aber meiner Meinung nach liegst du falsch. Ich bin sicher. Ich kann es beweisen. Schreiben Sie mir in PM, sprechen Sie.



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