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Befinden sich Porine auf der inneren oder äußeren Membran der Mitochondrien?

Befinden sich Porine auf der inneren oder äußeren Membran der Mitochondrien?


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Ich habe mir mehrere Ressourcen angesehen und sie sagen unterschiedliche Dinge.


Dies ist nicht mein Fachgebiet, aber die Transporter Classification Database scheint eine zuverlässige Quelle zu sein und besagt:

Die am besten charakterisierten Mitglieder der MPP-Familie sind die spannungsabhängigen anionenselektiven Kanalporine (VDAC) im mitochondriale äußere Membran.

Wenn man die Proteindatenbank durchsucht, kann man eine Kristallstruktur für den menschlichen spannungsabhängigen Anionenkanal 1 finden und das dazugehörige Papier sagt auch, dass er sich in der äußeren Mitochondrienmembran befindet, so dass man meinen könnte, dass sie es wissen sollten.


Zwischenmembranraum

Die Zwischenmembranraum ist der Bereich zwischen der inneren Membran und der äußeren Membran eines Mitochondriums oder eines Chloroplasten. Seine Hauptfunktion ist die Nukleotidphosphorylierung. Kanalproteine, Porine genannt, in der äußeren Membran ermöglichen die freie Bewegung von Ionen und kleinen Molekülen in die Zwischenmembranraum.

Wenn sich Elektronen in der Elektronentransportkette entlang der Proteine ​​​​bewegen, verlieren die Elektronen Energie, um H+-Ionen aus der mitochondrialen Matrix in die Zwischenmembranraum.

Zwischenmembranraum
Die Zwischenmembranraum (kurz IMS) der Mitochondrien ist die Region, die zwischen der äußeren und inneren Membran der Mitochondrien liegt. Hier findet die oxidative Phosphorylierung statt [14].
Mitochondriale Matrix .

ist der Raum zwischen der äußeren Membran und der inneren Membran. Er wird auch als perimitochondrialer Raum bezeichnet.

- Der Raum zwischen der äußeren und inneren Membran in einem Mitochondrium.
Lysosom - Eine membrangebundene Organelle, die in eukaryotischen Zellen vorkommt. Enthält Säuren und Enzyme, die unerwünschte Moleküle abbauen.
Matrix - Der Raum innerhalb der inneren Membran der Mitochondrien.

der Mitochondrien
C. Innere Membran der Mitochondrien
D. Matrix der Mitochondrien.

Der ellipsoidförmige Chloroplast ist von einer Doppelmembran umgeben und der Bereich zwischen den beiden Schichten, aus denen die Membran besteht, wird als bezeichnet

. Die äußere Schicht der Doppelmembran ist viel durchlässiger als die innere Schicht, die eine Reihe von eingebetteten Membrantransportproteinen aufweist.

Das Innere der beiden Membranen wird als Matrix bezeichnet, der Raum zwischen den beiden Membranen wird als bezeichnet

und die von der inneren Membran gebildeten Falten werden Cristae genannt. Mitochondrien enthalten auch ihre eigene DNA, die einige der Enzyme kodiert, die in den Mitochondrien verwendet werden.

aus der mitochondrialen Matrix.
293
98 .

Der Protonengradient entwickelt sich zwischen den

Das Mitochondrium besteht aus äußeren und inneren Membranen, und

(Raum zwischen den Membranen), die Cristae (Einfaltungen der inneren Membran) und die Matrix (Raum innerhalb der inneren Membran). Die äußere Membran enthält mehrere Porine, die Kanäle bilden, in denen bestimmte Moleküle frei diffundieren können.

Die beim Übergang der Elektronen von Träger zu Träger freigesetzte Energie bewegt Wasserstoffionen (Protonen) durch die Membran, von der mitochondrialen Matrix zum

, wodurch ein Konzentrationsgradient von Protonen entsteht.

Nach einer Zyanidvergiftung kann die Elektronentransportkette keine Elektronen mehr in die

würde zunehmen, und die ATP-Synthese würde aufhören.
B
C .

Mitochondrien mitochondriale äußere Membran innere Membran cristae

Die Komponenten der oxidativen Phosphorylierung – die Elektronentransportkette und die ATP-Synthase – sind in die innere Mitochondrienmembran eingebettet. Protonen (+) werden aus der Matrix in den flüssigkeitsgefüllten Raum zwischen den beiden Membranen gepumpt, auch "

Der Raum zwischen äußerer und innerer Membran wird als bezeichnet

. Innerhalb der inneren Membran befinden sich flache, pfannkuchenähnliche Strukturen, die Thylakoide genannt werden. Die Thylakoide bilden Stapel, die Grana genannt werden.


Funktionen der Mitochondrien

Mitochondrien sind für viele wichtige Aktivitäten innerhalb einer Zelle verantwortlich:

  • Es ist der Hauptstandort für die ATP-Synthese und wird daher als Kraftwerk der Zelle (Oxidative Phosphorylierung) bezeichnet. Die Zellen wie Muskelzellen, Leber, zeigen die höhere Rate der ATP-Verwertung in diesen Bereichen an. In reifen Erythrozyten fehlen Mitochondrien, um mehr Platz für Hämoglobin zur Sauerstoffbindung zu schaffen.
  • Die innere Membran der Mitochondrien enthält Proteine ​​(F0-F1-Partikel), die am Elektronentransport und der ATP-Synthese beteiligt sind.

  • Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der Aufnahme und Freisetzung von Ca2+, das die Calciumkonzentration im Zytoplasma der Zellen aufrechterhält.
  • Mitochondrien spielen auch eine sehr wichtige Rolle im Prozess der Apoptose in Säugerzellen. Die Proteine ​​der BCL2-Familie regulieren die Freisetzung von Cytochrom c aus der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien, die, sobald sie sich im Cytoplasma befinden, die Aktivierung anderer apoptotischer Signale bewirkt und schließlich den Zelltod verursacht.
  • Im Fettgewebe geben Mitochondrien Wärme über die Elektronentransportkette ab.

Biozentrum der Universität Würzburg, Würzburg, Deutschland

Biozentrum der Universität Würzburg, Würzburg, Deutschland

Abstrakt

Die mitochondriale Außenmembran enthält einen Kanal, der für den Durchgang hydrophiler Metaboliten durch die Membran verantwortlich ist. Das für viele Organismen bekannte kanalbildende Protein, genannt mitochondriale Porine oder VDAC (spannungsabhängiger anionenselektiver Kanal), hat eine Länge von etwa 280 Aminosäuren. Die Genome eukaryontischer Organismen enthalten mehrere Porin-Isoformen mit nicht genau definierter Funktion. Die Primärstruktur mitochondrialer oder eukaryotischer Porine ist nicht besonders hydrophob und Sekundärstrukturvorhersagen legen nahe, dass ein für die Sekundärstruktur bakterieller Porine typischer β-Fasszylinder auch den mitochondrialen Kanal bildet. Am mitochondrialen Stoffwechsel beteiligte Kinasen wie Hexokinase oder Glycerokinase binden an Porin und spielen eine wichtige Rolle bei der Kompartimentbildung in Mitochondrien. Mitochondriale Porine sind spannungsgesteuert und schalten bei Spannungen über 20 bis 30 mV in ionendurchlässige Unterzustände um. Der offene Kanal hat eine geringe Präferenz für Anionen gegenüber Kationen mit der gleichen wässrigen Mobilität. Die geschlossenen Zustände sind kationenselektiv und undurchlässig für ATP und ADP. Mitochondriale Porine scheinen an der Apoptose und der Freisetzung von Cytochromen beteiligt zu sein C. Es gibt neue Hinweise darauf, dass die zytoplasmatische Membran eukaryontischer Zellen auch Porine der eukaryontischen Porinfamilie mit einer noch nicht verstandenen Rolle im Zellstoffwechsel enthält.


Was sind Mitochondrien und warum sind sie wichtig?

Jedes Lebewesen besteht aus Zellen, die die Bausteine ​​des Lebens sind. Im Inneren dieser Zellen befinden sich eine Reihe von Organellen – subkompartimentartige Einheiten, die verschiedene, aber spezifische Funktionen erfüllen. Unterschiedliche Zellen in Ihrem Körper haben insbesondere unterschiedliche Formen und Größen und somit unterschiedliche Zwecke. Ähnliche Zellen (die die gleiche Aufgabe erfüllen) bilden Körpergewebe wie Muskel-, Haut- oder Knochengewebe. Gruppen verschiedener Zelltypen bilden die Organe in Ihrem Körper, wie Herz, Leber oder Lunge. Gemeinsam arbeiten alle Organe als System zusammen, um Sie am Leben und gesund zu erhalten (Science NetLinks).

Was sind Mitochondrien?

„Das Kraftpaket der Zelle“ so denken und erinnern sich die meisten Menschen an die Mitochondrien (Plural: Mitochondrien) aus dem Biologieunterricht an der High School. Sie sind Organellen, die wie mikroskopisch kleine, aber hochkomplexe Fabriken funktionieren, Energie produzieren und für den Körper schädlichen Abfall entsorgen. Mitochondrien sind entscheidend für das Überleben der Zellen, und ATP (Energie), das Ihre Mitrochondrien produzieren, ist für Stoffwechselprozesse und die Gesunderhaltung von entscheidender Bedeutung.

Die Struktur der Mitochondrien

Mitochondrien sind darauf ausgelegt, ihre Produktivität zu maximieren. Sie enthalten zwei Membranen – die äußere Membran funktioniert wie eine Haut und die innere Membran ermöglicht mehr Reaktionen. Dies bedeutet, dass Ihre Zellen mehr Arbeit erledigen können. Äußere Membran: Dies ist eine Phospholipid-Doppelschicht, die proteinbasierte Strukturen namens Porine enthält, die es Molekülen (Ionen, ATP, ADP usw.) ermöglichen, sich zu kreuzen.

Innere Membran: Diese Membran ist hochkomplex und dort wird das meiste ATP gebildet. Es umfasst alle Komplexe des Elektronentransportsystems , des ATP-Synthetase-Komplexes und Transportproteine. Die innere Membran hat keine Porine wie die äußere Membran, daher ist sie für die meisten Moleküle undurchlässig.

Cristae: Dies sind die Falten der inneren Membran, die die Oberfläche und den verfügbaren Raum für die Durchführung chemischer Reaktionen vergrößern. Hier befinden sich auch die Elektronentransportkette und Enzyme. Die Anzahl der Cristae in den Mitochondrien korreliert mit dem ATP-Bedarf der jeweiligen Zelle. Beispielsweise enthalten Herzmuskelzellen aufgrund des höheren ATP-Bedarfs (Biology Dictionary) bis zu dreimal mehr Cristae als andere Zellen.

Matrix: Dies ist der Raum innerhalb der inneren Membran, in dem der Zitronensäurezyklus oder Krebszyklus stattfindet. Dies ist ein wichtiger Teil der Zellatmung und der ATP-Produktion. Auch mitochondriale DNA ist hier untergebracht.

Wie die mächtigen Mitochondrien funktionieren

Mitochondrien kommen in den Zellen von Tieren, Menschen, Pflanzen und Pilzen vor. Während die Mitochondrien in erster Linie dafür bekannt sind, Energie aus Nahrung in Energie für biologische Prozesse umzuwandeln, sind Mitochondrien tief in verschiedene andere Aktivitäten eingebunden, die es den Zellen ermöglichen, effizient zu funktionieren, um Ihnen zu helfen, Ihren Körper gesund zu halten. Hier sind die fünf Schlüsselrollen, die Mitochondrien für die zelluläre Gesundheit spielen und was passieren kann, wenn diese Funktionen gestört sind:

  1. Produktion von ATP Mitochondrien produzieren 90 % der Energie, die unser Körper zum Funktionieren benötigt, indem sie chemische Energie von Nährstoffen in ATP umwandeln. Während der Zellatmung wird eine weitere Chemikalie namens NADH produziert, die dann von Enzymen verwendet wird, um ATP in Form von chemischen Bindungen zu erzeugen. Die Produktion von ATP ist wichtig, um dem Körper zu helfen, richtig zu funktionieren. Ohne Energie leiden Ihre Zellen und Ihr Körper. Funktionsstörungen aufgrund eines ATP-Mangels können zu einer Vielzahl von Gesundheitsproblemen beitragen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Alzheimer, Parkinson, Lou-Gehrig-Krankheit, Diabetes, Krebs und verschiedene Arten von mitochondrialen Erkrankungen.
  2. Kalziumhomöostase — Dies ist der Kalziumfluss in und aus den Mitochondrien einer Zelle. Dieser Prozess ist ein wichtiger Teil der Stoffwechselregulation und der Abtötung ungesunder Zellen. Wenn die mitochondriale Calciumhomöostase beeinträchtigt ist, können je nach beteiligtem Zelltyp (NCBI) unterschiedliche pathologische Zustände auftreten.
  3. Zellmigration Dies bezieht sich auf die orchestrierte Bewegung von Zellen zu bestimmten Orten als Reaktion auf chemische Signale. Die Regulierung der Zellmigration kann dazu beitragen, ungesunde Zellen zu beenden und die Wundheilung zu beschleunigen Bildung und Metastasierung. – Dies ist im Wesentlichen ein programmierter Zelltod, bei dem die Gesundheit des Körpers erhalten wird, indem alte Zellen, unnötige Zellen und ungesunde Zellen beseitigt werden. Ohne angemessene Apoptose (entweder zu wenig oder zu viel) besteht ein höheres Risiko für gesundheitliche Probleme, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, ischämischer Schäden, Autoimmunerkrankungen und vieler Krebsarten (NCBI) .
  4. Angeborene Immunität — Dies bezieht sich auf unspezifische Abwehrmechanismen – wie Haut, Chemikalien im Blut und Zellen innerhalb Ihres Immunsystems, die fremde Zellen angreifen — die im Grunde sofort oder innerhalb von Stunden nach dem Auftreten eines Antigens in der Karosserie . Neben der Regulierung der antiviralen Signalübertragung tragen Mitochondrien auch zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems nach Zellschädigung und Stress (NCBI) bei.

Um es noch einmal zusammenzufassen: ATP ist die Energiewährung für Ihre Zellen, und Ihre Mitochondrien sind die primären Quellen, um mehr davon zu produzieren, um Sie am Leben und gesund zu halten . Diese Organellen sind auch dafür verantwortlich, das Wachstum ungesunder Zellen zu überwachen und zu eliminieren. Wenn in Ihren Mitochondrien ein Mangel vorliegt, treten mit größerer Wahrscheinlichkeit gesundheitliche Probleme auf.


Ergebnisse

Ausdruck von VDAC in E coli

Um zu untersuchen, ob die E coli Der Bam-Komplex kann mit einem mitochondrialen β-Fass-Protein umgehen, aus dem wir genetisch fusionierten VDAC N. crassa an die Signalsequenz des bakteriellen Porins PhoE, um den Transport durch die innere Membran zu ermöglichen. Neben dem Volllängenprotein wurden zunächst zwei VDAC-Varianten konstruiert, um zu untersuchen, ob das β-Signal, das für den Einbau von β-Fassproteinen in das mitochondriale OM benötigt wird, auch für deren Einbau in das bakterielle OM benötigt wird. Die Deletion von zwei Aminosäureresten vom C-Terminus beeinflusst das von Kutik et al. identifizierte β-Signal nicht. (2008) und positioniert einen Phe-Rest am C-Terminus wie in der bakteriellen OMP-Signatursequenz ( Abb. 1). Die Deletion von fünf Resten beeinflusst das β-Signal und eliminiert den Phe-Rest ( Abb. 1). Die erzeugten Konstrukte stehen unter der Kontrolle der phoE Promotor, der eine Expression auf hohem Niveau ermöglicht, wenn die Zellen unter P . gezüchtet werdenich Einschränkung. Da sie sich auf einem Medium-Copy-Plasmid befinden, wurde eine Expression auf niedrigem Niveau unter P . erwartetich-vollen Bedingungen.

Vergleich der bakteriellen und mitochondrialen β-Barrel-OMP-Assembly-Signale und der C-Termini der in dieser Studie verwendeten VDAC-Varianten. Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren wird verwendet. X, beliebige Aminosäure φ, hydrophober Rest π, polarer Rest n, 1–28 Reste. Das mitochondriale β-Signal wird von dicken Linien umrandet.

Vergleich der bakteriellen und mitochondrialen β-Barrel-OMP-Assemblysignale und der C-Termini der in dieser Studie verwendeten VDAC-Varianten. Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren wird verwendet. X, beliebige Aminosäure φ, hydrophober Rest π, polarer Rest n, 1–28 Reste. Das mitochondriale β-Signal wird von dicken Linien umrandet.

Zellen des Wildtyps E coli Stamm MC4100, der die relevanten Plasmide enthält, wurden in P . gezüchtetich-gesättigte L-Brühe und Ganzzell-Lysate wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Die Immundekoration der Blots zeigte, dass VDAC voller Länge unter diesen Bedingungen exprimiert wurde ( 2A ). Die Spezifität des VDAC-Antiserums wurde durch das Fehlen eines Signals in dem Stamm bestätigt, der den leeren Vektor trägt ( 2A ). Nach Ultraschallunterbrechung des E coli Zellen, VDAC fraktioniert mit den Membranen wie den endogenen Porinen OmpF und OmpC, während das zytoplasmatische Chaperon SecB im Überstand gewonnen wurde (Abb. 2A). Die Deletion von zwei Resten vom C-Terminus beeinflusste die Proteinspiegel nicht, und wie das Volllängenprotein wurde diese mutierte Form auch in der Membranfraktion gewonnen ( 2A ). Das mutierte Protein, dem fünf C-terminale Reste fehlen, wurde jedoch unter diesen Bedingungen nicht nachgewiesen, möglicherweise weil diese Variante nicht in das OM eingebaut und somit proteolytisch abgebaut wurde. In ähnlicher Weise wurde VDAC nicht erkannt, wenn es ohne eine Signalsequenz exprimiert wurde ( 2A ). Um den proteolytischen Abbau des mutierten Proteins, dem fünf C-terminale Reste fehlen, zu verifizieren, wurde das für dieses Konstrukt kodierende Plasmid in den Stamm JW0157, dem die periplasmatische Hauptprotease DegP fehlt, und seinen isogenen Elternstamm BW25113 eingeführt. Da das mutierte Protein nur im GradP mutant ( Fig. 2B), scheint es ein Substrat für die periplasmatische Protease im Wildtyp-Stamm zu sein.

Mitochondrialer VDAC von Neurospora crassa ist auf das OM in . lokalisiert Escherichia coli. (EIN) Ganzzelllysate, Zellhüllen und lösliche Fraktionen (Überstand) wurden aus MC4100-Zellen isoliert, die Plasmide enthielten, die für VDAC (volle Länge) kodieren, C-terminal verkürzte Varianten, denen fünf (Δ5 C-Term.) oder zwei (Δ2 C-Term) fehlen .) Aminosäuren, VDAC ohne Signalsequenz (Δ-Signal) oder der leere Vektor. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren gegen VDAC analysiert. E coli Porine (OmpC/F) oder das zytoplasmatische Protein SecB. (B) Ganze Zellen von E coli Stamm BW25113 und seine GradP mutantes Derivat JW0157, beide enthaltend Plasmide, die entweder VDAC voller Länge oder mutierten VDAC ohne fünf C-terminale Reste kodieren, wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren, die gegen VDAC oder OmpA gerichtet sind, analysiert. (C) Innere Membranen und OMs von MC4100-Zellen, die VDAC voller Länge exprimieren, wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren, die gegen VDAC oder gerichtet waren, analysiert E coli Porine. Die NADH-Oxidase-Aktivität wurde als Marker der inneren Membran bewertet. Signale oder Aktivitäten für jedes Protein in jeder Fraktion wurden auf die in der Peakfraktion nachgewiesene Menge normalisiert. (D) Mitochondrien isoliert aus N. crassa (links) und Suspensionen von Zellhüllen aus E coli Stamm MC4100 exprimierend N. crassa VDAC (rechts) wurden entweder intakt gelassen (Eingabe), mit den angegebenen Konzentrationen von Proteinase K (PK) verdaut oder mit 6 M Harnstoff extrahiert und in eine extrahierbare (Überstand) und eine membraneingebettete (Pellets) Fraktion getrennt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Brilliant Blue zum Nachweis der OmpC-, OmpF- und OmpA-Proteine ​​oder Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen VDAC und Tom40. Tom40, mitochondriales OMP mit einer für Protease zugänglichen Schleife OmpA, E coli OMP mit Protease-zugänglicher periplasmatischer Erweiterung OmpC und OmpF, Protease-geschützte OMPs.

Mitochondrialer VDAC von Neurospora crassa ist auf das OM in . lokalisiert Escherichia coli. (EIN) Ganzzelllysate, Zellhüllen und lösliche Fraktionen (Überstand) wurden aus MC4100-Zellen isoliert, die Plasmide enthielten, die für VDAC (volle Länge) kodieren, C-terminal verkürzte Varianten, denen fünf (Δ5 C-Term.) oder zwei (Δ2 C-Term) fehlen .) Aminosäuren, VDAC ohne Signalsequenz (Δ-Signal) oder der leere Vektor. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren gegen VDAC analysiert. E coli Porine (OmpC/F) oder das zytoplasmatische Protein SecB. (B) Ganze Zellen von E coli Stamm BW25113 und seine GradP mutantes Derivat JW0157, beide enthaltend Plasmide, die entweder VDAC voller Länge oder mutierten VDAC ohne fünf C-terminale Reste kodieren, wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren, die gegen VDAC oder OmpA gerichtet sind, analysiert. (C) Innere Membranen und OMs von MC4100-Zellen, die VDAC voller Länge exprimieren, wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren analysiert, die gegen VDAC oder gerichtet waren E coli Porine. Die NADH-Oxidase-Aktivität wurde als Marker der inneren Membran bewertet. Signale oder Aktivitäten für jedes Protein in jeder Fraktion wurden auf die in der Peakfraktion nachgewiesene Menge normalisiert. (D) Mitochondrien isoliert aus N. crassa (links) und Suspensionen von Zellhüllen aus E coli Stamm MC4100 exprimierend N. crassa VDAC (rechts) wurden entweder intakt gelassen (Eingabe), mit den angegebenen Konzentrationen von Proteinase K (PK) verdaut oder mit 6 M Harnstoff extrahiert und in eine extrahierbare (Überstand) und eine membraneingebettete (Pellets) Fraktion getrennt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Brilliant Blue zum Nachweis der OmpC-, OmpF- und OmpA-Proteine ​​oder Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen VDAC und Tom40. Tom40, mitochondriales OMP mit einer für Protease zugänglichen Schleife OmpA, E coli OMP mit Protease-zugänglicher periplasmatischer Erweiterung OmpC und OmpF, Protease-geschützte OMPs.

Montage von VDAC im Bakteriellen OM

Wir wollten feststellen, in welcher Membran sich VDAC befindet. Um innere Membranen und OMs zu trennen, haben wir Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationen angewendet. VDAC fraktioniert mit den Marker-OM-Proteinen OmpF und OmpC und nicht mit dem Inner-Membran-Marker NADH-Oxidase ( Abb. 2C). Als nächstes überwachten wir die Integration von VDAC in das OM in Protease-Verdauungsexperimenten. In seiner natürlichen Umgebung, dem mitochondrialen OM, ist das Protein resistent gegen Proteinase K, während Tom40, das eine große Schleife an der Oberfläche der Mitochondrien aufweist, abgebaut wird (Abb. 2D). Auch im bakteriellen OM war VDAC weitgehend resistent gegen Proteinase K, wie die endogenen Porine OmpC und OmpF und im Gegensatz zu OmpA, das eine große periplasmaexponierte Domäne besitzt und unter diesen Bedingungen abgebaut wurde ( Abb. 2D). Darüber hinaus konnte VDAC, ähnlich den bakteriellen Porinen, nicht mit Harnstoff aus den Bakterienmembranen extrahiert werden (Abb. 2D), was bestätigt, dass es integral in das OM eingebaut wurde.

Wenn VDAC tatsächlich in das bakterielle OM eingebaut ist, könnte es an der bakteriellen Zelloberfläche mit spezifischen Antikörpern nachweisbar sein. Die niedrige Hintergrundexpression in nicht induzierten MC4100-Zellen war für den Nachweis von VDAC durch Immunfluoreszenzmikroskopie unzureichend. Um die Expressionsniveaus zu erhöhen, wurde das für VDAC kodierende Plasmid in . eingeführt E coli Stamm CE1224, der keine endogenen Porine produziert. Wachsen der transformierten Zellen unter Pich Limitierung führte zu einer drastischen Überproduktion von VDAC, sogar in einem solchen Ausmaß, dass ein kleiner Anteil an nicht prozessierten Vorläuferproteinen nachgewiesen wurde ( Abb. 3A). Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde das Protein an der Bakterienzelloberfläche wie an der Oberfläche isolierter Mitochondrien nachgewiesen ( Abb. 3B). Die Spezifität des beobachteten Signals wurde durch seine Abwesenheit in Bakterien bestätigt, die den leeren Vektor trugen. Auch das mutierte Protein, dem zwei C-terminale Aminosäurereste fehlen, wurde an der Bakterienzelloberfläche nachgewiesen, aber nicht das Protein, dem fünf Aminosäuren fehlen ( 3B ), obwohl es unter diesen Bedingungen reichlich produziert wurde ( 3C). Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass sich VDAC zum bakteriellen OM zusammenfügt und dass der Zusammenbau vom β-Signal abhängt.

Nachweis von VDAC auf der Bakterienzelloberfläche mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. (EIN) Steady-State-Pegel des VDAC voller Länge in verschiedenen Escherichia coli Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden. Escherichia coli Stamm CE1224 wurde unter P . gezüchtetich Deprivation, wohingegen die Stämme CE1265 und MC4100 exponentiell in L-Brühe gezüchtet wurden. Alle Stämme enthielten das Plasmid pJPNcPor1, das für VDAC in voller Länge unter der Kontrolle des kodiert phoE Promoter. Gleiche Mengen an Zellen wurden geerntet. Zellhüllen wurden isoliert, seriell verdünnt und durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung eines Antiserums gegen VDAC analysiert. In den vollständig induzierten CE1224-Zellen wird eine Akkumulation von unprozessiertem Vorläufer (P), der die Signalsequenz enthält, beobachtet. (B) Isolierte Mitochondrien aus Neurospora crassa oder E coli CE1224-Zellen, die Volllängen- oder C-terminal verkürzte VDAC-Varianten exprimieren oder einen leeren Vektor tragen, über Nacht unter P . gezüchtetich Entzug, wurden fixiert und mit einem Antiserum gegen VDAC immungefärbt, gefolgt von einem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper. Die Bilder wurden in Fluoreszenz- (FL) oder Hellfeld- (BF) Kanälen aufgenommen. (C) Vergleich der Expressionsniveaus von Volllängen-VDAC und dem mutierten Protein, dem fünf C-terminale Reste fehlen (Δ5 C-Term.) in Stamm CE1224, gezüchtet unter Pich Einschränkung. Gleiche Zellmengen wurden geerntet und durch SDS-PAGE und Western-Blotting mit Antiserum gegen VDAC analysiert. P, Vorläufer und M, reife Form.

Nachweis von VDAC auf der Bakterienzelloberfläche mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. (EIN) Steady-State-Pegel des VDAC voller Länge in verschiedenen Escherichia coli Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden. Escherichia coli Stamm CE1224 wurde unter P . gezüchtetich Deprivation, wohingegen die Stämme CE1265 und MC4100 exponentiell in L-Brühe gezüchtet wurden. Alle Stämme enthielten das Plasmid pJPNcPor1, das für VDAC in voller Länge unter der Kontrolle des kodiert phoE Promoter. Gleiche Mengen an Zellen wurden geerntet. Zellhüllen wurden isoliert, seriell verdünnt und durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung eines Antiserums gegen VDAC analysiert. In den vollständig induzierten CE1224-Zellen wird eine Akkumulation von unprozessiertem Vorläufer (P), der die Signalsequenz enthält, beobachtet. (B) Isolierte Mitochondrien aus Neurospora crassa oder E coli CE1224-Zellen, die Volllängen- oder C-terminal verkürzte VDAC-Varianten exprimieren oder einen leeren Vektor tragen, über Nacht unter P . gezüchtetich Entzug, wurden fixiert und mit einem Antiserum gegen VDAC immungefärbt, gefolgt von einem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper. Die Bilder wurden in Fluoreszenz- (FL) oder Hellfeld- (BF) Kanälen aufgenommen. (C) Vergleich der Expressionsniveaus von Volllängen-VDAC und dem mutierten Protein, dem fünf C-terminale Reste fehlen (Δ5 C-Term.) in Stamm CE1224, gezüchtet unter Pich Einschränkung. Gleiche Zellmengen wurden geerntet und durch SDS-PAGE und Western-Blotting mit Antiserum gegen VDAC analysiert. P, Vorläufer und M, reife Form.

Porenbildung durch VDAC im E coli OM

VDAC ist der Hauptweg, auf dem Metaboliten die äußere mitochondriale Membran passieren. Wenn VDAC korrekt in das bakterielle OM eingebaut wird, sollte es daher große Poren bilden. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde das für VDAC kodierende Plasmid in E coli Stamm CE1265, der keine endogenen Porine produziert. Aufgrund einer Mutation im regulatorischen Gen phoR, diese Sorte drückt die pho regulon konstitutiv, aber nicht im gleichen Ausmaß wie ein vollständig induzierter Stamm wie CE1224 (Abb. 3A). Die Porenbildung im OM wurde in einem Antibiotika-Sensitivitätstest bestimmt, bei dem die Zone der Wachstumshemmung um eine das getestete Antibiotikum enthaltende Scheibe ein Maß für die Diffusion des Antibiotikums durch die Poren ist. Wenn die Bakterien VDAC produzierten, waren sie gegenüber allen getesteten Antibiotika empfindlicher (Tabelle 1), was darauf hinweist, dass VDAC Poren im bakteriellen OM bildet. Um diese Schlussfolgerung zu untermauern, wurde die Spaltung von Nitrocefin durch periplasmatische β-Lactamase in intakten Zellen gemessen, ein Prozess, bei dem die Permeation dieses chromogenen Antibiotikums durch das OM geschwindigkeitsbestimmend ist. Die Synthese von VDAC führte zu einer drastisch erhöhten Spaltungsrate von Nitrocefin in intakten Zellen ( Abb. 4A), die mit der Bildung wässriger Poren im OM übereinstimmt. In beiden Assays wurde die Expression von phoE aus dem gleichen Vektor führte zu einem moderateren Anstieg der Antibiotikaaufnahme (Tabelle 1 und Abb. 4A), was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass VDAC eine erheblich größere Porengröße hat als die E coli Porine (Freitag et al. 1982). Zusammenfassend fördert die Integration von VDAC in das bakterielle OM, ähnlich seiner Rolle in Mitochondrien, den Fluss von gelösten Stoffen durch diese Membran.

Ausdruck von VDAC in Escherichia coli Zellen erhöht ihre Anfälligkeit für Antibiotika.

Plasmid Wachstumshemmzone (mm)
Ery (25) Verstärker (5) Tet (2) Rif (0.3) Vnc (5) Ceph (5)
Vektor 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plasmid Wachstumshemmzone (mm)
Ery (25) Verstärker (5) Tet (2) Rif (0.3) Vnc (5) Ceph (5)
Vektor 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

H INWEIS .-porin-weniger E coli Stamm CE1265 wurde mit einem leeren Vektor, einem PhoE kodierenden Plasmid oder einem VDAC kodierenden Plasmid transformiert. Die Empfindlichkeit der transformierten Zellen gegenüber Antibiotika wurde auf Platten durch Messung der Wachstumshemmzone um Filterscheiben herum bestimmt, die mit den Antibiotika in der in Klammern angegebenen Konzentration (in mg/ml) getränkt waren. Dargestellt sind Mittelwerte der Wachstumshemmzone (in mm vom Rand der Filterscheiben) aus drei Versuchen. Ery, Erythromycin Amp, Ampicillin Tet, Tetracyclin Rif, Rifamycin Vnc, Vancomycin und Ceph, Cephaloridin.

Ausdruck von VDAC in Escherichia coli Zellen erhöht ihre Anfälligkeit für Antibiotika.

Plasmid Wachstumshemmzone (mm)
Ery (25) Verstärker (5) Tet (2) Rif (0.3) Vnc (5) Ceph (5)
Vektor 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plasmid Wachstumshemmzone (mm)
Ery (25) Verstärker (5) Tet (2) Rif (0.3) Vnc (5) Ceph (5)
Vektor 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

H INWEIS .-porin-weniger E coli Stamm CE1265 wurde mit einem leeren Vektor, einem PhoE kodierenden Plasmid oder einem VDAC kodierenden Plasmid transformiert. Die Empfindlichkeit der transformierten Zellen gegenüber Antibiotika wurde auf Platten durch Messung der Wachstumshemmzone um Filterscheiben herum bestimmt, die mit den Antibiotika in der in Klammern angegebenen Konzentration (in mg/ml) getränkt waren. Dargestellt sind Mittelwerte der Wachstumshemmzone (in mm vom Rand der Filterscheiben) aus drei Versuchen. Ery, Erythromycin Amp, Ampicillin Tet, Tetracyclin Rif, Rifamycin Vnc, Vancomycin und Ceph, Cephaloridin.

VDAC bildet Poren im bakteriellen OM. (EIN) Zellen aus dem Stamm CE1265, enthaltend pBR322, das für β-Lactamase kodiert, wurden verwendet. Die Zellen wurden zusätzlich mit dem leeren Vektor oder einem entweder PhoE oder den angegebenen VDAC-Varianten kodierenden Plasmid transformiert und mit Nitrocefin inkubiert. Der Umsatz des Substrats wurde durch Spektrophotometrie bestimmt. (B) Ganzzell-Lysate aus Zellen, die in Nitrocefin-Aufnahme-Experimenten verwendet wurden, wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen die angegebenen Proteine ​​analysiert.

VDAC bildet Poren im bakteriellen OM. (EIN) Zellen vom Stamm CE1265, die pBR322 enthielten, das für β-Lactamase kodiert, wurden verwendet. Die Zellen wurden zusätzlich mit dem leeren Vektor oder einem entweder PhoE oder den angegebenen VDAC-Varianten kodierenden Plasmid transformiert und mit Nitrocefin inkubiert. Der Umsatz des Substrats wurde durch Spektrophotometrie bestimmt. (B) Ganzzell-Lysate aus Zellen, die in Nitrocefin-Aufnahme-Experimenten verwendet wurden, wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen die angegebenen Proteine ​​analysiert.

VDAC-Versammlung im E coli OM ist abhängig vom β-Signal

Im Nitrocefin-Aufnahme-Assay förderte die Expression des mutierten VDAC, dem zwei Reste am C-Terminus fehlen, die Spaltung des Antibiotikums mit ähnlichen Effizienzen wie bei der Expression des Volllängenproteins ( Abb. 4A), was darauf hindeutet, dass diese Mutation nicht beeinflussen die Montage und die Porenbildung. Im Gegensatz dazu wurde die Spaltung von Nitrocefin durch die Expression der Variante, der fünf Reste fehlen, viel weniger gefördert ( 4A ). Letztere Variante konnte im konstitutiven Stamm CE1265 nachgewiesen werden, allerdings deutlich weniger als das Volllängenprotein ( Abb. 4B). Das Protein wurde weitgehend abgebaut, wenn die Zellhüllenfraktion dieser Zellen mit Proteinase K behandelt wurde, und es konnte mit Harnstoff aus diesen Membranen extrahiert werden, während das in diesem Stamm produzierte Protein in voller Länge Protease-resistent und nicht mit Harnstoff aus den Membranen extrahierbar war ( Abb. 5A). Somit scheint es, dass ein großer Teil des nachgewiesenen mutierten Proteins nicht in das OM inseriert wurde, diese Polypeptide fraktionieren nur mit den Membranen, vermutlich weil sie dichte Aggregate bilden, die während des Zentrifugationsverfahrens mit den Membranen pelletiert werden (Tommassen 1986). Trotzdem war ein kleiner Teil der Polypeptide resistent gegen Proteinase K und wurde nicht mit Harnstoff extrahiert ( Abb. 5A). ) im Einklang mit der Bildung von funktionellen Poren.

VDAC-Montage in die Escherichia coli OM hängt von einem intakten β-Signal ab. (EIN) Die Mehrheit der VDAC-Moleküle, denen die fünf C-terminalen Reste fehlen, wird nicht richtig in das OM integriert. Zellhüllen von E coli Stamm CE1265, der entweder den Volllängen-VDAC (oberer Teil) oder den mutierten VDAC (unterer Teil) exprimiert, wurden mit Proteinase K (PK) behandelt oder mit Harnstoff extrahiert, wie in der Legende zu Abbildung 2D beschrieben, und durch SDS-PAGE und entweder Färbung analysiert mit Coomassie Brilliant Blue zur Visualisierung von OmpA oder Western Blotting zum Nachweis der VDAC-Variante. (B) Zellhüllen von E coli Stamm MC4100, der entweder VDAC in voller Länge oder das mutierte Protein, dem vier C-terminale Reste fehlen, exprimiert, mit Harnstoff extrahiert, wie in der Legende zu 2D beschrieben, und durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Antiserum gegen VDAC analysiert.

VDAC-Montage in die Escherichia coli OM hängt von einem intakten β-Signal ab. (EIN) Die Mehrheit der VDAC-Moleküle, denen die fünf C-terminalen Reste fehlen, wird nicht richtig in das OM integriert. Zellhüllen von E coli Stamm CE1265, der entweder den Volllängen-VDAC (oberer Teil) oder den mutierten VDAC (unterer Teil) exprimiert, wurden mit Proteinase K (PK) behandelt oder mit Harnstoff extrahiert, wie in der Legende zu Abbildung 2D beschrieben, und durch SDS-PAGE und entweder Färbung analysiert with Coomassie Brilliant Blue to visualize OmpA or western blotting to detect the VDAC variant. (B) Cell envelopes of E coli strain MC4100 expressing either full-length VDAC or the mutant protein lacking four C-terminal residues were extracted with urea as described in the legend to figure 2D and analyzed by SDS-PAGE and western blotting using antiserum against VDAC.

The results presented so far indicated that the mutant protein lacking five C-terminal residues is only very inefficiently incorporated into the E coli OM, whereas the mutant protein lacking two residues, which still retains an intact β-signal and presents a Phe residue at the C terminus, is assembled as efficiently as is the wild-type VDAC. To investigate whether the presence of a C-terminal Phe could compensate for the disruption of the β-signal, an additional mutant was constructed, which lacks four amino acid residues from the C terminus where it presents a Phe ( fig. 1). In contrast to the mutant protein lacking five C-terminal residues ( fig. 2A), the protein lacking four residues was detected when the construct was expressed in the wild-type E coli Belastung. However, when the membrane fraction of this strain was extracted with urea, the mutant protein was partially solubilized, whereas the wild-type protein was insoluble as before ( fig 5B). Therefore, in spite of the presence of a Phe at the C terminus, the mutant protein lacking four C-terminal residues is inefficiently assembled into the E coli OM. Together, our results are consistent with the notion that an intact β-signal is needed for efficient insertion of VDAC into the bacterial OM but is not absolutely essential for this process.

VDAC Assembly Is Dependent on BamA

To determine whether assembly of VDAC into the OM of E coli depends on the Bam complex, we made use of a temperature-sensitive (ts) bamA mutant strain ( Doerrler and Raetz 2005). This strain fails to grow at 44 °C, but even at a permissive temperature, it shows an assembly defect of OMPs as evidenced by decreased levels of these proteins. These reduced levels probably result from degradation of misassembled OMPs by periplasmic proteases, such as DegP. The plasmid encoding VDAC was introduced into this mutant strain and into an isogenic strain carrying a wild-type bamA gene, and the bacteria were grown at 32 °C under Pich-limiting conditions to induce VDAC synthesis. Die bamA(ts) mutation did not affect growth under these conditions ( fig. 6A). Like the amounts of correctly assembled endogenous porins and OmpA, the amount of membrane-inserted VDAC was drastically reduced in the bamA(ts) mutant strain ( fig. 6B). In contrast, levels of the periplasmic enzyme alkaline phosphatase (PhoA), the inner–membrane-located enzyme leader peptidase, and the cytoplasmic chaperone SecB in the cell lysates were unaffected ( fig. 6B). Thus, BamA is required for the efficient assembly of VDAC into the bacterial OM.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (EIN) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pich-poor medium (LPich) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPich) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) Pich-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPich or HPich were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pich limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (EIN) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pich-poor medium (LPich) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPich) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) Pich-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPich or HPich were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pich limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.


Mitochondria are double-membrane and rods shaped organelles found in the cells of both animals and plants and are responsible for various metabolic functions within the cells. Mitochondria play a vital role in providing the necessary biological energy for the cell through enzymatic oxidation of the substrates of the Krebs&rsquos cycle. The mitochondrion is made up of the outer membrane, inner membrane, intermembrane space, and matrix.

The outer membrane consists of the same amounts of proteins and phospholipids as well as a large number of porins which are specialized proteins. The outer membrane is permeable to ions, nutrients, and energy molecules such as ADP and ATP (Abdrakhimova et al, 2011). The inner membrane of the mitochondrion is complex and consists of a number of folds known as the cristae which are important since it increases the surface area within the organelle. The increased surface area within the organelle coupled with the presence of various proteins within the inner membrane is crucial in aiding various enzymatic reactions including the production of ATP.

However, unlike the outer membrane, the inner membrane is strictly permeable to ATP, Oxygen, and the movement of metabolites across the membrane (Jones, 2013). The space between the outer and the inner membranes is referred to as the intermembrane space and its composition is similar to that of the cytoplasm. The matrix which is the fourth component of the mitochondrion is made up of a complex mixture of enzymes and proteins which are important in the synthesis of the ribosome, ATP, mitochondrial DNA, and tRNAs (Miles et al, 2014).

Succinate dehydrogenase is one of the enzyme complex bound to the inner membrane of the mitochondrion. Succinate dehydrogenase plays a vital role in Krebs&rsquos cycle since it catalyzes the oxidation of Succinate to fumarate within the inner membrane (Gorbacheva et al, 2013).


How do proteins enter mitochondria?

If the inner membrane is so impermeable, how do proteins enter?

The outer membrane of the mitochondria contains the protein "porin". This forms an aqueous channel through which proteins up to 10,000 daltons can pass and go into the intermembrane space. Indeed, the small molecules actually equilibrate between the outer membrane and the cytosol. However, most proteins cannot get into the matrix unless they pass through the inner membrane. This membrane contains cardiolipin which renders it virtually impermeable. This requires transport mechanisms across the membrane that are more organized and regulated. A very simple view of the process is diagrammed in this cartoon.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

Transport across the mitochondrial membranes requires the concerted action of a number of translocation machineries. The machinery in the outer membrane is called the Tom complex (Translocator Öuter membrane) and that for the inner membrane is called the Tim complex (Translocator ichnner membrane). Proteins that have to go all the way to the matrix have an NH2 cleavable signal sequence (see the above cartoon).

Most proteins must be uncoiled or stretched out to go through the translocators. This involves ATP binding and is monitored and stabilized by a chaperone proteins, including hsp70. Thus, before the protein can go through Tom complex, it must become "translocation competent".

Transport through the outer membrane: characteristics of Tom complex.

Not surprisingly, the TOM complex will include import receptors that initially recognize the signal peptide or a signal sequence (these include Tom20, Tom22, and Tom70). Different proteins use different receptors. In the above cartoon, the receptor is represented as a blue oval in which the signal peptide is inserted. The receptors then bring the protein to the region containing the translocator proteins. This is actually a complex of proteins.
It is called the General Import Pore (GIP) and it facilitates the translocation of the presequence of the protein across the outer membrane. (the GIP is made of Tom40, Tom5, Tom 6, and Tom7). Tom40 appears to be the core element of the pore and forms oligomers. It traverses the membrane as a series of 14 anti-parallel beta strands which form a beta barrel. It also interacts with polypeptide chains passing through the pore. All of the other Tom components in GIP are anchored to the outer membrane by helical transmembrane segments (hydrophobic anchors).

Recent study of Tom40: Rapaport, D and Neupert W, Biogenesis of Tom40, Core Component of the TOM complex of mitochondria. J Cell Biol 146 321-332, 1999. Study looked at how Tom40 entered outer membrane and became a part of the GIP. The study reported that:

  • First, as with many mitochondrial proteins, Tom40 requires cytosolic chaperones to prepare it for entry. In the case of this protein, becoming "translocation competent" requires ATP and a partially folded state (the latter is mediated by the cytosolic chaperone (hsp70).
  • Second, when it is "competent", it interacts with the surface receptor, Tom20. There is no cleavable signal peptide however, the experiments showing the requirement for partial folding suggests targeting information is found in discontinuous sites brought together in the folded domain.
  • Final insertion is into preexisting Tom complexes. This requires an intact N terminus.
  • Dimerization occurs after entry into the membrane.

Characteristics of Tim Complexes

Mitochondrial proteins destined for the matrix often have a cleavable signal peptide on the protein which must be recognized before it will be admitted through the mitochondrial translocator. These proteins with "amino terminal signals" (your text), or "preproteins" or "presequences" (current literature) usually interact with Tom20 first. Then, they have to get through the outer membrane. To do that, they are transferred to the GIP complex: First, they interact with Tom22 and Tom5 which ushers them to the pore formed by Tom40. They then enter the matrix using the pore complex made of Tim23 and Tim17 which are in the inner membrane. Also, very important, their entry is dependent on membrane potential. This is set up by the electron transport complexes. Recall that hydrogen ions are being pumped into the intermembrane space creating a charge gradient that is more negative on the matrix site. This membrane potential actually helps pulls the protein into the Tim23-Tim17 channels. The protein then enters the matrix where the cleavable preprotein is clipped off by a protease, MPP. mt- hsp 70 in the matrix works with Tim44 to complete the full transfer to the matrix. mthsp70 and Tim 44 actually "pull" the protein into the matrix by a process that requires ATP. It also requires the membrane potential set up by the electron transport chain.

Some mitochondrial proteins destined for the inner membrane have a cleavable presequence followed by one or more hydrophobic membrane-spanning segments that function as stop-transfer sequences in the IM or, serve to insert the polypeptide into the IM after it gets in the matrix. These are like the Type I membrane proteins described in the unit on the rough endoplasmic reticulum.

However, other proteins do not have a cleavable targeting signal (Types II and III). Mitochondrial proteins that have an internal signal sequence (examples include a number of proteins in the inner membrane) generally interact with Tom70 as the receptor. Then, after they transit the outer membrane via the GIP complex, they enter the special Tim pathway. This may involve interactions with small Tim's of the intermembrane space and Tim22-Tim54 of the inner membrane itself.

Those proteins that do not have a cleavable targeting signal sequence often have signals with the following characteristics: They are often a stretch of positively charged amino acids (sometimes adjacent to a membrane spanning hydrophobic region). Sometimes these form loops that face the matrix. Recall the "positive inside rule" has positively charged amino acids concentrated at the cytosolic side for proteins being inserted into the rough endoplasmic reticulum. These mitochondrial proteins tend to follow this rule, only the matrix becomes the site where the positive charges are most numerous.

Examples from the literature:

Davis, AJ, Ryan, KR, and Jensen, RE Tim23p contains separate and distinct signals for targeting to mitochondria and insertion in to the inner membrane. Molecular Biology of the Cell 9: 2577-2593 (1999).

  • Tim23 is one of the inner membrane translocator proteins. It does not have an amino-terminal presequence. Targeting information is found within the mature protein.
  • Tim23 has 4 transmembrane segments and two positively charged loops facing the matrix. What is needed for signalling an import?
  • Replaced positively charged amino acids in one or both loops with alanine residues.
  • At least one of these loops is required for insertion into the inner membrane.
  • The signal for targeting to mitochondria is found in at least two of the hydrophobic transmembrane segments.

Kurz, M, Martin, H, Rassow J, Pfanner, N, and Ryan, MT. Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Molecular Biology of the Cell 10: 2461-2474 (1999). Compared the route and binding of three Tim proteins

  • Tim54 carries a amino terminal, noncleaved translocation sequence that is positively charged. However, it prefers to use Tom70 as its receptor instead of Tom20. After moving through the GIP, it uses its positively charged amino terminal sequence to enter the matrix. It required chaperones and ATP to get to the matrix.
  • Tim22 is a hydrophobic protein that uses Tom20 for targeting to the OM. Then it follows the Tim route for carrier proteins, like Tim23. It does not require hsp70 or ATP for entry.
  • Small Tims are normally found in the intermembrane space and are not membrane proteins. They used Tom20 for their receptor and transfer to the GIP complex. However, when Tom20 was destroyed by trypsin, leaving only Tom5, the small Tims were able to enter.

The above cartoon from your text shows more ways that proteins can be inserted into inner and outer membranes, once they are recognized by the receptors. As shown by proteins in the literature examples above, the mitochondria uses both positively charged signals as well as membrane spanning hydrophobic sequences to translocate and then reach their final destination. As in the above examples, there can be multiple signal and insertion sites. However, the distribution of the charged amino acids helps orient the protein so that the positive charges are in the matrix. This is how the cytochromes in the respiratory chain or the elementary particles are inserted by mitochondrial actions.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

The following figure is from another text by Lodish et al, Molecular Cell Biology. It shows the entire sequence of events required to take a protein into the matrix.

  • Step 1: Protein unfolds as it binds to hsp70 chaperone. Red positive area indicates targeting sequence. Chaperone binding is ATP dependent.
  • Step 2: Targeting sequence binds to receptor (usually Tom20)
  • Step 3. Receptor ushers protein to site of translocator. Other Tom proteins involved, but Tom40 is the core of the translocator channel.
  • Step 4: Protein is translocated stimulated by the membrane potential. Electron transport complexes on inner membrane have pumped H+ across to the intermembrane space, leaving the matrix more negative. This attracts the protein (the signal is positively charged). Protein moves through Tim translocators. Tim 44 and hsp70 in the matrix continue to guide and pull the protein through the pore. An ATP requiring process.
  • Step 5. another chaperone (called a chaperonin), hsp60 causes the folding of the the protein into its tertiary sequence. Also an ATP requiring process.
  • Step 6. Presequence is cleaved in the matrix.

What happens if an import protein is defective?

Studies of yeast have helped us learn about the receptor and translocation machinery contains a complex of proteins that work together to allow entry. In yeast, these have been named the MOMX. series, where the number designates the protein number. An important protein in the recognition of the signal peptide and its binding to the receptor is called "MOM19". MOM 19 works with MOM 72 to recognize and bind the proteins. Then MOM22 helps the protein to pass from the receptor binding site to the insertion point at the outer membrane. The importance of MOM19 can be proved by adding antibodies to MOM19 and blocking import.

In a recent paper by Harkness et al (J Cell Biology 124: 637-648, 1995), they created mutant yeast cells that included a defective gene for MOM19.

They also included a drug resistant marker so they could selectively grow cells with the mutant gene (in the presence of the drug, p=fluorophenyl alanine, or fpa). So, the longer the cells grow in the drug, the more drug-resistant mutant cells will be found. The above electron micrographs are from their paper (cited above). They show the result of the absent MOM19 protein. What is absent in the cells grown for 16 or 32 h in the drug?

When they did the assays for the proteins, what proteins were actually missing? Tests showed that there was a dramatic decrease in most of the respiratory chain (electron transport chain) including cytochromes a/a3, and b. However, cytochrome C was unaffected. This suggests that another protein must control its import.


Differentialzentrifugation

Differential centrifugation is the most common method of fractionating cell. Fractionation is separation of different organelles within a cell. It is a classical procedure used to isolate different particles by stepwise successive centrifugations at increasing RCF's (Relative Centrifugal Forces).
Centrifugation separates particles in a suspension based on differences in size, shape and density that together define their sedimentation coefficient. The tube containing the suspension of particles is rotated at a high speed, which exerts a centrifugal force directed from the center of the rotor towards the bottom of the tube. Centrifugal Force 'G' is more commonly expressed as the Relative Centrifugal Force (RCF) or g value in multiples of the earth's gravitational field 'g'.

Relative centrifugal force or g value is calculated using the following formula:

RCF =Relative Centrifugal Force,
r = radius in centimeter,
Q = revolutions per minute.

Thus depending on the radius of centrifuge being used the Q value will vary for different centrifuge to obtain the same g value. When doing differential centrifugation, density of the liquid in which the centrifugation is carried out should be uniform and its density must be far lower than that of the particles to be separated. The viscosity of the particles should also be very low. As a consequence, the rate of particle sedimentation depends on its size and the applied g force. Differential centrifugation gives a crude resolution of sub cellular fraction. This centrifugation is usually carried out using fixed angle rotor.


Mitochondria: Structure and Functions

Mitochondrien are known as the powerhouses der Zelle. Sie sind Organellen that act like a digestive system that takes in nutrients, breaks them down, and creates energy-rich molecules for the cell. The biochemical processes of the cell are known as Zellatmung. Many of the reactions involved in cellular respiration happen in the mitochondria. They are the working organelles that keep the cell full of energy.

There are small organelles floating free throughout the cell. Some cells have several thousand mitochondria while others have none. Muscle cells need a lot of energy so they have loads of mitochondria. Neurons (cells that transmit nerve impulses) don’t need as many. If a cell feels it is not getting enough energy to survive, more mitochondria can be created. Sometimes it can grow larger or combine with other mitochondria. It all depends on the needs of the cell.


Metabolons and Supramolecular Enzyme Assemblies

Kendrick B. Turner , . Scott A. Walper , in Methods in Enzymology , 2019

2.2.1.2 Cultivation conditions

Cultivation conditions as described in Section 2.1.1.2 can be followed until the induction of expression (steps 1–4). The subsequent protocols are based on the protein–protein packaging strategy described by Alves et al. that employs a SpyTagged-porin protein (OmpA-ST) and a SpyCatcher-labeled phosphotriesterase enzyme (PTE-SC) ( Alves et al., 2018 Alves, Turner, Medintz, et al., 2016 Zakeri et al., 2012 ). The methods below are based on a two vector expression system in which the anchor protein (OmpA-ST) is under the control of an arabinose-inducible promoter, and the enzyme (PTE-SC) is regulated using a T7 promoter. Expression of the T7 polymerase is itself regulated by a lactose-inducible promoter.

After the culture reaches an OD600 = 0.8 add l -arabinose (0.02%–1% final concentration v/v) to induce expression of the PTE-SC construct under the control of the arabinose inducible promoter.

Incubate an additional 2 h at 37°C.

Induce expression of the OmpA-ST anchor by adding the lactose analog Isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.5 mm.


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