Information

Warum sammeln Mücken kein Blut, nachdem die Blutplättchen aktiviert wurden?

Warum sammeln Mücken kein Blut, nachdem die Blutplättchen aktiviert wurden?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Das mag anekdotisch sein…

Der indische Subkontinent befindet sich im regnerischen Teil des Sommers. Daraus folgt, dass die Mückenpopulation steigt.

Als ich mir also die Handfläche aufschlitzte, erwartete ich, dass sich die Mücken dort mit großer Wucht sammeln würden. Doch während sie weiterhin an den Unterarmen, im Gesicht und anderswo ihren Geschäften nachgingen, hatte das Blut, das aus meiner Handfläche floss, keine Anziehungskraft auf sie. Dies sogar, nachdem ich absichtlich fast eine Minute lang stillgestanden habe! Vielleicht waren der Gerinnungsprozess/Blutplättchen/usw. ein Abwehrmittel.

Warum sammeln Mücken kein Blut, nachdem die Blutplättchen aktiviert wurden?


Blut aus einem Schnitt oder einer Wunde ist mit Bakterien aus der Umgebung verunreinigt. Aus evolutionärer Sicht wäre das für eine Mücke wie vom Boden zu fressen. Das Blut, das durch Ihre Adern fließt, ist aufgrund Ihres Immunsystems sauberer und so hat die Evolution einen Weg gewählt, der auf dem Einführen in die Haut basiert, um die Mahlzeit zu erhalten.


Thrombozyten setzen pathogenes Serotonin frei und kehren nach einer durch Immunkomplexe vermittelten Sequestrierung in den Kreislauf zurück

Immunkomplexe (ICs) bilden sich, wenn Antikörper auf ihre Antigene treffen. ICs sind im Blut bei mehreren pathologischen Zuständen vorhanden. Angesichts der Fülle von Blutplättchen im Blut und der Tatsache, dass sie einen Rezeptor für ICs exprimieren, den sogenannten Fcγ-Rezeptor IIA (FcγRIIA), haben wir den Einfluss von ICs im Blut in einem Mausmodell untersucht. Wir fanden heraus, dass zirkulierende ICs einen systemischen Schock induzierten, der durch Bewusstseinsverlust gekennzeichnet war, indem sie die Thrombozyten FcγRIIA aktivierten. Der Schock wurde durch die Freisetzung von Serotonin, einem Molekül, das besser für seine Rolle im Gehirn bekannt ist, aus Blutplättchengranulat vermittelt. Während des Schocks wurden Blutplättchen in Lunge und Gehirn sequestriert und nach ihrer Degranulation in den Blutkreislauf zurückgeführt. Blutplättchen sind daher als Reaktion auf ICs entscheidend.


Einführung

Der kürzlich veröffentlichte “International Consensus on (ICON) Anaphylaxis” beschrieb Anaphylaxie als 𠇊 schwere, generalisierte oder systemische, allergische oder Überempfindlichkeitsreaktion, die lebensbedrohlich oder tödlich sein kann”. 1 Diese Definition ist absichtlich “generisch”, da sie keine der spezifischen Immunelemente erwähnt, die an bestimmten Fällen der Erkrankung beteiligt sein könnten, da diese je nach individuellen Umständen variieren können. In diesem Review beschreiben wir die wichtigsten Immunelemente, wie Antikörperisotypen, Effektorzellen und biologische Mediatoren, die zur Entwicklung und pathophysiologischen Manifestationen der Anaphylaxie beitragen können. Wir werden insbesondere das Ausmaß der Beweise beachten, die diese Immunkomponenten mit der Anaphylaxie beim Menschen im Vergleich zu der in Mausmodellen der Erkrankung induziert haben, wobei wir uns insbesondere auf Formen der Anaphylaxie konzentrieren, die durch die Reaktionen von Allergenen mit antigenspezifischen Antikörpern induziert werden. Wir werden Formen der Anaphylaxie, die durch die antikörperunabhängige Aktivierung von Effektorzellen wie Mastzellen und Basophilen induziert werden, nicht ausführlich besprechen, Themen, die an anderer Stelle behandelt wurden. 2, 3


Transfusionsbedingte Nebenwirkungen

Akute hämolytische Transfusionsreaktionen

Akute hämolytische Transfusionsreaktionen (AHTRs) treten bei 1:76 000 Erythrozytentransfusionen auf (Eder und Chambers, 2007). Tödliche AHTRs treten bei 1:1 800 000 Transfusionen auf (Vamvakas und Blajchman, 2009). Typische AHTRs sind hämolytische Reaktionen, die innerhalb von 24 h nach der Transfusion auftreten und zu einer intravaskulären (selten extravaskulären) Hämolyse als Folge einer ABO-Inkompatibilität führen, aber auch aus anderen Blutgruppeninkompatibilitäten resultieren können. Im Gegensatz dazu führen DHTRs typischerweise zu einer extravaskulären Hämolyse.

Die intravaskuläre Hämolyse wird durch die Interaktion des RBC-Antigens mit vorgebildeten Antikörpern verursacht. Meist sind dies ABO (IgM)-Antikörper, aber auch ausreichende Konzentrationen an vorgebildetem IgG können eine Rolle spielen. Andere Blutgruppeninkompatibilitäten können zu AHTR führen, wie zum Beispiel Antikörper gegen Kidd- oder Duffy-Blutgruppensystem-Antigene. Schließlich kann einem Patienten inkompatibles Plasma transfundiert werden und zu einer AHTR führen. Am häufigsten tritt dies als Folge einer ABO-inkompatiblen Thrombozytentransfusion auf. Der Hämolysegrad hängt von der Menge und Stärke (Titer) des ABO-Antikörpers ab.

Nach der anfänglichen Antigen-Antikörper-Interaktion erfolgt eine Komplementaktivierung, die zur Bildung des Membranangriffskomplexes und schließlich zur Zerstörung der Erythrozyten mit Freisetzung ihrer Bestandteile in den Blutkreislauf führt. Hämoglobin wird zunächst von Haptoglobin gebunden und metabolisiert. Wenn die Haptoglobin-Speicher erschöpft sind, können das Hämoglobin und andere Bestandteile, wie z. Darüber hinaus können die Erythrozyten-Bestandteile die Gerinnungskaskade aktivieren und zu systemischer Vasokonstriktion und Schock führen ( Bellone und Hillyer, 2013 ).

AHTRs sind gekennzeichnet durch Fieber, Rücken- oder Flankenschmerzen, Brustschmerzen, Hypotonie, Schock und „drohendes Untergangsgefühl“ des Patienten. Diese Befunde treten häufig kurz nach Beginn der Transfusion auf. Die Transfusion sollte sofort abgebrochen werden. Die Behandlung umfasst eine starke Flüssigkeitszufuhr, Furosemid (um die Urinausscheidung aufrechtzuerhalten) sowie Blutdruckunterstützung, disseminierte intravaskuläre Gerinnung und andere klinische Folgeerscheinungen (Ludens et al., 1968).

Es sollte schnell eine Transfusionsreaktionsabklärung eingeleitet werden, um die Ursache der Reaktion zu identifizieren. Blutbanktests können Hämolyse, Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger und positives DAT aufdecken. Andere Laboranalysen, die hilfreich sein können, umfassen das Testen von Bilirubin- und LDH-Spiegeln sowie eine Urinanalyse (um freies Hämoglobin im Urin zu identifizieren).

Menschliches Versagen ist aufgrund der ABO-Inkompatibilität die häufigste Ursache für AHTRs. Der Fehler kann an vielen Stellen gemacht werden: bei der ersten Blutentnahme, der Ausgabe des Blutprodukts und der Transfusion des Produkts an den falschen Patienten. Wenn ein AHTR auftritt, ist eine Ursachenanalyse zwingend erforderlich (und von der Gemeinsamen Kommission beauftragt), um Korrekturmaßnahmen einzuleiten und solche Vorfälle in Zukunft zu verhindern ( Bellone und Hillyer, 2013 ). Bemühungen, die menschliche Fehlerkomponente weiter zu verringern, umfassen einen computergestützten Abgleich von Patientenarmband-Barcodes mit Blutprodukt-Barcodes. Prävention verlangt die Eliminierung der Möglichkeit menschlicher Fehler. Im Gegensatz dazu treten ABO-inkompatible Thrombozytentransfusionen aufgrund geringer Thrombozytenvorräte und kurzer Haltbarkeit von Thrombozyten nicht selten auf. AHTRs als Folge von Thrombozytentransfusionen werden durch die Transfusion von Thrombozyten mit niedrigem Titer oder ABO-kompatiblen Thrombozyten gemildert.


Diskussion

Das Vorliegen einer ADA-Aktivität im Speichel bei hämatophagen Insekten ist rätselhaft, da Adenosin eine gefäßerweiternde und thrombozytenaggregationshemmende Substanz ist (Collis, 1989 Dionisotti et al., 1992 Chinellato et al., 1994), von der erwartet werden könnte, dass sie die Blutverfügbarkeit am Fütterungsstelle. Adenosin kann jedoch an der peripheren Schmerzwahrnehmung beteiligt sein (Burnstock und Wood, 1996, Poon und Sawynok, 1999, Charlab et al., 2000), obwohl seine Rolle bei der Nozizeption widersprüchlich ist: Während Adenosin A2- und A3-Rezeptoren eindeutig nozizeptiv zu sein scheinen, Die Stimulation des A1-Rezeptors scheint antinozizeptiv zu sein (Poon und Sawynok, 1998, Poon und Sawynok, 1999). Eine weitere Wirkung von ADA im Speichel kann mit einer lokalen Ansammlung von Inosin an der Nahrungsstelle zusammenhängen. Es wurde gezeigt, dass Inosin ein potenter Inhibitor der Produktion der inflammatorischen Zytokine TNF-α, I 1 -1, I 1 -12, Makrophagen-inflammatorisches Protein-1α und IFN-γ ist (Hasko et al., 2000). Insbesondere I l -1 ist ein potentes peripheres nozizeptives Mittel (Bianchi et al., 1998). Es ist jedoch zweifelhaft, ob diese Zytokine vom Wirt produziert und während der wenigen Minuten, die die Mücken zum Fressen brauchen, freigesetzt werden können, obwohl sie das Schicksal der Immunantwort des Wirts auf Speichelallergene und Krankheitserreger, die zusammen mit den Mücken injiziert werden, beeinflussen können Speichel der Mücke. Während die Rolle von Adenosin bei der Nozizeption unklar ist, ist bekannt, dass Adenosin die Degranulation von Mastzellen induziert (Tilley et al., 2000), was zur Freisetzung von Histamin führt. Aus der Sicht der Mücke hätte der durch Histamin induzierte Juckreiz den unerwünschten Effekt, den Wirt auf seine Anwesenheit aufmerksam zu machen. Obwohl klar ist, dass Adenosin für hämatophage Insekten von Vorteil sein könnte, bis zu dem Punkt, dass Phlebotomin-Sandfliegen große Mengen der Substanz in ihren Speicheldrüsen produzieren (Ribeiro et al., 1999 Ribeiro und Modi, 2001), ist die Anwesenheit von ADA in der Speichel anderer hämatophager Insekten weist darauf hin, dass Adenosin, wenn es eine evolutionäre Bedeutung hat, an der Nahrungsstelle möglicherweise keine wünschenswerte Substanz ist.

Entsprechend der ambivalenten Rolle von Adenosin bei der Blutfütterung weisen die in dieser Arbeit präsentierten Daten darauf hin, dass das Vorkommen von ADA im Speichel bei Mücken kein konsistenter Befund ist, im Gegensatz zum ubiquitären Vorkommen diverser Antikoagulanzien oder des Enzyms Apyrase (Ribeiro, 1995). Es wurde keine ADA-Aktivität gefunden in Anopheles gambiae, aber in beiden wurden relativ hohe Aktivitäten gefunden Culex quinquefasciatus und Aedes aegypti. Die spezifische Aktivität von 16munitsdrüsenpaaren −1 für Aedes aegypti repräsentiert eine spezifische Aktivität von 5 Einheiten mg −1 Speichelprotein, während der Wert von 2,6 Einheiten Drüsenpaar −1 für C. quinquefasciatus repräsentiert 2,5 Einheiten mg –1 Speichelprotein. Diese Menge ist größer als die spezifische Aktivität von Erythrozyten-ADA (0,2 Einheiten mg –1 Protein Agarwal et al., 1975) und ähnelt der in Geweben, die auf die Verdauung spezialisiert sind, wie z Schleimhaut (1–5 Einheiten mg –1 Protein) (Sigma Chemical Catalog, Ausgabe 2000–2001). Im Falle des Aedes aegypti, Speichel-ADA scheint während einer Blutmahlzeit sezerniert zu werden, was durch die signifikante Abnahme der Speicheldrüsenspiegel nach einer Blutmahlzeit, sein Vorkommen in Lösungen, die von hungrigen weiblichen Mücken untersucht wurden, und sein Vorkommen in Serotonin-induziertem Speichel gezeigt wird. In C. quinquefasciatus, konnte keine Aktivität in Serotonin-induziertem Speichel nachgewiesen werden, obwohl sehr niedrige Konzentrationen des Enzyms (weniger als 0,03 % des Inhalts eines Drüsenpaares pro sondierender Mücke) in von dieser Spezies untersuchten Futtermitteln verblieben waren. In wurde keine signifikante Abnahme der Enzymspiegel festgestellt C. quinquefasciatus Speicheldrüsen nach einer Blutmahlzeit. Dies deutet darauf hin, dass ADA eine weitgehend endogene Funktion in den Speicheldrüsen von C. quinquefasciatus.

Über das evolutionäre Szenario, das zum Vorhandensein oder Fehlen von ADA im Speichel hämatophager Arthropoden geführt hat, können wir nur spekulieren, aber wir können davon ausgehen, dass Adenosin sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die Bluternährung hat. Die positiven Effekte könnten auf seine Wirkungen auf die Thrombozytenaggregation und Vasodilatation zurückzuführen sein. Vielleicht fliegt deshalb der Sand Phlebotomus papatasi und P. argentipes haben reichlich Adenosin in ihren Speicheldrüsen (Ribeiro et al., 1999 Ribeiro und Modi, 2001). Es ist möglich, dass diese Phlebotomin-Wirte weniger empfindlich auf die negativen Auswirkungen von Adenosin reagieren, dass sie sich ernähren, wenn sich ihre Wirte in tiefem Schlaf befinden und auf relativ kleine Störungen nicht reagieren, oder dass Sandfliegen andere Mechanismen haben, um den negativen Auswirkungen von Adenosin auf die Nahrungsaufnahme entgegenzuwirken. Allerdings beide Aedes aegypti und C. quinquefasciatus haben eigene gefäßerweiternde Moleküle im Speichel: das Peptid Sialokinin in Aedes aegypti (Champagner und Ribeiro, 1994) und eine unbekannte Substanz in C. quinquefasciatus (Ribeiro, 2000). Zusätzlich, Aedes aegypti hat große Mengen an Speichelapyrase, die die Thrombozytenaggregation hemmt (Ribeiro et al., 1984b), während C. quinquefasciatus hat eine potente Speichel-Phospholipase C, die den Thrombozytenaktivierungsfaktor zerstört (J. M. C. Ribeiro und I. Francischetti, in Vorbereitung). Andere Moleküle können daher die positiven Funktionen von Adenosin an der Nahrungsstelle ersetzen, und uns bleiben nur seine negativen Auswirkungen.

Wenn wir annehmen, dass die negative Rolle von Adenosin mit seiner Fähigkeit zusammenhängt, die Aufmerksamkeit des Wirts auf die Nahrungsstelle zu lenken, dann würde die Intensität dieses negativen Effekts durch zwei Variablen beeinflusst: das Ausmaß, in dem Adenosin Schmerzen oder Juckreiz auslöst die Nahrungsstelle und die Verhaltensreaktion des Wirts auf Schmerzen und Juckreiz. Die erste Variable kann von Art zu Art variieren, z.B. die Dichte der Mastzellen in der Haut des Wirts, der zur Nahrungsaufnahme durch die Mücke ausgewählt wurde, die Anzahl und Affinität von Adenosinrezeptoren, die die Zelldegranulation induzieren, oder die Dichte der nozizeptiven Adenosinrezeptoren in der Haut. Die zweite Variable hängt beispielsweise davon ab, ob das Wirbeltier schläft oder aufmerksam ist und wie es unter diesen beiden Bedingungen auf denselben Reiz reagiert. Abhängig von diesen Variablen kann es von mehr oder weniger selektivem Vorteil sein, die negative Wirkung von Adenosin auf die Blutfütterung zu neutralisieren, und mehr als eine Strategie kann verwendet werden, um ihren Wirkungen entgegenzuwirken. Somit könnte Adenosin zerstört werden über ADA oder deren Wirkungen reduziert durch den Einsatz von physiologischen Inhibitoren, z.B. Moleküle, die gegenläufig auf die Zielzelle wirken, wie beispielsweise Mastzelldegranulationshemmer oder Anästhetika.

Es ist interessant zu bemerken, dass Aedes aegypti ist ein tagaktiver Fresser und seine Hauptwirte sind Menschen. Speichelhomogenisate aus Aedes aegypti haben die Fähigkeit, die Freisetzung von Tumornekrosefaktor (TNF) durch Mastzellen zu verhindern (Bissonette et al., 1993), was darauf hinweist, dass dieses Insekt möglicherweise unter Druck steht, um eine Degranulation der Mastzellen des Wirts zu vermeiden. Im Gegensatz, C. quinquefasciatus ist ein nachtaktiver Fresser für den Menschen und kann die negativen Verhaltenseffekte von Adenosin vermeiden, indem er füttert, wenn der physiologische Zustand des Wirts weniger oder weniger auf einen Anstieg des Adenosinspiegels an der Fütterungsstelle anspricht. Alternative, C. quinquefasciatus können zusätzliche Speichelkomponenten aufweisen, die die nozizeptiven und/oder mastzelldegranulierenden Wirkungen von Adenosin antagonisieren. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass sowohl Triatomin-Wanzen (Ribeiro und Walker, 1994) als auch Zecken (Paesen et al., 1999) Speichelproteine ​​haben, die Histamin neutralisieren, und vor kurzem wurde über eine Anästhesiesubstanz aus dem Speichel von a . berichtet Triatomin-Bug (Dan et al., 1999). Das Vorhandensein von ADA in Aedes aegypti kann eine von mehreren Möglichkeiten darstellen, den negativen Wirkungen von Adenosin entgegenzuwirken. Während diese Überlegungen helfen können, zu erklären, warum Aedes aegypti von der Sekretion von ADA profitieren könnten, haben wir keine Ahnung von der Rolle von ADA im Speichel C. quinquefasciatus, obwohl wir spekulieren können, dass es an einigen endogenen Funktionen beteiligt sein könnte, wie z. Solche Spekulationen legen die Hypothese nahe, dass antinozizeptive und antimastzellige Speichelsubstanzen reichlich in den Speicheldrüsen von hämatophagen Arthropoden gefunden werden sollten.

Aus biochemischer Sicht ist interessant, dass die Speichel-AMP-Deaminase-Aktivität von C. quinquefasciatus ist ungefähr dreimal so groß wie die von ADA, während in Aedes aegypti es ist ein Zehntel der ADA-Aktivität. AMP-Deaminase und ADA sind Enzyme, die wahrscheinlich durch Genduplikationen entstanden sind (Becerra und Lazcano, 1998). Unter der Annahme, dass die beiden Aktivitäten in einem einzigen Enzym in den Speicheldrüsen von Mücken liegen, könnte das Klonen und die Expression dieser beiden Enzyme, eines von jeder Mückenart, auf die Aminosäurereste hinweisen, die eine größere Spezifität entweder gegenüber AMP oder Adenosin verleihen. Alternativ kann jede Mückenart die beiden Enzyme (ADA und AMP-Deaminase) in ihren Drüsen in unterschiedlichen Verhältnissen exprimieren.

Die in diesem Artikel diskutierte cDNA kann für den Großteil der Enzymaktivität verantwortlich sein, die in C. quinquefasciatus Speicheldrüsen. Die hier berichtete Arbeit bestätigt, dass die Sequenzierung von cDNA-Bibliotheken aus Speicheldrüsen hämatophager Insekten Informationen liefern kann, die zum Nachweis vieler zuvor nicht identifizierter Speichelenzyme führen, wie Amylasen, Hyaluronidasen, ADA und 5'-Nukleotidasen (Charlab et al., 1999 Charlab et al., 2000). Gepaart mit geeigneten biochemischen und pharmakologischen Assays verleiht dieser Ansatz unserem Verständnis der Entwicklung von Insekten zu einer der erfolgreichsten und vielfältigsten Artengruppen im Tierreich Impulse.


STEMI: Management

P2Y12 Inhibitoren

Das P2Y12 Inhibitoren sind nützlich, um die Blutplättchenaktivierung und -aggregation weiter zu hemmen. Die Wahl des P2Y12 Rezeptorblocker (Clopidogrel, Prasugrel, und Ticagrelor) hängt von der Reperfusionsstrategie ab.

Clopidogrel ( Tabelle 2 ) ist ein Thienopyridin der zweiten Generation, das das P2Y .-Plättchen irreversibel antagonisiert12 ADP-Rezeptor. Zu Aspirin hinzugefügtes Clopidogrel reduziert das Sterberisiko und andere kardiovaskuläre Ereignisse bei denen, die mit Fibrinolyse behandelt werden (Steg et al., 2012 Chen et al., 2005a Sabatin et al., 2005). Im Rahmen der primären PCI bevorzugen die aktuellen Leitlinien jedoch Ticagrelor oder Prasugrel, da sie sich in großen Endpunktstudien in Bezug auf das Sterberisiko und andere schwerwiegende kardiovaskuläre Ereignisse bei der Nachbeobachtung nach 1 Jahr als überlegen erwiesen haben ( Wiviott et al., 2007 Wallentin et al., 2009 O'Gara et al., 2013 Steg et al., 2012).

Prasugrel ( Tabelle 2 ) ist ein Thienopyridin P2Y . der dritten Generation12 Inhibitor, der schneller und vollständiger als Clopidogrel in seine aktive Form metabolisiert wird und daher eine stärkere und konsistentere Wirkung hat ( Gurbel et al., 2012 ). Die TRITON-Studie verglich die Anwendung von Prasugrel mit Clopidogrel bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, die Aspirin erhielten. Die Studie zeigte, dass die Anwendung von Prasugrel mit einer Verringerung des Risikos für kardiovaskulären Tod, nicht-tödlichen Myokardinfarkt und nicht-tödlichen Schlaganfall verbunden war, aber mit einem erhöhten Risiko schwerer Blutungen (Wiviott et al., 2007). Daher ist Prasugrel bei Patienten mit vorangegangenem Schlaganfall/vorübergehender ischämischer Attacke oder aktiver pathologischer Blutung kontraindiziert. Ein geringeres Körpergewicht (< 60 kg) und ein Alter ≥ 75 Jahre sind relative Kontraindikationen ( Steg et al., 2012 ).

Ticagrelor ( Tabelle 2 ) ist ein neues P2Y12 Rezeptorblocker. Im Gegensatz zu Clopidogrel oder Prasugrel ist Ticagrelor kein Thienopyridin. Es ist ein direkt wirkendes Mittel mit reversibler Wirkung, das keine Biotransformation erfordert und reversibel an das P2Y . bindet12 Rezeptoren, antagonisieren den ADP-Signalweg und die Thrombozytenaktivierung. Die PLATO-Studie verglich Ticagrelor mit Clopidogrel bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, die mit Aspirin und anderen Standardtherapien behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass Ticagrelor die Kombination aus kardiovaskulärem Tod, Myokardinfarkt oder Schlaganfall nach 12 Monaten reduziert, ohne dass die Rate schwerer Blutungen insgesamt zunimmt, aber mit einer Erhöhung der Rate nicht verfahrensbedingter Blutungen (Wallentin et al. , 2009).


Schlussfolgerungen

Obwohl die weitere Untersuchung bezüglich der Erregerinfektion bei den flugunfähigen Stechmücken noch zu klären ist, ist die Mückenaufzuchtmethode für Aedes Die hier vorgestellten Arten waren extrem sicher, und das Protokoll war kostengünstig und weniger arbeitsintensiv, was es ermöglichte, intensive Studien mit Moskitos durchzuführen, die für den Menschen gefährliche Krankheitserreger tragen, selbst in Bezirken, in denen hochsichere Eindämmungssysteme obligatorisch sind. Dieses Protokoll könnte auch anwendbar sein auf Anopheles und Culex Mücken, die Hauptvektoren für andere verheerende Krankheiten wie Malaria, West-Nil-Fieber und Japanische Enzephalitis sind.


Plättchenreiches Plasma: Die Wahl der Aktivierungsmethode beeinflusst die Freisetzung bioaktiver Moleküle

Platelet-Rich Plasma (PRP) ist ein kostengünstiges Verfahren zur Abgabe hoher Konzentrationen an autologen Wachstumsfaktoren (GFs). Die Thrombozytenaktivierung ist ein entscheidender Schritt, der die Verfügbarkeit bioaktiver Moleküle und damit die Gewebeheilung beeinflussen könnte. Die Aktivierung von PRP bei zehn freiwilligen gesunden Männern erfolgte durch Zugabe von 10 % CaCl2, 10 % autologes Thrombin, 10 % einer Mischung von CaCl2 + Thrombin und 10 % Kollagen Typ I. Blutderivate wurden 15 und 30 Minuten sowie 1, 2 und 24 Stunden inkubiert und die Proben wurden auf die Freisetzung von VEGF, TGF- untersucht.β1, PDGF-AB, IL-1β, und TNF-α. PRP aktiviert mit CaCl2, Thrombin und CaCl2/Thrombin-gebildete Gerinnsel wurden bei der 15-minütigen Auswertung nachgewiesen, wohingegen in Kollagen-Typ-I-aktivierten Proben keine Gerinnselbildung festgestellt wurde. Kollagen Typ I erzeugte eine insgesamt niedrigere GF-Freisetzung. Thrombin, CaCl2/Thrombin und Kollagen Typ I aktivierte PRPs zeigten eine sofortige Freisetzung von PDGF und TGF-

die über die Zeit stabil blieb, während VEGF einen steigenden Trend von 15 Minuten bis zu 24 Stunden zeigte. CaCl2 induzierte eine progressive Freisetzung von GFs von 15 Minuten und bis zu 24 Stunden ansteigend. Das gewählte Verfahren zur Aktivierung von PRP beeinflusst sowohl seine physikalische Form als auch das Freisetzungsprodukt in Bezug auf die GF-Menge und die Freisetzungskinetik.

1. Einleitung

Die Gewebereparatur bei Muskel-Skelett-Verletzungen ist oft ein langsamer und manchmal unvollständiger Prozess, bei dem der Patient unter Schmerzen und eingeschränkter Funktionsfähigkeit leidet und daher mit hohen Kosten für die Gesellschaft verbunden ist, sowohl in Bezug auf Gelder für die Gesundheitsversorgung als auch für den Verlust von Arbeit. Daher wurden viele Anstrengungen unternommen, um neue Ansätze zu untersuchen, um das regenerative Potenzial zu erhöhen und die Gewebeheilung zu begünstigen. Da mehrere Studien die Rolle von Wachstumsfaktoren (GFs) bei der Regulierung der normalen Gewebestruktur und der Reaktion auf Gewebeschäden unterstrichen haben, wird ihr Einsatz in der klinischen Praxis als nützlich erachtet, um eine schnelle Heilung mit hochwertigem Gewebe zu fördern und eine frühzeitige und sichere Rückkehr zu uneingeschränkter Aktivität [1].

Blutplättchen bilden ein Reservoir an kritischen GFs und Zytokinen, die den Gewebeheilungsprozess steuern und regulieren können. Die bioaktiven Moleküle, die von Thrombozyten sezerniert werden α-Granula sind an mehreren zellulären Aktivitäten wie Stammzelltransport, Proliferation und Differenzierung beteiligt, mit einer komplexen Wirkung auf pro/anti-inflammatorische und anabole/katabole Prozesse [2]. Darüber hinaus haben Thrombozyten im Hinblick auf gereinigte individuelle GF den theoretischen Vorteil, dass sie verschiedene bioaktive Moleküle mit einem natürlichen Gleichgewicht von anabolen und katabolen Funktionen enthalten, wodurch möglicherweise die Gewebeumgebung optimiert und der Heilungsprozess begünstigt wird [2]. Basierend auf diesem Grundprinzip ist Platelet-Rich Plasma (PRP) ein einfaches, kostengünstiges und minimal-invasives Verfahren, um hohe Konzentrationen von autologen GFs und Zytokinen in physiologischen Verhältnissen in verletztes Gewebe einzubringen. Dieses aus Blut gewonnene Produkt, das entweder chirurgisch oder durch Injektionen direkt in das geschädigte Gewebe eingebracht wird, wurde in verschiedenen Bereichen der Medizin ausgiebig erprobt [3-10].

Trotz der zahlreichen Vorteile, die PRP zugeschrieben werden, und der vielversprechenden Ergebnisse, die für sein therapeutisches Potenzial berichtet wurden, sind die klinischen Ergebnisse jedoch heterogen und manchmal widersprüchlich. Diese kontroversen Ergebnisse sind sowohl auf die unterschiedlichen angewandten klinischen Protokolle zurückzuführen, die es schwierig machen, Ergebnisse zu vergleichen und Schlussfolgerungen über die tatsächliche Wirksamkeit zu ziehen, als auch auf die fehlende Standardisierung der PRP-Herstellungsverfahren. Dies hat zur Verfügbarkeit einer Vielzahl von Produkten geführt, die sich in Bezug auf Zelltyp und Menge und damit GF- und Zytokingehalt und Freisetzungszeiten unterscheiden. Unter den verschiedenen Variablen, die die PRP-Freisetzung beeinflussen, ist die Thrombozytenaktivierung ein entscheidender Schritt, der die Verfügbarkeit bioaktiver Moleküle und damit die Gewebeheilung beeinflussen könnte [10, 11].

Der Begriff „Aktivierung“ bezieht sich auf 2 Schlüsselprozesse, die während der PRP-Herstellung eingeleitet werden: (1) Degranulation von Blutplättchen zur Freisetzung von GFs aus α-Granula und (2) Fibrinogenspaltung, um die Matrixbildung zu initiieren, einen Gerinnungsprozess, der die Bildung eines Blutplättchengels ermöglicht und daher die Sekretion von Molekülen auf die gewählte Stelle beschränkt [12]. Ein Aktivierungsschritt vor der PRP-Verabreichung ist in vielen der verwendeten Protokolle enthalten, üblicherweise durch Zugabe von Thrombin und/oder Calciumchlorid (CaCl2), aber einige Ärzte ziehen es vor, PRP in seiner Ruheform zu injizieren, wobei sie sich auf die spontane Thrombozytenaktivierung verlassen, die nach Exposition gegenüber dem im Bindegewebe vorhandenen nativen Kollagen auftritt [13]. Derzeit gibt es keine Evidenz für die am besten geeignete Methode zur PRP-Aktivierung, und die Wahl der Aktivierungsstrategie basiert hauptsächlich auf praktischen Gründen und wird nicht durch Studien zu den Auswirkungen der verschiedenen Verfahren auf die endgültige Thrombozytenfreisetzung gestützt. Die Definition der Unterschiede zwischen den Aktivierungsmethoden könnte eine Optimierung der PRP-Präparate ermöglichen, indem die am besten geeignete Strategie für jede spezifische Pathologie identifiziert wird, um ein maßgeschneidertes PRP für die verschiedenen klinischen Indikationen zu erhalten.

Das Ziel der vorliegenden Studie ist es daher, verschiedene Strategien zur Aktivierung von PRP zu vergleichen, indem der Gehalt an GFs und Zytokinen sowie deren Freisetzungskinetik bewertet werden.

2. Materialien und Methoden

Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission und dem Institutional Review Board genehmigt, und jeder Spender unterzeichnete eine schriftliche Einverständniserklärung. PRP, Platelet-Poor Plasma (PPP) und autologes Thrombin wurden von zehn freiwilligen gesunden Männern (mittleres Alter ± SD:

Jahre), die sich einer Blutentnahme von 150 ml unterzogen. Die Probanden zeigten in den 5 Tagen vor der Blutspende keine systemischen Störungen, Rauchergewohnheiten, Infektionen, nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, Hämoglobin unter 11 g/dl oder Blutplättchen unter 150 × 10 3 /μL. Jeder Probe wurde eine Codenummer zugewiesen, um die Anonymität des Probanden zu gewährleisten.

2.1. Herstellung und Aktivierung von Blutderivaten

PRP, PPP und autologes Thrombin wurden mit einem Vollblutseparator (Angel, Cytomedix Inc., Gaithersburg, MD) hergestellt. Für die PRP-Präparation wurden von jedem Spender 150 ml venöses Blut entnommen und in eine Angel-Zentrifugenkammer überführt und 25 min bei zwei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert: bei 3500 U/min für die ersten 3 Minuten und bei 3000 U/min für die restliche Zeit. Dann wurde PRP aus dem Buffy-Coat in eine leere sterile Spritze extrahiert. PPP wurde aus einem anderen Beutel gesammelt und in eine neue Spritze überführt. Autologes Thrombin wurde ausgehend von PPP gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.

2.2. Thrombozytenkonzentration und Anzahl der weißen Blutkörperchen

Die Blutplättchenkonzentration und die Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) von PRP, PPP und peripherem Blut (PB) wurden mit einem automatischen Blutzellzähler (COULTER LH 750 Hematology Analyzer Beckman Coulter SRL, Mailand, Italien) analysiert. Linearität war 5–1000 × 10 3 /μL für Thrombozytenzahl und 0,1–100 × 10 3 /μL für die Anzahl der weißen Blutkörperchen.

2.3. PRP-Aktivierung

Die Aktivierung von PRP erfolgte durch Zugabe von 10 % CaCl2 (Endkonzentration 22,8 mM), 10 % autologes Thrombin, 10 % einer Mischung aus CaCl2 + Thrombin und 10% Kollagen Typ I (Endkonzentration 4 μg) (Mascia Brunelli SpA, Mailand). Als Kontrolle dienten PRP ohne Aktivierung und PPP. Blutderivate wurden 15 und 30 Minuten und 1, 2 und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Proben bei 2800 × g für 15 Minuten bei 20 °C zentrifugiert, und die Überstände wurden gesammelt und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

2.4. Bewertung des Wachstumsfaktors

PRP und PPP wurden auf die Freisetzung von VEGF, TGF-β1, PDGF-AB, IL-1β, und TNF-α (R&D-Systeme, Minneapolis, MN). Die Proben wurden bei 4 °C aufgetaut und vor der Analyse zentrifugiert, dann wurden sie zweifach getestet und die Faktoren wurden unter Verwendung quantitativer Sandwich-Enzym-Immunoassays gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Die Ergebnisse wurden als pg/ml ausgedrückt.

2.5. Statistische Analyse

Alle kontinuierlichen normalverteilten Daten wurden als Mittelwert ausgedrückt und als Standardabweichung des Mittelwerts wurde der Median für nicht normalverteilte Daten verwendet. Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde durchgeführt, um die Normalität stetiger Variablen zu testen. Die Fläche unter der Freisetzungskurve zu jedem Zeitpunkt der Messung wurde für jedes Aktivierungsverfahren berechnet, um die Menge und Kinetik der freigesetzten Moleküle zu quantifizieren. Das General Linear Model (GLM) mit wiederholten Messungen mit Sidak-Test für Mehrfachvergleiche wurde durchgeführt, um die Unterschiede zu verschiedenen Nachbeobachtungszeiten in jeder Aktivierungsmethode zu bewerten. Der GLM mit wiederholten Messungen wurde auch verwendet, um den Einfluss der verschiedenen Aktivierungsmethoden zu bewerten.

galt als bedeutend.

Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung von SPSS v. 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) durchgeführt.

3. Ergebnisse

3.1. Thrombozytenkonzentration und Anzahl der weißen Blutkörperchen

Die mediane Thrombozytenzahl pro Kubikmillimeter betrug

für PB, PP bzw. PRP. Die mediane Konzentration der weißen Blutkörperchen pro Kubikmillimeter betrug

, , und für PB, PP bzw. PRP.

3.2. Gerinnselbildung

CaCl2, Thrombin, CaCL2/Thrombin und Kollagen Typ I induzierten eine andere Thrombozytenaggregation. Insbesondere mit CaCl . aktiviertes PRP2, Thrombin und CaCL2/Thrombin gebildete Gerinnsel, die in der 15-Minuten-Auswertung nachgewiesen wurden und bis zu 24 Stunden bestehen bleiben (Thrombin und CaCL2/Thrombin bereits nach 15 Minuten makroskopisch stabil, CaCl2 beginnend mit 15 und visuell stabilisiert nach 30 Minuten), wohingegen in Kollagen-Typ-I-aktivierten Proben zu keinem der bewerteten Zeitpunkte eine Gerinnselbildung festgestellt wurde ( 1 ).

3.3. Wachstumsfaktor und Zytokinfreisetzung

Keine nachweisbaren Spiegel von IL-1β und TNF-α Sekretion wurde in jeder der Proben zu jedem der ausgewerteten Versuchszeitpunkte gefunden.

Deutlich geringere Mengen an GFs wurden in nicht aktiviertem PRP und PPP im Vergleich zu anders aktiviertem PRP nachgewiesen ( ).

Die Auswirkungen der verschiedenen Aktivierungsmethoden auf die PRP-GF-Freisetzung sind in Abbildung 2 im Detail dargestellt.

3.3.1. PDGF

Nach 15 und 30 Minuten Thrombin und CaCl2/Thrombin produziert eine signifikant höhere Menge an PDGF im Vergleich zu CaCl&sub2;2 ( ). Nach 1 h CaCl2 und Thrombin allein produzierten eine ähnliche Menge an PDGF, während die Kombination von CaCl2/Thrombin induzierte eine signifikant höhere PDGF-Freisetzung im Vergleich zu CaCl2 ( ). Außerdem Thrombin und CaCl2/Thrombin zeigte eine größere Menge an PDGF im Vergleich zu Kollagen Typ I ( ). Bei 2 Stunden CaCl2, Thrombin und CaCl2/Thrombin produzierte ähnliche PDGF-Spiegel, alle signifikant höher im Vergleich zu Kollagen Typ I. Nach 24 h PDGF-Freisetzung aus CaCl&sub2;2 aktiviertes PRP war signifikant höher als das von Thrombin ( ) und CaCl2 und CaCl2/Thrombin induzierte mehr PDGF im Vergleich zu Kollagen Typ I ( ) ( 2 ).

3.3.2. TGF-β

Nach 15 Minuten Thrombin und CaCl2/Thrombin zeigte eine größere Menge an TGF-β gegenüber CaCl2 und Kollagen Typ I ( ), wohingegen kein signifikanter Unterschied zwischen CaCl&sub2;2 und Kollagen Typ I. Nach 30 Minuten Thrombin und CaCl2/Thrombin produzierte eine deutlich höhere Menge an TGF-β bezüglich Kollagen Typ I ( ). Nach 1 Stunde induzierte Thrombin einen signifikant höheren TGF-β Freisetzung in Bezug auf die von CaCl2 ( ), während CaCl2, Thrombin und CaCl2/Thrombin waren höher im Vergleich zu Kollagen Typ I ( ). Deutlich höhere TGF-Werteβ wurden für CaCl . beobachtet2, Thrombin und CaCl2/Thrombin in Bezug auf Kollagen Typ I sowohl nach 2 als auch nach 24 Stunden ( ) ( 2 ).

3.3.3. VEGF

Nach 15 und 30 Minuten Thrombin und CaCl2/Thrombin produziert eine signifikant höhere Menge an VEGF im Vergleich zu CaCl2 und Kollagen Typ I ( ). Nach 1 Stunde CaCl2 und Thrombin allein produzierten eine ähnliche Menge an VEGF, während die Kombination von CaCl2/Thrombin induzierte eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung im Vergleich zu CaCl2 ( ). Außerdem ist CaCl2, Thrombin und CaCl2/Thrombin zeigte eine größere Menge an VEGF im Vergleich zu Kollagen Typ I ( ). Sowohl nach 2 Stunden als auch nach 24 Stunden CaCl2, Thrombin und CaCl2/Thrombin produzierte signifikant höhere VEGF-Spiegel im Vergleich zu Kollagen Typ I ( ). Schließlich CaCl2/thrombin produced a significantly higher amount of VEGF with respect to that of thrombin at 24 hours ( ) (Figure 2).

3.4. Growth Factor Release Kinetics

The release pattern of PRP activated with CaCl2 was similar for all the GFs evaluated, with a significant and progressive release of GFs starting from 15 minutes and increasing up to 24 hours ( ) (Figure 2). Thrombin, CaCL2/thrombin, and collagen-type-I-activated PRP showed an immediate release of PDGF and TGF- that remained stable over time (Figure 2) conversely, VEGF showed an increasing trend from 15 minutes up to 24 hours ( ).

4. Diskussion

The main finding of our study is that the activation modality influences PRP clot formation, leading to differences in terms of both amount and release kinetics of platelet-derived GFs.

The most commonly used activation methods in the current clinical practice [14–16] were directly compared: CaCl2, autologous thrombin, their combination, and collagen type I to mimic the clinical conditions where their presence in the treated connective tissues should induce an “vor Ort” platelet activation. The latter is currently chosen for several PRP applications, since it is considered to be an easier and more effective strategy to deliver platelet bioactive molecules. However, our data showed that collagen type I does not lead to the same PRP releasate with respect to the other activators in terms of GFs released. In this study, we evaluated 3 GFs chosen among the most representative of PRP and involved in the wound healing cascade (TGF-β1, PDGF-AB, and VEGF) and 2 inflammatory mediators (IL-1β and TNF-α) to test whether the selected activators might induce an inflammatory component of PRP releasate. Die in vitro results showed significantly lower quantities of TGF-β1, PDGF-AB, and VEGF when collagen type I was used in this experimental condition.

Collagen is a weak platelet activator, which results in a lower amount of GFs released with respect to the other activation methods. This is a key aspect to bear in mind, since GFs are potent molecules and even small variations might affect the results in the tissue healing process [17, 18]. In fact, although low concentrations may be not effective enough to elicit the desired effects, high GF concentrations may have inhibitory effects on cellular functions and the level of the healing response [19–21]. Besides, they can be associated with unresolved inflammation and fibrotic events [22], thus confirming the importance of obtaining a proper releasate, also by choosing a specific PRP activation method to stimulate the release of bioactive molecules according to the requirements of the targeted tissue.

Besides the overall higher amount of released GFs with the other activation strategies used in the clinical practice, the comparison of the amount of molecules detected at each time point underlined another key factor related to PRP activation: the different release kinetics. This is of major importance and may also affect the treatment outcome. In fact, a rapid activation has been associated with a decrease in the total amount of GFs available at the tissue site over time [23]. GFs have a short half-life (from minutes to hours) and, if they are not immediately used upon release from platelets, they might be degraded before additional tissue receptors become available [15, 24]. From a clinical point of view, this aspect may be one of the causes related to the poor results sometimes reported by using PRP in musculoskeletal tissue regeneration [23]. Conversely, some other applications may benefit from a less sustained release, with the final results determined by the burst of bioactive molecules released [25, 26].

The study results highlighted that thrombin alone and in combination with CaCl2 and collagen type I (even if at lower level in this case) presented similar kinetics, stimulating a rapid release of GFs that remains stable up to 24 h. Similarly, comparing the PRP releasate induced by thrombin or collagen type I, Fufa et al. [14] observed that both activation methods stimulate immediate initial release sustained over 10 days from a PRP clot.

Conversely, CaCl2 showed a gradual release over time, with a lower initial level followed by a progressively increasing amount of GFs released, reaching similar or even higher levels at the 24-hour evaluation.

Another important aspect for the clinical application of blood derivatives is their physical form, which may range from liquid to solid gel allowing both surgical augmentations as well as minimally invasive injective PRP delivery. Concerning this, the study underlined how different activators influence platelet aggregation. In particular, the use of CaCl2 induced clot formation within 30 minutes of its addition, whereas thrombin and CaCl2/thrombin caused a more rapid clot formation, which was already detectable at the 15-minute evaluation. Interestingly, collagen-type-I-activated platelet concentrates exhibited far less aggregation, with no visible clots up to 24 hours. This result is partially in contrast to that obtained by Fufa et al. [14], who observed that PRP activation with collagen led to clot formation, albeit far less retracted than that observed with thrombin activation. This discrepancy may be due to the different experimental conditions, such as the type of collagen and the different procedures used to prepare PRP. PRP may present a wide range in terms of type and quantity of cells and molecules such as fibrinogen, which may explain the different propensity to form clots. The state of the platelet concentrate may be as important as the released molecules for treatment success. In fact, although the lack of a clot might not be a problem in the treatment of osteoarthritis, where a liquid PRP allows all articular tissues to be targeted without the risk of dispersion from the closed joint cavity [5], the liquid form may be unsuitable for other applications. This appears to be clear for surgical augmentations, where PRP is used to entrap cells or even sutured to the lesion site [23], but may also apply for less invasive injective approaches. This may be the case of intratendinous injections. Once delivered inside the tendon in the liquid form, the timely gelification process may allow the concentrate to remain in the injected area, thus allowing GF secretion in the treatment site. Conversely, the persistent liquid state may increase the risk of leakage and PRP dispersion, favoured by the contraction of the musculotendinous unit that might squeeze liquid PRP away from the injection site, thus reducing or even impairing its potentially positive effects [13]. A direct PRP activation vor Ort is an interesting approach that might overcome some of the shortcomings related to the use of thrombin, resulting in the risk of potentially life-threatening coagulopathies [27, 28], and CaCl2, sometimes associated with burning sensation due to low pH, as reported by DeLong et al. [23]. However, the results obtained in this study with collagen-mediated activation cast doubts on this method for PRP application in the clinical practice. Further studies should focus not only on the distribution of the injected PRP in the treated area, but also on its persistence over time and on the consequent effects on the final outcome for each specific application [29].

Finally, besides the differences in clot formation and GFs amount and release kinetics, another interesting finding that emerged from the study analysis regards the lack of influence of the activation methods on the inflammatory molecules in the releasate. The PRP used in this experimental setting is a leukocyte-rich PRP, which is currently being debated for the potentially deleterious effects of proteases and reactive oxygen species released by the white blood cell component. In fact, whereas some authors consider leukocytes to be a beneficial source of cytokines and enzymes that may be important for the prevention of infection, others attribute better results to formulations with leukocyte depletion [30–32].

The study results showed that, even in this leukocyte-rich PRP, none of the selected activators was able to induce an inflammatory releasate, as demonstrated by the lack of IL-1β and TNF-α secretion at all the experimental times evaluated. Future studies should investigate if the same findings will be confirmed also in an inflammatory environment better reproducing PRP use in the damaged tissues of the clinical setting.

This study has some limitations that need to be discussed. In fact, today little is known about the concentration of calcium, thrombin, or collagen needed to trigger the optimal release of GFs, and different concentrations may lead to different results. For example, it has been reported that high concentrations of calcium and thrombin trigger an immediate and significant increase in TGF-β1 and PDGF concentrations, which remained generally constant over a 6-day period, whereas lower concentrations tend to reduce and delay GF release [26]. However, the selected concentrations derive from the clinical practice thus, the study findings still reflect the current PRP applications. Nonetheless, the activator concentration should be the focus of further specifically designed studies, being a key aspect to determine the final properties of the platelet concentrates. Moreover, these findings give only general indications that could be useful for future PRP application in musculoskeletal tissues, and further studies are needed to investigate the effects of different PRP activation methods on cell cultures.

The results of this study confirm the importance of the method chosen to activate PRP, by determining both its physical form and the amount and release kinetics of GFs. It is not only the presence of GFs that dictates the level of healing response, but also the ability of targeting the treatment area, thus modulating cells with an appropriate dosage and in a timely manner [33]. Thus, PRP activation strategies should be selected not only based on procedure type (open versus arthroscopic), but also according to the desired biological effects in the targeted tissue. Future studies should aim at further investigating the effect of the different activation strategy on platelet concentrates according to the lesion target, in order to optimize the in vivo effect of the released bioactive molecules and therefore increase PRP healing potential.

Konkurrierende Interessen

Giuseppe Filardo is consultant and receives institutional support from Finceramica Faenza SpA (Italy), Fidia Farmaceutici SpA (Italy), and CartiHeal (2009) Ltd. (Israel). He is a consultant for EON Medica SRL (Italy). He receives institutional support from IGEA Clinical Biophysics (Italy), BIOMET (USA), and Kensey Nash (USA). Elizaveta Kon is a consultant for CartiHeal (2009) Ltd. (Israel) and has stocks of CartiHeal (2009) Ltd. (Israel). She is a consultant and receives institutional support from Finceramica Faenza SpA (Italy). She receives institutional support from Fidia Farmaceutici SpA (Italy), IGEA Clinical Biophysics (Italy), BIOMET (USA), and Kensey Nash (USA). Maurilio Marcacci receives royalties and research institutional support from Fin-Ceramica Faenza SpA (Italy). He receives institutional support from Fidia Farmaceutici SpA (Italy), CartiHeal (2009) Ltd. (Israel), IGEA Clinical Biophysics (Italy), BIOMET (USA), and Kensey Nash (USA). All the other authors declare that there are no competing interests regarding the publication of this paper.

Danksagung

The authors thank Dr. Elettra Pignotti for statistical assistance and Mr. Keith Smith for English editing, Rizzoli Orthopaedic Institute, Bologna, Italy. This work was supported by grants from “

” funds, Italian Ministry of Health (Project RF-2009, Grant no. 1498841), and Emilia-Romagna Region (Region-University Program 2010–2012: Regenerative Medicine of Cartilage and Bone).

Verweise

  1. E. Kon, G. Filardo, A. Di Martino, and M. Marcacci, “Platelet-rich plasma (PRP) to treat sports injuries: evidence to support its use,” Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy, Bd. 19, nein. 4, pp. 516–527, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  2. M. Tschon, M. Fini, R. Giardino et al., “Lights and shadows concerning platelet products for musculoskeletal regeneration,” Frontiers in Bioscience-Elite, Bd. 3, nein. 1, pp. 96–107, 2011. View at: Google Scholar
  3. L. Andriolo, B. Di Matteo, E. Kon, G. Filardo, G. Venieri, and M. Marcacci, “PRP augmentation for ACL reconstruction,” BioMed Research International, Bd. 2015, Article ID 371746, 15 pages, 2015. View at: Publisher Site | Google Scholar
  4. M. Del Fabbro, G. Gallesio, and M. Mozzati, “Autologous platelet concentrates for bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw treatment and prevention. A systematic review of the literature,” Europäische Zeitschrift für Krebs, Bd. 51, Nr. 1, pp. 62–74, 2015. View at: Publisher Site | Google Scholar
  5. G. Filardo, E. Kon, A. Roffi, B. Di Matteo, M. L. Merli, and M. Marcacci, “Platelet-rich plasma: why intra-articular? A systematic review of preclinical studies and clinical evidence on PRP for joint degeneration,” Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy, Bd. 23, nein. 9, pp. 2459–2474, 2015. View at: Publisher Site | Google Scholar
  6. E. Lopez-Vidriero, K. A. Goulding, D. A. Simon, M. Sanchez, and D. H. Johnson, “The use of platelet-rich plasma in arthroscopy and sports medicine: optimizing the healing environment,” Arthroscopy, Bd. 26, nein. 2, pp. 269–278, 2010. View at: Publisher Site | Google Scholar
  7. A. Roffi, G. Filardo, E. Kon, and M. Marcacci, “Does PRP enhance bone integration with grafts, graft substitutes, or implants? A systematic review,” BMC Musculoskeletal Disorders, Bd. 14, article 330, 2013. View at: Publisher Site | Google Scholar
  8. J. A. Textor, J. W. Norris, and F. Tablin, “Effects of preparation method, shear force, and exposure to collagen on release of growth factors from equine platelet-rich plasma,” American Journal of Veterinary Research, Bd. 72, nein. 2, pp. 271–278, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  9. F. Vannini, B. Di Matteo, G. Filardo, E. Kon, M. Marcacci, and S. Giannini, “Platelet-rich plasma for foot and ankle pathologies: a systematic review,” Foot and Ankle Surgery, Bd. 20, nein. 1, pp. 2–9, 2014. View at: Publisher Site | Google Scholar
  10. Y. Zhu, M. Yuan, H. Y. Meng et al., “Basic science and clinical application of platelet-rich plasma for cartilage defects and osteoarthritis: a review,” Osteoarthritis and Cartilage, Bd. 21, nein. 11, pp. 1627–1637, 2013. View at: Publisher Site | Google Scholar
  11. T. E. Foster, B. L. Puskas, B. R. Mandelbaum, M. B. Gerhardt, and S. A. Rodeo, “Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications,” The American Journal of Sports Medicine, Bd. 37, nein. 11, pp. 2259–2272, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  12. A. S. Wasterlain, H. J. Braun, and J. L. Dragoo, “Contents and formulations of platelet-rich plasma,” Operative Techniques in Orthopaedics, Bd. 22, nein. 1, pp. 33–42, 2012. View at: Publisher Site | Google Scholar
  13. B. Di Matteo, G. Filardo, E. Kon, and M. Marcacci, “Platelet-rich plasma: evidence for the treatment of patellar and Achilles tendinopathy𠅊 systematic review,” Musculoskeletal Surgery, Bd. 99, nein. 1, pp. 1–9, 2015. View at: Publisher Site | Google Scholar
  14. D. Fufa, B. Shealy, M. Jacobson, S. Kevy, and M. M. Murray, “Activation of platelet-rich plasma using soluble type I collagen,” Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Bd. 66, Nr. 4, pp. 684–690, 2008. View at: Publisher Site | Google Scholar
  15. S. Harrison, P. Vavken, S. Kevy, M. Jacobson, D. Zurakowski, and M. M. Murray, “Platelet activation by collagen provides sustained release of anabolic cytokines,” The American Journal of Sports Medicine, Bd. 39, nein. 4, pp. 729–734, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  16. E. Kon, G. Filardo, B. Di Matteo, and M. Marcacci, “PRP for the treatment of cartilage pathology,” The Open Orthopaedics Journal, Bd. 7, pp. 120–128, 2013. View at: Google Scholar
  17. P. Torricelli, M. Fini, G. Filardo et al., “Regenerative medicine for the treatment of musculoskeletal overuse injuries in competition horses,” International Orthopaedics, Bd. 35, Nr. 10, pp. 1569–1576, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  18. G. Weibrich, T. Hansen, W. Kleis, R. Buch, and W. E. Hitzler, “Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration,” Knochen, Bd. 34, Nr. 4, pp. 665–671, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  19. B. Han, J. Woodell-May, M. Ponticiello, Z. Yang, and M. Nimni, “The effect of thrombin activation of platelet-rich plasma on demineralized bone matrix osteoinductivity,” The Journal of Bone & Joint Surgery𠅊merican Volume, Bd. 91, Nr. 6, pp. 1459–1470, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  20. B. lberts, D. Bray, J. Lewis et al., Molekularbiologie der Zelle, Garland Publishing, New York, NY, USA, 3rd edition, 1994.
  21. D. M. Ranly, J. McMillan, T. Keller et al., “Platelet-derived growth factor inhibits demineralized bone matrix-induced intramuscular cartilage and bone formation: a study of immunocompromised mice,” Journal of Bone and Joint Surgery A, Bd. 87, nein. 9 I, pp. 2052–2064, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  22. L. Y. Carreon, S. D. Glassman, Y. Anekstein, and R. M. Puno, “Platelet gel (AGF) fails to increase fusion rates in instrumented posterolateral fusions,” Wirbelsäule, Bd. 30, nein. 9, pp. E243–E246, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  23. J. M. DeLong, R. P. Russell, and A. D. Mazzocca, “Platelet-rich plasma: the PAW classification system,” Arthroscopy, Bd. 28, Nr. 7, pp. 998–1009, 2012. View at: Publisher Site | Google Scholar
  24. S. C. Bir, J. Esaki, A. Marui et al., “Angiogenic properties of sustained release platelet-rich plasma: characterization in-vitro and in the ischemic hind limb of the mouse,” Journal of Vascular Surgery, Bd. 50, nein. 4, pp. 870–879, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  25. E. Mariani, G. Filardo, V. Canella et al., “Platelet-rich plasma affects bacterial growth in vitro,” Cytotherapy, Bd. 16, nein. 9, pp. 1294–1304, 2014. View at: Publisher Site | Google Scholar
  26. I. Martineau, E. Lacoste, and G. Gagnon, “Effects of calcium and thrombin on growth factor release from platelet concentrates: kinetics and regulation of endothelial cell proliferation,” Biomaterialien, Bd. 25, nein. 18, pp. 4489–4502, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  27. R. Landesberg, A. Burke, D. Pinsky et al., “Activation of platelet-rich plasma using thrombin receptor agonist peptide,” Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Bd. 63, Nr. 4, pp. 529–535, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  28. T. L. Ortel, M. C. Mercer, E. H. Thames, K. D. Moore, and J. H. Lawson, “Immunologic impact and clinical outcomes after surgical exposure to bovine thrombin,” Annals of Surgery, Bd. 233, Nr. 1, pp. 88–96, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  29. B. Hamilton, J. L. Tol, W. Knez, and H. Chalabi, “Exercise and the platelet activator calcium chloride both influence the growth factor content of platelet-rich plasma (PRP): overlooked biochemical factors that could influence PRP treatment,” British Journal of Sports Medicine, Bd. 49, nein. 14, pp. 957–960, 2015. View at: Publisher Site | Google Scholar
  30. T. M. Bielecki, T. S. Gazdzik, J. Arendt, T. Szczepanski, W. Król, and T. Wielkoszynski, “Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study,” The Journal of Bone & Joint Surgery𠅋ritish Volume, Bd. 89, Nr. 3, pp. 417–420, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  31. T. M. McCarrel, T. Minas, and L. A. Fortier, “Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy,” The Journal of Bone & Joint Surgery𠅊merican Volume, Bd. 94, Nr. 19, article e143, pp. 1–8, 2012. View at: Publisher Site | Google Scholar
  32. D. J. F. Moojen, P. A. M. Everts, R.-M. Schure et al., “Antimicrobial activity of platelet-leukocyte gel against Staphylococcus aureus,” Journal of Orthopaedic Research, Bd. 26, nein. 3, pp. 404–410, 2008. View at: Publisher Site | Google Scholar
  33. S. P. Arnoczky, D. Delos, and S. A. Rodeo, “What is platelet-rich plasma?” Operative Techniques in Sports Medicine, Bd. 19, nein. 3, pp. 142–148, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar

Urheberrechte ©

Copyright © 2016 Carola Cavallo et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


1. Avoid Transferring DC During Culture

Dendritic cells are composed of both adherent and non-adherent cells, making the movement of cells from one culture vessel to another a dicey situation. Those adherent cells won’t come off the plastic without a real fight. When possible, set up your cells in the culture configuration you want to use in your experiment, so you don’t have to disturb the cells.
If you do switch vessels during your culture or experimentation, expect to recover fewer cells.

2. Add the Right Proportion of Cytokines to Preserve the DC Phenotype

Dendritic cells will survive in culture for approximately one week. If you have plans to maintain your dendritic cells after an overnight culture, you need to add the proper proportion of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL4) recombinant human proteins.

We recommend adding 500 U/mL of GM-CSF and 500 U/mL of IL4, which you can purchase from suppliers like Thermo Fisher or PeproTech. This will ensure your dendritic cells maintain their phenotype after thawing.

3. Activate Your DC, If Necessary

Our dendritic cells are immature, but you can easily activate or mature them by adding lipopolysaccharides (LPS), poly(I:C), or other pathogen pattern molecules. Alternatively, you could use cytokines, such as IFNγ or TNFα, in combination with prostaglandin to achieve a similar result.

Depending on the stimuli used, you can get a slightly different dendritic cell that could suppress an immune response rather than ramp it up.

4. Always Include Serum When Stimulating DC with LPS

You can stimulate your dendritic cells with LPS, but you must include serum as well for proper activation. The soluble CD14 in the serum facilitates binding of the LPS to the dendritic cells.

For serum, you can use human serum or fetal bovine serum to achieve the desired result.

5. Follow Our Detailed Protocol for Successful DC Cultures

In addition to these tips, be sure to follow the procedures outlined in our Human Dendritic Cell Culture protocol.
Have other research questions? Ask a scientist and get a quick answer!

Author: Anne Lodge, Ph.D.

Dr. Lodge is the Chief Science and Innovation Officer at Cellero. She has a strong background in cell-based therapeutics and immunology, including a Ph.D. in Cell and Molecular Biology from the University of Vermont and a postdoctoral fellowship with the Multiple Sclerosis Society studying the role of T cells in the disease process. Learn more about Dr. Lodge.

2 Comments

Hi, thank you for these tips. I want to ask something. As far a I know we couldn’t make cryopreserved storage of dendritic cells. Than how long can we culture these cells by changing the media?

If you are starting from monocytes, it takes 4-6 days before they fully differentiate into DC (when culturing with GM-CSF and IL-4). This is the best time to harvest the DCs for your experiment. You can add fresh media to maintain them in culture for 2-3 more days. However, these cells will be increasingly adherent to tissue culture plastic.

Hinterlasse eine Antwort Antwort verwerfen

Diese Seite verwendet Akismet, um Spam zu reduzieren. Erfahren Sie, wie Ihre Kommentardaten verarbeitet werden.


Platelets in atherothrombosis

The participation of platelets in atherogenesis and the subsequent formation of occlusive thrombi depend on platelets' adhesive properties and the inability to respond to stimuli with rapid activation. By understanding the multifaceted mechanisms involved in platelet interactions with vascular surfaces and aggregation, new approaches can be tailored to selectively inhibit the pathways most relevant to the pathological aspects of atherothrombosis.

Arterial thrombosis is the acute complication that develops on the chronic lesions of atherosclerosis and causes heart attack and stroke, today the most common causes of mortality in developed countries. Platelets, with fibrin, are prominent components of the thrombi (clots) that occlude arteries, but may also participate in the development and progression of the atherosclerotic plaque. Thus, platelets are central to the process of atherothrombosis, a term that describes the combination of acute and chronic events in arterial disease. The normal function of platelets, however, is to arrest bleeding from wounds, which requires adhesion to altered vascular surfaces and rapid cellular activation with the ensuing accumulation of additional platelets and fibrin into a growing thrombus. Progress in understanding the mechanisms of platelet adhesion, activation and aggregation may improve the ability to prevent thrombosis and, possibly, the progression of atherosclerosis.