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12.10: Integrine – Bidirektionale Zelladhäsionsrezeptoren – Biologie

12.10: Integrine – Bidirektionale Zelladhäsionsrezeptoren – Biologie


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12.10: Integrine – bidirektionale Zelladhäsionsrezeptoren

LaunchPad für Nelsons Prinzipien der Biochemie (2-Term Online)

Klare Schrift und Illustrationen…Klare Erklärungen schwieriger Konzepte…Eine klare Kommunikation der Wege in der Biochemie wird derzeit verstanden und praktiziert. Seit über 35 Jahren, in Auflage für Bestseller, legt Principles of Biochemistry diese definierenden Prinzipien fest

Klare Schrift und Illustrationen…Klare Erklärungen schwieriger Konzepte…Eine klare Kommunikation der Wege in der Biochemie wird derzeit verstanden und praktiziert. Seit über 35 Jahren setzt „Principles of Biochemistry“ in einer Auflage nach der anderen diese bestimmenden Prinzipien in die Praxis um und führt die Studierenden durch eine schlüssige Einführung in die Grundlagen der Biochemie, ohne sie zu überfordern.

Die Neuausgabe führt diesen bemerkenswerten Text in eine neue Ära. Wie seine Vorgänger, Lehninger Principles of Biochemistry , Sixth Edition trifft eine sorgfältige Balance zwischen aktueller Wissenschaft und dauerhaften Konzepten und enthält eine enorme Menge neuer Erkenntnisse, aber nur solche, die dazu beitragen, die grundlegenden Prinzipien der Biochemie zu veranschaulichen. Mit dieser Ausgabe werden die Schüler neue Informationen aus der Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung, der Röntgenkristallographie, der Manipulation von Genen und der Genexpression sowie anderen Techniken kennenlernen isolierte Erforschung von Stoffwechselwegen bis hin zur Konzentration auf Wechselwirkungen zwischen Stoffwechselwegen.  Sie erhalten auch ein aktuelles Verständnis der Relevanz der Biochemie für die Erforschung menschlicher Krankheiten (insbesondere Diabetes) sowie der wichtigen Rolle der Evolutionstheorie in der biochemischen Forschung.

Diese umfangreichen inhaltlichen Änderungen sowie neue Kunst und leistungsstarke neue Lerntechnologien machen diese Ausgabe von Lehninger Principles of Biochemistry zur bisher beeindruckendsten.

Klare Schrift und Illustrationen…Klare Erklärungen schwieriger Konzepte…Eine klare Kommunikation der Wege in der Biochemie wird derzeit verstanden und praktiziert. Seit über 35 Jahren setzt „Principles of Biochemistry“ in einer Auflage nach der anderen diese bestimmenden Prinzipien in die Praxis um und führt die Studierenden durch eine schlüssige Einführung in die Grundlagen der Biochemie, ohne sie zu überfordern.

Die Neuausgabe führt diesen bemerkenswerten Text in eine neue Ära. Wie seine Vorgänger, Lehninger Principles of Biochemistry , Sixth Edition trifft eine sorgfältige Balance zwischen aktueller Wissenschaft und dauerhaften Konzepten und enthält eine enorme Menge neuer Erkenntnisse, aber nur solche, die dazu beitragen, die grundlegenden Prinzipien der Biochemie zu veranschaulichen. Mit dieser Ausgabe werden die Schüler neue Informationen aus der Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung, der Röntgenkristallographie, der Manipulation von Genen und der Genexpression sowie anderen Techniken kennenlernen isolierte Erforschung von Stoffwechselwegen bis hin zur Konzentration auf Wechselwirkungen zwischen Stoffwechselwegen.  Sie erhalten auch ein aktuelles Verständnis der Bedeutung der Biochemie für das Studium menschlicher Krankheiten (insbesondere Diabetes) sowie die wichtige Rolle der Evolutionstheorie in der biochemischen Forschung.

Diese umfangreichen inhaltlichen Änderungen sowie neue Kunst und leistungsstarke neue Lerntechnologien machen diese Ausgabe von Lehninger Principles of Biochemistry zur bisher beeindruckendsten.

  • Abschnitt 13.2, Chemische Logik und übliche biochemische Reaktionen , diskutiert die üblichen biochemischen Reaktionstypen, die allen Stoffwechselreaktionen zugrunde liegen, und hilft den Schülern, organische Chemie mit Biochemie zu verbinden.
  • NEUE chemische Logikfiguren heben die Erhaltung von Mechanismen hervor und veranschaulichen Muster, die Lernwege erleichtern. Für jeden der zentralen Stoffwechselwege sind chemische Logikfiguren angegeben: Glykolyse (Abb. 14-3), Zitronensäurezyklus (Abb. 16-7) und Fettsäureoxidation (Abb. 17-9).
  • Die Abbildungen des Mechanismus enthalten Schritt-für-Schritt-Beschreibungen, um den Schülern zu helfen, den Reaktionsprozess zu verstehen. Diese Figuren verwenden einen konsistenten Satz von Konventionen, die mit dem ersten angetroffenen Enzymmechanismus im Detail eingeführt und erklärt wurden.
  • In Text ausgearbeitete Beispiele führen die Schüler Schritt für Schritt durch einige der schwierigsten Gleichungen. In den Kapiteln 1, 2 und 19 erscheinen neue bearbeitete Beispiele. 
  • Mehr als 600 Aufgaben am Ende des Kapitels (über 75 davon neu) geben den Schülern weitere Gelegenheit, das Gelernte zu üben.
  • Data Analysis Problems (eines am Ende jedes Kapitels),  beigesteuert von Brian White von der University of Massachusetts–Boston, ermutigen die Schüler, Daten aus der Literatur zu interpretieren.

LaunchPad für Nelsons Prinzipien der Biochemie (2-Term Online)


Testbank (nur Download) für Lehninger Principles of Biochemistry 7. Auflage David L. Nelson Michael M. Cox ISBN-10: 1464187967 ISBN-13: 9781464187964 ISBN-10: 1464126119 ISBN-13: 9781464126116

1. Die Grundlagen der Biochemie
1.1 Zelluläre Grundlagen
1.2 Chemische Grundlagen
Kasten 1–1 Molekulargewicht, Molekulargewicht und ihre korrekten Einheiten
Kasten 1-2 Louis Pasteur und optische Aktivität: In Vino, Veritas
1.3 Physikalische Grundlagen
Kasten 1-3 Entropie: Dinge fallen auseinander
1.4 Genetische Grundlagen

2. Wasser
2.1 Schwache Wechselwirkungen in wässrigen Systemen
2.2 Ionisierung von Wasser, schwachen Säuren und schwachen Basen
2.3 Pufferung gegen pH-Änderungen in biologischen Systemen
Kasten 2-1 Medizin: Das eigene Kaninchen (nicht zu Hause ausprobieren!)
2.4 Wasser als Reaktant
2.5 Die Eignung einer wässrigen Umgebung für lebende Organismen

3. Aminosäuren, Peptide und Proteine
3.1 Aminosäuren
Kasten 3-1 Methoden: Absorption von Licht durch Moleküle: Das Lambert-Beer-Gesetz
3.2 Peptide und Proteine
3.3 Arbeiten mit Proteinen
3.4 Die Struktur von Proteinen: Primärstruktur
Kasten 3–2 Konsenssequenzen und Sequenzlogos

4. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen
4.1 Überblick über die Proteinstruktur
4.2 Sekundärstruktur von Proteinen
Kasten 4–1 Methoden: Die rechte Hand von der linken erkennen
4.3 Tertiäre und quartäre Proteinstrukturen
Kasten 4–2 Dauerwellen ist Bioverfahrenstechnik
Kasten 4–3 Warum Segler, Entdecker und College-Studenten ihr frisches Obst und Gemüse essen sollten
Kasten 4–4 Die Proteindatenbank
Kasten 4–5 Methoden: Methoden zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins
4.4 Proteindenaturierung und -faltung
Kasten 4–6 Medizin: Tod durch Fehlfaltung: Die Prionenkrankheiten

5. Proteinfunktion
5.1 Reversible Bindung eines Proteins an einen Liganden: Sauerstoffbindende Proteine
Kasten 5–1 Medizin: Kohlenmonoxid: Ein heimlicher Killer
5.2 Komplementäre Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Liganden: Das Immunsystem und Immunglobuline
5.3 Durch chemische Energie modulierte Proteinwechselwirkungen: Aktin, Myosin und molekulare Motoren

6. Enzyme
6.1 Eine Einführung in Enzyme
6.2 Wie Enzyme funktionieren
6.3 Enzymkinetik als Ansatz zum Verständnis des Mechanismus
Kasten 6–1 Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung: Der doppelreziproke Plot
Kasten 6–2 Kinetische Tests zur Bestimmung von Hemmmechanismen
Kasten 6–3 Heilung der afrikanischen Schlafkrankheit mit einem biochemischen Trojanischen Pferd
6.4 Beispiele für enzymatische Reaktionen
6.5 Regulatorische Enzyme

7. Kohlenhydrate und Glykobiologie
7.1 Monosaccharide und Disaccharide
Kasten 7–1 Medizin: Blutzuckermessungen in der Diagnose und Behandlung von Diabetes
Kasten 7–2 Zucker ist süß und ist es auch . . . ein paar andere Dinge
7.2 Polysaccharide
7.3 Glykokonjugate: Proteoglykane, Glykoproteine ​​und Glykolipide
7.4 Kohlenhydrate als Informationsmoleküle: Der Zuckercode
7.5 Mit Kohlenhydraten arbeiten

8. Nukleotide und Nukleinsäuren
8.1 Einige Grundlagen
8.2 Nukleinsäurestruktur
8.3 Nukleinsäurechemie
8.4 Andere Funktionen von Nukleotiden

9. DNA-basierte Informationstechnologien
9.1 Gene und ihre Produkte studieren
Kasten 9–1 Ein mächtiges Werkzeug in der Gerichtsmedizin
9.2 Verwendung von DNA-basierten Methoden zum Verständnis der Proteinfunktion
9.3 Genomik und die menschliche Geschichte
Kasten 9–2 Medizin: Personalisierte Genommedizin
Kasten 9–3 Die Neandertaler kennenlernen

10. Lipide
10.1 Speicherlipide
10.2 Strukturlipide in Membranen
Kasten 10–1 Medizin: Abnorme Ansammlungen von Membranlipiden: Einige erbliche Erkrankungen des Menschen
10.3 Lipide als Signale, Cofaktoren und Pigmente
10.4 Arbeiten mit Lipiden

11. Biologische Membranen und Transport
11.1 Zusammensetzung und Architektur von Membranen
11.2 Membrandynamik
11.3 Stofftransport über Membranen
Kasten 11–1 Medizin: Defekter Glukose- und Wassertransport bei zwei Formen von Diabetes
Kasten 11–2 Medizin: Ein defekter Ionenkanal bei Mukoviszidose

12. Biosignalisierung
12.1 Allgemeine Merkmale der Signalübertragung
Kasten 12–1 Methoden Scatchard-Analyse quantifiziert die Rezeptor-Ligand-Interaktion
12.2 Protein-gekoppelte Rezeptoren und zweite Botenstoffe
Kasten 12–2 Medizin: G-Proteine: Binäre Schalter in Gesundheit und Krankheit
Kasten 12–3 Methoden: FRET: Biochemie visualisiert in einer lebenden Zelle
12.3 Rezeptor-Tyrosin-Kinasen
12.4 Rezeptor-Guanylyl-Cyclasen, cGMP und Proteinkinase G
12.5 Multivalente Adapterproteine ​​und Membranrafts
12.6 Gated Ionenkanäle
12.7 Integrine: Bidirektionale Zelladhäsionsrezeptoren
12.8 Regulation der Transkription durch Nuklearhormonrezeptoren
12.9 Signalübertragung in Mikroorganismen und Pflanzen
12.10 Sinnestransduktion beim Sehen, Riechen und Gustation
Kasten 12–4 Medizin: Farbenblindheit: John Daltons Experiment aus dem Grab
12.11 Regulation des Zellzyklus durch Proteinkinasen
12.12 Onkogene, Tumorsuppressorgene und programmierter Zelltod
Kasten 12–5 Medizin: Entwicklung von Proteinkinase-Inhibitoren für die Krebsbehandlung

13. Bioenergetik und biochemische Reaktionstypen
13.1 Bioenergetik und Thermodynamik
13.2 Chemische Logik und übliche biochemische Reaktionen
13.3 Phosphorylgruppentransfers und ATP
Kasten 13–1 Glühwürmchen blinkt: Leuchtende Berichte über ATP
13.4 Biologische Oxidations-Reduktions-Reaktionen

14. Glykolyse, Glukoneogenese und der Pentosephosphatweg
14.1 Glykolyse
Kasten 14–1 Medizin: Hohe Glykolyserate bei Tumoren schlägt Angriffspunkte für Chemotherapie vor und erleichtert Diagnose
14.2 Feeder-Pfade für die Glykolyse
14.3 Schicksale von Pyruvat unter anaeroben Bedingungen: Fermentation
Kasten 14–2 Sportler, Alligatoren und Quastenflosser: Glykolyse bei limitierenden Sauerstoffkonzentrationen
Kasten 14–3 Ethanolfermentationen: Bier brauen und Biokraftstoffe herstellen
14.4 Gluconeogenese
14.5 Pentosephosphat-Weg der Glucoseoxidation
Kasten 14–4 Medizin: Warum Pythagoras keine Falafel essen würde: Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel

15. Prinzipien der Stoffwechselregulation
15.1 Regulation von Stoffwechselwegen
15.2 Analyse der metabolischen Kontrolle
Kasten 15–1 Methoden: Metabolische Kontrollanalyse: Quantitative Aspekte
15.3 Koordinierte Regulation von Glykolyse und Gluconeogenese
Kasten 15–2 Isozyme: Verschiedene Proteine, die dieselbe Reaktion katalysieren
Kasten 15–3 Medizin: Genmutationen, die zu seltenen Formen von Diabetes führen
15.4 Der Stoffwechsel von Glykogen bei Tieren
Kasten 15–4 Carl und Gerty Cori: Pioniere im Glykogenstoffwechsel und bei Krankheiten
15.5 Koordinierte Regulation von Glykogensynthese und -abbau

16. Der Zitronensäurezyklus
16.1 Herstellung von Acetyl-CoA (aktiviertes Acetat)
16.2 Reaktionen des Zitronensäurezyklus
Kasten 16–1 Moonlighting-Enzyme: Proteine ​​mit mehr als einem Job
Kasten 16–2 Synthasen und Synthetasen Ligasen und Lyasen Kinasen, Phosphatasen und Phosphorylasen: Ja, die Namen sind verwirrend!
Kasten 16–3 Citrat: Ein symmetrisches Molekül, das asymmetrisch reagiert
16.3 Regulierung des Zitronensäurezyklus
16.4 Der Glyoxylat-Zyklus

17. Fettsäurekatabolismus
17.1 Verdauung, Mobilisierung und Transport von Fetten
17.2 Oxidation von Fettsäuren
Kasten 17–1 Fettbären führen im Schlaf ß Oxidation durch
Kasten 17–2 Coenzym B12: Eine radikale Lösung für ein verwirrendes Problem
17.3 Ketonkörper

18. Oxidation von Aminosäuren und Produktion von Harnstoff
18.1 Metabolische Schicksale von Aminogruppen
18.2 Stickstoffausscheidung und der Harnstoffzyklus
Kasten 18–1 Medizin: Assays für Gewebeschäden
18.3 Wege des Aminosäureabbaus
Kasten 18–2 Medizin:Wissenschaftliche Detektive lösen ein Mordrätsel

19. Oxidative Phosphorylierung und Photophosphorylierung Oxidative Phosphorylierung
19.1 Elektronentransferreaktionen in Mitochondrien
Kasten 19–1 Heiße, stinkende Pflanzen und alternative Atmungswege
19.2 ATP-Synthese
Kasten 19–2 Methoden: Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung von Membranproteinen
19.3 Regulation der oxidativen Phosphorylierung
19.4 Mitochondrien bei Thermogenese, Steroidsynthese und Apoptose
19.5 Mitochondriale Gene: Ihr Ursprung und die Auswirkungen von Mutationen
Photosynthese: Lichtenergie ernten
19.6 Allgemeine Merkmale der Photophosphorylierung
19.7 Lichtabsorption
19.8 Das zentrale photochemische Ereignis: Lichtgetriebener Elektronenfluss
19.9 ATP-Synthese durch Photophosphorylierung
19.10 Die Evolution der sauerstoffhaltigen Photosynthese

20. Kohlenhydratbiosynthese in Pflanzen und Bakterien
20.1 Photosynthetische Kohlenhydratsynthese
20.2 Photorespiration und die C4- und CAM-Pfade
Kasten 20–1 Wird die Gentechnik photosynthetischer Organismen ihre Effizienz steigern?
20.3 Biosynthese von Stärke und Saccharose
20.4 Synthese von Zellwand-Polysacchariden: Pflanzenzellulose und bakterielles Peptidoglycan
20.5 Integration des Kohlenhydratstoffwechsels in die Pflanzenzelle

21. Lipidbiosynthese
21.1 Biosynthese von Fettsäuren und Eicosanoiden
Kasten 21–1 Medizin: Mischfunktionsoxidasen, Cytochrom P-450s und Medikamentenüberdosierungen
21.2 Biosynthese von Triacylglycerolen
21.3 Biosynthese von Membranphospholipiden
21.4 Cholesterin, Steroide und Isoprenoide: Biosynthese, Regulation und Transport
Kasten 21–2 Medizin: ApoE-Allele sagen Alzheimer-Inzidenz voraus
Kasten 21–3 Medizin: Die Lipidhypothese und die Entwicklung von Statinen

22. Biosynthese von Aminosäuren, Nukleotiden und verwandten Molekülen
22.1 Überblick über den Stickstoffstoffwechsel
Kasten 22–1 Ungewöhnliche Lebensstile der Obskuren, aber reichlich vorhanden
22.2 Biosynthese von Aminosäuren
22.3 Von Aminosäuren abgeleitete Moleküle
Kasten 22–2 Über Könige und Vampire
22.4 Biosynthese und Abbau von Nukleotiden

23. Hormonelle Regulation und Integration des Säugetierstoffwechsels
23.1 Hormone: Vielfältige Strukturen für vielfältige Funktionen
Kasten 23–1 Medizin: Wie wird ein Hormon entdeckt? Der beschwerliche Weg zu gereinigtem Insulin
23.2 Gewebespezifischer Stoffwechsel: Die Arbeitsteilung
Kasten 23–2 Kreatin und Kreatinkinase: Unschätzbare diagnostische Hilfsmittel und die Freunde des Muskelaufbaus
23.3 Hormonelle Regulation des Kraftstoffstoffwechsels
23.4 Fettleibigkeit und die Regulierung der Körpermasse
23.5 Fettleibigkeit, das metabolische Syndrom und Typ-2-Diabetes

24. Gene und Chromosomen
24.1 Chromosomale Elemente
24.2 DNA-Supercoiling
Kasten 24–1 Medizin: Heilung von Krankheiten durch Hemmung von Topoisomerasen
24.3 Die Struktur der Chromosomen
Kasten 24–2 Medizin: Epigenetik, Nukleosomenstruktur und Histonvarianten

25. DNA-Stoffwechsel
25.1 DNA-Replikation
25.2 DNA-Reparatur
Kasten 25–1 Medizin: DNA-Reparatur und Krebs
25.3 DNA-Rekombination
Kasten 25–2 Medizin: Warum die richtige chromosomale Segregation wichtig ist

26. RNA-Stoffwechsel
26.1 DNA-abhängige Synthese von RNA
Kasten 26–1 Methoden: RNA-Polymerase hinterlässt ihren Fußabdruck auf einem Promotor
26.2 RNA-Verarbeitung
26.3 RNA-abhängige Synthese von RNA und DNA
Kasten 26–2 Medizin: Bekämpfung von AIDS mit Inhibitoren der HIV-Reversen Transkriptase
Kasten 26–3 Methoden: Die SELEX-Methode zur Generierung von RNA-Polymeren mit neuen Funktionen
Kasten 26–4 Ein expandierendes RNA-Universum, gefüllt mit TUF-RNAs

27. Proteinstoffwechsel
27.1 Der genetische Code
Kasten 27–1 Ausnahmen, die die Regel bestätigen: Natürliche Variationen im genetischen Code
27.2 Proteinsynthese
Kasten 27–2 Von einer RNA-Welt zu einer Proteinwelt
Kasten 27–3 Natürliche und unnatürliche Erweiterung des genetischen Codes
Kasten 27–4 Induzierte Variation im genetischen Code: Unsinn-Unterdrückung
27.3 Protein-Targeting und -Abbau

28. Regulation der Genexpression
28.1 Prinzipien der Genregulation
28.2 Regulation der Genexpression in Bakterien
28.3 Regulation der Genexpression in Eukaryoten
Kasten 28-1 Von Flossen, Flügeln, Schnäbeln und Dingen

Anhang A Häufige Abkürzungen in der biochemischen Forschungsliteratur
Anhang B Abgekürzte Lösungen für Probleme
Glossar
Credits
Index


Was ist inbegriffen?

Zusätzlich zu alle Texte des Europäischen Arzneibuchs sind enthalten, enthält die Neuauflage außerdem:

  • 27 neue BP-Monographien, 39 neue Ph. Eur. Monographien
  • 117 geänderte BP-Monographien
  • Vier neue Monographien für nicht lizenzierte Formulierungen und zwei neue Monographien für pflanzliche Präparate
  • Zwei neue Monographien für biologische Arzneimittel
  • Eine neue und sechs geänderte BP Veterinary Monographien
  • Alle Monographien der Ph. Eur. 9. Auflage und Nachträge 9.1 bis 9.5
  • Drei Online- und Offline-Download-Produktupdates im Jahr zur Integration der Ph. Eur. Ergänzungen 9.6, 9.7 und 9.8

Stellen Sie sicher, dass Sie den bestmöglichen Zugang zu den Informationen erhalten, die Sie benötigen. Der BP wird in einer Reihe von flexiblen Lizenzen und Formaten – einschließlich vollständiger Online-Zugriff – angeboten, aus denen Sie auswählen können.

Das BP 2019 Komplettpaket

Sechsbändige gedruckte Ausgabe, darunter das BP (Veterinary) 2019

Einzelplatz-Online-Lizenz*

Einzelbenutzer-Download zur Offline-Nutzung*

Erscheinungsdatum: 15. April 2001 | ISBN-10: 0865428719 | ISBN-13: 978-0865428713 | Auflage: 2

Blackwell Publishing freut sich bekannt zu geben, dass dieses Buch beim BMA Medical Book Competition 2004 mit einer hohen Empfehlung ausgezeichnet wurde. Hier die Zusammenfassung der Jury zu diesem Buch:

"Dies ist ein technisches Buch zu einem technischen Thema, aber auf eine reizvolle Art und Weise präsentiert. Es gibt viele Bücher über Statistik für Ärzte, aber es gibt nur wenige, die ausgezeichnet sind, und dies ist sicherlich eines davon. Statistik ist kein einfaches Fach zu lehren oder zu schreiben über. Den Autoren ist es gelungen, ein Buch zu erstellen, das so gut wie möglich ist. Für den interessierten Studenten, der kein Buch für Mathematiker möchte, ist dies ein ausgezeichnetes erstes Buch über medizinische Statistik."

Essential Medical Statistics ist ein Klassiker unter den medizinischen Statistikern. Als einführendes Lehrbuch präsentiert es Statistik mit einer Klarheit und Logik, die das Thema entmystifiziert und gleichzeitig sowohl fortgeschrittene als auch grundlegende Methoden umfassend behandelt.

Die zweite Ausgabe von Essential Medical Statistics wurde umfassend überarbeitet und aktualisiert, um moderne statistische Methoden und moderne Ansätze der statistischen Analyse einzubeziehen, während der zugängliche und nicht mathematische Stil der ersten Ausgabe beibehalten wurde.Das Buch umfasst jetzt eine vollständige Abdeckung der am häufigsten verwendeten Regressionsmodelle, multiple lineare Regression, logistische Regression, Poisson-Regression und Cox-Regression sowie ein Kapitel über allgemeine Fragen der Regressionsmodellierung. Darüber hinaus werden in neuen Kapiteln weiterführende Themen wie Metaanalyse, Wahrscheinlichkeit, Bootstrapping und robuste Standardfehler sowie die Analyse geclusterter Daten vorgestellt.

Das Buch richtet sich an Studierende der medizinischen Statistik, Medizinforscher, Praktiker im öffentlichen Gesundheitswesen und praktizierende Kliniker, die Statistiken in ihrer täglichen Arbeit verwenden, und ist sowohl als Lehr- als auch als Nachschlagewerk konzipiert. Das Format des Buches ist klar mit hervorgehobenen Formeln und ausgearbeiteten Beispielen, so dass alle Konzepte einfach, praktisch und leicht verständlich dargestellt werden. Die zweite Auflage verstärkt die Betonung der Wahl geeigneter Methoden mit neuen Kapiteln zu Analysestrategien und Assoziations- und Wirkungsmaßen.

Seit der Veröffentlichung der Erstausgabe im Jahr 1999 wurde dieses Buch von den Fakultäten vieler Universitäten im In- und Ausland akzeptiert. Es ist bei Medizin-, Zahn- und Paramedizinstudenten wegen seiner eleganten Präsentation, einfachen Sprache und klaren Illustrationen mit Diagrammen, Flussdiagrammen und Tabellen beliebt. Die Autoren haben gemeinsame Anstrengungen unternommen, um den Inhalt zu verbessern und die Informationen in jeder nachfolgenden Ausgabe dieses Buches zu aktualisieren. Diese sechste Auflage mit neu formatierten und aktualisierten Tabellen, Flussdiagrammen und selbsterklärenden Diagrammen hilft den Studierenden beim besseren Verständnis und bei der Leistung in verschiedenen Prüfungsformen. Klinische Physiologie mit aktualisierten Informationen in dieser Ausgabe wird den Studierenden in hohem Maße zu ihrem klinischen Wissen verhelfen.

Das Buch ist weitgehend auf die breiten und spezifischen Bedürfnisse der Bachelor-Studenten ausgerichtet, wobei Einfachheit und Klarheit betont wurden. Die Studierenden können sich die logische Reihenfolge, in der die Fächer präsentiert wurden, leicht aneignen, damit sie nicht nur dasselbe verstehen, sondern auch in den verschiedenen Arten von objektiven und routinemäßigen Prüfungen gut abschneiden. Mehrere leicht verständliche Diagramme und Tabellen wurden eingefügt, um das Verständnis und die Überarbeitung des Themas zu erleichtern. Angewandte Physiologie, klinische Bedeutung und veränderte Situationen in der Pädiatrie, Geriatrie und Schwangerschaft wurden gut herausgearbeitet. Der Ansatz im Umgang mit dem Thema Physiologie würde auch von anderen Lehrern geschätzt.

Wie viele andere erfolgreiche Lehrbücher ist auch dieses Buch reibungslos, fruchtbar und erfolgreich durch die Jahre gesegelt. Vielleicht liegt es daran, dass es die Bedürfnisse jeder Lesergruppe erfüllt. Die Studierenden sind glücklich, weil es beim Lesen studentenfreundlich und beim Überarbeiten prüfungsfreundlich ist. Wissenssuchende sind glücklich, weil sie die aktuellen und neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der Physiologie erhalten. Ärzte sind zufrieden, weil angewandte Aspekte ausreichend abgedeckt werden.

Das Skript des Buches ist so formatiert, dass es nicht nur für Medizinstudenten, sondern auch für Studenten der Zahnmedizin und die Studenten verwandter Gesundheitsfächer wie Physiotherapie, Ergotherapie, Pharmazie, Krankenpflege, Sprechen, Hören und Sprache geeignet ist. usw. Dieses in Lehrbuchform verfasste Buch umfasst die Kenntnisse der Grundprinzipien der Physiologie in jedem System. Es wird auch versucht, die angewandte Physiologie in jedem System zu beschreiben. Um eine Vorstellung von den zu untersuchenden Themen zu geben, sind die Themen am Anfang jedes Kapitels aufgeführt. Die meisten Abbildungen sind in schematischer Form dargestellt, damit die Schüler die Fakten verstehen und wiedergeben können. Die zu den einzelnen Abschnitten gegebenen wahrscheinlichen Fragen helfen den Studierenden bei der Prüfungsvorbereitung. Es ist jedoch ideal für die Schüler, jeden Abschnitt gründlich zu lesen, bevor sie sich den Fragen widmen.

Mehr als zwei Millionen Medizinstudenten, Ärzte und andere Angehörige der Gesundheitsberufe auf der ganzen Welt besitzen seit der ersten Veröffentlichung ein Exemplar von Davidsons Principles and Practice of Medicine. In seiner 23. Auflage beschreibt dieses Lehrbuch die Pathophysiologie und die klinischen Merkmale der am häufigsten auftretenden Erkrankungen in den großen Fachgebieten der Erwachsenenmedizin und erklärt, wie sie erkannt, untersucht, diagnostiziert und behandelt werden können. Ausgehend von Sir Stanley Davidsons vielbewunderten Vorlesungsnotizen hat Davidsons Bestand, weil er mit der Lehre der modernen Medizin Schritt hält und eine Fülle von Informationen in einem leicht lesbaren, prägnanten und schön illustrierten Format bietet.

Dieses Buch wird den Lesern überall als Kerntext dienen, der die medizinische Wissenschaft mit der klinischen Medizin verbindet und Schlüsselwissen und praktische Ratschläge in einem leicht zugänglichen und lesbaren Format vermittelt.

HauptmerkmaleDer einleitende Abschnitt beschreibt die Grundlagen der Genetik, Immunologie, Infektionskrankheiten und Bevölkerungsgesundheit und diskutiert die Grundprinzipien der klinischen Entscheidungsfindung und der guten Verschreibung. Ein neuer zweiter Abschnitt zur Notfall- und Intensivmedizin umfasst Vergiftungen, Vergiftungen und Umweltmedizin, und leitet ein neues Kapitel über Akutmedizin und Critical Illness ein. Der dritte Abschnitt umfasst die wichtigsten medizinischen Fachgebiete, die jeweils gründlich überarbeitet und auf den neuesten Stand gebracht wurden. Zwei neue Kapitel zur Mutter- und Jugendmedizin/Übergangsmedizin ergänzen das Kapitel zu Alter und Krankheit.

Ein neues Kapitel zur medizinischen Augenheilkunde wurde aufgenommen. Übersichten über klinische Untersuchungen fassen die Hauptelemente für jedes System zusammen und sind jetzt in den Kapiteln Biochemie, Ernährung und Dermatologie enthalten. Die Abschnitte „Präsentation von Problemen“ bieten einen klaren Weg für die Bewertung eines Ansatzes für die häufigsten Beschwerden in jedem Fachgebiet. Zusammenfassungen von Practice Points beschreiben die praktischen Fähigkeiten, die Medizinstudenten und Assistenzärzte erwerben müssen. Notfallboxen betonen das Kernwissen, das für die Behandlung akut erkrankter Patienten benötigt wird. Boxen im Alter, in der Schwangerschaft und im Jugendalter zeigen Unterschiede in der ärztlichen Praxis dieser Patientengruppen auf und verdeutlichen die Schnittstellen zwischen medizinischen, geburtshilflichen und pädiatrischen Leistungen.

Der Text ist umfangreich illustriert, mit über 1000 Diagrammen, klinischen Fotografien sowie radiologischen und pathologischen Bildern. Die globale Perspektive wird durch ein internationales Beratungsgremium mit Experten aus 17 Ländern und Autoren aus der ganzen Welt erweitert.


Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust [109838/Z/15/Z], dem Engineering and Physical Science Research Council [EP/R041628/1] und dem Department of Bioengineering am Imperial College London unterstützt. NEIN. dankt für die Unterstützung durch ein TECNIOSspring PLUS-Postdoktorandenstipendium, das Teil des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Skłodowska-Curie-Stipendienvereinbarung Nr. 712949. Die Massenspektrometrie wurde teilweise in der CISBIO-Massenspektrometrie-Kernanlage unter der Leitung von Dr. Paul Hitchen am Imperial College London durchgeführt. WIE. und B.D.A. konzipiert und gestaltet die Forschung. WIE. entwickelte die TrAP-Plattform und führte die Proof-of-Concept-Experimente durch. NEIN. und F.J.E. führten die zellselektiven Aktivierungsexperimente durch. A.S., N.O., F.J.E. und B.D.A. die Daten analysiert. A.S., N.O., F.J.E. und B.D.A. schrieb das Papier.

WIE. und B.D.A. haben eine internationale Patentanmeldung für die TrAP-Plattformtechnologie [WO2018055360A1].

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Diskussion

Es bestehen starke reziproke Wechselwirkungen zwischen Tumormonozyten/Makrophagen und Tumorblut/Lymphgefäßen. TAMs und TEMs sind an der Angiogenese, an der Lymphangiogenese und an mehreren Metastasierungsschritten beteiligt, während Blutgefäße an der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen/TEMs in Tumoren und an der Makrophagen-Polarisation zum protumoralen M2-Phänotyp beteiligt sind. In den letzten Jahren wurden viele Entdeckungen über die Auswirkungen von Blutgefäßen auf die Polarisation von Makrophagen gemacht, obwohl noch Forschungsbedarf besteht. IMs fördern das Tumorwachstum und die Metastasierung. Umgekehrt verhindern nicht-klassische Monozyten der Maus Lungenmetastasen, während nicht-klassische Monozyten des Menschen die Angiogenese fördern in vitro. Da humane und murine Monozyten funktionelle Unterschiede aufweisen, wäre es interessant, besser zu verstehen, wie diese Monozyten Metastasen verhindern, und zu bestätigen, dass humane nicht-klassische Monozyten ähnliche Wirkungen auf Tumormetastasen haben. Darüber hinaus wäre es interessant zu wissen, welchen Einfluss nicht-klassische Monozyten auf die Tumorangiogenese haben in vivo und Mechanismen, die ihre Infiltration in Tumoren regulieren, besser zu verstehen. Die Verbesserung des Wissens über die Physiologie von Tumorblutgefäßen und TAMs führte zur Entwicklung mehrerer Therapien. Einige Therapien richten sich ausschließlich gegen TAMs mit dem Ziel, das TAM-Überleben und die TAM-Rekrutierung (CCL2/CCR2 oder CSF1/CSF1R-Hemmung) zu verringern oder eine Reprogrammierung von TAMs vom M2-Phänotyp zum M1-Phänotyp zu induzieren [208, 209]. Andererseits zielen einige Therapien nur auf Tumorblutgefäße ab und zielen darauf ab, die Angiogenese zu hemmen, die Integrität der Endothelverbindung zu verbessern, die Tumorperfusion zu verbessern oder die Gefäßnormalisierung zu fördern [210]. In jüngerer Zeit wurden viele Untersuchungen zur Kombination von antiangiogenen Medikamenten und Immuntherapien durchgeführt, und einige davon befinden sich derzeit in klinischen Studien (Übersicht in [211, 212]). Anti-angiogene Therapien haben positive Auswirkungen auf die Immuntherapie und umgekehrt. Im Zusammenhang mit diesem Review induziert die Kombination von Ang-2- und VEGF-Hemmung die Normalisierung der Tumorvaskulatur und fördert die TAM-Reprogrammierung vom M2- zum M1-Phänotyp und erhöht somit das M1/M2-Verhältnis und das Gesamtüberleben in Sarkom- und GBM-Mausmodellen [ 81, 213, 214]. In jüngerer Zeit wurde die duale Ang-2/VEGF-Hemmung mit CD40- oder PD-1-Immuntherapien kombiniert und zeigte starke synergistische Effekte in Bezug auf Tumorwachstum, Gesamtüberleben und Immunzellaktivierung in mehreren Maustumormodellen [94, 215] . Interessanterweise befindet sich die Kombination von Ang-2/VEGF mit PD-L1- oder CD40-Immuntherapien derzeit in klinischen Studien (NCT01688206 NCT02665416). Zusammenfassend führt das verbesserte Wissen über tumorassoziierte Monozyten/Makrophagen und Tumorblutgefäße zur Entwicklung neuer vielversprechender und innovativer therapeutischer Strategien, die das Gesamtüberleben der Patienten verbessern könnten. Nichtsdestotrotz besteht noch Forschungsbedarf zu diesem Thema, um das Patientenergebnis zu verbessern und die Nebenwirkungen der Behandlungen zu verringern.


Mechanobiologische Reaktionen von Stammzellen auf biophysikalische und biomechanische Hinweise

Biomaterialmatrizen können die Pluripotenz aufrechterhalten und die Differenzierung unterdrücken oder können verwendet werden, um die Differenzierung zu fördern (Engler et al., 2006 Khatiwala et al., 2006). Biomaterialien können aus natürlichen Polymeren (Kollagen, Hydroxyapatit, Alginat, Chitosan oder Cellulosederivate) oder synthetischen Polymeren (Polyvinylalkohol, Polyethylenglykole (PEG), Poly(lactid-coglycolid)) hergestellt werden (Vinatier et al., 2009). Die Wahl des Biomaterials ist entscheidend für das Zellverhalten, und eine Vielzahl von Studien hat versucht, spezifische Eigenschaften des Biomaterials zu identifizieren, einschließlich Zusammensetzung, Oberflächentopographie, Ligandenverfügbarkeit und mechanische Eigenschaften, die die Zellmigration, Proliferation, Differenzierung und Lebensfähigkeit beeinflussen (Tabelle 1) (Engler et al., 2006 Hübsch et al., 2010 Abdeen et al., 2016). Mechanische Stimulation spielt auch eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Antworten von Stammzellen in vitro (Rubin et al., 2007 Sen et al., 2008 Arnsdorf et al., 2009 Potier et al., 2010 Case et al., 2011 Gurkan et al., 2011).

Tabelle 1. Schlüsselstudien zum Einfluss von 2D-Substratsteifigkeit, Substratdicke, Substratsteifigkeitsgradienten und 3D-Biomaterialsteifigkeit auf das Stammzellverhalten.

Die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien wurden auf verschiedene Weise charakterisiert, beispielsweise durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM wird häufig verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von weichen biologischen Substraten, Geweben und Zellen zu charakterisieren (Engler et al., 2006 Evans et al., 2009 Huang et al., 2013 Mullen et al., 2013, 2014, 2015 Pietuch und Janshoff , 2013 Wen et al., 2014 Mc Garrigle et al., 2016).

2D-Substrate

Die biophysikalischen Eigenschaften von Biomaterialsubstraten wurden mit zahlreichen Methoden untersucht, um ein Verständnis spezifischer Eigenschaften abzuleiten, die das Verhalten von Stammzellen steuern könnten. Viele Forscher haben gezeigt, dass die Differenzierung, Morphologie und Beweglichkeit von Stammzelltypen von der Steifigkeit der Substrate bestimmt wird, auf die die Zellen ausgesät werden. Zum Beispiel erhöhten sich aus der Aorta stammende glatte Muskelzellen mit erhöhter Steifheit (Engler et al., 2004). In einer anderen Studie zeigten gemusterte menschliche Kardiomyozyten, die aus pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) differenziert waren, eine verbesserte kontraktile Aktivität, wenn sie auf Substraten mit physiologischer Steifheit kultiviert wurden (Ribeiro et al., 2015).

Substratsteifigkeit

Vernetzung während der Polymerisation

Die biochemische Vernetzung mit EDAC bildet Isopeptidbindungen zwischen Carboxyl- und Aminogruppen aus verschiedenen Resten in direktem Kontakt. Mehrere Studien haben Typ-I-Rattenschwanzkollagen mit EDAC vernetzt, um Substrate mit unterschiedlicher mechanischer Steifigkeit, aber identischer Ligandendichte herzustellen (Tierney et al., 2009 Keogh et al., 2010 Haugh et al., 2011 Mullen et al., 2013, 2015 Mc Garrigle et al., 2016). Eine Studie zeigte Osteoblastendifferenzierung auf Substraten von 1 kPa und Osteoblastendifferenzierung, gefolgt von einer frühen Osteozytendifferenzierung auf weicheren Substraten von 300 Pa (Mullen et al., 2013).

Eine veränderte Steifigkeit von Polyacrylamid (PA) kann durch Variation des Anteils von Acrylamid und Bisacrylamid im Polymerisationsprozess erreicht werden (Wang und Pelham, 1998 Tse und Engler, 2001 Engler et al., 2006 Lee et al., 2013, 2014) . MSCs, die auf steifen PA-Substraten (15 kPa) kultiviert wurden, zeigen eine höhere Expression von glatten Muskelzellen (SMC)-Markern (α-Actin, Calponin-1), während MSCs, die auf weichen PA-Substraten (1 kPa) kultiviert wurden, eine erhöhte chondrogene (Kollagen-II) und adipogene (LPL) Markerexpression (Park et al., 2011). Dieselbe Studie versuchte, die Wirkung der Matrixsteifigkeit auf die Differenzierung von MSC als Reaktion auf den transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGF-β) zu verstehen. TGF-β erhöhte die Expression von SMC-Markern auf steifen Substraten und erhöhte die chondrogene Markerexpression auf weichen Substraten, unterdrückte jedoch die Expression adipogener Marker auf weichen Substraten. Eine andere Studie maß sowohl das gezeigte Peptid auf Zellen als auch die mechanischen Eigenschaften des Substrats und erzeugte auf diese Weise PA-Hydrogele, die menschliche ESC (hESC) Oberflächen-GAGs binden (Musah et al., 2012). Sie zeigten, dass hESCs auf mechanische Informationen reagieren können, die über GAG-Eingriff übertragen werden, und dass steife Matrizen (10 kPa) die YAP/TAZ-Kernlokalisation aktivierten, während dies auf weicheren (0,7 kPa) Substraten nicht beobachtet wurde. Es wurde vorgeschlagen, dass steife Substrate für die langfristige Selbsterneuerung von hESCs effektiver sind. In einer anderen Studie wurde die osteogene Differenzierung von BMSCs auf steifem Substrat (15� kPa) durch die Verarmung von YAP und TAZ, Kultivierung von Zellen auf weichem Substrat (0,7𠄱 kPa) oder Inkubation mit einem Rho-Inhibitor (C3) gehemmt (Dupont et al.). al., 2011). Interessanterweise ermöglichte der Knockdown von YAP und TAZ eine adipogene Differenzierung auf steifen Substraten durch Nachahmung einer weichen Umgebung.

Die Vernetzung von Polyethylenglykolen ist mit der Zellverkapselung und der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit kompatibel, was die Abstimmung der mechanischen Eigenschaften in Gegenwart lebender Zellen erleichtert (Liang et al., 2011). Der Ansatz beinhaltet die Kombination unterschiedlicher Mengen an PEG𢄭iacrylat (PEGDA) mit nicht acryliertem PEG, und die Substrate müssen modifiziert oder beschichtet werden, um eine Zellanhaftung zu ermöglichen. Zur Nachahmung wurde eine dynamische Substratversteifung implementiert in vivo Änderungen der zeitlichen Steifigkeit, mittels thiolierter Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele, die mit PEGDA vernetzt sind, wobei ihre Steifigkeit durch variierendes Molekulargewicht des Vernetzers moduliert wurde (Young und Engler, 2011). Kollagenbeschichtete HA-Hydrogele, die mit Präkardialen Zellen beimpft wurden, erhöhten die Expression von reifen Herzmarkern und bildeten mehr reife Muskelfasern als wenn sie auf nachgiebigen PA-Hydrogelen gezüchtet wurden.

Embryonale Stammzellen wurden auf Kollagen I-beschichteten PDMS-Substraten mit unterschiedlicher Steifigkeit (0,041𠄲,7 MPa) gezüchtet, die durch unterschiedliche Vernetzerkonzentrationen (1�% (w/w)) erreicht wurden. Es wurde berichtet, dass die osteogene Differenzierung (OPN- und RUNX2-Expression) und die Mineralisierung durch ESCs auf steifen Substraten (Ϣ.3 MPa) im Vergleich zu weichen Substraten (0,04𠄱,9 MPa) verbessert wurden (Evans et al., 2009 ) und Gene, die in der frühen Mesendoderm-Differenzierung exprimiert wurden, wurden ebenfalls hochreguliert. Die Zellausbreitung und das Zellwachstum nahmen als Funktion der Substratsteifigkeit zu, während die Zellanhaftung nicht beeinflusst wurde.

Humane HSCs, die auf Tropoelastin-Substraten (Steifigkeit nicht berichtet) kultiviert wurden, verstärkten die Expansion und Erhaltung undifferenzierter Zellen (Holst et al., 2010). Wenn die Substrate mit Glutaraldehyd in Konzentrationen von mehr als 0,1% vernetzt wurden, um die Elastizität zu verändern (nicht berichtet), gingen die biologischen Wirkungen von Tropoelastin verloren und die Hemmung der Mechanotransduktion hob diese Wirkungen ebenfalls auf.

Andere Polymere einschließlich Poly(propylenfumarat) (PPF) (Payne et al., 2002) und Polymethylmethacrylat (PMMA) (Dalby et al., 2007) wurden ebenfalls verwendet, deren Steifigkeit durch Vernetzung während der Polymerisation kontrolliert werden kann Prozess.

Photopolymerisation

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen, die auf photopolymerisierbaren Methacrylamid-Chitosan-Substraten kultiviert wurden, erwiesen sich auf weichen Substraten (㰐 kPa) als am proliferativsten. Die neuronale Differenzierung wurde auf weichen Oberflächen begünstigt (ρ kPa), während die Oligodendrozytendifferenzierung auf steiferen Oberflächen (ϧ kPa) auftrat (Leipzig und Shoichet, 2009). Eine Astrozytendifferenzierung wurde nur in einem kleinen Prozentsatz auf Substraten unter 1 und 3,5 kPa beobachtet.

Ligandenverfügbarkeit

Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix kann auch durch Beschichten zytotoxischer Polymere mit zelladhäsiven Liganden wie Kollagen (Evans et al., 2009), Laminin (Rowlands et al., 2008) und Fibronektin (Rowlands et al., 2008 Altmann et al., 2011). Die Differenzierung von MSCs, die auf Kollagen-I-Substraten mit unterschiedlichen Ligandenbeschichtungen kultiviert wurden, wurde untersucht (Rowlands et al., 2008). Die osteogene Differenzierung (RUNX2-Expression) nahm mit der Substratsteifigkeit zu (von 0,7 kPa auf 80 kPa) und trat signifikant nur auf Kollagen I-beschichteten PA-Gelen mit hoher Steifigkeit (80 kPa) auf, während Substrate mit Kollagen IV, Fibronektin oder Laminin I stimulierte die osteogene Differenzierung, wenn die Steifigkeit in der Größenordnung von 25 kPa lag. Die myogene Differenzierung trat bei allen Gel-Protein-Kombinationen auf, die eine Steifigkeit von mehr als 9 kPa aufwiesen, aber bei mit Fibronektin beschichteten Gelen mit einem Modul von 25 kPa ihren Höhepunkt erreichten. Eine andere Studie berichtete, dass die Erhöhung der ECM-Steifigkeit von mit Matrigel beschichteten PA-Hydrogelen in vitro erhöht die hPSC- und Kolonieausbreitungsfläche, veränderte jedoch nicht die Selbsterneuerung (Keung et al., 2012), was im Gegensatz zu den Ergebnissen bei mESCs steht. Weiche Matrizen (100 – 700 Pa) förderten die Expression von frühen neuralen Ektodermmarkern und nachgelagerte Zunahmen der Gesamtneuronen und dopaminergen Neuronen. Eine kürzlich durchgeführte Studie untersuchte die Auswirkungen unterschiedlicher Steifigkeit (3 und 38 kPa), ECM-Typ und Ligandendichte auf die YAP-Kerntranslokation in hMSCs unter Verwendung von mit Liganden (Fibronektin, Kollagen I, Kollagen IV und Laminin) beschichteten PA-Substraten (Stanton et al., 2019 .). ). Auf steifen Hydrogelen (38 kPa) führte eine niedrige Ligandendichte (5 μg/ml) zu einer YAP-Kerntranslokation für mit Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV beschichtete PA-Substrate, wohingegen eine hohe Ligandendichte (20 μg/ml) erforderlich war für YAP-Kerntranslokation auf lamininbeschichteten PA-Substraten. Darüber hinaus führte die zytoplasmatische YAP-Lokalisierung, die bei niedrigen Ligandendichten von Kollagen I oder Fibronektin-beschichteten steifen Hydrogelen beobachtet wurde, zu einer geringen osteogenen Bindung (zytoplasmatisches RUNX2 und niedrige ALP-Expression). Im Gegensatz dazu führte die nukleäre YAP-Lokalisierung zu einer nuklearen RUNX2-Lokalisierung und höheren Niveaus der ALP-Expression für alle ECM-beschichteten steifen Hydrogele mit hoher Ligandendichte mit Ausnahme von Kollagen IV.

Eine abstimmbare PEG-Hydrogel-Plattform mit einer Reihe von Steifigkeiten (2� kPa) wurde entwickelt, indem der Prozentsatz des PEG-Polymers (𢏂,8𠄷,5 % w/v) in der Vorläuferlösung verändert wurde (Gilbert et al. , 2010) und anschließend wurde Laminin als kovalent mit dem Hydrogelnetzwerk vernetzter Adhäsionsligand verwendet. Skelettmuskelstammzellen (SMSCs), die auf weichen PEG-Hydrogelen (12 kPa) kultiviert wurden, mit einer Steifheit nahe der nativen Muskelelastizität, förderten die Selbsterneuerung in vitro und verbesserte Muskelregeneration bei Transplantation in Mäuse. Dies wurde bei steifem Gewebekulturkunststoff (� kPa) nicht beobachtet. Auf diese Weise wurde gezeigt, dass die Substratelastizität ein potenter Regulator des Schicksals von SMSCs in Kultur ist. Darüber hinaus erhöhte sich die Migrationsgeschwindigkeit der Stammzellen (120 μm/h), wenn sie auf den steifen PEG-Hydrogelen kultiviert wurden im Vergleich zu weicheren Matrices (99 μm/h) (Abbildung 3). Eine Studie berichtete, dass die Koloniebildung durch hESCs stärker durch die Benetzbarkeit moduliert wird als durch die Variation der Elastizitätsmodule (Mei et al., 2010). Die räumliche Organisation von hMSCs wurde an PEG-Hydrogelen unterschiedlicher Substratsteifigkeit (weich (7,4�,2 kPa) und steif (27,3�.8 kPa)) und Ligandenpräsentation (variierende RGD-Konzentrationen (0,05𠄲. 5 mM)) (Chahal et al., 2018). Unabhängig von der RGD-Konzentration und -Isoform gruppierten sich hMSCs auf weichen PEG-Hydrogelen mit reduzierter Zellanhaftung und Ausbreitungsfläche. Bei RGD-Konzentrationen von mehr als 0,5 mM breiten sich auf steifen Hydrogelen ausgesäte hMSCs mit hoher räumlicher Abdeckung aus. Daher wurde vorgeschlagen, dass sowohl die Hydrogelsteifigkeit als auch die Ligandenpräsentation wichtige Faktoren bei der Regulierung der hMSC-Organisation sind.

Figur 3. (EIN) Die mechanischen Eigenschaften von PEG-Hydrogelen wurden durch die Variation der Konzentration des Vorläuferpolymers verändert. (B) Geschwindigkeit von Skelettmuskelstammzellen, die auf weichem PEG-Hydrogel (12 kPa) oder starrem Zellkulturkunststoff (106 kPa) kultiviert wurden. (C) Anzahl der Skelettmuskelstämme (normalisiert), die über 70 h auf weichem (12 kPa) oder starrem Substrat (106 kPa) kultiviert wurden. Mit freundlicher Genehmigung von Gilbert et al. (2010). ***P < 0,0001.

In einer anderen Studie zeigte hMSC-geimpftes kollagenbeschichtetes PDMS mit einer Reihe von Steifigkeiten (weich, 0,07𠄰,10 kPa, steif, 2,15𠄲,40 MPa) eine verminderte Zellkontraktilität auf weichen Substraten von hydrophobem PDMS und hydrophilem Polyethylen. Oxid-PDMS (PEO-PDMS). Zellspreizung und osteogene Differenzierung traten jedoch nur bei weichem hydrophobem PDMS und nicht bei weichem hydrophilem PEO-PDMS (Elastizitätsmodul < 1 kPa) auf (Razafiarison et al., 2018).

Kohlenstoff-Nanoröhren

Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) haben eine hohe Steifigkeit mit einem Young’s-Modul von ungefähr 1 TPa (Treacy et al., 1996 Wong et al., 1997). CNTs haben aufgrund ihrer guten Festigkeit, Elastizität und Ermüdungsbeständigkeit, ihrer 3D-porösen Struktur, ihrer vernetzten Nanonetzwerkstruktur und geeignete Porosität, ihre kontrollierbare elektrische Leitfähigkeit und ihre zylindrische Form und nanoskalige Dimensionalität. Eine Studie zeigte, dass Ratten-BMSCs, die auf einer dicht mit Kohlenstoffnanoröhren beschichteten Glasoberfläche inkubiert wurden, eine hohe ALP-Aktivität, eine Hochregulierung von osteogenen Markern (BMP2, RUNX2, ALP1 und OCN) und einen erhöhten Kalziumgehalt aufweisen (Mori et al., 2020). Die neuere Anwendung von CNT für das Tissue Engineering durch Stammzelldifferenzierung wird in einem Übersichtsartikel ausführlich diskutiert (Lee et al., 2015).

Substratdicke

Die Substratdicke wurde als Methode zur Variation der lokalen Steifigkeit der Zelle verwendet (Sen et al., 2009 Leong et al., 2010). Der mechanische Einfluss der Substratdicke hängt mit der Zellkontraktilität zusammen, wobei sich bei dünnen Substraten (υ μm) die von den Zellen erzeugten Kontraktionskräfte über das gesamte Substrat ausbreiten können und in diesen Fällen das darunter liegende Material die mechanische Umgebung bestimmt, die der Zellen und damit das Zellverhalten. Auf dickeren Substraten können sich die Kräfte nicht durch das Substrat ausbreiten und somit wird das Zellverhalten von den Substratmaterialeigenschaften bestimmt. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Rolle der Substratsteifigkeit, ohne die Substratzusammensetzung zu ändern. Der Effekt der Substratsteifigkeit wurde in einer solchen Studie gezeigt, die die Differenzierung von MSCs in verschiedene Phänotypen untersuchte, wenn sie auf PA-Substraten unterschiedlicher Steifigkeit (0,1 – 40 kPa) kultiviert wurden, die durch Variation der Substratdicke erreicht wurden (Engler et al., 2006). Es wurde festgestellt, dass Zellen auf den weichsten Substraten (0,1 – 1 kPa) Gehirnneuritenzellen nachahmen, was eine verzweigte Morphologie zeigt. Diejenigen, die auf Substraten mit mittlerer Steifigkeit (8 – 15 kPa), ähnlich wie Muskelgewebe, kultiviert wurden, zeigten eine spindelähnliche Morphologie, während MSCs auf Substraten kultiviert wurden, die nicht mineralisiertem Osteoid ähnlich sind (15 – 40 kPa), entwickelten sie sich eine Ausbreitungsmorphologie ähnlich der von Osteoblasten. Die Differenzierungsprofile wurden durch Hochregulation von neurogenen, myogenen bzw. osteogenen spezifischen Markern bestätigt. In einer anderen Studie, die den Effekt der Substratsteifigkeit durch Variation der Substratdicke untersuchte, wurde gezeigt, dass MSCs, die auf kollagenbeschichteten PA-Gelen von 0,5 mm kultiviert wurden, dieselbe Ausbreitungsmorphologie aufwiesen wie diejenigen, die auf Kollagensubstraten von 34 kPa kultiviert wurden. Die auf dickeren Substraten (2 mm) mit identischer Zusammensetzung kultivierten MSCs verhalten sich ähnlich wie auf 1 kPa-Kollagengelen kultivierte MSCs (Amnon et al., 2010). Es wurde auch gezeigt, dass die Substratsteifigkeit die Differenzierung von MSCs beeinflusst, die auf Kollagen-I-Gelen mit unterschiedlicher Dicke (㸐 μm – 500 μm) ausgesät wurden. Es wurde gezeigt, dass MSCs auf weichen (dicken) Substraten ein niedrigeres Expressionsniveau von SMC-Markern (α-Actin und Calponin-1) aufwiesen als MSCs, die auf einem dünnen (steifen) Substrat gewachsen waren (Park et al., 2011). Chondrogener Marker (Kollagen II) in humanen MSCs, die auf dicken Gelen (weich) gezüchtet wurden, erhöht.

Keilförmige Gele wurden auch verwendet, um die Substratdicke zu variieren (Merkel et al., 2007 Rudnicki et al., 2013) und haben gezeigt, dass Zellfläche und Traktion von der Substratsteifigkeit beeinflusst werden. Die Substratmikrostruktur bestimmt jedoch auch die Wirkung der Substratdicke. Insbesondere wurde gezeigt, dass die fokale Adhäsionsfläche mit zunehmender Substratdicke (bis zu 5 μm Dicke) abnimmt und zellinduzierte Kräfte nur eine begrenzte Strecke (Mikrometer) durch lineare, homogene Substrate wie PA zurücklegen (Maloney et al. , 2008). Zellen auf faserigen Substraten können durch Strukturen beeinflusst werden, die bis zu 130 µm entfernt sind (Leong et al., 2010 Feng et al., 2013). Die faserige Natur biologischer Substrate ermöglicht es zellinduzierten Kräften, sich durch einzelne Fasern auszubreiten, um mit dem darunterliegenden Deckglas zu interagieren (Rudnicki et al., 2013).

Gradienten der Substratsteifigkeit

Es wurde festgestellt, dass Zellen in Bereiche höherer Steifigkeit wandern, ein Prozess, der als 𠇍urotaxis,” bekannt ist, und die fokale Adhäsionstraktion ist für diesen Prozess entscheidend (Plotnikov et al., 2012). Durotaxis ist der Begriff, der verwendet wird, um die Zellmigration zu beschreiben, die durch Steifigkeitsgradienten gesteuert wird, die sich aus den mikrostrukturellen Eigenschaften des Substrats ergeben, und beinhaltet typischerweise eine Zellmigration bevorzugt zu steiferen Substraten (Lo et al., 2000 Cukierman et al., 2001 Zamir und Geiger, 2001 Saez et al., 2005 Schwarz und Bischofs, 2005). Durch die Veränderung der differentiellen Diffusionsdistanz von Crosslinker und Monomer in ein PA-Hydrogel war es möglich, Substrate mit Steifigkeitsgradienten (0,5, 1,7, 2,9, 4,5, 6,8 und 8,2 kPa/mm) an der Grenzfläche Zelle/Matrix herzustellen. Die steifigkeitsabhängige Morphologie, Migration und Differenzierung menschlicher Fettstammzellen (hASC) wurde untersucht (Hadden et al., 2017). Es wurde festgestellt, dass Steifigkeitsgradienten von 2,9 kPa/mm nicht durotaktisch waren, während Durotaxis auf Matrizen mit Gradienten von 8,2 kPa/mm beobachtet wurde (Abbildung 4). Die mechanosensitiven Proteine ​​Lamin A/C, Lamin B, YAP und Myocardin-related Transcription Factor (MRTF-A) wurden analysiert. Die Lamin A-Expression skalierte dosisabhängig als Reaktion auf die Steifheit, und die Lamin A/Lamin B-Verhältnisse nahmen mit der Steifheit exponentiell zu. Es wurde bestätigt, dass die nukleäre Translokation von YAP für bestimmte Bereiche empfindlich auf Steifheit reagiert. Der MRTF-A wurde durch die Steifigkeit beeinflusst und erreichte einen Höchstwert von � kPa. Der adipogene Marker PPARγ war bei 3 kPa hochreguliert, der myogene Transkriptionsfaktor MyoD war bei 12 kPa hochreguliert, während der osteogene Marker CBFA1 bei 36 kPa am höchsten war.

Figur 4. (EIN) Menschliche ASC-Migration und (B) Geschwindigkeit/Geschwindigkeit auf 2,9 kPa/mm und 8,2-kPa/mm Steifigkeitsgradient Fibronektin-beschichteten PA-Gelen über 72 h. (C) Durchschnittliche Geschwindigkeit (xy) und x- und y-Geschwindigkeit über 72 h von hASCs auf Hydrogelen mit niedrigem (0,5 kPa/mm), mittlerem (1,7 kPa/mm) und hohem (2,9 kPa/mm) Steifigkeitsgradient. Mit freundlicher Genehmigung von Hadden et al. (2017). *P < 0,05, ***P < 0,001.

Humane MSCs wurden an Hydrogelen mit unterschiedlichen Steifigkeitsgradienten (0,04𠄱,6 kPa/μm) und unterschiedlicher absoluter Steifigkeit (2,5� kPa) untersucht, die mit photovernetzbaren Gelatinen hergestellt wurden (Moriyama und Kidoaki, 2019). Bei jeder Zunahme der absoluten Steifigkeit (2,5, 5 und 10 kPa) nahm auch der Schwellensteifigkeitsgradient (TG) zu (0,14, 1,0 bzw. 1,4 kPa/μm). Dies lag daran, dass die Zellen im steiferen Bereich stabilere fokale Adhäsionen bildeten, was durch Vinculin-Färbung bestätigt wurde. Sie kamen zu dem Schluss, dass der intrinsische Steifigkeitsgradient des Materials größer sein muss als die positionsabhängige Steifigkeit, um eine zelluläre Durotaxis zu induzieren.

Substratsteifigkeit und Porosität

Um die Rolle der Matrixanbindung, der Matrixporosität und der Matrixsteifigkeit für die Steuerung der Stammzelldifferenzierung zu entkoppeln, wurde in einer Studie die Substratporosität in PA-Gelen moduliert, ohne den Modul zu verändern (Wen et al., 2014). Es wurde gezeigt, dass eine Erhöhung der Konzentration des Bis-Acrylamid-Vernetzers Substrate mit einer Steifigkeit im Bereich von 4� kPa erreichen kann und auch, dass spezielle Formulierungen von Vernetzern die relative Porengröße verringern, ohne den Hydrogelmodul merklich zu verändern. Diese Studie berichtete, dass eine variierende Substratporosität durch Veränderung des Verhältnisses von Acrylamidmonomer und Bisacrylamid-Vernetzer die Matrixanbindung, Substratdeformationen oder das Differenzierungspotential von Stammzellen nicht signifikant veränderte. Darüber hinaus wurde die osteogene und adipogene Differenzierung durch Variation der Protein-Substrat-Linker-Dichte oder in Abwesenheit von Protein-Tethering nicht beeinflusst. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Matrixsteifigkeit die Stammzelldifferenzierung unabhängig von Proteinbindung und Porosität reguliert (Wen et al., 2014).

Eine weitere Studie versuchte, den kombinierten Einfluss von Matrixsteifigkeit und Porosität auf das Schicksal von humanen epidermalen Stammzellen und MSCs zu verstehen, indem sie auf kollagenbeschichteten PDMS-Oberflächen kultiviert wurden, die vernetzt wurden, um eine Bandbreite an Substratsteifigkeit (0,1 kPa – 2,3 MPa .) zu erreichen ) und PA-Hydrogeloberflächen unterschiedlicher Steifigkeit (0,5� kPa) (Trappmann et al., 2012). Für die PA-Oberflächen war die Porengröße umgekehrt mit der Steifigkeit korreliert, was zu erheblichen Unterschieden in der effektiven Porosität für die Substrate mit unterschiedlicher Steifigkeit führte (15 nm in 2 kPa-Gelen, aber Ϣ nm für die steifen Gele über 115 Pa). Interessanterweise waren epidermale Stammzellen, die auf den porössten Substraten plattiert wurden, abgerundet und durchliefen eine terminale Differenzierung, während sich die Zellen auf Substraten mit geringer Porosität (steifste Gele) ausbreiteten und undifferenziert blieben. Es wurde vorgeschlagen, dass die Porosität die Zellanhaftung beeinflusst, da die Kollagenverankerungspunkte in weicheren Gelen weiter auseinander liegen. Diese Ergebnisse unterstützen das Konzept, dass die Matrixsteifigkeit die Zellform in 3D-Hydrogelen nicht bestimmt und dass die Stammzelldifferenzierung durch die Fähigkeit der Zellen, die ECM umzugestalten, reguliert wird. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Schicksal von Stammzellen tatsächlich durch die Kollagenverankerungsdichte bestimmt werden kann, wobei sich Keratinozyten ausdifferenzierten und sich nicht ausbreiteten, wenn sie auf Kollagen mit einer geringen Nanopartikeldichte (190 nm Abstand) gezüchtet wurden, aber die Zellen sich ausbreiteten und bei der Kultivierung nicht differenzierten auf Kollagen mit eng verankerten Nanopartikeln (60 nm). Daraus wurde geschlossen, dass epidermale Stammzellen und MSCs eine mechanische Kraft auf kollagenbeschichtete Substrate ausüben und folglich auf die mechanische Rückkopplung durch das Kollagen reagieren. Dieses Feedback wird in Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit aufgrund von Variationen in der Verankerungsdichte verändert und bestimmt letztendlich die Entscheidungen über das Schicksal von Stammzellen (Trappmann et al., 2012).

Schaltsteifigkeit – Mechanischer Speicher

Die Kultur von MSCs auf weichen (𢏀,5 kPa) oder steifen (� kPa) Hydrogelen mit anschließender Übertragung auf Hydrogele mit entgegengesetzter Steifigkeit wurde untersucht (Lee et al., 2014). PA-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit wurden entwickelt und PDMS-Stempel (hergestellt mit photolithografischen Ansätzen) wurden verwendet, um die PA-Oberflächen mit Fibronektin zu bemustern. Es wurde berichtet, dass MSCs, die auf weichen Gelen kultiviert wurden, Marker für die Neurogenese exprimierten, während diejenigen, die auf steifen Hydrogelen kultiviert wurden, erhöhte Marker der Osteogenese exprimierten. Die Übertragung von MSCs auf Hydrogele mit entgegengesetzter Steifigkeit führte zu einem Wechsel der Abstammungsspezifikation. Bemerkenswert ist, dass MSCs, die ursprünglich auf steifen Hydrogelen kultiviert wurden, erhöhte Marker der Osteogenese behielten, was auf einen Grad an irreversibler Aktivierung hindeutet. Auf dieser Grundlage wurde vorgeschlagen, dass MSCs für mehrere Wochen anfällig für Matrixsteifigkeit bleiben und die Abstammungsspezifikation als Reaktion auf veränderte Hinweise umlenken können. Es wurde gezeigt, dass sich ASCs ähnlich wie BMSCs verhalten, indem sie sich dazu verpflichten, auf 1, 10 bzw. 34 kPa PA-Substraten neurogen, myogen und osteogen zu werden. Darüber hinaus war die linienspezifische mRNA-Expression in ASCs höher als in BMSCs. Interessanterweise fusionierten ASCs zu mehrkernigen Myotuben und exprimierten reife Muskelproteine ​​und blieben auch dann fusioniert, wenn sie in eine steife Nische geschaltet wurden, was zuvor für BMSCs nicht beschrieben wurde (Choi et al., 2012).

Photoabbaubare PEG-Hydrogele (� kPa) wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht weich (𢏂 kPa) verändert (Yang et al., 2014). Es wurde berichtet, dass die Aktivierung von YAP/TAZ und RUNX2 in humanen MSCs, die auf weichen Substraten (2 kPa) kultiviert wurden, von der vorherigen Kulturzeit auf steifen Substraten (3 GPa) abhing. Darüber hinaus wurde eine Schwellendauer für das mechanische Priming aufgedeckt, wobei MSCs, die zunächst für kurze Zeiträume (ϧ Tage) auf steifen PEG-Hydrogelen kultiviert wurden, gefolgt von einer Kultur auf weichen photoabstimmbaren PEG-Hydrogelen, eine reversible Aktivierung von YAP/TAZ und RUNX2 zeigten. Diese Aktivierung war in Zellen, die 10 Tage lang auf steifen photoabstimmbaren PEG-Hydrogelen kultiviert wurden, irreversibel, bevor sie weiter auf weichen Substraten kultiviert wurden. Es wurde auch berichtet, dass eine längere Kulturdauer für MSCs auf Polystyrol mit steifer Gewebekultur die osteogene Differenzierung verstärkte. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde vorgeschlagen, dass Stammzellen ein mechanisches Gedächtnis vergangener physischer Umgebungen besitzen, das durch YAP/TAZ-Signale vermittelt wird, die das Schicksal der Stammzellen beeinflussen. Unter Verwendung von methacrylierten HA-Substraten, die durch Additionspolymerisation hergestellt und mit Dithiothreitol (DTT) vernetzt wurden, wurde UV-Licht verwendet, um Substrate von weich (3 kPa) auf steif (30 kPa) umzuschalten (Guvendiren und Burdick, 2012). Die unmittelbare und langfristige Reaktion menschlicher MSCs darauf vor Ort Substratversteifung berichtete, dass hMSCs bei einer solchen Versteifung von einer adipogenen zu einer osteogenen Differenzierung wechselten. Diese Veränderungen wurden von einer Zunahme der Zellfläche, der Traktionskräfte und der Motilität begleitet, die sich innerhalb von 2𠄴 Stunden stabilisierten. Insbesondere der Zeitpunkt der Änderung der mechanischen Umgebung war kritisch, wobei ein früher Wechsel (Minuten-zu-Stunden) die osteogene Differenzierung der hMSCs begünstigte, während ein späterer Wechsel (Tage-Wochen) zur Adipogenese tendierte.

Mikropost-Arrays

Micropost-Arrays (MAs) können verwendet werden, um verschiedene mechanische Steifigkeiten für das Studium der Mechanobiologie zu erhalten. Die Arrays bestehen aus verformbaren Elastomermaterialien, auf die kontraktile Zellen ausgesät werden. Die Zellen üben Zugkräfte aus, um die Pfosten abzulenken, und nach der Balkentheorie bestimmen die Elastizität (E), Höhe (L) und der Durchmesser (d) dieser Pfosten den Grad, in dem sie sich als Reaktion auf diese Kräfte biegen. Für solche Studien werden Urformen aus Materialien wie Silikon hergestellt. MAs werden entwickelt, indem Kopien dieser Masterform unter Verwendung von Silikon oder thermoplastischem Material wie PDMS hergestellt werden (Tan et al., 2003). Durch Variieren der Höhe der Pfosten im Herstellungsprozess ermöglicht dieser Ansatz die Untersuchung der Substratsteifigkeit unabhängig von den Oberflächeneigenschaften.

Mikrogeformte hexagonale PDMS-Mikroarrays (PMAs) wurden unter Verwendung von mikrofabrizierten Silizium-Mastern (Fu et al., 2010) konstruiert und die Länge der PDMS-Mikrostifte wurde variiert, um die Substratsteifigkeit zu verändern (hohe Steifigkeit: L = 0,97 μm, K = 1.556 nN/μm, mittlere Steifigkeit: L = 6,1 μm, K = 18,16 nN/μm, geringe Steifigkeit: L = 12,9 μm, K = 1,90 nN/μm) unter Beibehaltung der gleichen Oberflächengeometrie. Unter Verwendung dieser PMAs wurde die hMSC-Differenzierung in Bezug auf die Substratsteifigkeit untersucht. Durch histologische Färbung und PCR-Genexpressionsanalysen wurde berichtet, dass die osteogene Differenzierung auf starren PMAs begünstigt wurde (K = 1.556 nN/μm), während die adipogene Differenzierung auf weicheren Arrays (K = 1,90 nN/μm).Es gab eine starke Korrelation zwischen Traktionskräften und der Differenzierung von hMSCs, wobei Zellen, die einer osteogenen Differenzierung unterzogen wurden, höhere Traktionskräfte zeigten als nicht-differenzierende Zellen und hMSCs, die sich nicht zu Adipozyten differenzierten, kontraktiler waren als differenzierende Adipozyten. Diese Studie berichtete auch, dass die Osteogenese von hMSCs nach der Behandlung mit Y-27632 zur Hemmung der Rho-ROCK-Signalgebung verringert war, was den Beweis erbrachte, dass die osteogene Differenzierung auf steifen Substraten durch das Aktin-Zytoskelett vermittelt wird. In einer anderen Studie wurden Mikrostifte unter Verwendung von Silizium-MA-Mastern konstruiert und tiefes reaktives Ionenätzen der Silizium-Master wurde für unterschiedliche Dauern durchgeführt, um unterschiedliche Mikropfostenhöhen zu erreichen (Sun et al., 2012). PDMS wurde über den Master gegossen und gehärtet, um eine Form zu erhalten, aus der das PDMS-Mikropfosten-Array hergestellt wurde, und dieses wurde dann mit Vitronectin beschichtet, um die Zelladhäsion zu fördern. Dieser Ansatz erreichte einen effektiven Steifigkeitsbereich (1,92 kPa – 1.218,4 kPa). Unter Verwendung dieses PMA-Systems wurde berichtet, dass die Substratsteifigkeit eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stammzellpluripotenz spielt, wobei mehr als 20 % der auf starren PMAs (1218,4 kPa) kultivierten hESCs im Vergleich zu Zellen auf weichen PMAs (1,92 kPa) undifferenziert blieben. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass hESCs die Kontraktilität des Zytoskeletts mit erhöhter Matrixsteifigkeit erhöhen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Kontraktilität des Zytoskeletts als Reaktion auf Veränderungen der Matrixeigenschaften mit Gap Junctions assoziiert sein könnte. In einer anderen Micropost-Array-Studie wurde berichtet, dass die neurale Induktion von hESCs durch Veränderung der Micropost-Steifigkeit beschleunigt werden kann, wobei ein weiches Substrat (5 kPa) die neuroepitheliale Umwandlung von hESC fördert (Sun et al., 2014). Darüber hinaus war die Reinheit und Ausbeute an funktionellen Motoneuronen, die von diesen neuralen Vorläufern abgeleitet wurden, auf weichen (5 kPa) im Vergleich zu starren (1.200 kPa) PMAs verbessert. Durch Immunfluoreszenz-Färbung und Western-Blot-Assays wurde gezeigt, dass dieser Prozess Smad-Phosphorylierung und nukleozytoplasmatisches Shuttle umfasst, reguliert durch Hippo-YAP-Signalgebung und Kontraktilität des Zytoskeletts.

3D-Biomaterialgerüste

3D-Kultursysteme imitieren in vivo Architektur und biologische Rolle der ECM, die verkapselte Zellen umgibt, rekapitulieren die in vivo Umgebung bis zu einem Grad an Komplexität, der in einem 2D-Kultursystem nicht erreichbar ist. Humane MSCs wurden auf Fibronektin-Hyaluronsäure (FN–HA)-Hydrogele mit unterschiedlichen Mengen an FN ausgesät (Trujillo et al., 2020). In Abwesenheit von FN lokalisierte YAP hauptsächlich im Zytoplasma, während YAP in Gegenwart von FN (50 μg/ml bis 500 μg/ml) hauptsächlich im Zellkern lokalisiert war. Dies wurde beobachtet, obwohl der Elastizitätsmodul bei allen Formulierungen ähnlich war (7 kPa). Im Gegensatz dazu nahm die YAP-Translokation zum Zellkern mit steigenden FN-Mengen in 3D nicht zu. Daher wurde vorgeschlagen, dass die YAP-Kerntranslokation von der Dimensionalität und der Zellausbreitung in 3D im Vergleich zu 2D beeinflusst wird, da die Zellausbreitung in allen experimentellen Gruppen ähnlich war. Es gibt eine Vielzahl von Veröffentlichungen, die 3D-Biomaterialsysteme für die Stammzellkultur untersuchen, und hier beschränken wir unsere Diskussionen auf vernetzte, abbaubare, poröse und viskoelastische Biomaterialien, um besser zu verstehen, wie sich die mechanischen Eigenschaften der Biomaterialmatrizen auf Stammzellen auswirken. Für detaillierte Diskussionen über Biomaterialeigenschaften und deren Auswirkungen auf Stammzellen werden die Leser auf Read Reviews verwiesen (Dawson et al., 2008 Kraehenbuehl et al., 2011 Zhao et al., 2019). Tissue Engineering Scaffolds bieten den Zellen eine 3D-Plattform für die Zellanheftung und -proliferation und bieten gleichzeitig die mechanische Stabilität, die erforderlich ist, um die physiologischen und biologischen Herausforderungen in der in vivo Umgebung. Um Zugang und Platz für die Zellen zu schaffen, um sich zu vermehren und eine Matrix zu bilden, aber auch um die Nährstoffversorgung zu ermöglichen, werden die meisten 3D-Biomaterialgerüste porös entwickelt. Diese Porosität und 3D-Architektur kann durch verschiedene Ansätze integriert werden, darunter Gefriertrocknung, Elektrospinnen, Extraktion von Porogen-Templaten unter Verwendung von Lösungsmitteln, Abbau weicher Materialien oder 3D-Druck. Es sollte beachtet werden, dass diese Biomaterialien komplexe mechanische 3D-Umgebungen bereitstellen, die durch die Steifigkeit des Schüttguts, aus dem das Gerüst besteht, sowie die topographischen Eigenschaften des Materials und die spezifischen Eigenschaften der porösen Architektur (z , Porosität, Porengröße, Strebendicke).

Das Ausmaß, in dem die Starrheit der ECM den Phänotyp von Stammzellen beeinflusst, wurde in einem 3D-Kultursystem untersucht, in dem MSCs in unterschiedlichen Gewichtsprozenten in PEGDM-Polymere eingekapselt und in Gegenwart von Acryloyl-PEG-GRGDS2 photovernetzt wurden (Huebsch et al., 2010). Osteogene Differenzierung trat hauptsächlich auf, wenn MSCs in 3D-Hydrogele mit moderater Steifigkeit (11� kPa) eingekapselt wurden, während die Adipogenese bei Hydrogelen mit einem Steifigkeitsbereich von 2,5𠄵 kPa begünstigt wurde. Im Gegensatz zu 2D in vitro Kulturstudien wurde berichtet, dass die Stammzell- und Kernmorphologie für die spezifischen untersuchten Bereiche nicht stark mit den mechanischen Eigenschaften der 3D-Hydrogele korreliert waren. Jedoch inhibierte die Matrixsteifigkeit die Integrinbindung und die Reorganisation von Adhäsionsliganden durch Zellkontraktilität und das Blockieren der RGD-Bindung an Integrine inhibierte die Osteogenese. Es wurde gezeigt, dass Adhäsion, Form und Zytoskelett-Organisation von MSCs von der Steifigkeit (0-40 kPa) von 3D-vernetzter Hyaluronsäure (HA) und 2D-PA-Substraten abhängen, wobei steifere Matrizen die Zellausbreitung fördern (Rehfeldt et al., 2012 .). ). In HA-Matrizen eingebettete Stammzellen wurden auf kugelsymmetrische Formen und den Zusammenbau eines überwiegend kortikalen Zytoskeletts beschränkt. Die Hemmung der Myosin-II-Kontraktilität (mit Blebbisatin) verhinderte die Ausbreitung der MSC-Behandlung. Humane BMSCs wurden in Kollagengerüsten unterschiedlicher Steifigkeit (1, 2, 7 und 29,7 kPa) eingekapselt und in Gegenwart von 1:1 proosteogener (50 μ/ml Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerophosphat und ) kultiviert 100 nM Dexamethason) und pro-adipogene (1 μM Dexamethason, 200 μM Indomethacin und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin) Medien zur Untersuchung des adipogenen und osteogenen Differenzierungspotenzials von hBMSCs (Herrera et al., 2019). Sowohl Osteocalcin als auch Perilipin wurden intrazellulär für alle Steifheit mit immunhistochemischen Methoden gefunden. Diese Bilder wurden mit speziell für ImageJ entwickelten Makros ausgewertet. Gerüste mit mittlerer Steifigkeit (2 kPa und 7 kPa) führten zu einer höheren Osteocalcin-Signalintensität im Vergleich zu Gerüsten mit niedriger (1 kPa) und hoher (29,7 kPa) Steifigkeit. Mit zunehmender Steifigkeit (1 bis 29,7 kPa) nahm die Perilipin-Signalintensität ab.

Interessanterweise wurde gezeigt, dass MSCs eine adipogene Differenzierung durchlaufen, wenn sie in kovalent vernetzte, nicht abbaubare HA-Matrizen unterschiedlicher Steifigkeit (4,4� kPa) eingekapselt sind, während eine osteogene Differenzierung in HA-Matrizen beobachtet wurde, die so modifiziert wurden, dass sie abbaubar sind (Khetan et al., 2013). Es wurde vorgeschlagen, dass durch kovalente Vernetzung bereitgestellte Hydrogel-Strukturhinweise die MSC-Differenzierung vermitteln. Innerhalb von Hydrogelen des gleichen Moduls wurde die Osteogenese begünstigt, wenn die Zellen in der Lage waren, die umgebende Matrix zusammenzuziehen, während die Adipogenese begünstigt wurde, wenn die Zellen durch sekundäre physikalische Vernetzung darauf beschränkt waren, abgerundet zu werden. Diese sekundäre Vernetzung reduzierte den Hydrogelabbau, unterdrückte die Traktion und führte zu einem Wechsel von der Osteogenese zur Adipogenese. In einer anderen Studie wurden MSCs in ein nanoporöses Hydrogel eingekapselt, das nach Injektion in das Wirtsgewebe (durch hydrolytischen Abbau) Poren bildete, mit dem Ziel, die Porenbildung von der Elastizität zu entkoppeln (Huebsch et al., 2015). Es wurde gezeigt, dass Zellproliferation und osteogene Differenzierung (ALP) in hohlraumbildenden Hydrogelen mit mittlerer Volumensteifigkeit (60 kPa) ihren Höhepunkt erreichten, aber bei denen mit höherer Steifigkeit (110 kPa) abfielen. Die Expression und Mineralisierung von Kollagen I durch MSCs in hohlraumbildenden Hydrogelen wurde auch in Hydrogelen mit einer Volumenelastizität von mehr als 60 kPa verstärkt. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden makroporöse Substrate (rekombinantes Elastin-ähnliches Protein (ELP)) verwendet, die die mechanischen Eigenschaften und die Ligandenchemie unabhängig voneinander steuern konnten (Haugh et al., 2018). Interessanterweise haben MSCs Marker für Osteogenese (ALP) und Adipogenese (Triglycerid) hochreguliert, wenn sie in steifen porösen 3D-Substraten (16 und 50 kPa) kultiviert wurden, verglichen mit weichen Gegenstücken (0,5 kPa), was von zuvor beobachteten Reaktionen auf die Substratsteifigkeit abweicht. Es wurde vermutet, dass dies auf die Bedeutung der Topographie als Determinante des zellulären Verhaltens zurückzuführen ist. Eine Studie zielte darauf ab, die genaue Wirkung der Porengröße (100, 200 und 300 μm) innerhalb von 3D-faserigen ECM-ähnlichen Gerüsten, die mittels Schmelzelektroschreiben (MEW) hergestellt wurden, auf das osteogene Potenzial von hBMSCs zu untersuchen (Brennan et al., 2019). Humane BMSCs wurden auf MEW-Gerüste ausgesät und bewertet, um eine optimale Porengröße zu bestimmen. Sie fanden eine Porengröße von 100 μm als optimal, was die größte Steifigkeit (𢏀,6 N/mm), die größte Impfeffizienz (55,7%) und die Beibehaltung der ausgebreiteten Zellmorphologie zeigt. Interessanterweise zeigten die Vorteile von 100 μm quadratischen Poren, einer Porengröße, die traditionell als untere Grenze für die Osteogenese angegeben wird, verstärkte osteogene Wirkungen mit deutlich größerer Kollagen- und Kalziumablagerung.

Das viskoelastische Verhalten natürlicher extrazellulärer Matrices wurde rekapituliert, indem eine Methode entwickelt wurde, um die Rate der Spannungsrelaxation von 3D-Hydrogelen unabhängig von Steifigkeit, Abbau und Ligandendichte zu verändern (Chaudhuri et al., 2016). Die nanoskalige Architektur von Alginathydrogelen wurde modifiziert, um Konstrukte mit einem breiten Spektrum an Spannungsrelaxationsraten, aber einem ähnlichen anfänglichen Elastizitätsmodul zu entwickeln. Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht und Vernetzungsdichten von Calcium, das Alginat ionisch vernetzt, wurden verwendet, um die Spannungsrelaxationseigenschaften der Hydrogele zu verändern. Die Rate der Spannungsrelaxation wurde erhöht durch (1) Erniedrigung des Molekulargewichts des Alginats von 280 kDa auf 35 kDa und (2) Koppeln von 5 kDa PEG-Abstandshaltern an das 35 kDa Alginat. Diese erhöhte Stressrelaxationsrate ahmt die Stressrelaxationsraten nach, von denen bekannt ist, dass sie von verschiedenen Geweben gezeigt werden und für das Zellverhalten relevant sind. Viskoelastische Alginathydrogele, die eine schnelle Stressrelaxation zeigten, verbesserten die Zellausbreitung, -proliferation, die osteogene Differenzierung durch MSCs und die Bildung einer mineralisierten Matrix. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Effekte durch Integrine, lokale Clusterbildung von RGD-Liganden, Aktomyosin-Kontraktilität und Kernlokalisation von YAP vermittelt werden. Eine andere Studie untersuchte die Rolle, die das Zellvolumen bei der Regulierung des Schicksals von Stammzellen in 3D-Kulturen spielt. In viskoelastischen Hydrogelen kultivierte MSCs zeigten eine Volumenexpansion durch Zellausbreitung, die die Osteogenese steigerte. Eine reduzierte Spannungsrelaxation oder ein erhöhter osmotischer Druck schränkt die Volumenexpansion ein und reduziert die Osteogenese, unabhängig von der Zellmorphologie. Im Gegenteil, ein reduzierter osmotischer Druck induziert eine Volumenexpansion und beschleunigt die Osteogenese. TRPV4 wurde als Mechanosensor der Matrix-Viskoelastizität identifiziert, der die Osteogenese reguliert (Lee et al., 2019). Es wurde festgestellt, dass die TRPV4-Ionenkanalaktivierung und Volumenexpansion die Kernlokalisation von RUNX2 steuert, um die osteogene Differenzierung zu fördern. Die quantitative Mikroelastographie (QME) von in 3D-GelMA-Hydrogelen verkapselten hASCs zeigte eine erhöhte Zell- und extrazelluläre Elastizität in 3D. Interessanterweise wurde bei GelMA, das TAZ-aktivierte hASCs enthielt, eine Zunahme der Elastizität (㸐 kPa) beobachtet (Hepburn et al., 2020).

Unter Verwendung von Mikrophotostrukturierungssubstraten (μPP) mit ausgerichteten zelladhäsiven Hinweisen hat sich gezeigt, dass die TRPV4-vermittelte Ca 2+ -Signalgebung in hMSCs entscheidend für die Bildung einer ausgerichteten Kollagenmatrixanordnung ist (Gilchrist et al., 2019). Dieser Prozess kann manipuliert werden, indem die TRPV4-Aktivität so verändert wird, dass die Hemmung von TRPV4 die Ca 2+ -Signalgebung reduziert und die ausgerichtete Collagenfibrillen-Assemblierung hemmt und die Aktivierung von TRPV4 die ausgerichtete Collagen-Bildung beschleunigt. Es wurde festgestellt, dass TRPV4-abhängige Ca 2+ -Oszillationen unabhängig von der Musterform oder der Untermusterzellposition sind (Gilchrist et al., 2019). Ein FRET-basierter intrazellulärer Spannungssensor wurde verwendet, um die Auswirkungen der TRPV4-Aktivität auf die Spannung über das Protein Vinculin innerhalb fokaler Adhäsionen zu untersuchen und die Hemmung von TRPV4 verringerte die Zugkraft über Vinculin, während die Aktivierung von TRPV4 zu einer dynamischen Entlastung und Wiederbeladung von Vinculin führte. Daher wurde vorgeschlagen, dass die TRPV4-abhängige Ca 2+ -Signalgebung in MSCs in Kombination mit der substratvermittelten Kontrolle der Zellform und -position den ausgerichteten Kollagenfibrillenaufbau reguliert.

Mechanische Belastung

Es ist allgemein bekannt, dass auch andere Formen mechanischer Stimulation, wie Flüssigkeitsscherspannung, hydrostatischer Druck und Zugspannung, das Schicksal von MSCs beeinflussen in vitro (Koike et al., 2005 Sen et al., 2008 Arnsdorf et al., 2009 Kearney et al., 2010 Case et al., 2011). Beispielsweise kann ein intermittierender und oszillatorischer Flüssigkeitsfluss eine osteogene Expression (Kalzium-Signalgebung, Osteopontin- und Osteocalcin-Expression) von Knochen-Osteoprogenitoren induzieren (Kreke und Goldstein, 2004, Li et al., 2004). Zyklische mechanische Belastung (8%) erhöht die Marker der Osteogenese (ALP, OC, Col I, Col III, Cbfa1) in humanen BMSCs (hBMSCs) (Jagodzinski et al., 2004). In einer anderen Studie hat sich gezeigt, dass 10% zyklische mechanische Belastung durch RANKL-Aktivierung höhere Mengen an ALP und Kalziumablagerungen durch dentale MSCs stimulieren. Es zeigte auch dramatische Veränderungen in der mRNA- und Proteinexpression von Osteogenese-spezifischen Biomarkern wie OPG, BSP und DSP (Zhang et al., 2019). Anwendung von hydrostatischem Druck, innerhalb ähnlicher Bereiche wie gesehen in vivo (0,1 MPa – 10 MPa) kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen in Aggregaten oder auf Kollagen- oder Agarosegerüsten ausgesät verbessern und so die Produktion des Knorpeltemplates fördern (Angele et al., 2003 Miyanishi et al., 2006 Finger et al., 2007 Luo und Seedhom, 2007 Wagner et al., 2008 Ogawa et al., 2009 Meyer et al., 2011 Vinardell et al., 2012 Carroll et al., 2014 Freeman et al., 2017). Darüber hinaus führt die mechanische Stimulation zu einer erhöhten mineralisierten Matrixproduktion durch in 3D kultivierte hBMSCs, kurze dynamische Kompressionsschübe (5%) induzieren die Knochenmatrixproduktion (Sittichokechaiwut et al., 2010). In einer anderen Studie wurden hBMSCs in Alginat (Alg)/HA- oder Alg/Hydroxyapatit (Hap)-Hydrogele verkapselt (Schiavi et al., 2018). Hydrogele wurden 28 Tage kultiviert und täglich stimuliert. Mechanische Belastung erhöhte die Chondrogenese in Alg/HA-Hydrogelen mit Anwesenheit von GAG und Kollagen II. In den Alg/Hap Hydrogelen wurde vermehrt Kollagen X nachgewiesen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hap Stammzellen induziert, sich zu einem hypertrophen chondrozytischen Phänotyp zu differenzieren und die mechanische Festigkeit des Hydrogels zu erhöhen. Das mechanische Verhalten der geschichteten Hydrogele wurde durch plane�hnungskompressionstests untersucht. Interessanterweise wurde berichtet, dass eine Erhöhung der Hydrogel-Steifigkeit von 5 kPa auf 29 kPa die hMSC-Ausbreitung in 3D-GelMA-Hydrogelen einschränkte, während zyklische Druckspannung (0,15 bis 0,63 mm) die Zellausbreitung erhöhte. Darüber hinaus zeigte die Gruppe mit dem höchsten Stamm (42 %) eine signifikante Zunahme der osteogenen Differenzierung (RUNX2-Expression und Kalziumablagerung) von hMSCs in 5 kPa GelMA-Hydrogel im Vergleich zu anderen Gruppen (Seo et al., 2018).

Die Steifigkeit des Substrats kann durch das Aufbringen einer extrinsischen mechanischen Belastung auf das Material verändert werden. Eine Vierpunkt-Biegevorrichtung ermöglichte die Einstellung der Substratsteifigkeit durch Anlegen von Mikrodehnungsspannungen an zellbesäte Substrate (Qi et al., 2008). Solche Ansätze verändern jedoch auch die Form des Substrats, was das Zellverhalten unabhängig von den Eigenschaften des Substrat-Volumenmaterials beeinflussen kann (Marcello Pilia et al., 2013). Eine Studie ergab, dass die Anwendung von Vibrationen niedriger Intensität (LIV) die MSC-Proliferation und die nuklearen Proteine ​​LaminA/C und Sun-2 wiederherstellte, wenn sie simulierter Mikrogravitation (sMG) ausgesetzt waren (Touchstone et al., 2019). Die Deaktivierung der LINC-Funktionalität durch gleichzeitige Depletion von Sun-1 und Sun-2 verhinderte die Wiederherstellung der Zellproliferation durch LIV. Eine andere Studie ergab, dass die Anwendung von Hochfrequenz hoher Stärke (HMHF, 2,5 gGipfel, 100 Hz) Vibration an hASCs auf einem Gewebekulturkunststoff in basalen und osteogenen Kulturmedien führte zu verringerten osteogenen Medien induzierten Veränderungen der Kerngröße und -dehnung (Halonen et al., 2020).

Ein dynamisches topographisches Substrat wurde unter Verwendung eines polyelektrolyt-mehrschichtigen (PEM) beschichteten Formgedächtnispolymers (SMP) entwickelt, das bei einer Änderung der Inkubationstemperatur von einer flachen zu einer faltigen Konfiguration übergeht, was eine Änderung der Morphologie, aber keine Änderung der Steifigkeit bewirkt (Sun et al ., 2020). Das spezifische Ziel war die Untersuchung des fortschreitenden Umbaus von humanen iPSC-CMs, die innerhalb von 24 Stunden auf SMP-PEM-Substraten ausgesät wurden. Die anfängliche Faltenbildung trat (Stunde 0) als Reaktion auf eine Änderung der Inkubationstemperatur von 30ଌ auf 37ଌ auf. Die Ausrichtung der hiPSC-CM-Zellen blieb zu Beginn der Kulturperiode (0� Stunden) unverändert, wurde jedoch nach 16 Uhr langsam wieder in Richtung der Faltenrichtung ausgerichtet. In Bezug auf die intrazelluläre Myofibrillen-Reorganisation nahm der Sarkomer-Index zu Beginn der Kulturperiode und die Vinculin-Länge ab nahm zu frühen Zeitpunkten (Stunde 4 und 8) ab, kehrte jedoch nach 12 Uhr auf die ursprüngliche Länge zurück. Die Länge der dünnen Filamente und die Sarkomerlänge nahmen spät in der Kulturperiode (16� h) zu (Sun et al., 2020). Daher wurde vorgeschlagen, dass hiPSC-CM-Prozesse auf dynamische strukturelle Hinweise aus der Zellmikroumgebung reagieren.


Synthetische Biomaterialien als instruktive extrazelluläre Mikroumgebungen für die Morphogenese im Tissue Engineering

In rasantem Tempo werden neue Generationen synthetischer Biomaterialien für den Einsatz als dreidimensionale extrazelluläre Mikroumgebungen entwickelt, um die regulatorischen Eigenschaften natürlicher extrazellulärer Matrices (ECMs) und ECM-gebundener Wachstumsfaktoren sowohl für therapeutische Anwendungen als auch für grundlegende biologische Studien nachzuahmen. Zu den jüngsten Fortschritten zählen nanofibrilläre Netzwerke, die durch Selbstorganisation kleiner Bausteine ​​gebildet werden, künstliche ECM-Netzwerke aus Proteinpolymeren oder peptidkonjugierten synthetischen Polymeren, die bioaktive Liganden präsentieren und auf zellsekretierte Signale reagieren, um eine proteolytische Remodellierung zu ermöglichen. Diese Materialien haben bereits Anwendung gefunden, um Stammzellen zu Neuronen zu differenzieren, Knochen zu reparieren und Angiogenese zu induzieren.Obwohl moderne synthetische Biomaterialien stark vereinfachte Nachahmungen natürlicher ECMs darstellen, denen die essentielle natürliche zeitliche und räumliche Komplexität fehlt, kann eine wachsende Symbiose von Materialtechnik und Zellbiologie letztendlich zu synthetischen Materialien führen, die die notwendigen Signale enthalten, um Entwicklungsprozesse in Gewebe- und Organ-spezifischen zu rekapitulieren Differenzierung und Morphogenese.


Einzelmolekülmessungen der Kraftwirkung auf die Thy-1/αv㬣-Integrin-Interaktion mit nicht gereinigten Proteinen

Advanced Center for Chronic Diseases (ACCDiS), Center for Studies of Exercise, Metabolism and Cancer, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 838-0453 Santiago, Chile

Physikabteilung, Pontificia Universidad Católica de Chile, 782-0436 Santiago, Chile

Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile, 838-0494 Santiago, Chile

Cellular Communication Laboratory, Programa de Biología Celular y Molecular, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 838-0453 Santiago, Chile

Advanced Center for Chronic Diseases (ACCDiS), Center for Studies of Exercise, Metabolism and Cancer, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 838-0453 Santiago, Chile

*Adresskorrespondenz an: Lisette Leyton (

Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile, 838-0494 Santiago, Chile

*Adresskorrespondenz an: Lisette Leyton (

Cellular Communication Laboratory, Programa de Biología Celular y Molecular, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 838-0453 Santiago, Chile

Advanced Center for Chronic Diseases (ACCDiS), Center for Studies of Exercise, Metabolism and Cancer, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 838-0453 Santiago, Chile

Thy-1 und αvβ3-Integrin vermitteln eine bidirektionale Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten. Thy-1/αvβ3-Wechselwirkungen stimulieren die Astrozytenmigration und die Retraktion neuronaler Verlängerungen, beides Prozesse, bei denen innere Kräfte erzeugt werden, die die bimolekularen Wechselwirkungen beeinflussen, die die Zell-Zell-Adhäsion aufrechterhalten. Nichtsdestotrotz ist die Frage, wie die Thy-1/αvβ3-Wechselwirkungen auf mechanische Hinweise reagieren, ein ungelöstes Problem. In dieser Studie wurde eine optische Pinzette als Einzelmolekül-Kraftaufnehmer verwendet und das Dudko-Hummer-Szabo-Modell wurde verwendet, um die kinetischen Parameter der Thy-1/αvβ3-Dissoziation zu berechnen. Eine neuartige experimentelle Strategie wurde implementiert, um die Interaktion von Thy-1-Fc mit nicht gereinigtem αvβ3-Fc-Integrin zu analysieren, wobei unspezifische Rupturereignisse unter Verwendung eines neuen mathematischen Ansatzes korrigiert wurden. Diese Methodik ermöglichte eine genaue Schätzung der spezifischen Bruchkräfte für die Thy-1-Fc/αvβ3-Fc-Dissoziation und die Berechnung der kinetischen und Übergangszustandsparameter. Erzwingt eine exponentiell beschleunigte Thy-1/αvβ3-Dissoziation, was auf ein Gleitbindungsverhalten hinweist. Wichtig ist, dass selbst für gereinigte Proteine ​​unspezifische Wechselwirkungen nachgewiesen wurden, was die Bedeutung der Korrektur solcher Wechselwirkungen unterstreicht. Zusammenfassend beschreiben wir eine neue Strategie zur Charakterisierung der Reaktion bimolekularer Wechselwirkungen auf Kräfte auch in Gegenwart unspezifischer Bindungsereignisse. Indem wir definieren, wie Kraft die Bindung von Thy-1/αvβ3-Integrin reguliert, bieten wir einen ersten Schritt zum Verständnis, wie das Neuron-Astrozyten-Paar mechanische Signale wahrnimmt und darauf reagiert.


Diskussion

FcγRIIa (CD32) ist ein Mitglied der Immunglobulin (Ig)-Gen-Superfamilie und besteht aus 2 extrazellulären Ig-Homologiedomänen – deren C-Terminus Bindungsstellen für die Fc-Region von IgG, eine Single-Pass-Transmembrandomäne und a . enthält Zytoplasmatischer Schwanz mit 76 Aminosäuren, der 2 YxxL-Sequenzen enthält, die durch eine etwas längere als übliche 12-Aminosäuren-Spacer-Region getrennt sind, die zusammen sein einziges ITAM bilden. 10 FcγRIIa ist der vorherrschende FcγRII-Rezeptor auf Neutrophilen und Makrophagen 38 und seine Vernetzung löst so unterschiedliche Aktivierungsereignisse wie Calciummobilisierung, 39 Superoxidproduktion 39 und Phagozytose aus. 40,41

Obwohl FcγRIIa vor fast 25 Jahren auf menschlichen Blutplättchen identifiziert, 26 vor fast 20 Jahren kloniert wurde, 38,42 und auf struktureller Ebene vor fast einem Jahrzehnt gelöst wurde, 43 der Grund, warum Blutplättchen 2000 bis 3000 Kopien exprimieren sollten 44,45 von einem niedrigen -Affinitätsrezeptor für monomeres IgG auf ihrer Oberfläche wurde nie zufriedenstellend erklärt. Von FcγRIIa ist bekannt, dass es für die rezeptorvermittelte Endozytose und das Packen in Thrombozyten-α-Granula von Plasma-IgG verantwortlich ist, 46 und wenn es in kernhaltige Zellen transfiziert wird, vermittelt es die Internalisierung von opsonisierten Partikeln. 41,47 Die Bedeutung dieser Funktionen für die menschliche Thrombozytenbiologie ist jedoch ungewiss, und obwohl die Bedeutung von FcγRIIa bei pathophysiologischen Erkrankungen wie der Heparin-induzierten Thrombozytopenie gut verstanden ist, 48 blieb seine Rolle in der normalen Thrombozytenphysiologie ein Rätsel.

Das wichtigste Ergebnis der aktuellen Untersuchung ist, dass FcγRIIa und seine nachgeschalteten Effektormoleküle Schlüsselkomponenten der Outside-In-Signalverstärkung darstellen, die durch das wichtigste humane Blutplättchen-Integrin αIIbβ3 vermittelt wird. Wir fanden, dass FcγRIIa, Syk und PLCγ2 jeweils nach der Bindung von entweder löslichem oder immobilisiertem Fibrinogen an αIIbβ3 aktiviert werden (Abbildungen 1,2), und zeigten anhand von drei komplementären Ansätzen, dass die funktionelle Kopplung zwischen diesem Integrin und dem, was bisher angenommen wurde um einfach ein Rezeptor für IgG-Immunkomplexe zu sein, ist für die αIIbβ3-vermittelte Outside-In-Signalgebung erforderlich. Somit wurde die Fähigkeit der Blutplättchen, aktiviert zu werden und sich auf Fibrinogen auszubreiten, durch die Vorinkubation von Blutplättchen mit dem blockierenden Anti-FcγRIIa-spezifischen mAk IV.3 (Abbildung 1) in Blutplättchen, die reduzierte Spiegel eines verkrüppelten FcγRIIa-Rezeptors exprimierten, signifikant gehemmt (Abbildung 3), und in Blutplättchen fehlt der größte Teil der zytoplasmatischen Domäne der Integrin-β3-Untereinheit (Fig. 4). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse FcγRIIa als den ITAM-tragenden Rezeptor, der die αIIbβ3-Außen-in-Integrin-Signalgebung in menschlichen Blutplättchen vermittelt.

FcγRIIa ist somit das jüngste einer wachsenden Zahl von Proteinen, von denen bisher angenommen wurde, dass sie ausschließlich für die Signalübertragung von Immunrezeptoren verwendet werden und von denen gezeigt wurde, dass sie eine herausragende Rolle bei der Integrin-vermittelten Signalübertragung spielen. Mócsai et al. berichteten kürzlich, dass eine Vielzahl von β2-Integrin-vermittelten Signalantworten in Neutrophilen und Makrophagen eine Tyrosinphosphorylierung der ITAM-tragenden Proteine ​​DAP12 und FcRγ sowie eine anschließende Rekrutierung von Syk erfordern. 22 Obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass Syk, 21 das Adapterprotein SLP-76, 21 und PLCγ2 18,19 für die Thrombozytenausbreitung auf immobilisiertem Fibrinogen benötigt wird, war das Membranprotein, das für die Rekrutierung von Syk an die Innenseite der Plasmamembran verantwortlich ist, nicht identifiziert. Frühere Studien an Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) mit erzwungener Überexpression von Syk legten nahe, dass diese Proteintyrosinkinase mit der zytoplasmatischen β3-Domäne in einer SH2-Domäne/ITAM-unabhängigen Weise assoziiert sein könnte, 49,50 jedoch neuere Studien mit Blutplättchen, die mutierte Isoformen von Syk, die einzelne Aminosäuresubstitutionen innerhalb ihrer SH2-Domänen beherbergen, die eine Assoziation mit phosphorylierten ITAMs verhindern, zeigten eindeutig eine Notwendigkeit für die SH2-Domänen von Syk in der Integrin-vermittelten Outside-in-Signalgebung 21 – was auf ein noch zu identifizierendes ITAM schließen lässt -enthaltendes Molekül stromaufwärts von Syk bei der Integrin-vermittelten zellulären Aktivierung. Unsere Identifizierung von FcγRIIa als dem ITAM-tragenden Rezeptor fügt eine weitere wichtige, wenn auch etwas unerwartete Signalkomponente zum Outside-in-Integrin-Signalisierungskreislauf hinzu.

Obwohl viele der molekularen Details, die der Integrin-vermittelten Signalübertragung zugrunde liegen, noch nicht aufgeklärt werden müssen, deuten zunehmende Hinweise in mehreren zellulären Systemen darauf hin, dass Kinasen der Integrin-assoziierten Src-Familie eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von Signalen stromabwärts der Ligandenbindung spielen. 37,51-56 Wang et al. beobachteten vor mehr als 10 Jahren, dass ein verkürztes Integrin β3 Untereinheit der zytoplasmatischen Domäne in einer Variante der Glanzmann-Thrombasthenie war nicht in der Lage, die Ausbreitung menschlicher Blutplättchen auf immobilisiertem Fibrinogen zu unterstützen, 57 was die Bedeutung der Outside-In-Signalgebung für die menschliche Blutplättchen-Pathophysiologie unterstreicht. Angesichts der Beobachtung, dass menschliche Blutplättchen, denen der größte Teil der zytoplasmatischen β3-Domäne fehlt, auch die ITAM-Tyrosine von FcγRIIa nicht tyrosinphosphorylieren (Abbildung 4A), ist es verlockend zu spekulieren, dass nach der Ligandenbindung eines der αIIbβ3-assoziierten Mitglieder der Src-Familie 37, 58 phosphoryliert FcγRIIa und bildet die Andockstelle für Syk, die einen Signalweg initiiert, der zur Aktivierung von PLCγ2 führt, das über die Produktion der sekundären Botenstoffe IP3 und Diacylglycerol eine Vielzahl von Thrombozytenaktivierungsreaktionen verstärkt.

Der in der vorliegenden Arbeit definierte Signalweg Fibrinogen→αIIbβ3→Src→FcγRIIa ITAM→Syk→PLCγ2 von außen nach innen zeigt eine gewisse Symmetrie in der Natur in Bezug auf die Art und Weise, wie Adhäsionsliganden Thrombozyten zu aktivieren scheinen. Somit verwendet die Kollagenbindung an das Integrin α2β1 sowohl die ITAM-tragende GPVI/FcRγ-Kette 59-61 als auch PLCγ2 17, um Aktivierungssignale zu übertragen, ebenso wie das Integrin α6β1, wenn Blutplättchen auf das extrazelluläre Matrixprotein Laminin treffen. 62,63 In ähnlicher Weise führt die Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit dem Thrombozyten-GPIb-Komplex zur Aktivierung der Kinasen der Src-Familie, Syk und PLCγ2, 64-67 und wir und andere haben gezeigt, dass PLCγ2 eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung der Thrombozytenausbreitung spielt 66,68 und Thrombusbildung 68 auf immobilisiertem VWF unter Fließbedingungen. Im Gegensatz zur durch Kollagen-, Laminin- oder Fibrinogenbindung induzierten Aktivierung scheint die VWF-induzierte Thrombozytenaktivierung jedoch kein FcγRIIa oder die FcRγ-Kette zu erfordern, um adhäsionsabhängige Signale zu übertragen, 66,69 obwohl sie als kostimulatorische Signalverstärkungsmoleküle dienen können, wenn vorhanden, nicht ausgeschlossen. 65,69 Vielleicht dient ein noch zu identifizierendes ITAM-tragendes Protein in Blutplättchen als primärer Mediator der GPIb-Signalübertragung. In dieser Hinsicht ist die Identifizierung potenzieller ITAM-haltiger Kandidatenproteine ​​stromabwärts der Interaktion von menschlichen Blutplättchen mit Fibronektin (über α5β1) oder Osteopontin (über αvβ3) oder von murinen Thrombozyten mit Fibrinogen (murine Thrombozyten exprimieren kein FcγRIIa 38,70,71 ) bleibt ein wichtiger Bereich für zukünftige Untersuchungen.

Obwohl die physikalische Natur, die der funktionellen Beziehung zwischen Integrinen und ITAM-tragenden Rezeptoren im Allgemeinen und zwischen αIIbβ3 und FcγRIIa im Besonderen zugrunde liegt, nicht verstanden wird, kommen mehrere Möglichkeiten zur Erklärung ihrer Reiz-Antwort-Kopplung in den Sinn. Obwohl weder Mócsai et al. leitet sich aus den Beobachtungen ab, dass (1) die Vorinkubation bestimmter αIIbβ3-spezifischer Antikörper mit Blutplättchen die Bindung sowohl des anti-FcγRIIa-mAb, IV.3, als auch des humanen aggregierten IgG, 72 hemmt, während (2) bestimmte andere anti-αIIb-β3-mAbs so binden, dass ihre Fc-Regionen FcγRIIa präsentiert werden, was zu einer robusten Thrombozytenaktivierung 73-76 führt – ein Ereignis, das durch Vorinkubation mit IV.3 vollständig blockiert werden kann. Unsere Beobachtung, dass IV.3 Fabs die durch Ligandenbindung induzierte, αIIbβ3-vermittelte Aktivierung von FcγRIIa, Syk und PLCγ2 sowie die Thrombozytenausbreitung auf immobilisiertem Fibrinogen verhindern (Abbildung 1), unterstützt dieses Konzept. Ob IV.3 Fabs die Integrin-vermittelte Signalübertragung hemmen, indem sie die aktivierungsinduzierte Annäherung einer Integrin-assoziierten Kinase an die ITAMs von FcγRIIa sterisch blockieren oder in ein noch zu identifizierendes intermediäres Andockprotein eingreifen, das Integrin-ITAM . vermittelt Kopplung, muss noch ermittelt werden.

Blutplättchen im Kreislauf patrouillieren den Blutkreislauf auf der Suche nach Stellen von Gefäßverletzungen und reagieren schnell auf eine Vielzahl externer Reize, um die Hämostase aufrechtzuerhalten. Liganden für GPCRs, Mitglieder der Immunrezeptorfamilie und Integrine lösen Signalwege aus, die zunehmend gemeinsame Komponenten zu teilen scheinen und konvergieren, um ein gemeinsames Ziel zu erreichen, nämlich die Freisetzung von Granula, die Aktivierung von Integrinen und schließlich die Thrombusbildung. Die Ergebnisse der aktuellen Studie ergänzen unser derzeitiges Verständnis des globalen Bildes der Signalübertragung in Thrombozyten um eine wichtige Information, indem sie eine Verbindung zwischen GPCRs, Immunrezeptoren und Integrinen herstellen. Die Identifizierung von FcγRIIa als wahrscheinlichem Ziel von Kinasen der Integrin-assoziierten Src-Familie und der Andockstelle für Syk, die zur Aktivierung von PLCγ2 führt, liefert einen neuen Teil des Thrombozyten-Signalisierungsschaltkreises, der die Outside-in-Integrin-vermittelte Signalübertragung mit gemeinsam genutzten Komponenten verbindet bei der Immunrezeptor-Signalisierung. Diese Erkenntnisse können zusätzlich eine Grundlage für die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung einer Vielzahl klinischer Störungen im Zusammenhang mit Blutungen und Gerinnung bilden.

Die Online-Version dieses Artikels enthält eine Datenergänzung.

Teile dieser Arbeit wurden in abstrakter Form auf der 49. Jahrestagung der American Society of Hematology am 11. Dezember 2007 in Atlanta, GA, präsentiert. 77

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