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Ist Ellmans Reagenz spezifisch für Proteine ​​und Thiole mit niedrigem Molekulargewicht?

Ist Ellmans Reagenz spezifisch für Proteine ​​und Thiole mit niedrigem Molekulargewicht?


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Ist es immer noch möglich, Cystein-reiche Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht wie Metallothionein in einer bestimmten Probe mit Ellmans Reagenz zu quantifizieren, wenn die Probe mit einigen Proteinen mit hohem Molekulargewicht verunreinigt ist?


Es ist spezifisch für Thiole im Allgemeinen. Wenn die verunreinigenden Proteine ​​lösungsmittelzugängliche Thiole enthalten, reagiert DTNB mit ihnen.


Einführung

Thiole, auch Mercaptane genannt, sind eine Klasse organischer Verbindungen, die eine Sulfhydrylgruppe (-SH) enthalten, die aus einem Schwefelatom und einem an ein Kohlenstoffatom gebundenen Wasserstoffatom besteht [1]. Der Plasma-Thiolpool wird hauptsächlich von Albuminthiolen, Proteinthiolen und geringfügig von niedermolekularen Thiolen wie Cystein (Cys), Cysteinylglycin, Glutathion, Homocystein und γ-Glutamylcystein gebildet [2].

Thiole (RSH) können über Oxidationsmittel eine Oxidationsreaktion eingehen und Disulfidbindungen (RSSR) bilden [3]. Eine Disulfidbindung ist eine kovalente Bindung, die Bindung wird auch als SS-Bindung oder Disulfidbrücke bezeichnet. Unter oxidativen Stressbedingungen kann die Oxidation von Cys-Resten zur reversiblen Bildung von gemischten Disulfiden zwischen Protein-Thiolgruppen und niedermolekularen Thiolen führen. Die gebildeten Disulfidbindungen können wieder zu Thiolgruppen reduziert werden, so dass die dynamische Thiol-Disulfid-Homöostase erhalten bleibt [4].

Der dynamische Thioldisulfid-Homöostase-Status spielt eine entscheidende Rolle beim antioxidativen Schutz, der Entgiftung, der Signalübertragung, der Apoptose, der Regulierung der enzymatischen Aktivität und der Transkriptionsfaktoren und der zellulären Signalmechanismen [5], [6]. Darüber hinaus wird die dynamische Thioldisulfid-Homöostase zunehmend mit vielen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Es gibt auch eine wachsende Zahl von Beweisen dafür, dass ein abnormaler Thioldisulfid-Homöostase-Zustand an der Pathogenese einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt ist, darunter Diabetes [7], Herz-Kreislauf-Erkrankungen [8], Krebs [9], rheumatoide Arthritis [10], chronische Nierenerkrankung [11], erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) [12], Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Friedreich-Ataxie (FRDA), Multiple Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose [13], [14], [ 15] und Lebererkrankungen [16]. Daher kann die Bestimmung der dynamischen Thioldisulfid-Homöostase wertvolle Informationen über verschiedene normale oder abnormale biochemische Prozesse liefern.

Der Thiolspiegel im Plasma wird am häufigsten mit dem klassischen Ellman-Reagenz 5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) gemessen. Diese Verbindung wird in einer Austauschreaktion durch freie Thiole stöchiometrisch reduziert, wobei ein gemischtes Disulfid entsteht und ein Molekül 5-Thionitrobenzoesäure freigesetzt wird, das bei 412 nm gemessen werden kann [17]. Ein alternatives Reagens zu DTNB ist 4,4′-Dithiodipyridin (4-DPS) [18]. Die Reduktion von 4-DPS führt zu 4-Thiopyridon-Tautomer, und dies kann bei 324 nm gemessen werden, was eine Wellenlänge im nahen Ultraviolett ist. Diese Wellenlänge kann von automatischen Analysegeräten nicht verwendet werden, da die niedrigste Wellenlänge in allen automatisierten Analysegeräten, die in Labors der klinischen Chemie verwendet werden, 340 nm beträgt.

Nach unserem besten Wissen gibt es keine automatisierte kolorimetrische Messmethode für die dynamischen Disulfidspiegel im Plasma/Serum [19]. In einigen neueren Studien wurden die Disulfid- und Thiolgehalte niedermolekularer Disulfidverbindungen des Plasmas mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) [20] [21], Fluoreszenzkapillarelektrophorese [22] und biolumineszenten Systemen bestimmt [23]. In diesen hochentwickelten Systemen werden Trennprozesse wie die Entfernung der verbleibenden Reduktionsmittel, die NaBH . sind,4, Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Tributylphosphin sowie die Fällung von Proteinen werden ebenfalls benötigt [19]. Diese Vorbehandlungsanwendungen und Messverfahren sind zeitaufwendig, arbeitsintensiv und kostspielig und erfordern komplizierte Techniken.

In dieser Studie wird ein neuartiger und automatisierter Assay zur Bestimmung der dynamischen Thiol/Disulfid-Homöostase beschrieben und ein neues Testclusterkonzept mit –S–S–, –SH, –S–S–/–SH, –S–S–/(– SH + –S–S–) und –SH/(–SH + –S–S–) wird eingeführt.


Geschwindigkeiten von Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen zwischen Mono- und Dithiolen und Ellmans Reagenz

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Abstrakt

Thiolgruppen in biologischen Molekülen spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen physiologischen Funktionen und pathologischen Zuständen. Thiole werden in zwei Hauptgruppen unterteilt: Proteinthiole und Nichtproteinthiole. Für Thiol-Assays wurde über zahlreiche Verfahren berichtet. Die meisten dieser Verfahren wurden für Glutathion, das wichtigste Nichtprotein-Thiol, entwickelt, obwohl zelluläre Proteinthiole häufiger vorkommen als Glutathion. Außerdem beinhalten diese Verfahren normalerweise einen Prozess der biologischen Probenvorbereitung, gefolgt von einem Trennverfahren, und sie sind zeitaufwendig. Wir haben zuvor über eine Reihe von Thiol-spezifischen fluorogenen Benzofurazansulfiden berichtet. Diese nicht fluoreszierenden Benzofurazansulfide reagieren schnell und spezifisch mit einem Thiol, um ein stark fluoreszierendes Thioladdukt zu bilden. Die schnelle Reaktion, Thiol-spezifische und fluorogene Natur der Sulfide führte erfolgreich zur Anwendung eines der Sulfide zur relativen Quantifizierung der Gesamtthiole in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie. In dieser Arbeit verwendeten wir dieselbe Verbindung, um die erste Hochdurchsatzmethode zur gleichzeitigen Überwachung von Proteinthiolen, Nichtproteinthiolen und Gesamtthiolen in Zellen in einer 96-Well-Platte auf einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader bei λ zu entwickelnEx = 430 nm undem = 520 nm bzw. Die Methode ist schnell und empfindlich und wurde durch ein HPLC-Thiol-Assay-Verfahren validiert. Das Verfahren kann Thiole mit Zellkonzentrationen von nur 500 Zellen/Vertiefung nachweisen. Wir haben auch gezeigt, dass die Methode Veränderungen der zellulären Thiolspiegel leicht überwachen kann. Obwohl das Verfahren keine absolute Quantifizierung für Thiole liefern kann, da die Fluoreszenzintensität verschiedener Thioladdukte variiert, liefert es eine genaue Messung der relativen Quantifizierung relativ zur Kontrolle. Die Methode wird ein wertvolles Werkzeug in der thiolbezogenen biomedizinischen/pharmazeutischen Forschung sein.


Materialien

Alle Reagenzien und Chemikalien waren von analytischer oder höherer Qualität. Ellman-Reagens (5,5&mgr;-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure), 2-Mercaptoethansulfonsäure, Natriumsalz (MES) und andere verwendete Chemikalien wurden von VWR Chemicals (BDH Prolab) und Sigma Aldrich bezogen.

ODS AQ Silicagel (Produkt 12S50) wurde von YMC Co. Ltd. Kyoto, Japan, bezogen. Bio-Gel P2 von Bio-Rad Laboratories Inc.

Alle verwendeten Lösungsmittel waren von analytischer Qualität, die von Sigma Aldrich oder Merck geliefert wurden. Lösungsmittel für HPLC waren Merck LiChroSolv-Qualität. Europa GMBH.

Große Glassäulen wurden von Soham Scientific, Fordham, Ely, Cambs., UK, geliefert

LNCaP (Androgen-sensitive menschliche Prostata-Adenokarzinom-Zellen, Klon FGC-ECACC Nr. 89110211) und PNT2-Zellen (eine normale menschliche Prostata-Epithelzelllinie, die mit dem SV40-Virus immortalisiert ist) wurden von den Public Health England Laboratories (ECACC-HPA) in Porton Down erworben , Salisbury, England. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in Zellfabriken in einem Medium gezüchtet, das aus RPMI 1640 + 2 mM Glutamin + 1 mM Natriumpyruvat, das 10 % Zone 2 FBS enthielt, bestand. Die konfluenten Zellen erhielten eine zweistündige Inkubation in frischem Medium, bevor sie durch Trypsinierung (Tryple Express) geerntet wurden. Zellzählungen wurden auf einem Nucleocounter NC3000 durchgeführt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die resultierenden Zellpellets wurden schockgefroren und bei –80°C gelagert, bis sie benötigt wurden.


Ergebnisse

In diesem Bericht verwendeten wir N-Acetylcystein (NAC) und das Thiol-enthaltende Redoxprotein, humanes Thioredoxin-1 (Trx1), um zu testen, ob MB Thiol-reaktiv ist und Proteinthiole kovalent modifiziert. Die Ergebnisse ( Fig. 1 A) zeigen, dass die Konzentration an freiem Thiol als Funktion der MB-Konzentration mit einem vollständigen Verlust abnahm, wenn MB:NAC 2:1 erreichte. Ein kinetischer Assay zeigte, dass die scheinbare Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung 5,03 M -1 s -1 betrug (Daten nicht gezeigt). Als nächstes untersuchten wir die Reaktivität von MB mit Proteinthiol unter Verwendung von rekombinantem Trx1 als Modell. Dieses Protein enthält Thiolreste, die für Lösungsmittel zugänglich sind, ein Reaktivitätsspektrum aufweisen und für seine biologische Funktion essentiell sind [12]. Abb. 1 B zeigt einen stöchiometrischen Verlust an Proteinthiolen aufgrund der MB-Behandlung. Trx1 enthält 5 Cys-Reste und das Biotin-Signal ging bei Inkubation mit MB:Trx1 bei einem Molverhältnis von 5:1 verloren, was auf eine vollständige Modifikation der Thiole (entweder Adduktion oder Oxidation, siehe unten) hinweist. Die Reaktivität von MB gegenüber primären Aminen wurde ebenfalls untersucht ( Abb. 1 C) unter Verwendung eines Verfahrens, das der Visualisierung von Proteinthiolen ähnelt. Nach der MB-Inkubation wurden die freien Amine markiert und mit Sulfo-NHS-Biotin sichtbar gemacht, wie in   Abb. 1 B gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass MB unter den Bedingungen des Assays nicht mit Aminen reagiert und vorzugsweise nur Proteinthiole modifiziert . Die Kinetik der Reaktion wurde mit einem Konzentrationsverhältnis von 5:1 unter Verwendung des mPEG . untersucht2-Biotin-Methode ( Abb. 1 D). In Übereinstimmung mit den NAC-Reaktivitätsdaten zeigen die Ergebnisse dieses Experiments, dass die Reaktion zwischen MB und Trx1 relativ langsam ist und sich der vollständigen Modifikation aller Trx1-Thiole bei 60 min nähert.

Maneb (MB) ist eine Thiol-reaktive Verbindung. (A) Die Zugabe von MB zu N-Acetylcystein verursacht einen Verlust des Thiolgehalts, gemessen mit Ellmans Reagens. Maneb bei einem Verhältnis von 2:1 M führte zu einem fast vollständigen Verlust von Thiol. (B) Unter Verwendung von Thioredoxin-1 (Trx1) als Modellprotein verursacht Maneb stöchiometrisch einen Verlust von Proteinthiolen. Mit mPEG . markierte Proteinthiole2-Biotin, ein biotinyliertes N-Ethylmaleinimid, und in Western-Blot-Analyse mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin sichtbar gemacht. (C) MB modifiziert Amine nicht, wie durch Reaktion von freien Aminen mit Sulfo-NHS-Biotin und anschließender Western-Blot-Analyse mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen wurde. (D) Ein Zeitverlauf zeigt, dass Maneb innerhalb von 15�?min den Verlust der meisten freien Thiole verursacht.

Die Aktivität von Trx1 wurde bewertet, um die funktionellen Konsequenzen der MB-Adduktion zu bestimmen. Trx1 wurde 1 h mit MB inkubiert (5:1, wie oben) und dann vor dem Aktivitätsassay entsalzt, um nicht umgesetztes MB zu entfernen. Die Daten zeigen, dass die MB-Modifikation von Trx1 die Trx1-abhängige Oxidation von NADPH in Gegenwart von Trx-Reduktase um 43% verlangsamte ( 2A und B). Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigte die Trx1-katalysierte Insulinreduktion durch DTT keine Wirkung auf die Aktivität aufgrund der MB-Modifikation (Daten nicht gezeigt). Die unvollständige Hemmung der Aktivität trotz des Nachweises für eine fast vollständige Modifikation von Thiolen zeigte, dass die MB-abhängige Thiol-Modifikation wahrscheinlich reversibel ist.

Maneb hemmt die Aktivität von Thioredoxin-1 (Trx1). Trx1 wurde mit 5 M Äquivalenten Maneb behandelt und die Aktivität wurde als Insulinreduktion in Gegenwart von NADPH und Thioredoxinreduktase-1 gemessen. Eine verminderte Aktivität war in der Geschwindigkeit der NADPH-Oxidation (A) und der berechneten Aktivität (B) ersichtlich. Ein Assay mit DTT als Reduktionsmittel anstelle der NADPH/Thioredoxin-Reduktase zeigte keine Hemmung der Aktivität (nicht gezeigt). Der Verlust von Proteinthiolen ist mit der Bildung eines Trx1-Dimers verbunden und wird durch Zugabe eines Reduktionsmittels rückgängig gemacht. Sowohl das Reduktionsmittel DTT (C) als auch N-Acetylcystein (D) können den durch Maneb vermittelten Verlust von Proteinthiolen umkehren.

Um die Reversibilität zu untersuchen, wurde MB-modifiziertes Trx1 mit 1 mM DTT inkubiert und der Thiolgehalt wurde mit mPEG . untersucht2-Biotinylierung und Western-Blotting wie oben. Die Ergebnisse zeigten, dass die Bande, die der unmodifizierten Thiolform von Trx1 entsprach, wiederhergestellt wurde ( Fig. 2 C). Titration mit NAC (Erhöhung des Verhältnisses von NAC:MB von 0 auf 13,3) zeigte, dass mehr als ein 5-facher Überschuss an NAC erforderlich war, um alle Thiole wiederherzustellen ( 2D). Die Ergebnisse zeigen daher, dass die Modifikation von Trx1 durch MB durch Behandlung mit Thiolen vollständig reversibel ist.

Röntgenkristallographie zeigte, dass oxidiertes Trx1 als Dimer kristallisiert wird, das von einem Disulfid zwischen C73-Resten gebildet wird [14]. Wir untersuchten die Möglichkeit, dass die MB-Behandlung die Bildung eines Trx1-Dimers verursachte, indem wir Trx1 mit steigenden MB-Konzentrationen behandelten, über SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen auftrennten und mit Coomassie-Blau visualisierten ( Abb. 3 A). Die Daten zeigen, dass MB zum Auftreten einer Bande bei 25 kD führt, was dem doppelten Molekulargewicht von Trx1 mit nur 1 M Äquivalent von MB entspricht. Dieses Ergebnis zeigt, dass nur ein Cys-Rest an der Dimerisierung beteiligt ist.

Die MB-Behandlung bewirkt, dass Trx1 ein Dimer bildet, das durch DTT (A) umgekehrt wird. Die Massenspektralanalyse von intaktem Trx1 (B) und MB-modifiziertem Trx1 zeigt (C) eine einzelne MB-Modifikation (Addition von 210 Masseneinheiten entsprechend der Addition von Ethylen-bis-dithiocarbamat (EBDTC)). Das Sternchen (*) bezeichnet ein m/z entsprechend einem potentiellen Mn-Trx1-Addukt (+54.9).

Aufgrund der Beobachtung von MB-vermittelter Proteinvernetzung führten wir LC–MS-Studien von intaktem, MB-behandeltem Trx1 mit ESI im positiven Ionisationsmodus und Detektion mit einem LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo) durch. Diese Experimente führten zum Nachweis von Trx1 und einem einzigen modifizierten Produkt (Abb. 3 B und C). In der MB-modifizierten Probe beobachteten wir eine starke Abnahme der Intensität des unmodifizierten Trx1-Peaks (m/z 11.602) und ein neuer Höhepunkt (m/z 11,810), verursacht durch die Bindung von Ethylen-bis-dithiocarbamat (EBDTC) an Trx1, was zu einer Massenverschiebung von 210 Masseneinheiten gegenüber dem unmodifizierten Peak führt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass MB keine einfache Oxidation von Thiolen zu Disulfiden verursacht, sondern eher an komplexeren Reaktionsprozessen teilnimmt.


Abstrakt

Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Signaltransduktion von Säugetieren. Während einiger Signalprozesse in Zellen inaktiviert die Bildung von endogenem Wasserstoffperoxid ausgewählte PTPs durch Oxidation der katalytischen Cysteinthiolatgruppe des Enzyms. Wichtig ist, dass niedermolekulare und Proteinthiole in der Zelle das Potenzial haben, die katalytisch aktiven PTPs zu regenerieren. Hier untersuchten wir die Erholung der katalytischen Aktivität von zwei oxidativ inaktivierten PTPs (PTP1B und SHP-2) durch verschiedene niedermolekulare Thiole und das Enzym Thioredoxin. Alle untersuchten Monothiole regenerierten die katalytische Aktivität von oxidiertem PTP1B, wobei die scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten um den Faktor 8 variiertenKein Thiolgruppen waren besonders wirksam. Das biologische Thiol Glutathion reparierte oxidiertes PTP1B mit einer scheinbaren Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung von 0,023 ± 0,004 M –1 s –1 , während das Dithioldithiothreitol (DTT) eine scheinbare Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von 0,325 ± 0,007 M –1 s – 1. Das Enzym Thioredoxin regenerierte die katalytische Aktivität von oxidiertem PTP1B wesentlich schneller als DTT. Thioredoxin (2 μM) wandelte oxidiertes PTP1B mit einer beobachteten Geschwindigkeitskonstante von 1,4 × 10 –3 s –1 in die aktive Form um. Die Geschwindigkeiten, mit denen diese Mittel oxidiertes PTP1B regenerierten, folgten der Reihenfolge Trx > DTT > GSHand vergleichbare Werte, die bei 2 &mgr;M Trx, 4 mM DTT und 60 mM GSH beobachtet wurden. Verschiedene Disulfide, die Nebenprodukte des Reaktivierungsprozesses sind, inaktivierten natives PTP1B bei Konzentrationen von 1–20 mM nicht. Das übliche biochemische Reduktionsmittel Tris(2-carboxyethyl)phosphin regeneriert die enzymatische Aktivität aus oxidiertem PTP1B etwas schneller als die Thiol-basierten Reagentien, mit einer Geschwindigkeitskonstante von 1,5 ± 0,5 M –1 s –1 . Wir beobachteten tiefgreifende kinetische Unterschiede zwischen der Thiol-abhängigen Regeneration der Aktivität von oxidiertem PTP1B und SHP-2, was das Potenzial von Strukturunterschieden in verschiedenen oxidierten PTPs hervorhebt, die eine signifikante Rolle bei der Geschwindigkeit spielen, mit der niedermolekulare Thiole und thiolhaltige Enzyme wie Thioredoxin und Glutaredoxin geben diesen Enzymen während Zellsignalisierungsereignissen katalytische Aktivität zurück.


ERGEBNIS UND DISKUSSION

Wir glauben fest daran, dass nur die Entwicklung chemischer Sonden, die in der Lage sind, SO2H selektiv einzufangen, eine klare Aufklärung über die Rolle der Proteinsulfinylierung ermöglichen wird. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich chemoselektive S ulfinsäure n itroso L igation (SNL). 16 Die Zugabe von SO2H-zu-C-Nitroso-Verbindungen sind seit mehr als einem Jahrhundert bekannt, das resultierende Addukt ist jedoch basenlabil (Abbildung S1). Um diese instabile Spezies abzufangen, haben wir ein elektrophiles Zentrum ( Abbildung 1 ) in die ortho-Position eines Nitroso-Benzol-Derivats (1). Das vorübergehende Oxyanion (2) reagiert mit dem Ester durch intramolekulare Umesterung zu einem stabilen Benzisoxazolon (3). Basierend auf dieser Idee haben wir eine Klasse von C-Nitrosoverbindungen synthetisiert, die eine schnelle Reaktivität mit niedermolekularem SO . zeigen2H. Diese Reagentien reagieren außer mit Thiolen nicht mit anderen biologisch relevanten Nucleophilen, die jedoch keine stabilen Addukte bilden (Abbildung S2).

Chemoselektive Markierung von Sulfinsäure mit Aryl-Nitroso-Verbindungen.

Verwendung von SNL zur Markierung von Proteinsulfinsäuren

Durch diese Ergebnisse ermutigt, haben wir uns eingestellt SNL chemische Sonden zum Nachweis von Proteinsulfinylierung zu entwickeln. Zuerst untersuchten wir die Fähigkeit von NO-Ph ( Abbildung 2 ), das C-Nitroso-Derivat, das die beste Reaktivität gezeigt hat, um SO . zu modifizieren2H innerhalb der Doppelmutante (C64,82S) der Thiolperoxidase Gpx3 aus Hefe. 17 In Gegenwart von H2Ö2, Gpx3 bildet eine intramolekulare Disulfidbrücke durch Sulfenylierung von katalytischem C36, gefolgt von Kondensation mit dem spaltenden C82. Die Mutation von C82 zu Serin stabilisiert das transiente Cys36-SOH und ermöglicht seine weitere kontrollierte Oxidation zu SO2H (siehe Hintergrundinformationen).

Nitroso-Sonden zur selektiven Markierung von Proteinsulfinsäuren.

Inkubation von NO-Ph mit C64,82S Gpx3-SO2H (22772 Da) ergibt das erwartete Sulfonamidaddukt (22949 Da), wie durch ESI-LC/MS-Analyse bestätigt ( 3A ). Unsere ersten Experimente mit kleinen Molekülen haben gezeigt, dass Thiole mit C-Nitroso-Verbindungen zu einem instabilen Sulfenamid-Addukt reagieren, das durch Reaktion mit einem zweiten Thiol gespalten wird (Abbildung S2). Um diese Ergebnisse mit Protein-SH zu bestätigen, behandelten wir vollständig reduziertes C64,82S Gpx3 (22740 Da) mit NO-Ph, gefolgt von einer Inkubation mit DTT. Überraschenderweise zeigte ESI-LC/MS die Bildung eines stabilen Addukts mit einer Masse von 22935 Da ( Abbildung 3B ). Umgekehrt verhinderte die Alkylierung des Cys-Rests mit N-Ethylmaleinimid (NEM) die Adduktbildung ( 3C ). Auch wenn man bedenkt, dass DTT das durch Zugabe von . gebildete Sulfenamid nicht spalten konnte NO-Ph zu Cys36 entspricht die nachgewiesene Massenzunahme (Δm = 195) nicht dem erwarteten Addukt (Δm = 177). Im Allgemeinen führt die Addition von Thiol an eine C-Nitrosoarylverbindung zu einem instabilen Semimercaptal, das mit einem zweiten Thiolmolekül reagieren oder eine Umlagerung eingehen kann, um ein stabileres Sulfinamid zu bilden (Abbildung S3). 18 Die spontane Umlagerung erfolgt über die Dissoziation eines Hydroxylanions und die Bildung eines kationischen Nitreniumion-Zwischenprodukts, das später durch Wasser hydrolysiert wird. Auf dem gleichen Weg würde die Addition von NO-Ph an C64,82S Gpx3-SH ein Sulfinamid-Addukt mit einer Massenzunahme von 195 Da bilden, was genau unseren Beobachtungen entspricht. Eine saure Umgebung begünstigt normalerweise die semimercaptale Umlagerung. Mit NO-Ph, jedoch scheint die Umlagerung nach der Bildung des Benzisoxazolons sogar bei neutralem pH-Wert zu erfolgen, wahrscheinlich weil die Carboxylatgruppe viel leichter vom Stickstoffatom dissoziiert als das Hydroxylanion (Abbildung S4). Die Bildung des umgelagerten Sulfinamids würde auch erklären, warum das Addukt nicht durch DTT reduziert wurde. Da bei niedermolekularen Thiolen nie eine Sulfinamidbildung beobachtet wurde, 16 fragten wir uns, warum die Umlagerung bei Protein-SH erfolgte. Wir spekulierten, dass in solchen Fällen der Angriff eines zweiten Thiolmoleküls auf das transiente Sulfenamid im Allgemeinen schneller ist als die Umlagerung des letzteren. Sobald jedoch das Sulfenamid gebildet ist, wäre der Angriff eines zweiten Cys-SH bei Verwendung von C64,82S Gpx3-SH wegen sterischer Hinderung ausgeschlossen. Um diese Hypothese zu überprüfen, testeten wir die Reaktivität von NO-Ph in Richtung C64S Gpx3, das sowohl redoxaktive als auch auflösende Cysteine ​​enthält. Die Inkubation von C64S Gpx3 mit NO-Ph förderte ausschließlich die Bildung des internen Disulfids ( 3D ). Die Anwesenheit des sich auflösenden Cys, das leicht mit dem mit katalytischem Cys gebildeten Sulfenamid-Addukt wechselwirken kann, verhindert dessen Umlagerung. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Bildung von stabilen Sulfinamiden und Disulfiden kompetitive Reaktionswege widerspiegelt, die von kinetischen Faktoren beeinflusst werden (Abbildung S5). Als zusätzlichen Beweis inkubierten wir 2-Methyl-2-propanthiol mit einem Überschuss an NO-Ph. In diesem Fall spekulierten wir, dass die Sulfenamidumlagerung erleichtert würde, da die Wechselwirkung zweier Thiolmoleküle durch sterische Hinderung stärker behindert würde. Wie erwartet, zeigten LC-MS-Analysen die Bildung des erwarteten Sulfinamid-Addukts (Abbildung S6).

ESI-LC/MS-Spektren von (A) C64,82S Gpx3-SO2H, (B) C64,82S Gpx3-SH, (C) C64,82S Gpx3-S-NEM und (D) C64S Gpx3-SH vor und nach der Behandlung mit NO-Ph. Jede Gpx3-Form wurde mit NO-Ph (40 Äquivalente) 1 h bei Raumtemperatur in PBS pH 7,4 inkubiert.

Selektiver Block freier Cysteinreste

Die Sulfenamid-Umlagerung begrenzt offenbar die Verwendung von SNL zum Nachweis der Proteinsulfinylierung. Wie das Experiment mit NEM jedoch nahelegt, kann der Schutz der freien Cysteine ​​verwendet werden, um die Bildung von nicht reduzierbaren Addukten mit gehinderten Thiolen zu verhindern. Tatsächlich beinhalten viele chemische Verfahren zum Nachweis spezifischer Thiolmodifikationen (z. B. S-Nitrosylierung) die selektive Blockierung von reduzierten Thiolen. 19 Der Erfolg dieser Assays beruht auf der Selektivität des Thiolblockierungsschritts und der Effizienz des Reagens beim vollständigen Schutz freier Thiole ohne Kreuzreaktion mit SO2H. Wir untersuchten die Reaktivität mehrerer Thiol-blockierender Reagentien gegenüber C64,82S Gpx3-SO2H. Wenn wir einen großen Überschuss gängiger Alkylierungsmittel wie NEM oder Iodacetamid (IAM) verwendeten, wurden bei ESI-LC/MS-Analysen kleine, aber signifikante Mengen an alkylierter Sulfinsäure nachgewiesen (Abbildungen S7A und S7B). Obwohl dieses Ergebnis unerwartet erscheinen mag, ist die Reaktion von niedermolekularem SO2H mit Michael-Akzeptoren und a-Halogen-Carbonylverbindungen wurde beschrieben. 20 Umgekehrt zeigten sulfhydrylreaktive Verbindungen, die die Bildung gemischter Disulfide fördern, wie 2,2′-Dipyridyldisulfid (DPS) und S-Methylmethanthiosulfonat (MMTS), keine Kreuzreaktivität gegenüber SO2H (Abbildungen S7C und S7D). Als nächstes untersuchten wir, ob der Schutz freier Cys-Reste als Disulfide ausreichend war, um eine Kreuzreaktivität mit . zu verhindern NO-Ph. Nachdem C64S,82S Gpx3-SH mit DPS (Abbildung S8A) oder MMTS (Abbildung S8B) vorinkubiert wurde, wurde der Überschuss an Thiol-blockierenden Reagenzien entfernt und das Protein mit . inkubiert NO-Ph. ESI-LC/MS-Analysen bestätigten, dass sowohl DPS als auch MMTS die Bildung des Sulfinamid-Addukts mit dem reduzierten Protein effizient blockierten.

Design und Synthese von NO-Bio

Nachdem ich das festgestellt habe SNL kann effizient zur Markierung von Protein SO . eingesetzt werden2H, wir haben entworfen und synthetisiert NO-Bio ( Figur 2 ). Die neue chemische Sonde kombiniert den C-Nitroso-Gefechtskopf (blau) mit einem Biotingriff (violett), der den Nachweis von Proteinsulfinylierung in biologischen Proben ermöglicht. Die Synthese von NO-Bio (Abbildung S9), das in den Hintergrundinformationen ausführlich beschrieben wird, beinhaltete die Kupplung von kommerziell erhältlichem Biotin-PEG4-NHS mit einem Diamino-Linker, N-tert-Butoxycarbonyl-1,6-hexandiamin. Die geschützte Aminogruppe wurde dann durch TFA-Behandlung abgespalten und das erzeugte primäre Amin wurde mit dem N-Succimidylester von NO-Ph gekuppelt, um NO-Bio zu ergeben, das durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde.

Entwicklung eines chemischen Ansatzes zum Nachweis von Proteinsulfinsäure

Wie 4A zeigt, konnte die Proteinsulfinylierung selektiv durch ein zweistufiges Verfahren nachgewiesen werden. Im ersten Fall wird eine Sulfhydryl-reaktive Verbindung (DPS oder MMTS) eingeführt, um selektiv freie Cys-Reste zu blockieren. Danach wird die Probe mit der Biotin-Tag-Sonde behandelt, NO-Bio, um Sulfinsäuren zu kennzeichnen. Wir testeten diesen Ansatz mit rekombinantem DJ-1 als Modell. Das assoziierte Protein von Parkinson hat einen konservierten Cys-Rest, C106, der extrem empfindlich auf oxidativen Stress reagiert und dazu neigt, ein stabiles SO2H zu bilden. Viele Studien zeigen, dass DJ-1 Zellen durch die Bildung von C106-SO2H vor oxidativer Stress-vermittelter Apoptose schützt. 21,22 Darüber hinaus enthält DJ-1 zwei weitere freie Cys-Reste, C46 und C53, die nicht redoxaktiv sind. Obwohl C53 nicht durch ROS modifiziert wird, ist es immer noch sehr reaktiv gegenüber Elektrophilen. 23 Dementsprechend stellt DJ-1 ein hervorragendes Modell dar, um die Selektivität unserer Strategie zu testen. Reduziertes oder oxidiertes WT DJ-1 wurde mit DPS inkubiert, gefolgt von einer Behandlung mit NO-Bio. Wie in 4B gezeigt, bestätigte die Massenanalyse eindeutig die selektive Modifikation des ausschließlich oxidierten DJ-1. Interessanterweise förderte DPS die Bildung eines internen Disulfids zwischen C46 und C53. Wir spekulierten, dass DPS zuerst mit dem stark lösungsmittelexponierten C53 reagieren würde, um ein gemischtes Disulfid zu ergeben. Später greift das relativ tiefer vergrabene C46 das aktive Disulfid an, was zur Bildung einer internen Disulfidbrücke führt (Abbildung S10). Ein selektiver Schutz des freien Cys kann auch mit MMTS erreicht werden (Abbildung S11). Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass MMTS mit Thiolen relativ langsamer reagiert als DPS. Tatsächlich wurden sogar in der reduzierten Probe geringe Mengen an Cys-SO2H nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass C106 während der Thiolblockierung teilweise oxidiert wurde. Obwohl die Zugabe von EDTA zum Puffer diese unerwünschte Oxidation verhinderte, entschieden wir uns, in allen nachfolgenden Experimenten das effizientere DPS zu verwenden. Der Biotingriff der Sonde ermöglicht die Sichtbarmachung der markierten Proteine ​​durch Streptavidin-Blotting. Daher ist die Selektivität von NO-Bio die Markierung wurde auch durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Reduziertes oder oxidiertes DJ-1 wurde mit DPS behandelt, gefolgt von einer Inkubation mit NEIN-Bio. Die Reaktionen wurden dann einer SDS-PAGE unterzogen und durch Streptavidin-Blotting analysiert. Behandlung von oxidiertem DJ-1 mit NO-Bio lieferte eine selektive Proteinmarkierung, während DJ-1 durch Streptavidin-Blotting in Abwesenheit des Oxidationsmittels überhaupt nicht nachgewiesen wurde, was die Spezifität unseres chemoselektiven Ansatzes demonstriert (Abbildung S12). NO-Bio zeigte auch eine höhere Sensitivität im Vergleich zu einem kommerziell erhältlichen Antikörper gegen hyperoxidiertes DJ-1 (Abbildung S13), was den Nachweis von sulfinyliertem DJ-1 in relativ niedrigen Konzentrationen ermöglichte.

Markierung von DJ-1 Sulfinsäure mit NO-Bio.

DJ-1 besitzt einen hochkonservierten G18-Rest, der die Ionisierung von C106 erleichtert, seinen pK . reduziertein, und hilft, C106-SO . zu stabilisieren2H. Kleine Veränderungen dieser Position können die oxidativen Eigenschaften von C106 drastisch beeinflussen. 24 Zum Beispiel hat die E18D DJ-1-Mutante eine geringere Neigung zur Bildung von SO2H, aber die strukturell ähnliche E18N-Mutante zeigt dank einer starken Stabilisierung von C106-SO . eine erhöhte Oxidationsneigung2H. Wir haben die Sensitivität von NO-Bio, die die unterschiedlichen Oxidationsneigungen verschiedener DJ-1-Mutanten untersucht, einschließlich C106S DJ-1, das kein redoxaktives Cystein enthält. Jede DJ-1-Variante (WT, E18N, E18D und C106S) wurde H . ausgesetzt2Ö2, mit DPS behandelt und schließlich mit inkubiert NO-Bio. Die Western-Blot-Analyse stimmte mit den erwarteten Ergebnissen überein ( 4c ). E18N DJ-1 zeigte einen höheren Sulfinylierungsanteil, selbst in Abwesenheit von H2Ö2. Der Sulfinylierungsgrad der E18D-Mutante, die oxidativem Stress ausgesetzt war, war dagegen fast vernachlässigbar. Es ist erwähnenswert, dass C106S DJ-1 mit H . behandelt wurde2Ö2 wurde durch Streptavidin-Blotting nicht nachgewiesen, was bestätigt, dass nur C106 SO . bilden kann2H unter relativ milden Oxidationsbedingungen.

NO-Bio weist sulfinsäuremodifizierte Proteine ​​in Zelllysaten nach

Nachdem wir die Spezifität und Sensitivität unseres zweistufigen Ansatzes in homogenen Proteinlösungen festgestellt hatten, untersuchten wir als nächstes, ob NO-Bio konnte Protein-SO . nachweisen2H in einem komplexen, unfraktionierten Zelllysat. Zu diesem Zweck haben wir unsere optimierte Chemie an einem Zellextrakt aus ganzen humanen Zervixkarzinomen (HeLa) getestet, der durch Lysieren der Zellen in modifiziertem RIPA-Puffer mit Katalase und DTT gewonnen wurde. Der reduzierende Lysepuffer verhindert eine weitere Oxidation von SO2H und behält freies Cys in der reduzierten Form bei, wodurch eine Überschätzung der Proteinsulfinylierung vermieden wird. Abbildung 5A zeigt einen HRP-Streptavidin-Western-Blot, der darauf hinweist, dass robuste Protein-SO .-Spiegel2H kann unter normalen Bedingungen nachgewiesen werden. Um zu zeigen, dass DPS alle freien Thiole effizient einfängt und daher der Streptavidin-Blot nur sulfinylierte Proteine ​​zeigte, verwendeten wir Iodacetyl-PEG2-Biotin (IAM-Bio). Das biotinylierte Reagens ist in der Lage, Thiole wie freie Cys-Reste zu alkylieren. Die Vorbehandlung der Probe mit DPS hob das IAM-Bio-abhängige Signal vollständig auf (Abbildung 5A, Spur 3), was indirekt bewies, dass NO-Bio reagiert nur mit Protein SO2H. Als nächstes haben wir festgestellt, ob unser chemischer Ansatz eine Zunahme der Proteinsulfinylierung in menschlichen Zellkulturen nachweisen kann. HeLa-Zellen wurden mit steigenden Mengen an H . inkubiert2Ö2 für 15 Minuten (dieser Zeitpunkt wurde nach einem vorläufigen zeitabhängigen Experiment gewählt – Abbildung S14A), lysiert und dann wie oben beschrieben markiert. Western-Blot-Analyse zeigte, dass das Niveau der Proteinsulfinylierung durch H . erhöht wurde2Ö2 dosisabhängig (Abbildung S14B). Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass SO2H ist stabil genug, um erfolgreich in Zelllysaten nachgewiesen zu werden und erfordert kein in vivo Beschriftung.

Reaktivität von No-Bio in Zelllysaten – 5 μg Protein beladen pro Spur – (A). Analyse der Proteinsulfinylierung in menschlichen Lungentumor-Gewebelysaten – 1 μg Protein beladen pro Spur – (B). Legende: T1-001-T1 Papilläres Adenokarzinom T1-001-N1 Passendes Normalgewebe T1-005-T1 Adenokarzinom T1-005-N1 Passendes Normalgewebe T1-013-T1 Adeno-Plattenepithelkarzinom T1-013-N1 Passendes Normalgewebe.

Proteinsulfinylierungsspiegel bei Lungenkrebs beim Menschen

Um zu zeigen, dass unsere Methode auf komplexere biologische Fragestellungen anwendbar ist, haben wir ein vergleichendes Sulfinsäure-Profiling in humanem Lungentumorgewebe durchgeführt. Für diese Experimente wurde die Proteinsulfinylierung durch Western-Blot-Analyse von Ganzzelllysaten charakterisiert. Unsere Ergebnisse zeigten eine sehr variable Anwesenheit von SO2H unter den drei Patienten-Tumorgewebeproben ( 5B ). Alle drei Tumorgewebe (papilläres Adenokarzinom, Adenokarzinom und adeno-Plattenepithelkarzinom) zeigten eine signifikante Zunahme des SO .-Ausmaßes2H-Modifikationen vs. angepasstes normales Gewebe. Obwohl die Anzahl der Proben zu gering war, um allgemeine Schlussfolgerungen zu ziehen, deuten diese ersten Beobachtungen darauf hin, dass erhöhte SO .-Spiegel2H könnte als Krebsmarker verwendet werden.


Redox und Thiole in Archaeen

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

  • Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout
  • p.11, l. 352 unclear sentence
  • p.12, l. 364 add UDP in Appendix A
  • p.12, l. 391 closing round bracket missing

Comments and Suggestions for Authors

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout

Response: We now use &gammaGC consistently throughout the manuscript. We no longer alternate with &gamma-GC.

p.11, l. 352 unclear sentence

Response: We corrected the sentence with stating cysteine instead of CoA. This correction now clarifies the sentence.

p.12, l. 364 add UDP in Appendix A

Response: UDP is now defined in Appendix A.

p.12, l. 391 closing round bracket missing

Response: The closing round bracket is now added.

Manuscript antioxidants-775988 by Rawat and Maupin-Furlow

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

  1. 67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite
  2. 276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here
  3. 311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA
  4. 332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite
  5. 334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase
  6. 371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

  1. 30 such as
  2. 38 the canonical pathway
  3. 76 auto-oxidation
  4. 107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo
  5. 109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors
  6. 140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo
  7. 187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?
  8. 202 &lsquoinsulin&rsquo instead of &lsquoinulin&rsquo
  9. 210 InterPro
  10. 266 &lsquosequences&rsquo
  11. 275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing
  12. 281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing
  13. 322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing
  14. 333 correct citation name
  15. 358 &lsquothan&rsquo instead of &lsquothat&rsquo
  16. 359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo
  17. 387 &lsquoto involve to&rsquo?
  18. 390-391 &lsquoan archaeal&rsquo
  19. 411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

Response: Thanks, we have altered this section of the manuscript to enhance organization and highlight the insight provided on thioredoxins in Archaea including reference to methanogens.

67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite

Response: Thanks, we have rewritten these sentences to emphasis the theme of this section is focused on GSH synthesis.

276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here

Response: we now state that DTNB would presumably oxidize all of the &ndashSH groups.

311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA

Response: we now state that it [leads to the induction of expression of the gene encoding OhrA]

332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite

Response: transition now added.

334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase

Response: this point is now corrected.

371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Response: we have reorganized this paragraph to more clearly explain this section of the manuscript.

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

Response: we now consistently use archaea in a general manner - since we do not specifically state Archaeen domain in the text.

Response: corrected to autoxidation.

107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo

109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors

Response: corrected to all &lsquoand&rsquo.

140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo

187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?

Response: corrected all Interpro to InterPro.

275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing

Response: Ellman's reagent [(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) or DTNB)] is now defined.

281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing

Response: Docosahexaenoic acid (DHA) and bis(2‐hydroxyethyl) disulfide (HED) are now defined.

322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing

Response: dithiothreitol (DTT) is now defined.

333 correct citation name

Response: We were unclear what is meant by this point but have added that the information is related to the binding of MsvR to its own promoter to clarify which promoter is under discussion if this is what the reviewer meant.

line 333 is related to the following: Incubation of oxidized MsvR with the M. acetivorans thioredoxin system, consisting of NADPH, thioredoxin reductase and one of the 7 thioredoxins, leads to reduction of the cysteines and binding to its own promoter [105].

The citation references the work by the following which appears appropriate for the information presented:

Sheehan, R. McCarver, A.C. Isom, C.E. Karr, E.A. Lessner, D.J. The Methanosarcina acetivorans thioredoxin system activates DNA binding of the redox-sensitive transcriptional regulator MsvR. J Ind Microbiol Biotechnol 2015, 42, 965-969, doi:10.1007/s10295-015-1592-y.

359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo

411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Response: the shade of gray is now darker for better contrast.

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

Response: FTR/FDR added to legend with explanation and citation.

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Line 163 Please change Halobacterium salinarum zu H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus zu P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae Familie

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii in P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus in S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus in S. solfataricus

Lane 320 Insert the follow reference: Lipscomb, G.L. , Schut, G.J. Scott RA, Adams, M.W.W. SurR is a master regulator of the primary electron flow pathways in the order Thermococcales. Mol Microbiol 2017, 104, 869-881, doi: 10.1111/mmi.13668

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus in P. furiosus und Sulfolobus solfataricus in S. solfataricus

Comments and Suggestions for Authors

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

Response: we replaced the , with : to avoid confusion and clarify that bacillithiol is one example of a LMW thiol that differs from GSH.

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Response: Thanks, we now include all of this information in the manuscript text in the section which discusses Prxs and the work performed in archaea. The references listed above and citations are now in the main body of the text.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

Response: We now use GRX and TRX throughout the manuscript.

Line 163 Please change Halobacterium salinarum zu H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus zu P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae Familie

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii in P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus in S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus in S. solfataricus

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus in P. furiosus und Sulfolobus solfataricus in S. solfataricus

Response: We have made all of these taxonomic changes and now use appropriate abbreviations.