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Separate DNA-Fragmente mit sehr unterschiedlicher Größe (Oligo- und Lambda-DNA)

Separate DNA-Fragmente mit sehr unterschiedlicher Größe (Oligo- und Lambda-DNA)


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Ich führe eine Ligationsreaktion an einem der klebrigen Enden der Lambda-DNA durch.

Das Oligo für die Ligation beträgt 25 bp (10x Überschuss), während Lambda-DNA 48 kbp hat. Ich möchte die Lambda-DNA zurückgewinnen und das unreagierte überschüssige Oligo verwerfen. Angesichts ihrer sehr unterschiedlichen Molekulargewichte sollten sie leicht zu trennen sein, aber ich konnte online keine Standardmethode finden.

Ich möchte kein Gel laufen lassen und mein Gesamtprobenvolumen beträgt 0,5 ml. Es gibt einige Filtersäulen, die möglicherweise funktionieren, aber das Eingangsvolumen beträgt nur 25 uL (ich habe das 20-fache).

muss ich nicht loswerden alle das Oligo mit etwas mehr Lambda-DNA als Oligo am Ende würde ausreichen.

Welches einfache Protokoll kann in diesem Fall funktionieren?


Eine Spin-Säule kann für Ihre Zwecke funktionieren, da Sie mehrere Bindungsrunden durchführen können, wenn Ihr Volumen zu groß ist, um in einem einzigen Durchgang zu binden, aber bei DNA dieser Größe bleibt eine Menge irreversibel an der Säule haften. Siehe zum Beispiel das Protokoll für das Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit.

Daher würde ich empfehlen, nur eine Ethanolfällung durchzuführen, die die Gewinnung längerer DNA-Moleküle begünstigt (siehe zum Beispiel dieses Protokoll).


Die 7 wichtigsten Techniken der Gentechnik

Dieser Artikel beleuchtet die sieben wichtigsten Techniken der Gentechnik. Die sieben Techniken sind: (1) Agarose-Gelelektrophorese (2) Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren (3) Isolierung von Chromosomen (4) Nukleinsäure-Blotting-Techniken (5) DNA-Sequenzierung (6) Alternative Methoden der DNA-Sequenzierung und (7) Chemische Synthese von DNA.

Technik Nr. 1. Agarose-Gelelektrophorese:

Elektrophorese bezeichnet die Bewegung geladener Moleküle in einem elektrischen Feld. Die negativ geladenen Moleküle bewegen sich zur positiven Elektrode, während die positiv geladenen Moleküle zur negativen Elektrode wandern.

Die Gelelektrophorese ist eine routinemäßig verwendete Analysetechnik zur Trennung/Reinigung spezifischer DNA-Fragmente. Das Gel besteht entweder aus Polyacrylamid oder Agarose. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wird zur Trennung kleinerer DNA-Fragmente verwendet, während Agarose-Elektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 100 Basenpaaren bis 20 kb-Paaren geeignet ist. Die Gelelektrophorese kann auch zur Trennung von RNA-Molekülen verwendet werden.

Agarose ist ein Polysaccharid, das aus Algen gewonnen wird. Es bildet ein festes Gel, wenn es in wässriger Lösung in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2,0 % (w/v) gelöst wird. Es ist hier anzumerken, dass die für die Elektrophorese verwendete Agarose eine gereinigtere Form von Agar ist, verglichen mit der für Kulturzwecke verwendeten. Eine schematische Ansicht der Agarosegel-Elektrophoreseeinheit ist in Abb. 7.1 dargestellt.

Die DNA-Proben werden in die Wells der Geloberfläche gegeben und die Stromversorgung eingeschaltet. Da die DNA negativ geladen ist, bewegen sich DNA-Fragmente durch das Gel in Richtung der positiven Elektrode. Die Migrationsgeschwindigkeit der DNA hängt von der Größe und Form ab. Im Allgemeinen bewegen sich kleinere lineare Fragmente schneller als die größeren. Daher kann die Gelelektrophorese bequem zur Trennung einer Mischung von DNA-Fragmenten basierend auf ihrer Größe verwendet werden.

Agarose bildet Gele mit Porengrößen im Bereich von 100 bis 300 nm Durchmesser. Die tatsächliche Porengröße hängt von der Konzentration der Agarose ab. Die Größe der Poren bestimmt den Bereich der DNA-Fragmente, die bei der Elektrophorese getrennt werden können. Beispielsweise wird eine 0,3%ige Agarose zur Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 5 und 50 kb verwendet, während eine 5%ige Agarose 100-500 bp-Moleküle trennen kann.

Die Migration von DNA-Fragmenten während der Elektrophorese kann durch Verwendung von Farbstoffen mit bekannten Migrationsraten verfolgt werden. Diese Farbstoffe werden den DNA-Proben vor dem Laden zugesetzt. Die Banden der DNA können durch Einweichen des Gels in Ethidiumbromidlösung nachgewiesen werden.

Bei Aktivierung durch ultraviolette Strahlung emittieren DNA-Basenpaare in Verbindung mit Ethidiumbromid orange Fluoreszenz. Und so können die in der Agarose-Elektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente identifiziert werden (Abb. 7.2).

Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE):

Die großen DNA-Moleküle (10 Mb) können in Agarosegelen unter Verwendung von PFGE getrennt werden. Dies wird ermöglicht, indem die Richtung der DNA-Migration periodisch geändert wird, indem die Ausrichtung des elektrischen Felds in Bezug auf das Gel geändert wird. Wenn sich die Ausrichtung des elektrischen Felds ändert, richten sich die DNA-Moleküle aus und wandern in neue Richtungen.

Die Haupteinschränkung der Pulsfeld-Gelelektrophorese besteht darin, dass die Proben nicht in geraden Linien wandern. Dies macht die weitere Analyse der DNA ziemlich schwierig.

Konturgeklemmte homogene Elektro-Feld-Elektrophorese (CHEF):

CHEF ist ein verbessertes Verfahren zum Anlegen alternierender elektrischer Felder, um DNA-Moleküle in der Elektrophorese zu trennen. Bei diesem Ansatz wird der Umorientierungswinkel des elektrischen Felds auf 120°C (oder sogar auf 90°) festgelegt und eine Elektrophorese durchgeführt. Mit CHEF können große DNA-Fragmente (200-300 kb) routinemäßig innerhalb von Stunden getrennt werden.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE):

Polyacrylamidgel besteht aus Ketten von Acrylamidmonomeren, die mit Methylenbisacrylamideinheiten vernetzt sind. Die Porengröße des Gels ist abhängig von der Gesamtkonzentration der Monomere und der Vernetzungen. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) dient der Trennung einzelsträngiger DNA-Moleküle, die sich in der Länge nur um ein Nukleotid unterscheiden.

Agarosegele können hierfür nicht verwendet werden. Dies liegt daran, dass Polyacrylamidgele kleinere Porengrößen als Agarosegele haben und eine präzise Trennung von DNA-Molekülen von 10-1500 bp ermöglichen. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine wunderbare Technik zur Feintrennung von DNA-Molekülen, die sich sogar um 1-3 Nukleotide voneinander unterscheiden. PAGE wird bei der DNA-Sequenzierung und zur Identifizierung amplifizierter DNA-Produkte durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.

Andere Anwendungen der Gelelektrophorese:

Neben der Trennung von DNA-Fragmenten ist die Gelelektrophorese auch nützlich, um die molekulare Konfiguration von DNA-Molekülen und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen zu verstehen. Letzteres beruht auf dem Prinzip, dass die Bindung eines Proteins an DNA in der Regel zu einer Verringerung der elektrophoretischen Mobilität führt.

Die elektrophoretische Technik für die Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung beinhaltet die Zugabe eines gewünschten Proteins zu doppelsträngigen DNA-Fragmenten, die Trennung dieses Komplexes und der nackten DNA durch Elektrophorese. Die getrennten Muster können visualisiert werden, um die Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen zu verstehen.

Technik # 2. Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren:

Fast alle Experimente, die sich mit Genmanipulationen befassen, erfordern entweder reine DNA- oder RNA-Formen oder manchmal sogar beides. Daher besteht ein Bedarf für die zuverlässige Isolierung von Nukleinsäuren aus den Zellen. Die Reinigung von Nukleinsäuren umfasst im Allgemeinen drei Stufen.

1. Aufbrechen oder Öffnen der Zellen, um Nukleinsäuren freizulegen.

2. Abtrennung von Nukleinsäuren von anderen zellulären Komponenten.

3. Gewinnung von Nukleinsäuren in reiner Form.

Zur Aufreinigung von Nukleinsäuren werden analytische Verfahren verwendet, die einige Schritte bis mehrere Schritte umfassen. Tatsächlich sind heutzutage kommerzielle Kits leicht erhältlich, um die Reinigung von entweder DNA oder RNA aus verschiedenen Quellen zu ermöglichen. Die Grundprinzipien und Verfahren zur Nukleinsäurereinigung werden kurz beschrieben.

Reinigung von zellulärer DNA:

Der erste Schritt zur DNA-Reinigung besteht darin, die Zellen zu öffnen und DNA freizusetzen. Die Methode sollte schonend sein, um die native DNA zu erhalten. Aufgrund der Variabilität in der Zellstruktur sind auch die Ansätze zum Aufbrechen der Zellen unterschiedlich.

Die Bakterienzellen (z. B. E. coli) können durch eine Kombination von enzymatischen und chemischen Behandlungen lysiert werden. Dazu werden das Enzym Lysozym und die Chemikalie Ethylendiamintetraacetat (EDTA) verwendet. Darauf folgt die Zugabe eines Detergens wie Natriumdodecylsulfat (SDS).

Tierische Zellen, insbesondere kultivierte Tierzellen, können durch direkte Behandlung der Zellen mit Detergenzien (SDS) leicht geöffnet werden.

Pflanzenzellen mit starken Zellwänden erfordern eine harte Behandlung, um aufzubrechen. Die Zellen werden eingefroren und dann in einem Mörser und Pistill gemahlen. Dies ist eine effektive Möglichkeit, die Zellulosewände zu durchbrechen.

Methoden zur Reinigung von DNA:

Es gibt zwei verschiedene Ansätze, um DNA aus den Zellextrakten zu reinigen.

1. Reinigung von DNA durch Entfernung zellulärer Bestandteile:

Dies beinhaltet den Abbau oder die vollständige Entfernung aller zellulären Komponenten außer der DNA. Dieser Ansatz ist geeignet, wenn die Zellen keine großen Mengen an Lipiden und Kohlenhydraten enthalten. Der Zellextrakt wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Trümmer (z. B. Zellwandstücke) zu entfernen, die am Boden des Röhrchens ein Pellet bilden.

Der Überstand wird gesammelt und mit Phenol behandelt, um Proteine ​​an der Grenzfläche zwischen der organischen und der wässrigen Schicht auszufällen. Die wässrige Schicht, die die gelösten Nukleinsäuren enthält, wird gesammelt und mit dem Enzym Ribonuklease (RNase) behandelt. Die RNA wird abgebaut, während die DNA intakt bleibt. Diese DNA kann durch Zugabe von Ethanol präzipitiert und nach Zentrifugation isoliert und in einem geeigneten Puffer suspendiert werden.

2. Direkte Reinigung von DNA:

Bei diesem Ansatz wird die DNA selbst selektiv aus dem Zellextrakt entfernt und isoliert. Es gibt zwei Möglichkeiten zur direkten Reinigung von DNA. Bei einem Verfahren führt die Zugabe eines Detergens Cetyltrimethylammonium (CTAB) zur Bildung eines unlöslichen Komplexes mit Nukleinsäuren. Dieser Komplex in Form eines Niederschlags wird nach Zentrifugation gesammelt und in einer Hochsalzlösung suspendiert, um Nukleinsäuren freizusetzen. Durch Behandlung mit RNase wird RNA abgebaut. Reine DNA kann durch Ethanolfällung isoliert werden.

Die zweite Technik basiert auf dem Prinzip der engen Bindung zwischen DNA und Silica-Partikeln in Gegenwart eines Denaturierungsmittels wie Guanidiniumthiocyanat. Die DNA-Isolierung kann durch direkte Zugabe von Silica-Partikeln und Guanidiniumthiocyanat zum Zellextrakt und anschließende Zentrifugation erreicht werden. Alternativ kann eine Kieselsäure enthaltende Säulenchromatographie verwendet werden, durch die der Extrakt und Guanidiniumthiocyanat geleitet werden. Die DNA bindet an die Kieselsäurepartikel in der Säule, die wiedergewonnen werden kann.

Reinigung von Plasmid-DNA:

In gentechnischen Experimenten werden oft reine Formen von Plasmid-DNA benötigt. Voraussetzung für eine erfolgreiche Isolierung von Plasmid-DNA ist die entsprechende und schonende Lyse der Wirtszellen, damit die Plasmid-DNA ohne zu viel Kontamination mit chromosomaler DNA freigesetzt wird.

Die chromosomale DNA der Wirtszelle mit hohem Molekulargewicht kann zusammen mit den Zelltrümmern durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation entfernt werden. Dabei entsteht ein geklärtes Lysat, aus dem reine Plasmid-DNA isoliert werden kann. Von den verschiedenen Verfahren, die zur Isolierung von Plasmid-DNA verwendet werden, werden zwei kurz beschrieben.

Isopyknische Zentrifugationsmethode:

Das geklärte Lysat (siehe oben) wird mit einer Lösung von Cäsiumchlorid (CsCl) behandelt, die Ethidiumbromid (EtBr) enthält. EtBr kann an lineare DNA-Moleküle (chromosomale DNA-Fragmente und offene Plasmid-DNA) binden und nicht an zirkuläre Plasmid-DNA. Die Dichte des DNA-EtBr-Komplexes ist viel geringer als die der Plasmid-DNA. Die zirkuläre Plasmid-DNA kann durch isopyknische Zentrifugation in einem CsCl-EtBr-Gradienten aufgetrennt werden (Abb. 7.3).

Birnboim- und Doly-Methode:

Die von Birnboim und Doly (1979) entwickelte Technik wird häufig zur Reinigung von Plasmid-DNA verwendet. Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass es einen engen pH-Bereich (12,0-12,5) gibt, bei dem die Denaturierung von linearer DNA und nicht von geschlossener zirkulärer DNA auftritt.

Wenn das geklärte Lysat einem sorgfältig überwachten alkalischen pH (12,0 bis 12,5) ausgesetzt wird, bleiben die Plasmid-DNA-Moleküle in Lösung, während alle anderen DNA-Moleküle denaturiert werden und präzipitieren. Dieser Niederschlag kann durch Zentrifugation entfernt werden. Die Plasmid-DNA im Überstand kann durch Ethanolfällung konzentriert werden. Manchmal kann eine weitere Reinigung der Plasmid-DNA erforderlich sein, die durch Gelfiltration erreicht werden kann.

Faktoren, die die Reinigung von Plasmid-DNA beeinflussen:

Mehrere Faktoren beeinflussen die Reinigung von Plasmid-DNA. Die wichtigsten werden kurz beschrieben.

1. Nummer der Plasmidkopie:

Die Anzahl der Plasmide, die zum Zeitpunkt der Ernte in den Wirtszellen vorhanden sind, ist wichtig. Die Kopienzahl wiederum wird durch das Wachstumsmedium, den Genotyp der Wirtszelle und das Wachstumsstadium beeinflusst. Im Allgemeinen ist die Ausbeute an Plasmid-DNA bei der Reinigung umso besser, je höher die Kopienzahl ist.

2. Herstellung von geklärtem Lysat:

Die angewandte Methodik und die Sorgfalt, die für die Lyse der Wirtszellen verwendet wird, um geklärtes Lysat herzustellen, ist wichtig.

3. Wirtszellen mit End-A-Gen:

Die Wildtyp-Wirtszellen besitzen ein endA-Gen, das für das Enzym Endonuklease I kodiert. Die Funktionen dieses Enzyms sind nicht eindeutig bekannt. Es wird jedoch beobachtet, dass Zellstämme, die endA-Mutationen tragen, die Stabilität und Ausbeute an Plasmid-DNA verbessern.

Reinigung von mRNA:

Unter den RNAs wird mRNA häufig in reiner Form für genetische Experimente benötigt. Nachdem die Zellen bei der Lyse durch verschiedene Techniken aufgebrochen wurden, wird der Zellextrakt durch Behandlung mit Phenol oder Phenol/Chloroform-Gemischen deproteiniert. Beim Zentrifugieren werden die Nukleinsäuren in der oberen wässrigen Phase konzentriert, die dann mit Isopropanol oder Ethanol ausgefällt werden kann.

Die Aufreinigung der mRNA kann durch Affinitätschromatographie mit Oligo (dT)-Cellulose erfolgen (Abb. 7.4). Dies basiert auf dem Prinzip, dass Oligo(dT)-Cellulose spezifisch an die Poly(A)-Schwänze eukaryontischer mRNA binden kann. Somit ist es durch diesen Ansatz möglich, mRNA aus DNA, rRNA und tRNA zu isolieren.

Wenn die Nukleinsäurelösung durch eine affinitätschromatographische Säule geleitet wird, bindet das Oligo (dT) an Poly(A)-Schwänze der mRNA. Durch Waschen der Säule mit Hochsalzpuffer können DNA, rRNA und tRNA eluiert werden, während die mRNA fest gebunden ist. Diese mRNA kann dann durch Waschen mit salzarmem Puffer eluiert werden. Die mRNA wird mit Ethanol präzipitiert und durch Zentrifugation gesammelt (Abb. 7.4).

Technik # 3. Isolierung von Chromosomen:

Die Trennung großer Chromosomen von Eukaryoten ist durch konventionelle Elektrophorese nicht möglich. Die einzelnen Chromosomen von Eukaryoten können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), auch Durchflusszytometrie oder Durchflusskaryotypisierung genannt, getrennt werden.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung:

Zur Durchführung von FACS werden die sich teilenden Zellen (mit kondensierten Chromosomen) vorsichtig aufgebrochen und eine Mischung intakter Chromosomen hergestellt. Diese Chromosomen werden dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Die Menge des Farbstoffs, der an ein Chromosom bindet, hängt von seiner Größe ab. Daher binden größere Chromosomen (mit mehr DNA) mehr Farbstoff und fluoreszieren heller als die kleineren.

Die farbstoffgemischten Chromosomen werden verdünnt und durch eine feine Öffnung geleitet, die zur Bildung eines Tröpfchenstroms führt. Jedes Tröpfchen enthält ein einzelnes Chromosom. Die Fluoreszenz der Chromosomen wird mit einem Laser detektiert.

Wenn die Fluoreszenz anzeigt, dass das vom Laser beleuchtete Chromosom das gewünschte ist, wird eine elektrische Ladung speziell auf diese Tröpfchen (und keine anderen) aufgebracht, die aufgeladen werden. Dies führt zur Ablenkung der Tröpfchen mit dem gewünschten Chromosom, die vom Rest getrennt und gesammelt werden können (Abb. 7.5). Ungeladene Tröpfchen, die nicht das gewünschte Chromosom enthalten, passieren ein Abfallsammelgefäß.

Sammlung von Chromosomen mit identischer Größe:

Die direkte Anwendung von FACS (oben beschrieben) ist nicht geeignet zur Trennung von Chromosomen gleicher Größe, z.B. Chromosomen 21 und 22 beim Menschen. Die Sammlung solcher Chromosomen kann durch Verwendung spezieller Farbstoffe (z. B. Hoechst 33258 und Chromomycin A .) erreicht werden3), die an AT-reiche DNA oder GC-reiche DNA binden. Der Rest des Verfahrens ist das gleiche, das beschrieben wurde. Es ist zweckmäßig, zwei oder mehr Chromosomen mit identischer Größe durch verschiedene Farbstoffe zu trennen. Dies ist möglich, da wahrscheinlich keine zwei Chromosomen identische GC/AT-Gehalte enthalten.

Technik # 4. Nukleinsäure-Blotting-Techniken:

Blotting-Techniken sind weit verbreitete Analysewerkzeuge zur spezifischen Identifizierung von gewünschten DNA- oder RNA-Fragmenten aus Tausenden von Molekülen. Blotting bezieht sich auf den Prozess der Immobilisierung von Probennukleinsäuren oder festem Träger (Nitrozellulose oder Nylonmembranen). Die geblotteten Nukleinsäuren werden dann als Targets in den Hybridisierungsexperimenten für ihren spezifischen Nachweis verwendet. Ein Überblick über die Nukleinsäure-Blotting-Technik ist in Abb. 7.6 dargestellt.

Arten von Blotting-Techniken:

Die am häufigsten verwendeten Blotting-Techniken sind unten aufgeführt:

I. Southern-Blotting (für DNA)

II. Northern-Blotting (für RNA)

NS. Kolonie- und Plaque-Hybridisierung (Zellen aus Kolonie).

Das Southern Blotting ist nach dem Wissenschaftler Ed Southern (1975) benannt, der es entwickelt hat. Die anderen Bezeichnungen Northern Blotting und Western Blotting sind Laborjargons, die mittlerweile akzeptiert werden. Western-Blotting beinhaltet die Übertragung von Protein-Blots und deren Identifizierung unter Verwendung spezifischer Antikörper.

Eine schematische Darstellung einer typischen Blotting-Apparatur ist in Abb. 7.7 dargestellt.

I. Southern Blotting:

Die Southern-Blotting-Technik ist das erste Nukleinsäure-Blotting-Verfahren, das 1975 von Southern entwickelt wurde. Sie ist in Abb. 7.8 dargestellt und kurz beschrieben.

Die aus Zellen/Geweben isolierte genomische DNA wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut. Diese Mischung wird in eine Vertiefung in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel geladen und dann einer Elektrophorese unterzogen. DNA, die negativ geladen ist, wandert in Richtung der Anode (positiv geladene Elektrode), die kleineren DNA-Fragmente bewegen sich schneller.

Die abgetrennten DNA-Moleküle werden durch Einwirkung eines milden Alkalis denaturiert und auf Nitrozellulose- oder Nylonpapier übertragen. Dies führt zu einer exakten Nachbildung des Musters der DNA-Fragmente auf dem Gel. Die DNA kann unter Hitzeeinwirkung (80°C) an das Papier angelagert werden. Das Nitrozellulose- oder Nylonpapier wird dann markierten cDNA-Sonden ausgesetzt. Diese Sonden hybridisieren mit komplementären DNA-Molekülen auf dem Papier. Das Papier wird nach gründlichem Waschen einem Röntgenfilm ausgesetzt, um ein Autoradiogramm zu entwickeln. Dies zeigt spezifische Banden, die den DNA-Fragmenten entsprechen, die von der cDNA-Sonde erkannt werden.

Faktoren, die das Southern-Blotting beeinflussen:

1. Strenge Bedingungen (Stringenzkontrolle):

Stringenz bezieht sich auf die Spezifität, mit der eine bestimmte DNA-Zielsequenz von einer Sonde nachgewiesen wird. Somit binden und hybridisieren unter hochstringenten Bedingungen (erhöhte Temperatur und niedrige Salzkonzentration) nur vollständig komplementäre DNA-Sequenzen.

Niedrig stringente Bedingungen ermöglichen jedoch die Hybridisierung von teilweise übereinstimmenden Sequenzen. Daher ist die Stringenzkontrolle für den spezifischen Nachweis von DNA-Molekülen beim Southern-Blotting sehr wichtig.Bei guter Kontrolle der Stringenz ist es jetzt möglich, ein DNA-Molekül nur mit einem einzigen Basenpaarunterschied nachzuweisen.

2. Membranen für den Blot-Transfer:

In den frühen Jahren wurde Nitrocellulose zur Immobilisierung von DNA-Molekülen während des Blot-Transfers verwendet. Der Nachteil von Nitrozellulose besteht darin, dass sie zerbrechlich ist und sorgfältig gehandhabt werden muss. In den letzten Jahren verwenden die meisten Labors Nylonmembranen, da sie eine hohe Zugfestigkeit und eine bessere Bindungskapazität für Nukleinsäuren aufweisen.

Anwendungen des Southern Blotting:

Die Southern-Blotting-Technik ist äußerst spezifisch und empfindlich, obwohl es sich um eine einfache Technik handelt.

Einige der Anwendungen sind aufgeführt:

A. Es ist eine unschätzbare Methode in der Genanalyse.

B. Wichtig für die Bestätigung von DNA-Klonierungsergebnissen.

C. Nützlich zum Kartieren von Restriktionsstellen um eine Einzelkopie-Gensequenz herum.

D. Forensisch angewendet, um kleinste DNA-Mengen zu erkennen (um Elternschaft, Diebe, Vergewaltiger usw. zu identifizieren).

e. Sehr nützlich für die Bestimmung des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), der mit pathologischen Zuständen verbunden ist.

F. DNA-Stücke einer Spezies (z. B. Mensch) können zum Nachweis von DNA-Molekülen verwandter Spezies (z. B. Schimpanse, Kuh) verwendet werden. Diese Technik wird als Zoo-Blotting bezeichnet.

II. Northern Blotting:

Northern Blotting ist die Technik zur spezifischen Identifizierung von RNA-Molekülen. Das gewählte Verfahren ist dem für Southern-Blotting beschriebenen nahezu ähnlich und in Abb. 7.9 dargestellt. RNA-Moleküle werden einer Elektrophorese unterzogen, gefolgt von Blot-Transfer, Hybridisierung und Autoradiographie.

RNA-Moleküle binden nicht leicht an Nitrozellulosepapier oder Nylonmembranen. Der Blot-Transfer von RNA-Molekülen wird unter Verwendung eines chemisch reaktiven Papiers durchgeführt, das durch Diazotierung von Amino-Benzyloxymethyl hergestellt wurde, um Diazobenzyloxymethyl (DBM)-Papier herzustellen. Die RNA kann kovalent an DBM-Papier binden.

Einige Arbeiter haben später geeignete Bedingungen entwickelt, um RNA-Banden auf Nitrozellulosepapier und modifizierte Nylonmembranen zu blotten. Diese werden heute häufig beim RNA-Blotting verwendet. Die Verwendung von DBM-Papieren wird fast eingestellt. Die durch Blot übertragenen RNA-Moleküle hybridisieren mit DNA-Sonden, die durch Autoradiographie nachgewiesen werden können.

Northern Blotting ist theoretisch eine gute Methode, um die Anzahl der Gene (durch mRNA) zu bestimmen, die auf einer bestimmten DNA vorhanden sind. Dies ist jedoch nicht wirklich praktikabel, da jedes Gen zu zwei oder mehr RNA-Transkripten führen kann. Ein weiterer Nachteil ist das Vorhandensein von Exons und Introns.

III. Dot-Blotting:

Dot-Blotting ist eine Modifikation der oben beschriebenen Southern- und Northern-Blotting-Techniken. Bei diesem Ansatz werden die Nukleinsäuren (DNA oder RNA) direkt auf die Filter getüpfelt und nicht einer Elektrophorese unterzogen. Das Hybridisierungsverfahren ist das gleiche wie bei den ursprünglichen Blotting-Techniken. Die Dot-Blotting-Technik ist besonders nützlich, um quantitative Daten zur Bewertung der Genexpression zu erhalten.

NS. Western-Blotting:

Western Blotting beinhaltet die Identifizierung von Proteinen. Es ist zu sehr nützlich, die Nukleinsäurefunktionen zu verstehen, insbesondere im Zuge von Genmanipulationen. Die Technik des Western-Blottings beinhaltet die Übertragung elektrophoretisch behandelter Proteinbanden vom Polyacrylamidgel auf eine Nylon- oder Nitrozellulosemembran. Diese Proteine ​​können durch spezifische Protein-Ligand-Wechselwirkungen nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden üblicherweise Antikörper oder Lektine verwendet.

Autoradiographie:

Autoradiographie ist der Prozess der Lokalisierung und Aufzeichnung eines radioaktiven Markers in einer festen Probe, wobei ein Bild in einer fotografischen Emulsion erzeugt wird. Diese Emulsionen bestehen aus in Gelatine suspendierten Silberhalogenidkristallen. Wenn ein p-Teilchen oder ein ƴ-Strahl eines radioaktiven Markers durch die Emulsionen hindurchtritt, werden Silberionen in metallische Silberatome umgewandelt. Dies führt zur Entwicklung eines sichtbaren Bildes, das leicht erkannt werden kann.

Direkte Autoradiographie:

Die direkte Autoradiographie ist ideal geeignet zum Nachweis schwacher bis mittelstarker β-emittierender Radionuklide ( 3 H, 14 C, 35 S). Bei dieser Technik wird die Probe in direkten Kontakt mit der Folie gebracht. Durch die radioaktiven Emissionen entstehen schwarze Bereiche.

Indirekte Autoradiographie:

Für den Nachweis hochenergetischer β-Partikel (z. B. 32 P, 125 l) ist die direkte Autoradiographie nicht geeignet. Dies liegt daran, dass diese Emissionen durch den Film und darüber hinaus gehen und ein Großteil der Energie verschwendet wird. Die indirekte Autoradiographie eignet sich zum Nachweis hochenergetischer β-Partikel. Bei dieser Technik wird die Energie der β-Teilchen zuerst durch einen Szintillator in Licht umgewandelt, der dann Photonen emittiert, wenn er einer fotografischen Emulsion ausgesetzt wird.

Anwendungen der Autoradiographie:

Wie bereits beschrieben, ist die Autoradiographie eng mit Blotting-Techniken zum Nachweis von DNA, RNA und Proteinen verbunden.

Kolonie- und Plaque-Blotting:

Kolonie- und Plaque-Blotting ist ein Hybridisierungsverfahren zur spezifischen Identifizierung und Reinigung von Kolonien (z. B. Bakterienklonen). Diese Technik ist in Abb. 7.10 dargestellt und wird im Folgenden kurz beschrieben.

Die gewünschten Bakterien werden als Kolonien auf einer Agarplatte gezüchtet. Wenn ein Nitrozellulose-Filterpapier auf die Agarplatte gelegt wird, werden die Kolonien übertragen. Sie werden durch Hitze dauerhaft auf dem Papier fixiert. Bei Behandlung mit Alkali (NaOH) lysieren die Zellen und die DNA wird denaturiert.

Wenn diese DNA-Abdrücke spezifischen Sonden (Radiomarkierung) ausgesetzt werden, kommt es zur Hybridisierung. Der Hybridkomplex kann durch Autoradiographie lokalisiert und nachgewiesen werden. Eine ähnliche Strategie (oben für Bakterien beschrieben) kann zur Identifizierung von Phagen und Fragmenten von Phagenbibliotheken verwendet werden.

Technik # 5. DNA-Sequenzierung:

Die Bestimmung der Nukleotidsequenz in einem DNA-Molekül ist die grundlegende und grundlegende Anforderung in der Biotechnologie. Die DNA-Sequenzierung ist wichtig, um die Funktionen von Genen und die Grundlage von Erbkrankheiten zu verstehen. Darüber hinaus erfordern DNA-Klonierung und Genmanipulation ausnahmslos die Kenntnis einer genauen Nukleotidsequenz.

Maxam und Gilbert-Technik:

Die erste DNA-Sequenzierungstechnik unter Verwendung chemischer Reagenzien wurde von Maxam und Gilbert (1977) entwickelt. Diese Methode wird im Folgenden kurz beschrieben (Abb. 7.11).

Ein Strang der Quell-DNA wird an einem Ende mit 32 P markiert. Die beiden DNA-Stränge werden dann getrennt. Die markierte DNA wird in vier Proben (in separaten Röhrchen) verteilt. Jede Probe wird mit einer Chemikalie behandelt, die spezifisch eine (G, C) oder zwei Basen (A + G, T + C) in der DNA zerstört. Somit werden die DNA-Stränge in vier Proben an den Stellen G, A + G, T + C und C teilweise verdaut. Dies führt zur Bildung einer Reihe markierter Fragmente unterschiedlicher Länge.

Die tatsächliche Länge des Fragments hängt von der Stelle ab, an der die Base vom markierten Ende her zerstört wird. Wenn also beispielsweise C-Reste an den Positionen 4, 7 und 10 vom markierten Ende entfernt vorhanden sind, dann wird die Behandlung von DNA, die C spezifisch zerstört, markierte Stücke der Länge 3, 6 und 9 Basen ergeben. Die in den vier Röhrchen erhaltenen markierten DNA-Fragmente werden nebeneinander einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Sequenz der Basen in der DNA kann aus den Banden bei der Elektrophorese konstruiert werden.

Didesoxynukleotid-Methode:

Gegenwärtig ist die bevorzugte Technik zur Bestimmung der Nukleotidsequenz in DNA die von Sanger (1980) entwickelte. Dies ist ein enzymatisches Verfahren, das allgemein als Didesoxynukleotid-Methode oder Kettenabbruchmethode bezeichnet wird (Anmerkung: Fredrick Sanger gewann zweimal den Nobelpreis, einmal für die Bestimmung der Proteinstruktur, das zweite Mal für Insulin für die Sequenzierung der Nukleotide in einem RNA-Virus).

Ein Didesoxynukleotid ist ein im Labor hergestelltes chemisches Molekül, dem sowohl am 2′ als auch am 3′ Kohlenstoff des Zuckers eine Hydroxylgruppe fehlt (Abb. 7.12). Dies steht im Gegensatz zu dem natürlichen Desoxyribonukleotid, das an 3′ Hydroxylgruppen des Zuckers besitzt.

Terminationsrolle von Didesoxynukleotid:

Im normalen Prozess der DNA-Replikation wird ein ankommendes Nukleosidtriphosphat mit seiner 5′-Phosphatgruppe an die 3′-Hydroxylgruppe des letzten Nukleotids der wachsenden Kette gebunden, wenn ein Didesoxynukleotid in die wachsende Kette eingebaut wird. es findet keine weitere Replikation statt. Dies liegt daran, dass Didesoxynukleotid, dem eine 3′-Hydroxylgruppe fehlt, keine Phosphodiesterbindung bilden kann und somit die DNA-Synthese endet.

Sequenzierungsmethode:

Der Vorgang der DNA-Sequenzierung durch das Didesoxynukleotid-Verfahren wird kurz beschrieben. Als Matrize wird eine zu sequenzierende einzelsträngige DNA gewählt. Es ist an einen Primer (ein kurzes DNA-Oligonukleotid) angehängt, der zu einem kleinen Abschnitt der Matrize komplementär ist. Die 3′-Hydroxylgruppe des Primers initiiert die neue DNA-Synthese.

Die DNA-Synthese wird in vier Reaktionsgefäßen durchgeführt. Jedes Röhrchen enthält die geprimte DNA, Klenow-Untereinheit (das größere Fragment der DNA-Polymerase von E. coli), vier Didesoxyribonukleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Es ist notwendig, den Primer oder eines der Desoxyribonukleotide (mit 32 P) radioaktiv zu markieren.

Wenn die neue DNA-Synthese abgeschlossen ist, enthält jedes der Röhrchen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die an den Primer gebunden sind. Betrachten wir das erste Reaktionsröhrchen mit Di-Desoxyadenosin (ddATP). In diesem Röhrchen endet die DNA-Synthese immer dann, wenn die wachsende Kette ddA (komplementär zu dT auf dem Matrizenstrang) eingebaut hat. Daher enthält dieses Röhrchen eine Reihe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die jeweils mit ddA enden. In ähnlicher Weise stoppt die DNA-Synthese bei den anderen 3 Reaktionsröhrchen, wenn die entsprechenden Didesoxynukleotide eingebaut werden.

Die Synthese neuer DNA-Fragmente in den vier Röhrchen ist in Abb. 7.13 dargestellt.

Die DNA-Stücke werden denaturiert, um freie Stränge mit radioaktiver Markierung zu ergeben. Die Proben aus jedem Röhrchen werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Diese Trenntechnik löst DNA-Stücke auf, die sich sogar um ein einzelnes Nukleotid in der Größe unterscheiden. Die kürzeste DNA bewegt sich bei der Elektrophorese am schnellsten.

Die Basensequenz in einem DNA-Fragment wird durch Identifizierung der elektrophoretischen (radiomarkierten) Banden durch Autoradiographie bestimmt. In Abb. 7.14 ist die zum ursprünglichen DNA-Stück komplementäre Sequenz des neu synthetisierten DNA-Fragments dargestellt.

Es ist üblich, die Bänder von unten nach oben in Richtung 5′ bis 3′ zu lesen. Durch Notieren der Reihenfolge der Banden erstes C, zweites G, drittes T usw. kann die Sequenz der DNA genau bestimmt werden. Bis zu 350 Basensequenzen eines DNA-Fragments können unter Verwendung von Autoradiographien eindeutig identifiziert werden.

Modifikationen der Didesoxynukleotid-Methode:

Der Ersatz des 32 P-Radiolabels durch 33 P oder 35 S verbessert die Schärfe autoradiographischer Bilder. DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus (anstelle des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I) oder eine modifizierte Form der Phagen-T7-DNA-Polymerase (Sequenase) verbessert die Technik.

Einschränkungen der Didesoxynukleotid-Methode:

Es gibt hauptsächlich zwei Einschränkungen bei diesen Techniken. Die Notwendigkeit einer einzelsträngigen DNA-Matrize und die Verwendung eines Primers für unbekannte Sequenzen. Diese Probleme können durch die Verwendung des Bakteriophagen M . überwunden werden13.

Bakteriophage M13 als Klonierungs- und DNA-Sequenzierungsvektor:

Der Lebenszyklus des Phagen M13 ist in Abb. 7.15 dargestellt. Dieses Virus enthält eine einzelsträngige zirkuläre DNA. Wenn es E. coli infiziert, wird die doppelsträngige DNA synthetisiert, die eine replikative Form (RF) ist. RF-DNA repliziert, bis 50-100 Kopien hergestellt sind. Jetzt wird der Replikationsmodus geändert, um einzelsträngige DNA-Moleküle (ssDNA) zu synthetisieren.

Jede der ssDNA des Phagen M13 ist mit einem Protein überzogen. Die Phagenpartikel passieren dann ungehindert die Membran, um freigesetzt zu werden. Somit sind die mit M . infizierten E. coli-Zellen13 können kontinuierlich infektiöse Partikel absondern, ohne dass sie lysiert werden.

Bakteriophage M13 wird als Klonierungs- und DNA-Sequenz-bestimmender Vektor verwendet. Dies ist möglich, da die doppelsträngige replikative Form isoliert und als Plasmid verwendet werden kann, während die einzelsträngige Phagen-DNA als Matrize für die DNA-Sequenzierung verwendet werden kann. Normalerweise kann eine Ziel-DNA mit weniger als 500 bp kloniert und in den Phagen M . sequenziert werden13.

Diese doppelsträngige RF bildet den Phagen M13 werden isoliert und die zu klonierende DNA inseriert. Dieser einem Plasmid vergleichbare Phagen wird in E. coli zurückgeführt. (Die Aufnahme von Phagen mit Inserts kann unter Verwendung des lac Z-Markers gescreent werden).

Während der Phagen seinen Lebenszyklus durchläuft (Abb. 7.15), werden einzelsträngige DNA-Moleküle der inserierten DNA gewonnen. Die Sequenzbestimmung der einzelsträngigen DNA kann durch die Didesoxynukleotid-Methode erfolgen. Der verwendete Primer ist komplementär zu einem Teil des Phagen M13 DNA, die sich nahe der Insertionsstelle befindet. Daher kann ein einzelner Primer für verschiedene inserierte DNA-Moleküle verwendet werden. Um die Sequenz einer größeren DNA (≤ 2.000 bp) zu bestimmen, müssen verschiedene DNA-Stücke kloniert werden. Aus den Sequenzen dieser Fragmente (häufig überlappend) kann die endgültige Sequenz aufgebaut werden.

DNA-Sequenzierung durch Primer-Walking:

Die Primer-Walking- oder Primer-Extension-Technik wird zur Sequenzbestimmung von langen DNA-Stücken (≥ 5.000 bp) verwendet. Bei diesem Verfahren wird Plasmid-klonierte DNA, die Ziel-DNA enthält, mit einem Primer (synthetisches Oligonukleotid) angelagert. Der Primer bindet mit der DNA nahe der inserierten DNA. Nun wird die Ziel-DNA (250-350 Nukleotide) sequenziert, am häufigsten durch die Didesoxynukleotid-Methode (bereits beschrieben).

Aus der Basensequenz eines Fragments der Ziel-DNA (bestimmt in der ersten Runde) wird der zweite Primer ausgewählt. Es ist ein Oligonukleotid, das an eine Region bindet, die ungefähr 300 Nukleotide von der ersten Primerbindung entfernt ist. Das nächste Fragment der Ziel-DNA kann um weitere 250-300 Basen sequenziert werden (zweite Runde).

Diese Sequenz wird nützlich sein, um den dritten Primer auszuwählen und die nächsten 250-350 Basen zu bestimmen (dritte Runde). Auf diese Weise wird das Primer-Walking fortgesetzt, bis die vollständige Ziel-DNA sequenziert ist. Drei Runden der Primer-Walking-Technik zur DNA-Sequenzierung sind in Abb. 7.16 dargestellt.

Chromosomen-Walking in der DNA-Sequenzierung:

Chromosomen-Walking ist eine DNA-Basen-Sequenzierungsmethode, bei der das Chromosom analysiert wird, indem eine Spitze ausgefahren wird, um die andere zu erreichen. Die Technik besteht im Wesentlichen darin, sich systematisch entlang des Chromosoms von einem bekannten Ort zu einem unbekannten Ort zu bewegen und so die DNA-Sequenz zu bestimmen. Die Methode des Chromosomen-Walkings ist in Abb. 7.17 dargestellt und wird im Folgenden kurz beschrieben.

Ein DNA-Fragment mit ungefähr 40.000 Basenpaaren kann sequenziert werden. Zu Beginn wird ein Marker verwendet, um die entsprechende Gensonde (aus der DNA-Sondenbibliothek) zu identifizieren. Diese Gensonde muss einen Abschnitt des Basenpaars aufweisen, der mit den Basenpaaren des Markers identisch ist. Diese anfängliche Sonde hybridisiert nur mit den Klonen, die Fragment A enthalten.

Dieses Fragment A kann isoliert, kloniert und als Sonde zum Nachweis von Fragment B verwendet werden. Dieses Verfahren des Klonens und Sondierens mit Fragmenten wird immer wieder wiederholt, bis Fragment D mit Fragment E hybridisiert Sonden, die von den Enden überlappender Klone abgeleitet sind, um einen Spaziergang entlang der DNA-Sequenz zu erleichtern. Dabei kann die Sequenz des gewünschten Zielgens identifiziert werden.

Chromosomenspringen:

Eine verbesserte Strategie des Chromosomen-Walkings ist das Chromosomen-Jumping. Viele DNA-Regionen, die durch Gehen schwer zu klonen sind, können übersprungen werden. Das Verfahren beinhaltet die Zirkularisierung großer genomischer Fragmente, die durch den Verdau von Endonukleasen erzeugt werden. Darauf folgt die Klonierung der Region, die den Verschluss des Fragments verringert. Durch diesen Ansatz können die weit entfernten DNA-Sequenzen zusammengeführt und kloniert werden. Ein Chromosomensprung kann auf diese Weise konstruiert und für lange Chromosomenwanderungen verwendet werden.

Anwendungen von Chromosomen-Walking und -Jumping:

Das für die Krankheit Mukoviszidose (CF) verantwortliche Gen wurde durch das Gehen und Springen der Chromosomen identifiziert. Das für CF verantwortliche Proteingen wird als Cystic Fibrosis Trans Membran Conductance Regulator (CFTR) bezeichnet und befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 7.

Automatisierte DNA-Sequenzierung:

Die DNA-Sequenzierung wird in den letzten Jahren durch einen automatisierten DNA-Sequenzer durchgeführt. Bei dieser Technik werden fluoreszierende Tags an kettenabbrechende Nukleotide (Di-Desoxynukleotide) angehängt. Dieser Tag wird in die DNA-Moleküle eingebaut, während die Synthese neuer Stränge beendet wird.

Vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe werden verwendet, um Kettenabbruchreaktionen in einem Sequenzierungsgel zu identifizieren. Die DNA-Banden werden durch Elektrophorese getrennt und durch ihre Fluoreszenz nachgewiesen. In letzter Zeit werden vier Farbstoffe, die eine starke Absorption im Laser zeigen, für die automatisierte Sequenzierung verwendet.

Vorteile der automatisierten Sequenzierung:

Es ist eine schnelle und genaue Technik. Der automatisierte DNA-Sequenzer kann bis zu 100.000 Nukleotide pro Tag genau sequenzieren. Die Kosten betragen nicht mehr als 0,2 pro Nukleotid. Die automatisierte DNA-Sequenzierung wurde im Humangenomprojekt erfolgreich eingesetzt.

Technik # 6. Alternative Methoden der DNA-Sequenzierung:

Einige Gruppen von Forschern haben alternative Verfahren zum Sanger-Verfahren zur Sequenzierung von DNA entwickelt. Leider sind die meisten dieser Methoden trotz der anfänglichen Aufregung von der Bildfläche verschwunden. Es gibt mindestens zwei vielversprechende Methoden für die DNA-Sequenzierung – Pyro-Sequenzierung und Genchips (Microarrays).

Pyro-Sequenzierung:

Pyro-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem Prinzip basiert, zu bestimmen, welche der vier Basen (A, G, C, T) bei jedem Schritt eingebaut wird, während eine DNA-Matrize kopiert wird. Bei dieser Technik kopiert die Matrize auf einfache Weise ohne zugesetzte Didesoxynukleotide (ddNTPs).

Bei der Synthese des neuen Strangs wird die Einbaureihenfolge der Desoxynukleotide (dNTPs) ermittelt und die Sequenz kann im Verlauf der Reaktion abgelesen werden (Abb. 7.18). Die Identifizierung der Basenaddition wird möglich, da die Addition eines Nukleotids von der Freisetzung eines Pyrophosphatmoleküls begleitet wird. Dies kann durch Chemilumineszenz-Technik nachgewiesen werden.

Bei der Pyrosequenzierung wird jedes dNTP einzeln (nicht alle vier zusammen) zusammen mit einem Nukleotidenzym hinzugefügt. Dieses Enzym baut das dNTP ab, wenn es nicht in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut wird. Sobald das geeignete Nukleotid in den neuen DNA-Strang eingebaut ist, wird ein Pyrophosphat-Molekül freigesetzt.

Diese kann durch das Enzym Sulfurylase in einen Lichtblitz umgewandelt werden (Chemilumineszenz). Durch die separate Zugabe jedes dNTPs nacheinander kann die Reihenfolge der an den wachsenden DNA-Strang angefügten Nukleotide verfolgt und die Sequenz identifiziert werden.

Der Nachweis des Moleküls Pyrophosphat ist die Grundlage der DNA-Sequenzierung, daher der Name Pyro-Sequenzierung. Da die Pyrosequenzierung keine Elektrophorese oder irgendeine andere DNA-Fragment-Trennungstechnik erfordert, ist sie schneller als die Kettenabbruchsequenzierung.

Die Haupteinschränkung der Pyrosequenzierung besteht darin, dass sie geeignet ist, die Sequenz von etwa 200 Nukleotiden nachzuweisen. Dies ist viel weniger als die Sanger-Methode. Bei der Pyrosequenzierung werden viele Verbesserungen vorgenommen, so dass viel längere DNA-Moleküle sequenziert werden können. Tatsächlich ist jetzt auch ein automatisiertes System für die Pyrosequenzierung verfügbar.

DNA-Chips (Microarrays):

DNA-Chips oder DNA-Microarrays sind neue Entwicklungen für die DNA-Sequenzierung, die auf Fortschritte in der Automatisierung und Miniaturisierung zurückzuführen sind. Auf der festen Oberfläche, die entweder aus Nylon oder aus Glas besteht, wird eine Vielzahl von DNA-Sonden mit jeweils unterschiedlicher Sequenz an definierten Positionen immobilisiert. Die Sonden können kurze DNA-Moleküle wie cDNAs oder synthetische Oligonukleotide sein. Zur Herstellung von Arrays mit hoher Dichte werden Oligonukleotide in situ auf der Oberfläche von Glas oder Silizium synthetisiert. Dies führt eher zu einem Oligonukleotid-Chip als einem DNA-Chip.

Technik der DNA-Sequenzierung:

Zur DNA-Sequenzierung kann ein DNA-Chip verwendet werden, der ein Array verschiedener Oligonukleotide trägt. Dazu wird auf den Chip ein fluoreszenzmarkiertes DNA-Testmolekül aufgebracht, dessen Sequenz bestimmt werden soll. Zwischen den komplementären Sequenzen des Test-DNA-Moleküls und den Oligonukleotiden des Chips findet eine Hybridisierung statt.

Die Positionen dieser hybridisierenden Oligonukleotide können durch konfokale Mikroskopie bestimmt werden. Jedes hybridisierende Oligonukleotid stellt eine 8-Nukleotidsequenz dar, die in der DNA-Sonde vorhanden ist. Aus den Überlappungen zwischen den Sequenzen der hybridisierenden Oligonukleotide lässt sich die Sequenz des Test-DNA-Moleküls ableiten (Abb. 7.19).

Anwendungen von DNA-Chips:

Es gab viele Erfolge mit dieser relativ neuen Technologie von DNA-Chips. Einige davon sind aufgelistet.

A. Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des Nervensystems verantwortlich sind.

B. Nachweis von Genen, die für entzündliche Erkrankungen verantwortlich sind.

C. Konstruktion von Microarrays für jedes Gen im Genom von E. coli und fast alle Gene der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

D. Die Expression mehrerer Gene in Prokaryonten wurde identifiziert.

e. Nachweis und Screening von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs).

F. Schneller Nachweis von Mikroorganismen für die Umweltüberwachung.

Die Zukunft der DNA-Chips:

Die größte Einschränkung von DNA-Chips ist derzeit die Nichtverfügbarkeit vollständiger Genom-Arrays für höhere Eukaryoten, einschließlich des Menschen. Es wird erwartet, dass in den nächsten Jahren solche DNA-Chips verfügbar sein werden. Dies wird den Biotechnologen helfen, die funktionellen Momentaufnahmen des Genoms in Aktion für höhere Organismen zu erfassen.

Technik # 7. Chemische Synthese von DNA:

Fortschritte in den Labortechniken haben es möglich gemacht, DNA in kurzer Zeit chemisch zu synthetisieren. Somit können Oligonukleotide von etwa 100 Basen in etwa 10 Stunden hergestellt werden. Die schnelle und kostengünstige Laborsynthese von DNA (vor kurzem unter Verwendung von DNA-Synthesizern oder Genmaschinen) mit einer spezifischen Nukleotidsequenz hat wesentlich zum Klonen beigetragen. Die chemische Synthese von DNA basiert auf der Fähigkeit, die reaktiven -5′ und -3′ Enden zu schützen, indem man sie blockiert (schützt).

Die Phosphoramidit-Methode:

Die Phosphoramidit-Methode ist die derzeit gebräuchliche Technik der Wahl für die DNA-Synthese. Die Synthese wird an einem Festphasensystem durchgeführt, d. h. durch Anbringen des wachsenden DNA-Strangs an einen festen Träger in einem Reaktionsgefäß. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte.

1. Nukleosid-Anheftung an einen festen Träger:

Das anfängliche Nukleosid (Base + Zucker) ist am Ende 3′ an einen inerten festen Träger gebunden, normalerweise an Glasperlen mit einheitlichen Poren, die als Glasperlen mit kontrollierten Poren (CPG) bezeichnet werden.

2. Herstellung von Phosphoramiditen:

Für jede der vier Basen (A, G, C und T) können Phosphoramidite synthetisiert werden. Dies wird erreicht, indem eine Dimethoxytrityl (DMT)-Gruppe an die 5′-Hydroxylgruppe von Desoxyribose und eine Diisopropylamingruppe an die 3′-Phosphitgruppe des Nukleosids gebunden wird. Ein Methylrest schützt die 3′-Phosphitgruppe. Die allgemeine Struktur von Phosphoramidit ist in Abb. 7.20 dargestellt.

Ein Nukleotidvorläufer (d. h. ein Phosphoramidit) mit seinem 3′-Phosphor koppelt mit dem 5′-Hydroxyl des anfänglichen Nukleosids, das an eine CPG-Perle gebunden ist.

4. Oxidation und Entschützung:

Das instabile dreiwertige Phosphat wird zu fünfwertigem stabilem Phosphat oxidiert. Darauf folgt die Entfernung von DMT, das die 5-Hydroxylgruppe schützt (entschützt). Der Einfachheit halber werden Oxidation und Entschützung auch in Abb. 7.21 zusammen betrachtet, sie sind eigentlich zwei unabhängige Reaktionen. Nun wird ein weiterer Nukleotidvorläufer zugegeben und die in den Schritten 3 und 4 beschriebenen Reaktionen werden wiederholt.

Kupplung, Oxidation und Entschützung sind die drei Schritte in der zyklischen Reaktion für die DNA-Synthese nach der Phosphoramidit-Methode. Die Zyklen werden immer wieder wiederholt, um die gewünschte DNA zu synthetisieren. Zum Schluss wird das fertige Oligonukleotid vom Glasträger entfernt und die Basen- und Phosphatschutzgruppen abgespalten.

Anwendungen synthetisierter Oligonukleotide:

Chemisch synthetisierte Oligonukleotide haben eine Reihe von Anwendungen in der Biotechnologie.

1. Die Linker und Adapter sind die Oligonukleotide, die üblicherweise bei der Herstellung von rekombinanter DNA verwendet werden

2. Chemisch synthetisierte DNAs mit bekannten Sequenzen können für die Synthese von Proteinen/Polypeptiden verwendet werden.

3. DNA-Sonden, insbesondere die einzelsträngigen Oligonukleotid-Sonden, können im Labor synthetisiert werden. Diese basiert auf der Codon-Sequenz der mRNA, die wiederum von der Aminosäuresequenz abhängt.

4. Einzelsträngige Oligonukleotide werden als Primer in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.

5. Für die in vitro-Mutagenese werden einzelsträngige Oligonukleotide verwendet.

Synthese von Genen:

Gen ist eine doppelsträngige DNA Zwei einzelsträngige komplementäre Oligonukleotide können getrennt synthetisiert werden und bilden beim Annealing Doppelstränge. Dies kann bequem für kleinere Gene (60-90 bp) erreicht werden. Die Synthese längerer Gene (> 300 bp) ist jedoch mit einigen praktischen Schwierigkeiten verbunden.

Dies liegt hauptsächlich daran, dass die Kopplungseffizienz für die chemische Synthese von DNA nie 100% beträgt. Um dieses Problem zu lösen, werden kleine DNA-Fragmente synthetisiert und zusammengesetzt (Abb. 7.22). Die Versiegelung der Nicks wird durch die Verwendung von T4-DNA-Ligase erreicht.

Ein anderer Weg zur Synthese von Genen besteht darin, überlappende Oligonukleotide herzustellen, die beim Annealing große Lücken enthalten. Diese Lücken können durch enzymatische DNA-Synthese durch DNA-Polymerase gefüllt werden – bei der Gensynthese im Labor sollte mit größter Sorgfalt auf die richtige Sequenz der Nukleotide geachtet werden (dies kann durch DNA-Sequenzierungstechnik überprüft werden). Der in Indien geborene und in den USA ansässige Wissenschaftler Har Gobind Khorana und seine Mitarbeiter waren 1972 die ersten, die ein komplettes tRNA-Gen für Hefe-Alanyl-tRNA synthetisierten.


Die 4 besten Werkzeuge der Gentechnik

Die Erzeugung einer genomischen Bibliothek umfasst das Klonen der gesamten genomischen DNA. Daher ist eine genomische Bibliothek eine Sammlung rekombinanter DNA-Moleküle (Plasmide, Phagen), so dass die Gesamtsumme der DNA-Inserts in dieser Sammlung das gesamte Genom des Organismus darstellt. Abhängig von der Größe des Genoms kann ein prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor ausgewählt werden. Auf diese Weise kann das gesamte Genom in Stücke geschnitten und in Vektoren oder durch PCR-Technik kloniert werden. Dies kann als genomisches Klonen bezeichnet werden.

Das Erstellen einer genomischen Bibliothek umfasst die folgenden Schritte:

1. Isolierung chromosomaler DNA

2. Die DNA-Fragmentierung erfolgt durch mechanisches Scheren oder Beschallen oder durch Verwendung einer geeigneten Endonuklease zum partiellen Verdau der DNA (Abb. 15.1). Mechanisches Scheren erzeugt stumpfe Enden, während Endonuklease kohäsive Enden erzeugt. Ein vollständiger Verdau wird vermieden, da er Fragmente erzeugt, deren Größe zu heterogen ist, um verwendet zu werden.

3. Ligation von DNA-Fragmenten – Der teilweise Verdau von genomischer DNA wird einer Agarosegelelektrophorese zur Trennung von Fragmenten der erforderlichen Größe unterzogen. Die Fragmente geeigneter Größe werden aus dem Gel eluiert. Diese Fragmente werden dann in einen geeigneten Vektor eingefügt. Diese Vektoren werden mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten. Danach werden die DNA-Fragmente mit DNA-Ligase in den Vektor ligiert (Abb. 15.2). Durch diese Technik können etwa 25 kb DNA-Fragmente in Vektoren eingefügt werden.

4. Identifizierung des gewünschten Klons – Identifizierung der Bakterienkolonie, die das gewünschte DNA-Fragment enthält, durch Verwendung einer geeigneten Hybridisierungssonde bei der Koloniehybridisierung. Die Sonde kann mRNA des Gens, cDNA seiner mRNA, homologes Gen aus einem anderen Organismus oder ein synthetisches Oligonukleotid sein, das die Sequenz eines Teils des gewünschten Gens/DNA-Fragments darstellt. Um eine Hybridisierung nachzuweisen, muss die Sonde normalerweise mit einem radioaktiv markierten Isotop markiert werden.

Alternative Vektorsysteme zur Erstellung einer Genombibliothek:

Für Prokaryoten (kleinere Genome) geeignet, um Genbibliotheken in Plasmiden zu erstellen. Plasmid-Insertionen normalerweise -5-10 kb, so dass nur einige tausend Rekombinanten für eine repräsentative Bibliothek benötigt werden. Eukaryoten (größere Genome) brauchen wirklich Vektoren, die viel größere Insert-DNA-Fragmente enthalten können (Tabelle 15.1).

Der Bakteriophage Lambda zeigt eine viel effizientere Infektion von E. coli, als dies durch Plasmidtransformation erreicht werden kann. Phagen Lambda bindet an Rezeptoren auf der Oberfläche von E. coli und injiziert DNA. Die Infektion durch Lambda ist viel effizienter als die Plasmidtransformation, die – erhalten kann

10 9 Plaques pro Mikrogramm DNA, vs

10 6 Kolonien pro Mikrogramm Plasmid-DNA.

Wenn die Bakterienzellen lysieren, bildet sich eine Plaque, die sich ausbreitet, wenn mehr Zellen infiziert werden und lysieren. Der Plaque enthält die infektiösen viralen Partikel oder Virionen und jedes repräsentiert einen individuellen Lambda-Klon (ähnlich einer Bakterienkolonie, die einen individuellen Plasmidklon darstellt).

Das Erscheinungsbild ist ein klarer Kreis in einer ‘Wolke’ von Bakterienzellen (der bakterielle ‘Rasen’) (Abb. 15.3). Bei längerer Inkubation wachsen diese Kreise weiter (die immer mehr Viruspartikel enthalten) und breiten sich aus, bis alle Bakterienzellen ausgelöscht sind. Um einen einzelnen Lambda-Klon auszuwählen, wird der Plaque aus der Agarplatte „ausgestanzt“ und in einer Haltelösung aufbewahrt. Dies kann dann verwendet werden, um mehr Bakterienzellen zu infizieren und mehr von der rekombinanten Lambda-DNA zu replizieren.

Vektoren zum Erstellen von Bibliotheken mit größeren Inserts:

Cosmid-Bibliotheken werden zum Klonen von Genen mit großen Introns und zum Sequenzieren größerer Abschnitte des Genoms verwendet. Cosmidvektoren sind Hybride aus Plasmid- und Bakteriophagen-Lambdaλ-DNA (ein kleiner

5 kb-Plasmid, enthaltend den Plasmid-Replikationsursprung (ori), ein Antibiotikaresistenzgen wie amp und eine geeignete Restriktionsstelle zum Klonieren zusammen mit der COS-Sequenz aus Phagen-λ-DNA). Aufgrund der COS-Sequenz können Cosmid-Rekombinanten in virale Partikel verpackt werden (was eine hocheffiziente Transformation ermöglicht).

Da die meisten genomischen Bibliotheken in Cosmidvektoren verworfen wurden, kann die λ-DNA durch die interessierende DNA ersetzt werden, solange sie die 50-kb-Grenze für die Verpackung in den Viruskopf nicht überschreitet. Die Einfügungsgrößen liegen in der Größenordnung von 35-45 kb. Da die rekombinante DNA keine Lambda-Proteine ​​kodiert, bilden Cosmide keine viralen Partikel (oder Plaques), sondern große zirkuläre Plasmide und die entstehenden Kolonien können wie andere Plasmid-DNA-Transformanten auf Antibiotikaplatten selektiert werden.

Cosmidklone können auf ähnliche Weise manipuliert werden, was eine einfache Plasmidisolierung ermöglicht. Da viele eukaryotische Gene in der Größenordnung von 30 – 40 kb liegen, wird die Wahrscheinlichkeit, einen DNA-Klon zu erhalten, der die gesamte Gensequenz enthält, bei Verwendung einer Cosmid-Bibliothek signifikant erhöht.

YAC-Bibliotheken werden zum Klonen sehr großer DNA-Fragmente (von mehr als 1 Mb) verwendet und sind nützlich zum Klonen großer Gene (wie dem 250 kb-Gen für Mukoviszidose) und zum Erstellen von Bibliotheken großer überlappender Klone, wie für einzelne isolierte Chromosomen aus Organismen (Chromosomenbibliotheken). Diese wurden ausgiebig für die Kartierung von Genomen komplexer Organismen (z. B. Homo sapiens) verwendet.

YACs sind künstliche Hefechromosomen und sind Hybride aus bakterieller Plasmid-DNA und Hefe-DNA. Die für die Replikation/Segregation der natürlichen Hefechromosomen erforderlichen Komponenten wurden mit E. coli-Plasmid-DNA kombiniert. YACs werden in der Hefe Saccharomomyces cerevesiae gezüchtet und enthalten so selektierbare Marker, die für das Wirtssystem geeignet sind. Anstelle einer Antibiotika-Selektion ermöglichen Hefe-selektierbare Marker das Wachstum der Transformante auf selektiven Medien, denen spezifische Nährstoffe fehlen. (Nicht-Transformanten können nicht wachsen). Die verwendeten Hefestämme sind auxotropher –, das heißt, sie sind nicht in der Lage, eine bestimmte Verbindung herzustellen.

Trpl-Mutanten können beispielsweise kein Tryptophan herstellen und können daher nur auf mit Tryptophan ergänzten Medien wachsen. Wenn der mutierte Stamm mit einem YAC transformiert wird, das ein intaktes Trpl-Gen enthält, wird dies das inaktive Gen (Komplement) kompensieren und die transfizierte Zelle kann auf Medien ohne Tryptophan wachsen.

YACs werden aufgrund inhärenter Probleme nicht mehr so ​​häufig verwendet. YAC-Klone können beispielsweise nicht zusammenhängende Abschnitte des Genoms enthalten. Dies bedeutet, dass 2 oder mehr DNA-Fragmente aus getrennten Teilen des Genoms in ein einzelnes YAC integriert werden können (da sie in der Lage sind, ziemlich große Inserts zu unterstützen). Ein zweites Problem besteht darin, dass YACs instabil sind und während der Vermehrung häufig Teile der DNA verlieren.

BAC-Bibliotheken werden auch zum Klonen sehr großer DNA-Fragmente verwendet und waren besonders nützlich für die Sequenzierung großer Genome. BACs sind bakterielle künstliche Chromosomen und basieren auf einem natürlich vorkommenden großen bakteriellen Plasmid, dem F-Faktor. BAC-Vektoren können DNA-Inserts von bis zu 300 kb aufnehmen, was immer noch recht respektabel ist, wenn große Gene kloniert oder komplexe Genome kartiert und sequenziert werden müssen. BACs haben gegenüber YACs mehrere Vorteile, was bedeutet, dass sie jetzt häufiger verwendet werden. Der größte Teil des menschlichen Genoms wurde eher mit BAC als mit YAC-Klonen sequenziert.

Werkzeug # 2. cDNA und cDNA LBibliothek:

Komplementäre DNA (cDNA) ist synthetische DNA, die aus mRNA unter Verwendung eines speziellen Enzyms namens Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase, die 1970 von Temin und Baltimore entdeckt wurde) hergestellt wird. Ursprünglich wurde dieses Enzym aus Reteroviren isoliert. Dieses Enzym führt ähnliche Reaktionen wie DNA-Polymerase durch und erfordert einen Primer mit einem freien 3′ OH-Terminus. Unter Verwendung einer mRNA als Matrize synthetisiert die reverse Transkriptase ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das dann als Matrize für doppelsträngige DNA verwendet werden kann (Abb. 15.4). Da sie aus mRNA hergestellt wird, weist die cDNA weder stromaufwärts noch stromabwärts gelegene regulatorische Sequenzen und Introns auf.

Dies bedeutet, dass cDNA aus Eukaryoten in Bakterien in funktionelles Protein übersetzt werden kann, ein wichtiges Merkmal bei der Expression eukaryotischer Gene in bakteriellen Wirten. Eine kurze Oligo(dT)-Kette wird an den Poly(A)-Schwanz des mRNA-Strangs hybridisiert. Das Oligo (dT)-Segment dient als Primer für die Wirkung der reversen Transkriptase, die die mRNA als Matrize für die Synthese des cDNA-Strangs verwendet. Die resultierende cDNA endet in einer Haarnadelschleife. Wenn die mRNA aus einem RNA-DNA-Hybrid durch Behandlung mit NaOH oder RNase H abgebaut wurde, bleibt ein kurzes Stück RNA zurück. Diese Haarnadelschleife wird zu einem Primer für die DNA-Polymerase I, die den gepaarten DNA-Strang vervollständigt.

Die Schleife wird dann durch SI-Nuklease (die nur auf die einzelsträngige Schleife wirkt) gespalten, um ein doppelsträngiges cDNA-Molekül herzustellen. Diese doppelsträngige DNA kann in Plasmid-, Cosmid-, Phagen-Lambda-, Klonierungsvektoren durch stumpfe Ligation eingefügt werden.

Eine cDNA-Bibliothek ist eine Population von bakteriellen Transforraanten oder Phagenlysaten, in denen jede aus einem Organismus oder Gewebe isolierte mRNA als ihre cDNA-Insertion in einem Plasmid oder einem Phagenvektor dargestellt wird. Die Häufigkeit spezifischer cDNA in einer solchen Bibliothek würde von der Häufigkeit der betreffenden mRNA in diesem Gewebe abhängen.

Werkzeug # 3. Analyse von Genen und Gentranskripten:

Die rekombinante DNA-Technologie beinhaltet die Lokalisierung des interessierenden Gens. Dieses Gen kann entweder isoliert oder synthetisiert werden, bevor es manipuliert und zur Transformation verwendet wird, die zur Produktion transgener Pflanzen und Tiere führt. Es wurden verschiedene Techniken zur Isolierung verschiedener Genvarianten verwendet, wie zum Beispiel das ribosomale RNA-Gen, das Gen für phänotypische Merkmale mit unbekanntem Genprodukt, für spezifische Proteinprodukte und Gene, die an regulatorischen Funktionen beteiligt sind, z. Promotorgene usw.

Isolierung ribosomaler RNA-Gene:

Die ribosomale RNA macht 80% der Gesamt-RNA aus und wird auf einem ribosomalen Gen synthetisiert, das isoliert werden könnte. Die Isolierung dieses Gens war aufgrund einiger charakteristischer Merkmale der rRNA einfach (a) ribomsomale Gene sind in mehreren Kopien vorhanden (b) Unterschied zwischen ribosomalen Genen und anderen Genen aufgrund ihres relativ hohen G + C-Gehalts in der rRNA. Das ribosomale Gen wurde erstmals 1965 von H. Wallace und M.L. Birnstiel in einer Amphibie namens Xenopus.

Die verschiedenen Schritte bei der Isolierung von rRNA-Genen sind die folgenden:

1. rRNA wird aus den Ribosomen isoliert und radioaktiv markiert, indem man sie in tritiummarkiertem Uridin enthaltendem Medium replizieren lässt.

2. Ribosomale DNA wird durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert (hoher G+C-Gehalt der rDNA erleichtert die Abtrennung durch Zentrifugation vom Rest der DNA) gefolgt von ihrer Denaturierung.

3. Anschließend wird einzelsträngige DNA auf Filterpapier fixiert und dem Papier wird markierte RNA zugesetzt.

4. Nun findet eine DNA- und RNA-Hybridisierung statt und überschüssige markierte RNA wird abgewaschen.

5. Die Radioaktivität wird gemessen und das Duplex-Hybrid wird bei Denaturierung einzelsträngige DNA ergeben, die doppelsträngig gemacht werden kann. Auf diese Weise kann das rRNA-Gen isoliert werden.

Isolierung des Gens spezifischer Proteine:

Dies ist durch die Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase möglich. Dieses Enzym kann aus RNA eine Kopie/komplementäre DNA (cDNA) herstellen. Daher ist es notwendig, dass Techniken zur Isolierung von mRNA verfügbar sind.

Die verschiedenen erforderlichen Schritte sind die folgenden:

1. Proteinprodukt des Gens wird gereinigt.

2. Antikörper werden gegen diese Proteinprodukte durch Immunisieren von Tieren wie Kaninchen und Mäusen produziert.

3. Es erfolgt eine Präzipitation von Polysomen, die an der Synthese spezifischer Proteine ​​beteiligt sind. Dies geschieht mit Hilfe von Antikörpern, die produziert werden.

4. mRNA wird aus den Polysomenfraktionen isoliert und gereinigt. Diese mRNA wird zur Synthese von cDNA verwendet.

5. Diese cDNA wird dann zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek in Klonierungsvektoren inseriert. Danach wird eine immunologische und elektrophoretische Analyse der Translationsprodukte von cDNA-Klonen durchgeführt, um den spezifischen cDNA-Klon zu identifizieren, der das Gen für das spezifische interessierende Protein aufweist.

6. Spezifische cDNA-Sonden werden dann zur Identifizierung und Isolierung des Gens aus genomischer DNA durch Screening einer vollständigen oder teilweisen genomischen Bibliothek ausgewählt.

Isolierung des Gens unbekannter Produkte (mit gewebespezifischer Expression):

Es ist einfach, die gewebespezifischen Genprodukte zu isolieren. Beispielsweise werden Gene für Speicherproteine ​​nur in sich entwickelnden Samen exprimiert, das Globin-Gen wird in Erythrozyten exprimiert. Solche Gene können leicht isoliert werden, da mRNA, die aus solchem ​​Gewebe extrahiert wurde, von großem Interesse ist. Andere mRNA kann eliminiert werden, die durch Isolierung und Vergleich von mRNA aus dem Gewebe identifiziert werden kann, in dem dieses Gen nicht exprimiert wird. Dann wird diese isolierte mRNA zur Synthese von cDNA unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase verwendet. Dann ist das Verfahren das gleiche wie bei der Isolierung von Genen beschrieben, die für bekannte spezifische Proteine ​​kodieren.

Isolierung von Genen mit DNA- und RNA-Sonden:

Wenn die spezifischen molekularen Sonden (DNA- und RNA-Sonden) verfügbar sind, können sie zur Isolierung spezifischer Gene verwendet werden. Diese Sonden können entweder von einer anderen Pflanzenart erhalten werden oder können unter Verwendung eines Teils der Aminosäuresequenz des Proteinprodukts des interessierenden Gens künstlich synthetisiert werden. Die von einer Pflanzenart gewonnenen und für eine andere Pflanzenart verwendeten Sonden werden als heterologe Sonden bezeichnet.

Es wurde gefunden, dass diese heterologen Sonden bei der Identifizierung von Genklonen während der Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung oder beim Southern Blot wirksam sind. Beispielsweise wurde das Gen für Chalcon-Synthase aus Antirrhinum majus und Petunia hybrida unter Verwendung einer heterologen Sonde aus Parsely isoliert. Heterologe Sonden werden im Allgemeinen mit der cDNA-Bibliothek verwendet.

Mit unserem Wissen über die Synthese von cDNA-Sonden können diese Sonden nun bei der Synthese synthetischer Sonden hilfreich sein. Bei diesem Verfahren wird das gereinigte Protein unter Verwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese zur Mikrosequenzierung von 5-15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren verwendet, diese Informationen können für die Synthese entsprechender Oligonukleotide unter Verwendung automatisierter DNA-Synthesizer verwendet werden. Diese Oligonukleotide können dann direkt zum Screenen von cDNA oder genomischer Bibliothek zur Isolierung des interessierenden Gens verwendet werden.

Werkzeug # 4. Koloniehybridisierung:

Koloniehybridisierung ist das Screening einer Bibliothek mit einer markierten Sonde (radioaktiv, biolumineszent usw.), um eine spezifische Sequenz von DNA, RNA, Enzym, Protein oder Antikörper zu identifizieren (Abb. 15.5).

Die Hybridisierung hat zwei wichtige Merkmale:

1. Hybridisierungsreaktionen sind spezifische Sonden, die nur an Stellen binden, die komplementäre Sequenzen aufweisen.

2. Hybridisierungsreaktionen treten in Gegenwart großer Mengen von Molekülen auf, die der Stelle ähnlich, aber nicht identisch sind. Dies bedeutet, dass eine Sonde ein Zielmolekül in einer Mischung von Millionen verwandter, aber nicht komplementärer Moleküle finden kann.

Diese Spezifität ermöglicht es, eine bestimmte Sequenz in einem komplexen Gemisch voller ähnlicher Sequenzen zu finden. Eine Hybridisierungstechnik ermöglicht es Wissenschaftlern auch, das interessierende Molekül aus sehr komplexen Mischungen herauszusuchen und das Molekül selbst zu untersuchen.

Methode der Koloniehybridisierung:

Folgende Schritte sind erforderlich:

1. Isolieren und züchten Sie die Kulturen in einem geeigneten Medium (Agar).

2. Übertragen Sie eine Probe der Kolonien auf eine feste Matrix wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran.

3. Die Zellen auf der Membran werden lysiert und die DNA anschließend denaturiert.

4. Der Matrix wird eine markierte Sonde zugesetzt und die Hybridisierung findet statt.

5. Die Matrix wird gespült, um die nicht hybridisierten Sondenmoleküle zu entfernen.

6. Bei radioaktiven Sonden verwendet man Autoradiographie und die Matrix wird auf einen Röntgenfilm gelegt.

7. Der Film wird auf schwarze Flecken untersucht, die Kolonien entsprechen, die mit der Sonde hybridisierten.

8. Vergleichen Sie den Röntgenfilm mit der Masterplatte, um zu sehen, welche Kolonien eine Sondenhybridisierung aufwiesen. Dies sind die Kolonien, die die spezifische Sequenz enthielten, die tatsächlich mit der Sonde hybridisierte.

9. Kolonien auf der Masterplatte, die die gewünschte Sequenz aufweisen, können dann bei Bedarf subkultiviert werden.

Vorteile:

1. Ermöglicht es Ihnen, aus Millionen ein interessantes Molekül auszuwählen.

2. Erfordert keine Isolierung von Nukleinsäuren.

3. Es ist möglich, Mikroorganismen zu kultivieren und zu identifizieren, die die hybridisierte Sequenz enthalten.

Nachteile:

1. Zeitaufwendig, braucht Zeit, bis die Kolonien inkubiert sind und die Hybridisierung auf dem Röntgenfilm sichtbar wird.

2. Bei der Identifizierung von Mikroorganismen funktioniert das Verfahren nur, wenn die Organismen wachsen und eine nachweisbare Kolonie bilden.


DNA-Fragmente mit sehr unterschiedlicher Größe trennen (Oligo- und Lambda-DNA) - Biologie

1.a. In DNA mit einer Basenzusammensetzung von A + T = G + C, wie groß ist die durchschnittliche Fragmentlänge, wenn die DNA mit . geschnitten wird Öko RI? mit Hin dIII? mit Hin dII? mit HPA II?

B. Ihre Antworten in (a) beziehen sich auf die Anzahl der erwarteten Stellen in einem bestimmten DNA-Stück (wie?). Wie viele Stellen für jedes Enzym würden Sie in der λ-DNA erwarten (48.502 bps Basenpaarzusammensetzung entspricht etwa 50 % AT)?

2. Diese Frage bezieht sich auf das obige Diagramm. Die erste Zeile zeigt eine Restriktionskarte eines Fragments des Genoms (genomische DNA), das die rx Gen (ein hypothetisches Gen). Die offenen Kästchen im genomischen DNA-Diagramm zeigen die Positionen der Exons. Sie haben einen (vollständigen) cDNA-Klon, der aus der mRNA besteht, die vom rx-Gen transkribiert wurde.

A. Die genomische DNA wird verdaut mit Hin dIII und nach dem Southern-Hybridisierungsverfahren mit radioaktiv markierter cDNA sondiert. Welche Größe Fragmente hybridisieren? Welche Größe Fragmente hybridisieren, wenn die genomische DNA stattdessen mit geschnitten wird Öko RI? Wenn die genomische DNA mit geschnitten wird Hin dIII & Pvu II?

B. Linker mit Eco RI-Stellen wurden an den Enden der rx cDNA. Das resultierende cDNA-Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle von pBR322 ligiert. (Anmerkung: die Belastung von E coli verwendet weder Restriktions- noch Modifikationsenzyme, die das Folgende stören könnten.) Wenn der pBR322-cDNA-Klon enthält rx wird verdaut mit Öko RI, die Fragmente werden auf einem Agarosegel getrennt und wie bei einem Southern-Transfer auf Nitrozellulose übertragen, und der Filter wird an die radioaktiv markierte cDNA hybridisiert. Welche Fragmente werden hybridisieren? Welche Fragmente werden hybridisieren, wenn das pBR322 rx Klon ist mit beiden geschnitten Öko RI und Hin dIII?

C. Der pBR322 rx cDNA-Klon wird verdaut mit Hin dIII und ein 1-kb-Fragment wird isoliert und radioaktiv markiert. Dieses Fragment wird dann mit einem Southern-Blot genomischer DNA hybridisiert. Welche Fragmente werden hybridisieren, wenn die genomische DNA mit geschnitten wird? ÖkoRI?

D. Die Krankheit Testpanikurie ist eine rezessive Erkrankung, bei der das rx-Genprodukt defekt ist. DNA aus dem Blut eines erkrankten Individuums wurde mit Dutzenden von Restriktionsenzymen verdaut und mit der rx-cDNA durch Southern-Analyse sondiert. Es wurde festgestellt, dass das zweite Exon vollständig fehlte, keine anderen genomischen Fragmente fehlten oder beeinflusst wurden. Welche Fragmente würden Sie in diesem Fall in einem Southern-Transfer-Experiment erwarten, bei dem die Wildtyp-cDNA als Sonde verwendet wurde, in der die genomische DN A des Patienten mit HindIII verdaut wurde?

e. Ein weiteres Allel wurde bei einer Person mit Testpanikurie untersucht. In diesem Fall war der Untersucher faul und führte nur ein Experiment durch. Genomische DNA der betroffenen Person wurde verdaut mit PvuII und analysiert durch Southern-Transfer unter Verwendung der Wildtyp-cDNA als Sonde. Ein einzelnes Fragment von ungefähr 6,4 kb wurde beobachtet. Was ist die wahrscheinliche Ursache des Allels? Könnte dieses Allel mit dem in (d) beschriebenen identisch sein? Warum Warum nicht?

3. Angenommen, Sie haben eine cDNA für ein menschliches Gen kloniert. Sie schneiden menschliche genomische DNA mit Öko RI und stellen Sie fest, dass nur ein einzelnes Fragment mit Ihrer Sonde hybridisiert. Sie klonen dieses Fragment, isolieren die DNA und schneiden die DNA mit Hpa und/oder Mbo (zwei andere Restriktionsendonukleasen). Die resultierenden Fragmente werden auf einem Gel mit den folgenden Ergebnissen aufgetrennt (die Zahlen geben die Größe der Fragmente in Kilobasen an).

Dieses Gel wurde auf Nitrozellulose geblottet und mit der cDNA, die radioaktiv markiert worden war, sondiert. Die beschrifteten Bänder waren:

A. Zeichnen Sie mit diesen Daten eine Restriktionskarte der Öko RI-Fragment (bitte angeben alle der bekannten Restriktionsschnittstellen).

B. Unter Verwendung der Hybridisierungsdaten folgern Sie, ob das Gen Introns hat oder nicht. Erkläre deine Antwort. (Wenn es Introns gibt, was können Sie über deren Anzahl sagen?)

C. Name einer Methode, die es ermöglichen würde, die cDNA radioaktiv zu markieren, und beschreibt die Grundlage dieser Methode.

4.a. Suchen Sie nach den Erkennungsseiten für Bam Hallo und Bgl II und vergleichen Sie die von diesen beiden Enzymen erkannten Sequenzen und die resultierenden "klebrigen Enden". Welche Ähnlichkeiten und Unterschiede sehen Sie?

B. Wenn ein 5 kb-Plasmid nur eines hat Bam HI-Sequenz und nur eine Bgl II-Sequenz (getrennt durch 0,5 kb), wie kann man ein Plasmid herstellen, dem die Bam HI-Bgl II. Fragment. [Hinweise: (a) Möglicherweise müssen Sie etwas DNA reinigen - wie werden Sie das tun? (b) Plasmide sind geschlossene Kreise.]

C. Wie viele Bam HI-Stellen wird das resultierende Plasmid haben? Wie viele Bgl II-Sites?

D. Wenn das resultierende Plasmid eine Arzneimittelresistenz behält, wie können Sie die Ergebnisse in (c) verwenden, um Ihre Konstruktion in (b) zu vereinfachen. (Hinweis: nur intakte Plasmide können sich transformieren E coli.)

5. Angenommen, Sie versuchen, ein Gen zu klonen, indem Sie hineingehen Drosophila. Obwohl keine nahegelegenen Gene geklont wurden, wurden einige Deletionen und Translokationen identifiziert, die Ihr Gen sehr nahe an einige geklonte Gene bringen. Wie würden Sie diese Informationen nutzen, um Ihren "Wander" zu Ihrem Gen zu unterstützen (vielleicht durch "Sprung")?

6. Wenn ein 10 kb großes genomisches DNA-Fragment aus C. elegans mit verschiedenen Kombinationen der angegebenen Restriktionsenzyme verdaut wurde, wurden die folgenden Fragmente gesehen (Zahlen neben den Banden zeigen ihre relative Intensität). H = Hind III, E = Öko RI, P = PST ich

A. Zeichnen Sie eine Restriktionskarte des Fragments. Erkläre deine Antwort.

B. Wie würden Sie die genomische DNA verwenden, um (ohne Klonen) zu zeigen, dass diese DNA eine mRNA von 4 Kb kodiert? Angenommen, Sie haben einen Vorrat an mRNA, der genomischen DNA und allen notwendigen Chemikalien und Geräten. Sie sollten sich kurz fassen.

C. Eine 4 kb cDNA wird isoliert und verwendet, um die obige Restriktionsenzym-verdaute DNA zu sondieren. Markierte Banden sind durch Sternchen gekennzeichnet (die Intensität der Markierung dieser Banden ist nicht angegeben). Wo wird die cDNA auf der genomischen DNA abgebildet? Erkläre deine Antwort.

7. Beschreiben Sie für jedes der folgenden Verfahren die experimentellen Verfahren, die Sie verwenden würden. Fass dich kurz. Benennen Sie das Verfahren und erklären Sie in ein oder zwei Sätzen, wie es funktioniert.

A. Wie würden Sie nach der Isolierung von Nukleinsäuren aus einigen Zellen eine Lösung erhalten, die nur RNA enthält? nur DNA?

B. Eine DNA-Probe ergibt eine einzelne Bande auf einem Agarosegel Sie vermuten jedoch, dass diese Bande tatsächlich zwei verschiedene DNAs der gleichen Größe enthalten könnte. Welches Experiment könnten Sie durchführen, um diese Hypothese zu testen (keine Sequenzierung erlaubt)?

C. Sie haben gerade ein Gen geklont in Caenorhabditis elegans und finde zwei weitere ähnliche Gene (Homologe) in der C. elegans Genom. Wenn Sie die von diesen Genen kodierten Nukleotidsequenzen vergleichen, stellen Sie fest, dass mehrere Bereiche der DNA von einem Gen zum nächsten identisch sind. Welche zwei sehr unterschiedlichen Methoden könnten Sie verwenden, um DNA zu identifizieren, die für ähnliche Homologe in kodiert? Drosophila?

D. Wie würden Sie feststellen, ob ein Gen (dessen DNA Sie haben) alternativ gespleißt wird, um mehr als eine mRNA unterschiedlicher Größe herzustellen?.

e. Sie erhalten a C. elegans Mutante, die weiterhin einige eigene Nachkommen produziert, die den mutierten Phänotyp aufweisen, und einige, die dies nicht tun, d. h. der Stamm brütet nicht richtig. Sie vermuten, dass die Tiere alle den gleichen Genotyp haben, aber eine unvollständige Penetranz zeigen. Wie würden Sie eine unvollständige Penetranz demonstrieren?

8. Was ist RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) und wofür wird sie angewendet?

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 kb

B = Bam HI-Stelle E = Öko RI-Standort H = Hin dIII-Site

9. Oben ist eine Restriktionskarte für ein Fragment genomischer DNA. Die beiden offenen Kästchen sind die Exons einer mRNA. In den folgenden Fragen müssen Sie das Aussehen von Agarosegelen oder Autoradiogrammen von Nitrocellulosefiltern zeichnen, die Fragmente enthalten, die durch Agarosegelelektrophorese getrennt wurden. Geben Sie für jede der linken Ordinanten eine Größenskala für die Fragmente an.

A. Welches Bandenmuster führt zu einem Agarosegel, wenn das Genomfragment mit i) eingeschränkt wird? Bam Hallo ii) Hin dIII iii) Öko RI (iv) Hin dIII und Öko RI?

B. Die von . erzeugten Fragmente Bam HI-Verdau wurden isoliert und durch Nick-Translation radioaktiv markiert. mRNA wurde aus der Leber isoliert, die dieses Gen exprimiert, und aus dem Gehirn, das dies nicht tut. Mehrere Agarosegele wurden mit einer separaten Spur für die Leber- und Gehirn-mRNAs laufen gelassen. Die abgetrennten mRNAs aus den Gelen wurden auf Nitrozellulose übertragen. Die verschiedenen Nitrozellulosefilter wurden separat mit einem der Bam HI-Fragmente aus der genomischen DNA (alle Bam HI-Fragmente wurden verwendet). Beschreiben oder zeichnen Sie die Ergebnisse dieses Experiments.

C. Ein DNA-RNA-Hybrid wird mit radioaktiv markierter DNA aus diesem Klon und mRNA aus der DNA hergestellt. Dieses Hybrid wird mit S1-Nuklease verdaut. Das resultierende Material wird auf einem Agarosegel laufen gelassen und auf Nitrozellulose geblottet. Zeichnen Sie ein Diagramm des Musters der Radioaktivität.

D. Wenn der gesamte Klon für einen Transkriptionsassay verwendet wurde (wie DNA-vermittelte Transformation von Zellen oder ein in vitro Transkriptionssystem) wurde die DNA genau transkribiert. Wenn die 12 kb Hin dIII-Fragment verwendet wurde, wurde die DNA nicht transkribiert. Geben Sie eine nichttriviale Erklärung für das Ergebnis an.

10. Antworten Sie mit WAHR oder FALSCH. Wenn die Anweisung WAHR ist, erklären Sie oder geben Sie ein unterstützendes Beispiel. Wenn die Anweisung FALSE ist, korrigieren Sie entweder die Anweisung oder geben Sie ein Gegenbeispiel an.

Plasmidvektoren werden für die Klonierung gegenüber Vektoren bevorzugt, die den Phagen Lambda beinhalten, da sie größere DNA-Mengen enthalten können.


KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die begleitenden Zeichnungen, die in diese Beschreibung aufgenommen sind und einen Teil derselben bilden, veranschaulichen Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung, liefern Daten, die die schriftliche Beschreibung unterstützen, und dienen zusammen mit der schriftlichen Beschreibung dazu, bestimmte Prinzipien der Erfindung zu erklären.

FEIGE. 1, Tafeln A–D, zeigt eine Reihe von Schritten, die durchgeführt werden können, um einen Transposase-Komplex zu erzeugen, den Komplex an ein festes Substrat zu binden und den an festes Substrat gebundenen Komplex zu verwenden, um DNA zu fragmentieren und festsubstratgebundene DNA-Fragmente herzustellen.

FEIGE. 2 zeigt die Verwendung von fester substratgebundener DNA für die in vitro-Amplifikation.

FEIGE. 3 zeigt ein Bild eines auf DNA gefärbten Agarosegels, das zeigt, dass Transposase („Vibhar“) mit Transposase-spezifischen Oligonukleotiden komplexiert, die in rohen Zelllysaten gebildet und an ein festes Substrat gebunden und in gebundener Form aus den Lysaten isoliert wurden ( dh gereinigte immobilisierte Komplexe) können verwendet werden, um Ziel-DNA (Phagen-Lambda-DNA) zu fragmentieren, und die Fragmente können in PCR spezifisch amplifiziert werden. Spurinhalt: Lysate von E coli Zellen, die Vibhar-Transposase exprimieren (Spur 3) oder Lysate von Negativkontrollzellen, die keine Vibhar-Transposase exprimieren (Spur 2, 4, 5), aufgetragen mit Ziel-DNA (Spur 3 und 5) oder ohne die Ziel-DNA (Spur 2 und 4) . Zum Vergleich wurde 1 kb+ DNA-Leiter (Life Technologies, Carlsbad, CA) auf Spur 1 laufen gelassen.

FEIGE. 4 beschreibt schematisch bestimmte beispielhafte Transposasen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Wenn eine Transposase eine Chimäre aus zwei oder mehr Transposasen ist, werden die verschiedenen kombinierten Sequenzen in verschiedenen Grauschattierungen dargestellt, wobei die Anmerkung auf der linken Seite die Reihenfolge der Sequenzen angibt. 1. A (Vibhar+Ameise), Vibrio harveyi Transposase (YP_001446289 SEQ ID NO: 1) mit einer C-terminalen Erweiterung von GGGRQIKIWFQNRRMKWKKEN (SEQ ID NO: 2) – die vollständige Sequenz wird als SEQ ID NO: 3 bereitgestellt 2. L (Vibhar+Lef) Vibrio harveyi Transposase mit einer C-terminalen Verlängerung von GGGKKKRKRER (SEQ ID NO: 4) – die vollständige Sequenz wird als SEQ ID NO: 5 bereitgestellt 3. S (Vibhar+Sox) Vibrio harveyi Transposase mit C-terminaler Verlängerung von GGGKYRPRRRKQ (SEQ ID NO: 6) – die vollständige Sequenz wird als SEQ ID NO: 7 bereitgestellt 4,5B-Photobakterium profundum SS9-Transposase (YP_133439 SEQ ID NO:8) 5. 5L Vibrio harveyi Transposase mit ihrer C-terminalen Domäne ersetzt die entsprechende C-terminale Domäne von Photobakterium profundum SS9-Transposase (vollständige Sequenz der Chimäre, bereitgestellt als SEQ ID NO: 9) 6. V6, Vibrio harveyi Transposase (YP_001446289 SEQ ID NO: 1) 7. Vibrio cholerae V51-Transposase (ZP_04918286.1 SEQ ID NO:10) 8. Vibrio cholerae V51-Transposase (ZP_04918286.1) mit geänderten Aminosäuren konform zu Vibrionales Bakterium SWAT-3-Transposase (ZP_01815141.1 vollständige Sequenz der Chimäre, bereitgestellt als SEQ ID NO: 11) 9. Vibrio harveyi-Transposase mit ihrer C-terminalen Domäne ersetzt die entsprechende C-terminale Domäne aus der Transposase TnpA der IS4-Familie [Legionella pneumophila Untersp. Pneumophilie str. Philadelphia 1] (vollständige chimäre Sequenz, bereitgestellt als SEQ ID NO: 12) 10. Vibrio harveyi Transposase mit ihrer C-terminalen Domäne ersetzt die entsprechende C-terminale Domäne von Vibrio cholerae V51-Transposase (vollständige chimäre Sequenz, bereitgestellt als SEQ ID NO: 13) 11. Vibrio harveyi Transposase mit ihrer C-terminalen Domäne ersetzt die entsprechende C-terminale Domäne von Vibrionales Bakterium SWAT-3-Transposase (ZP_01815141.1 vollständige chimäre Sequenz, bereitgestellt als SEQ ID NO: 14).

FEIGE. 5 zeigt Adapter und Primer für die PCR-Amplifikation und Oligonukleotide für die Sequenzierung auf Illumina-Instrumenten. AgP1=SEQ ID NO:15 3bio=SEQ ID NO:16 3i0=SEQ ID NO:17 AgP2=SEQ ID NO:18 8i1=SEQ ID NO:19 8i0=SEQ ID NO:20 i1=SEQ ID NO:21 i2 =SEQ ID NO:22 i3=SEQ ID NO:23 i4=SEQ ID NO:24 i5=SEQ ID NO:25 i6=SEQ ID NO:26 i7=SEQ ID NO:27 i8=SEQ ID NO:28 3iS= SEQ ID NO: 29 8iS = SEQ ID NO: 30 Rp1 = SEQ ID NO: 31 Rp2 = SEQ ID NO: 32 InP = SEQ ID NO: 33.

FEIGE. 6 zeigt ein Bild eines auf DNA gefärbten Agarosegels, das zeigt, dass eine Vielzahl von Festsubstrat-gebundenen Transposase-Komplexen, einschließlich rekombinanter/chimärer Transposase-Komplexe, verwendet werden kann, um die Ziel-Lambda-DNA zu fragmentieren und die fragmentierte DNA zu amplifizieren, wenn sie an das Festsubstrat gebunden ist . Zum Vergleich wurde 1 kb+ DNA-Leiter (Life Technologies, Carlsbad, CA) auf den Gelen neben den Fragmenten laufen gelassen. Über den Vertiefungen des Gels bereitgestellte Probencodes entsprechen den in Fig. 1 bereitgestellten Codes. 4.

FEIGE. 7 zeigt ein Bild eines auf DNA gefärbten Agarosegels, das zeigt, dass eine Vielzahl von festen substratgebundenen Transposase-Komplexen, einschließlich rekombinanter/chimärer Transposase-Komplexe, verwendet werden können, um Target- zu fragmentieren E coli DNA und amplifizieren die fragmentierte DNA, wenn sie an das feste Substrat gebunden ist, und dass die Amplifikation nicht von einer bestimmten Polymerase oder Polymerasemischung abhängt. Über den Vertiefungen des Gels bereitgestellte Probencodes entsprechen den in Fig. 1 bereitgestellten Codes. 4. Molekulargewichte sind auf der rechten Seite des Gels angegeben.M = verstärkt unter Verwendung von PICOMAXX™ (Agilent Technologies, Inc.) U = verstärkt unter Verwendung von PFUULTRA™ HF (Agilent Technologies, Inc.).

FEIGE. 8 zeigt Bioanalyzer-Elektropherogramme von DNA-Fragmenten vor der Übermittlung zur Sequenzierung. Die Probennummern entsprechen den in Fig. 1 bereitgestellten Nummern. 4.

FEIGE. 9 zeigt sequenzierte DNA-Fragmente des E coli Genom (Genbank CP000946), erhalten unter Verwendung verschiedener Transposasen, ausgerichtet auf die E coli Genom und präsentiert über das Interactive Genomics Viewer-Programm (Robinson et al., Nature Biotechnology 29, 24-26, 2011). Probeninhalte sind angegeben und entsprechen den in Fig. 1 bereitgestellten Konstrukten. 4.

FEIGE. 10 zeigt GC-Bias-Plots von sequenzierten DNA-Fragmenten der E coli Genom (Genbank CP000946), erhalten unter Verwendung verschiedener Transposasen. Beispielcodes der Plots entsprechen den in Fig. 1 bereitgestellten Codes. 4.


Modul 3

Die isoelektrischen Punkte des fraglichen Stücks kennen.

Messen der Größe der Banden auf dem Gel

Entfernen der Banden aus dem Gel und Hybridisieren mit einem bekannten DNA-Strang, der komplementär zum interessierenden Gen ist

Identifizieren der Molekulargewichte der betreffenden Fragmente

Informationen über bakterielle Orthologe des Gens

Eine EST-Datenbank des menschlichen Genoms

Microarray-Daten von Geweben, in denen das Gen exprimiert wird

Daten zur Vererbung von SNP-Markern in Familien mit der Krankheit

groß, hauptsächlich in monocistronischen Transkriptionseinheiten ohne Introns organisiert.

klein, hauptsächlich in monocistronischen Transkriptionseinheiten mit Introns organisiert.

groß, hauptsächlich in polycistronischen Transkriptionseinheiten ohne Introns organisiert.

klein, mit hoher Gendichte.

Groß, hauptsächlich in monocistronischen Transkriptionseinheiten ohne Introns organisiert.

klein, hauptsächlich in monocistronischen Transkriptionseinheiten mit Introns organisiert.

groß, hauptsächlich in polycistronischen Transkriptionseinheiten ohne Introns organisiert.

klein, hauptsächlich in polycistronischen Transkriptionseinheiten ohne Introns organisiert.

werden verwendet, um DNA-Moleküle zufällig zu verdauen.

sind alle gentechnisch verändert.

hybridisiert filtergebundene DNA mit einer DNA-Sonde.

hybridisiert filtergebundene RNA mit einer DNA-Sonde.

untersucht Aminosäuresubstitutionen mit radioaktiven Sonden.

spaltet RNA mit Restriktionsendonukleasen.

Prokaryoten verwenden einen anderen genetischen Code als Eukaryoten

Bakterien können eukaryotische Introns nicht entfernen.

bakterielle RNA-Polymerase kann RNA nicht komplementär zur Säugetier-DNA herstellen

die beiden Proteine ​​haben identische Funktionen.

die beiden Proteine ​​haben keinen gemeinsamen Ursprung.

die beiden Proteine ​​haben eine gemeinsame Abstammung.

die beiden Proteine ​​haben identische Tertiärstrukturen.

notwendig für eine effiziente Replikation der Zell-DNA in der Interphase

eine Technik zur Amplifikation von DNA-Sequenzen in vitro

eines der Kontrollelemente des Zellzyklus

jedes Cosmid repliziert nichtautom.

lysogene Phagen integrieren weiterhin ihre DNA in das Wirtschromosom, wodurch die Anzahl der gewünschten rekombinanten Klone reduziert wird.

jeder Vektor kann nur einen relativ kleinen Bruchteil der eukaryontischen DNA aufnehmen.

jedes Ligationsprodukt ist sequenzspezifisch.

Prüfen Sie, ob eine EST-Datenbank Sequenzen in der Region enthält.

Prüfen Sie, ob eine SNP-Datenbank Sequenzen in der Region enthält.

Scannen Sie die Region nach Promotorsequenzen.

Ein 8-kb- und ein 2-kb-Fragment

Ein 10-kb- und ein 2-kb-Fragment

Konstruieren Sie eine physikalische Karte der 3,3 Milliarden Basenpaare im menschlichen Genom.

sammeln Zellproben aus allen Teilen der Welt, um die genetische Vielfalt des Menschen zu erhalten.

Sammeln von Pflanzensamen, um die Auswirkungen menschlicher Aktivitäten auf das Pflanzensterben zu reduzieren.


1. Analytische Anwendungen zur Bestimmung experimenteller Ergebnisse

Die analytischen Anwendungen der Nukleinsäureelektrophorese bieten Möglichkeiten, experimentelle Ergebnisse eines vorherigen Schritts zu untersuchen, bevor der Arbeitsablauf oder eine andere Reihe von Experimenten fortgesetzt wird. Dieser Ansatz beruht hauptsächlich auf der Bewertung der Anwesenheit oder Abwesenheit gewünschter Banden in Gelen, ihrer Intensitäten, Migrationsmuster, Mobilitäten und Hybridisierung, wie unten beschrieben.

A. Erfolgsbestimmung bei enzymatischen Synthese-, Verdauungs- und Klonierungsexperimenten

Die elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren wird üblicherweise unmittelbar nach den folgenden Techniken (Abbildung 1) um experimentellen Erfolg und Effizienz zu bestimmen:

  • Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR, amplifiziert eine einzelne Kopie einer Zielsequenz in wenigen Stunden auf Millionen von Kopien. Die Elektrophorese wird nach der Endpunkt-PCR durchgeführt, um die Amplifikation des Ziels und seine Ausbeute zu bestätigen. (Erfahren Sie mehr: PCR-Grundlagen und -Anwendungen)
  • Nach Restriktionsverdauungen, die Reaktionen mit Restriktionsenzymen sind, um spezifische Sequenzen auf DNA-Substraten zu spalten, werden Proben auf einem Gel laufen gelassen, um das Muster der DNA-Spaltung (sowie das Ausmaß der Beendigung des Verdaus) zu bestimmen. (Weitere Informationen: Grundlagen und Anwendungen von Restriktionsenzymen)
  • In molekulares Klonen, wird ein DNA-Fragment über einen Prozess namens . in einen Vektor eingefügt Liga. In einigen Fällen kann nach der Ligation eine Elektrophorese durchgeführt werden, um die Reaktionseffizienz zu beurteilen (Figur 2). Das ligierte Produkt wird dann verwendet, um kompetente Zellen eines Klonierungsorganismus zu transformieren, wie z E coli, zur Vermehrung, wonach die gebildeten Kolonien gescreent werden, um zu bestimmen, ob sie den Vektor mit dem gewünschten Insert tragen. PCR und Restriktionsverdau, die beide häufig Elektrophorese als Teil des Arbeitsablaufs beinhalten, sind gängige Techniken, die beim Kolonie-Screening verwendet werden. (Weitere Informationen: Grundlagen des molekularen Klonens, Grundlagen der Transformation und Methoden des Kolonie-Screenings) ist die Synthese von DNA, die zu einer RNA-Matrize (cDNA) komplementär ist, durch ein Enzym namens Reverse Transkriptase. Nach der cDNA-Synthese und Entfernung der RNA-Matrize kann das Produkt auf einem denaturierenden Gel laufen gelassen werden, um die Reaktionseffizienz zu beurteilen. Das Verfahren ist am nützlichsten, wenn eine bekannte Sequenz oder Länge von RNA revers transkribiert wird. (Weitere Informationen: Grundlagen und Anwendungen der reversen Transkription) ist die Synthese von RNA aus einer DNA-Matrize durch eine RNA-Polymerase. Nach dem Entfernen der DNA-Matrize kann die synthetisierte RNA auf einem denaturierenden Gel laufen gelassen werden, um den Erfolg zu bestimmen. (Mehr erfahren: In vitro Transkriptionsgrundlagen)

Abbildung 1. Gängige molekularbiologische Anwendungen, bei denen Elektrophorese verwendet werden kann, um den experimentellen Erfolg zu bestimmen.

Abbildung 2. Ligationseffizienz bestimmt durch Gelelektrophorese. Lambda-DNA wurde zuerst mit HindIII gespalten, einem ortsspezifischen Restriktionsenzym vom Typ II (Spur 1). Die Probe wurde religiert und durch Gelelektrophorese (Spur 2) analysiert, wobei die vollständig ligierte DNA die auffälligste Bande ist.

B. Quantifizierung von Nukleinsäureproben durch Gelelektrophorese

Elektrophorese kann verwendet werden, um interessierende DNA- oder RNA-Banden zu quantifizieren, indem ein Standard oder eine Leiter verwendet wird, die eine bekannte Menge jedes Fragments enthält. Das weit verbreitete spektrophotometrische Quantifizierungsverfahren kann durch das Vorhandensein von Verunreinigungen wie Nukleotiden, Primern und anderen Spezies verfälscht werden. Die Elektrophorese trennt die interessierende Probe von diesen Verunreinigungen und bietet eine alternative zuverlässige Quantifizierungsstrategie.

Die Gelquantifizierung wird erreicht, indem die Intensität einer Bande in der Probe mit einer Bande in der Leiter ähnlicher Größe verglichen wird, um die Menge der Probe abzuschätzen (Abbildung 3A). Idealerweise sollten bei Verwendung einer Leiter für die Quantifizierung unterschiedliche Mengen der Leiter geladen werden, um eine Standardkurve der Menge gegen die Intensität für eine genauere Quantifizierung zu zeichnen (Abbildung 3B). Darüber hinaus kann das Färben von Nukleinsäuren mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der eine hohe Empfindlichkeit und einen breiten Dynamikbereich aufweist, die Gelquantifizierung weiter verbessern. Einige Gel-Imager sind mit einer Analysesoftware zur einfacheren Quantifizierung von Proben im Gel ausgestattet, während andere über Cloud-Konnektivität zur Datenspeicherung verfügen.

Figur 3. (EIN) Gelquantifizierung unter Verwendung von Fragmenten in bekannten Mengen. (B) Standardkurve für die Gelquantifizierung.

C. Analyse von Probenreinheit, Integrität, Fragmentierung und Syntheseeffizienz

Gelelektrophorese kann verwendet werden, um die Reinheit und Integrität von Nukleinsäureproben nach der Extraktion aus ihren Quellen sowie den Erfolg der Probenfragmentierung und den Prozentsatz der Oligonukleotide voller Länge nach der Synthese zu beurteilen.

  • Genomische DNA, die RNA-Proben kontaminiert und umgekehrt, kann mittels Gelelektrophorese zur Untersuchung nachgewiesen werden Probenreinheit (Abbildung 4A). Der Nachweis kontaminierender Spezies hängt von der Empfindlichkeit des verwendeten Nukleinsäurefärbemittels sowie von der Menge der Kontaminanten ab.
  • Mittels Gelelektrophorese wird die Integrität der Gesamt-RNA nach einer Extraktion kann durch Bewerten der relativen Intensitäten von 28S- und 18S-rRNAs untersucht werden, wobei ein Verhältnis von 2:1 intakte RNA anzeigt. Das Vorhandensein von Ausstrichen, insbesondere bei niedrigeren Molekulargewichten, weist auf einen RNA-Abbau hin (Abbildung 4B).
  • Einige Protokolle erfordern Fragmentierung von Nukleinsäureproben, wie bei der Vorbereitung des Probeneingangs für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), um für den nächsten Schritt geeignete Fragmentgrößen zu erhalten. Die Effizienz der Probenfragmentierung kann durch Gelelektrophorese (Abbildung 4C).
  • Nach der Synthese enthalten Oligonukleotidprodukte volle Länge sowie verkürzte oder fehlerhafte Sequenzen (d. h. n–1, n–2 usw.), aufgrund der Kopplungseffizienz der Synthese, die <100% beträgt. Elektrophorese ist eine Möglichkeit, Produkte voller Länge von Fehlersequenzen basierend auf der Größe und Konformation von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge zu unterscheiden.

Abbildung 4. Gelelektrophorese zur Bestimmung von Probenreinheit, Integrität und Fragmentierung.(EIN) Extrahierte genomische DNA und Gesamt-RNA wurden auf getrennten Gelen analysiert. Die roten Pfeile zeigen kontaminierende RNA bzw. genomische DNA an. Kontaminierende RNA ist nur zu Beginn der Elektrophorese (≤5 min Lauf) nachweisbar. (B) Zwei Proben gereinigter RNA wurden durch Elektrophorese und Analyse von 28S- und 18S-rRNAs auf Integrität untersucht. (C) Die Effizienz der DNA-Fragmentierung und die Verteilung der fragmentierten DNA wurden auf einem Gel bestimmt. (M = Molekulargewichtsstandard. RNA-Proben wurden auf denaturierenden Gelen laufen gelassen.)

D. Detektion von interessierenden Sequenzen in einer Mischung von Proben

Die Gelelektrophorese ist ein kritischer Teil des Arbeitsablaufs beim Nachweis von Zielsequenzen in einem Pool von Nukleinsäuren durch Sondenhybridisierung (Abbildungen 5, 6). Sonden sind einzelsträngige Nukleinsäuren bekannter Sequenzen, die entworfen sind, um Zielsequenzen spezifisch über Basenkomplementarität zu binden.

  • Für die DNA-Fragmentanalyse sind Southern Blot und Restriktionsenzymfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse zwei wohlbekannte Techniken, bei denen Elektrophorese verwendet wird, um Proben vor dem Zielnachweis zu trennen (Abbildung 5).

Abbildung 5. Southern- und Northern-Blots werden verwendet, um spezifische DNA- bzw. RNA-Sequenzen in einem Probenpool nachzuweisen.

  • Für die RNA-Fragmentanalyse verlassen sich Northern Blots und Nukleaseschutzassays (NPA) ebenfalls auf die Sondenhybridisierung, um die interessierenden Sequenzen nachzuweisen. Der Northern-Blot folgt dem gleichen Arbeitsablauf wie der Southern-Blot, außer dass die Eingabe RNA ist (Abbildung 5). Beim Ribonuklease-Protection-Assay (RPA) binden RNA-Sonden an die Zielsequenzen im Probengemisch. Die verbleibenden einzelsträngigen RNAs, wie ungebundene Sonden und Matrizen, und ihre Überhänge werden dann von Ribonukleasen wie ein RNase A/T1-Mix verdaut. Gebundene Sonden und Proben werden dann auf einem Gel zur stromabwärts gerichteten Detektion und Analyse von Zielen laufen gelassen.

Abbildung 6. Nuklease-Schutz-Assay.

E. Beurteilung der DNA-Konformation und des Nukleinsäure-Protein-Komplexes

Wie im Abschnitt über Elektrophorese-Überlegungen diskutiert, kann Plasmid-DNA derselben Sequenz je nach Konformation unterschiedliche elektrophoretische Mobilitäten aufweisen. Dieses Merkmal kann verwendet werden, um die DNA-Konformation sowie den Gehalt an intakten Plasmiden nach der Extraktion zu beurteilen.

An Proteine ​​gebundene Nukleinsäurefragmente wandern bei der Elektrophorese langsamer als ungebunden. Früher als elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) bekannt, wird die auf diesem Prinzip basierende Methode allgemein als Gel-Shift- oder Gel-Retardations-Assay bezeichnet, da die gebundenen Proteine ​​die Migration der Nukleinsäurefragmente in Gelen verschieben oder verzögern (Abbildung 7). Daher kann der Elektrophoreseschritt des Assays einen „Schnappschuss“ des Gleichgewichts zwischen gebundener und freier DNA in der Probe liefern. Für EMSA sollte sowohl bei der Gelpräparation als auch bei der Elektrophorese ein Puffer mit niedriger Ionenstärke verwendet werden, um den Nukleinsäure-Protein-Komplex während der Elektrophorese zu stabilisieren.

Abbildung 7. Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay.


Warum ist Southern Blotting wichtig?

Bild 5:Ein Southern Blot ist eines der Verfahren, die bei Vaterschaftstests verwendet werden.
Bildquelle:slideplayer.com

Southern Blotting ist wichtig, da es in den verschiedenen Interessengebieten nützlich ist, wie zum Beispiel:

  1. Es wird zum Nachweis der DNA in einer bestimmten Probe verwendet, z. B. beim DNA-Fingerabdruck in der Forensik.
  2. Es ist nützlich, um das interessierende Gen zu isolieren und zu identifizieren.
  3. In der Forensik ist Southern Blotting eines der am häufigsten verwendeten Verfahren, insbesondere bei:
    1. Kriminelle Identifizierung
    2. Opferidentifikation

    DISKUSSION

    Das hier beschriebene Bibliothekspräparationsverfahren bietet in seiner ersten Implementierung mehrere Vorteile gegenüber der einzelsträngigen DNA-Bibliothekspräparation. Die neue Methode setzt auf das weit verbreitete und kostengünstige T4 DNA-Ligase anstelle von CircLigase, was die Kosten erheblich senkt (siehe Zusatztabelle S4 für einen Vergleich der Reagenzienkosten) und die Methode robuster gegenüber größeren Mengen an zugeführter DNA macht. Obwohl ssDNA2.0 auch mit einer geringfügigen Reduzierung der Anzahl der Reaktionsschritte einhergeht, bleibt die einzelsträngige Bibliotheksvorbereitung zeitaufwändiger als doppelsträngige Methoden, was die Anzahl der Proben, die durch manuelles Pipettieren verarbeitet werden können, begrenzt. Unabhängig von der Wahl der Protokolle ist eine Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz jedoch ohne den Einsatz von Laborautomatisierungssystemen schwierig zu erreichen. Der aus unserer Sicht wichtigste Vorteil von ssDNA2.0 liegt somit im Wegfall des von CircLigase benötigten erweiterten Hochtemperatur-Inkubationsschrittes, was die Methode mit der Automatisierung auf offenen Liquid-Handling-Plattformen kompatibel macht und die Möglichkeit zur Bibliotheksvorbereitung in Mikrotiterplatten eröffnet Format.

    Wir glauben, dass der Kern der Methode, die einzelsträngige DNA-Ligation mit Splitter-Oligonukleotiden mit degenerierten Basen – wie erstmals in Proof-of-Principle-Experimenten von Kwok . beschrieben et al. (19) – birgt ungenutzte Potenziale für die Methodenentwicklung in der Molekularbiologie. Wir beobachteten, dass eine hocheffiziente Ligation mit zufällig ausgewählten Adaptersequenzen erreicht werden kann und dass die Trennung von Adapter- und Splitter-Oligonukleotid die Wirksamkeit dieser Ligationsstrategie nicht beeinträchtigt. Weiterhin zeigt die Analyse von Sequenzdaten, dass Ligationsfehler minimiert werden, wenn Splitter verwendet werden, die sieben oder acht degenerierte Basen tragen. Wir zeigen auch, dass die Ligation von geschienter DNA am effizientesten mit Akzeptoren hoher Sequenzkomplexität ist, wie z. B. Fragmenten genomischer DNA, die aus biologischem Gewebe isoliert wurden. Die Sequenzierung von DNA mit geringer Komplexität unter Verwendung von ssDNA2.0, beispielsweise zur Qualitätskontrolle der Oligonukleotidsynthese, kann daher die Verwendung relativ geringer Mengen an Eingangs-DNA erfordern, um sicherzustellen, dass genügend Splitter mit Sequenzähnlichkeit zu den Akzeptorsträngen für die Ligation verfügbar sind.

    Unsere Studie bietet auch einen umfassenderen Vergleich der einzel- und doppelsträngigen Bibliothekspräparation als zuvor ( 9, 10, 13). Bei diesen Studien wurde vor allem auf die Eigenschaften der erhaltenen Sequenzen Wert gelegt, beispielsweise deren Größenverteilung oder die Anteile an endogenen und kontaminierenden mikrobiellen DNA-Sequenzen. Einer der Schlüsselparameter, der den Erfolg der Bibliotheksherstellung bestimmt, ist jedoch der Gehalt an einzigartigen Molekülen in jeder Bibliothek (oft als Bibliothekskomplexität bezeichnet). Mit Ausnahme einer Einzelstudie an FFPE-Proben ( 13 ) wurde dieser Parameter entweder nicht bewertet oder lediglich aus der Klonalität von Sequenz-Reads basierend auf sehr flachen Sequenzdaten extrapoliert. Wir bestehen darauf, dass die Anzahl der Bibliotheksmoleküle vor der Amplifikation und Sequenzierung bestimmt werden sollte, wenn die Leistung von Bibliotheksherstellungsverfahren bewertet wird. Hierfür ist die quantitative PCR gut geeignet ( 38), da sie direkte Vergleiche der Bibliotheksausbeute ermöglicht. Durch die Bereitstellung von Schätzungen der Bibliothekskomplexität unabhängig von der Sequenzierung zeigen wir schlüssig, dass die einzelsträngige Bibliothekspräparation die Bibliotheksausbeute aus alter DNA um ungefähr eine Größenordnung und um einen Faktor von ∼1.4 für zellfreie DNA im Vergleich zu den besten doppelsträngigen . erhöht Methode. Noch dramatischer ist der Unterschied bei formalinfixierten Proben, bei denen durch die einzelsträngige Bibliothekspräparation bis zu 3100-mal mehr Moleküle zurückgewonnen werden. Diese Beobachtung steht im Einklang mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht, in dem festgestellt wurde, dass die einzelsträngige Bibliotheksherstellung die Anzahl der Bibliotheksmoleküle aus FFPE-Geweben im Vergleich zu doppelsträngigen Verfahren um das durchschnittlich 900-fache erhöht (13). Im Gegensatz zu FFPE-Proben, die typischerweise über Stunden oder Tage in Formalin fixiert werden, wurden die hier verwendeten Proben jedoch über viele Jahre in Formalin gelagert, was darauf hindeutet, dass auch unter so extrem ungünstigen Bedingungen konserviertes Material genetischen Studien zugänglich gemacht werden kann.

    Schließlich zeigt unsere Arbeit, inwieweit Details der Bibliotheksherstellung, wie die Wahl der Enzyme, die Eigenschaften von Sequenzen beeinflussen, die aus degradierter DNA gewonnen werden. Zum Beispiel wurde die Zunahme der Häufigkeit von Desaminierungs-induzierten Substitutionen nahe dem Ende von DNA-Sequenzen verwendet, um die Länge einzelsträngiger Überhänge in alter DNA abzuleiten (30, 39), jedoch die Häufigkeit dieser Substitutionen an den Endpositionen von Sequenz-Alignments und ihr Abfall zum Inneren der Sequenz hin hängen im Wesentlichen sowohl von der Ligase ab, die verwendet wird, um Adapter bei der Bibliotheksherstellung zu verbinden, als auch von der Polymerase, die zum Kopieren der Matrizenstränge verwendet wird. Die Möglichkeit von Verzerrungen bei der DNA-Extraktion und Bibliothekserstellung, die im Allgemeinen noch wenig verstanden werden, sollte daher berücksichtigt werden, wenn Parameter von DNA-Schäden aus alten DNA-Sequenzdaten abgeleitet werden.


    Labor 6 & Molekularbiologie

    Um die Struktur und Funktion eines einzelnen Protein-kodierenden Gens zu untersuchen, muss man das Gen in gereinigter Form herstellen. Wirbeltierzellen enthalten genug DNA, um für mehr als 100.000 Proteine ​​zu kodieren, daher ist es nicht sehr praktisch, ein Gen durch konventionelle biochemische Verfahren zu isolieren. Aus diesem Grund ist die rekombinante DNA-Technologie so wichtig, dass sie relativ einfach verwendet werden kann, um ein bestimmtes Gen zu isolieren und zu amplifizieren.
    Plasmide, kleine zirkuläre DNA-Moleküle, sind normalerweise extra chromosomal, sie existieren in den meisten Bakterienarten getrennt von den Chromosomen. Plasmide sind für das Überleben der Wirtsbakterien nicht notwendig, können aber Gene enthalten, die es den Bakterien ermöglichen, in bestimmten Umgebungen zu überleben.Wenn eine Bakterienzelle ein Plasmid enthält, das ein Gen trägt, das Resistenz gegen Antibiotika verleiht, könnte diese Zelle in Gegenwart des Arzneimittels überleben.
    Plasmide können durch den Transformationsprozess in Bakterienzellen eingeführt werden. Bakterien, die in eine Calciumchloridlösung gegeben werden, können Plasmid-DNA-Moleküle aufnehmen. Auf diese Weise können große Mengen spezifischer Plasmid-DNA hergestellt werden, da eine transformierte Zelle zu doppelten Zellen führt, die auch das Plasmid-DNA-Molekül enthalten.
    Plasmide sind für den Molekularbiologen sehr wichtig, da sie als Genträgermoleküle dienen, die als Klonierungsvektoren bezeichnet werden. Ein interessierendes Gen kann mit Vektor-DNA verbunden werden, um ein hybrides oder rekombinantes Molekül zu bilden, das sich in Bakterien replizieren kann. Bei der Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls ist ein Verfahren zum Schneiden von Klonierungsvektoren und zellulären DNA-Molekülen in genauen Positionen erforderlich.
    Restriktionsnukleasen sind für die rekombinante DNA-Technologie wichtig, da sie DNA an bestimmten Stellen schneiden. Diese Enzyme werden normalerweise von Bakterienarten hergestellt, in denen sie eindringende fremde DNA innerhalb der Bakterienzelle abbauen. Die meisten Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische Sequenz von Nukleotiden in der DNA und schneiden eine lange DNA-Doppelhelix in Restriktionsfragmente, die bei der Agarosegelelektrophorese gemessen werden.

    Einführung: Übung 6B: DNA Fingerabdruck

    Elektrophorese ist die Bewegung geladener Teilchen in Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes. Bei der Gelelektrophorese ist Agarosegel das stabilisierende Medium, das als Matrix für den Puffer dient, in dem die Probenmoleküle wandern. Das Gel wird in Puffer innerhalb der elektrophoretischen Gelzelle eingetaucht. Die Proben werden in die Probenvertiefungen im Gel geladen und elektrischer Strom wird durch das Gel geleitet.
    DNA-Moleküle sind aufgrund negativer Ladungen an der Phosphatgruppe negativ geladen. Bei dieser Übung wandern Nukleinsäuren durch die Poren des Gels vom negativen Ende zum positiven Ende. Die großen DNA-Moleküle bewegen sich langsamer als kleinere Moleküle, daher werden die Moleküle nach Größe sortiert.

    Ziel: Übung 6A


    ichuntersuchen grundlegende genetische Konzepte durch die Transformation von Bakterienzellen durch Einfügen eines Ampicillin-resistenten Gens in E. coli-Zellen.

    Ziel: Übung 6B

    Untersuchen Sie grundlegende genetische Konzepte, indem Sie restriktive Enzyme verwenden, um Phagen-Lambda-DNA zu verdauen und die DNA-Fragmente mithilfe von Gelelektrophorese zu trennen und zu identifizieren.

    Materialien und Methoden: Übung 6A


    Die in dieser Übung verwendeten Materialien umfassten: 2 Luria-Agarplatten, 2 Luria-Agarplatten mit Ampicillin, 2 Mikrozentrifugenröhrchen, 1 Impföse, 1 Bacti-Spreader, sterile Mikropipetten, Calciumchlorid, Luria-Brühe, Plasmid pUC8, Bunsenbrenner, Heizplatte, Eis, Wasserbad.
    Die beiden Mikrozentrifugenröhrchen wurden mit !I+” und !1-!1 markiert und mit einer Pipette jeweils 250IJI kaltes Calciumchlorid zugegeben. Eine große Bakterienkolonie wurde jedem Röhrchen mit einer sterilen Impföse zugesetzt. Eine Mikropipette wurde verwendet, um 10IJI der Plasmid-pUCS-Lösung in das !I+”-Röhrchen zu überführen. Beide Röhrchen wurden 15 Minuten auf Eis inkubiert und Inzwischen waren die beiden Luria-Agarplatten mit “+” und “-” beschriftet, ebenso die beiden Luria-Platten mit Ampicillin. Die Röhrchen wurden vom Eis genommen und 90 Sekunden in ein 42 °C heißes Wasserbad gestellt. Die Röhrchen wurden dann aus dem Wasserbad genommen und für zwei Minuten auf Eis gestellt. Eine Mikropipette wurde verwendet, um jedem Röhrchen 250 IJI Luria-Brühe zuzusetzen. Eine weitere Mikropipette wurde verwendet, um 100 IJI der !I+”-Lösung auf die beiden !I+”-Platten und 1oo Mikroliter der Lösung auf die beiden “-”-Platten zu geben. Die Bakterien wurden zur Sterilisation geflammt und nach dem Abkühlen verwendet, um die Zellen über die gesamte Oberfläche der Platten zu verteilen. Nach fünf Minuten wurden die Platten über Nacht in einen Inkubator von 37ºC umgedreht angeordnet.

    Materialien und Methoden: Übung 6B


    Die in dieser Übung verwendeten Materialien umfassten: 8% Agarosegel, 2 Elektrophoresekammern, Netzteil, Laufpuffer-Tris, Mikropipette und Spitzen, Färbetablett, Methylenblau-Farbstoff, Handschuhe, Schürzen, 4 DNA-Proben, die mit restriktiven Enzymen geschnitten wurden, Fläschchentablett , Mikrozentrifuge, Papier, Bleistift, destilliertes Wasser, Spachtel, Kunststoffbehälter zum Entfärben, Kreppband, Leuchtkasten, Lineal, Semi-Iog Millimeterpapier. Das Gel auf dem Geltablett wurde in der Mitte der Kammer platziert, wobei die Vertiefungsseite des Gels nahe der schwarzen Elektrode lag. Ungefähr 350 ml Laufpuffer wurden in die Kammer gegeben. Von jeder DNA-Probe wurden 10 Mikroliter in die entsprechende Gelspur geladen mit einer Mikropipette. Die Netzkabel wurden an die entsprechenden Anschlüsse angeschlossen und die Stromversorgung auf 50 Volt eingestellt. Die Proben wurden drei Stunden lang wandern gelassen. Das Gel wurde dann entfernt, gefärbt und über Nacht entfärbt. Das Gel wurde auf einer Leuchttafel betrachtet und die Bandenwanderungsdistanzen gemessen.


    Schau das Video: Genbibliothek erstellen - Gensuche, Identifizierung von Genen cDNA - Gentechnik, 67 (Kann 2022).