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Undichtigkeit des T7-Promotors

Undichtigkeit des T7-Promotors


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Kann ein Gen unter dem T7-Promotor in einem E. coli-Stamm (z. B. DH5 alpha) exprimiert werden, in dessen Genom das T7-Polymerase-Gen nicht kodiert ist? Mit anderen Worten, ist der T7-Promotor undicht?

Genauer gesagt, wie ist es möglich, dass ein regulärer E. coli-Stamm, der nicht für die T7-Polymerase kodiert, auf kan-selektiven Medien wachsen kann, wenn er mit einem Plasmid transformiert wurde, das das kanR-Gen unter dem T7-Promotor trägt?


Offenbar nicht, die Undichtigkeit kann durch eine strenge Regulierung der T7-Polymerase mit einem engen Promotor (in diesem Fall lacUV5) kontrolliert werden.


PET- und pBAD-Expressionssysteme

Dieses System wurde für eine Vielzahl von Expressionsanwendungen entwickelt, einschließlich Hybridpromotoren, multiple Klonierungsstellen für den Einbau verschiedener Fusionspartner und Protease-Spaltungsstellen. Das in Abbildung 1 gezeigte pET-Plasmid ist ein 5,4-kb-Konstrukt mit den folgenden Elementen:

  • lacI kodiert für das lac-Repressorprotein
  • ampR-Codes für Ampicillin-Resistenz
  • ori col E1-Replikationsursprung
  • lacO-Codes für das lac-Operon
  • PT7 kodiert für den T7-Promotor, der nur für die T7-RNA-Polymerase spezifisch ist
  • TT7-Codes für den T7-Terminator
  • MCS-Multiple-Klonierungsstelle, weist die Sequenz auf, die für das interessierende Protein kodiert.

Die Verwendung von PT7, einer 20-Nukleotid-Sequenz, die das E nicht erkennt, ist ein Schlüsselmerkmal. In der prokaryotischen Genomsequenz tritt weder coli-RNA-Polymerase noch T7-RNA-Polymerase auf, daher wird PT7 in Abwesenheit von T7-RNA-Polymerase nicht aktiviert und kein interessierendes Protein wird produziert. Wie unten beschrieben, transkribiert PT7, wenn es als viraler Promotor aktiviert wird, schnell, mit einer maximalen Geschwindigkeit von etwa 230 Nukleotiden pro Sekunde, etwa fünfmal schneller als E. Coli Polymerase-RNA. Die Expression erfordert einen Wirtsstamm unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren lacUV5-Promotors, der durch ein DE3-Phagenfragment lysogenisiert wird, das für die T7-RNA-Polymerase kodiert, und ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 2 gezeigt.

Figur 2

Es gibt eine Kopie des lacI-Gens, die auf dem E. Genom von coli und pET gefunden wird. LacI ist ein schwach exprimiertes Gen und eine 10-fache Verstärkung der Repression wird erreicht, wenn die überexprimierende Promotormutante LacIq verwendet wird.35 Das lac-Repressorprotein LacI reprimiert den lacUV5-Promotor der Wirtszelle und den kodierten T7/lac-Hybridpromotor durch das Expressionsplasmid. Das lacI-Tetramer bindet dann in Abwesenheit eines Induktors an den lac-Operator sowohl auf dem Wirtszellgenom als auch auf dem Plasmid. Dies verhindert, dass die Wirtszelle RNA-Polymerase T7 produziert und verhindert, dass das interessierende Protein durch das Plasmid produziert wird. Es bindet und bewirkt die Freisetzung von tetramerem lacI aus dem lac-Operator sowohl auf dem Genom als auch auf dem Plasmid, wenn der Induktor, typischerweise IPTG, eingeführt wird, der die Expression der T7-RNA-Polymerase in der Wirtszelle auslöst. Auf diese Weise wird die Transkription des Zielgens vom Hybridpromotor T7/lac initiiert.

Eine niedrige Hintergrundexpression von pET-Expressionsplasmiden kann auftreten, dies kann durch Co-Expression mit entweder dem Plasmid pLysS oder pLysE von T7-Lysozym, einem natürlichen T7-RNA-Polymerase-Inhibitor, reduziert werden. Bezüglich des verwandten Tetracyclin-responsiven (Tc)-Promotors beherbergen diese Plasmide das T7-Lysozym-Gen in stiller (pLysS) und exprimierter (pLysE) Orientierung.
Obwohl der lacUV5-Promotor weniger empfindlich auf die Regulation des cAMP-CRP-Komplexes (cAMP-Rezeptorprotein) reagiert, reduziert die Aufnahme von 1% Glucose in das Kulturmedium die cAMP-Spiegel und verbessert die Repression des Promotors signifikant. Die Kontrolle der Zielproteinexpression wird durch Wirtsstämme verbessert, denen das lacY-Gen fehlt, das für Lactosepermease kodiert.

Das pBAD-Expressionssystem

Die Regulation des Arabinose-Operons in E.coli wird durch das Arabinose-Genprodukt38 gesteuert, das die Syntheserate der Proteine ​​AraE, AraF und AraG steuert, die für die Aufnahme von Arabinose benötigt werden, sowie der benötigten Enzyme AraB, AraA und AraD für seinen Katabolismus. Dies impliziert, dass der intrinsische Zustand des ara-spezifischen Promotors ausgeschaltet ist und AraC sie einschaltet, während der Set-Zustand des lac-Operon-Promotors eingeschaltet ist und der lac-Repressor ihn ausschaltet. Darüber hinaus wird pBAD durch Kataboliten reprimiert. Dies impliziert, dass das Züchten der Kultur die Expression in Gegenwart von Glucose weiter reprimieren wird. Während die Expression eines klonierten Plasmidgens, das den araBAD-Promotor enthält, in Kulturen, die in Gegenwart von untersättigenden Arabinosekonzentrationen gezüchtet wurden, über mehrere Größenordnungen moduliert werden kann, werden einzelne Zellen entweder vollständig induziert oder nicht induziert.

Zellen mit dem nativ kontrollierten Arabinosetransportgen (araE) werden entweder induziert oder nicht induziert, deren relativer Anteil durch die Arabinosekonzentration kontrolliert wird. Als Funktion der Induktorkonzentration ist die bevölkerungsgemittelte Variation der pBAD-Expression eher proportional zum Prozentsatz der Zellen, die vollständig induziert (im Vergleich zu nicht induziert) sind, als dem Expressionsniveau in einzelnen Zellen. In E. coli kann dieses All-Ornon-Phänomen, das unerwünschte Auswirkungen auf die heterologe Genexpression haben kann, durch araE-Expression von Arabinose-unabhängigen Promotoren eliminiert werden.

Alle Zellen in der Population weisen in diesen mit Arabinose-Transport konstruierten Zellen ungefähr das gleiche Induktionsniveau auf.40 Daher sind Stämme am besten geeignet, die L-Arabinose transportieren, aber nicht metabolisieren können, wie z. B. ein Stamm von recA, endA.
Die araBAD-Promotor-basierten Expressionsplasmide wurden für eine strenge Hintergrund-Expressionskontrolle und eine präzise Kontrolle der Expressionsniveaus des Zielproteins entwickelt. Dies steht im Gegensatz zu der Alles-Ornothing-Induktion, die die meisten anderen bakteriellen Expressionssysteme erreicht haben. Ein Plasmid pBAD, abgeleitet von pBR322 und in Abbildung 3 gezeigt, ist ein Konstrukt von 4,1 kb, das die folgenden Elemente enthält:

  • araC ORF kodierend für araC Protein
  • ampR-Codes für Ampicillin-Resistenz
  • ori col E1-Replikationsursprung
  • pBAD araBAD-Promotor
  • rrnB-Transkriptionsterminationsregion
  • Die MCS-Mehrfachklonierungsstelle weist die Sequenz auf, die das interessierende Protein kodiert.

Im Arabinose-Operon bindet das AraC-Dimer drei Stellen, I1, I2 und O2. In Abwesenheit von Arabinose, 210 Basenpaare stromaufwärts von pBAD, kontaktiert das AraC-Dimer die O2-Stelle, die sich innerhalb des araC-Gens befindet. Wie gezeigt, kontaktiert die andere Hälfte des araC-Dimers die I1-Stelle in der Promotorregion, die die DNA-Schleife bildet. Daher wird die Transkription von pBAD und dem Promotor von araC (pC) durch die Schleife gehemmt. Das araC-Dimer ändert seine Konformation bei der Bindung von Arabinose, so dass es an die pBAD I2-Stelle statt an die O2-Stelle bindet. Dies entfernt die Schleifenstruktur und die Transkription durch RNA-Polymerase-Starts. Das cAMP-Rezeptorprotein (CRP) stimuliert die Bindung des araC-Dimers an die I1- und I2-Stellen, was bedeutet, dass die Glucose-vermittelte Katabolitrepression die Hintergrundexpression von araBAD reduzieren kann.


RNA-Polymerasen

(a) Chromosomale Expressionssysteme.

Ein Phagen-RNA-Pol-Gen kann stabil in die E coli Chromosom über ein λ-Lysogen und exprimiert unter der IPTG-induzierbaren Kontrolle des lacUV5 Promoter. Eine rechtzeitige Expression des chromosomalen T7-RNA-Pol-Gens würde dann die Expression des T7-Promotor-gebundenen Fremdgens, das in einen separaten Vektor kloniert wurde, antreiben.

Wenn eukaryontische Zellen als Wirte verwendet werden, kann eine ähnliche chromosomale Expression des Pol-Gens des Phagen durch Transformation der Zellen mit geeigneter DNA erzeugt werden. Alternativ kann die RNA-Polymerase-Expression im Zytoplasma auf den Zellkern gerichtet werden, um die Expression eines Chromosom-lokalisierten Fremdgens zu steuern. In solchen reversen chromosomalen Expressionssystemen wird das Phagen-RNA Pol-Gen, das auf einem Plasmidvektor (54) oder Vacciniavirusvektor (55) getragen wird, in eukaryontischen Zellen (z. B. Maus-L- und NIH-3T3-Zellen) vom Maus-Metallothionein-Promotor oder Vaccinia-Promotor exprimiert , bzw. Die RNA Pol wird dann durch das Polymerase-gebundene nukleäre Lokalisierungssignal (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val) des SV40-Large-T-Antigens zum Kern von Hefe- oder Säugerzellen transportiert (50, 54, 56). . Unmodifizierter T7-RNA-Pol ist hauptsächlich zytoplasmatisch und ist nicht in der Lage, ein nachweisbares Niveau der T7-Promotor-gebundenen Genexpression im Zellkern zu steuern. Wenn die Polymerase jedoch auf ein Niveau von 0,5–1,5% des gesamten Zellproteins überexprimiert wird, kann etwas T7-RNA-Pol passiv in den Zellkern gelangen. Es wurde gezeigt, dass die Expression solcher T7-Konstrukte mindestens sechsmal effizienter ist als eine analoge Expression, die vom RSV-LTR-Promotor ausgeht, der als einer der stärksten in Säugerzellen bekannt gilt.

Beachten Sie, dass eine Reihe von Säugerzelllinien ein beträchtliches Expressionsniveau des T7-Promotors aufweisen, selbst in Abwesenheit von T7-RNA-Pol. Diese Hintergrundexpression, die tatsächlich die von T7 RNA Pol durchgeführte Transkription stört, ist auf die Bindung einiger Kernfaktoren an den T7-Promotor zurückzuführen, wodurch die Transkription durch RNA Pol II ermöglicht wird. Die Verwendung mutierter T7-Promotoren beispielsweise mit gleichzeitigen Veränderungen bei -13 (A bis T) und +1 (G bis C) verringert die Bindung des Kernfaktors erheblich und erhöht folglich die Spezifität der T7-RNA-Pol-abhängigen Transkription in Säugerzellen bis zu 10-fach (117).


Undichtigkeit des T7-Promotors - Biologie

F. William Studier, emeritierter Senior Scientist am Brookhaven National Laboratory, im Jahr 2004. In den 1980er Jahren entschlüsselten Studier und ein Team von Mitarbeitern die wichtigsten Details des T7-Bakteriophagen und verwandelten das Gelernte in ein System zur Produktion großer Mengen gewünschter Proteine. Die Produktion der heutigen mRNA-COVID-19-Impfstoffe beruht auf diesen grundlegenden Entdeckungen.

Sie haben wahrscheinlich gehört, dass die ersten beiden Impfstoffe, die in den USA zur Bekämpfung von COVID-19 zugelassen wurden, einen relativ neuen Ansatz verwenden: Injektionen einfacher Pakete mit mRNA, einem genetischen Material, das unsere Zellen anweist, Coronavirus-Spike-Proteine ​​​​zu produzieren. Aber die Technologie zur Generierung ausreichender Mengen dieser mRNA-Pakete stammt aus den 1980er Jahren, als F. William Studier, damals leitender Biophysiker am Brookhaven National Laboratory des US-Energieministeriums, einen Weg entwickelte, die molekulare Maschinerie eines ganz anderen Virus zu nutzen .

&bdquoDie Tatsache, dass wissenschaftliche Erkenntnisse und Werkzeuge, die vor Jahrzehnten entwickelt wurden, heute verwendet werden, um lebensrettende mRNA-Impfstoffe gegen COVID-19 herzustellen, ist ein großartiges Beispiel dafür, wie die langfristigen Investitionen des Energieministeriums in die Grundlagenforschung in unseren National Laboratories das Leben der Amerikaner heute verbessern können und in die Zukunft&rdquo, sagte Dr. Steve Binkley, amtierender Direktor des DOE&rsquos Office of Science.

In den 1980er Jahren schlossen Studier, der verstorbene John Dunn, und ihre Gruppe in der Biologieabteilung des Brookhaven Lab die Sequenzierung und Annotation des Genoms des T7-Bakteriophagen ab. T7 ist ein Virus, das infiziert E coli Bakterien und beschlagnahmt diese Zellen, um Kopien des Virus zu erstellen. Die vollständige Genomsequenz half den Wissenschaftlern zu verstehen, wie T7-Gene und andere Elemente zusammenarbeiten, um viele Kopien des Virus zu reproduzieren.

Kurz darauf fanden Studier und sein Team einen Weg, die produktiven Kopierfunktionen von T7 auf andere Dinge als mehr T7 zu lenken. Sie klonten die T7-RNA-Polymerase, das Enzym, das DNA-Gene in Boten-RNA (mRNA) umschreibt, die Zellen anweist, welche Aminosäuren sie verbinden sollen, um ein bestimmtes Protein aufzubauen. Das Team verwendete dann diese T7-RNA-Polymerase zusammen mit einem leistungsstarken T7-Promotor (einem genetischen Element, das als „Start&rdquo-Signal für die Gentranskription dient), um große Mengen an RNA aus fast jedem Gen herzustellen. Diese RNAs könnten direkt verwendet werden, beispielsweise in mRNA-basierten Impfstoffen, oder an Ribosomen (Zellen und Proteinfabriken) abgegeben werden, um in Proteine ​​übersetzt zu werden, wie im T7-Expressionssystem.

&bdquoWissenschaftler auf der ganzen Welt haben Bill&rsquos &lsquoT7-Expressionssystem&rsquo verwendet, um große Mengen interessanter Proteine ​​oder RNA in den letzten vier Jahrzehnten herzustellen&rdquo, sagte Venki Ramakrishnan, ein mit dem Nobelpreis ausgezeichneter Strukturbiologe vom Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, in Cambridge, Großbritannien. &bdquoDie neuen mRNA-COVID-19-Impfstoffe verwenden genau dieses System&rdquo, sagte er.

In den von Pfizer/BioNTech und Moderna betriebenen Produktionsstätten produzieren T7-abgeleitete Promotoren und Enzyme Kilogramm Spike-Protein-mRNA auf einmal&8212überlassen unsere eigenen Zellen, um den Teil der Proteinherstellung zu übernehmen, nachdem eine Dosis von Anweisungen in unsere Arme injiziert wurde .

&bdquoBills grundlegende Arbeit machte die lebensrettenden mRNA-Impfstoffe möglich&rdquo Ramakrishnan.

Zurück zum Wesentlichen

Diese vereinfachte Grafik vergleicht die T7-Bakteriophageninfektion mit dem T7-Expressionssystem, das in den 1980er Jahren im Brookhaven Lab entwickelt wurde, und der Verwendung genetischer T7-Elemente zur Herstellung heutiger mRNA-COVID-19-Impfstoffe. Alle drei verwenden den T7-Promotor als Signal, um die Gentranskription zu starten, und die T7-abgeleitete RNA-Polymerase, um den DNA-Code in mRNA-Anweisungen zu transkribieren, die Ribosomen „sagen“, wie sie Proteine ​​aufbauen. Bei einer T7-Infektion handelt es sich bei dem Produkt um neue Viren (Proteinhüllen, die Kopien von T7-DNA und anderen viralen Proteinen einkapseln). Das Expressionssystem produziert ein bestimmtes gewünschtes Protein. Für den Impfstoff werden uns die mRNAs in die Arme injiziert, wo unsere Ribosomen verwenden sie, um COVID-19-Spike-Proteine ​​herzustellen. Diese virusfreien Spitzen trainieren unser Immunsystem, um bereit zu sein, wenn wir das echte Virus bekämpfen müssen.

William Studier hatte keine Visionen von der Herstellung von Impfstoffen, als er als Doktorand der Biophysik am California Institute of Technology seine Grundlagenforschung zum T7-Virus begann und diese Forschung nach seinem Eintritt in das Brookhaven Lab fortsetzte.

&bdquoT7 war kein gut untersuchter Bakteriophage, als ich 1964 nach Brookhaven kam&rdquo, sagte er. &bdquoI benutzte es, um die Eigenschaften der DNA zu untersuchen und beschloss, auch ihre Molekulargenetik und Physiologie zu studieren. Mein Ziel war natürlich, so viel wie möglich über T7 und seine Funktionsweise zu verstehen.&rdquo

Das Klonen des Gens für die T7-RNA-Polymerase im Jahr 1983 war besonders schwierig, bemerkte Studier.

&bdquoAndere hatten es versucht und sind gescheitert. Unternehmen hatten mich gefragt, ob wir es hätten“, sagte er. &bdquoWir hatten damals die DNA-Sequenz und ich dachte, ich hätte verstanden, warum das Klonen fehlgeschlagen war und wie man das Problem beheben kann.“

Studier arbeitete mit Parichehre Davanloo, damals Postdoktorand, und Alan Rosenberg, Senior Lab Member, um die Herausforderung anzugehen. John Dunn reinigte die T7-RNA-Polymerase und zeigte, dass sie große Mengen an RNA produziert. Barbara Moffatt, damals Doktorandin, arbeitete mit Studier zusammen, um diese Entdeckungen in das T7-Expressionssystem umzusetzen.

&bdquoDer Patentanwalt von Brookhaven Lab wusste, was wir taten, und wir reichten das meiner Meinung nach erste Patent in Brookhaven nach dem Bayh-Dole-Gesetz ein&ldquo„ein Gesetz vom Kongress im Jahr 1980, das Institutionen und Erteilungsempfängern erlaubte, Patente und Lizenzrechte an Erfindungen zu erteilen, aus staatlich finanzierter Forschung, erklärte Studier.

Der Rest ist Geschichte. Das T7-Expressionssystem wurde zur erfolgreichsten Technologie von Brookhaven Lab, mit Forschungslaboren auf der ganzen Welt und Hunderten von Unternehmen, die die Technologie zur Herstellung von Produkten lizenzieren. Und obwohl die Patente inzwischen abgelaufen sind, ist T7 immer noch das System der Wahl für Biochemiker überall.

„T7-RNA-Polymerase kann große Mengen an RNA aus jeder DNA synthetisieren, die einem starken T7-Promotor benachbart ist. Ich weiß nicht, ob es etwas Vergleichbares gibt«, sagte Studier.

John Shanklin, Vorsitzender der Biologieabteilung des Brookhaven Lab, stimmt dem zu. &bdquoDie T7-Polymerase und der Promotor sind so effizient, dass sie es ermöglichen, genügend mRNA für Millionen von Impfstoffdosen gleichzeitig zu produzieren. Bills Entdeckungen spielten eine große Rolle dabei, die Produktion schnell zu steigern, um Menschen auf der ganzen Welt vor COVID-19 zu schützen.&rdquo

Zwei dieser kürzlich geimpften Personen sind Bill Studier und seine Frau Sue.

&bdquoIch hatte mich beiläufig gefragt, ob die T7-RNA-Polymerase an der Herstellung der RNA-Impfstoffe beteiligt sein könnte&rdquo überlegte Studier, jetzt emeritierter leitender Biophysiker. &bdquoGrundlagenforschung ist fast immer nützlich, und ich freue mich, dass meine Arbeit dazu beigetragen hat, wirksame Impfstoffe gegen diese Pandemie zu erhalten.“

Diashow mit historischen Bildern von William Studier, aufgenommen 1970, 1972 (mit Polly Winston), 1978 und 1984 (mit John Dunn). Bewegen Sie den Mauszeiger über das Bild, um die Steuerelemente für die Diashow anzuzeigen.

F. William Studier hat einen B.S. in Biophysik in Yale im Jahr 1958, gefolgt von einem Ph.D. 1963 vom California Institute of Technology. Er arbeitete als Postdoktorand am Department of Biochemistry der Stanford University School of Medicine und wechselte dann 1964 als Biophysiker in das Brookhaven Lab&rsquos Biology Department. Im Laufe der Jahre stieg Studier in den Reihen der Abteilung auf, erhielt 1971 eine Anstellung und wurde 1974 zum leitenden Biophysiker ernannt. Von 1990 bis 1999 war er Vorsitzender der Abteilung für Biologie und kehrte dann in die Forschung zurück. Er war außerdem außerordentlicher Professor für Biochemie an der Stony Brook University. Seine Leistungen wurden 1990 durch die Wahl in die American Academy of Arts and Sciences, 1992 in die National Academy of Sciences und 2007 als Fellow der American Association for the Advancement of Science gewürdigt. 2015 wurde er zum Senior Scientist Emeritus ernannt am Brookhaven Lab und wurde 2018 zum Fellow der National Academy of Inventors gewählt. Er hält 15 Patente, von denen 9 lizenziert und kommerzialisiert wurden, einschließlich derjenigen auf dem T7-System.

Die Forschung der Studierenden am Brookhaven Lab wurde vom DOE Office of Science (BER) unterstützt.


Die Wissenschaft hinter dem Schuss: Im Brookhaven Lab entwickelte Biotech-Tools, die grundlegend für die Herstellung von COVID-19-Impfstoffen sind

25. Mai 2021 13:16 ET | Quelle: Brookhaven National Laboratory Brookhaven National Laboratory

Upton, New York, VEREINIGTE STAATEN

Upton, NY, 25. Mai 2021 (GLOBE NEWSWIRE) -- Sie haben wahrscheinlich gehört, dass die ersten beiden Impfstoffe, die in den Vereinigten Staaten zur Bekämpfung von COVID-19 zugelassen sind, einen relativ neuen Ansatz verwenden – Injektionen einfacher Pakete, die mRNA, ein genetisches Material, enthalten das unsere Zellen anweist, Coronavirus-Spike-Proteine ​​​​zu produzieren. Die Technologie zur Generierung ausreichender Mengen dieser mRNA-Pakete stammt jedoch aus den 1980er Jahren, als F. William Studier, damals leitender Biophysiker am Brookhaven National Laboratory des US-Energieministeriums, einen Weg entwickelte, die molekulare Maschinerie eines ganz anderen Virus zu nutzen .

„Die Tatsache, dass wissenschaftliche Erkenntnisse und Werkzeuge, die vor Jahrzehnten entwickelt wurden, jetzt verwendet werden, um die heutigen lebensrettenden mRNA-Impfstoffe gegen COVID-19 herzustellen, ist ein großartiges Beispiel dafür, wie die langfristigen Investitionen des Energieministeriums in die Grundlagenforschung in unseren National Laboratories das Leben der Amerikaner verbessern können.“ heute und in der Zukunft“, sagte Dr. Steve Binkley, amtierender Direktor des Office of Science des DOE.

In den 1980er Jahren schlossen Studier, der verstorbene John Dunn, und ihre Gruppe in der Biologieabteilung des Brookhaven Lab die Sequenzierung und Annotation des Genoms des T7-Bakteriophagen ab. T7 ist ein Virus, das infiziert E coli Bakterien und kommandiert diese Zellen, um Kopien des Virus zu machen. Die vollständige Genomsequenz half den Wissenschaftlern zu verstehen, wie T7-Gene und andere Elemente zusammenarbeiten, um viele Kopien des Virus zu reproduzieren.

Kurz darauf fanden Studier und sein Team einen Weg, die produktiven Kopierfunktionen von T7 auf andere Dinge als mehr T7s auszurichten. Sie klonierten die T7-RNA-Polymerase – das Enzym, das DNA-Gene in Boten-RNA (mRNA) umwandelt, die Zellen anweist, welche Aminosäuren sie verbinden sollen, um ein bestimmtes Protein aufzubauen. Das Team verwendete dann diese T7-RNA-Polymerase zusammen mit einem leistungsstarken T7-Promotor (einem genetischen Element, das als „Start“-Signal für die Gentranskription dient), um große Mengen an RNA aus fast jedem Gen herzustellen. Diese RNAs könnten direkt verwendet werden, beispielsweise in mRNA-basierten Impfstoffen, oder an Ribosomen (Proteinfabriken der Zellen) abgegeben werden, um in Proteine ​​übersetzt zu werden, wie im T7-Expressionssystem.

"Wissenschaftler auf der ganzen Welt haben Bills 'T7-Expressionssystem' verwendet, um in den letzten vier Jahrzehnten große Mengen interessanter Proteine ​​oder RNA herzustellen", sagte Venki Ramakrishnan, ein mit dem Nobelpreis ausgezeichneter Strukturbiologe vom Medical Research Council Laboratory of Molecular Biologie in Cambridge, Großbritannien. „Die neuen mRNA-COVID-19-Impfstoffe verwenden genau dieses System“, sagte er.

In den von Pfizer/BioNTech und Moderna betriebenen Produktionsstätten produzieren T7-abgeleitete Promotoren und Enzyme Kilogramm Spike-Protein-mRNA auf einmal – und überlassen unseren eigenen Zellen die Proteinherstellung, nachdem eine Dosis von Anweisungen in unsere Arme injiziert wurde .

„Bills grundlegende Arbeit hat die lebensrettenden mRNA-Impfstoffe ermöglicht“, sagte Ramakrishnan.

William Studier hatte keine Visionen von der Herstellung von Impfstoffen, als er als Doktorand in Biophysik am California Institute of Technology seine Grundlagenforschung zum T7-Virus begann und diese Forschung nach seinem Eintritt in das Brookhaven Lab fortsetzte.

„T7 war kein gut untersuchter Bakteriophage, als ich 1964 nach Brookhaven kam“, sagte er. „Ich benutzte es, um die Eigenschaften der DNA zu untersuchen und beschloss, auch ihre Molekulargenetik und Physiologie zu studieren. Mein Ziel war es natürlich, so viel wie möglich über T7 und seine Funktionsweise zu verstehen.“

Das Klonen des Gens für die T7-RNA-Polymerase im Jahr 1983 war besonders schwierig, bemerkte Studier.

„Andere hatten es versucht und sind gescheitert. Unternehmen hatten mich gefragt, ob wir es hätten“, sagte er. "Wir hatten damals die DNA-Sequenz und ich dachte, ich hätte verstanden, warum das Klonen fehlgeschlagen war und wie man das Problem beheben kann."

Studier arbeitete mit Parichehre Davanloo, damals Postdoktorand, und Alan Rosenberg, Senior Lab Member, um die Herausforderung anzugehen. John Dunn reinigte die T7-RNA-Polymerase und zeigte, dass sie große Mengen an RNA produziert. Barbara Moffatt, damals Doktorandin, arbeitete mit Studier zusammen, um diese Entdeckungen in das T7-Expressionssystem umzusetzen.

„Der Patentanwalt von Brookhaven Lab wusste, was wir taten, und wir reichten meines Erachtens das erste Patent in Brookhaven nach dem Bayh-Dole Act ein“ – ein 1980 vom Kongress verabschiedetes Gesetz, das Institutionen und Erteilungsempfängern Patent- und Lizenzrechte auf Erfindungen aus staatlich finanzierter Forschung, erklärte Studier.

Der Rest ist Geschichte. Das T7-Expressionssystem wurde zur erfolgreichsten Technologie von Brookhaven Lab, mit Forschungslabors auf der ganzen Welt und Hunderten von Unternehmen, die die Technologie zur Herstellung von Produkten lizenzieren. Und obwohl die Patente inzwischen abgelaufen sind, ist T7 immer noch das System der Wahl für Biochemiker überall.

„T7-RNA-Polymerase kann große Mengen an RNA aus jeder DNA synthetisieren, die einem starken T7-Promotor benachbart ist. Ich weiß nicht, ob es etwas Vergleichbares gibt“, sagte Studier.

John Shanklin, Vorsitzender der Biologieabteilung des Brookhaven Lab, stimmt dem zu. „Die T7-Polymerase und der Promotor sind so effizient, dass sie es ermöglichen, genügend mRNA für Millionen von Impfstoffdosen gleichzeitig zu produzieren. Bills Entdeckungen haben eine große Rolle dabei gespielt, die Produktion schnell zu steigern, um Menschen auf der ganzen Welt vor COVID-19 zu schützen.“

Zwei dieser kürzlich geimpften Personen sind Bill Studier und seine Frau Sue.

„Ich hatte mich beiläufig gefragt, ob die T7-RNA-Polymerase an der Herstellung der RNA-Impfstoffe beteiligt sein könnte“, überlegte Studier, jetzt emeritierter leitender Biophysiker. „Grundlagenforschung ist fast immer nützlich, und ich freue mich, dass meine Arbeit dazu beigetragen hat, wirksame Impfstoffe gegen diese Pandemie zu erhalten.“

F. William Studier hat einen B.S. in Biophysik in Yale im Jahr 1958, gefolgt von einem Ph.D. 1963 vom California Institute of Technology. Er arbeitete als Postdoktorand am Department of Biochemistry der Stanford University School of Medicine und wechselte 1964 als Biophysiker zum Brookhaven Lab. Im Laufe der Jahre stieg Studier in den Reihen der Abteilung auf, erhielt 1971 eine Anstellung und wurde 1974 zum leitenden Biophysiker. Er war von 1990 bis 1999 Vorsitzender der Abteilung für Biologie und kehrte dann in die Forschung zurück. Er war außerdem außerordentlicher Professor für Biochemie an der Stony Brook University. Seine Leistungen wurden 1990 durch die Wahl in die American Academy of Arts and Sciences, 1992 in die National Academy of Sciences und 2007 als Fellow der American Association for the Advancement of Science gewürdigt. 2015 wurde er zum Senior Scientist Emeritus ernannt am Brookhaven Lab und wurde 2018 zum Fellow der National Academy of Inventors gewählt. Er hält 15 Patente, von denen 9 lizenziert und kommerzialisiert wurden, einschließlich derjenigen auf dem T7-System.

Die Forschung der Studienteilnehmer am Brookhaven Lab wurde vom DOE Office of Science (BER) unterstützt.


Biochemie und Molekularbiologie

4.14.3.3.1.2 Bombyx mori zytoplasmatischer Aktin-Promotor

Eine leistungsfähige Lepidoptera-Expressionskassette, pIE1/153A, wurde kürzlich im Labor von Dr. Kostas Iatrou an der Universität von Calgary entwickelt. Die Kassette verwendet die Seidenmotte ( B. mori) zytoplasmatischer Aktin-Genpromotor (Mounier und Prudhomme, 1986 Johnson et al., 1992), einer der stärkeren konstitutiven zellulären Promotoren, der auch in einer Vielzahl von transfizierten Lepidoptera-Zelllinien aktiv ist. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Transkription von diesem zellulären Promotor durch das unmittelbare frühe Genprodukt (dh-1) von BmNPV, IE-1, einem Transkriptionsfaktor, der die in vitro Transkriptionsrate vom Aktinpromotor in trans um das bis zu 100-fache ( Lu et al., 1996). Eine Stimulierung des Aktinpromotors um bis zu zwei Größenordnungen wurde auch durch die Verknüpfung in . erreicht cis die homologe Repeat 3 (HR3)-Region von BmNPV in verschiedenen Orientierungen relativ zum Aktin-Promotor ( Lu et al., 1997). Verknüpfung der dh-1 Gen und das HR3-Enhancer-Element mit dem Actin-Gen-Promotor in der pIE1/153A-Expressionskassette führten in transienten Expressionsassays für zwei Reporterproteine ​​(Lu et al., 1997). Stabile Zelllinien wurden durch Cotransfizieren der Zellen mit der Expressionskassette und einem zweiten Plasmid erzeugt, das eine Resistenz gegen Hygromycin B, Puromycin oder G418 verleiht. Die berichteten Expressionsspiegel von sekretierten Proteinen aus stabilen Zelllinien, die mit diesem System transformiert wurden, überstiegen bei weitem die mit dem Baculovirus-Expressionssystem erhaltenen (Farrell® et al., 1998 Farrell et al., 1999). Darüber hinaus funktioniert das Expressionsplasmid in einer Vielzahl von Lepidoptera-Zelllinien, einschließlich solcher, die von B. mori, T. ni, Plodia interpuntella, L. dispar, Mamestra Brassicae, C. fumiferana, und S. frugiperda ( Keith et al., 1999). Die Expressionskassette ist auch für hochskalierte transiente Expressionsprotokolle geeignet, die innerhalb von 5 Tagen nach der Transfektion Dutzende Milligramm rekombinantes Protein pro Liter liefern können (Farrel und Iatrou, 2004) (Abbildung 5), wodurch der zeitaufwändige und arbeitsintensive Prozess vermieden wird stabile Antibiotika-Selektion und das Klonen von High-Expressoren. Derivate der pIE1/153A-Expressionskassette sind von Dr. Iatrou erhältlich.

Abbildung 5. Transiente Expression und Affinitätsreinigung von Histidin-markierter humaner sezernierter alkalischer Phosphatase (SEAP freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Eric Carpentier und Amine Kamen, Biotechnology Research Institute, Montreal, Kanada) aus einer Lipofectin-vermittelten Transfektion von High Five™ Zellen in Suspensionskultur unter Verwendung des pIE1/ 153A Expressionskassette. Im Vergleich zu einer Reihe von Rinderserumalbumin-Massenstandards auf dem mit Coomassie-Blau gefärbten Gel waren 5 Tage nach Transfektion und Produktion in proteinfreiem Medium ESF-921 ca „+“ im Vergleich zu der mit „–“ gekennzeichneten Kontrolle). Zwei Milligramm SEAP wurden aus einer Elutionsfraktion (E) nach Ni-Ionen-Affinitätsreinigung aus 50 ml Kulturüberstand gewonnen.


Undichtigkeit des T7-Promotors - Biologie

Bild: Illustrierte Plasmidkarte im PNG-Format

GenBank-Datei: Plasmidsequenz und Anmerkungen. Verwenden Sie einen Texteditor oder eine Plasmid-Mapping-Software, um die Sequenz anzuzeigen.

SnapGene-Datei: Plasmidsequenz und SnapGene-verbesserte Annotationen. Verwenden Sie mit der SnapGene-Software oder dem kostenlosen Viewer, um zusätzliche Daten zu visualisieren und andere Sequenzen auszurichten.

Vollständige Sequenzkarte des Addgens für pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

Kartenbild für pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

Karte vom Einleger hochgeladen.

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Expression des Promotors T7 - (19.06.2011 )

Ich habe ein Taschentuch, das ich mit allen besprechen kann, und freue mich darauf, die Hilfe von Ihnen allen zu teilen. Derzeit führe ich eine Studie über den Design-Expressionsvektor der Gene durch, die das Enzym Lycopin-Biosynthese in E. coli kodieren. Hier verwende ich als Vektorexpression pRSET-A und alpha-Stämme DH5 alpha als Wirtszelle. Das pRSET-A, das Gen, wird an das vom T7-Promotor gesteuerte System angehängt, dieser Promotor erfordert die Transkription des Enzyms T7-RNA-Polymerase, um stattfinden zu können. Das im DH5-Alpha-Stamm ohne dieses Enzym. Wir erhielten jedoch die Expression der Lycopin-Kolonien. Warum passiert das?

Haben Sie ein "Gewebe"? hahaha. sorry nur scherz

Haben Sie zuerst bestätigt, dass DH5 alpha die Gene fehlen, die für das Enzym Lycopin-Biosynthese kodieren? Ich vermute, dass DH5 alpha dieses Gen enthält. Wenn Sie also den Ausdruck überprüfen, erhalten Sie natürlich das Protein. Es ist sehr wichtig, die Kompatibilität zwischen dem Wirtsplasmid zu gewährleisten. Wenn Sie ein Gen in E.coli exprimieren möchten, stellen Sie sicher, dass dieses Gen in diesem Wirt vorhanden ist. Wenn Sie nicht sicher sind, ob DH5alpha dieses Gen enthält, versuchen Sie zuerst, die Zelle zu kultivieren

1.Überprüfen Sie die Expression von DH5alpha ohne Plasmid.
2.Überprüfen Sie die Expression von DH5 alpha mit pRSET-A-Plasmid (kein IPTG hinzugefügt)
3.Machen Sie eine Expression von DH5 alpha mit dem PRSER-A-Plasmid und fügen Sie etwas IPTG-Konz

Ok, was wir uns davon erwarten:
Wenn Sie die Bande für alle Spuren erhalten, bedeutet dies, dass derselbe Expressionslevel .. der Wildtyp von DH5alpha enthält das Gen, das das Enzym kodiert,
Wenn Sie die (3.) dickere Expression erhalten, bedeutet dies, dass der Promotor T7 wirklich funktioniert, da wir alle wissen, dass T7 durch die Anwesenheit von IPTG induziert werden kann. Wenn Sie sehen, dass es keinen Unterschied zwischen (2) und (3) gibt, bedeutet dies, dass die T7-Polymerase hier nicht das Problem ist (nicht einmal ein Taschentuch. lol nur Scherz). es kam vom Gastgeber. der Wirt, der in der Lage ist, das Gen zu exprimieren (weil das Gen im Genom mit dem ursprünglichen Promotor vorhanden ist).

Versuchen Sie in diesem Fall, einen anderen E.coli-Wirt zu verwenden, der dieses Gen verliert. Habe ich es dir klar gesagt? Der richtige Gastgeber zeigt Ihnen die Unterschiede vor und nach der Induktion mit IPTG

Das ist mir durch den Kopf gegangen

Ich glaube nicht, dass E. coli Lycopin nativ herstellt, aber ich könnte mich irren. Wahrscheinlicher ist, dass die Transkription von einem Promoter erfolgt, den Sie nicht identifiziert haben. This could be a cryptic promoter in your operon, or read-through transcription from a promoter on the plasmid. You might try putting your operon in the reverse orientation in your plasmid. Or changing plasmids to one that reduces this read-through (Lucigen makes some, I believe).

I don't understand. how can putting the operon in reverse orientation in the plasmid can help?

p/s: hmn. lucigen. lately I heard people talked about it quite frequently. a new company?

If you have transcription activity arising from the plasmid, then the direction of the insert can determine if the transcript is in the sense or anti-sense direction. Lucigen is a U. Wisconsin Madison spinout that has been around for about 5-7 years, I think. They make a series of interesting cloning vectors.


Optimization of a T7-RNA polymerase system in Synechococcus sp. PCC 7002 mirrors the protein overproduction phenotype from E coli BL21(DE3)

With the goal of expanding the diversity of tools available for controlling gene expression in cyanobacteria, the T7-RNA polymerase gene expression system from E coli BL21(DE3) was adapted and systematically engineered for robust function Synechokokken sp. PCC 7002, a fast-growing saltwater strain. Expression of T7-RNA polymerase was controlled via LacI regulation, while functionality was optimized by both further tuning its expression level along with optimizing the translation initiation region of the expressed gene, in this case an enhanced YFP reporter. Under high CO2 conditions, the resulting system displayed a 60-fold dynamic range in expression levels. Furthermore, when maximally induced, T7-RNA polymerase-dependent protein production constituted up to two-thirds of total cellular protein content in Synechokokken sp. PCC 7002. Ultimately, however, this came at the cost of 40% reductions in both biomass and pigmentation levels. Taken together, the developed T7-RNA polymerase gene expression system is effective for controlling and achieving high-level expression of heterologous genes in Synechokokken sp. PCC 7002, making it a valuable tool for cyanobacterial research.

Wichtige Punkte

• Promoter driving T7-RNA polymerase was optimized.

• Up to 60-fold dynamic range in expression, depending on CO 2 Bedingungen.


DISKUSSION

The conditional lethal system presented here consists of the streptavidin gene as a key suicide element. The biotin-binding ability of streptavidin in P. putida is notable because it requires not only proper peptide folding but also formation of the correct tetrameric structure. So far, there are only several genes that have been proven to be bactericidal upon expression in the members of genus Pseudomonas. These are genes encoding cell membrane destabilizing peptides Hok (E coli plasmid R1) (22) and Gef (E coli) (23), lysis genes of bacteriophages λ and φX174 (24), and the colE3 gene encoding an RNase (E coli) (25). It is also worth mentioning that the T7 lysozyme maintains its T7 RNA polymerase inhibition ability in a heterologous P. putida System.

The rate of inactivation, a basic determinant of the efficiency of suicide designs, in our stv-based system is 10 −7 –10 −8 per cell per generation. This value is lower than those already reported for constructs based on single toxic functions (10 −2 –10 −6 ), even in E coli, which is easier to contain (9, 23, 26, 27). It apparently reflects the very low basal level of streptavidin in cells. Despite the fact that the coupled T7 transcription/LacI-Olac system is less leaky than the lac system alone (Table 1), an additional explanation of the better protection of cells against uninduced expression of the stv gene is synthesis of the antisense RNA originating from the Pm Promoter. The lack of such protection, especially without a transcription terminator (e.g., LacI-Olac complex) upstream of φ10 as in pVLTΔ-S02, resulted in a remarkably higher mutation frequency of 10 −4 –10 −5 per cell per generation. The LacI-Olac complex formed upstream of the φ10 in pCC-S04 apparently interferes also with binding of bacteriophage RNA polymerase to the φ10 promoter (slower induction of the stv gene expression upon removal of 3MB) and further decreases the frequency of appearance of killing-resistant clones by reducing uninduced transcription of the stv Gen. Preliminary data on the killing of E coli by IPTG-induced expression of the stv gene suggest that, as expected, this system should be effective also in enteric bacteria.

A temperature shift from 30°C to 20°C alters the kinetics of the culture decay. This effect was more pronounced in a bacterial population depleted of 3MB in the absence of IPTG, indicating a contribution of both weaker interaction of T7 RNA polymerase with φ10 and the longer lifetime of the LacI repressor and/or its mRNA within a cell. Continuing decline of the culture after the addition of IPTG indicates a lower rate of mutational inactivation of the construct at 20°C than at 30°C.

The suicide design was tested under rich nutrient conditions—i.e., in LB medium containing some biotin. The growth conditions were favorable for cell survival, since killing occurs by depletion of biotin. In fact, slightly higher levels of IPTG-induced cell death were observed in minimal M9 medium (not shown). Under mostly starving conditions in, for instance, soil or seawater, this system may perform even more effectively. EIN SmaI fragment of pCC-S05 containing xylS2, lacI, und stv genes (Fig. 2B) has been already stably integrated into P. putida chromosome via mini-Tn5-mediated transposition (data not shown). Other known killing genes will be placed under control of φ10 promoter and integrated into the chromosome of P. putida <hsdR1 stv lacI xylS2 Kan r > to create multiple back up systems following incorporation of the T7 RNA polymerase-lysozyme regulatory module. Alternatively, stability of pRO-ilp upon induction of suicide in the absence of selection for plasmid maintenance can be achieved, for instance, by inserting into it the parB (hok/sok) locus of R1.

To summarize, additional regulatory circuits arranged to reduce the basal level of the expression of killing gene can remarkably increase the effectiveness of cell suicide machinery. Because of the general demand of biotin as a carboxyl carrier in the living world, the stv gene can serve as a universal cassette for programmed cell death. Die stv-based system in combination with, for example, biotinylated solid supports and biotinylated fluorescent probes could also allow very sensitive monitoring of the presence of recombinant microorganisms.


Schau das Video: Transcription in Bacteria. Promoter and promoter complex (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Rishim

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  2. Hyperion

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    Ich entschuldige mich für die Einmischung ... Ich bin kürzlich hier. Aber dieses Thema ist mir sehr nahe. Schreiben Sie an PM.

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