Information

Warum machen wir verschachtelte PCR?

Warum machen wir verschachtelte PCR?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wikipedia:

Verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion (Nested PCR) ist eine Modifikation der Polymerase-Kettenreaktion, die die unspezifische Bindung in Produkten aufgrund der Amplifikation unerwarteter Primer-Bindungsstellen reduzieren soll.

Ich verstehe, dass es zwei Schritte gibt und einer dieser Schritte einen unspezifischen Primer gefolgt von einem spezifischen Primer beinhaltet…

Aber das scheint keinen Sinn zu haben. Was ist der Zweck, eine unspezifische PCR durchzuführen, nur um sie anschließend mit einem bestimmten Primer zu treffen?

Was gewinnen wir, wenn wir eine verschachtelte PCR durchführen?

Praxisbeispiel: Wir planen die Sequenzierung des menschlichen Hautmikrobioms. Würden sich die Verhältnisse der verschiedenen Bakterienarten unterscheiden, wenn wir die Nested-PCR-Produkte zur Sequenzierung verwenden würden, im Vergleich zur Standard-PCR?


In dem Artikel von K. Lily Therese, U. Jayanthi & H. N. Madhavan war die traditionelle PCR nicht empfindlich genug, um eine genaue Ablesung dessen zu ermöglichen, was sie zu untersuchen versuchten. Durch die Verwendung von nPCR waren sie in der Lage, um das Gen herum zu amplifizieren, an dem sie interessiert waren, und dann zu amplifizieren nur das Gen, an dem sie interessiert waren, für eine genauere und empfindlichere Studie. Die sukzessive PCR ermöglichte es ihnen, ihr spezifisches Gen zu amplifizieren, selbst wenn es nur eine Kopie in der Probe gab.

Ich erinnere mich, dass ich dieses Verfahren im Molecular Genetics Lab verwendet habe, um sicherzustellen, dass unsere Probe reiner war.


Es kann davon abhängen, welches Protokoll Sie betrachten, aber Sie können ein spezifisches Primerset für die erste PCR und ein anderes spezifisches Primerset für die zweite PCR verwenden.

Selbst wenn Sie für die erste PCR ein nicht spezifisches Primerset verwenden, kann es einfacher sein, Ihre Zielsequenz zu amplifizieren, da Ihre Zielsequenz vor der Durchführung der ersten PCR häufiger vorhanden wäre als die ursprüngliche Lösung.


Warum eine verschachtelte PCR durchführen? (HIV-Virus) - (10. August 2006)

Ich habe Artikel über HIV gelesen und daran gearbeitet. Diese Frage beschäftigt mich. Warum führt jeder (jede Zeitung, die ich lese) eine verschachtelte PCR für das HIV-Virus durch. Ich frage mich wirklich warum? auch bei Patienten mit hoher Viruslast.

Warum können wir nicht einfach eine 1-Schritt-PCR durchführen und ein Gel laufen lassen? Gibt es Gründe? um die Spezifität zu erhöhen?

Wunderring eben. Ich weiß, dass Denggi eine Verschachtelung durchführt, um den Typ zu bestätigen. Was ist mit anderen Viren?

Ich würde denken, dass in diesem Fall verschachtelte PCR verwendet wird, um die Spezifität zu erhöhen oder vielleicht den Subtyp zu überprüfen, wie Sie es erwähnt haben.

Bei HIV wird meistens verschachtelt, um die Spezifität zu erhöhen (es ist ein verdammt unterschiedliches Virus). Außerdem ist es besser, mit einer einzigen Methode zu arbeiten, unabhängig von der Viruslast Ihrer Patienten.

Tatsächlich hängt es von Ihrer Anwendung ab. Wenn Sie nur eine diagnostische PCR durchführen, haben Sie möglicherweise eine kurze PCR, die gut genug ist, um dies in einer einzigen Reaktion durchzuführen, aber für Sequenzierungszwecke sollten Sie aus Gründen der Spezifität besser verschachtelt werden.

Die Leute fragen mich, warum ich eine verschachtelte Methode mache, und ich werde sie aus Gründen der Genauigkeit beantworten. Aber ich ließ ein Gel auf das erste PCR-Produkt laufen. es gibt keine Banden! Egal wie oft ich optimiert habe, aber wenn ich mit einer zweiten PCR fortgefahren bin. Die Bands erscheinen einfach ! Strange.

das problem könnte ertragsbedingt sein? Nach vielen PCR-Zyklen sinkt Ihre Amplifikationseffizienz.

Wenn Sie der Meinung sind, dass die Spezifität nicht das Problem ist, warum führen Sie Ihre äußere PCR nicht erneut mit Ihrer äußeren PCR durch (versuchen Sie mehrere Mengen Ihrer ersten PCR, führen Sie sogar Verdünnungen durch. ).


Inhalt

Die kombinierte RT-PCR- und qPCR-Technik wurde als quantitative RT-PCR [3] oder Echtzeit-RT-PCR [4] (manchmal sogar als quantitative Echtzeit-RT-PCR bezeichnet [5] ) bezeichnet, unterschiedlich abgekürzt als qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] und rRT-PCR. [9] Um Verwirrung zu vermeiden, werden in diesem Artikel durchgehend die folgenden Abkürzungen verwendet:

Technik Abkürzung
Polymerase Kettenreaktion PCR
Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion RT-PCR
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion qPCR
RT-PCR / qPCR kombinierte Technik qRT-PCR

Nicht alle Autoren, insbesondere frühere, verwenden diese Konvention und der Leser sollte beim Folgen von Links vorsichtig sein. RT-PCR wurde verwendet, um sowohl Real-Time-PCR (qPCR) als auch reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) anzuzeigen.

Seit seiner Einführung im Jahr 1977 wurde der Northern Blot trotz seiner Mängel in großem Umfang für die RNA-Quantifizierung verwendet: (a) zeitaufwendige Technik, (b) erfordert eine große RNA-Menge zum Nachweis und (c) quantitativ ungenau in der geringen Menge an RNA-Gehalt. [10] [11] Allerdings hat die RT-PCR seit ihrer Erfindung durch Kary Mullis im Jahr 1983 den Northern Blot als Methode der Wahl für den RNA-Nachweis und die Quantifizierung verdrängt. [12]

Die RT-PCR hat sich aus mehreren Gründen zur Benchmark-Technologie für den Nachweis und/oder den Vergleich von RNA-Spiegeln entwickelt: (a) Sie erfordert keine Post-PCR-Prozessierung, (b) eine breite Palette (>10 7 -fach) der RNA-Häufigkeit gemessen werden kann und (c) es Einblicke in qualitative und quantitative Daten gibt. [5] Aufgrund ihrer Einfachheit, Spezifität und Sensitivität wird die RT-PCR in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, von einfachen Experimenten wie der Quantifizierung von Hefezellen in Wein bis hin zu komplexeren Anwendungen als diagnostische Werkzeuge zum Nachweis von Infektionserregern wie der Vogelgrippe Virus und SARS-CoV-2. [13] [14] [15]

Bei der RT-PCR wird die RNA-Matrize zunächst mit Hilfe einer reversen Transkriptase (RT) in eine komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Die cDNA wird dann als Matrize für die exponentielle Amplifikation mittels PCR verwendet. Die Verwendung der RT-PCR zum Nachweis von RNA-Transkripten hat die Untersuchung der Genexpression in folgenden wichtigen Punkten revolutioniert:

  • Macht es theoretisch möglich, die Transkripte praktisch jedes Gens nachzuweisen [16]
  • Ermöglicht die Probenamplifikation und eliminiert die Notwendigkeit für reichlich Ausgangsmaterial, das bei der Verwendung der Northern-Blot-Analyse erforderlich ist [17][18]
  • Vorausgesetzt, dass der RNA-Abbau toleriert wird, solange die RNA, die den Primer umspannt, intakt ist [17]

Einstufige RT-PCR vs. zweistufige RT-PCR Bearbeiten

Die Quantifizierung von mRNA mittels RT-PCR kann entweder als einstufige oder als zweistufige Reaktion erfolgen. Der Unterschied zwischen den beiden Ansätzen liegt in der Anzahl der Röhrchen, die bei der Durchführung des Verfahrens verwendet werden. Die zweistufige Reaktion erfordert, dass die Reverse-Transkriptase-Reaktion und die PCR-Amplifikation in getrennten Röhrchen durchgeführt werden. Der Nachteil des zweistufigen Ansatzes ist die Kontaminationsanfälligkeit durch häufigeres Probenhandling. [19] Andererseits läuft die gesamte Reaktion von der cDNA-Synthese bis zur PCR-Amplifikation im einstufigen Ansatz in einem einzigen Röhrchen ab. Es wird angenommen, dass der einstufige Ansatz die experimentelle Variation minimiert, indem alle enzymatischen Reaktionen in einer einzigen Umgebung enthalten sind. Es macht die Schritte zum Pipettieren des cDNA-Produkts, das arbeitsintensiv und anfällig für Kontaminationen ist, für die PCR-Reaktion überflüssig. Der weitere Einsatz von Inhibitor-toleranten Polymerasen, Polymerase-Enhancern mit einer optimierten einstufigen RT-PCR-Bedingung, unterstützt die reverse Transkription der RNA aus ungereinigten oder rohen Proben wie Vollblut und Serum. [20] [21] Die Ausgangs-RNA-Matrizen neigen jedoch beim einstufigen Ansatz zum Abbau, und die Verwendung dieses Ansatzes wird nicht empfohlen, wenn wiederholte Assays aus derselben Probe erforderlich sind. Darüber hinaus wird berichtet, dass der einstufige Ansatz im Vergleich zum zweistufigen Ansatz weniger genau ist. Es ist auch die bevorzugte Analysemethode bei Verwendung von DNA-bindenden Farbstoffen wie SYBR Green, da die Eliminierung von Primer-Dimeren durch eine einfache Änderung der Schmelztemperatur erreicht werden kann. Dennoch ist der einstufige Ansatz eine relativ bequeme Lösung für den schnellen Nachweis von Ziel-RNA direkt in der Biosensorik. [ Zitat benötigt ]

Endpunkt-RT-PCR vs. Echtzeit-RT-PCR Bearbeiten

Die Quantifizierung von RT-PCR-Produkten lässt sich grob in zwei Kategorien einteilen: Endpunkt und Echtzeit. [22] Die Verwendung der Endpunkt-RT-PCR wird bevorzugt, um Veränderungen der Genexpression in einer kleinen Anzahl von Proben zu messen, aber die Echtzeit-RT-PCR hat sich zum Goldstandard für die Validierung quantitativer Ergebnisse aus Array-Analysen oder Genexpression entwickelt Veränderungen auf globaler Ebene. [23]

Endpunkt-RT-PCR Bearbeiten

Die Messansätze der Endpunkt-RT-PCR erfordern den Nachweis von Genexpressionsniveaus durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid, [24] [25] P32-Markierung von PCR-Produkten mit Phosphorimager [26] oder durch Szintillationszählung. [18] Endpunkt-RT-PCR wird üblicherweise mit drei verschiedenen Methoden erreicht: relativ, kompetitiv und vergleichend. [27] [28]

Relative RT-PCR Die relative Quantifizierung der RT-PCR beinhaltet die Co-Amplifikation einer internen Kontrolle gleichzeitig mit dem interessierenden Gen. Die interne Kontrolle wird verwendet, um die Proben zu normalisieren. Nach der Normalisierung kann ein direkter Vergleich der relativen Transkripthäufigkeit über mehrere mRNA-Proben hinweg durchgeführt werden. Als Vorsichtsmaßnahme ist zu beachten, dass die interne Kontrolle so gewählt werden muss, dass sie durch die experimentelle Behandlung nicht beeinflusst wird. Das Expressionsniveau sollte bei allen Proben und mit der interessierenden mRNA konstant sein, damit die Ergebnisse genau und aussagekräftig sind. Da die Quantifizierung der Ergebnisse durch den Vergleich des linearen Bereichs der Ziel- und Kontrollamplifikation analysiert wird, ist es entscheidend, vor Beginn der Analyse die Konzentration der Zielmoleküle und deren Amplifikationsrate zu berücksichtigen. Die Ergebnisse der Analyse werden als Verhältnisse von Gensignal zu internem Kontrollsignal ausgedrückt, wobei die Werte dann für den Vergleich zwischen den Proben bei der Abschätzung der relativen Ziel-RNA-Expression verwendet werden können. [25] [28] [29] Kompetitive RT-PCR Die kompetitive RT-PCR-Technik wird zur absoluten Quantifizierung verwendet. Dabei wird eine synthetische „Kompetitor“-RNA verwendet, die sich durch einen kleinen Größen- oder Sequenzunterschied von der Ziel-RNA unterscheiden lässt. Für das Design der synthetischen RNA ist es wichtig, dass sie in der Sequenz identisch, aber etwas kürzer als die Ziel-RNA ist, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Nach dem Design und der Synthese wird eine bekannte Menge der Kompetitor-RNA zu experimentellen Proben hinzugefügt und mit dem Ziel unter Verwendung von RT-PCR co-amplifiziert. Dann wird eine Konzentrationskurve der Kompetitor-RNA erstellt und sie wird verwendet, um die von den endogenen Transkripten produzierten RT-PCR-Signale zu vergleichen, um die Menge des in der Probe vorhandenen Targets zu bestimmen. [28] [30] Vergleichende RT-PCR Vergleichende RT-PCR ähnelt der kompetitiven RT-PCR darin, dass die Ziel-RNA um Amplifikationsreagenzien innerhalb einer einzigen Reaktion mit einem internen Standard mit nicht verwandter Sequenz konkurriert. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die Ergebnisse mit einer externen Standardkurve verglichen, um die Ziel-RNA-Konzentration zu bestimmen. Im Vergleich zu den relativen und kompetitiven Quantifizierungsmethoden wird die vergleichende RT-PCR als die bequemere Methode angesehen, da der Untersucher kein Pilotexperiment in der relativen RT-PCR durchführen muss, der exponentielle Amplifikationsbereich der mRNA muss vorbestimmt sein und bei der kompetitiven RT-PCR muss eine synthetische Kompetitor-RNA synthetisiert werden. [28] [31] [32] [33] [34]

Echtzeit-RT-PCR-Bearbeitung

Das Aufkommen neuer fluoreszierender DNA-Markierungstechniken in den letzten Jahren hat die Analyse und den Nachweis von PCR-Produkten in Echtzeit ermöglicht und folglich zur weit verbreiteten Einführung der Echtzeit-RT-PCR für die Analyse der Genexpression geführt. Die Echtzeit-RT-PCR ist heute nicht nur die Methode der Wahl zur Quantifizierung der Genexpression, sondern auch die bevorzugte Methode, um Ergebnisse aus Array-Analysen und Genexpressionen auf globaler Ebene zu erhalten. Derzeit stehen vier verschiedene fluoreszierende DNA-Sonden für den Echtzeit-RT-PCR-Nachweis von PCR-Produkten zur Verfügung: SYBR Green, TaqMan, Molecular Beacons und Scorpion-Sonden. Alle diese Sonden ermöglichen den Nachweis von PCR-Produkten durch Erzeugung eines Fluoreszenzsignals. Während der SYBR Green-Farbstoff sein Fluoreszenzsignal einfach durch Bindung an die doppelsträngige DNA in Lösung emittiert, hängt die Fluoreszenzerzeugung der TaqMan-Sonden, Molecular Beacons und Scorpions von der Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-Kopplung des Farbstoffmoleküls ab und eine Quencher-Einheit für die Oligonukleotid-Substrate. [35]

SYBR Green Wenn SYBR Green an die doppelsträngige DNA der PCR-Produkte bindet, emittiert es bei Anregung Licht. Die Intensität der Fluoreszenz nimmt mit der Anreicherung der PCR-Produkte zu. Diese Technik ist einfach anzuwenden, da das Designen von Sonden aufgrund mangelnder Spezifität ihrer Bindung nicht notwendig ist. Da der Farbstoff jedoch die doppelsträngige DNA nicht von den PCR-Produkten und denen von den Primer-Dimeren unterscheidet, ist eine Überschätzung der Zielkonzentration ein häufiges Problem. Wenn eine genaue Quantifizierung unbedingt erforderlich ist, müssen weitere Tests zur Validierung der Ergebnisse durchgeführt werden. Dennoch ist SYBR Green unter den Echtzeit-RT-PCR-Produkterkennungsmethoden die wirtschaftlichste und am einfachsten zu verwendende. [22] [23]

Zwei Strategien werden üblicherweise verwendet, um die Ergebnisse zu quantifizieren, die durch Echtzeit-RT-PCR, das Standardkurvenverfahren und das vergleichende Schwellenwertverfahren, erhalten wurden. [40]

Die exponentielle Amplifikation über die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion stellt eine hochempfindliche Technik bereit, bei der eine sehr geringe Kopienzahl von RNA-Molekülen nachgewiesen werden kann. Die RT-PCR wird häufig bei der Diagnose genetischer Erkrankungen und semiquantitativ bei der Bestimmung der Häufigkeit von spezifischen unterschiedlichen RNA-Molekülen innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes als Maß für die Genexpression verwendet.

Forschungsmethoden Bearbeiten

RT-PCR wird häufig in Forschungsmethoden verwendet, um die Genexpression zu messen. Lin et al. verwendeten qRT-PCR, um die Expression von Gal-Genen in Hefezellen zu messen. Zuerst haben Lin et al. eine Mutation eines Proteins manipuliert, von dem vermutet wird, dass es an der Regulation von Gal-Genen beteiligt ist. Es wurde angenommen, dass diese Mutation die Gal-Expression selektiv aufhebt. Um dies zu bestätigen, wurden die Genexpressionsniveaus von Hefezellen, die diese Mutation enthielten, mittels qRT-PCR analysiert. Die Forscher konnten schlüssig feststellen, dass die Mutation dieses regulatorischen Proteins die Gal-Expression reduziert. [41] Die Northern-Blot-Analyse wird verwendet, um die Genexpression der RNA weiter zu untersuchen.

Geninsertion Bearbeiten

RT-PCR kann auch bei der Insertion eukaryontischer Gene in Prokaryonten sehr nützlich sein. Da die meisten eukaryotischen Gene Introns enthalten, die im Genom, aber nicht in der reifen mRNA vorhanden sind, ist die aus einer RT-PCR-Reaktion erzeugte cDNA die exakte (ohne Rücksicht auf die fehleranfällige Natur von Reverse Transkriptasen) DNA-Sequenz, die direkt nach der Transkription in Protein übersetzt. Wenn diese Gene zur Proteinproduktion oder -reinigung in prokaryotischen Zellen exprimiert werden, muss die direkt aus der Transkription hergestellte RNA nicht gespleißt werden, da das Transkript nur Exons enthält. (Prokaryoten wie E. coli fehlt der mRNA-Spleißmechanismus von Eukaryoten).

Genetische Krankheitsdiagnose Bearbeiten

Die RT-PCR kann verwendet werden, um genetische Erkrankungen wie das Lesch-Nyhan-Syndrom zu diagnostizieren. Diese Erbkrankheit wird durch eine Fehlfunktion des HPRT1-Gens verursacht, die klinisch zum tödlichen Harnsäurestein und gichtähnlichen Symptomen führt. [6] [ Klärung nötig ] Die Analyse einer schwangeren Mutter und eines Fötus auf mRNA-Expressionsniveaus von HPRT1 wird zeigen, ob die Mutter eine Trägerin ist und ob der Fötus wahrscheinlich ein Lesch-Nyhan-Syndrom entwickelt. [42]

Krebserkennung Bearbeiten

Wissenschaftler arbeiten an Möglichkeiten, die RT-PCR bei der Krebserkennung einzusetzen, um die Prognose zu verbessern und das Ansprechen auf die Therapie zu überwachen. Zirkulierende Tumorzellen produzieren je nach Krebsart einzigartige mRNA-Transkripte. Ziel ist es, zu bestimmen, welche mRNA-Transkripte die besten Biomarker für einen bestimmten Krebszelltyp sind und anschließend deren Expressionslevel mit RT-PCR zu analysieren. [43]

RT-PCR wird häufig bei der Untersuchung der Genome von Viren verwendet, deren Genome aus RNA bestehen, wie Influenzavirus A, Retroviren wie HIV und SARS-CoV-2. [44]

Trotz ihrer großen Vorteile ist die RT-PCR nicht ohne Nachteile. Das exponentielle Wachstum der revers transkribierten komplementären DNA (cDNA) während der mehreren PCR-Zyklen führt zu einer ungenauen Endpunktquantifizierung aufgrund der Schwierigkeit, die Linearität aufrechtzuerhalten. [45] Um einen genauen Nachweis und eine Quantifizierung des RNA-Gehalts in einer Probe zu ermöglichen, wurde die qRT-PCR mit fluoreszenzbasierter Modifikation entwickelt, um die Amplifikationsprodukte während jedes PCR-Zyklus zu überwachen. Die extreme Sensitivität der Technik kann ein zweischneidiges Schwert sein, da selbst die kleinste DNA-Kontamination zu unerwünschten Ergebnissen führen kann. [46] Eine einfache Methode zur Eliminierung falsch positiver Ergebnisse besteht darin, Anker oder Tags in die 5'-Region eines genspezifischen Primers einzufügen. [47] Darüber hinaus können Planung und Design von Quantifizierungsstudien aufgrund der Existenz zahlreicher Variationsquellen, einschließlich der Templatkonzentration und der Amplifikationseffizienz, eine technische Herausforderung darstellen. [31] Das Einbringen einer bekannten RNA-Menge in eine Probe, das Hinzufügen einer Reihe von RNA-Verdünnungen, die eine Standardkurve erzeugen, und das Hinzufügen einer Probe ohne Template-Kopie (keine cDNA) können als Kontrollen verwendet werden.

RT-PCR kann durch das einstufige RT-PCR-Protokoll oder das zweistufige RT-PCR-Protokoll durchgeführt werden.

RT-PCR-Bearbeitung in einem Schritt

Die einstufige RT-PCR unterzieht mRNA-Ziele (bis zu 6 kb) einer reversen Transkription, gefolgt von einer PCR-Amplifikation in einem einzigen Reagenzglas. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung von intakter, qualitativ hochwertiger RNA und einem sequenzspezifischen Primer die besten Ergebnisse liefert.

Sobald ein einstufiger RT-PCR-Kit mit einer Mischung aus Reverser Transkriptase, Taq-DNA-Polymerase und einer Korrekturlese-Polymerase ausgewählt wurde und alle erforderlichen Materialien und Geräte beschafft wurden, muss ein Reaktionsgemisch hergestellt werden. Die Reaktionsmischung enthält dNTPs, Primer, Template-RNA, notwendige Enzyme und eine Pufferlösung. Die Reaktionsmischung wird für jede Reaktion in ein PCR-Röhrchen gegeben, gefolgt von Template-RNA. Die PCR-Röhrchen werden dann in einen Thermocycler gegeben, um mit dem Zyklus zu beginnen. Im ersten Zyklus erfolgt die Synthese von cDNA. Der zweite Zyklus ist die anfängliche Denaturierung, bei der die reverse Transkriptase inaktiviert wird. Die verbleibenden 40-50 Zyklen sind die Amplifikation, die Denaturierung, Annealing und Elongation umfasst. Wenn die Amplifikation abgeschlossen ist, können die RT-PCR-Produkte mit Gelelektrophorese analysiert werden. [48] ​​[49]

(PCR-Anwendungshandbuch und Biotools)

Zweistufige RT-PCR-Bearbeitung

Die zweistufige RT-PCR erfolgt, wie der Name schon sagt, in zwei Schritten. Zuerst die reverse Transkription und dann die PCR. Dieses Verfahren ist empfindlicher als das einstufige Verfahren. Kits sind auch für die zweistufige RT-PCR nützlich. Verwenden Sie wie bei der One-Step-PCR nur intakte, hochwertige RNA, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Der Primer für die zweistufige PCR muss nicht sequenzspezifisch sein.

Schritt eins Bearbeiten

Kombinieren Sie zunächst Template-RNA, Primer, dNTP-Mix und nukleasefreies Wasser in einem PCR-Röhrchen. Fügen Sie dann dem PCR-Röhrchen einen RNase-Inhibitor und eine reverse Transkriptase hinzu. Legen Sie als Nächstes das PCR-Röhrchen für einen Zyklus in einen Thermocycler, wobei

Annealing, Verlängerung und Inaktivierung der reversen Transkriptase tritt auf. Fahren Sie schließlich direkt mit Schritt 2 fort, der PCR ist, oder lagern Sie das Produkt auf Eis, bis die PCR durchgeführt werden kann.

Schritt zwei Bearbeiten

Master-Mix hinzufügen, der Puffer enthält, dNTP-Mix, MgCl2, Taq-Polymerase und nukleasefreies Wasser in jedes PCR-Röhrchen. Fügen Sie dann die erforderliche Grundierung zu den Röhrchen hinzu. Als nächstes legen Sie die PCR-Röhrchen für 30 Zyklen des Amplifikationsprogramms in einen Thermocycler. Dazu gehören: Denaturierung, Annealing und Elongation. Die Produkte der RT-PCR können mit Gelelektrophorese analysiert werden. [50]

Der quantitative RT-PCR-Assay gilt als Goldstandard zur Messung der Kopienzahl spezifischer cDNA-Targets in einer Probe, ist jedoch schlecht standardisiert. [51] Obwohl es zahlreiche Veröffentlichungen gibt, die die Technik verwenden, liefern viele jedoch unzureichende experimentelle Details und verwenden ungeeignete Datenanalysen, um unangemessene Schlussfolgerungen zu ziehen. Aufgrund der inhärenten Variabilität der Qualität quantitativer PCR-Daten fällt es den Gutachtern nicht nur schwer, diese Manuskripte zu bewerten, sondern es wird auch unmöglich, die Studien zu replizieren. [52] In Anerkennung der Notwendigkeit einer Standardisierung der Berichterstattung über experimentelle Bedingungen wurden von einem internationalen Konsortium akademischer Wissenschaftler die Richtlinien für die Mindestinformationen zur Veröffentlichung von quantitativen Real-Time-PCR-Experimenten (MIQE, ausgesprochen mykee) veröffentlicht. Die MIQE-Richtlinien beschreiben die Mindestinformationen, die für die Bewertung quantitativer PCR-Experimente erforderlich sind und für die Veröffentlichung erforderlich sein sollten, um eine bessere experimentelle Praxis zu fördern und die Relevanz, Genauigkeit, korrekte Interpretation und Wiederholbarkeit quantitativer PCR-Daten sicherzustellen. [53]

Neben den Richtlinien für die Berichterstattung betont das MIQE die Notwendigkeit, die Nomenklatur der quantitativen PCR zu standardisieren, um beispielsweise Verwechslungen zu vermeiden: die Abkürzung qPCR sollte für die quantitative Real-Time-PCR und RT-qPCR für die reverse Transkription verwendet werden-qPCR, und Gene, die für die Normalisierung verwendet werden, sollten als Referenzgene anstelle von Housekeeping-Genen bezeichnet werden. Sie schlägt auch vor, kommerziell abgeleitete Begriffe wie TaqMan-Sonden nicht zu verwenden, sondern stattdessen als Hydrolysesonden zu bezeichnen. Darüber hinaus wird vorgeschlagen, den Quantifizierungszyklus (Cq) zu verwenden, um den für die Quantifizierung verwendeten PCR-Zyklus anstelle von Schwellenwertzyklus (Ct), Kreuzungspunkt (Cp) und Entnahmepunkt (TOP) zu beschreiben, die sich auf denselben Wert beziehen, aber von verschiedenen Herstellern von Echtzeitinstrumenten geprägt. [51]

Die Leitlinie besteht aus folgenden Elementen: 1) experimentelles Design, 2) Probe, 3) Nukleinsäureextraktion, 4) reverse Transkription, 5) qPCR-Zielinformationen, 6) Oligonukleotide, 7) Protokoll, 8) Validierung und 9) Daten Analyse. Spezifische Elemente innerhalb jedes Elements tragen ein Etikett von entweder E (wesentlich) oder D (wünschenswert). Die mit E gekennzeichneten werden als kritisch und unverzichtbar angesehen, während die mit D gekennzeichneten als peripher, aber wichtig für bewährte Verfahren angesehen werden. [53]


Beeinflusst UNG andere Aspekte der qPCR?

UNG ist auf einzel- und doppelsträngiger dU-haltiger DNA aktiv, aber dUTP ist kein Substrat für UNG. Taq-Polymerase und andere Komponenten des PCR-Ansatzes werden durch die UNG-Behandlung nicht beeinflusst. Bei der UNG-Behandlung wird nur das verschleppte Produkt entfernt [8].

Das dU-haltige PCR-Produkt verhält sich beim Blotten, Klonen und Sequenzieren wie native dT-haltige DNA, und das Vorhandensein von UNG beeinflusst die meisten Post-PCR-Analysen nicht. Darüber hinaus hat UNG keinen Einfluss auf die elektrophoretische Mobilität oder die Ethidium-Bromid-Färbungseffizienz von DNA und hat keinen Einfluss auf Ihre experimentellen Ergebnisse.

Um Verschleppungen in Ihrer qPCR zu vermeiden, verwenden Sie einen Mastermix, der entweder UNG oder UDG enthält.


Verschiedene Techniken:

PCR wird regelmäßig nicht nur verwendet, um Mutationen oder Genotypen zu identifizieren, sondern sie wird auch verwendet, um Mutationen an einer bestimmten Stelle einzufügen. Das gleiche Verfahren, das zum Screenen von Mutationen verwendet wird, kann verwendet werden, um Mutationen einzufügen.

Konventionelle PCR:

Die konventionelle PCR-Methode ist eine der beliebtesten und einfachsten Methoden zur ortsgerichteten Mutagenese. Der Aufbau ist einfach kurze, einzelsträngige Oligonukleotid-Primer sind so konzipiert, dass sie die Mutation aufweisen, die wir untersuchen möchten.

Die bei der herkömmlichen PCR verwendete Taq-DNA-Polymerase weist keine Exonuklease-Aktivität auf, daher kann sie während der Amplifikation keine Fehlpaarung identifizieren. Wenn die Mutation minimal genug ist, um eingebaut zu werden, bindet der Primer an die DNA mit Mutation.

Über einen Zeitraum eines gewissen Amplifikationszyklus wird die ursprüngliche DNA-Sequenz durch die DNA-Sequenz mit einer Mutation ersetzt. Die Hauptempfehlung für die konventionelle PCR-basierte Mutagenese besteht darin, mutierte Basen bis zu mehreren Grenzen am 5'-Ende des Primers oder in der Mitte des Primers einzufügen.

Ab dem 3'-Ende expandiert die Taq-Polymerase die DNA. Die Wahrscheinlichkeit eines Reaktionsversagens ist dort also höher. Eine weitere Einschränkung des vorliegenden Verfahrens besteht darin, dass es aufgrund des Vorhandenseins von Matrizen-DNA sowohl mutierte als auch nicht mutierte DNA (gemischte DNA-Typen) trägt.

Daher ist die Ausbeute der herkömmlichen, auf PCR basierenden ortsgerichteten Mutagenese geringer.

Weitere Informationen zur konventionellen PCR finden Sie im vorliegenden Artikel: A Complete Guide of the Polymerase Chain Reaction.

Notiz: Anstelle der Taq-DNA-Polymerase können wir die High-Fidelity-DNA-Polymerase verwenden. Aber dafür ist der experimentelle Assay völlig anders. Außerdem kann die Taq-DNA-Polymerase nur bei dem herkömmlichen PCR-Ansatz verwendet werden und hat die Fähigkeit, nur 2 bis 3 Nukleotide zu verändern.

Die Übersicht über die vorliegende Methode ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Konventionelle PCR-basierte ortsgerichtete Mutagenese.

Primer-Extension oder nested PCR:

Bei der Primer-Extension werden 2 Primer-Sets verwendet, in die ein einzelner Primer-Set eingebettet ist. Hier ist der Mechanismus zum Tragen der Mutation der gleiche, die Mutation wird an einem der Enden in den Primer eingeführt.

Benennen wir nun die Primer der Einfachheit halber,

Nehmen wir an, der äußere Vorwärtsprimer ist 1 und der äußere Rückwärtsprimer ist 4

Der innere Vorwärtsprimer ist 3 und der innere Rückwärtsprimer ist 2.

Die Lage aller vier Primer ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Hier enthalten die inneren Primer 2 und 3 die Mutation/fehlgepaarte Basen am Ende. Der Amplifikationsprozess bei der nested PCR wird in zwei Amplifikationsrunden abgeschlossen.

In der ersten Amplifikationsrunde erzeugen Primer 1-2 und Primer 3-4 zwei verschiedene PCR-Produkte.

Primer 2 und 3 sind mutierte Primersequenzen, daher werden in zwei verschiedene PCR-Produkte zwei verschiedene Mutationen eingebaut. In der zweiten Amplifikationsrunde amplifizieren die Primer 1 und 4 die gesamte DNA-Sequenz mit der gewünschten Mutation.

Inverse PCR:

Bei der inversen PCR amplifizieren die Primer das andere Fragment als die Zielsequenz. Das heißt, es verstärkt sich in umgekehrter Ausrichtung.

Das Verfahren wird zum Einfügen einer Mutation in das Plasmid mit einem Gen von unserem Interesse verwendet. Die High-Fidelity-DNA-Polymerase wird verwendet, um die Amplifikation durchzuführen sowie die zirkuläre Plasmid-DNA zu linearisieren. Sobald die Mutation eingefügt ist, ermöglicht das phosphorylierte 5'-Ende der Primer die Ligation der linearen DNA.

Durch die intermolekulare Ligation wird das Plasmid dann rezirkularisiert. Das vorliegende Verfahren beruht auf der Amplifikation der flankierenden Region und wird daher so oft beim Deletieren von Sequenzen aus einem Plasmid verwendet. Siehe die Abbildung unten,

Wir können viele Nukleotide löschen, indem wir die inverse PCR-Methode verwenden. Siehe Abbildung unten für Deletion durch inverse PCR,

Diese drei Verfahren sind für die ortsgerichtete Mutagenese am beliebtesten. Sehen Sie sich nun einige der Komponenten an, die in der PCR-Reaktion verwendet werden, insbesondere für die ortsgerichtete Mutagenese.

Template-DNA:

Hier ist unsere Matrize immer eine zirkuläre Plasmid-DNA, weil wir das Gen von unserem Interesse untersuchen wollen, das in einem Plasmid vorliegt. Lesen Sie mehr über Plasmid: Plasmid DNA – Struktur, Funktion, Isolierung und Anwendungen.

Die Konzentration der Plasmid-DNA muss zwischen 0,1-1,0 ng/μl liegen und sie muss hochrein sein.

Verwenden Sie ein Plasmid-Reinigungskit, um die Plasmid-DNA zu reinigen.

Wenn der GC-Gehalt des Plasmids höher ist, verwenden Sie DMSO in der PCR-Reaktion.

DNA-Polymerase:

Die bei der ortsgerichteten Mutagenese verwendete Polymerase muss speziell sein und sich von der herkömmlichen unterscheiden. Verwenden Sie hier anstelle der normalen Taq-DNA-Polymerase High-Fidelity-DNA-Polymerase.

Außerdem muss sich die im vorliegenden Assay verwendete High-Fidelity-DNA-Polymerase auch von anderen High-Fidelity-Polymerasen unterscheiden. Die hier verwendete Polymerase sollte 3' bis 5' Exonukleaseaktivität aufweisen (nicht 5' bis 3' Exonukleaseaktivität).

Die High-Fidelity-DNA-Polymerase mit 5'- bis 3'-Exonuklease-Aktivität entfernt die fehlgepaarten Nukleotide, während die 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität die Amplifikationsspezifität erhöht.

Polymerase hat auch die 5'- bis 3'-Polymerase-Aktivität. DNA-Polymerasen wie Pfu, Vent und Phusion ermöglichen eine höhere Amplifikationsrate bei der ortsgerichteten Mutagenese. Die Taq-DNA-Polymerase wird nur in der herkömmlichen PCR-basierten Methode zur Einführung von Mutationen verwendet.

Idealerweise wird die Mutation am Ende des Primers eingebaut, aber wenn die Mutation dazwischen liegt, stellen Sie sicher, dass beide Seiten des Primers mindestens 11 Basenpaare komplementäre Sequenzen aufweisen.

Außerdem weist der bei der ortsgerichteten Mutagenese verwendete Primer keine repetitiven Sequenzen und Sekundärstrukturen auf.

Eine 3-Basen-Fehlpaarung ist in dem idealen 22 bis 25 Nukleotide langen Primer tolerierbar.

Das ist jetzt etwas sehr Wichtiges.

Die Matrizen-DNA ist natürliche DNA, sie muss eine Methylgruppe enthalten, dh die Matrizen-DNA ist methyliert, während die neu gebildete DNA unmethyliert ist Die methylierungsspezifische Endonuklease- eine hier verwendete Nuklease-Art, die nur die methylierte DNA spaltet.

Daher wird die Matrizen-DNA, die nicht die Mutation aufweist, aus der Reaktion entfernt (weil sie methyliert ist). Nur die mutierte DNA verbleibt in der Reaktion. Siehe das Bild,

Das Bild zeigt die methylierungsspezifische Nukleaseaktivität, die die methylierte Template-DNA spaltet.


Warum verwenden wir PCR?

Hallo zusammen, ich bin ein neuer Student in Biologie, der derzeit in der Highschool ist. Ich frage mich nur, was passieren würde, wenn die Gelelektrophorese mit dem Kulturmix ohne PCR durchgeführt würde, werden wir dann noch DNA-Banden beobachten oder nicht? Mein derzeitiges Verständnis ist, dass pcr verwendet wird, um eine bestimmte Sequenz in der DNA zu finden und sie zu amplifizieren, um sie auf der Gelelektrophorese zu sehen. Wenn keine PCR verwendet wird, sehen wir dann Banden oder gibt es nicht genug DNA-Material, um Banden zu beobachten, oder werden Banden in Abwesenheit von PCR beobachtet, werden dann viele Banden an verschiedenen Positionen in Bezug auf die DNA innerhalb der Zelle vorhanden sein? Danke!

PCR ist ein Werkzeug zur Amplifikation von DNA- oder RNA-Stücken. Es kann viele Gründe geben, eine PCR durchzuführen. Ein paar Beispiele:

Sie möchten ein Gen amplifizieren, um es in einen Plasmidvektor zu klonen.

Sie möchten messen, wie viel von einem Gen im Vergleich zu einem anderen in einer Zelle exprimiert wird.

Sie möchten die Sequenz einer Region unbekannter DNA überprüfen.

Ein Gel ist lediglich ein Werkzeug, das verwendet wird, um die Qualität und Größe der erhaltenen DNA zu überprüfen. Das Ziel ist immer, eine Nukleotidsequenz ausreichend zu amplifizieren, um sie für einige nachgelagerte molekularbiologische Techniken wie das Klonen verwenden zu können oder um eine biologische Frage zu der zu amplifizierenden Region zu beantworten. Manchmal erfordert die Beantwortung der biologischen Frage, dass Sie ein Gel ausführen müssen, aber wir betrachten das Gel nicht als Ziel, sondern eher als Werkzeug, wenn dies sinnvoll ist.

Vielen Dank für Ihren Kommentar. Ist es möglich, einen DNA-Extrakt aus einer Zelle auf Agarose zu laufen, ohne pcr zu verwenden? Werden wir Banden beobachten oder reicht die Menge für Beobachtungen nicht aus?

Es ist durchaus möglich, DNA von Zellen direkt auf einem Gel laufen zu lassen, aber Sie müssten viele Zellen verwenden (um genug DNA zum Sehen zu bekommen) und was Sie zu sehen erwarten, wäre völlig anders. Sie müssten auch ein etwas anderes Elektrophorese-Setup verwenden. PCR erzeugt spezifisch mehr von der kurzen DNA-Sequenz zwischen den Primern, wodurch ein DNA-Fragment von einigen hundert oder tausend Basenpaaren erzeugt wird. DNA in Zellen (wenn es sich um Säugetiere handelt) besteht aus langen linearen Chromosomen mit einer Länge von Millionen von Basenpaaren oder (wenn es sich um Bakterien handelt) aus kreisförmigen Chromosomen mit einer Länge von Hunderttausenden von Basenpaaren. Um sie auf einem Gel zu trennen, müssen Sie eine Technik namens Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese verwenden und auch die DNA sorgfältig reinigen, um die enormen DNA-Moleküle nicht zu scheren.

I'm sorry but most of this is very wrong. You absolutely do extract DNA from samples (cells, tissue etc) and run it on a gel. That is the first check for visualising qualitatively how much DNA you have and the quality of it. Generally one high band means you have a lot of very good DNA (high band = high molecular weight DNA = not degraded into small pieces). When DNA is degraded you will see smearing on a gel (corresponding to lots of different sized fragments of DNA).

PCR has many applications. It is used to amplify (make many copies) of a particular region of DNA. Usually you would do it to look at one particular gene. You run the PCR product on the gel to visualise that amplification has worked. You will not see the DNA that you amplified the PCR product from on the gel because you do not use much in the PCR reaction, and the PCR product is amplified to a concentration much higher than the template DNA.


Diagnostic reliability of nested PCR depends on the primer design and threshold abundance of Helicobacter pylori in biopsy, stool, and saliva samples

Pavol Sulo, Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Ilkovicova 6, Bratislava, 842 15, Slovakia.

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

First Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Pavol Sulo, Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Ilkovicova 6, Bratislava, 842 15, Slovakia.

Abstrakt

Hintergrund

The aim of this work was to find a reliable nested PCR for the detection of Helicobacter pylori in biopsy, stool, and saliva specimens.

Materialen und Methoden

Novel nested PCR was elaborated and validated on 81 clinical biopsy, stool, and saliva samples from the same individual and compared to available H pylori assays: histology, rapid urease test (RUT), stool antigen test (SAT), 13 C-urea breath test (UBT).

Ergebnisse

The efficiency and selectivity of 17 published nested polymerase chain reactions (PCR) available for Helicobacter pylori detection were re-evaluated. Most of them had serious limitations and mistakes in primer design. Hence, we elaborated a nested PCR for the unambiguous identification of H pylori in biopsy, stool, and saliva, using primers targeted to variable regions of the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene. Moreover, we determined the detection limit by adding a known number of cells. This number was as low as 0.5 cells in a PCR vial, but due to the DNA isolation procedures, it required 1-5 × 10 3 cells/g or ml of specimen. The sensitivity for nested PCR from stomach biopsies was on the same scale as 13 C-UBT (93.8%), but it was much lower in amplifications from stool (31.3%). Sequencing of all obtained PCR products exclusively confirmed H pylori-specific DNA sequences.

Schlussfolgerungen

Elaborated nested PCR assay can serve as an auxiliary method for controversial samples (patients with bleeding or taking proton-pump inhibitor) in laboratories with basic equipment. The sensitivity and specificity for the amplification from gastric biopsies was almost like 13 C-UBT. Despite the good sensitivity, the threshold occurrence and the ability to survive in the oral cavity aside from and independent of the stomach is the reason why H pylori DNA cannot be reliably detected in saliva, stool, and some biopsy samples.


Diagnostic reliability of nested PCR depends on the primer design and threshold abundance of Helicobacter pylori in biopsy, stool, and saliva samples

Pavol Sulo, Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Ilkovicova 6, Bratislava, 842 15, Slovakia.

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

First Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia

Pavol Sulo, Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Ilkovicova 6, Bratislava, 842 15, Slovakia.

Institutionelle Anmeldung
Melden Sie sich bei der Wiley Online-Bibliothek an

Wenn Sie zuvor einen Zugang mit Ihrem persönlichen Konto erhalten haben, loggen Sie sich bitte ein.

Sofortzugriff kaufen
  • Sehen Sie sich das Artikel-PDF und alle dazugehörigen Ergänzungen und Abbildungen für einen Zeitraum von 48 Stunden an.
  • Artikel kann nicht gedruckt werden.
  • Artikel kann nicht heruntergeladen werden.
  • Artikel kann nicht neu verteilt werden.
  • Unbegrenzte Ansicht des Artikel-PDFs und der dazugehörigen Ergänzungen und Abbildungen.
  • Artikel kann nicht gedruckt werden.
  • Artikel kann nicht heruntergeladen werden.
  • Artikel kann nicht neu verteilt werden.
  • Unbegrenzte Ansicht des Artikel-/Kapitel-PDFs und der dazugehörigen Ergänzungen und Abbildungen.
  • Artikel/Kapitel können gedruckt werden.
  • Artikel/Kapitel können heruntergeladen werden.
  • Artikel/Kapitel kann nicht neu verteilt werden.

Abstrakt

Hintergrund

The aim of this work was to find a reliable nested PCR for the detection of Helicobacter pylori in biopsy, stool, and saliva specimens.

Materialen und Methoden

Novel nested PCR was elaborated and validated on 81 clinical biopsy, stool, and saliva samples from the same individual and compared to available H pylori assays: histology, rapid urease test (RUT), stool antigen test (SAT), 13 C-urea breath test (UBT).

Ergebnisse

The efficiency and selectivity of 17 published nested polymerase chain reactions (PCR) available for Helicobacter pylori detection were re-evaluated. Most of them had serious limitations and mistakes in primer design. Hence, we elaborated a nested PCR for the unambiguous identification of H pylori in biopsy, stool, and saliva, using primers targeted to variable regions of the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene. Moreover, we determined the detection limit by adding a known number of cells. This number was as low as 0.5 cells in a PCR vial, but due to the DNA isolation procedures, it required 1-5 × 10 3 cells/g or ml of specimen. The sensitivity for nested PCR from stomach biopsies was on the same scale as 13 C-UBT (93.8%), but it was much lower in amplifications from stool (31.3%). Sequencing of all obtained PCR products exclusively confirmed H pylori-specific DNA sequences.

Schlussfolgerungen

Elaborated nested PCR assay can serve as an auxiliary method for controversial samples (patients with bleeding or taking proton-pump inhibitor) in laboratories with basic equipment. The sensitivity and specificity for the amplification from gastric biopsies was almost like 13 C-UBT. Despite the good sensitivity, the threshold occurrence and the ability to survive in the oral cavity aside from and independent of the stomach is the reason why H pylori DNA cannot be reliably detected in saliva, stool, and some biopsy samples.


Variations on the basic PCR technique

  • Allele-specific PCR: a diagnostic or cloning technique based on single-nucleotide variations (SNVs not to be confused with SNPs) (single-base differences in a patient). It requires prior knowledge of a DNA sequence, including differences between alleles, and uses primers whose 3′ ends encompass the SNV (base pair buffer around SNV usually incorporated). PCR amplification under stringent conditions is much less efficient in the presence of a mismatch between template and primer, so successful amplification with an SNP-specific primer signals presence of the specific SNP in a sequence. [21] See SNP genotyping for more information.
  • Assembly PCR oder Polymerase Cycling Assembly (PCA): artificial synthesis of long DNA sequences by performing PCR on a pool of long oligonucleotides with short overlapping segments. The oligonucleotides alternate between sense and antisense directions, and the overlapping segments determine the order of the PCR fragments, thereby selectively producing the final long DNA product. [22]
  • Asymmetric PCR: preferentially amplifies one DNA strand in a double-stranded DNA template. It is used in sequencing and hybridization probing where amplification of only one of the two complementary strands is required. PCR is carried out as usual, but with a great excess of the primer for the strand targeted for amplification. Because of the slow (arithmetic) amplification later in the reaction after the limiting primer has been used up, extra cycles of PCR are required. [23] A recent modification on this process, known as Linear-EINfter-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), uses a limiting primer with a higher melting temperature (Tm) than the excess primer to maintain reaction efficiency as the limiting primer concentration decreases mid-reaction. [24]
  • Dial-out PCR: a highly parallel method for retrieving accurate DNA molecules for gene synthesis. A complex library of DNA molecules is modified with unique flanking tags before massively parallel sequencing. Tag-directed primers then enable the retrieval of molecules with desired sequences by PCR. [25]
  • Helicase-dependent amplification: similar to traditional PCR, but uses a constant temperature rather than cycling through denaturation and annealing/extension cycles. DNA helicase, an enzyme that unwinds DNA, is used in place of thermal denaturation. [26]
  • Hot start PCR: a technique that reduces non-specific amplification during the initial set up stages of the PCR. It may be performed manually by heating the reaction components to the denaturation temperature (e.g., 95°C) before adding the polymerase. [27] Specialized enzyme systems have been developed that inhibit the polymerase’s activity at ambient temperature, either by the binding of an antibody[10][28] or by the presence of covalently bound inhibitors that dissociate only after a high-temperature activation step. Hot-start/cold-finish PCR is achieved with new hybrid polymerases that are inactive at ambient temperature and are instantly activated at elongation temperature.
  • Intersequence-specific PCR (ISSR): a PCR method for DNA fingerprinting that amplifies regions between simple sequence repeats to produce a unique fingerprint of amplified fragment lengths. [29]
  • Inverse PCR: is commonly used to identify the flanking sequences around genomic inserts. It involves a series of DNA digestions and self ligation, resulting in known sequences at either end of the unknown sequence. [30]
  • Ligation-mediated PCR: uses small DNA linkers ligated to the DNA of interest and multiple primers annealing to the DNA linkers it has been used for DNA sequencing, genome walking, and DNA footprinting. [31]
  • Methylation-specific PCR (MSP): developed by Stephen Baylin and Jim Herman at the Johns Hopkins School of Medicine, [32] and is used to detect methylation of CpG islands in genomic DNA. DNA is first treated with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosine bases to uracil, which is recognized by PCR primers as thymine. Two PCRs are then carried out on the modified DNA, using primer sets identical except at any CpG islands within the primer sequences. At these points, one primer set recognizes DNA with cytosines to amplify methylated DNA, and one set recognizes DNA with uracil or thymine to amplify unmethylated DNA. MSP using qPCR can also be performed to obtain quantitative rather than qualitative information about methylation.
  • Miniprimer PCR: uses a thermostable polymerase (S-Tbr) that can extend from short primers (“smalligos”) as short as 9 or 10 nucleotides. This method permits PCR targeting to smaller primer binding regions, and is used to amplify conserved DNA sequences, such as the 16S (or eukaryotic 18S) rRNA gene. [33]
  • Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA): permits multiple targets to be amplified with only a single primer pair, thus avoiding the resolution limitations of multiplex PCR (see below).
  • Multiplex-PCR: consists of multiple primer sets within a single PCR mixture to produce amplicons of varying sizes that are specific to different DNA sequences. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test-run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes. That is, their base pair length should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis.
  • Nested PCR: increases the specificity of DNA amplification, by reducing background due to non-specific amplification of DNA. Two sets of primers are used in two successive PCRs. In the first reaction, one pair of primers is used to generate DNA products, which besides the intended target, may still consist of non-specifically amplified DNA fragments. The product(s) are then used in a second PCR with a set of primers whose binding sites are completely or partially different from and located 3′ of each of the primers used in the first reaction. Nested PCR is often more successful in specifically amplifying long DNA fragments than conventional PCR, but it requires more detailed knowledge of the target sequences.
  • Overlap-extension PCR oder Splicing by overlap extension (SOEing) : a genetic engineering technique that is used to splice together two or more DNA fragments that contain complementary sequences. It is used to join DNA pieces containing genes, regulatory sequences, or mutations the technique enables creation of specific and long DNA constructs. It can also introduce deletions, insertions or point mutations into a DNA sequence. [34][35]
  • Quantitative PCR (qPCR): used to measure the quantity of a target sequence (commonly in real-time). It quantitatively measures starting amounts of DNA, cDNA, or RNA. qPCR is commonly used to determine whether a DNA sequence is present in a sample and the number of its copies in the sample. Quantitative real-time PCR has a very high degree of precision. QRT-PCR (or QF-PCR) methods use fluorescent dyes, such as Sybr Green, EvaGreen or fluorophore-containing DNA probes, such as TaqMan, to measure the amount of amplified product in real time. It is also sometimes abbreviated to RT-PCR (Real Time PCR) or RQ-PCR. QRT-PCR or RTQ-PCR are more appropriate contractions, since RT-PCR commonly refers to reverse transcription PCR (see below), often used in conjunction with qPCR.
  • Digital PCR (dPCR): used to measure the quantity of a target DNA sequence in a DNA sample. The DNA sample is highly diluted so that after running many PCR reactions in parallel, some of them will not receive a single molecule of the target DNA. The target DNA concentration is calculated using the proportion of negative outcomes. Hence the name ‘digital PCR’.
  • Reverse Transcription PCR (RT-PCR): for amplifying DNA from RNA. Reverse transcriptase reverse transcribes RNA into cDNA, which is then amplified by PCR. RT-PCR is widely used in expression profiling, to determine the expression of a gene or to identify the sequence of an RNA transcript, including transcription start and termination sites. If the genomic DNA sequence of a gene is known, RT-PCR can be used to map the location of exons and introns in the gene. The 5′ end of a gene (corresponding to the transcription start site) is typically identified by RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends).
  • Solid Phase PCR: encompasses multiple meanings, including Polony Amplification (where PCR colonies are derived in a gel matrix, for example), Bridge PCR [36] (primers are covalently linked to a solid-support surface), conventional Solid Phase PCR (where Asymmetric PCR is applied in the presence of solid support bearing primer with sequence matching one of the aqueous primers) and Enhanced Solid Phase PCR [37] (where conventional Solid Phase PCR can be improved by employing high Tm and nested solid support primer with optional application of a thermal ‘step’ to favour solid support priming).
  • Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR): for isolation of an unknown sequence flanking a known sequence. Within the known sequence, TAIL-PCR uses a nested pair of primers with differing annealing temperatures a degenerate primer is used to amplify in the other direction from the unknown sequence. [38]
  • Touchdown PCR (Step-down PCR): a variant of PCR that aims to reduce nonspecific background by gradually lowering the annealing temperature as PCR cycling progresses. The annealing temperature at the initial cycles is usually a few degrees (3-5°C) above the Tm of the primers used, while at the later cycles, it is a few degrees (3-5°C) below the primer Tm. The higher temperatures give greater specificity for primer binding, and the lower temperatures permit more efficient amplification from the specific products formed during the initial cycles. [39]
  • PAN-AC: uses isothermal conditions for amplification, and may be used in living cells. [40][41]
  • Universal Fast Walking: for genome walking and genetic fingerprinting using a more specific ‘two-sided’ PCR than conventional ‘one-sided’ approaches (using only one gene-specific primer and one general primer — which can lead to artefactual ‘noise’) [42] by virtue of a mechanism involving lariat structure formation. Streamlined derivatives of UFW are LaNe RAGE (lariat-dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends), [43] 5’RACE LaNe [44] and 3’RACE LaNe. [45]
  • In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e-PCR) refers to computational tools used to calculate theoretical polymerase chain reaction results using a given set of primers (probes) to amplify DNA sequences from a sequenced genome or transcriptome.

Why do we do nested PCR? - Biologie

Error prone PCR is a method by which random mutants maybe inserted into any piece of DNA. The technique is based on the well founded PCR (polymerase chain reaction), which is a standard technique in many molecular biology laboratories. Normally the replication of DNA by the polymerase is extremely specific,The difference in error prone PCR is that the fidelity of the Taq DNA polymerase is modulated by alteration of the composition of the reaction buffer . In these conditions, the polymerase makes mistakes in the base paring during DNA synthesis that results in the introduction of errors in the newly synthesized complementary DNA strand. By carefully controlling the buffer composition the frequency of mis-incorporation of nucleotide bases, and therefore the number of errors introduced into the sequence may be regulated. In directed evolution experiments, the substitution frequency is normally controlled at around 1 - 3 base pair substitutions per kilobase of DNA.

For the technique to work properly, i t is important to use a Taq DNA polymerase which does not have proof-reading ability. This proof-reading, or auto-correction of nucleotide sequence, is a property that is found in many commercially available Taq DNA polymerases. However, use of a proof-reading DNA polymerase is used in a error prone PCR reaction will result in the automatic correction of the mismatched nucleotides, and any mutations that were introduced during the reaction will be lost.


Schau das Video: 5 Tipů, jak skoncovat s prokrastinací (Kann 2022).