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Optimierung des E. coli-Wachstums in D₂O (Schwerwasser)

Optimierung des E. coli-Wachstums in D₂O (Schwerwasser)


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Ich möchte eine Methode finden, um die Biomasse meines D . zu erhöhen2O-Kulturen, weil meine derzeitige Methode nicht genügend Protein liefert. Ich möchte auch die Menge an H . minimieren2O in meiner Kultur.

Meine aktuelle Methodik ist ein Wachstum von 3 ml im kleinen Maßstab mit 75% D2O und LB wuchsen ungefähr 9 Stunden lang. Diese Kultur wird dann verwendet, um 20 ml 100 % D . auszusäen2O- und M9-Kultur über Nacht und diese gesamte Kultur wird verwendet, um 1L D . auszusäen2O- und M9-Kultur.

Vielen Dank für Ihre Zeit.


Es sieht so aus, als würden Sie $^1mathrm{H}$ sehr strikt vermeiden. Sie können erwägen, Ihre Transformationen auf $mathrm{D}_2mathrm{O}$-Platten zu replizieren (vorher für $mathrm{D}_2mathrm{O}$-Toleranz auswählen).

Ich nehme an, Sie machen Protein-NMR und wollen "dreifache Markierung". Je nachdem, wie spezifisch Ihre Kohlenstoffkennzeichnung ist, möchten Sie Ihre Starterkulturen möglicherweise auf dreifach markiertem Agalhydrolysat (so etwas wie "Bioexpress") züchten Stock) und wenn Ihre Vorspeisen gut wachsen, können Sie für die gleiche Menge von $^2mathrm{H}$,$^{13}mathrm{C}$,$^{15}mathrm{N}$ für springen um $405.


Optimierung des Wachstums von E. coli in D₂O (Schwerwasser) - Biologie

ein Universität Graz, Institut für Molekulare Biowissenschaften, NAWI Graz, 8010 Graz, Österreich, B BioTechMed Graz, 8010 Graz, Österreich, C Exzellenzfeld BioHealth – Universität Graz, Graz, Österreich, D Institut Laue–Langevin, 38043 Grenoble, Frankreich, und e University of Tennessee, Center for Environmental Biotechnology, Knoxville, Tennessee, USA
* Korrespondenz-E-Mail: [email protected], [email protected]

Ein zuvor berichtetes Multiskalenmodell für (Ultra-)Kleinwinkel-Röntgen (USAXS/SAXS) und (sehr) Kleinwinkel-Neutronenstreuung (VSANS/SANS) von lebenden Escherichia coli wurde auf der Grundlage von kompositorischen/metabolomischen und ultrastrukturellen Beschränkungen überarbeitet. Der Zellkörper wird, wie zuvor beschrieben, durch ein Ellipsoid mit mehreren Schalen modelliert. Die von Flagellen ausgehende Streuung wurde jedoch durch einen Begriff ersetzt, der die Oligosaccharid-Kerne des Lipopolysaccharid-Blatts der äußeren Membran einschließlich seiner Kreuzung mit dem Zellkörper berücksichtigt. Dies wurde hauptsächlich durch (U)SAXS-Experimente motiviert, die eine nicht unterscheidbare Streuung für Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Flagellen oder Fimbraen zeigten. Dem überarbeiteten Modell gelang es, USAXS/SAXS- und unterschiedlich kontrastierte VSANS/SANS-Daten von E coli ATCC 25922 über vier Größenordnungen in der Längenskala. Insbesondere bietet dieser Ansatz detaillierte Einblicke in die strukturellen Merkmale der Zellhülle, einschließlich des Abstands der inneren und äußeren Membranen sowie der Streulängendichten aller Bakterienkompartimente. Das Modell wurde auch erfolgreich angewendet auf E coli K12, verwendet für die Originalmodellierung der Autoren sowie für zwei weitere E coli Stämme. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Stämmen in Bezug auf die Bakteriengröße, den Abstand zwischen den Membranen und deren Positionsschwankungen festgestellt. Diese Ergebnisse bestätigen die allgemeine Anwendbarkeit des hier skizzierten Ansatzes zur quantitativen Untersuchung der Wirkung von bakteriziden Verbindungen auf ultrastrukturelle Merkmale gramnegativer Bakterien, ohne dass auf invasive Färbe- oder Markierungsmittel zurückgegriffen werden muss.

1. Einleitung

Escherichia coli gehört zu den am besten untersuchten gramnegativen Bakterienstämmen in den Biowissenschaften, mit zahlreichen Berichten über seine Struktur und Zusammensetzung (Breed & Dotterrer, 1916 Lieb et al. , 1955 Maclean & Munson, 1961 Neidhardt et al. , 1990 Seltmann & Holst, 2002 Silhavy et al. , 2010). Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein unverzichtbares Werkzeug, um die Ultrastruktur der Zelle abzuleiten, d.h. die wenige zehn Nanometer dicke Struktur der bakteriellen Zellwand (Milne & Subramaniam, 2009). Es bedurfte jedoch erheblicher Anstrengungen, um Einschränkungen aufgrund des invasiven Charakters der Technik zu minimieren (Hobot et al. , 1984 Matias et al. , 2003). Darüber hinaus erlaubt TEM keine dynamischen Studien der zellulären Ultrastruktur unter physiologisch relevanten Bedingungen und damit Echtzeit-Einblicke in die Modifikation von E coli durch bakterizide Verbindungen, wie antimikrobielle Peptide. Zeitaufgelöste Kleinwinkelstreuexperimente (Huxley et al. , 1980 ), die strukturelle Heterogenitäten auf der (Sub-)Mikrometer- bis Subnanometer-Längenskala untersuchen können, ohne dass sperrige Etiketten oder invasive Färbetechniken verwendet werden müssen, sind mögliche Lösungen für dieses Problem [siehe z.B. Zemb & Lindner (2002) für einen Überblick über Streutechniken]. In statischen Gleichgewichtsexperimenten wurde die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) beispielsweise verwendet, um die Reaktion von Thylakoidmembranen in lebenden Chloroplasten auf äußere Reize zu untersuchen (Liberton et al. , 2013 Nagy et al. , 2014 ), während eine Hauptkomponentenanalyse von Kleinwinkel-Röntgenstreuungsdaten (SAXS) angewendet wurde, um einen qualitativen Einblick in die Wirkung von Antibiotika auf E coli (von Gundlach, Garamus, Gorniak et al. , 2016 von Gundlach, Garamus, Willey et al. , 2016 ).

Es ist jedoch eine Herausforderung, quantitative Einblicke in die Ultrastruktur einer lebenden Zelle mit SAXS oder SANS zu erhalten. Dies liegt einfach daran, dass beide Techniken einen globalen Durchschnitt des gesamten Zellinhalts liefern, was es sehr schwierig macht, einzelne Mitwirkende herauszugreifen (Semeraro et al. , 2020). Dies kann durch ausgiebige Nutzung der Kontrastvariationsfähigkeiten von SANS angegangen werden. Zum Beispiel Nickel et al. (2017) konnten voll deuteriert wachsen Bacillus subtilis mit Mischungen aus protiierten und deuterierten Fettsäuren gefüttert, die es ihnen ermöglichten, mit SANS nanoskopische Domänen innerhalb der zytoplasmatischen Membran der Bakterien hervorzuheben. Es ist jedoch auch möglich, Einblicke in die zelluläre Ultrastruktur zu erhalten, ohne dass Bakterien in D . gezüchtet werden müssen 2 O. Insbesondere haben wir kürzlich über ein Multiskalenmodell berichtet, das die verstreuten Intensitäten des Lebens erfolgreich beschreibt E coli K12 aus Ultra-SAXS (USAXS), SAXS und SANS Experimenten bei fünf D 2 OH 2 O-Verhältnisse (Semeraro et al. , 2017). Insbesondere wendet das Modell eine Kern-Schale-Beschreibung des Zellkörpers an, die aus einem ellipsoiden zytoplasmatischen Raum und einer mehrschichtigen Zellwand besteht, und beinhaltet Beiträge von Flagellen in Form von selbstvermeidenden Polymerketten (Doi & Edwards, 1988). Es wurde festgestellt, dass die letzte Komponente bei mittleren bis hohen Magnituden des Streuvektors signifikant beiträgt Q .

Wir setzen unsere Bemühungen fort, Techniken der elastischen Streuung zur Nutzung der Ultrastruktur von E coli führte uns zu SAXS-Experimenten an E coli ATCC 25922 mit entweder regulären oder kurzen Geißeln und die ATCC-geißelfreie Mutante Δ fliC mit dem überraschenden Ergebnis von grundsätzlich überlagerbaren Streumustern (siehe Abb. S1 in den Begleitinformationen). Dies veranlasste uns, unser analytisches Formfaktormodell auf der Grundlage robuster Schätzungen der molekularen Zusammensetzung der Bakterien und ihrer strukturellen Integration gründlich zu überarbeiten. Diese Schätzungen umfassen die Größen, Volumina, Konzentrationen und Verteilungen aller wichtigen bakteriellen Komponenten.

Kurz gesagt, die wichtigsten Änderungen unseres überarbeiteten Bakterienmodells sind wie folgt: (i) Einschränkungen für die durchschnittlichen Streulängendichten (SLDs) verschiedener Zellkompartimente wurden abgeleitet, indem ihre konstituierenden Makromoleküle als separate Körper betrachtet wurden, einschließlich Schätzungen der SLDs des Metaboloms und Membran (ii) Beiträge von Flagellen wurden durch die Oligosaccharidkerne von Lipopolysaccharid (LPS) ersetzt, die als gepfropfte Polymere modelliert wurden, und (iii) Variationen des Abstands zwischen den Membranen wurden durch eine log-normale Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion (PDF) zusammen mit Entfernen der vernachlässigbaren Polydispersität über den Zellradius aus dem Modell.

Das Modell wurde gegen USAXS/SAXS- und Kleinwinkel-Neutronenstreuung (VSANS)/SANS-Daten bei zehn verschiedenen Kontrasten von . getestet E coli ATCC 25922, liefert sehr zufriedenstellende Anpassungen über den gesamten Bereich der aufgezeichneten Streuvektorgrößen (3 ×󈇾 𕒷 < Q < 7 nm 𕒵). Diese Tests beinhalten auch ein komplexeres Modell, das ein heterogen strukturiertes Zytosol berücksichtigt und insbesondere die von Ribosomen ausgehende Streuung einbezieht. Unsere Analyse zeigte jedoch, dass der Beitrag der Ribosomen zur Gesamtstreuung von dem der Zellwand überlagert wird. Das neue Modell wurde auch erfolgreich auf USAXS/SAXS-Daten von E coli K12, früher für die Entwicklung unseres Multi-Scale-Modells (Semeraro et al. , 2017 ), sowie der fimbrafreie JW4283 und der Stamm Nissle 1917, die deutliche Unterschiede in den ultrastrukturellen Merkmalen aufzeigen.

Das Papier ist wie folgt aufgebaut. Zuerst fassen wir die experimentellen Methoden und Proben kurz zusammen, bevor wir in Abschnitt 3 die überarbeitete Modellierung detailliert beschreiben, einschließlich einer umfassenden Liste von Zusammensetzungsdaten in den Begleitinformationen. Abschnitt 4 beschreibt ein analytisches Modell für die Streuung von einem heterogenen Zytosol unter Berücksichtigung von Ribosomen und Abschnitt 5 fasst die beteiligten Parameter und die angewandte Optimierungsstrategie zusammen. Ergebnisse der Anwendung der Modellierung auf experimentelle Daten von fünf verschiedenen E coli Stämme werden in Abschnitt 6 beschrieben und diskutiert, bevor wir in Abschnitt 7 abschließen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Bakterienproben

Bakterienkolonien von E coli Stämme ATCC 25922, K12 5K, K12 JW4283 (Baba et al. , 2006) und Nissle 1917 (Sonnenborn, 2016) wurden in Lysogenie-Brühe (LB)–agar (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) Platten bei 310 K gezüchtet. Übernachtkulturen (ONCs) wurden von diesen Kolonien abgeleitet, indem eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Medium (Luria/Miller, Carl Roth) in sterilen konischen Polypropylenröhrchen (15 ml) geimpft wurde, was ein Wachstum unter aeroben Bedingungen für 12&min; 821116 h in einem Schüttelinkubator bei 310 K. Hauptkulturen wurden durch Suspendieren eines Aliquots der ONCs in 10 &# 8197 ml LB-Medium in sterilen konischen 50 &# 8197 ml-Polypropylenröhrchen hergestellt, was ein Bakterienwachstum unter den gleichen Bedingungen wie bei ONCs bis zur Mitte der exponentiellen Wachstumsphase ermöglichte. Die Zellen wurden dann sofort zweimal gewaschen und in nährstofffreier und isotonischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Phosphatpuffer 20'8197 ml) resuspendiert m , NaCl 130 m m ) bei pH 7,4 (Sigma Aldrich, Wien, Österreich). Trübungsmessungen wurden verwendet, um die Bakterienkonzentration zu kontrollieren. Werte der optischen Dichte bei Wellenlänge λ = 600 nm (OD 600 ) wurden mit dem Spektrophotometer Thermo Spectronic Genesys 20 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [OD 600 = 1 ≃ 8 ×󈇾 8 koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter]. In diesen Beispielen entspricht 1 CFU einer einzelnen Zelle. Bei Proben mit D 2 O, Bakteriensuspensionen wurden zweimal mit entweder PBS oder 90 wt% D . gewaschen 2 O PBS-Lösungen, um zwei konzentrierte Stammlösungen für beide Pufferbedingungen zu erhalten. Diese beiden Vorräte wurden gemischt und auf die erforderlichen Bakterienkonzentrationen und D . verdünnt 2 O Inhalt gemäß den experimentellen Einstellungen.

Die Vorbereitung der ATCC-Proben wurde mit größter Sorgfalt durchgeführt, um die Integrität der Flagellen zu erhalten. ATCC-Zellen mit mechanisch fragmentierten Flagellen wurden durch fünfmaliges Scheren der Suspension durch eine 3'197 ml-Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel hergestellt, wie von Turner beschrieben et al. (2012). Die Suspension wurde in PBS gewaschen, um Flagellumfragmente im Überstand zu entfernen.

Die ATCC 25922 Δ fliC Stamm wurde durch Phagentransduktion konstruiert, wie von Silhavy . beschrieben et al. (1984). Der P1vir-Phagen wurde auf dem Stamm YK4516 (Komeda et al. , 1980) unter Verwendung des Plattenlysatverfahrens. YK4516 enthält eine Tn10-Insertion in fliC (fliC5303::Tn10) und wurde vom Coli Genetic Stock Center (Yale University, New Haven, CT, USA) bezogen. Als Empfänger diente der Stamm ATCC 25922. Transduktanden wurden auf tetracyclinhaltigen Platten (10 µg ml𕒵) selektiert und die fli − Der Phänotyp wurde durch Tüpfeln auf halbfesten Agarplatten (0,3% Agarose) bestätigt.

2.2. Versuchsaufbau

2.2.1. USAXS

USAXS/SAXS-Messungen wurden an der TRUSAXS-Beamline (ID02) an der ESRF, Grenoble, Frankreich, durchgeführt. Das Instrument verwendet einen monochromatischen Strahl, der in einer Pinhole-Konfiguration kollimiert wird. Die Messungen wurden mit einer Wellenlänge von 0,0995 nm und Proben-Detektor-Abständen von 30,8, 3,0 und 1,2 m durchgeführt und deckt a . ab Q Bereich von 0.001𔃅 nm 𕒵 (Narayanan et al. , 2018). Die gemessenen zweidimensionalen Streumuster wurden auf einem Rayonix MX170-Detektor erfasst, auf den absoluten Maßstab normiert und azimutal gemittelt, um die entsprechenden eindimensionalen USAXS/SAXS-Profile zu erhalten. Der normalisierte kumulative Hintergrund von Puffer, Probenzelle und Instrument wurde subtrahiert, um das endgültige . zu erhalten ich ( Q ). Proben mit einer Bakterienkonzentration von 󕽺 10  cells ml 𕒵 wurden bei 310 K gemessen und in Quarzkapillaren mit 2 mm Durchmesser, montiert auf einem Durchfluss-Setup, um die Präzision der Hintergrundsubtraktion.

2.2.2. VSANS

VSANS/SANS-Messungen wurden auf dem D11-Instrument am Institut Laue–Langevin (ILL), Grenoble, Frankreich, mit einem mehradrigen 3 He-Detektor von 256 ×� pixeln (3,75 ×𔀵.75& #8197mm). Vier verschiedene Setups (Abstände von Probe zu Detektor von 2, 8, 20,5 und 39 m mit entsprechenden Kollimationen von 5,5, 8, 20,5 bzw. 40,5 m) bei einer Wellenlänge λ = 0,56 nm ( Δ λ / λ = 9%), abgedeckt a Q Bereich von 0,014𔃁 nm 𕒵 . Sehr niedrig zu erreichen Q , eine Kombination aus großer Wellenlänge ( λ = 2,1 nm), zwei fokussierenden MgF 2 Linsen und ein Spiegel zur Aufhebung schädlicher Schwerkrafteffekte (Neutronenverlust bei der Kollimation und Auflösungsverlust durch Schwerkraftverschmierung auf dem Detektor) wurden verwendet der Aufbau wird von Cubitt . beschrieben et al. (2011). Proben (Konzentration 󕽺 10  cells ml 𕒵) wurden bei 310 K gemessen und in Quarz-Hellma 120-QS-Banjo-Küvetten mit 2 mm Weg enthalten. Sie waren auf einem rotierenden Probenhalter montiert, der die Sedimentation der Bakterien verhinderte. Daten wurden mit dem Lampe Programm von ILL, Durchführung von Flat-Field-, Raumwinkel-, Totzeit- und Transmissionskorrektur, Normalisierung durch einfallenden Fluss (über einen Monitor) und Subtrahieren des Beitrags von einer leeren Zelle. Der Versuchsaufbau und die Daten sind unter https://doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-03-910 verfügbar.

2.2.3. Hauseigene SAXS

Für SAXS-Laborexperimente wurde eine SAXSpace Kompaktkamera (Anton Paar, Graz, Österreich) mit einem Eiger R 1 M Detektorsystem (Dectris, Baden-Daettwil, Schweiz) verwendet. Cu  K α (λ = 1,54 Å) Röntgenstrahlen wurden von einem 30 W-Genix 3D-Mikrofokus-Röntgengenerator (Xenocs, Sassenage, Frankreich) bereitgestellt. Die Proben wurden in Glaskapillaren (Durchmesser: 1 mm Anton Paar) aufgenommen und vor der Messung mit einem Peltier-gesteuerten Probentisch (TC 150, Anton Paar) 10  min bei 310 K äquilibriert. Die Gesamtbelichtungszeit betrug 30 min (6 Bilder von 5 min), wobei der Abstand zwischen Probe und Detektor auf 308 mm eingestellt wurde. Die Datenreduktion, einschließlich sektorieller Datenintegration und Korrekturen für Probentransmission und Hintergrundstreuung, wurde mit dem Programm durchgeführt SAXSanalyse (Anton Paar).

2.2.4. Dynamische Lichtstreuung

Die Messungen wurden unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical, Malvern, UK) durchgeführt. ATCC 25922 und K12 5K Proben (Konzentration 󕽺 7  cells ml 𕒵) wurden in Glasküvetten mit 1 cm Schichtdicke suspendiert und bei 310 K äquilibriert. Diese Bakterienkonzentration lieferte ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis und verhinderte Mehrfachstreuungseffekte. Die Daten wurden automatisch von der mitgelieferten Software (Malvern) analysiert, die über eine Standardkumulantenanalyse eine monomodale Wahrscheinlichkeitsverteilung der Bakterienpopulation als Funktion des hydrodynamischen Radius lieferte R h . Jede Verteilung hatte aufgrund der Variationen der Zelllängen während des Wachstums und der Teilung einen durchschnittlichen Polydispersitätsindex von 𕙘,25. Durchschnitt R h Werte und die damit verbundenen Fehler wurden aus 18 Messungen (sechs Frames mit drei verschiedenen Probenvolumina) berechnet. Das Fehlen von Energiequellen in PBS und das kräftige Vortexen der Proben (Fragmentierung von Flagellen) minimierten die Zellmotilität, was den Brownschen Random Walk zur dominierenden Dynamik dieser Probe machte.

3. Gesamtstreuungsbeiträge und Kompositionsmodellierung

Eine ganzheitliche Beschreibung der elastischen Streuung komplexer gramnegativer prokaryotischer Zellen kann abgeleitet werden, indem zunächst ihre vorherrschenden molekularen und supramolekularen Komponenten betrachtet werden, von denen jede einen wohldefinierten Bereich von Längen, Volumina und Dichten aufweist, die als Leitfaden für die Konstruktion einer umfassenden Streuungsformfaktor-Modell. Die hier angewendeten Streuungsbeitragsschätzungen basieren auf den neuesten experimentellen und rechnerischen Berichten über E coli , einschließlich isolierter Zellkomponenten. Insbesondere haben wir Zusammensetzungs- und Strukturinformationen über E coli und seine Zellwand (Neidhardt et al. , 1990 Seltmann & Holst, 2002 Schwarz-Linek et al. , 2016 ) der zytoplasmatische Raum und seine Komponenten (Zimmerman & Trach, 1991 Tweeddale et al. , 1998 Prasad Maharjan & Ferenci, 2003 Bennett et al. , 2009 Guo et al. , 2012 Lebedew et al. , 2015 ) die bakterielle Ultrastruktur (Hobot et al. , 1984 Beveridge, 1999 Matias et al. , 2003 ) die Zusammensetzung und Struktur der Lipidmembran (De Siervo, 1969 Oursel et al. , 2007 Lohner et al. , 2008 Pandit & Klauda, ​​2012 Kučerka et al. , 2012 , 2015 Leber et al. , 2018 ) die LPS-Besonderheiten (Heinrichs et al. , 1998 Müller-Loennies et al. , 2003 Kučerka et al. , 2008 Kim et al. , 2016 Rodriguez-Loureiro et al. , 2018 Micciulla et al. , 2019 ) der periplasmatische Raum (Burge et al. , 1977 Labischinski et al. , 1991 Rosa et al. , 2000 Gan et al. , 2008 ) und die äußeren bakteriellen Bestandteile (Yamaschita et al. , 1998 Whitfield & Roberts, 1999 Stukalov et al. , 2008 Turner et al. , 2012). All diese Informationen wurden in SLDs ρ zusammengefasst, die in Abb. 1 zusammengefasst sind. Eine detaillierte Beschreibung finden Sie in den Begleitinformationen (SI).


Abbildung 1
Schema von E coli Struktur und Zusammensetzung, einschließlich typischer Größen, sowie Röntgen- und Neutronen-SLDs der wichtigsten Bestandteile. Die Bakterienform wird bequem durch ein Ellipsoid modelliert, wie von Semeraro . detailliert beschrieben et al. (2017 ).

Der Vorteil dieser detaillierten Beschreibung wird deutlich, wenn man die Fähigkeit von SANS betrachtet, den Kontrast für eine gegebene molekulare Einheit in Abhängigkeit von dem angewendeten H . zu neutralisieren oder zu verstärken 2 O/D 2 O-Verhältnis. Für homogene Streuer im verdünnten Regime gilt: d.h. wenn ihr Volumenanteil, die Vorwärtsstreuungsintensität, ich (0), bezieht sich auf die Streuinvariante, Q , wie

wo V ist das Volumen des Streuers und 〈 Δ ρ 2 〉 ist der durchschnittliche quadratische Streukontrast (Porod, 1982). Bei inhomogenen Systemen, wie komplexen lebenden Zellen, kann der durchschnittliche Kontrast als volumenfraktionsgewichteter Durchschnitt des Kontrasts jedes Zellkompartiments/-spezies berechnet werden, wobei ϕ ich ist der Volumenanteil des ich te Komponente. Daher sind die Schätzungen ϕ ich und Δ ρ ich ermöglichen uns eine Annäherung Q für alle Bakterienbestandteile [Abb. 2 siehe auch Nickel et al. (2017)]. Diese Näherung führt zu einem "Übereinstimmungspunkt" der gesamten Zelle bei etwa 40 wt% D 2 O. Bei höherem D 2 O-Gehalt wird die Gesamtstreuintensität zunehmend von den Acylketten der Membranlipide dominiert, da diese wasserfrei sind. Zum unteren D 2 O-Gehalte, zytoplasmatische Komponenten, wie Ribosomen und Proteine, sind wiederum die dominierenden Streuungsfaktoren.


Figur 2
Quadratwurzel der geschätzten Porod-Invariante Q als Funktion von D 2 O Gew.-%, berechnet für jede Komponente unter Verwendung von Gleichung (1) und multipliziert mit dem Zellvolumen. Der Einschub zeigt die Unterschiede zwischen dem Beitrag der LPS-Oligosaccharidkerne (durchgezogen grün) und der Flagellen (rosa gestrichelt).

3.1. Multiskaliges Streumodell

Wie bereits berichtet (Semeraro et al. , 2017 ), der Hauptteil von E coli kann durch die Streuamplitude eines Ellipsoids mit mehreren Schalen (Multi-Core–Shell) beschrieben werden:

wo ρ ich sind die SLDs, die durch die Zusammensetzung gegeben werden E coli Durchschnitte jeder Schale der Breite Δ ich ( ρ m +1 ist die SLD des Puffers) ψ ist der Winkel bezogen auf jede mögliche Ausrichtung eines prolaten in Suspension R 1 ist der kleinere Radius des zytoplasmatischen Kerns (CP) und ɛ > 1 ist das Verhältnis zwischen dem großen, ɛ R 1 , und kleinere Radien des Ellipsoids. Außerdem,

ist das Produkt aus Volumen und normierter Streuamplitude des Ellipsoids (Pedersen, 1997), wobei

Trotz der Tatsache, dass Zylinder realistischere Bakterienformmodelle wären, treten bei Prolates keine Instabilitäten während der Anpassung auf und Unterschiede zwischen einer Prolate- oder Zylindergeometrie sind im reziproken Raum vernachlässigbar (Semeraro et al. , 2017). Ein wesentlicher Unterschied zum Vorgängermodell (Semeraro et al. , 2017 ) bezieht sich auf die ρ ich Werte, die als Anpassungsbeschränkungen verwendet werden. Hier betrachteten wir angesichts der verfügbaren Q Streubereich, Streubeiträge jeder makromolekularen Spezies (Proteine, Ribosomen, DNA etc .) einzeln zur Berechnung der durchschnittlichen SLDs. Dies betrifft im Vergleich zu unseren zuvor verwendeten Werten im Wesentlichen die ρ ich Schätzungen des Zytoplasmas – jetzt basierend auf metabolomischer Analyse – und der Phospholipidmembranen (Abb. 1). Im Gegensatz zu elastischen Streuexperimenten an reinen Lipid-Mimetika können Strukturparameter jeder einzelnen Doppelschicht im Rahmen einer Ganzzellanalyse (Semeraro et al. , 2020). Daher ist die Δ ich und ρ ich Werte beider Membranen wurden als feste Parameter betrachtet (siehe Abb.ف mehr Details zu Δ ich und ρ ich sind im SI angegeben).

Der Volumenanteil der Bakteriensuspensionen betrug 𕟨.007, daher ist das Vorhandensein eines interzellulären Strukturfaktors für Wechselwirkungen unwahrscheinlich.

Die wohl deutlichsten Unterschiede zum früheren Modell resultieren aus Flagellen, deren Streuung zuvor in Form eines polymerähnlichen Strukturfaktors hinzugefügt wurde, der signifikante Beiträge zu ich ( Q ) zum Q > 0.06 nm 𕒵 (Semeraro et al. , 2017). Überraschenderweise ist jedoch ein Vergleich der SAXS-Daten der nativen ATCC 25922, ATCC mit physikalisch gebrochenen, kurzen Flagellen (Turner et al. , 2012 ) und die geißelfreie Δ fliC Die ATCC-Mutante zeigte nicht unterscheidbare Streuintensitäten im Q Bereich, von dem bisher angenommen wurde, dass er von Flagellen dominiert wird (Abb. S1). Folglich tragen Flagellen nicht wesentlich zur E coli Streusignal. Beachten Sie, dass die Integrität von Flagellenfilamenten in üblichen Bakterienkulturen nicht garantiert ist, da übermäßiges Zentrifugieren oder unachtsame Probenmanipulationsschritte leicht zu ihrer Fragmentierung führen (Schwarz-Linek et al. , 2016). Auch wenn wir nicht garantieren können, dass die ATCC-Referenzprobe vollständig intakte Geißeln aufwies, wurden die in dieser Arbeit verwendeten Bakteriensuspensionen mit größter Sorgfalt hergestellt. Das gleiche Probenvorbereitungsprotokoll ermöglichte es uns, bewegliche Bakterien (Semeraro et al. , 2018 ), was darauf hindeutet, dass die Flagellenintegrität zumindest bis zu einem gewissen Grad erhalten blieb.

Der Versuch, die fehlenden Streuintensitäten in unserem Multiskalenmodell zu korrigieren, führte dazu, dass wir Beiträge berücksichtigen, die von den inneren und äußeren Kernen des Oligosaccharids (OS) stammen. Zunächst wurde die Funktion durch eine neue Shell modifiziert, die die OS-Kerne beschreibt, was zu nichtphysikalischen Ergebnissen führte (Abb. S2). Insbesondere ρ Röntgen ≃ 15 ×󈇾 𕒸  nm 𕒶 für die OS-Schicht deutete darauf hin, dass Wasser ausgestoßen wird, was mit Neutronenreflektometrie-Experimenten an unterstützten LPS-Schichten unvereinbar ist, die zeigen, dass die Hydratation der inneren und äußeren Kerne reicht von 40 bis 80 vol% (Clifton et al. , 2013 Rodriguez-Loureiro et al. , 2018 Micciulla et al. , 2019). Wir entschieden uns daher, die OS-Kerne in Form von gepfropften Blöcken auf der äußeren Zelloberfläche zu modellieren. Jeder Kern wurde durch ein Gaußsches Kettenpolymer angenähert, was die Anwendung des Polymer-gepfropften Kolloidformalismus erforderte (Pedersen & Gerstenberg, 1996). Der streuende Formfaktor eines solchen Systems ist gegeben durch (Pedersen, 2000 )

wo n Betriebssystem ist die Anzahl der Betriebssystemkerne und β Betriebssystem = V Betriebssystem ( ρ Betriebssystem − ρ BF ) ist das Produkt aus jedem Volumen und SLD-Kontrast zum Puffer,

der Strukturfaktor einer Gaußschen Kette ist und

seine Streuamplitude. x = ( qR g ) 2 , wobei R g ist der Gyrationsradius des OS-Kerns. Der Begriff Φ ( Q ,

wobei gemäß (4) + . Hier, R äußere = R 1 + Δ äußere ist der Radius, der die äußere Oberfläche der Zelle beschreibt.

Die gesamte Streuintensität für eine Suspension von Lebend E coli Zellen der Zahlendichte n liest sich dann als

wo ist der Orientierungsmittelwert und beschreibt die Polydispersität der Dicke des periplasmatischen Raums. Konkret haben wir eine Log-Normalverteilungsfunktion angewendet L ( R ). Die Konstante in Gleichung (9) berücksichtigt den streuenden Hintergrund bei hohem Q aus unbekannten Beiträgen stammen. Die logarithmische Normalverteilung der periplasmatischen Dicke sorgt für die untere Grenze der Intermembranabstandsfluktuationen, die durch die endliche Größe der Zellwandarchitektur gegeben ist. Beachten Sie, dass Variationen der Zellgröße aufgrund von Überparametrisierung nicht berücksichtigt wurden, die Polydispersität über den Zellradius führte zu unbedeutenden Änderungen im mittleren bis hohen Bereich Q Bereich, d.h. Q ≥ 0,05 nm 𕒵 .

4. Betrachtet man ein heterogen strukturiertes Zytosol

Es ist berechtigt zu hinterfragen, ob die interne zytosolische Struktur zumindest teilweise durch SAXS/SANS aufgelöst werden kann. Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine komplexere analytische Streufunktion abgeleitet, die mit experimentellen Daten getestet werden kann.

Betrachten wir zunächst den allgemeinen Fall einer Kugel (Radius: R 0 SLD: ρ 0 ) ausgesetzt in einem Medium von ρ m , enthält n kleinere identische kugelförmige Perlen ( R 1 , ρ 1 ), wobei der relative Abstand zwischen zwei Perlen R ich < R 0R 1 . Die Streuamplitude dieses Systems ist

wo β 0 = ( ρ 0 − ρ m ) V 0 und β 1 = ( ρ 1 − ρ 0 ) V 1 , und V 0 , V 1 , EIN 0 und EIN 1 sind jeweils die Volumina der Kugel und einer einzelnen Perle und die normalisierten Streuamplituden der Kugel und einer Perle. Der Vektor R m definiert alle relativen Abstände zwischen den Innensicken. Der Gesamtformfaktor [ P ( Q ) = | EIN ( Q )| 2 ] liest sich dann als

wobei der erste Term der Formfaktor der Kugel ist, der zweite Term die Gesamtstreuintensität der n interne Perlen und die dritte beschreibt das Kreuzwort zwischen der Kugel und den Perlen. Ein analoger Ansatz wurde für die Modellierung der inneren Struktur eines 'biphasischen' Copolymersystems beschrieben (Keerl et al. , 2009). Hier unter der Annahme R1 << R0 und n → ∞, man kann das Innere dieser Kugel ungefähr als makroskopisches kanonisches System beschreiben. Dies ermöglicht die Anwendung des kanonischen Gesamtmittelwerts auf die Summationen von Gleichung (11) (Klein & D'Aguanno, 1996), was zu

wo S ss ( Q ) entspricht dem Strukturfaktor der Wechselwirkungen zwischen den Kügelchen. Die Summation innerhalb des Integrals definiert die mikroskopische Dichte von n Perlen. Sein Ensemblemittelwert entspricht der Einzelpartikeldichte, die wegen der Translationsinvarianz eines homogenen Systems gleich der mittleren Beaddichte n / V 0 (Klein & D'Aguanno, 1996). Daher ist das ganze Integral einfach gleich N / A 0 ( Q ), was die endgültige Form des Formfaktors des Kugelkügelchensystems ergibt:

Der Kreuzterm wird also durch die normierte Streuamplitude der Kugel moduliert, EIN 0 ( Q ), was einer Faltung einer homogenen Verteilung von Perlen innerhalb des Volumens einer Kugel mit Radius . entspricht R 0 . Wichtig ist, dass diese endgültige Form des Kreuzterms nicht vom ursprünglichen Volumen der Kugel abhängt, die die kleinen Kugeln beherbergt. Das heißt, selbst wenn die Kügelchen auf einen bestimmten Bereich der Kugel beschränkt sind – wie im Fall von Ribosomen, die sich hauptsächlich in die nicht-nukleoide Region des Zytoplasmas aufteilen, – die Skalierung dieses Kreuzbegriffs tut nicht ändern.

Im nächsten Schritt übersetzen wir das sphärische Bead-System auf den Fall eines heterogen strukturierten bakteriellen Zytosols. Dies erfordert einige Näherungen. Ermutigt durch die Tatsache, dass die Streuintensität proportional zum Quadrat des Partikelvolumens skaliert, konzentrieren wir uns zunächst auf Beiträge, die von Ribosomen stammen. Genauer gesagt Ribosomen mit einem Volumen V rb ≃ 2800 nm 3 , eine Gesamtzahl n rb ≃ (1 − 6) ×󈇾 4 und R g = 8,77  nm (Zimmerman & Trach, 1991 Lebedev et al. , 2015 ) sollten bei Röntgenstrahlung oder Neutronen in Abwesenheit von schwerem Wasser die dominierenden zytosolischen Streuer sein (Abb. 2 und SI, für zytoplasmatische Zusammensetzung und Volumenanteile). Zweitens schätzen wir die Streuung von Ribosomen bei sehr niedrigen Q , d.h. im Guinier-Regime bis zum ersten Minimum des Streuformfaktors durch die Streuung einer 'effektiven' Kugel von V rb = 2800  nm 3 mit R rb = 11 nm. Drittens gehen wir davon aus, dass gemischte Wechselwirkungen mit Makromolekülen unterschiedlicher Größe, Form und Nettoladung (zytosolische Proteine) zu einer insgesamt effektiven S ss ( Q ) ≃ 1. Darüber hinaus vereinfachen wir die Cross-Term-Modulation durch ein kompaktes Ellipsoid, vernachlässigen, dass Ribosomen in die Nicht-Nukleotid-Region sequestrieren, und schließen die gepfropften OS-Kerne nicht in den Cross-Term ein.

Dann ist die endgültige Form der gestreuten Intensität unter Berücksichtigung der Beiträge von Ribosomen gegeben durch

wo β rb = V rb ( ρ rb − ρ Zyto ), EIN rb ist die normierte Streuamplitude von Ribosomen, angenähert durch eine äquivalente Kugel und EIN Zyto ist die normalisierte Streuamplitude eines Prolatus, der den zytoplasmatischen Raum beschreibt ( d.h. nur der zentrale Teil des Core–Shell-Systems definiert ).

5. Parametrierungs- und Optimierungsstrategie

Alle Parameter, die benötigt werden, um elastische SAS von zu beschreiben E coli sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Generell unterscheiden wir zwischen Parametern, die vom einzelnen Experiment abhängig sind oder nicht ( z.B. Probenkonzentration, Streukontrast). Experimentspezifische Parameter werden als „lokal“ bezeichnet, während andere als „globale“ Parameter bezeichnet werden.

Tabelle 1
Übersicht der Parameter des überarbeiteten Multiskalenmodells für Live E coli Streuung ( cf . Gleichungen 9 und 14 )

Parameter, die strukturelle Details der zytoplasmatischen Membran (CM) und der äußeren Membran (OM) beschreiben, wurden gemäß den Werten festgelegt, die aus Experimenten und Simulationen an membrannachahmenden Systemen von E coli Zellmembranen (De Siervo, 1969 Oursel et al. , 2007 Lohner et al. , 2008 Pandit & Klauda, ​​2012 Kučerka et al. , 2012 , 2015 Leber et al. , 2018 ), wie in Tabelle 2 aufgeführt (siehe auch Abb. 1 und SI). Diese Entscheidung kann durch das Fehlen eindeutiger Streumerkmale für Q > 0,27 nm 𕒵 , entsprechend Entfernungen von 󕾄 nm. Folglich sind Strukturmerkmale 󖼤 nm, obwohl sie zur Gesamtstreuung beitragen, schwer mit angemessener Genauigkeit aufzulösen. Beachten Sie, dass Membranproteine ​​ähnlich wie Proteine ​​in anderen Kompartimenten als Körper behandelt werden, die individuell zur gestreuten Intensität beitragen und daher nicht zu den durchschnittlichen SLDs der inneren und äußeren Membranen beitragen. Verglichen mit der vom Zellkörper ausgehenden Gesamtstreuung kann gezeigt werden, dass ihr Gesamtbeitrag vernachlässigbar ist. Ebenso die Breite der Peptidoglycan-Schicht (PG), W PG , und der Trägheitsradius des OS-Kerns, R g, OS , wurden nach Analyse ihrer Beiträge auf die in Tabelle 2 angegebenen Werte festgelegt. W PG Werte von 𕙞 nm wurden gemeldet (Matias et al. , 2003 ) und Simulationen im Bereich 2.5𔃅.5 nm (Labischinski et al. , 1991 ) führte zu unbedeutenden Variationen von ρ PG . Darüber hinaus zeigen unsere Schätzungen, dass R g, OS < 1 nm (siehe SI). Variationen seines Wertes innerhalb dieser Einschränkung führen jedoch nicht zu signifikanten Änderungen in unserem Streuungsmodell, da R äußereR g, OS .

Tabelle 2
Liste der festen Parameterwerte

Schließlich wurde das Verhältnis zwischen großen und kleinen Ellipsoidradien, ɛ , für die ATCC- und K12-Stämme festgelegt. Diese Wahl wurde durch das niedrigste verfügbare getrieben Q Bereich, der das Guinier-Plateau der Bakterienstreuung nicht erreicht und somit keine genaue Bestimmung der Zelllänge zulässt. Wir haben daher die dynamische Lichtstreuung verwendet, um zunächst die durchschnittliche Länge abzuschätzen, L C , von , verwenden R g  ≃  R h und typische Werte für R äußere in der Literatur. Dies führte zu  nm und  nm. Das resultierende ɛ  = L C /(2 R äußere ) Werte wurden in einigen Testläufen des Optimierungsverfahrens für USAXS/SAXS-Daten nachträglich verfeinert mit R äußere als einstellbarer Parameter und dann für die detaillierte USAXS/SAXS- und VSANS/SANS-Analyse fixiert, was die in Tabelle 2 angegebenen Werte ergibt.

Aufgrund der Komplexität des Systems und der hohen Anzahl von Parametern wurde die Optimierung der einstellbaren Parameter mit einem Monte-Carlo-genetischen Selektionsalgorithmus (Banzhaf et al. , 1998). Kurz gesagt, der Algorithmus ist in einer Reihe von Schritten schematisiert, die in jedem Zyklus wiederholt werden ( Generation ). Als Schritt Null wurden für jeden Parameter neun Sequenzen mit geringer Diskrepanz (Quasi-Zufallszahlen) erstellt ( Gen ) innerhalb bestimmter Grenzen, basierend auf Zusammensetzungsschätzungen (siehe SI). Neun Parametersätze ( Einzelpersonen ) wurden dann als Eingabe verwendet, um eine gleiche Anzahl möglicher Streuintensitätskurven zu testen (Schritt 1, Auswertung ). Dies beinhaltete die Berechnung von neun standardgewichteten Chi-Quadrat-Werten als

wo n kostenlos ist die Anzahl der freien Parameter und σ ich ist der mit dem gemessenen verbundene Fehler ich Daten, ich zu gegebener Zeit Q ich . Nur die vier Einzelpersonen mit den niedrigsten χ 2 Werten wurden dann ausgewählt (Schritt 2, Auswahl ) um das erste zu generieren Nachwuchs , bestehend aus acht neuen Einzelpersonen die durch zufälliges Mischen der . entstanden sind Gene der vier ausgewählten Eltern (Schritt 3, Rekombination ). Die neue neunte Individuell war eine Kopie des Elternteils mit dem niedrigsten χ 2 Wert (Regel 1: Erbe der Besten ). Nach dem Rekombination , jede einzelne Gen hatte eine endliche Wahrscheinlichkeit, verändert zu werden (Schritt 4, Mutation ). Außerdem bestand eine endliche Wahrscheinlichkeit, ein Ganzes zu ersetzen Individuell mit einem brandneuen Satz zufällig erstellter Gene (Regel 2: der Fremde ). Diese Konstruktion des neuen Nachwuchs beendete den ersten Zyklus, und jeder Individuell wurde erneut anhand der χ 2 Werte ausgewertet (zurück zu Schritt 1). Der Vorgang wurde wiederholt, bis die Änderungen des niedrigsten Werts 25 aufeinanderfolgende weniger als 0,5% betrugen Generationen .

Die Mutation Schritt und Regel 2 ermöglichen es dem Algorithmus, mögliche lokale Minima in der χ 2-Landschaft zu überspringen, während Regel 1 eine schnelle Konvergenz der Anpassung ermöglicht. Beachten Sie, dass mit Ausnahme der Erstellung des Anfangssatzes von Einzelpersonen , wurden im gesamten Algorithmus Pseudozufallszahlen für die Entscheidungsprozesse der Rekombination und Mutation Schritte, und für Regel 2. Beachten Sie auch, dass eine größere Anfangspopulation (>9 Einzelpersonen ) führte zu keinem Rechenzeitgewinn. Jeder neue Pseudozufalls Gen wurde immer auf die anfänglichen Grenzen beschränkt, um den Erhalt einer physikalischen Bedeutung der Ergebnisse zu gewährleisten. Insgesamt wurde jede Streukurve 500 Mal angepasst, und es wurden nur konvergierende Anpassungen (Konvergenzkriterium) verwendet, um Durchschnittswerte und Standardabweichungen für jeden Parameter abzurufen.

Im Fall von SANS ist die Q -abhängige instrumentelle Verschmierung wurde zusätzlich berücksichtigt. Dies wurde mit einer Standardfaltung erreicht

wo g (Q) ist ein normalisiertes Gaußsches Profil der Breite Δ Q ( Q ). Die Δ Q ( Q ) Werte als Funktion von Q waren feste Parameter während der Anpassung und wurden durch die D11-Primärdatenbehandlung bereitgestellt. Im Gegensatz dazu war der Effekt des instrumentellen Verschmierens für SAXS-Daten vernachlässigbar.

6. Ergebnisse und Diskussion

6.1. Globale SAXS/SANS-Analyse

Das überarbeitete Multiskalenmodell wurde anhand von USAXS/SAXS- und VSANS/SANS-Daten getestet E coli Stamm ATCC 25922. Es wurden zehn SANS-Datensätze mit unterschiedlichen Kontrastbedingungen gesammelt, die D 2 O von 0 bis 90 wt% (Schritte von 10 wt%). Die Ergebnisse der kombinierten SAXS/SANS-Datenanalyse sind in Abb. 3 und den Tabellen 3 und S1 dargestellt. Abb. 3 ( ein ) hebt die unterschiedlichen Beiträge des Multi-Core–Shell-Modells, der OS-Kerne und der Summe der beiden Kreuzterme [siehe Gleichung (5)] im USAXS- und SAXS-Regime hervor. Der Streubeitrag der Core–Shell-Funktion, d.h. Zellkörper plus Zellwand, dominiert aufgrund des großen Massenunterschieds gegenüber der Streuintensität, die von den OS-Kernen ausgeht. Der Kreuzterm ist jedoch als Funktion der gesamten Zelloberfläche hauptsächlich für die Modulation der Streuintensitäten zwischen Q ≃ 0,1 nm 𕒵 und Q ≃ 0,3 nm 𕒵 . Dies führt zu einer durchschnittlichen Steigung zwischen Q 𕒵.5 und Q 𕒶 in diesem Regime, das eine typische Signatur von gepfropften Systemen ist, auch „Blob-Streuung“ genannt (Pedersen, 2000). Zuvor wurde dieses Regime als von Flagellen dominiert angesehen, die durch einen Polymerbegriff des selbstvermeidenden Gehens (Semeraro et al. , 2017). Dies beschreibt jedoch nicht die scheinbare Änderung der Steigung bei Q ≃ 0,04 nm 𕒵 und die Streufunktion bei Q ≃ 0.1 nm 𕒵 , das für den ATCC-Stamm spezifisch zu sein scheint (siehe Abb. S3), aber nicht für K12 (siehe unten). Daher ermöglicht der OS-Core-Kreuzbegriff eine vollständige Beschreibung der Q Bereich zwischen 0,03 und 0,2 nm 𕒵 .

Tisch 3
Fit-Ergebnisse für die globalen Parameter, die USAXS/SAXS und VSANS/SANS von . beschreiben E coli ATCC 25922 Stamm

Die Fehler wurden aus den Standardabweichungen des Ensembles konvergierter Fittings berechnet. Siehe Tabelle S1 für Ergebnisse zu lokalen Parametern.


Figur 3
( ein ) USAXS/SAXS-Datenanalyse von E coli ATCC 25922 unter Verwendung von Gleichung (9), wobei Beiträge von verschiedenen Termen hervorgehoben werden (negative Werte des Kreuzterms sind nicht gezeigt). ( B ) Alternative Analyse der gleichen Daten unter Verwendung von Gleichung (14), die Beiträge von Ribosomen zeigt. Der Vergleich mit einer Anpassung nach Gleichung (9) (schwarze gestrichelte Linie) zeigt vernachlässigbare Unterschiede. ( C ) VSANS/SANS-Daten des gleichen Stamms bei ausgewählten D 2 O-Kontraste (siehe Abb. S4 für zusätzliche Neutronendaten). Streukurven wurden zur besseren Sichtbarkeit skaliert.

Versuche, die gleichen Daten mit dem komplexeren Modell unter Berücksichtigung von Ribosomen [Gleichung (14)] abzugleichen, zeigten unbedeutende Streubeiträge der Makromoleküle [Abb. 3 ( B )]. Insbesondere die Anpassungsgüte und die Ergebnisse für das gemeinsame Anpassbare waren innerhalb des Analysefehlers identisch. Somit ist der Ribosomenbegriff zusammen mit seinem zugehörigen Kreuzbegriff im Vergleich zum Zellwandbeitrag vernachlässigbar. Beachten Sie, dass nur SAXS- oder SANS-Daten bei den niedrigsten Gew.-% von D 2 O sind empfindlich, um diesen Beitrag zu testen. SANS-Daten werden durch den Acylkettenbeitrag bei höherem Schwerwassergehalt dominiert ( 2 ). Darüber hinaus bestehen Ribosomen aus Aminosäuren und RNA, die unterschiedlich aufeinander abgestimmt sind, was die Analyse herausfordert. Beachten Sie, dass n rb war der einzige einstellbare Parameter für diese Analyse. V rb und R rb Werte wurden wie in Abschnitt 4 beschrieben festgelegt. Interessanterweise führte das Ergebnis dieses Tests zu einer viel geringeren Anzahl von Ribosomen ( n rb ≃ 500) als unsere Schätzung von n rb ≃ 10 4 nach Zimmerman & Trach (1991) (siehe SI). Dies hängt möglicherweise mit dem geringen Kontrast dieser Moleküle in der lokalen zytoplasmatischen Umgebung zusammen. Da die Skalierung proportional zu n rb ( ρ rb − ρ CP ) 2 verzerren kleine Unterschiede im effektiven Kontrast leicht die Bestimmung der Anzahl der Makromoleküle.

Wichtig ist, dass diese Analyse nicht nur zeigt, dass das effektive Streusignal von Ribosomen vernachlässigbar ist, sondern dass ähnliche Überlegungen auch auf die anderen zytoplamischen Komponenten angewendet werden können. Aufgrund ihrer geringeren Größe (Proteine) oder ihres kleineren Volumenanteils (DNA und RNA) tragen sie jedoch noch weniger zur gesamten Streuintensität bei. Daher sind Techniken der elastischen Streuung nicht geeignet, um unterschiedlich strukturierte Kompartimente innerhalb des Zytosols in lebenden Bakterienzellen zu unterscheiden. Gleiches gilt für Membranproteine ​​(siehe oben) oder Proteine, die im periplasmatischen Raum und in der Peptidoglycanschicht vorhanden sind.

Die Analyse ausgewählter VSANS/SANS-Daten bei ausgewählten Kontrasten ist in Abb. 3 dargestellt ( C ) (der gesamte Satz von Neutronenstreuungsdaten und Anpassungen ist in Abb. S4 dargestellt). Anpassungen unter Verwendung von Gleichung (9) erfassen eindeutig alle Änderungen der Streuintensitäten bei Variation von D 2 O-Konzentrationen, die unseren Modellierungsansatz stark unterstützen. Die resultierenden Parameter, die die Röntgen- und Neutronen-SLD-Profile der Bakterienhülle bilden, sind in Fig. 4 zusammengefaßt, wiederum bei ausgewählten Neutronenkontrasten (siehe Fig. S5 für alle Neutronen-SLD-Profile). Kleine Unterschiede zwischen den Abständen in Röntgen- und Neutronenprofilen sowie globalen Parametern (Tabelle 3) sind auf die biologische Variabilität der Proben zurückzuführen, sind aber mit Ausnahme von n Betriebssystem , immer noch im Vertrauensbereich der Ergebnisse. Bei 10 wt% D 2 O, die Kontrastunterschiede zwischen verschiedenen Platten sind mit denen aus SAXS-Daten vergleichbar. Die Streuintensitäten waren in diesen Fällen auch hinsichtlich der Streueigenschaften bei vergleichbar Q ≃ 0,1 und 0,3  nm 𕒵 (Abb. 3). Bei 40 D . wiederum 2 O wt% (und ähnlich bis zu 90 wt% D 2 O), der Kontrast von stark hydratisierten bakteriellen Unterkompartimenten (PG-Schicht etc .) ist viel geringer als der Hauptkontrast der hydrophoben Bereiche der beiden Membranen [Abb. 4 ( B )]. Diese Eigenschaft führt zur Verschiebung des Streumerkmals von Q ≃ 0,27 nm 𕒵 to Q ≃ 0,2 nm 𕒵 [Abb. 3 ( C )], die hauptsächlich mit dem Abstand zwischen den Membranen zusammenhängt. Dies stimmt qualitativ gut mit der invarianten Abschätzung überein (Abb. 2), die darauf hindeutet, dass die Streuintensität durch den Beitrag der Acylkettenregion für D . dominiert wird 2 O ≥ 40 wt%.


Figur 4
( ein ) Röntgen-SLD-Profil der bakteriellen Ultrastruktur des Stammes ATCC 25922, entsprechend der in Abb. 3 gezeigten Anpassung ( ein ). Das Panel hebt die durchschnittlichen Positionen sowohl der zytoplasmatischen als auch der äußeren Membran und der Peptidoglycanschicht hervor. Die Abszisse beschreibt den Abstand vom Zellmittelpunkt entlang des Nebenradius R . ( B ) Ausgewählte Neutronen-SLD-Profile desselben Stammes [ cf . Abb. 3 ( C )]. Siehe auch Tabelle S1.

Um unsere Modellierungsstrategie zu testen, berichten wir die Variation der verschiedenen SLDs mit D 2 O Inhalt. Da das Lösungsmittel frei in den zytoplasmatischen und periplasmatischen Raum gelangt, sollten solche Plots eine lineare Abhängigkeit aufweisen. Tatsächlich folgten die Trends dem erwarteten Verhalten, wodurch wir auch die Matchpoints für die einzelnen Kompartimente berechnen konnten [Abb. 5 ( ein )𔃃 ( C )]. Beachten Sie, dass die SLD-Werte der hydratisierten Phospholipid-Kopfgruppen fixiert waren (Tabelle 2). Im Fall von β Betriebssystem , werden Streubeiträge durch das aus dem Membranabstand für D . stammende Signal verdrängt 2 O < 60 wt%. Der lineare Trend für β Betriebssystem wurde daher im Bereich 0󔼺 wt% bestimmt und dann auf höhere D . extrapoliert 2 O-Konzentrationen unter Verwendung einer Vertrauensgrenze von . Die Ergebnisse dieser Analyse wurden verwendet, um die gemessene effektive Invariante als Funktion von D . abzuleiten 2 O Gew.-% [Abb. 5 ( D )]. Der Vergleich mit den geschätzten Q zeigt eine Verschiebung des Minimums von den geschätzten 40 wt% zu den gemessenen 50 wt% D 2 O, möglicherweise aufgrund eines größeren Beitrags der Komponenten, die bei D . dominieren 2 O ≤ 30 wt% (Abb. 2). Andererseits sind diese Komponenten genau die Makromoleküle, von denen nachgewiesen wurde, dass sie einen vernachlässigbaren Streubeitrag haben.


Abbildung 5
( ein ), ( B ) Plots der Zytoplasma (rote Kreise), Periplasma (grüne Quadrate) und Peptidoglycan (orange Dreiecke) SLDs, zusammen mit linearen Anpassungen und passenden Punkten. Die SLDs der Phospholipid-Kopfgruppenschichten waren feste Parameter (blaue Dreiecke). ( C ) Handlung der β Betriebssystem (lila Kreise) Werte, zusammen mit linearen Anpassungen und übereinstimmenden Punkten. ( D ) Vergleich zwischen geschätzter Streuinvariante und extrapolierter Vorwärtsstreuung.

Die Antwort auf dieses Paradox kann in Abwesenheit eines Nettogrößenunterschieds zwischen Makromolekülen gefunden werden, die einzeln streuen und in den SLD-Durchschnitten enthalten sind. Die Übertragung der Molekularmassenverteilung aus der Gelfiltration zytosolischer Proteine ​​(Zimmerman & Trach, 1991) in eine Größenwahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion ergibt einen Maximalwert bei der kleinsten in unseren Experimenten nachgewiesenen Proteingröße (siehe SI). Daher ist es wahrscheinlich, dass ein Bruchteil der kleinsten bakteriellen Proteine ​​im Parameter ρ . enthalten sein muss CP . Unsere angepassten Werte für ρ CP sind tatsächlich sowohl bei der SAXS- als auch bei der SANS-Analyse größer als die geschätzten SLDs der Metaboliten (vgl. Abb. 1 und Tabelle S1). In jedem Fall diente die geschätzte Invariante nur als wertvoller Leitfaden für unsere Modellierung. Offensichtlich verliert Gleichung (1) ihre Gültigkeit im Fall von dichten und überfüllten Suspensionen, und für verbesserte Schätzungen sollte eine neue Formel verwendet werden, die jeden Volumenanteil berücksichtigt (Porod, 1982).

6.2. Vergleich zwischen ATCC und K12-verwandten Stämmen

Nach erfolgreicher Verifikation unseres überarbeiteten Multi-Scale-Modells für Live E coli ATCC haben wir getestet, ob das neue Modell auch auf andere anwendbar ist E coli Stämme. Abb. 6 zeigt die USAXS/SAXS-Daten der Stämme K12 5K, JW4283 und Nissle 1917 im Vergleich zu ATCC. Auffallend ist, dass die Streumuster von K12 5K, JW4283 (der Fimbria-frei ist) und Nissle 1917 überlagert werden können Q > 0,06 nm 𕒵 , was darauf hindeutet, dass die wichtigsten ultrastrukturellen Merkmale in diesen Stämmen konserviert sind und bestätigt, dass das Vorhandensein von Fimbrien nicht zu SAXS beiträgt. Beachten Sie auch, dass unser Vorgängermodell perfekt zu allen K12-Stämmen passen würde. Unterschiedliche Minimalpositionen der Streuintensitäten bei niedrigeren Q Die Werte sind stattdessen auf die unterschiedlichen Größen der verschiedenen Stämme zurückzuführen.


Abbildung 6
Multiskalenanalyse von USAXS/SAXS-Daten der ATCC-, K12-, Fimbrien-freien K12 JW4283- und Nissle 1917-Stämme. Der Einschub zeigt die Plots des log-normalen PDFs von Δ OM Werte für ATCC (durchgehend rot) und K12 (gestrichelt grün) Stämme. Die PDFs von JW4283 und Nissle 1917 sind mit K12 vergleichbar und werden daher nicht gezeigt.

Wichtig ist, dass unser neues Modell in der Lage ist, alle Dehnungen anzupassen, wie die insgesamt hervorragende Übereinstimmung mit experimentellen Daten zeigt (Abb. 6). Die aus dieser Analyse resultierenden Strukturparameter sind in den Tabellen 4 und S2 angegeben. Die meisten dieser Parameter sind von vergleichbarer Größenordnung. Wesentliche Unterschiede betreffen die Zellgröße ( R , ɛ ) – wie in den verschiedenen Positionen der Streuminima beobachtet (Abb. 6 ), die Anzahl der OS-Kerne ( n Betriebssystem ) und der Zwischenmembranabstand ( Δ OM , σ OM ). Die letzte bezieht sich auf die tatsächliche periplasmatische Raumdicke über Δ OM = (2 W MICH + D CM + D OM )/2 (siehe Abb. S6 für die Röntgen-SLD-Profile). Sowohl die periplasmatische Dicke als auch ihre Fluktuation sind bei K12-verwandten Stämmen geringer als bei ATCC. Beachten Sie, dass Δ OM für K12 5K stimmt mit unserem zuvor gemeldeten Wert für einen ähnlichen Stamm (Semeraro et al. , 2017). Trotz der unterschiedlichen Δ OM und σ OM für ATCC- und K12-Stämme die Größe der relativen Schwankungen σ OM / Δ OM ≃ (0,16– 0,22) ist grob konserviert.

Tabelle 4
Anpassungsergebnisse für den Satz lokaler freier Parameter für die USAXS/SAXS-Analyse der Stämme ATCC 25922, K12 5K, JW4283 und Nissle 1917

Unter Berücksichtigung der Zellgrößenunterschiede finden wir je nach Zelloberfläche eine Reihenfolge, die K12 5K (2.8 ×󈇾 6  nm 2 ) < Nissle 1917 (3,3 ×󈇾 6 & #8197nm 2) ≃ ATCC 25922 (3,4 ×󈇾 6  nm 2) < JW4283 (4,5 ×󈇾 6  nm 2). Es wird erwartet, dass Unterschiede in der Zellgröße an die Anzahl der LPS-Moleküle gekoppelt sind, die das äußere Segel der Zellhülle dominieren. In der Tat, n Betriebssystem folgt ungefähr der für die bakterielle Außenfläche beobachteten Reihenfolge (Tabelle 4). Normalisieren n Betriebssystem Werte durch die bakterielle Außenfläche führt zu einer LPS-Oberflächendichte von 1,3𔂿,5 nm 𕒶 . Da die Querschnittsfläche pro LPS jedoch 𕙙.6 nm 2 (Clifton et al. , 2013 Micciulla et al. , 2019 Kim et al. , 2016 ), beträgt die erwartete Oberflächendichte 𕙘.6 nm 𕒶 . Die Diskrepanz zwischen den beiden Schätzungen ist höchstwahrscheinlich auf eine Unterschätzung der Bakterienoberfläche unter Berücksichtigung der prolaten Näherung oder auf Unsicherheiten zurückzuführen, die durch β . eingeführt wurden Betriebssystem , die, wie n Betriebssystem , skaliert Streubeiträge von Oligosacchariden und deren Kreuzterme [Gleichung (5)]. Ein zusätzlicher Faktor könnte mit der Rauheit der Bakterienoberfläche zusammenhängen (Alves et al. , 2010 ), was zu einer größeren effektiven Fläche führt als hier in unserer einfachen Abschätzung berücksichtigt.

Schließlich ist der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen der PG-Schicht und dem OM Δ PG ≃ 17 nm, mit einem Röntgen-SLD ρ PG ≃ 10.2 ×󈇾 𕒸  nm 𕒵 für alle derzeit untersuchten E coli Stämme. Zuvor haben wir Δ . gemeldet PG ≃ 11 nm (Semeraro et al. , 2017), was eher mit der Länge der Lipoproteine ​​übereinstimmt, die die Peptidoglycanstränge mit der äußeren Membran vernetzen. Diese Abweichung vom erwarteten Wert könnte auf die Schwankungsmodi von Δ . zurückzuführen sein PG die nicht vollständig mit denen von Δ . korrelieren OM , die hier durch eine Log-Normalverteilungsfunktion modelliert wird. Entwicklung einer separaten/teilweise gekoppelten Verteilungsfunktion für Variationen von Δ PG , liegt jedoch außerhalb der gegenwärtigen experimentellen Auflösung. Im Gegensatz dazu stimmt unser neuer Wert für (und auch für ATCC) jetzt mit den berichteten Hydratationswerten der Peptidoglycanschicht überein. d.h. 80󈟆 vol% (Labischinski et al. , 1991 Rosa et al. , 2000). Der zuvor gemeldete Wert 󕽻.6 ×󈇾 𕒸  nm 𕒵 schloss das Vorhandensein makromolekularer Spezies im SLD-Durchschnitt ein.

7. Fazit

Die Ähnlichkeit der SAXS-Daten von nativen und Flagellum-/Fimbrien-freien E coli Belastungen führten uns dazu, unser zuvor berichtetes Streuungsformfaktor-Modell (Semeraro et al. , 2017 ) des gramnegativen Bakteriums E coli . Der Beitrag der Geißeln wurde ersetzt, indem die Streuung von den inneren und äußeren Oligosaccharidkernen der Lipopolysaccharide im Sinne eines Pfropfpolymermodells betrachtet wurde. Das hier vorgestellte Modell basiert auf detaillierten kompositorischen und strukturellen Schätzungen charakteristischer Längen, Volumina und Streulängendichten für jede zelluläre Komponente und vereint damit jahrzehntelange Forschung zu E coli Ultrastruktur und molekulare Zusammensetzung zu einer einzigen umfassenden Streufunktion. Die Anwendbarkeit des abgeleiteten Modells auf Röntgen- und Neutronenstreuungsexperimente ermöglicht die Verwendung der leistungsstarken Technik der Kontrastvariation, um Beiträge von spezifischen Bakterienkompartimenten hervorzuheben oder zu annullieren.

Interessanterweise fanden wir, dass kombinierte (U)SAXS/(V)SANS-Experimente nicht auf die strukturelle Heterogenität des Zytoplasmas reagieren, da das Streusignal seiner konstituierenden Makromoleküle durch den Beitrag der Zellhülle überlagert wird. Ebenso ist die kombinierte Analyse nicht in der Lage, Unterschiede im Sub-Nanometer-Bereich, insbesondere für zytoplasmatische oder äußere Membranen, wie Dicke oder Zusammensetzungsasymmetrie, um nur einige zu nennen, zu berichten. Die zugrunde liegenden SLD-Variationen für CM und OM wurden daher zusammen mit der Breite der Peptidoglycanschicht und der effektiven auf die in Tabelle 2 aufgeführten Werte festgelegt R g jedes Oligosaccharidkerns. Unsere Technik ist wiederum hochempfindlich gegenüber der Gesamtzellgröße, dem durchschnittlichen Kontrast des zytoplasmatischen und periplasmatischen Raums und der Struktur der Zellhülle. Letztere umfasst den Abstand zwischen zytoplasmatischer und äußerer Membran sowie deren durchschnittliche Fluktuationen und den Abstand zwischen der Peptidoglycanschicht und der äußeren Membran. Eine mögliche Einschränkung unseres Modells besteht darin, dass die Parameter β Betriebssystem , n Betriebssystem und Δ PG kann nur qualitativ bestimmt werden.Insbesondere wird die Gesamtzahl der LPS-Moleküle (Oligosaccarid-Kerne) durch die Annäherung an die Hülle des Bakteriums durch eine ellipsoide Oberfläche beeinflusst, während der Abstand zwischen der Peptidoglycanschicht und der äußeren Membran von der verwendeten Intermembranabstandsverteilungsfunktion abzuhängen scheint. Insgesamt zeigt sich die Robustheit unseres Modells durch eine hervorragende Übereinstimmung der abgeleiteten Parameter mit einer umfangreichen Literatur über E coli Ultrastruktur.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass elastische Streuexperimente an lebenden E coli liefern Ensemble-gemittelte Werte spezifischer ultrastruktureller Bakterienmerkmale ohne die Notwendigkeit einer invasiven Markierung und ergänzen die Transmissionselektronenmikroskopie oder optische Mikroskopie. Hier berichten wir über Unterschiede zwischen fünf E.  Stämme, die hauptsächlich auf die Gesamtgröße und die Intermembranabstände zurückzuführen waren (Tabelle 6). Zukünftige Forschungen können diese Plattform nutzen, um die Auswirkungen unterschiedlicher Wachstumsbedingungen der Proben oder die Auswirkungen bakterizider Verbindungen wie Antibiotika zu erkennen. Insbesondere die Kombination unserer Analyse mit zeitaufgelösten (U)SAXS im Millisekundenbereich ermöglicht eine kinematographische Erfassung ihrer Aktivität. Unser Labor untersucht derzeit einen solchen Ansatz für antimikrobielle Peptide. Wir stellen auch fest, dass die Entwicklung analoger Modelle für verschiedene Stämme (einschließlich grampositiver Bakterien, anderer einfacher Organismen und Zellen) eine ähnliche Qualität komplementärer Informationen erfordert, um geeignete physikalische Beschränkungen für die einstellbaren Parameter festzulegen. Nichtsdestotrotz bietet das hier vorgestellte Modell Wege und Leitlinien, wie solche Bemühungen angegangen werden können.

Zusätzliche Informationen

Danksagung

ESRF – Das Europäische Synchrotron und das Institut Laue–Langevin (ILL) sind für die Bereitstellung von SAXS (Vorschlag LS-2869) bzw. SANS (Exp. 8-03-910) anerkannt. Die Autoren danken auch der Laborunterstützung der Besucher des EMBL Grenoble für die Bereitstellung des Zugangs zu den Laborgeräten für die Vorbereitung von Bakterienproben während der SAXS- und SANS-Experimente. Die Autoren danken T. Narayanan für die Unterstützung der USAXS/SAXS-Messungen sowie für fruchtbare Diskussionen und Ratschläge sowie N. Malanovic für die Weitergabe ihres Fachwissens über Bakterienkulturen. Schließlich danken die Autoren den Mitarbeitern des Instituts für Molekulare Biowissenschaften, der Strahllinie ID02 und des D11-Instruments für die Unterstützung und Verfügbarkeit.

Förderinformationen

Diese Arbeit wurde im Rahmen des FWF-Projekts Nr. P30921 (verliehen an KL) durchgeführt.

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Einführung

Die Proteinphosphorylierung spielt eine wesentliche Rolle bei der Signalübertragung von Zellen, und ihre Fehlregulation kann pathologische Folgen haben. 1,2 Große Anstrengungen wurden auf die globale Analyse von Proteinphosphorylierungsstellen und auf die Enzyme gerichtet, die die Besetzung von Phosphositen kontrollieren. 3 Während die am besten untersuchten phosphorylierten Aminosäurereste Serin, Threonin und Tyrosin sind, wurde die Phosphorylierung anderer Aminosäuren beobachtet und ist in einigen Fällen seit vielen Jahrzehnten bekannt. 4𢄦 Insbesondere Phosphohistidin (pHis) wurde erstmals vor über 50 Jahren in Mitochondrien der Rinderleber entdeckt, 7 und wurde seitdem auch in anderen eukaryontischen und prokaryontischen Systemen nachgewiesen. In Prokaryoten spielt pHis eine wichtige Rolle in Zwei-/Mehrkomponenten-Signalsystemen und bei der Erleichterung der Zuckeraufnahme durch das Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System (PTS). 8,9 In Eukaryoten wurde pHis als dynamische regulatorische Modifikation oder als direkter enzymatischer Teilnehmer im Zusammenhang mit Chromatin, zentralem Kohlenstoffmetabolismus und Ionenkanalaktivität beobachtet. 4 Dennoch ist im Gegensatz zu Phosphoserin (pSer), Phosphothreonin (pThr) und Phosphotyrosin (pTyr) noch relativ wenig über die pHis-Modifikation bekannt. Fortschritte bei der Untersuchung von pHis wurden erheblich durch den Mangel an verfügbaren Forschungsinstrumenten 4 aufgrund der labilen Natur der pHis-Phosphoramidat-Einheit behindert. Die Hydrolyse des Phosphoramidats in pHis setzt ungefähr die doppelte Energie des Phosphoesters von pSer, pThr oder pTyr frei (Δg° der Hydrolyse � bis � kcal/mol vs 𢄦.5 bis 𢄩,5 kcal/mol). Dementsprechend wird pHis unter sauren Bedingungen schnell zu Phosphorsäure und Histidin mit einer Halbwertszeit von 㰰 s in 1 M HCl hydrolysiert. Somit hat die leichte Dephosphorylierung von pHis Studien der pHis-Biologie extrem schwierig gemacht. 4

Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat unser Labor kürzlich Antikörper entwickelt, die pHis erkennen können. Zunächst entwickelten wir einen sequenzspezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen phosphoryliertes Histon H4 unter Verwendung eines synthetischen Histon-H4-Peptids mit dem stabilen Analogon Phosphoryltriazolylalanin (pTza). 10 Vor kurzem haben wir einen sequenzunabhängigen (pan) pHis-Antikörper unter Verwendung des kleinen Moleküls Phosphoryltriazolylethylamin (pTze) als Hapten hergestellt. 11 Mit diesem pan-pHis-Antikörper haben wir zusammen mit massenspektrometrischen (MS) Analysen die Histidinphosphorylierung von Escherichia coli PEP-Synthase (PpsA) und die Veränderungen des Niveaus dieser Modifikation als Funktion des Zellzustands. 11 Im Verlauf dieser Studie stellten wir fest, dass pHis-Peptidionen bei der Fragmentierung durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) durchweg eine Reihe ausgeprägter Neutralverluste aufwiesen.Insbesondere beobachteten wir einen markanten neutralen Verlust von 98 Da durch CID, der mit früheren Beobachtungen anderer übereinstimmt, 12� mit zusätzlichen Verlusten von 80 und 116 Da. Tatsächlich dominierten diese neutralen Verluste oft den Ionenstrom in den MS/MS-Spektren, was zu einer verringerten Effizienz der Peptidrückgratfragmentierung und der nachgeschalteten Identifizierung durch Datenbanksuchmaschinen führte.

Der neutrale Verlust von Phosphorsäure (𹒘 Da) durch CID ist seit langem als Kennzeichen von Peptiden mit pSer und pThr bekannt. 16 Der Verlust von Phosphorsäure erfolgt an der pSer- oder pThr-Reststelle durch β-Eliminierung oder einen ladungsgerichteten Mechanismus, der ausgenutzt wurde, um die Phosphorylierungsstelle des Phosphopeptids zu bestimmen. 17,18 Für pHis-Peptide ist der CID-induzierte Neutralverlust von 80 Da nicht überraschend, da dies einen Verlust von HPO . darstellt3 nach Fragmentierung der labilen P–N-Bindung im pHis-Rest. Die Beobachtung von 𹒘 Da als dem prominentesten CID-induzierten Neutralverlust für pHis-Peptide ist jedoch rätselhaft. Es deutet darauf hin, dass zusätzlich zum Verlust von HPO3 (𹒀 Da) durch Fragmentierung an der labilen P–N-Bindung geht eine zusätzliche Wassereinheit (𹐘 Da) irgendwie gleichzeitig aus dem Peptid an einer anderen Stelle als dem Histidinrest verloren.

Um dieses Rätsel zu lösen, untersuchten wir hier den Gasphasen-Reaktionsmechanismus des pHis-Peptids 𹒘 Da neutraler Verlust unter Verwendung von Isotopenmarkierung und Peptidfragmentierung unter CID-Bedingungen. Darüber hinaus haben wir das Muster der neutralen Verluste von pHis-Peptiden, das wir durch CID beobachten (dominanter Verlust von 98 Da und begleitende Verluste von 80 und 116 Da), ausgenutzt, um unsere Fähigkeit zu verbessern, pHis-Peptide aus proteomischen Proben nachzuweisen und zu charakterisieren. Zu diesem Zweck haben wir ein Software-Tool namens TRIPLET entwickelt, um MS/MS-Spektren zu identifizieren, die das charakteristische CID-Neutralverlust-Triplettmuster (𹒘, 𹒀 und � Da) von pHis-Peptiden aufweisen. Wir haben auch einen MS-basierten Workflow entwickelt, der dieses Softwaretool auf zwei Arten einbezieht: (1) um die Zuordnung von CID-MS/MS-Spektren in der Datenbank zu pHis-Peptiden zu unterstützen, und (2) um potenzielle pHis-Peptide für die anschließende erneute Analyse durch . zu kennzeichnen LC–MS mit alternativen Fragmentierungstechniken. Schließlich haben wir diesen Arbeitsablauf in Verbindung mit der ersten berichteten Anreicherung von pHis auf Peptidebene durch Immunpräzipitation mit einem pan-pHis-Antikörper eingesetzt, um eine globale MS-basierte proteomische pHis-Analyse von E coli Zellen.


Ergebnisse

Modellbau.

Hier beschreiben wir die Rekonstruktion unserer berechenbaren Multiskalen-Beschreibung von ROS-Schäden an Metalloproteinen. Multiskalen bedeutet hier, dass wir Reaktionen modellieren, die an den Prozessen der Proteinexpression (langsam) und des Stoffwechsels (schnell) beteiligt sind, wie zuvor beschrieben (9). Diese Raten können 15 Größenordnungen umfassen, daher verwenden wir spezialisierte (Quad-Precision) Solver, um stationäre Lösungen zu berechnen (10). Wir beginnen mit einer veröffentlichten Rekonstruktion von E colis integrierte metabolische und makromolekulare Expressionsnetzwerke (ME) (11). Dieses ME-Modell berücksichtigt 1.678 Gene, 7.031 Metaboliten und 12.655 Reaktionen. Das Modell umfasst eine detaillierte Pfadrekonstruktion für Transkription, Translation, Komplexbildung und prothetische Gruppenanpflanzung (12 ⇓ –14). Das Modell bildet auch Proteinkomplex-Metall-Stöchiometrien ab, darunter 43 Komplexe, die einkernige Eisen- oder Eisen-Schwefel-Cluster enthalten. Wir rekonstruieren ROS-basierte Schadens- und zelluläre Reparaturprozesse für diese Metalloproteine ​​und liefern das OxidizeME-Modell (Abb. 1), wie unten beschrieben.

OxidizeME: eine mehrskalige Beschreibung des Stoffwechsels und der makromolekularen Expression, die für die Schädigung von Makromolekülen durch ROS verantwortlich ist. (EIN) Mononukleare Fe(II)-Proteine ​​werden durch ROS demetalliert und mit alternativen zweiwertigen Metallionen fehlmetalliert. (B) Eisen-Schwefel-Cluster werden oxidiert und repariert. (C) Nicht eingebautes Fe(II) reagiert spontan mit H2O2 über die Fenton-Chemie, wodurch Hydroxylradikale erzeugt werden, die die DNA schädigen, während das Dps-Protein nicht eingebautes Eisen speichert und die DNA vor Schäden schützt. (D) Proteinstruktureigenschaften werden berechnet, um die Wahrscheinlichkeit einer Metall-Cofaktor-Schädigung durch ROS (RSA: relative Lösungsmittelzugänglichkeit) abzuschätzen. (E) Prozesse in ANZEIGE sind in ein oxidatives Multiskalenmodell mit dem Namen OxidizeME integriert. OxidizeME wird verwendet, um den Umfang makromolekularer Schäden und die zelluläre Reaktion auf unterschiedliche intrazelluläre Konzentrationen von Superoxid, Wasserstoffperoxid und zweiwertigen Metallionen (Fe(II), Mn(II), Co(II), Zn(II)) zu berechnen SI-Anhang für Details.

Zuerst definieren wir mathematische Ausdrücke, um die Schädigung von Eisen-Schwefel-(Fe-S)-Clustern durch Superoxid und H 2 O 2 quantitativ zu beschreiben. Die Nettoreaktionen für Fe-S-Clusterschäden sind (4) [ 4Fe - 4S ] 2 + + O 2 ⋅ − + 2 H + → [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 2 + + H 2 O 2 , [ 4Fe - 4S ] 2 + + H 2 O 2 + 2 H + → [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 3 + + 2 H 2 O . Unter der Annahme, dass die ROS-Konzentration [ ROS ] KM , hängt die Rate der Fe-S-Clusterschädigung v dmg von [ ROS ] , der Geschwindigkeitskonstanten k cat / KM dmg und der Fe-S-Proteinkonzentration E ab, v dmg = k cat KM dmg [ ROS ] ⋅ E = k cat KM dmg [ ROS ] v dil / μ , [1] wobei μ die spezifische Wachstumsrate der Zelle in h −1 und v dil die Verdünnungsrate des Proteins ist.

Zweitens beschreiben wir die Fe-S-Clusterreparatur. Wir nehmen an, dass yggX (15) oder ytfE (16) repariert Fe-S-Cluster mit NADH als Elektronendonor und definiert die Nettoreparaturreaktion: [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 2 + + NADH → [ 4Fe - 4S ] 2 + + NAD + . Die Reparaturgeschwindigkeit v Reparatur wird durch die Konzentrationen der Menge der Reparaturproteine ​​R = < YggX, YtfE > und deren Geschwindigkeitskonstanten der Fe-S-Clusterreparatur k Reparatur eingeschränkt: v Reparatur ≤ ∑ j ∈ R k Reparatur , j ⋅ E j = ∑ j ∈ R k Reparatur , j ⋅ vj dil / μ . [2] Drittens beschreiben wir die Demetallierung und Fehlmetallierung von mononuklearen Eisenmetalloproteinen. Unter der Annahme [ ROS ] ≪ KM , ist die Demetallierungsrate des Proteins j durch die ROS k ∈ O = < O 2 ⋅ − , H 2 O 2 > definiert als vjk demet = kjk demet [ ROS ] vj dil / μ , [3] wobei kjk demet die Demetallisierungsratenkonstante ist. Um als nächstes die Fehlmetallierung durch konkurrierende Metalle zu beschreiben, nehmen wir an, dass die Metallierung schnell erfolgt und nahe am Gleichgewicht liegt (17). Wir verwenden die Metall-Protein-Stabilitätskonstante von Metall i ( β j i ) relativ zu β j Fe , zusammen mit den relativen Metallkonzentrationen ( [ Metal i ] / [ Fe ( II ) ] ). Wir definieren dann die Geschwindigkeit, mit der Protein j mit Metall i metalliert wird, als v j Metall, i = β j i [Metall i] β j Fe [Fe(II)] ∑ k ∈ O v j k demet + v j dil. [4] Wir betrachten die Menge der alternativen Metalle M = < Mn ( II ), Co ( II ), Zn ( II ) >. Anschließend skalieren wir die katalytische Effizienz k eff der alternativ metallierten Enzyme basierend auf Schätzungen aus veröffentlichten Daten (18, 19).

Schließlich formulieren wir ein Optimierungsproblem, um den metabolischen und proteomischen Zustand von . zu berechnen E coli unter ROS-Stress. Im ursprünglichen ME-Modell wird der Flusszustand (v) – für metabolische und makromolekulare Expressionsreaktionen – der die Wachstumsrate maximiert, berechnet durch Lösung des Problems (10, 11) max μ , v μ abhängig von S ( μ ) ⋅ v = 0 , l ≤ v ≤ u , [5] wobei S ( μ ) eine stöchiometrische Matrix ist, die Koeffizienten enthält, die von μ abhängen, und l, u untere und obere Flussgrenzen sind. In OxidizeME ist das entsprechende Problem folgendes: max μ , v μ abhängig von S ( μ ) ⋅ v = 0 , l ≤ v ≤ u , vj dmg − vj Reparatur − vj dil = 0 , ∀ j ∈ D , vj dmg = k Kat KM j dmg [ ROS ] vj dil / μ , ∀ j ∈ D , vj dil ≥ ∑ i ∈ R μ k Reparatur ivij Reparatur , ∀ j ∈ D , ∑ j ∈ D vij Reparatur ≤ ∑ i ∈ R k Reparatur , i ⋅ vi dil / μ , vjk demet = kjk demet [ ROS ] vj dil / μ , vj Metall , i = β ji [ Metall i ] β j Fe [ Fe ( II ) ] ∑ k ∈ O vjk demet + vj dil , i M , ∀ j ∈ D . [6] Beim Vergleich von Simulationen mit gemessener Proteomik (20) stellen wir fest, dass OxidizeME bis zu 85% der E coli Proteom nach Masse (Datensatz S1). Code und Dokumentation für OxidizeME sind unter https://github.com/SBRG/oxidizeme verfügbar.

Aminosäure-Auxotrophie unter oxidativem Stress.

Eine charakteristische Reaktion auf ROS-Schaden für E coli ist die Deaktivierung von Biosynthesewegen von verzweigtkettigen und aromatischen Aminosäuren, die durch die Ergänzung dieser Aminosäuren abgeschwächt wird (4). Verglichen mit der Ergänzung aller 20 Aminosäuren hat OxidizeME korrekt vorhergesagt, dass der Ausschluss von Ile und Val einen größeren Einfluss auf die Wachstumsrate hatte als der Ausschluss von Phe, Trp und Tyr (Abb. 2 .).EIN). Der Grund dass E coli ohne Supplementierung von verzweigtkettigen Aminosäuren unter ROS-Stress nicht wachsen kann, besteht darin, dass die Eisen-Schwefel-Cluster der Dihydroxysäure-Dehydratase und Isopropylmalat-Isomerase durch ROS inaktiviert werden, wodurch der Biosyntheseweg für verzweigtkettige Aminosäuren geschwächt wird (21). Die Auxotrophie aromatischer Aminosäuren wurde ursprünglich der Inaktivierung der Transketolase-Reaktion zugeschrieben (22), wurde aber kürzlich auf die Fehlmetallierung des mononuklearen Eisen-Cofaktors in der 3-Desoxy-D-arabinheptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase zurückgeführt (19). OxidizeME hat diese molekularen Mechanismen und ihre phänotypischen Konsequenzen korrekt vorhergesagt (Abb. 2).

Systemische Folgen von ROS-Stress. (EIN) Vorausgesagte optimale Wachstumsrate bei niedrigen und hohen Superoxidkonzentrationen mit unterschiedlicher Supplementierung von Aminosäuren (AAs). „Alle AAs“ bezieht sich auf alle 20 gängigen Aminosäuren und „–Ile & Val“ bedeutet, dass alle Aminosäuren außer Ile und Val ergänzt wurden. (B) Vorausgesagte optimale Wachstumsrate vs. Superoxidkonzentration in verschiedenen schwefelhaltigen Aminosäureergänzungsmedien. (C) Gleich wie B aber ohne Beschädigung von CysI von ROS simuliert. (D) Simulierte Schadensflüsse für das Wachstum auf Glykolat vs. D-Galactose. AROL: Shikimatkinase II. (E) Wachstumsrate von MG1655 auf Glykolat-Minimalmedium mit 0 bis 0,6 µM PQ, mit und ohne 50 µM Shikimat-Supplementierung. (F) Gleich wie E aber für das Wachstum auf D-Galactose-Minimalmedium. * bedeutet, dass sich die Wachstumsrate zwischen zwei PQ-Konzentrationen signifikant ändert (2-tailed Welch’s T Test, P < 0,01).

Inzwischen ist die Grundlage der schwefelhaltigen Aminosäure-Auxotrophie in E coli bleibt trotz mehrfacher Untersuchungen ergebnislos (23, 24). OxidizeME hat die Auxotrophie für schwefelhaltige Aminosäuren (Cystein und Methionin) unter ROS-Stress korrekt vorhergesagt (Abb. 2 .)EIN). Wir verfolgten einen plausiblen Mechanismus für die Schädigung des Eisen-Schwefel-Clusters in CysI, der den Sulfitreduktase-Schritt der Cys-Biosynthese katalysiert. Sulfitreduktase bindet vier Cofaktoren: Eisen-Schwefel, FAD, FMN und Sirohäm. In Übereinstimmung mit früheren Studien (25) schätzte unser Strukturmodell, dass die Sirohämgruppe der Sulfitreduktase von ROS schwer zu erreichen ist, hauptsächlich aufgrund der Tiefe des Cofaktor-Bindungsrests (Datensatz S2). Frühere Studien zeigten, dass der Eisen-Schwefel-Cluster wahrscheinlich nicht mit molekularem Sauerstoff autoxidiert wird, da er keinem Lösungsmittel ausgesetzt ist (25). Unser Strukturmodell sagte jedoch voraus, dass der Eisen-Schwefel-Cluster von ROS erreicht wird, wenn sowohl die Lösungsmittelexposition als auch die Tiefe des Cluster-bindenden Rückstands von der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche berücksichtigt werden (Datensatz S2). Simulationen bestätigten, dass die Linderung der Schädigung der Sulfitreduktase ausreichend war, um den beobachteten Wachstumsratendefekt umzukehren und ein Wachstum bei höheren ROS-Konzentrationen in Abwesenheit von Cys und Met zu ermöglichen (Abb. 2 .). B und C). Unsere Hypothese, dass die Sulfitreduktase durch ROS deaktiviert wird, stimmt mit Studien in Salmonella enterica Dies zeigt, dass die Aktivität dieses Enzyms tatsächlich durch erhöhtes Superoxid reduziert wird (26). Darüber hinaus steht die Deaktivierung der Sulfitreduktase im Einklang mit der Akkumulation ihres Substrats Sulfit und erklärt die zuvor beobachtete Akkumulation von Sulfit (24). Wir stellen fest, dass die CysI-Inaktivierung die Möglichkeit nicht ausschließt, dass Superoxid zusätzlich zu einer Schädigung der Zellhülle führt, was den Austritt kleiner Moleküle erleichtert (27). Somit kann OxidizeME verwendet werden, um die Grundlage für Aminosäure-Auxotrophien als systemische Reaktion auf spezifische makromolekulare Anfälligkeiten für ROS zu verstehen und vorherzusagen.

Berechnung und Erklärung der Umgebungsabhängigkeit der ROS-Toleranz.

Um zu untersuchen, wie der Umweltkontext die ROS-Toleranz beeinflusst, haben wir das Wachstum unter Superoxidstress in 180 Kohlenstoffquellen (SI-Anhang, Abb. S2). Anschließend verglichen wir Paare von Kohlenstoffquellen im Hinblick auf die Komplexe, die am stärksten durch ROS geschädigt werden. Insbesondere haben wir aus Simulationen vorhergesagt, dass die Inaktivierung der Shikimatkinase II, AroL, ein wichtiger Engpass für das Wachstum von D-Galactose unter ROS-Stress ist (Abb. 2 .).D). Im Gegensatz dazu wurde vorhergesagt, dass AroL kein direkter Flaschenhals für das Wachstum auf Glykolat ist (Abb. 2D). Um diese Vorhersage zu validieren, haben wir das Wachstum von gemessen E coli MG1655 auf diesen beiden Kohlenstoffquellen in 0 bis 0,6 μM Paraquat (PQ). PQ ist ein zweiwertiges Kation, das opportunistisch aufgenommen wird, typischerweise von Polyamin-Transmembrantransportern, und dann Reduktions- und Autoxidationszyklen durchläuft, die von einem von drei katalysiert werden E coli PQ-Diaphorasen zur Erzeugung von Superoxid (28). Um direkt zu testen, ob AroL ein Flaschenhals ist, haben wir die Kulturen zusätzlich mit 50 μM Shikimat ergänzt. Wie vorhergesagt, linderte Shikimat PQ-induzierte Wachstumsdefekte während des Wachstums auf Glykolat nicht (Abb. 2 .).E). Währenddessen linderte Shikimat Wachstumsdefekte durch PQ während des Wachstums auf D-Galactose (Abb. 2 .).F). Diese Ergebnisse bestätigen, dass OxidizeME in der Lage ist, ROS-induzierte Aminosäure-Auxotrophien in verschiedenen Umweltkontexten genau vorherzusagen. Diese Vorhersagefähigkeit beruht auf ihrer Fähigkeit, molekulare und makromolekulare Mechanismen zu berechnen.

Wir haben dann OxidizeME verwendet, um zu erklären, warum das Wachstum auf Glykolat und Galactose unterschiedliche ROS-Toleranzen aufwies. Erstens erhöht ROS-Stress global die Anforderungen an den Redoxausgleich und die Energieproduktion, um der verringerten Stoffwechsel- und Proteinexpressionseffizienz aufgrund von Metallproteinschäden entgegenzuwirken. Somit ist der Unterschied in E coliDie Fähigkeit von , diese Stoffwechselkapazitäten unter verschiedenen Kohlenstoffquellen wieder aufzufüllen, kann die Unterschiede in der ROS-Empfindlichkeit erklären.

Während des Wachstums auf D-Galactose war die primäre Quelle von NADPH der oxidative Pentosephosphatweg (Gnd und Zwf), mit und ohne ROS-Stress. Unter ROS-Stress mit D-Galactose als Kohlenstoffquelle zeigten Simulationen eine erhöhte Aktivität der Methylentetrahydrofolat-Dehydrogenase (FolD), um die NADPH-Produktion durch den PPP (Pentosephosphatweg) zu ergänzen, obwohl PPP immer noch die Hauptquelle von NADPH war. Unterdessen stützte sich die NADH-Produktion stark auf das Glycin-Spaltungssystem mit ROS, während Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase die primäre NADH-Quelle ohne ROS war. Der Anstieg der Fluxe des FolD- und Glycin-Spaltungssystems zur Auffüllung von NADPH und NADH erhöhte beide den Bedarf an Tetrahydrofolat und seinen Derivaten, was zu einem neuen metabolischen Engpass unter ROS-Stress führte. Im Gegensatz dazu wurde mit Glykolat als Kohlenstoffquelle vorhergesagt, dass die optimale NADPH-Produktion vom TCA-Zyklus (kein ROS) zum Apfelsäureenzym (mit ROS) wechselt. Somit kann der Unterschied zwischen den ROS-Toleranzkapazitäten für Galactose und Glykolat als Kohlenstoffquellen durch die flexible NADPH-Produktion während des Wachstums auf Glykolat vs. die starre NADPH-Produktion während des Wachstums auf Galactose erklärt werden.

OxidizeME grenzt stressspezifische differentielle Genexpression von globalen Expressionsänderungen ab.

Als nächstes bewerteten wir die systemische Reaktion von E coli zum ROS-Stress. Wir haben das Transkriptom von gemessen E coli unter Superoxid-Stress mit PQ-Behandlung und identifizierten 914 differentiell exprimierte Gene (DEGs), von denen 501 in OxidizeME berücksichtigt wurden (Abb. 3 und ). SI-Anhang, Abb. S3). Insbesondere wurden 87 Gene hochreguliert. Unter Verwendung von OxidizeME stellten wir fest, dass diese 87 Gene eher aufgrund von Schäden aktiviert wurden, die für Eisenmetalloproteine ​​spezifisch sind als für jedes andere Protein (P < 0,001). Darüber hinaus veränderte sich von den korrekt vorhergesagten DEGs ein großer Teil (84 %) der reprimierten Gene aufgrund einer verringerten Wachstumsrate durch die PQ-Behandlung, während 95 % der aktivierten Gene spezifische Antworten auf Stress waren ( 3 ). Es wird erwartet, dass die Genexpression direkt auf ROS-Stress reagiert – z. B. durch Hochregulieren von ROS-Entgiftungsgenen – und indirekt – als Reaktion auf verringerte Stoffwechselraten, die durch ROS-Schäden verursacht werden. Die Reaktionen, die wir als spezifisch für ROS und nicht für die Wachstumsrate identifizierten, umfassten acht zelluläre Prozesse (Abb. 3): ROS-Entgiftung, zentraler Stoffwechsel, anaerobe Atmung, Aminosäurebiosynthese, Kofaktorsynthese und -reparatur, Translation, Eisenhomöostase und Transkription Regulierung durch die rpoS Sigma-Faktor.

Validierung der Folgen und Reaktionen auf ROS-Stress. (EIN und B) DEGs (|log2(fold change)|> 0,9, FDR [False Discovery Rate] < 0,01), die aktiviert sind (EIN) und unterdrückt (B). Korrekt vorhergesagte DEGs werden von der globalen wachstumsassoziierten Regulation mit OxidizeME unterschieden. (C) Zelluläre Prozesse, die an einer systemischen Reaktion auf Eisen-Metalloprotein-Schäden durch ROS beteiligt sind.

ROS-entwickelte Zellen deregulieren die Fe-S-Cluster-Biosynthese.

E coli besitzt zwei alternative Systeme zur Synthese von Fe-S-Clustern: ISC (Eisen-Schwefel-Cluster) und SUF (Schwefel-Assimilation). Jedes System kann Fe-S-Cluster in Abwesenheit des anderen synthetisieren (29). Während unter normalen Wachstumsbedingungen ISC vorherrscht, wird SUF aktiviert und kann unter oxidativem oder eisenlimitierendem Stress zum primären System werden (4, 30). Ein Grund für diese Umstellung auf SUF ist, dass ROS die Effizienz der ISC-basierten Fe-S-Assemblierung durch eine verstärkte Fehlmetallierung labiler Eisen-Schwefel-Cluster auf den Gerüstproteinen IscU und SufA (31) verringert. Im Prinzip ist der Wechsel von ISC zu SUF nicht der einzige Mechanismus, um die Fe-S-Assemblierung unter ROS-Belastung aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel, Mycobacterium tuberculosis besitzt nur das ISC-Operon, doch kann dieser Erreger unter oxidativem Stress auch in Makrophagen wachsen, vermutlich durch Hochregulierung seines ISC-Operons (32). Eine mögliche Erklärung ist, dass M. tuberkuloseDie ISC-Gerüstproteine ​​von reagieren weniger empfindlich auf ROS als diejenigen in E coli oder repariert werden. Jedoch, E coli besitzt auch mehrere mutmaßliche Fe-S-Cluster-Reparaturgene, einschließlich ygfZ (33), yggX (15), und ytfE (16). Insgesamt bestehen Lücken in unserem Verständnis des Kosten-Nutzen-Verhältnisses zwischen ISC und SUF unter ROS-Stress. Hier untersuchen wir dieses Problem mit OxidizeME und experimenteller Validierung.

Zuerst entdeckten wir DEGs in Wildtyp E coli MG1655 als Reaktion auf 0,25 mM PQ unter Verwendung von RNA-Seq in Glucose-Minimalmedium. Wir haben die Unterdrückung von . festgestellt iscRSUA (Mittelwert l o g 2 (fache Änderung) = – 1,53 , FDR-bereinigter P < 0,001 ). Dieses Experiment haben wir dann mit einem . wiederholt E coli Stamm (genannt BOP1000), der entwickelt wurde, um schnell auf Glucose zu wachsen (34). Wie bei MG1655 wurde der Stamm BOP1000 unterdrückt iscRSUA (Mittelwert l o g 2 (facher Wechsel) = – 1,32 , FDR-bereinigter P < 0,053 ) (Datensatz S3).

Schließlich erhielten wir einen im Labor entwickelten Stamm von E coli (genannt PQ3), das entwickelt wurde, um auf 0,8 mM PQ zu wachsen (SI-Anhang, SI-Materialien und -Methoden). Der Ausgangsstamm für PQ3 ist der Glukose-entwickelte BOP1000. Wir kultivierten PQ3 in 0,2 und 0,6 mM PQ und identifizierten DEGs mit RNA-Seq. Unter 0,6 mM PQ regulierte der Stamm PQ3 die sufABCDSE Transkriptionseinheit (Mittelwert l o g 2 (fache Änderung) = – 2,01 , FDR-bereinigter P < 0,034 ) (Datensatz S3). Darüber hinaus behielt der Stamm PQ3 unter 0,2 mM PQ eine höhere Expression von ISC bei, verglichen mit dem zuvor entwickelten BOP1000-Stamm. Insbesondere beobachteten wir eine höhere Expression der Transkriptionseinheiten iscRSUA (Mittelwert l o g 2 (facher Wechsel) = 3,47 , FDR-bereinigter P < 0,001 ) und hscBA-fdx-iscX (mittlerer Wert 2 (facher Wechsel) = 1,99 , FDR-angepasster P < 0,001 ) (Datensatz S3).

Die gegensätzliche transkriptomische Reaktion des PQ-entwickelten Stamms von denen der Glucose-entwickelten und Wildtyp-Stämme veranlasste uns, genetische und systemische Mechanismen für die ROS-Anpassung zu untersuchen.

Genetische und Systemebene Mechanismen der optimalen Fe-S-Cluster-Biosynthese.

Die genetische Grundlage für die PQ-entwickelte Reaktion von ISC und SUF war eine Mutation in iscR. IscR reguliert die Transkription von ISC und SUF basierend auf der Koordination von 2Fe–2S an seinen Cys92-, Cys98- und Cys104-Resten (29, 35). Der entwickelte Stamm hatte die Mutation C104S in iscR. Diese Mutation kann die Fähigkeit von IscR beeinträchtigen, 2Fe-2S einzubauen und die Expression des ISC- und SUF-Systems unter ROS-Stress zu regulieren (35).

Wir untersuchten dann, warum eine Erhöhung des ISC und die Unterdrückung von SUF die Fitness unter anhaltendem ROS-Stress verbessern. Wir erwarten eindeutig einen Kompromiss zwischen der Rate der Fe-S-Inaktivierung an der IscU und dem Fitnessvorteil der Verwendung von SUF. Tatsächlich zeigen Simulationen, dass unterhalb einer Schwellengeschwindigkeit der Fe-S-Inaktivierung an IscU ( ∼ 0.78 s −1 ) der Schwefeltransfer während der Fe-S-Assemblierung fast ausschließlich durch IscS statt durch SufSE erfolgt (SI-Anhang, Abb. S4). Interessanterweise steigt die IscU-Expression proportional zur Fe-S-Inaktivierungsrate bis zum Schwellenwert an, was auf eine anfängliche kompensatorische Reaktion auf eine verringerte Effizienz der Fe-S-Assemblierung bei IscU hindeutet. Oberhalb des Schwellenwerts fällt die Expression von IscU und IscS jedoch stark ab, während die Expression von SufSE und SufBCD zunimmt. Ein Grund für den Fitnessvorteil von ISC gegenüber SUF sind die Kosten der Proteinexpression für jedes System. Betrachtet man nur die Schwefeltransfer- und Gerüstkomplexe, benötigen IscS und IscU 118 kDa translatiertes Protein, während SufSE und S u f B C 2 D 227 kDa benötigen – 93% mehr als ISC.

Somit deutet eine erhöhte ISC-Expression darauf hin, dass der Stamm PQ3 eine verringerte Fe-S-Inaktivierung an IscU erfahren könnte. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, erinnern Sie sich daran, dass E coli besitzt mehrere Gene, die mit der Reparatur- oder Oxidationsresistenz von Fe-S-Clustern assoziiert sind, einschließlich ygfZ (33), yggX (15), und ytfE (16). RNA-Seq (Datensatz S3) zeigte, dass keines dieser Gene vom Stamm PQ3 als Reaktion auf PQ unterschiedlich exprimiert wurde. Es gab auch keinen Unterschied im Expressionsniveau im Vergleich zum Stamm BOP1000 unter PQ-Behandlung. DNA-Seq zeigte jedoch eine Mutation (T108P) in ygfZ, ein Gen, von dem angenommen wird, dass es zur Synthese oder Reparatur von Fe-S-Clustern beiträgt (33). Alternative, ygfZ kann PQ direkt abbauen, da gezeigt wurde, dass es Plumbagin, eine weitere Redox-Cycling-Verbindung, abbaut (36). Beide adaptiven Funktionen wären mit einer insgesamt geringeren Schädigung der Fe-S-Cluster vereinbar, jedoch ist unklar, ob der Schutz der Fe-S-Cluster an der IscU ausreicht, um die beobachtete Zunahme der ISC-Expression (und der Unterdrückung von SUF) zu reproduzieren.

Wir führten daher Simulationen durch, bei denen wir die Schadensrate an Fe-S-Clustern am IscU auf Null setzten und die Schadensprozesse für alle anderen Eisen- und Fe-S-Cluster-enthaltenden Komplexe behielten. Wir haben dann das Wachstum von . simuliert E coli unter basalen (0,2 nM) und hohen (2 nM) intrazellulären Konzentrationen von Superoxid und identifiziert in silico DEGs. Simulierte DEGs stimmten mit der RNA-Seq von PQ3 überein: hscBA-fdx-iscX und iscRSUA Operons wurden hochreguliert, und sufABCDSE wurde verdrängt (Datensatz S4). Dieses Ergebnis zeigt, dass der Schutz von Fe-S-Clustern an IscU ausreicht, um ISC unter ROS-Stress günstiger zu machen als SUF. Die PQ-entwickelte Sorte erreicht diesen Schutz möglicherweise durch ygfZ und wechselt wiederum durch Mutation von zum günstigeren ISC iscR.


Raman-Mikrospektroskopie, oberflächenverstärkte Raman-Streuungs-Mikrospektroskopie und Raman-Mikrospektroskopie mit stabilen Isotopen zur Charakterisierung von Biofilmen

Biofilme stellen die vorherrschende Form des mikrobiellen Lebens auf unserem Planeten dar. Diese Aggregate von Mikroorganismen, die in eine Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen eingebettet sind, können nahezu alle Grenzflächen besiedeln. Detaillierte Kenntnisse über in Biofilmen eingeschlossene Mikroorganismen sowie über die chemische Zusammensetzung, Struktur und Funktion der komplexen Biofilmmatrix und deren Veränderungen in verschiedenen Stadien der Biofilmbildung und unter verschiedenen physikalischen und chemischen Bedingungen sind in verschiedenen Fachgebieten relevant. Wichtige Forschungsthemen sind die Entwicklung und Verbesserung von Antibiotika und Medizinprodukten sowie die Optimierung von Bioziden, Antifouling-Strategien und die biologische Abwasserbehandlung. Die Raman-Mikrospektroskopie ist ein leistungsfähiges und zerstörungsfreies Werkzeug, das detaillierte zweidimensionale und dreidimensionale chemische Informationen über Biofilmbestandteile mit der räumlichen Auflösung eines optischen Mikroskops und ohne Störungen durch Wasser liefern kann. Allerdings ist die Empfindlichkeit der Raman-Mikrospektroskopie eher begrenzt, was die Anwendbarkeit der Raman-Mikrospektroskopie insbesondere bei niedrigen Biomassekonzentrationen erschwert. Glücklicherweise können der Resonanz-Raman-Effekt sowie die oberflächenverstärkte Raman-Streuung helfen, diesen Nachteil zu überwinden. Darüber hinaus kann die Kombination der Raman-Mikrospektroskopie mit anderen mikroskopischen Techniken, Massenspektrometrie-Techniken oder insbesondere mit Stabil-Isotopen-Techniken umfassende Informationen über Mono- und Multispezies-Biofilme liefern. Hier wird ein Überblick über verschiedene Raman-Mikrospektroskopietechniken, einschließlich der Resonanz-Raman-Mikrospektroskopie und der oberflächenverstärkten Raman-Streuungsmikrospektroskopie, zur in-situ-Detektion, Visualisierung, Identifizierung und chemischen Charakterisierung von Biofilmen gegeben, sowie die wichtigsten Möglichkeiten und Grenzen dieser Techniken in Biofilmen Forschung präsentiert. Zukünftige Möglichkeiten und Herausforderungen der Raman-Mikrospektroskopie allein und in Kombination mit anderen analytischen Techniken zur Charakterisierung komplexer Biofilm-Matrizen werden in einem kritischen Review diskutiert.

Anwendbarkeit der Raman-Mikrospektroskopie für die Biofilmanalyse

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Optimierung des Wachstums von E. coli in D₂O (Schwerwasser) - Biologie

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Über das Cover:

Das Titelbild zeigt einen neuen Ansatz für den schnellen Aufbau chemischer Biosensoren in Hefe unter Verwendung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Kombination von handelsüblichen Aktoren (Transkriptionsfaktoren) und sensorischen Einheiten (GPCRs) ermöglicht die Montage von Biosensoren für eine Vielzahl von Chemikalien. Dargestellt ist der Sensor für Decansäure, eine Biokraftstoff-Vorstufe. Artwork von Jorge Luis Peralta-Yahya basierend auf DOI:10.1021/sb500365m.

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Briefe
GPCR-basierte chemische Biosensoren für mittelkettige Fettsäuren
  • Kuntal Mukherjee,
  • Souryadeep Bhattacharyya und
  • Pamela Peralta-Yahya*

Eine wesentliche Einschränkung bei der Entwicklung von Mikroben für die chemische Produktion ist die Abhängigkeit von Screens auf Chromatographie-Basis mit niedrigem Durchsatz für den chemischen Nachweis. Während kolorimetrische Chemikalien für Hochdurchsatz-Screenings geeignet sind, sind viele wertschöpfende Chemikalien nicht kolorimetrisch und erfordern Sensoren für das Hochdurchsatz-Screening. Hier verwenden wir G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), von denen bekannt ist, dass sie mittelkettige Fettsäuren in Säugerzellen binden, um schnell chemische Sensoren in Hefe zu konstruieren. Mittelkettige Fettsäuren sind unmittelbare Vorläufer der fortschrittlichen Biokraftstoff-Fettsäuremethylester, die als „Drop-in“-Ersatz für D2-Diesel dienen können. Einer der Sensoren erkennt geradkettige C8-C12-Fettsäuren mit einem 13- bis 17-fachen Signalanstieg nach Aktivierung mit linearen Bereichen bis 250 μM. Die Einführung einer synthetischen Reaktionseinheit ändert sowohl den dynamischen als auch den linearen Bereich und verbessert die Sensorreaktion auf Decansäure auf einen 30-fachen Anstieg des Signals nach der Aktivierung mit einem linearen Bereich von bis zu 500 μM. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über einen ganzzelligen Biosensor für mittelkettige Fettsäuren, der unserer Meinung nach auf die evolutionäre Entwicklung von fettsäureproduzierenden Mikroben angewendet werden könnte. Angesichts der Affinität von GPCRs zu einer Vielzahl von Chemikalien sollte es möglich sein, durch einfachen Austausch der GPCR-Sensoreinheit schnell neue Biosensoren aufzubauen. Diese Sensoren sollten für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet sein, die unterschiedliche dynamische und lineare Bereiche erfordern, indem unterschiedliche Reaktionseinheiten eingeführt werden.

Metabolic Engineering von Synechozystis sp. PCC 6803 zur Herstellung des pflanzlichen Diterpenoids Manoyloxid
  • Elias Englund,
  • Johan Andersen-Ranberg,
  • Rui Miao,
  • Björn Hamberger und
  • Pia Lindberg*

Forskolin ist ein hochwertiges Diterpenoid mit einem breiten Spektrum an pharmazeutischen Anwendungen, das natürlicherweise in der Wurzelrinde der Pflanze Coleus forskohlii vorkommt. Aufgrund seiner komplexen Molekülstruktur ist die chemische Synthese von Forskolin kommerziell nicht attraktiv. Daher bleibt die arbeits- und ressourcenintensive Extraktion und Reinigung aus C. forskohlii-Pflanzen die aktuelle Quelle der Verbindung. Wir haben das einzellige Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 zur Herstellung des Forskolin-Vorläufers 13R-Manoyloxid (13R-MO) und ebnet damit den Weg für die lichtgetriebene biotechnologische Produktion dieser hochwertigen Verbindung. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine neue Serie integrativer Vektoren zur Verwendung in Synechocystis entwickelt und verwendet, um stabile Linien zu erzeugen, die chromosomal integrierte CfTPS2 und CfTPS3 exprimieren, die Enzyme, die für die Bildung von 13R-MO in C. forskohlii verantwortlich sind. Die gentechnisch veränderten Stämme ergaben Produktionstiter von bis zu 0,24 mg g–1 DCW 13R-MO. Um die Ausbeute zu erhöhen, wurden 13R-MO-produzierende Stämme durch Einführung ausgewählter Enzyme aus C. forskohlii weiter entwickelt, wodurch der Titer auf 0,45 mg g–1 DCW verbessert wurde. Diese Arbeit bildet eine Grundlage für die Weiterentwicklung der Produktion komplexer pflanzlicher Diterpenoide in Cyanobakterien.

Synthetische Auxotrophe mit Liganden-abhängigen essentiellen Genen für einen BL21(DE3)-Biosicherheitsstamm

Synthetische Auxotrophe sind Organismen, die so konstruiert wurden, dass sie für ihre Lebensfähigkeit die Anwesenheit eines bestimmten Moleküls benötigen. Sie haben potenzielle Anwendungen im Biocontainment und im Enzym-Engineering. Wir zeigen, dass diese Organismen durch das Engineering von Ligandenabhängigkeit in essentielle Gene erzeugt werden können. Wir demonstrieren eine Methode zur Generierung eines synthetischen Auxotrophen basierend auf einem Liganden-abhängigen essentiellen Gen (SLiDE) unter Verwendung von 5 essentiellen Genen als Testfälle: pheS, dnaN, tyrS, metG und adk. Wir zeigen, dass ein einzelner SLiDE-Stamm eine 1 × 108-fache Steigerung der Lebensfähigkeit aufweisen kann, wenn er chemisch mit dem Liganden Benzothiazol komplementiert wird. Das optimierte SLiDE-Strain-Engineering-Protokoll erforderte weniger als 1 Woche und 100 USD. Wir kombinierten mehrere SLiDE-Stammallele zu dem industriellen Escherichia coli-Stamm BL21(DE3), wodurch ein Organismus erhalten wurde, der die biologischen Sicherheitskriterien mit einer Fluchthäufigkeit unterhalb der Nachweisgrenze von 3 × 10–11 übertrifft.

Artikel
Technischer Kunststoff cis-Regulatorische Elemente zur gleichzeitigen Erkennung von drei Transkriptionsfaktoren in Bakterien
  • Gerardo Ruiz Amores,
  • Maria-Eugenia Guazzaroni und
  • Rafael Silva-Rocha*

Die Erkennung von cis-regulatorischen Elementen durch Transkriptionsfaktoren (TF) an Zielpromotoren ist entscheidend für die Genregulation in Bakterien. In diesem Prozess hängt die Bindung von TFs an ihre verwandten Sequenzen von einer Reihe von physikalischen Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen und spezifischen Nukleotiden in der Operatorregion ab. Zuvor haben wir gezeigt, dass In-silico-Optimierungsalgorithmen in der Lage sind, kurze Sequenzen zu generieren, die von zwei verschiedenen TFs von Escherichia coli, nämlich CRP und IHF, erkannt werden, wodurch ein logisches UND-Gatter erzeugt wird. Hier haben wir diesen Ansatz erweitert, um DNA-Sequenzen zu entwickeln, die gleichzeitig von drei nicht verwandten TFs (CRP, IHF und Fis) erkannt werden können. Mit in silico Optimierung und experimentellen Validierungsstrategien konnten wir einen Kandidaten-Promotor (Plac-CFI1) erhalten, der von nur zwei TFs mit einer UND-Logik reguliert wird, was eine Einschränkung im Design demonstriert. Anschließend modifizierten wir den Algorithmus, um die Optimierung verlängerter Sequenzen zu ermöglichen, und konnten zwei synthetische Promotoren (PCFI20-1 und PCFI22-5) entwickeln, die in vivo funktionsfähig waren. Expressionsassays in mutierten E. coli-Stämmen für jeden TF zeigten, dass, während CRP die Promotoraktivitäten positiv reguliert, IHF und Fis starke Repressoren beider Promotorvarianten sind. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse das Potenzial von In-silico-Strategien für das Engineering von bakteriellen synthetischen Promotoren. Darüber hinaus zeigt die Studie auch, wie kleine Modifikationen in cis-regulatorischen Elementen die endgültige Logik des resultierenden Promotors drastisch beeinflussen können.

Pterin-abhängige Monooxidation für die mikrobielle Synthese eines modifizierten Monoterpen-Indol-Alkaloids

Monoterpen-Indolalkaloide (MIAs) haben einen wichtigen therapeutischen Wert, einschließlich als Antikrebs- und Antimalariamittel. Wegen ihrer chemischen Komplexität werden therapeutische MIAs oder fortgeschrittene Zwischenprodukte davon oft aus den einheimischen Pflanzen isoliert. Die mikrobielle Synthese von MIAs würde die schnelle und skalierbare Produktion komplexer MIAs und MIA-Analoga für therapeutische Zwecke ermöglichen. Hier produzieren wir das modifizierte MIA Hydroxystrictosidin aus Glucose und dem Monoterpen Secologanin über eine Pterin-abhängige Monooxidationsstrategie. Konkret haben wir die Hefe Saccharomyces cerevisiae für die Synthese von Tetrahydrobiopterin auf hohem Niveau entwickelt, um Tryptophan zu 5-Hydroxytryptophan zu monooxidieren, das nach der Decarboxylierung zu Serotonin an exogen zugeführtes Secologanin gekoppelt wird, um in einem Acht-Enzym-Weg 10-Hydroxystrictosidin zu produzieren . Wir wählten Hydroxystrictosidin als unser Syntheseziel, da die Hydroxylierung an der 10′-Position des Alkaloidkerns Strictosidin einen chemischen Ansatzpunkt für die zukünftige chemische Semisynthese von Therapeutika bietet. Wir zeigen die Allgemeingültigkeit der Pterin-abhängigen Monooxidationsstrategie für die Alkaloidsynthese durch Hydroxylierung von Tyrosin zu L-DOPA – einem wichtigen Zwischenprodukt in der Benzylisochinolinalkaloid (BIA)-Biosynthese – und anschließend der weiteren Umwandlung in Dopamin. Zusammen stellen diese Ergebnisse die erste mikrobielle Synthese eines modifizierten Alkaloids, die erste Produktion von Tetrahydrobiopterin in Hefe und die erste Anwendung einer Pterin-abhängigen Monooxidationsstrategie für die Synthese von L-DOPA dar. Diese Arbeit öffnet die Tür zur skalierbaren Produktion von MIAs sowie zur Produktion von modifizierten MIAs, die als späte Zwischenprodukte in der Semisynthese bekannter und neuer Therapeutika dienen. Darüber hinaus können die Mikrobenstämme in dieser Arbeit als Werkzeuge zur Entdeckung von Pflanzenwegen verwendet werden, um bekannte MIA-Biosynthesewege aufzuklären oder Wege zu identifizieren, die zu neuen MIAs führen.

Entwicklung eines synthetischen Malonyl-CoA-Sensors in Saccharomyces cerevisiae für intrazelluläres Metabolitenmonitoring und genetisches Screening

Genetische Sensoren, die in der Lage sind, wichtige Metabolitenspiegel in Fluoreszenzsignale umzuwandeln, ermöglichen die Überwachung der Konzentrationen intrazellulärer Verbindungen in lebenden Zellen und sind ein effizientes Werkzeug im genetischen Hochdurchsatz-Screening. Allerdings hinkt die Entwicklung genetischer Sensoren in Hefen weit hinter der Entwicklung in Bakterien hinterher. Hier berichten wir über das Design eines Malonyl-CoA-Sensors in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines angepassten bakteriellen Transkriptionsfaktors FapR und seines entsprechenden Operators fapO, um intrazelluläre Malonyl-CoA-Spiegel zu messen. Durch die Kombination dieses Sensors mit einer genomweiten Überexpressionsbibliothek identifizierten wir zwei neue Gen-Targets, die die intrazelluläre Malonyl-CoA-Konzentration verbesserten. Wir nutzten den resultierenden rekombinanten Hefestamm weiter, um eine wertvolle Verbindung, 3-Hydroxypropionsäure, aus Malonyl-CoA herzustellen und steigerten seinen Titer um 120%. Ein solcher genetischer Sensor bietet einen leistungsstarken Ansatz für ein genomweites Screening und könnte die Synthese einer Vielzahl von Chemikalien, die von Malonyl-CoA in Hefe abgeleitet sind, weiter verbessern.

Polymerase-Kettenreaktion an einem viralen Nanopartikel
  • James Carr-Smith,
  • Raúl Pacheco-Gómez ,
  • Haydn A. Little ,
  • Matthew R. Hicks ,
  • Sandeep Sandhu,
  • Nadja Steinke,
  • David J. Smith ,
  • Alison Rodger,
  • Sarah A. Goodchild ,
  • Roman A. Lukaszewski ,
  • James. H. R. Tucker* , und
  • Timothy R. Dafforn*

Der Bereich der synthetischen Biologie umfasst Studien, die darauf abzielen, neue Materialien und Geräte aus Biomolekülen zu entwickeln. In den letzten Jahren wurde viel mit einer Reihe biomolekularer Chassis gearbeitet, darunter α-helikale Coiled Coils, β-Faltblatt-Amyloide und sogar virale Partikel. In dieser Arbeit zeigen wir, wie hybride Bionanopartikel aus einem viralen M13-Bakteriophagengerüst durch Konjugation mit DNA-Primern hergestellt werden können, die eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) steuern können. Dieses beispiellose Beispiel einer PCR an einem Viruspartikel wurde durch flussorientierte Lineardichroismus-Spektroskopie untersucht, die Informationen über die Struktur des Produkts sowie eine neue Prototypenmethodik für den DNA-Nachweis liefert.Wir schlagen vor, dass diese Demonstration der PCR auf der Oberfläche eines Bionanopartikels eine nützliche Ergänzung zu den Möglichkeiten darstellt, wie Hybridanordnungen mithilfe der synthetischen Biologie konstruiert werden können.

Abstimmbare Riboregulator-Schalter für die posttranskriptionelle Kontrolle der Genexpression
  • Malathy Krishnamurthy,
  • Scott P. Hennelly ,
  • Taraka Dale,
  • Shawn R. Starkenburg ,
  • Ricardo Martí-Arbona ,
  • David T. Fox ,
  • Scott N. Twary ,
  • Karissa Y. Sanbonmatsu* , und
  • Clifford J. Unkefer*

Bis vor kurzem konzentrierten sich Engineering-Strategien zur Veränderung der Genexpression auf die Transkriptionskontrolle unter Verwendung starker induzierbarer Promotoren oder einer von mehreren Methoden, um verschwenderische Gene auszuschalten. Kürzlich wurden synthetische Riboregulatoren für die translationale Regulation der Genexpression entwickelt. Hier berichten wir über eine neue modulare synthetische Riboregulator-Klasse, die das Potenzial hat, die Proteinexpression fein abzustimmen und die Konzentration jedes Enzyms in einem konstruierten Stoffwechselweg unabhängig zu kontrollieren. Diese Entwicklung ist wichtig, da der einfachste Ansatz zur Veränderung des Flusses durch einen bestimmten Stoffwechselschritt darin besteht, die Konzentration des Enzyms zu erhöhen oder zu verringern. Unser Design beinhaltet einen cis-Repressor am 5'-Ende der mRNA, der eine Stamm-Schleife-Helix bildet, die ribosomale Bindungssequenz verschließt und die Translation blockiert. Eine trans-exprimierte aktivierende RNA setzt die ribosomal bindende Sequenz frei, die die Translation anschaltet. Die Gesamtarchitektur der Riboregulatoren basiert auf Watson-Crick-Basenpaarungsstabilität. Wir beschreiben hier einen cis-Repressor, der die Translation von Antibiotikaresistenz-Reportern vollständig unterbinden kann, und einen Trans-Aktivator, der die Translation wiederherstellt. Wir haben festgestellt, dass es möglich ist, diese Riboregulatoren zu verwenden, um eine translationale Kontrolle der Genexpression über einen breiten dynamischen Bereich zu erreichen. Wir haben auch festgestellt, dass eine Targeting-Sequenz modifiziert werden kann, um Riboregulatoren zu entwickeln, die im Prinzip die Translation vieler Gene unabhängig regulieren können. In einem Selektionsexperiment haben wir gezeigt, dass es durch eine subtile Veränderung der Sequenz des Transaktivators möglich ist, das Verhältnis der reprimierten und aktivierten Zustände zu verändern und eine intermediäre Translationskontrolle zu erreichen.

Entwicklung eines Lysin-ON-Riboschalters zur metabolischen Kontrolle der Lysinproduktion in Corynebacterium glutamicum

Riboswitches sind natürliche RNA-Elemente, die die Genexpression durch Bindung eines Liganden regulieren. Hier demonstrieren wir die Möglichkeit, einen natürlichen Lysin-OFF-Riboschalter aus Eschericia coli (ECRS) in einen synthetischen Lysin-ON-Riboschalter umzuwandeln und zur Stoffwechselkontrolle zu verwenden. Zu diesem Zweck wurde eine Lysin-ON-Riboswitch-Bibliothek unter Verwendung von tetA-basierter dualer genetischer Selektion konstruiert. Nach dem Screening der Bibliothek wurde die Funktionalität der ausgewählten Lysin-ON-Riboswitches unter Verwendung eines Report-Gens, lacZ, untersucht. Ausgewählte Lysin-ON-Riboswitches wurden in das lysE-Gen (das ein Lysin-Transportprotein kodiert) von Corynebacterium glutamicum eingeführt und verwendet, um eine dynamische Kontrolle des Lysin-Transports in einem rekombinanten Lysin-produzierenden Stamm, C. glutamicum LPECRS, der eine deregulierte Aspartokinase trägt und a Lysin-OFF-Riboschalter zur dynamischen Steuerung des Enzyms Citrat-Synthase. Die Ergebnisse der Batch-Fermentation der Stämme zeigten, dass der C. glutamicum LPECRS-Stamm mit einem zusätzlichen Lysin-ON-Riboswitch zur Kontrolle von lysE eine um 21% höhere Lysinausbeute im Vergleich zum C. glutamicum LPECRS-Stamm und sogar eine 89 % Ertragssteigerung im Vergleich zum Stamm mit deregulierter Aspartokinase. Diese Arbeit stellt einen nützlichen Ansatz zur Generierung von Lysin-ON-Riboschaltern für das metabolische Engineering von C. glutamicum dar und zeigt zum ersten Mal eine synergetische Wirkung von Lysin-ON- und -OFF-Riboschaltern zur Verbesserung der Lysinproduktion in diesem industriell wichtigen Mikroorganismus. Der Ansatz kann verwendet werden, um andere Gene dynamisch zu kontrollieren und kann auf andere Mikroorganismen angewendet werden.

Tn7-basiertes Gerät zur kalibrierten heterologen Genexpression in Pseudomonas putida
  • Sebastian Zobel,
  • Ilaria Benedetti,
  • Lara Eisenbach,
  • Victor de Lorenzo* ,
  • Nick Wierckx und
  • Lars M. Blank

Das Bodenbakterium Pseudomonas putida erregt zunehmend großes Interesse als Plattform für fortschrittliches Metabolic Engineering durch Ansätze der synthetischen Biologie. Der genomische Kontext, die Genkopienzahl und das Wechselspiel zwischen Transkription und Translation führen jedoch häufig zu erheblichen Unsicherheiten beim Design zuverlässiger genetischer Konstrukte. In dieser Arbeit haben wir ein standardisiertes heterologes Expressionsgerät etabliert, bei dem die Promotorstärke die einzige Variable ist und die restlichen Parameter des Flusses stabile Standardwerte aufweisen. Zu diesem Zweck haben wir einen Mini-Tn7-Delivery-Transposon-Vektor maßgeschneidert, der die Konstrukte in einen einzelnen genomischen Locus des P. putida-Chromosoms inseriert. Dieser wurde dann mit einer Promotorinsertionsstelle, einem unveränderlichen Translationskoppler und einer stromabwärts gelegenen Stelle zusammengeführt, um das/die interessierende(n) Gen(e) unter feste Montageregeln zu stellen. Diese Anordnung wurde genutzt, um eine Sammlung synthetischer Promotoren mit geringem Transkriptionsrauschen in diesem bakteriellen Wirt zu vergleichen. Wachstumsexperimente und Durchflusszytometrie mit Single-Copy-Promotor-GFP-Konstrukten zeigten ein robustes, konstitutives Verhalten dieser Promotoren, deren Stärken und Eigenschaften genau verglichen werden konnten. Dieses standardisierte Expressionsgerät erweitert das Repertoire an verfügbaren Werkzeugen für zuverlässiges metabolisches Engineering und andere genetische Verbesserungen von P. putida erheblich.

Evolutionäres Design von Cholin-induzierbaren und -repressiblen T7-basierten Induktionssystemen
  • Kohei Ike,
  • Yusuke Arasawa,
  • Satoshi Koizumi,
  • Satoshi Mihashi,
  • Shigeko Kawai-Noma ,
  • Kyoichi Saito und
  • Daisuke Umeno*

Durch Zusammenbau und evolutionäres Engineering von T7-Phagen-basierten Transkriptionsschaltern aus endogenen Komponenten des Bet-Operons auf dem Chromosom von Escherichia coli wurden genetische Schalter konstruiert, die durch Cholin, eine sichere und kostengünstige Verbindung, induzierbar sind. Die funktionelle Plastizität des BetI-Repressors wurde durch die schnelle und hochfrequente Identifizierung funktioneller Varianten mit verschiedenen Eigenschaften, einschließlich solcher mit hoher Stringenz, hohem maximalem Expressionsniveau und umgekehrten Phänotypen, aus einem Pool von BetI-Mutanten aufgedeckt. Die Plasmidexpression von BetI-Mutanten führte zu einem Cholin-induzierbaren (Bet-ON) oder Cholin-repressiblen (Bet-OFF) Umschalten von Genen unter der pT7/betO-Sequenz auf beispiellos hohem Niveau, während die minimale Leaky-Expression unter uninduzierten Bedingungen beibehalten wurde.

Gedächtnis und kombinatorische Logik basierend auf DNA-Inversionen: Dynamik und evolutionäre Stabilität
  • Jesus Fernandez-Rodriguez,
  • Lei Yang,
  • Thomas E. Gorochowski ,
  • D. Benjamin Gordon und
  • Christopher A. Voigt*

Genetisches Gedächtnis kann mithilfe von Enzymen implementiert werden, die DNA-Inversionen katalysieren, wobei jede Orientierung einem „Bit“ entspricht. Hier verwenden wir zwei DNA-Invertasen (FimE und HbiF), die die DNA irreversibel zwischen zwei Zuständen mit entgegengesetzter Richtung umorientieren. Zuerst konstruieren wir einen Speicher, der von FimE gesetzt und von HbiF zurückgesetzt wird. Als nächstes bauen wir ein NOT-Gatter, wo der Input-Promotor FimE antreibt und in Abwesenheit eines Signals der umgekehrte Zustand durch die konstitutive Expression von HbiF aufrechterhalten wird. Das Tor benötigt ∼3 h zum Ein- und Ausschalten. Die evolutionäre Stabilität dieser Schaltkreise wird durch passagierende Zellen während der Zyklenfunktion gemessen. Der Speicherschalter ist über 400 h (17 Tage, 14 Zustandsänderungen) stabil, jedoch bricht das Gate nach 54 h (>2 Tage) aufgrund der kontinuierlichen Invertase-Expression. Die Genomsequenzierung zeigt, dass der Kreislauf intakt bleibt, aber der Wirtsstamm entwickelt sich, um die Invertase-Expression zu reduzieren. Diese Arbeit unterstreicht die Notwendigkeit, die evolutionäre Robustheit und Fehlermodi von Schaltungsdesigns zu bewerten, insbesondere wenn komplexere Multigate-Schaltungen implementiert werden.


Figur 4

Abbildung 4. Gesamt- und ausgewählte SIMS-Bilder zeigen die Lokalisierung des TET-Signals zu einzelnen E coli. Die Bakterien wurden auf Si kultiviert und mit 20 µg/ml TET behandelt. Die gesamten positiven Ionenbilder in (a, b) zeigen den Umriss von Bakterien, die einer Strahlerosion von der oberen Oberfläche bis in eine Tiefe von 800 nm unterliegen. Die Verteilung von Si (abgebildet durch m/z 167.9) und TET (kartiert durch Summation des Molekülions mit Fragmenten bei m/z 410.1, 427.2 und 445.2) von oben bis in die Tiefe von 800 nm sind in (c)–(f) dargestellt. Die Signalüberlagerungsbilder in (g) und (h) zeigen die Kolokalisation von TET (gelb) zu E coli, dargestellt durch die schwarzen Bereiche innerhalb des Si (blau) Hintergrunds.

Einfluss der TetA-Efflux-Pumpe auf die TET-Akkumulation

Drogensignal (m/z 410 + 427 + 445) Zählungen/Pixel ± gewichtete STABW
Dosis von TET (μg/ml)Tiefe (nm)TetAVektorregelung
00–4008.8 ± 2.38.1 ± 6.0
400–8007.0 ± 2.57.9 ± 5.1
200–4009.1 ± 6.815.2 ± 6.3
400–8006.2 ± 6.67.0 ± 4.8
1800–40020.1 ± 7.626.4 ± 12.2
400–80014.8 ± 10.223.5 ± 9.8

Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Department of Chemistry and Biochemistry, Center for Biofilm Engineering, and Thermal Biology Institute, Montana State University, Bozeman, MT, USA

Roland Hatzenpichler, Viola Krukenberg, Rachel L. Spietz & Zackary J. Jay

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Beiträge

R.H. hat das Konzept für diesen Aufsatz entworfen. Alle Autoren haben das Manuskript verfasst.

Korrespondierender Autor


Geförderte Projekte

Titel: Studien zum Massentransport von Sauerstoff ohne Gas-Flüssigkeits-Resistenz in der Anwendung auf Biosysteme.

Höhe des Zuschusses: Rs. 3.79 Lakhs

Zeitraum und Status: 1995-1997, abgeschlossen

Abstrakt:Der Massentransport von Sauerstoff durch Gas-Flüssigkeits-Massentransfer ist ein limitierender Faktor für den optimalen Betrieb vieler industriell wichtiger Systeme, wie beispielsweise aerobe Bioreaktoren. Dieses Projekt untersuchte den Sauerstoffmassentransport durch eine Methodik, die keinen Gas-Flüssigkeits-Widerstand beinhaltet. Die Methodik umfasste Flüssigphase vor Ort Abbau von Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser. Diese neuartige Methodik für den Sauerstofftransport verbesserte die spezifische Produktivität von Bioprozessen deutlich.

Sponsoring-Agentur: Forschungsrat für Nuklearwissenschaften (BRNS)

Titel: Behandlung von Ammoniakabwässern aus Schwerwasseranlagen.

Höhe der Förderung: Rs. 10,25 lakhs

Zeitraum und Status: 1997-1999, abgeschlossen

Mitermittler: S.R.Asolekar, K.V.Venkatesh (IIT) R.R.Sonde (BARC)

Abstrakt:Die Produktion von Schwerwasser in Reaktorqualität führt zu großen Mengen an flüssigem Abwasser, das inakzeptable Mengen an Ammoniak enthält. Das in Schwerwasserwerken eingesetzte Verfahren zur Reduzierung des Ammoniakgehalts im Abwasser war sehr energieintensiv und konnte das Problem auch nicht vollständig lösen. Daher war ein Abwasserbehandlungssystem, das die mikrobielle Umwandlung von Ammoniak verwendet, das die durch das obige Verfahren aufgeworfenen Probleme überwindet, sehr wünschenswert. Das Projekt befasste sich mit einer mikrobiellen Methode zur Umwandlung von Ammoniak in harmlosen Stickstoff und Nitrat. Dies beinhaltete die Verwendung verschiedener Bakterienarten der Nitrosomonas und Nitrobacter Vielfalt. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Methode ist, dass das produzierte Nitrat als „Dünger“ für das Rasen- und Baumwachstum verwendet werden kann. Der optimale Nitratgehalt, der aus der Abwasserbehandlungsanlage bezogen auf den tatsächlichen Bedarf an „Düngemitteln“ erhältlich ist, wurde ebenfalls angesprochen. Darüber hinaus wurden die verschiedenen biologischen Prozesse, die an dieser Abwasserbehandlung beteiligt sind, basierend auf dem energetischen (metabolischen) Status der Kultur optimiert.

Sponsoring-Agentur: All India Council for Technical Education (AICTE)

Titel: Verbesserung der Bioreaktorerträge durch den Kulturstatus in viskosen Fermentationen.

Höhe des Zuschusses: Rs. 5 Lakhs

Zeitraum und Status: 1997-2000, abgeschlossen

Mitermittler: A. K. Suresh

Abstrakt:Die im obigen DST-Projekt erwähnte Methode wurde optimiert. Um die Methode zu optimieren, brauchten wir Informationen über den Zustand der Zellen in der Kultur, den eigentlichen Fabriken, die das Produkt herstellen. Solche Informationen sind durch die Messung des Kulturstatus verfügbar. Der Kulturstatus wird durch Kulturfluoreszenz gemessen, die ein nicht-invasives Maß für den NADH-Spiegel in der Kultur ist.

Sponsoring-Agentur: Institut für Wissenschaft und Technologie (DST)

Titel: Verbesserung der Enzymproduktivität durch scherempfindliche aerobe Systeme

Höhe des Zuschusses: Rs. 10,75 lakhs

Zeitraum und Status: 2000-2003, abgeschlossen

Mitermittler: A. K. Suresh

Abstrakt:Es wurde ein neuartiger Couette-Flow-Bioreaktor (CFB) entwickelt, in dem die gesamte Kultivierung unter definierten Scherbedingungen durchgeführt werden kann. Die Sauerstoffzufuhr, der normale limitierende Faktor für ganze Kultivierungen unter definierten Scherbedingungen, wurde erreicht, indem Luft durch eine am Innenzylinder des CFB befestigte Teflonmembran geleitet wurde. Noch wichtiger ist, dass Analysen der Sauerstoffübertragungsfähigkeiten sowie der Scherraten zeigen, dass in diesem CFB die Auswirkungen einer definierten Scherung ohne Beeinflussung durch die Auswirkungen der Sauerstoffzufuhr untersucht werden können. Es wurde festgestellt, dass der spezifische intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-Spiegel zu Beginn der stationären Phase beim Züchten in der CFB das Maximum ist, und es wird vermutet, dass der Zelltod die Apoptose ist.

Sponsoring-Agentur: Ministerium für Personalentwicklung (MHRD)

Titel: Verbesserung der Leistung von Bioreaktoren mit rekombinanten Organismen unter Verwendung der Flüssigphasen-Sauerstoffversorgungsstrategie (LPOS).

Höhe des Zuschusses: Rs. 12 Lakhs

Zeitraum und Status: 2003-2006, abgeschlossen

Mitermittler: S. B. Noronha, A. K. Suresh

Abstrakt: Die Flüssigphasen-Sauerstoffversorgungsstrategie (LPOS), die durch die Sauerstoffentwicklung in der Flüssigphase durch katalasische Zersetzung von Wasserstoffperoxid (H2Ö2) Hülsenfrüchte, wurde zur Kultivierung eines rekombinanten Systems – rekombinant Escherichia coli die durch eine Temperaturänderung induziert werden kann, Streptokinase zu produzieren. Toxizitätsstudien zeigten, dass ein anfänglicher H2Ö2Konzentration von 7,5 mM war optimal. Die spezifische Ausbeute an Streptokinase bei der Kultivierung mit LPOS betrug das 2-fache des Wertes, der bei konventioneller Kultivierung basierend auf der Sauerstoffzufuhr durch Belüftung erhalten wurde. Interessanterweise war der Plasmidverlust bei LPOS im Vergleich zur konventionellen Kultivierung um etwa 10-15% geringer. Um optimale Zufuhrprofile von H . zu erhalten2Ö2wurde ein Vorgehensmodell entwickelt. Das Modell wurde mit einem robusten stochastischen Optimierungslöser basierend auf einem genetischen Algorithmus optimiert, um ein optimales H . zu erhalten2Ö2Vorschubgeschwindigkeiten. Es wurde ein modellvorhergesagter Ansatz verwendet, und auch die unbekannten Modellparameter wurden mit dem genetischen Algorithmus vorhergesagt. Das optimale H2Ö2Zugabeprofile, die ebenfalls experimentell verifiziert wurden, führten zu 4-fach höheren spezifischen Ausbeuten an Streptokinase im Vergleich zu denen aus Kultivierungen mit Belüftung und 2-fach höheren spezifischen Ausbeuten im Vergleich zu den Kultivierungen ohne Optimierung.

Sponsoring-Agentur: Institut für Biotechnologie (DBT)

Titel: Biotechnologische Ansätze zur Herstellung und Kultivierung von Patchouli.

Höhe des Zuschusses: Gesamt: Fr. 85,14 lakhs (multiinstitutionelles Projekt) IIT Bombay: Rs. 26.45 lakhs

Zeitraum und Status: 2003-2006, abgeschlossen

Mitermittler: Wissenschaftliches Forschungszentrum des Kelkar Education Trust (Mumbai, Maharashtra), Keva Biotech. Limited (Mumbai, Maharashtra), Central Plantation Crops Research Institute (Kasargod, Kerala), Nationales Forschungszentrum für Heil- und Aromapflanzen (Boriavi, Gujarat), Universität für Agrarwissenschaften (Dharwad, Karnataka), Dr. Balasaheb Sawant Konkan Krishi Vidyapeet ( Dapoli, Maharashtra)

Abstrakt: Die klonale Vermehrung von Pflanzen durch Gewebekultur wurde dann als das beste Verfahren zur Gewinnung von Pflanzmaterial für vegetativ vermehrte Pflanzen etabliert. Ein Problem mit dem Gewebekultursystem sind die hohen Kosten der Pflanzen aufgrund der spezialisierten Inputs. Die Mikrovermehrung von Pflanzen ist größtenteils ein manueller Vorgang und wird durch die Beschränkungen der einfachen Handhabung durch erfahrene Bediener und strenge Sterilitätsbedingungen eingeschränkt.

Bioreaktorsysteme sind eine alternative Methode, um den Betriebsumfang und die Produktionsrate der Pflanzen zu erhöhen. In Anbetracht der erhöhten Produktionseffizienz bei geringeren Kosten wird die Gartenbauindustrie die Vorteile der Verwendung von Gewebekulturpflanzen für die Kultivierung besser erkennen, wenn die Mikrovermehrung von Pflanzen in großem Maßstab auf die Bioreaktormethode umgestellt wird. Obwohl Bioreaktoren weit verbreitet sind und in der Bioindustrie ausgiebig verwendet werden, sind Bioreaktoren für die Pflanzensprosskultur selten. Im Rahmen dieses Projekts wurde ein neuartiger, wiederverwendbarer Bioreaktor für Sprosskulturen entworfen, gebaut und betrieben.

Der entwickelte Sprosskultur-Bioreaktor benötigte keine Pflänzchen, um auf der Flüssigkeitsoberfläche zu wachsen. Somit wurde der Hauptnachteil der Hyperhydratation oder Verglasung vollständig vermieden, wenn der entwickelte Bioreaktor verwendet wurde. Darüber hinaus war der entwickelte Bioreaktor wiederverwendbar und ermöglichte eine einfache, kontinuierliche Überwachung vieler wichtiger Bioreaktorvariablen wie gelöster Sauerstoff (DO), pH, Temperatur, Sprossmasse und andere, die für die Optimierung des Prozesses unerlässlich sind. Außerdem war es in dem entwickelten Bioreaktor möglich, die Atmosphäre in Richtung auf wünschenswerte Ergebnisse wie hohe Wachstumsraten, wünschenswerte Inhaltsstoffe von Pflanzenteilen wie dem Blatt und andere zu manipulieren. Darüber hinaus gab es in dem derzeit entwickelten Bioreaktor mehrere Merkmale, die attraktiv und patentierbar waren.

Sponsoring-Agentur: Indo-US-Forum

Titel: Aspekte der reaktiven Sauerstoffspezies im Trinkwasser

Höhe des Zuschusses: 30.000 US-Dollar

Zeitraum und Status: 2008-2010, abgeschlossen

Partner: Jeanne VanBriesen, Carnegie Mellon University

Abstrakt:Die Chlorung von Trinkwasser ist eine primäre Desinfektionsmethode. Viele interessierende Organismen sind jedoch resistent gegen Chlorierung (z. Mykobakterium). Der Mechanismus der mikrobiellen Inaktivierung durch Chlor ist nicht gut verstanden und daher fehlt auch das Verständnis der Mechanismen der Chlorresistenz. Wir stellten die Hypothese auf, dass die mikrobielle Inaktivierung auf Chlorbasis durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Wir haben diese Hypothese ausgewertet und die Arbeit führte zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Chlor auf Mykobakterium, sowie ein verbessertes Verständnis des Mechanismus der mikrobiellen Inaktivierung durch Chlor.

Sponsoring-Agentur: Institut für Biotechnologie (DBT)

Titel: Entwicklung eines Photobioreaktors für Algenbiokraftstoffe

Höhe der Förderung: Rs. 1,3 Millionen

Zeitraum und Status: 2009-2011, abgeschlossen

Mitermittler: Shrikumar Suryanarayan

Abstrakt: Ziel dieses Projekts war die Entwicklung eines Designparameters für das effektive Scale-up eines Photobioreaktors zur Herstellung von Öl (Lipiden) aus Chlorella vulgaris. Chlorella vulgaris wurde als Modellalgensystem gewählt, da es im Vergleich zu allen anderen Algen, die das Potenzial zur Kultivierung unter salzhaltigen Bedingungen haben, umfangreiche Hintergrundinformationen zu diesem Algen verfügbar sind.Die salzhaltigen Bedingungen waren von größter Bedeutung, da wir vom DBT aufgefordert wurden, uns auf marine Aspekte zu konzentrieren. Für die Studie wurde ein großer Photobioreaktor im Labormaßstab mit einer Kapazität von 15 Litern entworfen und hergestellt. Die Auswirkungen von Parametern wie Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt und Licht auf Chlorella vulgariswaren gelernt. Außerdem arbeiten einige an der Wirkung von Parametern auf Dunaliella parva und Chaetoceros Mullieri wurde auch gemacht. Dann wurden die Aspekte des Photobioreaktor-Scale-up im Detail behandelt.

Sponsoring-Agentur: Divashri

Titel: Algen-Biokraftstoffe

Höhe der Förderung: Rs. 25 Lakhs+

Zeitraum und Status: 2008-2013, abgeschlossen

Abstrakt: Dieses Projekt befasste sich zunächst mit der Entwicklung alternativer Kultivierungssysteme für Mikroalgen und dann mit einigen Studien zur Verbesserung vieler Kultivierungsaspekte von Mikroalgen wie der Elektroflockung.

Sponsoring-Agentur: Institut für Wissenschaft und Technologie (DST)

Titel:Reaktive Spezies für verbesserte Bioölausbeuten aus Mikroalgen

Höhe der Förderung: Rs. 32,83 lakhs

Zeitraum und Status:06.02.2013 – 05.02.2016, Arbeiten abgeschlossen

Abstrakt:Eine Herausforderung bei der algenbasierten Bioölproduktion besteht darin, gleichzeitig die spezifischen Wachstumsraten und den spezifischen Lipidgehalt zu erhöhen. Wir demonstrierten gleichzeitige Erhöhungen der beiden oben genannten in Chlorella vulgaris durch reaktive Spezies, die unter UVA- und UVB-Lichtbehandlungen induziert wurden, und erreichte eine 8,8-fache Steigerung der volumetrischen Lipidproduktivität.

Darüber hinaus berichteten wir erstmals, dass die endogenen, pseudo-stationären, spezifischen intrazellulären Spiegel des Hydroxylradikals ultradian oszillieren (Modellsystem: die Mikroalge, Chlorella vulgaris) und charakterisierte auch die verschiedenen Rhythmusparameter. Wir haben den endogenen Rhythmus durch Entrainment mit UVA-Strahlung zurückgesetzt und zwei neue ultradiane Rhythmen erzeugt. Das Zurücksetzen vergrößerte das Fenster der maximalen Lipidakkumulation von 6 h auf 12 h gleichzeitig mit dem Einsetzen der ultradianen Rhythmen.

Darüber hinaus berichteten wir über eine neuartige Anwendung: Photon-Up-Conversion, ein Prozess zur Umwandlung von Strahlung mit niedrigerer Energie in Strahlung mit höherer Energie durch die Verwendung geeigneter Phosphorsysteme, wurde als neuartige Strategie zur Verbesserung des Mikroalgenwachstums und der Lipidproduktivität eingesetzt.

Sponsoring-Agentur: Institut für Wissenschaft und Technologie (DST)

Titel: Entrainment of Rhythms für eine verbesserte Krebstherapie

Höhe der Förderung: Rs. 38,3 Lakhs

Zeitraum und Status:25. Januar 2017 – Januar 2020, laufend


Abstrakt

Die Proteinfällung in organischen Lösungsmitteln ist eine wirksame Strategie zur Abreicherung von Natriumdodecylsulfat (SDS) vor der MS-Analyse. Hier bewerten wir die Rückgewinnung von Membran- und wasserlöslichen Proteinen durch Fällung mit Chloroform/Methanol/Wasser oder mit Aceton (80%). Mit jedem Lösungsmittelsystem war die Membranprotein-Wiedergewinnung größer als 90 %, was im Allgemeinen höher war als die von zytosolischen Proteinen. Mit wenigen Ausnahmen wurden durch MS nachgewiesene restliche Überstandsproteine ​​auch im Präzipitationspellet mit einer höheren MS-Signalintensität in der Pelletfraktion nachgewiesen. Nach der Fällung präsentieren wir eine neue Strategie zur quantitativen Resolubilisierung von Proteinen in einem MS-kompatiblen Lösungsmittelsystem. Das Pellet wird bei -20 °C in 80 % Ameisensäure/Wasser inkubiert und anschließend mit Wasser 10-fach verdünnt. Die Membranproteingewinnung entspricht der der Beschallung des Pellets in 1% SDS. Die resolubilisierten Proteine ​​sind bei Raumtemperatur stabil, ohne beobachtete Formylierung, wie es für Proteine, die bei Raumtemperatur in Ameisensäure suspendiert sind, typisch ist. Das Protokoll wird auf die Molekulargewichtsbestimmung von Membranproteinen aus einer GELFrEE-fraktionierten Probe von . angewendet Escherichia coli Proteine.


Schau das Video: E. coli Cells Explode (Kann 2022).