Information

Funktion zur Rettung von Zelllinien

Funktion zur Rettung von Zelllinien


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich lese in einem Artikel, in dem die Autoren drei Zelllinien erstellt haben, um die Funktion eines interessierenden Gens zu untersuchen (Mbd3):

Das eine ist für das interessierende Gen ausgeknockt [Mbd3 -/-], das andere ist für das eine Allel gefloxt [Mbd3 fl/-], und die dritte ist die gerettete Knock-out-Zelllinie [Mbd3 -/- (gerettet)], das bedeutet, dass sie in der Zelllinie der Knock-out-Zellen stabil ein Plasmid transfiziert haben, das das interessierende Gen exprimiert. Ich frage mich dann, warum sie diese Rettungszelllinie verwenden, anstatt die Wildtyp-Zellen mit den Wildtyp-Allelen von zu verwenden Mdb3?


Rettungsexperimente sind der Goldstandard, um zu bestätigen, dass eine Wirkung auf das interessierende Gen zurückzuführen ist.

Das Entfernen eines Gens kann Off-Target-Effekte haben, aber wenn Sie die Funktion wieder „normal“ machen können, indem Sie das Gen wieder in die Zelllinie/das Tier einführen, dann ist dies ein starker Beweis dafür, dass das Gen und sein Produkt die Ursache für die beobachteten Wirkungen sind im Versuch.

Wildtyp-Zellen würden normalerweise eingeschlossen werden, um zu zeigen, was eine "normale" Reaktion ist.


Identifizierung der Genfunktion durch zyklische Verpackungsrettung retroviraler cDNA-Bibliotheken

Gene, die Reaktionen in Säugerzellen regulieren, sind durch funktionelle Klonierungsstrategien, die auf eine einzige Selektionsrunde beschränkt sind, oft schwer zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Strategie, die zyklische Verpackungsrettung (CPR), die eine schnelle Wiederherstellung und erneute Übertragung von retroviralen cDNA-Bibliotheken ermöglicht. CPR kann nicht nur bei immortalisierten Zelllinien wie Fibroblasten und Jurkat-T-Zellen angewendet werden, sondern auch bei primären B-Lymphozyten, die nur in Kurzzeitkulturen gehalten werden können. CPR ermöglicht mehrere Selektions- und Anreicherungsrunden, um cDNAs zu identifizieren, die Antworten in Säugerzellen regulieren. Unter Verwendung von CPR wurden fünf cDNAs funktionell kloniert, die Schutz gegen Tumornekrosefaktor-alpha (TNFalpha)-induzierte Apoptose in RelA(-/-)-Fibroblasten verliehen. Drei der Gene, RelA, zelluläres FLICE-like inhibitory protein (c-FLIP) und eine dominant-negative Mutante des TNF-Rezeptors 1, die durch CPR entstand, boten starken Schutz gegen Apoptose. Zwei der identifizierten Gene, Dbs und das Fas-assoziierte Todesdomänenprotein (FADD), das zuvor als proapoptotisches Molekül identifiziert wurde, boten einen teilweisen Schutz gegen TNFalpha-induzierte Apoptose. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CPR eine vielseitige Methode ist, die eine funktionelle Identifizierung von sowohl Wildtyp- als auch dominant-negativen Genprodukten ermöglicht, die zelluläre Reaktionen regulieren.

Figuren

Schnelle Wiederherstellung und kontrollierte Neuübertragung…

Schnelle Erholung und kontrollierte Weiterübertragung von Retroviren aus mehreren Zelllinien unter Verwendung von…

Mehrere Runden einer funktionellen…

Mehrere Runden eines funktionellen Assays können verwendet werden, indem CPR verwendet wird, um…

Durch CPR funktionell identifizierte Gene…

Zu den durch CPR funktionell identifizierten Genen gehören dominant-negative Mutanten, die während des Prozesses der…

Durch CPR funktionell identifizierte Gene…

Zu den durch CPR funktionell identifizierten Genen gehören die Modifikatoren FADD und Dbs*, die nur…


Inhalt

Es gibt verschiedene unsterbliche Zelllinien. Einige von ihnen sind normale Zelllinien (z. B. aus Stammzellen gewonnen). Andere immortalisierte Zelllinien sind die in vitro Äquivalent zu Krebszellen. Krebs tritt auf, wenn eine Körperzelle, die sich normalerweise nicht teilen kann, Mutationen durchläuft, die eine Deregulierung der normalen Zellzykluskontrollen verursachen, was zu einer unkontrollierten Proliferation führt. Immortalisierte Zelllinien haben ähnliche Mutationen durchlaufen, die es einem Zelltyp ermöglichen, der sich normalerweise nicht teilen könnte in vitro. Die Ursprünge einiger unsterblicher Zelllinien, beispielsweise menschlicher HeLa-Zellen, stammen von natürlich vorkommenden Krebsarten. HeLa, die allererste unsterbliche menschliche Zelllinie, wurde 1951 von Henrietta Lacks (ohne Einwilligung [1] ) im Johns Hopkins Hospital in Baltimore, Maryland, entnommen.

Immortalisierte Zelllinien werden häufig als einfaches Modell für komplexere biologische Systeme verwendet, beispielsweise für die Analyse der Biochemie und Zellbiologie von Säugerzellen (einschließlich menschlicher Zellen). [2] Der Hauptvorteil der Verwendung einer unsterblichen Zelllinie für die Forschung ist ihre Unsterblichkeit, die Zellen können auf unbestimmte Zeit in Kultur gezüchtet werden. Dies vereinfacht die Analyse der Biologie von Zellen, die ansonsten eine begrenzte Lebensdauer haben könnten.

Immortalisierte Zelllinien können auch kloniert werden, was zu einer klonalen Population führt, die wiederum unbegrenzt vermehrt werden kann. Dadurch kann eine Analyse an genetisch identischen Zellen viele Male wiederholt werden, was für wiederholbare wissenschaftliche Experimente wünschenswert ist. Die Alternative, eine Analyse an Primärzellen von mehreren Gewebespendern durchzuführen, hat diesen Vorteil nicht.

Immortalisierte Zelllinien finden Anwendung in der Biotechnologie, wo sie eine kostengünstige Methode zur Züchtung von Zellen darstellen, die denen in einem vielzelligen Organismus ähneln in vitro. Die Zellen werden für eine Vielzahl von Zwecken verwendet, von der Prüfung der Toxizität von Verbindungen oder Arzneimitteln bis hin zur Produktion von eukaryontischen Proteinen. [3]

Einschränkungen Bearbeiten

Veränderungen von nicht unsterblichen Ursprüngen Bearbeiten

Während immortalisierte Zelllinien oft aus einem bekannten Gewebetyp stammen, haben sie signifikante Mutationen durchlaufen, um unsterblich zu werden. Dies kann die Biologie der Zelle verändern und muss bei jeder Analyse berücksichtigt werden. Darüber hinaus können sich Zelllinien über mehrere Passagen genetisch verändern, was zu phänotypischen Unterschieden zwischen Isolaten und möglicherweise unterschiedlichen experimentellen Ergebnissen führt, je nachdem, wann und mit welchem ​​Stammisolat ein Experiment durchgeführt wird. [4]

Kontamination mit anderen Zellen Bearbeiten

Viele Zelllinien, die in der biomedizinischen Forschung weit verbreitet sind, wurden von anderen, aggressiveren Zellen kontaminiert und überwuchert. Zum Beispiel waren angebliche Schilddrüsenlinien tatsächlich Melanomzellen, vermutetes Prostatagewebe tatsächlich Blasenkrebs und angenommene normale Uteruskulturen waren tatsächlich Brustkrebs. [5]

Es gibt mehrere Methoden, um immortalisierte Zelllinien zu erzeugen: [6]

  1. Isolierung von einem natürlich vorkommenden Krebs. Dies ist die ursprüngliche Methode zur Erzeugung einer immortalisierten Zelllinie. Zu den wichtigsten Beispielen gehört das menschliche HeLa. [7]
  2. Einführung eines viralen Gens, das den Zellzyklus teilweise dereguliert (z. B. wurde das Adenovirus Typ 5 E1-Gen verwendet, um die HEK 293-Zelllinie zu immortalisieren, das Epstein-Barr-Virus kann B-Lymphozyten durch Infektion immortalisieren [8] ).
  3. Künstliche Expression von Schlüsselproteinen, die für die Unsterblichkeit erforderlich sind, zum Beispiel Telomerase, die den Abbau von Chromosomenenden während der DNA-Replikation in Eukaryoten verhindert. [9] , speziell verwendet zur Erzeugung immortalisierter Antikörper-produzierender B-Zelllinien, bei denen eine Antikörper-produzierende B-Zelle mit einer Myelom-(B-Zell-Krebs)-Zelle fusioniert wird. [10]

Beispiele Bearbeiten

Es gibt mehrere Beispiele für immortalisierte Zelllinien mit jeweils unterschiedlichen Eigenschaften. Die meisten immortalisierten Zelllinien werden nach dem Zelltyp klassifiziert, aus dem sie stammen oder dem sie biologisch am ähnlichsten sind.


Datenvernichter zur Rettung

D er Junge war erst einen Monat alt, hatte aber so viele gesundheitliche Probleme entwickelt, die andere Menschen im Laufe ihres Lebens nicht bekommen. Er litt ständig an bakteriellen Infektionen, kämpfte mit unerklärlichen Entzündungen, nahm nicht zu und hatte – am schlimmsten – blutigen Durchfall, ein rätselhaftes Symptom, das manche Ärzte glauben ließ, er hätte eine pädiatrische Version einer Reizdarmerkrankung.

Artemio Miguel Jongco, ein Spezialist für Allergie und Immunologie, der sein Medizinstudium abschloss, sah den Jungen am ersten Tag seiner ersten Rotationspraxis im Jahr 2008. Die Symptome klangen aus seiner Lehrbuchlektüre vage bekannt: eine seltene genetische Erkrankung namens chronische Granulomatose oder CGD, bei der das Immunsystem Infektionen nicht richtig bekämpfen kann. Es gab unterstützende Behandlungen für CGD, aber solche, die bei einigen Patienten funktionierten, wirkten nicht unbedingt bei anderen.

Warum Mutter Natur ein so wichtiges Gen auf das X-Chromosom gelegt hat, werden wir wahrscheinlich nie erfahren.

Obwohl die meisten genetischen Erkrankungen unheilbar sind, tun die Ärzte ihr Bestes, um sie zu behandeln. Einige Medikamente helfen, während sich andere als nutzlos erweisen – ein Phänomen, das auf die genetischen Variationen der Patienten und die Schwierigkeit zurückzuführen ist, vorherzusagen, welche Gene beteiligt sind. Wenn Kliniker mehr über das Zusammenspiel der Gene wüssten, könnten sie personalisierte Therapien entwickeln und sie an die spezifische genetische Ausstattung der Patienten anpassen.

Bis vor kurzem hatten Kliniker keine guten Werkzeuge für eine personalisierte genetische Analyse. Aber das ändert sich dank der quantitativen Biologie. Die Disziplin kombiniert mathematische, statistische und computergestützte Methoden, um lebende Organismen zu untersuchen, erklärt Jesse Gillis, ein quantitativer Biologe am Cold Spring Harbor Laboratory, der jetzt mit Jongco in der CGD-Forschung zusammenarbeitet. Quantitative Biologen entwickeln Algorithmen, die große Datensätze durchkauen und versuchen, sie zu verstehen. Bei seltenen genetischen Störungen bedeutet dies, dass viele Daten von mehreren Patienten analysiert werden, um zu verstehen, wie ihre Gene zusammenwirken. Forscher wie Gillis und sein Team hoffen, Klinikern einen Einblick in die Gene ihrer Patienten zu geben und so bei der Entwicklung personalisierter Therapien zu helfen.

Für Jongco, jetzt Spezialist für pädiatrische Allergie und Immunologie bei Northwell Health, einem Gesundheitssystem in New York, stellte CGD ein solches Rätsel dar, dass es sein persönliches Bestreben wurde, alle seine Grundlagen zu verstehen, um auf persönliche Weise zu diagnostizieren und zu behandeln. Wissenschaftler hatten CGD mit den nicht funktionierenden Neutrophilen in Verbindung gebracht – der Art von weißen Blutkörperchen, die sich normalerweise um Krankheitserreger wickeln, als würden sie sie in einem Zellgefängnis oder einer Art Todeskammer vom Körper abschließen. Dann tun die Neutrophilen das, was Wissenschaftler einen oxidativen Ausbruch nennen – in dieser Todeskammer setzen sie aktive Moleküle frei, die als freie Radikale bezeichnet werden und die Käfer zerstören. Dabei sterben auch Neutrophile, aber der Körper produziert mehr.

Soziale Ungleichheit hinterlässt genetische Spuren

Beim Menschen bedeuten die tiefgreifenden biologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern, dass ein einzelner Mann physisch in der Lage ist, weit mehr Kinder zu bekommen als eine einzelne Frau. Frauen tragen neun Monate lang ungeborene Kinder und stillen sie oft. WEITERLESEN

Bei Menschen mit CGD funktionieren die Neutrophilen nicht richtig. Sie hüllen die Käfer entweder nicht vollständig ein oder zappen sie nicht richtig, aber die Krankheitserreger bleiben bestehen, während die freien Radikale das körpereigene Gewebe schädigen. „Es ist wie ein in sich geschlossenes Paket, das Mutter Natur entwickelt hat, um Krankheitserreger zu zerstören“, sagt Jongco. "Aber aus welchen Gründen auch immer, dieses in sich geschlossene Paket funktioniert nicht richtig."

CGD-Symptome können fast oxymoronisch sein. Manche Patienten haben aufgrund eines geschwächten Immunsystems eine Immunschwäche, kämpfen aber gleichzeitig mit Autoimmunerkrankungen, bei denen ein übereifriges Immunsystem den eigenen Körper angreift. Ersteres braucht einen Schub, letzteres eine Dämpfung. Wie behandelt ein Arzt beides?

Normalerweise verabreichen Ärzte den Patienten antibakterielle und antimykotische Medikamente sowie ein Interferon-Gamma-Medikament, das das Käfer-Zapping stimuliert – aber nur bei Patienten, die eine gewisse oxidative Burst-Kapazität haben (einige haben keine). entzündungshemmende Medikamente. Für andere kann eine riskante Stammzelltransplantation der letzte Ausweg sein. Zu wissen, welche Behandlungsoptionen und Medikamentenkombinationen am besten funktionieren, liegt irgendwo im komplexen Zusammenspiel der Gene der Patienten.

Das Studium von Erkrankungen wie CGD ist schwierig, da sie selten sind und nicht viele Patienten vorhanden sind. Sie an Mäusen zu untersuchen – in Nasslabors, wie Wissenschaftler sie nennen – dauert lange. Was bei Mäusen funktioniert, funktioniert auch nicht immer beim Menschen.

Es gibt ein wachsendes Verständnis dafür, dass die Genfunktion oft kontextabhängig ist, wobei ein großer Teil dieses Kontexts durch die Aktivitäten anderer Gene bereitgestellt wird.

In den letzten Jahren sind DNA-Sequenzierungstechnologien so weit gereift, dass ein intelligenter Algorithmus genetische Daten von mehreren Patienten und ihren Familien analysieren kann – und viel schneller Geschichtenerzählende Trends findet als Experimente an Nagetieren. „Mir wurde klar, dass wir am Labortisch nur so viel tun können, dass wir nicht alles beherrschen“, sagt Jongco. „Ich mag es nicht, Code zu schreiben, also brauchte ich einen Computational Data Scientist-Partner, um Big Data zu verarbeiten, jemanden, der die Computerseite liebt, aber bereit ist, etwas über grundlegende Biologie zu lernen.“

Im Jahr 2017 wandte sich Jongco an Gillis, dessen Nische genau das war, wonach Jongco suchte – eine Möglichkeit, genetische Daten von verschiedenen Patienten zu analysieren und gemeinsame Muster und Trends zu finden. Das CGD-Projekt stand im Einklang mit Gillis’ anderen quantitativen Biologieprojekten. Einige seiner Algorithmen untersuchten die Pflanzenbiologie und untersuchten Gene, die Pflanzen helfen können, besser zu wachsen oder widerstandsfähiger zu sein. Aber Jongcos Idee, die Gene der Patienten zu durchsuchen, in der Hoffnung, Schlüssel für eine personalisierte Versorgung zu finden, war ein inspirierendes Unterfangen. „Es bot eine echte Gelegenheit, echten Menschen zu helfen“, sagt Gillis.

Gillis und Jongco haben sich zusammengetan, um im Internet nach Genen zu suchen. Sie haben ein Protokoll ausgearbeitet. Sobald ein neuer Patient mit granulomatösen Symptomen in Jongcos Büro eintraf, wurden dessen Blutproben entnommen, Immunzellen extrahiert und an das CSHL geschickt. Manchmal gab Jongco sie sogar per Hand ab – CSHL ist nur 15 Minuten entfernt und Neutrophile leben nicht lange außerhalb des Körpers, daher war das Timing von entscheidender Bedeutung. Bald schlossen sich andere Institutionen den Bemühungen an, darunter die National Institutes of Health und in jüngerer Zeit die University of Pittsburgh. Gillis’ Team würde die Zellen durch den Sequenzer schicken und die Daten mit denen von zuvor sequenzierten Patienten vergleichen, um einige gemeinsame Muster zu finden.

Es gibt einige genetische Fakten über die Krankheit, die Wissenschaftler bereits kennen, zum Beispiel gibt es sie in zwei verschiedenen Versionen. Eine Version wird durch eine Mutation in mehreren Genen mit den kryptischen Namen verursacht CYBA, NCF1, NCF2, und NCF4, und heißt CGD. Das andere wird von einem Gen mit einem ebenso kryptischen Namen ausgelöst CYBB, das sich auf dem X-Chromosom befindet, daher der Name XCGD. Diese Version betrifft hauptsächlich Jungen, da sie ein X- und ein Y-Chromosom haben, während Mädchen zwei X haben und ein geringeres Risiko haben, die Krankheit zu entwickeln. Aber auch Mädchen können Trägerinnen sein, und sie leiden auch darunter, allerdings in einer milderen Form von Hautausschlägen und Entzündungen, die sich oft mit zunehmendem Alter verschlimmern. Die Jungen bekommen die schwerere, potenziell lebensbedrohliche XCGD, die sie von ihren Müttern erben. „Warum Mutter Natur ein so wichtiges Gen auf das X-Chromosom gelegt hat, werden wir wahrscheinlich nie erfahren“, sagt Jongco.

Die Variabilität der Krankheit führte die Wissenschaftler zu der Annahme, dass während der CYBB Gen könnte der Hauptschuldige des XCGD sein, es hat auch Komplizen – andere Gene, die eine Rolle spielen. Genetiker haben allmählich erkannt, dass Gene oft dazu neigen, oft zusammenzuarbeiten, so dass die Suche nach solchen Tandems wertvolle Erkenntnisse liefern könnte. „In den letzten Jahren hat sich die Erkenntnis durchgesetzt, dass die Genfunktion oft kontextabhängig ist, wobei ein Großteil dieses Kontexts durch die Aktivitäten anderer Gene bereitgestellt wird“, sagt Gillis. Sein Labor konzentriert sich darauf, diese gemeinsamen Muster zu finden und aufzuklären, wie sie die Funktion der Zellen verändern.

Die Algorithmen von Gillis können die RNA-Moleküle der Zelle analysieren, die eine wesentliche Rolle beim Lesen von Informationen aus den Genen und beim Zusammensetzen von Proteinen aus diesen Anweisungen in diesem Fall spielen, Proteine, die für die Keimabtötung der Neutrophilen unerlässlich sind. Störungen in der RNA-Funktion können zu falsch zusammengesetzten Proteinen führen, die die Fähigkeit der Neutrophilen beeinträchtigen, die Keime mit ihrem oxidativen Ausbruch zu zappen. Es macht auch einen Unterschied, an welcher Stelle in diesem Fließband solche Pannen auftreten. Wenn die Proteine ​​fast vollständig herauskommen, können die Neutrophilen ihre Arbeit möglicherweise halbwegs verrichten, was zu milderen Symptomen führt. Andernfalls könnten sie einen schweren Mangel aufweisen und die Krankheit wird schlimmer. Auch wo auf dem Gen die Mutation liegt, ist wichtig. Wenn die Mutation auf den weniger kritischen Teil des Gens fällt, ist die Krankheit weniger schwerwiegend, sodass diese Patienten möglicherweise weniger Medikamente oder geringere Dosen benötigen.

Um zu verstehen, wie sich solche feinen Details in der Krankheitsvariabilität auswirken, können Wissenschaftler im Nasslabor jahrelange Arbeit benötigen, sagt Gillis. Sie müssten Mäuse mit unterschiedlichen Genmutationen herstellen und sehen, wie sie die Schwere der Krankheit beeinflussen und auf welche Behandlungen sie ansprechen. Und wenn sie wissen wollten, welche „Tandem“-Gene dazu beitragen, müssten sie blindlings unzählige Kombinationen ausprobieren. In der Welt der Computerbiologie kann ein Algorithmus diese Daten innerhalb von Tagen analysieren. „Wir sollten täglich Fragen stellen, die sukzessive aufeinander aufbauen“, sagt Gillis über sein Labor. „Im Gegensatz zu einem Nasslabor, in dem alle sechs Monate eine Frage gestellt wird.“

Bisher ist es den Cyber-Genjägern gelungen, nur etwa 10 Patienten zusammen mit ihren Müttern und Schwestern zu sequenzieren – teils weil die Krankheit selten ist und teils weil die Pandemie alles verlangsamt hat. Das reicht noch nicht aus, um endgültige Schlüsse zu ziehen. Aber wenn mehr Patienten ankommen, wird der Datenpool wachsen und die Algorithmen sollten in der Lage sein, einige Geschichten zu erzählen, die es Jongco ermöglichen würden, seine Patienten präziser zu behandeln. „Wenn Jesse ein genetisches Profil erstellen kann, bei dem die Wahrscheinlichkeit einer Autoimmunität erhöht wird, müssen wir sie möglicherweise nicht behandeln“, sagt Jongco. Die quantitative Biologie kann Jongco auch dabei helfen, eine Behandlung zu entwickeln, die die Fähigkeit der Patienten zum Keimen von Keimen wiederbelebt. „Wir hoffen, dass unser Ansatz dazu beitragen kann, solche genetischen Profile zu identifizieren“, sagt Gillis. „Und das könnte wirklich dazu beitragen, die Lebensqualität der Patienten zu verbessern.“

Lela Nargi ist eine erfahrene Journalistin für Wissenschaft, Nachhaltigkeit sowie Ernährungspolitik und Landwirtschaft für Medien wie die Guardian, Washington Post, Hakai, The Counter, JSTOR Daily, und Ensia. Finden Sie sie unter lelanargi.com.

Leitbild: ymgerman / Shutterstock

Dieser Artikel wurde ursprünglich im Juni 2021 auf unserem Biology + Beyond-Kanal veröffentlicht.


Charlotte Aumeier und Laura Schaedel: Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Mitgliedschaften

CytoMorpho Lab, Biosciences & Biotechnology Institute of Grenoble, UMR5168, CEA/INRA/CNRS/Université Grenoble-Alpes, 38054 Grenoble, Frankreich

Charlotte Aumeier, Laura Schaedel, Jérémie Gaillard, Laurent Blanchoin & Manuel Théry

Laboratoire Interdisciplinaire de Physique, CNRS/Université Grenoble-Alpes, 38402 Saint-Martin-d’Hères, Frankreich

CytoMorpho Lab, Hopital Saint Louis, Institut Universitaire d’Hematologie, UMRS1160, INSERM/Université Paris Diderot, 75010 Paris, Frankreich

Laurent Blanchoin & Manuel Théry

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Sie können auch in PubMed Google Scholar nach diesem Autor suchen

Beiträge

C. A. Experimente in Zellen durchgeführt. L.S. und J. G. die Experimente durchgeführt in vitro. PFUND. und M. T. leitete die Arbeit. C.A., L.S., K.J., L.B. und M. T. die Daten analysiert. M. T. schrieb das Papier.

Korrespondierende Autoren


MATERIALEN UND METHODEN

Chemikalien und Reagenzien stammten von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) und Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), sofern nicht anders angegeben.

Tubulinreinigung

Tubulin wurde wie zuvor beschrieben gereinigt (Waterman-Storer, 1998). Kurz gesagt wurde Schweinehirngewebe isoliert, gereinigt und unter Verwendung eines Edelstahlmischers homogenisiert. Die homogenisierte Aufschlämmung wurde durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × geklärt g für 1 Std. Die Tubulinheterodimere wurden durch das gut charakterisierte Doppelzyklusprotokoll gereinigt, Mikrotubuli wurden 1 h bei 37 °C zusammengesetzt und dann wurde das Pellet nach Zentrifugation gesammelt. Das gesammelte Mikrotubuli-Pellet wurde 1 h auf Eis depolymerisiert, wonach der geklärte Überstand nach einer weiteren Zentrifugation gesammelt wurde. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt. Das Doppelzyklus-Protein wurde weiter durch Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Phosphocellulose-Anionenaustauschersäule gereinigt, die wie zuvor beschrieben hergestellt wurde (Waterman-Storer, 1998). Wir bestätigten die Aktivität unseres gereinigten Proteins durch den Kauf von kommerziell erhältlichem Tubulin (Cytoskeleton, Denver, CO Cat: T238P) und testeten es unter den gleichen Bedingungen.

In-vitro-Mikrotubuli-Dynamik-Assays

Assays zur Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch TIRF-Mikroskopie basierten auf zuvor beschriebenen Methoden (Gell et al., 2010 Gebühren und Moore, 2018). Doppelzyklische Mikrotubuli-Samen wurden durch Inkubation von 20 µM Rhodamintubulin (Cytoskeleton, Denver, CO) in BRB80-Puffer (80 mM PIPES, mit KOH auf pH 6,9 gebracht, 1 mM Ethylenglycoltetraessigsäure [EGTA], 1 mM MgCl .) aufgebaut2 geringfügige pH-Einstellungen wurden mit NaOH) mit 1 mM GMPCPP bei 37 °C für 30 Minuten vorgenommen. Die Probe wurde dann bei 100.000 × zentrifugiert g für 10 min bei 30°C und der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde in 0,8 × Startvolumen eiskaltem BRB80-Puffer suspendiert, um labile Mikrotubuli zu depolymerisieren. Es wurde zusätzlich 1 mM GMPCPP zugegeben und die Mikrotubuli wurden 30 min bei 37 °C polymerisiert und erneut pelletiert. Das Pellet wurde in 0,8 × Startvolumen warmem BRB80 suspendiert. Die Reaktion wurde dann 8–10 Mal vorsichtig pipettiert, um die Mikrotubuli zu scheren, in 1-µl-Volumina aliquotiert und entweder sofort verwendet oder schockgefroren und bei –80°C gelagert.

Die Bildgebungskammern wurden unter Verwendung von 22 × 22 mm und 18 × 18 mm Deckgläsern zusammengesetzt. Die Deckgläser wurden wie zuvor beschrieben gereinigt und silanisiert (Gell et al., 2010 Gebühren und Moore, 2018). Die vorbereiteten Deckgläser wurden bis zur Verwendung in Exsikkatoren bei Raumtemperatur gelagert. Die Deckgläser wurden in einen speziell angefertigten Bühneneinsatz montiert und mit geschmolzenen Parafilmstreifen versiegelt. GMPCPP-stabilisierte Mikrotubuli-Samen wurden unter Verwendung von Anti-Rhodamin-Antikörpern (Fisher Scientific Cat# A-6397, 1:50 in BRB80 verdünnt) auf Deckgläsern befestigt. Die Kammern wurden mit 1% Pluronic-F127 in BRB80 gespült, um zu verhindern, dass andere Proteine ​​am Glas haften, und mit einem sauerstoffbindenden Puffer (40 mM Glucose, 1 mM Trolox, 64 nM Katalase, 250 nM Glucoseoxidase, 10 mg/ml Casein .) äquilibriert ) vor der Zugabe von freiem Tubulin. Der Bildgebungspuffer bestehend aus unpolymerisiertem Tubulin (15–20 % HiLyte 488-markiertes Tubulin [Zytoskelett] und 80–85 % unmarkiertes Schweinehirntubulin), 5 mM MgCl2, 1 mM GTP, der Sauerstofffängerpuffer, und BRB80–50 µl Volumen wurden dann in die Bildgebungskammern geflossen. Die Kammer wurde mit VALAP (1:1:1 Vaseline, Lanolin, Paraffinwachs) abgedichtet und unter Verwendung eines ASI400 Air Stream Stage Incubators (Nevtek, Williamsville, VA) 5 min vor der Bildgebung auf 37 °C erwärmt. Die Temperatur wurde mit einem Infrarot-Thermometer verifiziert.

Für Experimente, die den Einfluss von Calcium auf die Rettungsaktivität testen, 10 µM CaCl2 wurde dem Bildgebungspuffer vor der Kammermontage zugesetzt. Wir verwendeten MaxChelator (maxchelator.stanford.edu), um die Konzentration an freiem Calcium in diesen Reaktionen anhand theoretischer Werte für Ionen- und Chelatorkonzentrationen, pH und Temperatur abzuschätzen. Unter Standardbedingungen plus Calcium (5 mM MgCl2, 10 µM CaCl2, 1 mM EGTA und 1 mM GTP bei pH 6,9 und 37 °C) wird geschätzt, dass mehr als 99,9 % des Ca 2+ an EGTA gebunden sind.

Die Bilder wurden auf einem Nikon Ti-E-Mikroskop aufgenommen, das mit einem 1,49 NA 100× CFI160 Apochromat-Objektiv, TIRF-Illuminator, OBIS 488-nm- und Saphir-561-nm-Lasern (Coherent, Santa Clara, CA) und einem ORCA-Flash 4.0 LT . ausgestattet war sCMOS-Kamera (Hamamatsu Photonics, Japan) mit NIS Elements-Software (Nikon, Minato, Tokio, Japan). Die Bilder wurden unter Verwendung von Zweikanal-Single-Plane-TIRF in 1-s-Intervallen akquiriert.

Bildanalyse

Die Bilder wurden mit einem maßgeschneiderten MATLAB-Programm analysiert, wie zuvor beschrieben (Fees und Moore, 2018). Kurz gesagt wurden Seeds durch Schwellenwertbildung der Bildintensität identifiziert und verwendet, um die Bilder entlang der Achse des Mikrotubulus zu segmentieren. Die Bilder wurden dann automatisch auf 4 Pixel oberhalb und unterhalb der Mikrotubuli-Achse beschnitten, und dann wurde die maximale Intensitätsprojektion für jeden Zeitpunkt gestapelt, um Kymogramme für die Analyse zu erzeugen.

Polymerisations- und Depolymerisationsraten wurden berechnet, indem die Veränderungen der Mikrotubulilänge und -zeit vom ersten und letzten Punkt der einzelnen Polymerisations- und Depolymerisationsereignisse aus den Kymographen gemessen wurden. Die Konstanten der Polymerisationsgeschwindigkeit wurden als Steigung des linearen Modells der Polymerisationsgeschwindigkeit geschätzt. Die Konstanten der Depolymerisationsrate wurden auf ähnliche Weise bestimmt, jedoch unter Verwendung der mittleren Depolymerisationsrate (µm*min –1 ) aus allen gepoolten Tubulinkonzentrationen.

Die Rettungs- und Katastrophenhäufigkeit wurde als Quotient aus der Anzahl der Übergänge und der Depolymerisations- bzw. Polymerisationsdauer berechnet. Die Häufigkeit der Rettung wurde bestimmt, indem die Anzahl der einzelnen Rettungsereignisse durch die Gesamtlänge dividiert wurde, die während der Depolymerisation verloren ging. Einzigartige Rettungsereignisse wurden als Rettungsstellen definiert, die mindestens 200 nm von vorherigen Rettungsstellen auf dem Mikrotubulusgitter entfernt waren. Die Rettungsposition relativ zum Plus-Ende wurde als Differenz zwischen der Länge der Mikrotubuli bei der Katastrophe und der Länge bei der Rettung berechnet.

Tubulin-Einwaschversuche

Für Wash-in-Experimente wurden GMPCPP-geimpfte Bildgebungskammern ähnlich zusammengebaut, jedoch nicht mit VALAP versiegelt. Die Bildgebungskammern wurden 3–5 Minuten auf dem Tisch erwärmt, sodass sich die Temperatur auf 37 °C ausgleichen konnte, und dann wurden dynamische Mikrotubuli 10 Minuten lang abgebildet, bevor die Bildgebungskammer mit dem 4–5-fachen Kammervolumen an warmem Reaktionspuffer gespült wurde. Die Bildaufnahme wurde während der Kammerspülung angehalten und unmittelbar danach wieder aufgenommen. Die durchschnittliche Einwaschdauer für alle Einwaschversuche betrug ∼60 s vom Zeitpunkt der Aufnahmepause bis zur Wiederaufnahme.

Die Bilder wurden wie oben beschrieben verarbeitet, mit zusätzlicher Bildstabilisierung nach der Aufnahme, die verwendet wurde, um kleinere XY Drift während der Bildaufnahme mit dem Bildstabilisator-Plug-in für ImageJ (Li, 2008).

Bestimmung der Tubulinkonzentration

Für jedes Experiment wurde die Tubulinkonzentration bestimmt, indem eine Probe des Bildgebungspuffers, der unpolymerisiertes Tubulin enthielt, auf einem 10 % Bis-Tris SDS-PAGE-Gel laufen gelassen wurde, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Blau. Die Konzentration wurde durch Densitometrie bestimmt, direkt verglichen mit einer Standardkurve, die aus Rinderserumalbumin-Standards erstellt wurde, die auf demselben Gel gefahren wurden.

Monte-Carlo-Simulationen

Die Dynamik der Mikrotubuli wurde mit einem maßgeschneiderten MATLAB-Programm simuliert. Mikrotubuli wurden als einzelnes lineares Filament modelliert, das aus einem einzigen „Samen“ gebildet wurde und in Übereinstimmung mit experimentellen Beobachtungen wachsen und schrumpfen würde. Die Ausgabe der Simulation modellierte Veränderungen der Mikrotubuluslänge im Laufe der Zeit. Die Zeit wurde für diese Simulationen auf 1 s kalibriert. Simulierte Längenänderungen wurden durch begrenzte zufällige Stichproben von Polymerisations- und Depolymerisationsraten bei experimentell beobachteten Frequenzen bestimmt. Die Ober- und Untergrenzen dieser Raten wurden jeweils als Max und Min der experimentell beobachteten Raten definiert. Simulierte Mikrotubuli-Übergangsfrequenzen wurden in ähnlicher Weise angewendet. Bei den Simulationen wurde eine Reihe von Tubulinkonzentrationen (5–8 µM) untersucht, um mit den experimentellen Daten konsistent zu sein.

Rettungen wurden stochastisch simuliert und unterschieden sich geringfügig zwischen den beiden Modellen. Für das endgetriebene Modell wurden Rettungsereignisse darauf beschränkt, stochastisch nur während der Depolymerisation mit einer Häufigkeit aufzutreten, die mit der experimentell beobachteten Rettungshäufigkeit übereinstimmte. Für das gittergesteuerte Modell wurden Rettungsaktionen simuliert, indem Stellen mit einer empirisch abgeleiteten Frequenz in den wachsenden Mikrotubulus eingebaut wurden. Nach einer Katastrophe wurde ein Rettungsereignis ausgelöst, als sich das depolymerisierende Ende der Einbaustelle innerhalb von 100 nm näherte. Der Einfachheit halber haben wir Rettungsstellen so modelliert, dass sie nach der Integration in das Gitter nur zu einem einzigen Rettungsereignis pro Stelle führen. Die simulierten Mikrotubuluslängen wurden als experimentelle Daten analysiert.


Veröffentlicht von der Royal Society unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, die eine uneingeschränkte Nutzung gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Verweise

. 2016 Bedeutung von Hepatokinen bei Stoffwechselstörungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen . BBA-Klin. 5, 108-113. (doi:10.1016/j.bbacli.2016.03.002) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2013 Die Rolle von Hepatokinen im Stoffwechsel . Nat. Rev. Endocrinol. 9, 144-152. (doi:10.1038/nrendo.2012.258) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2006 Primäre Maushepatozyten für systembiologische Ansätze: ein standardisiertes in vitro System zur Modellierung von Signaltransduktionswegen . Syst. Biol. (Stevenage) 153, 433-447. (doi:10.1049/ip-syb:20050067) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Langzeitkultur und Kokultur von primären Ratten- und Human-Hepatozyten . Methoden Mol. Biol. 945, 287-302. (doi:10.1007/978-1-62703-125-7_17) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castell JV, Jover R, Martinez-Jimenez CP, Gomez-Lechon MJ

. 2006 Hepatozytenzelllinien: ihre Verwendung, ihr Umfang und ihre Grenzen in Studien zum Arzneimittelstoffwechsel . Expertenmeinung. Arzneimittel Metab. Giftig. 2, 183-212. (doi:10.1517/17425255.2.2.183) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2016 MiR-1271, das durch gesättigte Fettsäurepalmitat hochreguliert wird, provoziert eine beeinträchtigte Insulinsignalisierung, indem es die INSR- und IRS-1-Expression in HepG2-Zellen unterdrückt. Biochem. Biophys. Res. Komm. 478, 1786-1791. (doi:10.1016/j.bbrc.2016.09.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Knowles BB, Howe CC, Aden DP

. 1980 Humane hepatozelluläre Karzinomzelllinien sezernieren die wichtigsten Plasmaproteine ​​und das Hepatitis-B-Oberflächenantigen. Wissenschaft 209, 497-499. (doi:10.1126/science.6248960) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2013 Proteomweite Analysen humaner Hepatozyten während der Differenzierung und Dedifferenzierung . Hepatologie 58, 799-809. (doi:10.1002/hep.26414) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wisniewski JR, Vildhede A, Noren A, Artursson P

. 2016 Eingehende quantitative Analyse und Vergleich der HepG2-Proteome der humanen Hepatozyten- und Hepatomzelllinie . J. Proteomik 136, 234-247. (doi:10.1016/j.jprot.2016.01.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1994 Etablierung und Charakterisierung von differenzierten, nicht-transformierten Hepatozyten-Zelllinien aus Mäusen, die für die Transformation des Wachstumsfaktors alpha transgen sind. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 91, 674-678. (doi:10.1073/pnas.91.2.674) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hsiao PJ, Chiou HC, Jiang HJ, Lee MY, Hsieh TJ, Kuo KK

. 2017 Pioglitazon verbessert die zytosolische Lipolyse, Beta-Oxidation und Autophagie, um die Lebersteatose zu lindern. Wissenschaft Repräsentant 7, 9030. (doi:10.1038/s41598-017-09702-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Li J, Liu G, Zhang F, Zhang Z, Xu Y, Li Q

. 2017 Rolle von Glykoprotein 78 und Cidec bei Lebersteatose . Mol.-Nr. Med. Repräsentant 16, 1871-1877. (doi:10.3892/mmr.2017.6834) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Die Acetylierung der mitochondrialen trifunktionellen Protein-Alpha-Untereinheit erhöht ihre Stabilität, um die Fettsäureoxidation zu fördern, und wird bei nichtalkoholischer Fettlebererkrankung verringert. Mol.-Nr. Zelle. Biol. 36, 2553-2567. (doi:10.1128/MCB.00227-16) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Su SL, Liu X, Liu J, Peng F, Fang C, Li B

. 2017 miR-494 reguliert den PI3 K/Akt-Signalweg über das Targeting von PTEN nach oben und schwächt hepatische Ischämie-/Reperfusionsschäden in einem Rattenmodell ab. Bioszi. Repräsentant 37, BSR20170798. (doi:10.1042/bsr20170798) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Yao W, Li H, Han X, Chen C, Zhang Y, Tai WL, Xia Z, Hei Z

. 2017 MG53, verankert durch Dysferlin an der Zellmembran, reduziert die Hepatozyten-Apoptose, die durch Ischämie/Reperfusionsverletzung induziert wird in vivo und in vitro . J. Zelle. Mol.-Nr. Med. 21, 2503-2513. (doi:10.1111/jcmm.13171) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Tao GZ, Lehwald N, Jang KY, Baek J, Xu B, Omary MB, Sylvester KG

. 2013 Wnt/beta-Catenin-Signalisierung schützt die Mausleber vor oxidativer Stress-induzierter Apoptose durch die Hemmung des Forkhead-Transkriptionsfaktors FoxO3 . J. Biol. Chem.-Nr. 288, 17 214-17 224. (doi:10.1074/jbc.M112.445965) Crossref, ISI, Google Scholar

1993 Simian virus 40 large tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte characteristics and metabolize chemical carcinogens . Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 90, 5123-5127. (doi:10.1073/pnas.90.11.5123) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Huang BP, Lin CS, Wang CJ, Kao SH

. 2017 Upregulation of heat shock protein 70 and the differential protein expression induced by tumor necrosis factor-alpha enhances migration and inhibits apoptosis of hepatocellular carcinoma cell HepG2 . Int. J. Med. Wissenschaft 14, 284-293. (doi:10.7150/ijms.17861) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ip BC, Hu KQ, Liu C, Smith DE, Obin MS, Ausman LM, Wang XD

. 2013 Lycopene metabolite, apo-10'-lycopenoic acid, inhibits diethylnitrosamine-initiated, high fat diet-promoted hepatic inflammation and tumorigenesis in mice . Cancer Prev. Res. (Phila ) 6, 1304-1316. (doi:10.1158/1940-6207.CAPR-13-0178) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Latorre P, Varona L, Burgos C, Carrodeguas JA, Lopez-Buesa P

. 2017 O-GlcNAcylation mediates the control of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase activity via Pgc1alpha . Plus eins 12, e0179988. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2013 MicroRNA 33 regulates glucose metabolism . Mol.-Nr. Zelle. Biol. 33, 2891-2902. (doi:10.1128/MCB.00016-13) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Heme-regulated eIF2alpha kinase modulates hepatic FGF21 and is activated by PPARbeta/delta deficiency . Diabetes 65, 3185-3199. (doi:10.2337/db16-0155) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Georgiadi A, Lichtenstein L, Degenhardt T, Boekschoten MV, van Bilsen M, Desvergne B, Muller M, Kersten S

. 2010 Induction of cardiac Angptl4 by dietary fatty acids is mediated by peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta and protects against fatty acid-induced oxidative stress . Zirk. Res. 106, 1712-1721. (doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.217380) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2017 Angiopoietin-like protein 4 is an exercise-induced hepatokine in humans, regulated by glucagon and cAMP . Mol.-Nr. Metab. 6, 1286-1295. (doi:10.1016/j.molmet.2017.06.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ramboer E, De Craene B, De Kock J, Vanhaecke T, Berx G, Rogiers V, Vinken M

. 2014 Strategies for immortalization of primary hepatocytes . J. Hepatol. 61, 925-943. (doi:10.1016/j.jhep.2014.05.046) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2008 Consequences of lipid droplet coat protein downregulation in liver cells . Diabetes 57, 2037-2045. (doi:10.2337/db07-1383) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Insulin resistance induces posttranslational hepatic sortilin 1 degradation in mice . J. Biol. Chem.-Nr. 290, 11 526-11 536. (doi:10.1074/jbc.M115.641225) Crossref, ISI, Google Scholar

Chen W, Goff MR, Kuang H, Chen G

. 2015 Higher protein kinase C zeta in fatty rat liver and its effect on insulin actions in primary hepatocytes . Plus eins 10, e0121890. PubMed, ISI, Google Scholar

Magnusson I, Rothman DL, Katz LD, Shulman RG, Shulman GI

. 1992 Increased rate of gluconeogenesis in type II diabetes mellitus. A 13C nuclear magnetic resonance study . J. Clin. Investieren. 90, 1323-1327. (doi:10.1172/JCI115997) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

ter Horst KW, Gilijamse PW, Ackermans MT, Soeters MR, Nieuwdorp M, Romijn JA, Serlie MJ

. 2016 Impaired insulin action in the liver, but not in adipose tissue or muscle, is a distinct metabolic feature of impaired fasting glucose in obese humans . Stoffwechsel 65, 757-763. (doi:10.1016/j.metabol.2016.02.010) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen CC, Lee TY, Kwok CF, Hsu YP, Shih KC, Lin YJ, Ho LT

. 2016 Cannabinoid receptor type 1 mediates high-fat diet-induced insulin resistance by increasing forkhead box O1 activity in a mouse model of obesity . Int. J.Mol. Med. 37, 743-754. (doi:10.3892/ijmm.2016.2475) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Rakhshandehroo M, Hooiveld G, Muller M, Kersten S

. 2009 Comparative analysis of gene regulation by the transcription factor PPARalpha between mouse and human . Plus eins 4, e6796. (doi:10.1371/journal.pone.0006796) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2004 The direct peroxisome proliferator-activated receptor target fasting-induced adipose factor (FIAF/PGAR/ANGPTL4) is present in blood plasma as a truncated protein that is increased by fenofibrate treatment . J. Biol. Chem.-Nr. 279, 34 411-34 420. (doi:10.1074/jbc.M403058200) Crossref, ISI, Google Scholar

Kersten S, Lichtenstein L, Steenbergen E, Mudde K, Hendriks HF, Hesselink MK, Schrauwen P, Muller M

. 2009 Caloric restriction and exercise increase plasma ANGPTL4 levels in humans via elevated free fatty acids . Arterioscler. Thromb. Vask. Biol. 29, 969-974. (doi:10.1161/ATVBAHA.108.182147) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vanden Heuvel JP, Kreder D, Belda B, Hannon DB, Nugent CA, Burns KA, Taylor MJ

. 2003 Comprehensive analysis of gene expression in rat and human hepatoma cells exposed to the peroxisome proliferator WY14,643 . Giftig. Appl. Pharmacol. 188, 185-198. (doi:10.1016/S0041-008X(03)00015-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2015 ANGPTL4 mediates shuttling of lipid fuel to brown adipose tissue during sustained cold exposure . Elife 4, e08428. (doi:10.7554/elife.08428) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


Box 2: Exploiting viruses in mouse genetics

The first transgenic mice were generated by infecting embryos with viruses [97], and today viral vectors remain an integral part of the mouse genetics toolkit. Lentiviruses integrate their genome into the host's DNA, making them an effective transgene delivery vector. The lentiviral genome, derived from immunodeficiency viruses, has been deconstructed and distributed across multiple plasmids to minimize the potential formation of replication-competent viruses [98]. A transgene of interest may be included in a plasmid containing a viral packaging signal. This is co-transfected into a cell line (typically human embryonic kidney HEK293T cells) with other plasmids expressing proteins required for viral production, such as envelope proteins. Viruses produced in this way can be introduced into oocytes for transgenesis (reviewed in [99]). In its simplest form, this method necessitates only a few weeks between target selection and phenotypic analysis, offering a distinct advantage over other approaches. To enable pooled loss-of-function screens to identify complex genetic interactions, lentiviral short hairpin RNA (shRNA) libraries targeting most mouse genes have been generated [27]. Some groups have recently used ultrasound-guided microinjections of lentiviruses to deliver genes to organs and tissues of early mammalian embryos in utero [100].

Slow transforming retroviruses have been widely used to generate mouse models of cancer [101]. They can re-infect the same cell, randomly inserting their genome into the host DNA multiple times, resulting in an accumulation of mutations. This process of progressive mutagenesis recapitulates the multi-step progression of human tumorigenesis (reviewed in [102]). The development of next-generation sequencing technologies has dramatically enhanced the process of identifying retroviral insertion sites, and databases, such as the Retroviral Tagged Cancer Gene Database, have been developed to map insertion sites to the reference genome [103].


A-T AND THE ATM GENE

A-T is a rare disease characterized by a loss of motor control (ataxia), dilated blood vessels in the eyes and facial area (telangiectasia), and an assortment of other problems, including immunodeficiency leading to recurrent pulmonary and sinus infections and a predisposition to cancer. A-T patients are not mentally impaired and can lead productive lives, although they often require assistance and usually become wheelchair bound at an early age. Although some have survived into their 40s and 50s, most A-T patients die at an earlier age from respiratory failure or cancer. In addition, heterozygous carriers of an A-T mutation (∼1% of the general population) are three to five times more susceptible to cancer than are noncarriers ( Swift et al., 1991).

The gene responsible for A-T, called Ataxia Telangiectasia Mutated (Geldautomat), encodes a large protein with a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–like domain at the C terminus (reviewed by Rotman and Shiloh, 1998). PI3K-related proteins make up a large family of Ser-Thr protein kinases, numerous members of which are involved in the regulation of cell cycle progression, responses to DNA damage, and the maintenance of genomic stability ( Hoekstra, 1997). Mammalian ATM has been found to play critical roles in cellular responses to ionizing radiation (IR) and in normal cell cycle progression and meiosis ( Xu and Baltimore, 1996 Rotman and Shiloh, 1998). More specifically, it is believed to function in the response to DNA double-strand breaks that occur as a result of IR and also during normal cellular processes (reviewed by Rotman and Shiloh, 1998).

For example, immunodeficiency in A-T patients is believed to be related to an essential role of ATM in V(D)J recombination that is essential for normal lymphocyte development. (Genes that encode antigen receptor variable regions are not inherited intact but are assembled from different germline DNA segments via V(D)J recombination during the early stages of lymphocyte differentiation.) ATM deficiency in mammals also results in severe meiotic disruption and sterility ( Barlow et al., 1998) and is believed to be involved in the repair of DNA breaks that occur normally during meiotic recombination ( Rotman and Shiloh, 1998). ATM also is active in the response to DNA damage induced by IR. In mammalian cells, ATM-mediated responses to DNA damage induced by IR include the activation of cell cycle checkpoints, DNA repair, and apoptosis ( Rotman and Shiloh, 1998).

Garcia et al. (2000)identified a homolog of Geldautomat in Arabidopsis, AtATM, which is present in a single copy on the short arm of chromosome 3. The gene contains 79 exons, which is the largest number of exons in the Arabidopsis genome. The AtATM protein has 3856 amino acid residues and is more similar to mammalian ATM than to various other PI3K-related proteins. In dieser Ausgabe von Die Pflanzenzelle, Garcia et al. (pages 119–132) describe the isolation and characterization of two T-DNA insertion mutants of AtATM in Arabidopsis and show that AtATM plays an essential role in meiosis and in the somatic response to DNA damage in plants, similar to the function of ATM in mammals and other eukaryotes.

Garcia et al. (2003)analyzed two independent T-DNA insertion mutants of AtATM. Die atm-1 mutant, in the Wassilewskija background, contains a T-DNA insertion in exon 78. A second mutant, atm-2, was isolated in the Columbia background and contains a complex insertion in intron 64 that includes the insertion of filler DNA from other regions of the genome on both sides of the T-DNA and a truncated right border. Both mutants exhibit similar phenotypic characteristics that are consistent with a dual role for the ATM protein in the DNA damage response pathway and in the regulation of meiosis.


Cannabinoids and Their Receptors

Morag R. Hunter , . Michelle Glass , in Methods in Enzymology , 2017

3 Design and Validation of V8-CAMYEL

While CAMYEL ( Jiang et al., 2007 ) is excellent for use in large samples of easily transfectable cell lines , there are various experimental designs which would benefit from a biosensor with an increased bioluminescent output. Experiments on very small populations of cells, for example, are technically challenging because there can be too few photons released from the biosensor per well to be efficiently detected by standard plate readers. In order to increase the bioluminescent output and increase stability in mammalian cytoplasm, the luciferase in CAMYEL was changed to the mutant Rluc8 ( Loening, Fenn, Wu, & Gambhir, 2006 ) and the fluorescent acceptor was changed to Venus ( Nagai et al., 2002 ). This pairing was predicted to increase the quantum yield of the biosensor. The new biosensor was called “V8-CAMYEL” (pcDNA3L-His-V8-CAMYEL) and can be obtained from the corresponding author of this chapter. The modifications in V8-CAMYEL have allowed the measurement of biosensor activity from much smaller samples of cells in a conventional plate reader.

3.1 Validation of V8-CAMYEL

In order to validate V8-CAMYEL, it was tested alongside the original CAMYEL biosensor. These assays were designed to verify that modifications to the BRET pair did not alter the responsiveness of the biosensor to changes in cytoplasmic cAMP in mammalian cells. First, the biosensors were compared in their responsiveness to forskolin, an adenylate cyclase agonist, which directly modifies the production of cAMP. Then the biosensors were assayed for responsiveness to an endogenously expressed Gαs-coupled GPCR (PAC1, agonist: PACAP) and a stably transfected Gαi-coupled GPCR (CB1, agonist: CP55,940).

To determine that the V8-CAMYEL biosensor acted equivalently to the original CAMYEL construct, cAMP assays were performed using both biosensors. The HEK 3HA-hCB1 cell line was transiently transfected with either the CAMYEL or V8-CAMYEL construct and assayed as per the protocol for adherent cells described earlier.

The results of these assays are shown in Fig. 2 . As predicted, V8-CAMYEL had much higher light emissions in both the 460/25 nm and 535/25 nm channels, on average a 2.5-fold increase when transiently transfected ( Fig. 2 A). AUC measurements were taken across 20 min and used to generate concentration–response curves for forskolin and CP55,940. In the case of PACAP, data were collected 5 min after agonist addition for 15 min. V8-CAMYEL showed equivalent sensitivity to these agonist-induced cAMP changes compared to the original CAMYEL biosensor.

The overall range of inverse BRET ratios measured is reduced in V8-CAMYEL compared to the parental construct, as shown in Fig. 2 E and F. This indicates that, ratiometrically, Venus emissions in V8-CAMYEL are higher relative to luciferase than in the original construct, thus making the inverse BRET ratio lower. This is not entirely surprising, as the increased quantum yield of Rluc8 ( Loening et al., 2006 ) may increase the energy transfer to Venus. There is also likely to be a higher proportion of functional Venus fluorophore in V8-CAMYEL, as this acceptor protein matures faster than other YFP derivatives ( Nagai et al., 2002 ). However, when drug responses are normalized to an internal control (e.g., 5 μm forskolin), V8-CAMYEL shows an improved signal-to-noise ratio, approximately 1.78 ± 0.03-fold higher than the original CAMYEL biosensor across the dynamic range.

Overall, V8-CAMYEL was found to perform equivalently to the original CAMYEL biosensor, but with the considerable advantage of increased total luminescence. This allows us to obtain a useable biosensor signal from extremely small samples of cells, using a standard luminescence plate reader.

3.1.1 Stable Cell Lines

Stable cells lines expressing V8-CAMYEL can be used to streamline experimental workflow. In this example, HEK293 FlpIn cells (Invitrogen, CA, USA) were stably transfected with CAMYEL or V8-CAMYEL using the standard, random-integration transfection method, in order to allow the FlpIn site to be used for future transfection. After selection, both cell lines contained very similar levels of biosensor expression. Here, we show example data from these cell lines assayed in the suspension assay format described above, using 384-well microtiter plates.

Fig. 3 shows that a stable cell line expressing V8-CAMYEL maintains a useable window for measuring cAMP signaling, even when diluted to very low cell numbers. Furthermore, when AUC analysis is an acceptable measurement (thus averaging out some assay noise), HEK293 FlpIn V8-CAMYEL cells can be diluted much further we have found these cells can be diluted to 312 cells/well. This opens the possibility of using this biosensor with hard to transfect cells, or primary cells where cells are less abundant.

Abb. 3 . HEK293 FlpIn cells were stably transfected with (A and C) CAMYEL or (B and D) V8-CAMYEL and treated with vehicle (Schwarz) and forskolin (grau). Cells were diluted to (A and B) 20,000 cells/well or (C and D) 1250 cells/well in a 384-well plate. Duplicate wells of cells treated at the same time are shown for each condition, plotted as nonnormalized inverse BRET ratios.


Schau das Video: .. man weiß nicht, in welche Zellen die mRNA gelangt! - Prof. Sucharit Bhakdi. VÖ: (Kann 2022).