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Epithelzellen und Rhinovirus

Epithelzellen und Rhinovirus


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Wenn Sie einem Tumor mit Rhinovirus infizierten Epithelzellen injizieren würden, würde dies dann immer noch eine Immunantwort hervorrufen, wie dies bei den Atemwegen der Fall wäre? Zweitens, was ist der spezifische Grund, warum das Rhinovirus nur von den Epithelzellen im Atmungssystem angezogen wird? Geben diese Zellen eine spezifische chemische Signatur ab, von der das Virus angezogen wird?


Die Infektion von Tumorzellen mit Viren, um eine Immunantwort hervorzurufen, wurde früher als (Tumor/Immun-) „Xenogenisierung“ bezeichnet. Der Ansatz kann nun unter die Oberbegriffe Tumorimmunologie, Immunmodifikatoren oder Tumorvakzine fallen. Die Xenogenisierung wird seit Jahrzehnten erforscht (mit nur mäßigem Erfolg). Einige moderne Ansätze beinhalten das Hinzufügen immunstimulierender Gene zum viralen „Vektor“ (z. B. GM-CSF), um eine Immunantwort zu verbessern. Die Xenogenisierung ist in der Regel für die Anwendung mit patienteneigenen (autologen) Tumorzellen vorgesehen. Andere Ansätze, die Viren verwenden, umfassen die Abgabe von Genen, die vorzugsweise in Tumorzellen wirken, oder "Tumorantigene". Einige dieser modifizierten Viren wurden möglicherweise so entwickelt, dass sie eine geringe oder keine Fähigkeit zur Replikation im Körper haben. Beachten Sie, dass einige Viren wie Influenza- oder Rhinoviren (im Allgemeinen) nicht in der Lage sind, im Blutkreislauf zu zirkulieren (Virämie), um entfernte Tumorzellen zu infizieren. Stattdessen besteht das Ziel der Verwendung solcher Viren darin, eine Immunantwort gegen Tumorantigene zu provozieren, die auf den "original infizierten" Zellen an der Injektionsstelle exprimiert werden, und zu hoffen, dass das Immunsystem weiter entfernte Massen/Metastasen angreift.


Das Virus hat einige Moleküle auf seiner Oberfläche, die an Rezeptoren auf der Oberfläche seiner Wirtszellen passen. Bei Rhinoviren sind drei Rezeptoren möglich. Die Viren der sogenannten Hauptgruppe (oder HRV-A-Spezies) docken an ICAM1, die Nebengruppe (oder HRV-B-Spezies) an den LDLR (Low Density Lipid Rezeptor) und die relativ junge Gruppe der HRV-C docken an der HRVC-Rezeptor. Siehe das Bild unten. Es stammt aus diesem Artikel ("Human Rhinoviren"), der einen ziemlich schönen Überblick über das Gebiet gibt.

Zur Injektionsfrage: Sie werden eine Immunreaktion gegen die Epithelzellen provozieren, wenn diese von einer anderen Person stammen. Wenn dies nicht der Fall ist, sterben diese Zellen einfach ab und es passiert nichts mehr.


Rhinovirus-Infektion ist bei kleinen Kindern mit Mukoviszidose mit der Nekrose und Entzündung von Epithelzellen der Atemwege über Interleukin-1 verbunden

Einführung: Die Reaktionen von Mukoviszidose-(CF)-Atemwegsepithelzellen (AEC) auf eine Rhinovirus-(RV)-Infektion tragen wahrscheinlich zu einer frühen Pathobiologie der Lungenerkrankung mit erhöhter neutrophiler Entzündung und geringer berichteter Apoptose bei. Eine Nekrose von AEC, die zu einer Atemwegsentzündung führt, die durch IL-1-Signale ausgelöst wird, ist ein charakteristischer Befund bei CF, der in den Atemwegen von Kleinkindern nachweisbar ist. Als häufigste Infektion im frühen Leben kann die RV-induzierte Epithelnekrose über den IL-1-Signalweg zu einer frühen neutrophilen Entzündung bei CF beitragen. Da wenig über IL-1 und die Biologie der Lungenerkrankung bei CF bekannt ist, untersuchte diese Studie die zellulären und proinflammatorischen Reaktionen von CF und Nicht-CF-AEC nach einer RV-Infektion mit der Hypothese, dass eine RV-Infektion epitheliale Nekrose und IL-1-bedingte Entzündungen fördert . Methoden:Primäre AEC von Kindern mit (n = 6) und ohne CF (n = 6) wurden mit RV (MOI 3) für 24 h infiziert und lebensfähige, nekrotische und apoptotische Ereignisse quantifiziert mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung einer siebenstufigen Gating-Strategie (% Gesamtereignisse). IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-8, CXCL10, CCL5, IFN-β, IL-28A, IL-28B und IL-29 wurden auch in Zellkulturüberständen (pg/ml) gemessen. Ergebnisse:RV-Infektion reduziert lebensfähige Ereignisse bei Nicht-CF-AEC (P < 0,05), erhöhte nekrotische Ereignisse bei Nicht-CF- und CF-AEC (P < 0,05) und erhöhte apoptotische Ereignisse bei Nicht-CF-AEC (P < 0,05). Die Infektion induzierte die Produktion von IL-1α und IL-1β in beiden Phänotypen (P < 0,05), aber nur mit Nekrose korreliert (IL-1α: R = 0,80 IL-1β: R = 0.77 P < 0,0001) in CF AEC. Eine RV-Infektion erhöhte auch IL-1Ra bei Nicht-CF- und CF-AEC (P < 0,05), wenn auch deutlich mehr bei Nicht-CF-AEC (P < 0,05). Schließlich stimulierte die Infektion die IL-8-Produktion in Nicht-CF- und CF-AEC (P < 0,05) und korreliert mit IL-1α (R = 0,63 & R = 0,74 bzw. P < 0,0001). Schlussfolgerungen:Diese Studie ergab, dass eine RV-Infektion den nekrotischen Zelltod bei CF-AEC fördert. Darüber hinaus korrelierte RV-induziertes IL-1 stark mit dem nekrotischen Zelltod in diesen Zellen. Da die IL-1R-Signalgebung die Neutrophilie und die Muzinproduktion der Atemwege antreibt, deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass eine RV-Infektion im frühen Lebensalter Entzündungen und Muzinakkumulationen verschlimmern kann, die eine frühe CF-Lungenerkrankung verursachen. Da IL-1R therapeutisch mit IL-1Ra angesteuert werden kann, legen diese Daten einen neuen entzündungshemmenden therapeutischen Ansatz nahe, der auf nachgeschaltete Effekte der IL-1R-Signalgebung abzielt, um viral induzierte, muko-inflammatorische Auslöser früher Lungenerkrankungen zu mildern.

Schlüsselwörter: Atemwegsepithel Mukoviszidose Interleukin-1-Nekrose Rhinovirus.

Copyright © 2020 Montgomery, Frey, Mall, Stick und Kicic.

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Rhinovirus-Infektion von Nicht-CF und…

Eine Rhinovirus-Infektion von Nicht-CF und CF AEC verringert lebensfähige Ereignisse, erhöht nekrotische Ereignisse,…

IL-1α und IL-1β sind erhöht…

IL-1α und IL-1β sind im Überstand von Nicht-CF- und CF-AEC nach…

IL-1α und IL-1β im Überstand…

IL-1α und IL-1β im Überstand sind mit nekrotischen Ereignissen bei CF AEC verbunden…

Eine Rhinovirus-Infektion erhöht IL-1Ra und…

Eine Rhinovirus-Infektion erhöht die IL-1Ra- und IL-8-Signalgebung im Überstand von Nicht-CF und CF…

Die Rolle der Rhinovirus-Infektion…

Die Rolle der Rhinovirus-Infektion bei der IL-1-Entzündungsreaktion bei der CF…


Der Toll-like-Rezeptor 3 wird durch eine Rhinovirus-Infektion humaner Bronchialepithelzellen induziert und vermittelt antivirale Aktivität gegen diese

Rhinoviren (RV) sind die Hauptursache für Erkältungen und akute Exazerbationen von Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind eine konservierte Familie von Rezeptoren, die eine Vielzahl von pathogenassoziierten molekularen Mustern erkennen und darauf reagieren. TLR3 erkennt doppelsträngige RNA, ein wichtiges Zwischenprodukt vieler viraler Lebenszyklen (einschließlich RV). Die Bedeutung von TLR3 bei der Reaktion des Wirts auf eine Virusinfektion ist nicht bekannt. Mit BEAS-2B (einer humanen Bronchialepithelzelllinie) zeigten wir, dass die RV-Replikation die Expression von TLR3-mRNA und TLR3-Protein auf der Zelloberfläche erhöht. Wir beobachteten, dass die Blockierung von TLR3 zu einer Abnahme von Interleukin-6, CXCL8 und CCL5 als Reaktion auf Poly(IC) führte, jedoch zu einer Zunahme nach einer RV-Infektion. Schließlich haben wir gezeigt, dass TLR3 die antivirale Reaktion vermittelt. Diese Studie zeigt eine wichtige funktionelle Voraussetzung für TLR3 in der Wirtsantwort gegen eine Lebendvirusinfektion und zeigt, dass Poly(IC) nicht immer ein gutes Modell zum Studium der Biologie einer Lebendvirusinfektion ist.

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RV-Infektion führt zu zeitabhängigen…

Eine RV-Infektion führt zu einem zeitabhängigen Anstieg der TLR3-mRNA und der Oberflächenproteinexpression.…

Induktion des TLR3-Oberflächenproteins…

Die Induktion der TLR3-Oberflächenproteinexpression ist dosisabhängig und serotypunabhängig und…

Die proinflammatorische Wirkung funktioneller…

Die proinflammatorische Wirkung der funktionellen Hemmung von oberflächenexprimiertem TLR3 als Reaktion auf poly(IC)…

Die Wirkung der funktionellen Hemmung…

Die Wirkung der funktionellen Hemmung von oberflächenexprimiertem TLR3 auf die RV-Replikation. Zellen waren…

Ein Schema für das Differential…

Ein Schema für die unterschiedlichen Effekte, die durch die Hemmung von Oberflächen-TLR3 vermittelt werden. Hemmung…


Die respiratorischen Epithelzellen der Maus unterstützen die effiziente Replikation des humanen Rhinovirus

Humane Rhinoviren (HRV) sind für die Mehrzahl der Virusinfektionen der oberen Atemwege verantwortlich. Darüber hinaus ist eine HRV-Infektion mit einer akuten Exazerbation von Asthma und anderen chronischen Atemwegserkrankungen der unteren Atemwege verbunden. Für die Entwicklung neuer Therapien ist ein Kleintiermodell der HRV-induzierten Erkrankung erforderlich. Es ist jedoch schwierig, mit bestehenden Mausmodellen der HRV-Infektion zu arbeiten, und bis vor kurzem wurde angenommen, dass Mauszelllinien für die HRV-Replikation in vitro im Allgemeinen nicht permissiv sind. In diesem Bericht zeigen wir, dass ein Virus der kleineren Rezeptorgruppe, HRV1B, eine respiratorische Epithelzelllinie (LA-4) der Maus effizienter infizieren und replizieren kann als in einer Mausfibroblastenzelllinie (L). Das Virus der Hauptrezeptorgruppe HRV16 benötigt das humane interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) für den Zelleintritt und kann daher LA-4-Zellen nicht infizieren. Die Transfektion von in vitro transkribierter HRV16-RNA führte jedoch zur Replikation viraler RNA und zur Produktion von infektiösem Virus. Die Expression eines chimären ICAM-1-Moleküls, das Maus-ICAM-1 umfasst, wobei die extrazellulären Domänen 1 und 2 durch die äquivalenten humanen Domänen ersetzt wurden, machte die ansonsten nicht-permissive Maus-Atemwegsepithelzelllinie empfänglich für den Eintritt und die effiziente Replikation von HRV16. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Entwicklung von Mausmodellen für Atemwegsinfektionen sowohl durch die Haupt- als auch durch die Nebengruppen-HRV verfolgt werden sollte.


Durch Rhinovirus-Infektion induzierte Veränderung von Tight-Junction- und Adhärens-Junction-Komponenten in humanen Nasenepithelzellen

Zu den Manifestationen von Rhinovirus (RV)-Infektionen gehören Schleimüberproduktion, erhöhte Gefäßpermeabilität und sekundäre bakterielle Infektionen. Diese Effekte können gestörte epitheliale Barrierefunktionen widerspiegeln, die hauptsächlich durch interzelluläre Verbindungen reguliert werden, die als Tight Junctions (TJs) und Adhärens Junctions (AJs) bezeichnet werden. Das Ziel dieser Studie war es, Veränderungen der Komponenten von TJs (ZO-1, okkludierend und Claudin-1) und AJs (E-Cadherin) nach RV-Infektion in kultivierten Nasenepithelzellen zu untersuchen.

Methoden:

Primäre humane Nasenepithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden, wurden apikal mit RV infiziert. RV-induzierte Veränderungen in der Expression von epithelialen TJ- und AJ-Proteinen wurden mit Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen bestimmt. Funktionelle Veränderungen in der Integrität von Junktionsproteinen wurden durch Messung des transepithelialen Widerstands (TER) unter Verwendung eines Voltmeters bewertet.

Ergebnisse:

Die RV-Infektion verringerte die mRNA-Spiegel von ZO-1, Occludin, Claudin-1 und E-Cadherin auf 64,2 %, 51,8 %, 56,2 % bzw. 56,3 % der Kontrollen (P < .05). In immunfluoreszierenden konfokalen mikroskopischen Bildern waren Abnahmen der ZO-1-, Occludin-, Claudin-1- und E-Cadherin-Proteinspiegel in RV-infizierten Zellen ersichtlich. Die Expressionsspiegel dieser Proteine ​​waren in der RV-infizierten Gruppe in Western-Blot-Analysen ebenfalls niedriger. RV-Infektion reduzierte die mittlere TER von 143,1 /cm 2 (Kontrollen) auf 122,6 Ω/cm 2 .

Schlussfolgerungen:

Eine RV-Infektion verringerte die Expression von TJ- und AJ-Komponenten und verringerte die TER in primär kultivierten humanen Nasenepithelzellen, was darauf hindeutet, dass eine RV-Infektion eine schädliche Wirkung auf die Barrierefunktion des Nasenepithels haben kann. Laryngoskop, 2010


Biologische Eigenschaften und Vermehrung des humanen Rhinovirus-C in differenzierten Sinusepithelzellen

Informationen über die grundlegenden biologischen Eigenschaften von humanen Rhinovirus-C (HRV-C)-Viren fehlen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kultivierung dieser Viren. Unser Ziel war es, ein Zellkultursystem zur Züchtung von HRV-C zu entwickeln. Epithelzellen aus menschlichen Nebenhöhlen (HSEC) wurden an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) differenziert. Differenzierte Kulturen unterstützten ein Wachstum von 1-2 logs von HRV-C15, wie durch quantitative RT-PCR nachgewiesen. Zwei charakteristische Merkmale von HRVs sind Säurelabilität und optimales Wachstum bei 33-34 °C. Wir haben dieses System verwendet, um zu zeigen, dass HRV-C15 durch einen niedrigen pH-Wert (4,5) neutralisiert wird. Im Gegensatz zu den meisten HRV-Typen war die Replikation von HRV-C15 und HRV-C41 bei 34 und 37 °C ähnlich. Das HSEC ALI bietet ein nützliches Werkzeug für quantitative Studien der HRV-C-Replikation. Die Fähigkeit von HRV-C, bei 34 °C und 37 °C gleich gut zu wachsen, kann dazu beitragen, dass HRV-C bei Säuglingen und Kindern mit Asthma zu Erkrankungen der unteren Atemwege führt.

Copyright © 2012 Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

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Mikrophotographie des menschlichen Sinusepithels…

Mikrophotographie von humanem Sinusepithel nach Differenzierung bei ALI (Haemotoxylin & Eosin, 600×…

Vermehrung von HRV-C15 in verschiedenen…

Vermehrung von HRV-C15 in verschiedenen Formen des menschlichen Sinusepithels. (A) Stücke von…

HRV-Infektion von ALI-Kulturen.…

HRV-Infektion von ALI-Kulturen. HSEC ALI Kulturen ( n =6) um 21…

Dosis-Wirkungs-Kurve der HRV…

Dosis-Wirkungs-Kurve der HRV bei differenzierter HSEC. Differenzierte HSEC-Kulturen ( n…

Einfluss des Kulturalters auf die HRV-C15-Replikation. HSEC-Kulturen ( n =3)…

Empfindlichkeit von HRV-C15 auf niedrige…

Empfindlichkeit von HRV-C15 gegenüber niedrigem pH-Wert. HRV-C15 wurde 1:10 in Citratphosphat verdünnt…

Einfluss der Temperatur auf HRV-C…

Einfluss der Temperatur auf die HRV-C-Replikation. (A) Differenzierte Kulturen von HSEC ( n…


Respiratorische Virusinfektionen sind häufig und können für Patienten mit einer zugrunde liegenden Lungenerkrankung verheerend sein. Die Diagnose von Virusinfektionen erfordert oft eine invasive Probenahme, und die Interpretation erfordert oft spezielle Laborgeräte. Hier testen wir die Hypothese, dass ein Atemtest Influenza- und Rhinovirus-Infektionen anhand eines In-vitro-Modells der menschlichen Atemwege diagnostizieren könnte.

Kultivierte primäre humane tracheobronchiale Epithelzellen wurden entweder mit Influenza A H1N1 oder Rhinovirus 1B infiziert und mit gesunden Kontrollzellen verglichen. Messungen von flüchtigen Metaboliten im Headspace von Zellkulturen wurden 12 Stunden nach der Infektion unter Verwendung eines thermischen Desorptions-Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahrens durchgeführt.

Basierend auf 54 Verbindungen unterschieden statistische Modelle Profile flüchtiger organischer Verbindungen von Influenza- und Rhinovirus-infizierten Zellen von gesunden Gegenstücken. Die Werte der Fläche unter der Kurve betrugen 0,94 für Influenza, 0,90 für Rhinovirus und 0,75 für Kontrollen. Die Regressionsanalyse sagte vorher, wie viele Stunden vorher Zellen infiziert wurden, mit einem quadratischen Mittelwertfehler von 6,35 Stunden für Influenza- und 3,32 Stunden für Rhinovirus-infizierte Zellen.

Flüchtige Biomarker, die von Bronchialepithelzellen freigesetzt werden, könnten nicht nur verwendet werden, um zu diagnostizieren, ob Zellen infiziert waren, sondern auch zum Zeitpunkt der Infektion. Unser Modell unterstützt die Hypothese, dass ein Atemtest zur Diagnose von Virusinfektionen dienen könnte.


Virusinfektionen

Epidemiologie und Übertragung

Wohnmobile sind weltweit im Vertrieb. In den Vereinigten Staaten wurde beobachtet, dass RV bei Erwachsenen 0,74 bis 0,77 Infektionen pro Person und Jahr verursacht. Es wird angenommen, dass RV bei Kindern noch höhere Infektionsraten hervorruft, was zur Bildung von Antikörpern gegen die verschiedenen RV-Typen während der Kindheit und Jugend führt, wobei die Antikörperprävalenz bei jungen Erwachsenen am höchsten ist. Die Immunität gegen RV ist typspezifisch und bietet einen lang anhaltenden Schutz nach einer Infektion, obwohl es zu Zweitinfektionen mit demselben Virustyp kommen kann. Die verschiedenen Immuntypen zirkulieren in einer gegebenen Population auf scheinbar zufällige Weise. In den Vereinigten Staaten treten RV-Infektionen im frühen Herbst und im späten Frühjahr am häufigsten auf.

Das Hauptreservoir für RV sind Schulkinder, die RV-Infektionen unter Gleichaltrigen im Klassenzimmer übertragen und in ihre Häuser einschleppen und andere Familienmitglieder infizieren. Studien zu experimentellen RV-Erkältungen bei Freiwilligen haben gezeigt, dass RV am effizientesten durch kontaminierte Finger verbreitet wird, die versehentlich Viren in Nase oder Auge absetzen. Experimentelle RV-Übertragung wurde auch über die Luft erreicht, vermutlich durch großteiliges Aerosol. Die relative Bedeutung dieser beiden Wege der RV-Übertragung unter natürlichen Bedingungen wurde nicht bestimmt.


Materialen und Methoden

Patienten

Gesund (n = 8), Asthma (n = 10) und COPD (n = 9). Gesunde Kontrollpatienten wurden aus anderen Gründen als Asthma oder COPD einer diagnostischen Bronchialbiopsie unterzogen. Asthmapatienten wurden gemäß den GINA-Richtlinien als leicht bis schwer eingestuft. COPD-Patienten wurden nach den GOLD-Richtlinien klassifiziert (Tabelle 1).

Die ethische Zustimmung zur Entnahme der erforderlichen Gewebeproben besteht als generelle Erlaubnis, nicht benötigtes Biopsiematerial für wissenschaftliche Studien zu verwenden, nachdem jeder Patient schriftlich zugestimmt hat (EKBB 05/06).

Eine Standardlösung von OM-85 wurde von OM Pharma SA, 1217 Meyrin 1, Schweiz, bereitgestellt

Isolierung und Charakterisierung von Bronchialepithelzellen (BEC)

Dies wurde bereits früher veröffentlicht [32]. Kurz gesagt, kleine Stücke (2 x 2 x 2 mm) von Bronchialgewebe wurden in Zellkulturgefäße gegeben, die mit BEC-spezifischem Medium Cnt-PR-A (CellnTech, Bern, Schweiz) vorbenetzt wurden. Das Medium wurde jeden zweiten Tag ersetzt und die BEC wurden durch Trypsin/EDTA-Behandlung (5 min, 37 °C) passagiert, bevor sie in 3 ml Cnt-PR-A, das 25 % fötales Kälberserum enthielt, zur besseren Haftung resuspendiert wurden. Das Adhäsionsmedium wurde nach 18 Stunden durch Cnt-PR-A ersetzt. BEC wurden durch positive Färbung von E-Cadherin (Abcam 15148, Abcam, Cambridge, UK), Pan-Cytokeratin (sc-8018, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Cytokeratin-14 (Abcam 9220) und negative Färbung auf Fibronektin (Abcam 23751), wie in Fig. 1A gezeigt.

(A) BEC-Charakterisierung durch IF-Färbung für: E-Cadherin, Cytokeratin-14, Pan-Cytokeratin und negative Färbung für Fibronectin. Bilder wurden mit einem EVOS-Mikroskop (ThermoFisher Scientific, Schweiz) erhalten. (B) Behandlungsschemata für die BEC-Behandlung mit OM-85 und RV-Infektion.

Rhinovirus (RV)-Infektion und Bestimmung der Infektionsrate

Der für die Experimente verwendete RV-Stamm wurde bereits früher beschrieben [33] und wurde als RV-16 identifiziert. Für die unten beschriebenen Experimente haben wir das gleiche Material verwendet, das zuvor beschrieben wurde [33].

BEC wurden in Passage 1 oder 2 verwendet und wurden bis zu 3 Tage lang mit 1x Multiplizität der Infektion (MOI) von RV infiziert. Die Infektionsrate wurde durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Anti-RV16-Antikörpers (Kat# 18758, QED-Bioscience Inc. San Diego, USA) bestimmt. Zellen wurden in 8-Well-Kammer-Objektträger (Thermofisher Scientific, Schweiz) ausgesät und mit RV und anderen chemischen Verbindungen oder OM-85 behandelt, wie in den Behandlungsschemata in 1B angegeben.

Nach der Behandlung wurden die Zellen nach Waschen mit PBS in 4% Formalin (in PBS) für 5 Minuten fixiert. Die fixierten Zellen wurden 2x mit PBS gewaschen und für 15 Minuten mit 0,01% TWEEN-100 in PBS permeabilisiert. Unspezifische Bindung wurde in 2% Rinderserumalbumin (30 Minuten in PBS) blockiert, bevor sie über Nacht (4°C) mit dem Anti-RV16-Antikörper (1:100 Verdünnung) inkubiert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem anti-Maus-FITC-markierten Antikörper (Abcam, Schweiz) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde die Anzahl der RV-positiven Zellen durch Immunfluoreszenzmikroskopie (EVOS FLoid cell imaging station, Thermofisher Scientific) gezählt und die Zellkerne wurden für die Zellzählung mit dem Lebendzellreagenz des Händlers (Thermofisher Scientific) gefärbt.

Immunblotting

Die Proteinanalyse wurde bereits früher beschrieben [33]. Nach Proteintrennung durch ein Polyacrylamid-Gradientengel (4–12%) und Elektroblotting auf eine PVDF-Membran wurden Proteine ​​identifiziert und ihre Expressionsrate durch Western-Blotting bestimmt. Folgende Proteine ​​wurden nachgewiesen: β-Defensin, C1qR, ICAM1, CREB und phos-CREB, Erk1/2, phos-Erk1/2, ICOS, ICOSL, JNK, phos-JNK, MHC2, MYD88, p38 und Phos- S.38. Einzelheiten zu Verdünnung und Herstellern sind in Tabelle 2 angegeben.

Die Membranen wurden 1 Stunde (Raumtemperatur) in PBS blockiert, das 0,01% Tween-20 und 2% Rinderserumalbumin enthielt. Die primären Antikörper wurden in den in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 3 Waschungen mit Blockierungspuffer wurden die Membranen mit sekundären Spezies-spezifischen Antikörpern, die mit Meerrettichperoxidase markiert waren, 1 Stunde lang inkubiert. Ungebundener Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit Blockierungspuffer abgewaschen und Proteinbanden wurden durch Exposition gegenüber Röntgenfilmen sichtbar gemacht.

Zelloberflächenspezifische ELISAs

Diese Analysen basierten auf den eigens entwickelten ELISA-Systemen zur Deposition extrazellulärer Matrixmoleküle [34]. Kurz gesagt, BEC wurden in 96-Well-Platten ausgesät und bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden entweder mit RV oder OM-85 oder Signaltransduktionsinhibitoren für Erk1/2 MAPK, p38 MAPK oder cAMP allein oder in Kombination infiziert, wie zuvor beschrieben [34]. BEC wurden nach verschiedenen Inkubationsperioden mit 2% Formalin in PBS (4 °C, 2 × 5 min) fixiert. Die unspezifische Bindung von Antikörpern wurde durch 30-minütige Inkubation der fixierten Zellen in 2% Rinderserumalbumin in PBS + 0,01% Tween-20 blockiert. Der erste gegen eines der Zellmembranproteine ​​spezifische Antikörper (Tabelle 2) wurde dem Blockierungspuffer zugesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Ungebundener Antikörper wurde dreimal mit Blockierungspuffer abgewaschen, bevor der sekundäre Antikörper zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Antikörperbindung wurde nach 3 Waschungen mit Blockierungspuffer durch die Meerrettich-Peroxidase-Substrate (TBM) quantifiziert. Die optische Dichte wurde durch einen ELISA-Plattenleser (Biorad) bestimmt und die Veränderungen der Antikörperbindung wurden als Prozentsatz nicht stimulierter Zellen berechnet.

IFN-γ ELISA

Ausgeschiedenes IFN-γ wurde mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit (R&D Systems, UK) im Zellkulturmedium von primärem humanem BEC vor und nach der Infektion mit RV nach 24, 48 und 72 Stunden nachgewiesen. Der ELISA wurde gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchgeführt.

Die BEC-Isolierung und -Charakterisierung wurde bereits früher veröffentlicht [34]. Kleine Stücke von Bronchialgewebe wurden in Zellkulturgefäße gegeben, die mit BEC-spezifischem Medium Cnt-PR-A (CellnTech, Bern, Schweiz) vorbenetzt wurden. Das Medium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht und die Zellen wurden durch mechanisches Schütteln von sich teilenden Zellen passagiert. Die Zellen wurden durch positive Färbung von E-Cadherin und Pan-Keratin und negative Färbung für Fibronektin (Ergänzung 1B) charakterisiert.

Statistiken

Die Nullhypothese war, dass OM-85 weder die RV-Infektion noch die Expressionszellmembranproteine ​​oder intrazelluläre Signalproteine ​​beeinflusst. Für die statistische Analyse wurden der Student-t-Test (gepaart, zweiseitig) und der Wilcoxon-Test verwendet. p-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen.


Diskussion

Der Einstrom von Neutrophilen ist ein anerkanntes Merkmal einer Virusinfektion, die die Atemwege betrifft, und die Neutrophilenrekrutierung ist wahrscheinlich das Ergebnis von Chemokinen, die von Epithelzellen freigesetzt werden. Chemokine wie ENA-78 können somit eine zentrale Rolle bei der Auslösung von Entzündungsereignissen spielen, die letztlich durch Neutrophile vermittelt werden. Die vorliegende Studie zeigt, dass die RV-Infektion des Epithels die Freisetzung von ENA-78-Protein zusätzlich zu IL-8 erzeugt, RV die ENA-78-mRNA-Produktion in Epithelzellen induziert, die ENA-78-Genaktivierung durch RV-Infektion induziert wird und ENA-78 ist bei RV-Infektionen in vivo erhöht. Unsere Beobachtungen legen nahe, dass die Freisetzung von ENA-78 eine hervorstechende Gewebereaktion auf eine RV-Infektion der Atemwege darstellen könnte

Obwohl IL-8 derzeit als das vorherrschende CXC-Chemokin bei der Rekrutierung von Neutrophilen an Entzündungsherden bei einer Vielzahl von Krankheiten angesehen wird, ist wahrscheinlich auch der Beitrag verwandter Familienmitglieder von Bedeutung. ENA-78 ist ein 78-aa-Polypeptid-Mitglied der α-Chemokin-Familie, das homolog zu IL-8 ist, mit dem es eine 22%ige Sequenzidentität teilt [ 22]. Obwohl seine Rolle bei menschlichen Krankheitszuständen in Blut, Sinovialgewebe, Nierentransplantatempfängern und Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen und idiopathischer Lungenfibrose untersucht wurde [ 23–25], wurde die ENA-78-Expression als Reaktion auf eine RV-Infektion nur in 1 Studie [ 26]. In der letztgenannten Studie produzierten BEAS-2B-Zellen nach der Infektion mit RV39 ENA-78, und die Produktion wurde als Reaktion auf einen Inhibitor der p38-Kinase reduziert. Unsere Studien untersuchten Reaktionen auf Infektionen mit einem anderen Serotyp (RV16) in derselben Epithelzelllinie (BEAS-2B) und in kultivierten primären Epithelzellen, dem Zelltyp, bei dem das Virus die Infektion in vivo initiiert [ 27]. BEAS-2B-Zellen wurden aufgrund von Titration und RT-PCR für RV-RNA infiziert, und eine Infektion konnte durch RT-PCR in primären Epithelzellen nachgewiesen werden. Kleine Veränderungen in der Virustitration können das Ergebnis einer geringeren Anzahl infizierter Zellen sein (<10% in einer neueren Studie [ 28]), außerdem könnte eine durch Titrationstechniken gemessene erhöhte Virusreplikation nachweisbar gewesen sein, wenn eine höhere MOI verwendet wurde, um Zellen zu infizieren [ 28 ]. Da in Pilotversuchen bei einem MOI von 1 eine signifikante Chemokinproduktion festgestellt wurde, wurde ein höherer MOI nicht untersucht

Die Produktion von ENA-78-Protein wurde aufgrund der bekannten Aktivitäten von IL-8 nach einer RV-Infektion mit der von IL-8 verglichen [ 8, 9] und weil ENA-78 einem anderen Produktionsverlauf folgen kann [ 29]. In humanen alveolären Makrophagen scheint beispielsweise IL-8 anstelle von ENA-78 das vorherrschende Chemokin in Überständen zu sein, die 24 Stunden nach Lipopolysaccharid-Stimulation erhalten wurden [ 30]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass signifikante Mengen von ENA-78 als Reaktion auf RV gebildet werden und dass ENA-78 Protein und mRNA in einem späteren Stadium produziert zu werden scheinen als IL-8 in Epithelzellen (siehe Abbildungen 2–35). Eine verlängerte Aktivierung des ENA-78-Gens durch RV16 liefert zusätzliche Beweise für eine ENA-78-Antwort auf RV, die sich von der von IL-8 unterscheidet. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ENA-78 nach der frühen Freisetzung von IL-8 den laufenden Neutrophilenverkehr vom Gefäßkompartiment zu den interstitiellen Geweberäumen verstärken und unterstützen kann. Die Aktivierung von Neutrophilen (anfänglich durch IL-8) und ihre Freisetzung von Mediatoren durch die Wirkung von ENA-78, die in einem späteren Stadium in Geweben vorhanden sind, kann die Entzündungskaskade verstärken, was in der Kininfreisetzung gipfelt, die Gefäßpermeabilität erhöht und a weiterer Zustrom von Entzündungszellen, Proteinen und Mediatoren [ 5]. Es sollte beachtet werden, dass die freigesetzten Chemokinmengen möglicherweise nicht die biologische Aktivität und die Fähigkeit zum Anlocken von Neutrophilen widerspiegeln, aber bis heute wurden keine Studien über einen direkten Vergleich der chemotaktischen Potenzen von IL-8 und ENA-78 . berichtet

Der Grund bzw. die Gründe für die relativen Unterschiede in der Chemokinproduktion in Primärzellen und in der Zelllinie BEAS-2B können aus unseren Studien nicht ermittelt werden. Die von infizierten BEAS-2B-Zellen freigesetzten ENA-78-Spiegel waren moderat höher als die in der Studie von Griego et al. [26]. Dies kann eine Funktion eines anderen RV-Serotyps (RV39 vs. RV16) oder Variationen der Kulturbedingungen oder der verwendeten Infektionsdosen sein [ 28]. Vergleichbare Studien zur ENA-78-Produktion durch primäre Epithelzellen der Atemwege wurden nicht berichtet. Die Messungen von IL-8, das von RV-infizierten BEAS-2B-Zellen freigesetzt wurde, waren ähnlich den in anderen Studien gefundenen Spiegeln [ 8, 9, 26]. Wir stellten jedoch eine 2- bis 4-fach höhere Freisetzung von IL-8 aus primären Bronchialepithelzellen fest, als in einer neueren Studie berichtet wurde [ 31]. Interessanterweise wurden IL-8-Spiegel, die mit den in unserer Studie gefundenen vergleichbar waren, von einer anderen mit RV9 infizierten Atemwegsepithelzelllinie (A549-Zellen) produziert [ 32], was wiederum die Rolle des Zelltyps und des viralen Serotyps (zusätzlich zu verschiedenen MOIs) betont. bei variablen Chemokinantworten. Die ENA-78-mRNA-Transkription und die Proteinfreisetzung schienen beide nach 48 h ihren Höhepunkt zu erreichen, außerdem gab es eine deutlichere mRNA-Induktion (8-fach über der scheininfizierten Abbildung 4A) als die Proteinfreisetzung (2,5-fach gegenüber der scheininfizierten Abbildung 3A). . Es kann sein, dass nicht alle produzierten ENA-78 für die Sekretion bestimmt sind oder dass verschiedene Isoformen von ENA-78 exprimiert werden und nur 1 sezerniert wird. Im Fall von IL-8 fanden wir, dass die mRNA 24 Stunden nach der RV-Infektion von primären Epithelzellen (1,5-fache Zunahme gegenüber scheininfizierten Abbildung 4B) ihren Höhepunkt erreichte, ähnlich den in BEAS-2B-Zellen berichteten Spiegeln [26]. Die Sekretion von IL-8-Protein erreichte später nach 48 h ihren Höhepunkt, wie zu erwarten wäre, wenn neu synthetisiertes Protein freigesetzt würde (4,3-facher Anstieg gegenüber scheininfizierter Abbildung 3B). Studien zur mRNA-Stabilität und zum Vorhandensein und zur Freisetzung vorgeformter Mediatoren werden einige in dieser und anderen Studien beobachtete Diskrepanzen klären

Die Spezifität der zellulären Antworten wurde mittels Scheininfektion und Inkubation mit UV-bestrahltem RV16 bewertet. Die Ergebnisse von UV-bestrahlten Kontrollen waren denen von Scheininfektionen ähnlich, obwohl einige andere Untersucher einen leichten Anstieg gegenüber dem Ausgangswert berichteten [ 26, 33]. Dies kann sich auf UV-Bestrahlungsprotokolle und die Anwesenheit von restlichem infektiösem Virus in hier nicht näher beschriebenen Experimenten beziehen. Wir haben festgestellt, dass eine UV-Bestrahlungszeit von < 30 min mit einem durch Titration nachweisbaren lebensfähigen RV verbunden sein kann. Andere Methoden zur Inaktivierung von RV, wie die Exposition gegenüber einem niedrigen pH-Wert, sind möglicherweise ebenfalls nicht vollständig wirksam. Es ist jedoch möglich, dass RV-interzelluläre Adhäsionsmolekül-1-Wechselwirkungen Signalwege unabhängig von der Virusreplikation induzieren können, und dies erfordert weitere Untersuchungen

Der Zusammenhang zwischen ENA-78 und RV bei Infektionen beim Menschen wurde nicht untersucht. Wir haben ENA-78 in einer Querschnittsstudie an Patienten mit akutem Asthma und gesunden Kontrollpersonen gemessen und Unterschiede in den nasalen ENA-78-Spiegeln gefunden, die vom Vorhandensein oder Fehlen von RV abhingen. Bei akuten Asthmatikern wurden Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne nasalem RV festgestellt, und bei Patienten mit vorhandenem RV waren die nasalen ENA-78-Spiegel signifikant höher als bei der Erholung nach 56 Tagen. Unsere Beobachtungen legen nahe, dass RV die Freisetzung von ENA-78 in vivo induziert und zusätzliche Beweise für seine Rolle bei menschlichen Infektionen liefert. Wir haben in der Gruppe ohne RV nicht auf das Vorhandensein anderer Viren getestet, und bei einigen von ihnen könnten Viren zu den in einigen Fällen beobachteten moderaten Erhöhungen von ENA-78 beigetragen haben. In der Gruppe ohne RV fehlten jedoch signifikante Unterschiede zwischen akutem Asthma und Erholung. In den vorliegenden Studien wurde nicht untersucht, ob RV auch bei mit RV infizierten Personen ohne Asthma ENA-78 induziert. Diese Frage konnten wir nicht beantworten, da die ursprüngliche Studie, aus der Proben generiert wurden, diese Gruppe nicht umfasste [18]. Im Gegensatz zu Gemeinschaftsstudien an Kindern mit Asthma mit RV-Infektion [ 34] und während experimenteller RV16-Infektion [ 35] konnten wir keine Unterschiede im nasalen IL-8 während der Infektion feststellen. Dies kann in unserer Studie mit dem Alter (Erwachsene) und dem Zeitpunkt der Probenentnahme (später im Krankenhaus) zusammenhängen

Die wichtige Rolle von Atemwegsvirusinfektionen als Ursache für Morbidität in der Gemeinde und für akutes Asthma ist derzeit gut bekannt. Chemokine können eine zentrale Rolle bei der Initiierung von Entzündungsreaktionen auf Virusinfektionen spielen und können gezielt für Versuche eingesetzt werden, nachfolgende schädliche Ereignisse zu reduzieren oder zu verhindern, insbesondere bei Patienten mit Asthma. Unsere Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit von RV-Erkältungsviren, die Produktion von ENA-78 in vitro zu induzieren, und ihrer bekannten Fähigkeit, in vivo Asthma-Exazerbationen zu verursachen. Diese Beobachtungen implizieren ENA-78 durch seine mutmaßlichen Wirkungen auf Neutrophile und auch durch zusätzliche mögliche Wirkungen auf die inflammatorische Genexpression [36] und die Angiogenese [13], die eine Atemwegsentzündung verschlimmern können, mit viralen und allergischen Entzündungen. Die Charakterisierung der ENA-78-Regulierung wird Einblicke in die komplexen biologischen Reaktionen liefern, die RV-Infektionen charakterisieren, und Strategien für ihre zukünftige therapeutische Modulation vorschlagen


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