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Beeinflusst der pH-Wert die Michaelis-Konstante?

Beeinflusst der pH-Wert die Michaelis-Konstante?


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Ich habe versucht, den Km eines Substrats zu bestätigen (der 34 +/- 4 mM beträgt). Dieser Wert wurde in 50 mM MOPS, pH 6,3, erhalten. Ich habe meinen Kinetik-Assay in einem Puffer von pH 7 durchgeführt und einen Km-Wert von 21,5 erhalten. Gemäß dieser Arbeit, Abb. 2C, beträgt die normalisierte spezifische Aktivität des Enzyms etwa 70 % bei pH 6,3 und etwa 47 % bei pH 7. Wenn ich 34 mM bei pH 6,3 durch 0,7 dividiere (was mir den optimalen Km bei den optimalen pH-Wert von 5,5) und dann mit 0,48 multiplizieren, dann erhalte ich 23 mM. Das Papier sagt jedoch, dass Km zwischen 30 und 38 mM liegt. Wenn ich also 30 und 38 getrennt durch 0,7 dividiere und mit 0,47 multipliziere, erhalte ich 20 bzw. 25,6 mM. Da mein Wert in diesen Bereich fällt, muss das dann bedeuten, dass ich das richtige Enzym und das gleiche Ergebnis wie das Papier habe.

Also meine Fragen sind:

  1. Wenn das Papier sagt, dass Km "34 +/- 4 mM" ist, kann ich davon ausgehen, dass der Km irgendwo zwischen 30 - 38 mM liegen kann? Ich bin überrascht, wie groß die Bandbreite ist. Ich ging davon aus, dass Km normalerweise nur ein Wert mit einer Abweichung von höchstens 0,1 ist.

  2. Ändert der pH-Wert die Km-Werte? Ich verstehe, dass der pH-Wert die Form(en) des Enzyms und/oder des Substrats ändert. Das muss sich also darauf auswirken, wie viel es an das Substrat binden möchte. Wenn der Wunsch des Enzyms, an ein Substrat zu binden, beispielsweise aufgrund eines Anstiegs des pH-Werts abnimmt, würde dies bedeuten, dass mehr Substrate benötigt werden, um das Enzym zu umgeben, wodurch Km erhöht wird.

  3. Wenn sich der pH-Wert Km ändert, bestimme ich auf diese Weise den Km-Wert eines anderen pH-Werts, wenn der Km-Wert bei einem anderen pH-Wert bereits bekannt ist? Ich weiß, dass spezifische Aktivität und Michaelis-Konstante unterschiedlich sind, aber wie viel Produkt pro Minute umgesetzt werden kann, hängt davon ab, wie stark das Enzym an ein Substrat bindet, was durch die Michaelis-Konstante dargestellt wird. Sind meine Überlegungen und Berechnungen zum richtigen Schluss gekommen? Wenn nein, wie erfolgt die Berechnung?


Aus der Herleitung der Michaelis-Menten-Kinetik sieht man:

$$K_m=frac{k_f + k_{cat}}{k_r}$$

Dabei sind $k_f$ und $k_r$ bindende bzw. nicht bindende Geschwindigkeitskonstanten (für Enzym-Substrat-Bindung) und $k_{cat}$ die Umsatzzahl. Dies gilt für die Quasi-Steady-State-Approximation (QSSA). Für die Gleichgewichtsnäherung:

$$K_m=frac{k_f}{k_r}$$ was der Assoziationskonstante entspricht.

In beiden Fällen kann der pH die Bindungs- und Entbindungsgeschwindigkeit beeinflussen, indem er die Affinität zwischen dem Enzym und dem Substrat beeinflusst. Nehmen wir zum Beispiel an, dass die Substratbindungsstelle negativ geladen ist. Ein niedriger pH würde das elektrostatische Potential der Substratbindungsstelle gegen Null erhöhen, indem die Ionisierung der funktionellen Gruppen beeinflusst wird.

Der pH-Wert kann auch indirekte Auswirkungen auf die Substratbindungsstelle haben, da er die Gesamtstruktur des Proteins modifizieren kann.

Viele enzymkatalysierte Reaktionen beinhalten eine Säure-Base-Katalyse, d. h. es findet ein Protonentransfer statt. Bei solchen Reaktionen kann der pH-Wert $k_{cat}$ beeinflussen.

Wenn sich der pH-Wert Km ändert, bestimme ich auf diese Weise den Km-Wert eines anderen pH-Werts, wenn der Km-Wert bei einem anderen pH-Wert bereits bekannt ist?

Sie können dies tun, indem Sie ein Lineweaver-Burk-Plot für den geänderten pH-Wert erstellen.


3.7: Der Einfluss des pH-Werts auf die Enzymkinetik

So wie jedes Enzym eine optimale Temperatur hat, hat auch jedes Enzym einen optimalen pH-Wert, bei dem es am besten funktioniert. Trypsin und Pepsin sind zum Beispiel beide Enzyme im Verdauungssystem, die Proteinketten in der Nahrung in kleinere Stücke aufbrechen - entweder in kleinere Peptidketten oder in einzelne Aminosäuren. Pepsin wirkt bei stark sauren Bedingungen des Magens. Es hat einen optimalen pH-Wert von etwa 1,5. Trypsin hingegen wirkt im Dünndarm, der teilweise einen pH-Wert von etwa 7,5 hat. Der optimale pH-Wert von Trypsin liegt bei etwa 8.

Tabelle (PageIndex<1>): pH für optimale Aktivität
Enzym Optimaler pH-Wert Enzym Optimaler pH-Wert
Lipase (Pankreas) 8.0 Invertase 4.5
Lipase (Magen) 4.0 - 5.0 Maltase 6.1 - 6.8
Lipase (Rizinusöl) 4.7 Amylase (Pankreas) 6.7 - 7.0
Pepsin 1.5 - 1.6 Amylase (Malz) 4.6 - 5.2
Trypsin 7.8 - 8.7 Katalase 7.0
Urease 7.0

Wenn Sie an die Struktur eines Enzymmoleküls und die Art der Bindungen denken, die es mit seinem Substrat eingehen kann, überrascht es nicht, dass der pH-Wert eine Rolle spielen sollte. Angenommen, ein Enzym hat einen optimalen pH-Wert von etwa 7. Stellen Sie sich vor, dass sich bei einem pH-Wert von etwa 7 ein Substrat über zwei Ionenbindungen an das Enzym bindet. Im Diagramm unten werden die Gruppen, die ionische Bindungen ermöglichen, durch die Übertragung eines Wasserstoffions von einer -COOH-Gruppe in der Seitenkette eines Aminosäurerests auf ein -NH . verursacht2 Gruppe in der Seitenkette eines anderen.

In diesem vereinfachten Beispiel gilt dies gleichermaßen für das Substrat und das Enzym.

Denken Sie nun darüber nach, was bei einem niedrigeren pH-Wert passiert – also unter sauren Bedingungen. Es hat keinen Einfluss auf das -NH3 + Gruppe, aber -COO - nimmt ein Wasserstoffion auf. Was Sie haben werden, wird dies sein:

Sie haben nicht mehr die Fähigkeit, ionische Bindungen zwischen dem Substrat und dem Enzym zu bilden. Wenn diese Bindungen notwendig wären, um das Substrat zu binden und es in irgendeiner Weise zu aktivieren, dann funktioniert das Enzym bei diesem niedrigeren pH-Wert nicht. Was ist, wenn Sie einen pH-Wert über 7 haben – also unter alkalischen Bedingungen. Diesmal ist die -COO - Gruppe nicht betroffen, aber die -NH3 + Gruppe verliert ein Wasserstoffion. Das lässt. . .

Auch hier besteht keine Möglichkeit, Ionenbindungen zu bilden, und so wird das Enzym wahrscheinlich auch diesmal nicht funktionieren. Bei extremen pH-Werten kann etwas Drastischeres passieren. Denken Sie daran, dass die Tertiärstruktur des Proteins teilweise durch ionische Bindungen zusammengehalten wird, genau wie wir es zwischen dem Enzym und seinem Substrat betrachtet haben. Bei sehr hohen oder sehr niedrigen pH-Werten können diese Bindungen innerhalb des Enzyms zerstört werden und es kann seine Form verlieren. Wenn es seine Form verliert, geht das aktive Zentrum wahrscheinlich vollständig verloren. Dies ist im Wesentlichen dasselbe wie das Denaturieren des Proteins durch zu starkes Erhitzen.


Michaelis konstant

Da die Substratkonzentration bei Vmax nicht exakt gemessen werden kann, müssen Enzyme durch die Substratkonzentration charakterisiert werden, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte des Maximums beträgt. Diese Substratkonzentration wird Michaelis-Menten-Konstante (KM ) auch bekannt als Michaelis-Konstante. Dies repräsentiert (für Enzymreaktionen mit einfacher Michaelis-Menten-Kinetik) die Dissoziationskonstante (Substrataffinität) des Enzym-Substrat-(ES)-Komplexes. Niedrige Werte weisen darauf hin, dass der ES-Komplex sehr eng zusammengehalten wird und selten dissoziiert, ohne dass das Substrat zuerst zum Produkt reagiert.


Methoden

Versuchsaufbau in kontinuierlicher Kultur

Im Gegensatz zu vielen anderen Gruppen, die Chargenkulturen von C. acetobutylicum, haben wir kontinuierliche Kulturen verwendet, um den Einfluss des pH-Werts auf die Lösungsmittelproduktion, insbesondere auf die Butanolproduktion, zu untersuchen. Ein kontinuierlich betreibbarer Fermentationsprozess hat gegenüber einem Batch-Prozess in der industriellen und biotechnologischen Fertigung mehrere Vorteile: Für eine lange Produktionszeit wird nur eine Serie von Vorkulturen benötigt, die „Totzeit“ für das Abfüllen, Sterilisieren, Kühlen und Entleeren von die Ausrüstung wird weitgehend verkleinert und das Volumen des Fermenterbehälters kann ohne Produktionseinbußen reduziert werden [17]. Eine stabile Lösungsmittelproduktion kann in einem synthetischen Medium unter Phosphatlimitierung in einer Chemostatkultur viel länger aufrechterhalten werden als im traditionellen Batch-Verfahren [21].

Unser Modell basiert auf Experimenten zur kontinuierlichen dynamischen Verschiebung von Kulturen. Die Experimente wurden gemäß einem standardisierten Versuchsaufbau [16, 18] und unter Verwendung von Standardarbeitsanweisungen für die Extraktion und Handhabung verschiedener Arten von Proben durchgeführt. Die Belastung C. acetobutylicum ATCC824 wurde unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C gezüchtet und die Vorkulturen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [18]. Die Phosphat-limitierten Chemostat-Experimente wurden in einem BiostatB 1,5-l-Fermentersystem (BBI, Melsungen, Deutschland) mit 0,5 mM KH . durchgeführt2Bestellung4 und 4% (wt/vol) Glucose im Liefermedium [22] und eine Verdünnungsrate von D = 0.075 h -1 . Der externe pH im Kulturmedium wurde durch automatische Zugabe von 2 M KOH auf pH 5,7 und pH 4,5 eingestellt und konstant gehalten. Die Analyse der Fermentationsprodukte erfolgte wie zuvor beschrieben [18]. Drei einzelne Experimente wurden durchgeführt, wobei die Kultur von pH 5,7 auf pH 4,5 verschoben wurde (die wir die "Vorwärtsverschiebungs"-Experimente nennen) und einer von pH 4,5 auf pH 5,7 (das "Rückwärtsverschiebungs"-Experiment). Die Daten wurden über die gesamte Dauer der Beobachtungszeit aufgenommen. Die biologischen Daten sind in Zusatzdatei 1: Tabellen S1 - S4 angegeben.

PH-abhängige Modellierung der AB-Fermentation

Wie bereits erwähnt, ist der Stoffwechsel der AB-Fermentation in C. acetobutylicum zeigt zwei charakteristische Stoffwechselphasen, Acidogenese und Solventogenese. Eine detaillierte Darstellung der entsprechenden Stoffwechselwege wurde von Jones und Woods [10] veröffentlicht. Bisher wurden nur wenige Stoffwechselmodelle veröffentlicht, die diesen fermentativen Prozess beschreiben. Papoutsakis [23] entwickelte ein stöchiometrisches Modell, das verwendet werden könnte, um die Reaktionsgeschwindigkeiten innerhalb der AB-Fermentationswege mehrerer (AB-produzierender) Clostridienbakterien in Batch-Kulturen abzuschätzen. Wichtig ist jedoch, dass diese Ergebnisse nicht auf kontinuierliche Kultivierungen wie die in dieser Studie verwendeten Chemostatkulturen übertragbar sind, bei denen die Zellen durchgehend exponentiell wachsen. Votruba et al. [24] formulierte ein Modell des Fermentationsprozesses für Batch-Kulturen ohne Einbeziehung der Zwischenmetaboliten, wobei die Variablen auf Biomasse, Glucose und die Endprodukte beschränkt wurden und dieses Modell die beiden Phasen gut erfasst. Die Stoffwechselflussanalyse wird seitdem auf den Stoffwechselweg angewendet [25–27]. Bestehende kinetische Modelle, die die Dynamik der ABE-Fermentation beschreiben, versuchen nicht, die Wirkung des pH-Werts auf das metabolische Netzwerk zu erfassen: in Shinto et al. [28] (was eigentlich berücksichtigt, dass Clostridium saccharoperbutylacetonicum) wird angenommen, dass der Schalter glukoseabhängig ist und die Enzymspiegel konstant sind, während in Li et al. [29] Enzymaktivität wird eingebaut, aber die Regulation wird direkt aus experimentellen Daten in das Modell eingespeist (anstatt innerhalb des Modells frei variieren oder von anderen Modellkomponenten beeinflusst werden zu dürfen). Unserer Kenntnis nach ist daher das hier vorgestellte Modell das erste, das den Einfluss des pH-Werts auf das metabolische Netzwerk berücksichtigt.

Das reduzierte Stoffwechselnetzwerk

Hier präsentieren wir ein Modell der AB-Fermentation in C. acetobutylicum in kontinuierlicher Kultur. Da es an veröffentlichten Informationen zu den kinetischen Parametern dieser Reaktionen unter den Bedingungen unserer experimentellen Arbeiten in der Literatur fehlt, aggregieren wir eine Reihe von Reaktionen des von Jones und Woods [10] veröffentlichten metabolischen Netzwerks. Dies ermöglicht es uns, die Anzahl der Parameter, die aus der experimentellen Arbeit geschätzt werden müssen, zu minimieren, indem wir das Modell auf die Reaktionen konzentrieren, die am wahrscheinlichsten durch den pH-Wert der Umgebung reguliert werden. So wurden, wie in Abbildung 1 gezeigt, fünf glykolytische Schritte zu einer Reaktion zusammengefasst (R1) unter der Annahme, dass es einen konstanten Fluss von Glucose zu Acetyl-CoA gibt. Außerdem reduzieren wir die Anzahl der Schritte bei fünf anderen Reaktionen: den Umwandlungen von Acetyl-CoA in zwei Acetatmoleküle (R2), von Butyryl-CoA in zwei von Butanol (R10), von Butyryl-CoA in zwei von Butyrat (R8) und von Acetyl-CoA in zwei von Ethanol (R5) reduzieren wir zwei Schritte in einen. Schließlich stellen wir die drei Schritte bei der Umwandlung von Acetoacetyl-CoA zu Butyryl-CoA durch einen (R9). Alle Zwischenreaktionen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Wenn die Genregulation nicht explizit in der Darstellung einer Reaktion enthalten ist, verwenden wir Michaelis-Menten-Ausdrücke. Im folgenden Abschnitt erläutern wir unseren Ansatz bei expliziter Einbeziehung der Genregulation.

Genregulation einbeziehen

Die für die Solventogenese erforderlichen Reaktionen sind auf genetischer Ebene streng reguliert: Die Produktion der Enzyme, die für die Katalyse dieser Reaktionen erforderlich sind, kann auf Transkriptionsebene durch die Bindung von regulatorischen Proteinen an die entsprechende DNA ein- oder ausgeschaltet (oder allgemeiner erhöht oder verringert) werden Websites. Die Spiegel der spezifischen regulatorischen Proteine ​​werden als Reaktion auf interne und externe Signale (zum Beispiel pH), die durch die Zelle übertragen werden, angepasst. Es wird daher erwartet, dass der Wechsel von der Acidogenese zur Solventogenese (oder auch umgekehrt) zumindest teilweise über die pH-Regulierung der enzymassoziierten Gene erklärt werden kann.

Die wichtigsten Enzyme, die an der Solventogenese beteiligt sind, werden von den Genen kodiert adc, adhE, bdhA/B, ctfA/B und thlA - siehe Tabelle 1. Wir stellen fest, dass es zwei adhE Gene in C. acetobutylicum diejenige, die wir in unser Modell integrieren, wird manchmal als bezeichnet adhE1. Aus den unten aufgeführten Gründen beziehen wir nur den Einfluss von drei dieser Gene in unser dynamisches Modell ein, nämlich adc, adhE und ctfA/B.

Ausdruck der ctfA/B Gen führt zur Acetoacetyl-CoA: Acetat/Butyrat:CoA-Transferase [8] (oder einfach CoA-Transferase), welches das Enzym ist, das für die Umwandlung von Acetoacetyl-CoA und dem zuvor sezernierten Acetat oder Butyrat in Acetoacetat und Acetyl-CoA verantwortlich ist oder Butyryl-CoA bzw. Die adhE Gen ist Teil des gleichen Operons wie ctfA/B, nämlich die Sol Operon [30]. Die Dehydrogenase AdhE katalysiert die Umwandlung von Butyryl-CoA und Acetyl-CoA in Butanol bzw. Ethanol [31, 32].

Die adc Gen kodiert Acetoacetat-Decarboxylase (Adc), das Enzym, das für die Decarboxylierung von Acetoacetat in Aceton und CO . verantwortlich ist2[14, 15]. Es sind zwei bekannt bdh Gene: bdhA und bdhB die Produkte beider Gene sind Butanol-Dehydrogenasen [33], die (neben AdhE) Butyryl-CoA in Butanol umwandeln. Da ihre Funktionen denen von AdhE ähnlich sind, können ihre Auswirkungen in die Parameterwahl für AdhE aufgenommen werden. Daher haben wir sie in unserem dynamischen Modell vernachlässigt. Das Genprodukt von thlA ist eine Thiolase, die die Umwandlung von Acetyl-CoA in Acetoacetyl-CoA katalysiert und daher sowohl für die Acidogenese als auch für die Solventogenese benötigt wird [34]. Es wird spekuliert, dass der Ausdruck der thlA Gen ist konstitutiv [35] und neuere Experimente zeigen, dass der Unterschied in den Transkriptionsniveaus von thlA zwischen Acidogenese und Solventogenese ist viel weniger ausgeprägt als die von ctfA/B, adc, und adhE[36]. Daher wurde ThlA auch in unserem dynamischen Modell vernachlässigt, da wir davon ausgehen, dass die ThlA-Werte während der Experimente relativ konstant bleiben, wie in [16] festgestellt. Die adc, adhE und ctfA/B Gene werden entsprechend der metabolischen Phase reguliert, wobei ihre Transkription in der solventogenen Phase zunimmt [36]. Daher werden sie wahrscheinlich über ein pH-bezogenes Signal induziert und wir integrieren daher jedes dieser Gene in das Modell. Wir nehmen an, dass sie jeweils mit zwei unterschiedlichen Raten transkribiert werden: basal (R E für Enzym E, siehe den gestrichelten Abwärtspfeil in (1) unten), wenn der pH-Wert ausreichend hoch ist (tatsächlich existieren niedrige Spiegel dieser Transkripte vor dem Einsetzen der Solventogenese, siehe zum Beispiel [37, 38]) und bei einer höheren Geschwindigkeit (, siehe gestrichelten Aufwärtspfeil in (1)), wenn der pH-Wert der Umgebung niedrig ist.

Wir nehmen an, dass alle enzymatischen Reaktionen von

wo S ist das Substrat, E das Enzym, C der Komplex gebildet von S und E, und P das resultierende Produkt. Wie bei der Herleitung der Michaelis-Menten-Dynamik nehmen wir an, dass die Konzentration von C befindet sich in einem quasi-stationären Zustand [13, 39] aber im Gegensatz dazu nehmen wir nicht E konstant zu sein, da seine Produktion durch den pH-Wert reguliert wird [13]. Wenn wir die Enzymkonzentration explizit einschließen möchten, verwenden wir daher die konventionelle kinetische Theorie, um die folgenden Gleichungen zu erhalten [40]:

wo α = k1·k2/(k-1 + k2), obwohl die Gleichungen mit CtfA/B das Produkt von drei Variablen in den Gleichungen (2a) und (2b) erfordern, da die von ihr katalysierten Reaktionen zwei Substrate beinhalten. Die Produktion des Enzyms wird durch die Expressionsrate des entsprechenden Gens bestimmt, da die Mechanismen, durch die die Solventogenese induziert wird, nicht vollständig aufgeklärt sind, schließen wir einen generischen pH-abhängigen Schalter ein F(P), die eine erhöhte Enzymproduktion unterhalb eines bestimmten pH-Schwellenwerts einschaltet. Der Schalter hat die Form der geglätteten Sprungfunktion,

wo P* stellt den pH-Schwellenwert dar, bei dem der Wechsel erfolgt und n bestimmt die Steilheit der glatten Schaltfunktion.

Da der pH-Wert in den dynamischen Verschiebungsexperimenten extern eingestellt und kontrolliert wurde, führen wir für diese Variable keine Differentialgleichung ein. Für jedes Experiment wird der pH zu regelmäßigen Zeitpunkten gemessen. Wir passen eine Funktion (mit ' nlinfit ' in Matlab [41]) der Form

zu den pH-Daten, wobei C1,C2 und C3 sind Konstanten, um für jede Simulation eine eindeutige Funktion zu erhalten, die den pH darstellt, wird diese Funktion dann über die Schalterfunktion in das Modell eingespeist F(P).

Kombination des pH-abhängigen Stoffwechselnetzwerks mit Genregulation

Wenn Enzymkonzentrationen explizit angegeben werden sollen, haben die Reaktionen die im obigen Abschnitt skizzierte Form, ansonsten wird die Michaelis-Menten-Kinetik verwendet. Die in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellten Reaktionen werden daher dargestellt durch:

wobei die Grenzreaktionsgeschwindigkeit i gegeben ist durch und die entsprechende Dissoziationskonstante ist . Wir beziehen die stöchiometrische Konstante von zwei in R1 da aus einem Molekül Glucose zwei Moleküle Acetyl-CoA gebildet werden. Ebenso die Konstante 0,5 in R4 steht für die Bildung eines Acetoacetyl-CoA aus zwei Acetyl-CoA. Das resultierende Stoffwechselmodell ist gegeben durch:

wobei wir zu jeder Gleichung einen Ausflussterm hinzugefügt haben, der das Produkt der Verdünnungsrate mit der Konzentration des entsprechenden Metaboliten ist, da wir einen konstanten Ausfluss sowohl von extrazellulären als auch intrazellulären (als Ergebnis des Zellausflusses) haben. Produkte über den Chemostat.

Zusätzlich benötigen wir die folgenden Gleichungen zur Darstellung der Enzymkonzentrationen:

Wir passen das Modell an experimentelle Daten an, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.

Datennormalisierung, Parameterschätzung und Modellsimulation

Alle Parameter werden aus drei "Vorwärts"-Experimenten mit der SBToolbox in Matlab [42] geschätzt. Wie bereits erwähnt, werden GC-Daten aus den dynamischen Shift-Experimenten verwendet, die die Zeit messen, bis das Medium einen bestimmten pH-Wert erreicht. Die Zeitspanne des gesamten Wechsels variierte zwischen den Experimenten und variierte von 22 ('Vorwärts'-Experiment 1, siehe Abbildung 2(a)) bis 33,5 Stunden ('Vorwärts'-Experiment 2, siehe Abbildung 2(b)) siehe Ergänzungsdatei 1 für die Rohdaten. Um einen Durchschnitt der für die Parameterschätzung zu verwendenden Daten zu bilden, mussten die Daten daher über das dynamische Verschiebungsintervall normalisiert werden, um Vergleiche zwischen den Zeitpunkten sinnvoll zu machen (dh Zeitpunkte für jeden Datensatz sollten äquivalenten Phasen entsprechen, nämlich Acidogenese, die dynamische Verschiebung oder Solventogenese). Um dies zu erreichen, wurden die Datensätze 1 und 3 auf Datensatz 2 normiert, dh die während der dynamischen Verschiebung auftretenden Zeitpunkte wurden so skaliert, dass die dynamische Verschiebungsphase in allen normierten Datensätzen die Lösungsmittelogenese-Phasenzeitpunkte so übersetzt, dass die Der Beginn der Solventogenese erfolgt 33,5 Stunden nach Beginn der dynamischen Shift-Phase für alle normalisierten Datensätze. Jeder Datensatz wurde zu identischen Zeitpunkten interpoliert, wodurch der Durchschnitt der drei skalierten Datensätze für die Parameterschätzung berechnet werden konnte, deren Ergebnisse in Tabelle 2 dargestellt sind Sätze verwendet werden.

Vergleich unseres Modells (durchgezogene Linien) mit den Daten der Chemostat-Experimente mit dynamischer Verschiebung (Punkte). Abbildung 2(a) zeigt die Ergebnisse des Experiments mit dynamischer Vorwärtsverschiebung. Die zwei Wiederholungen dieses Experiments mit dynamischer Vorwärtsverschiebung sind in Abbildung 2(b) und Abbildung 2(c) gezeigt. Bei einem pH-Wert von 5,7 produzieren die Zellen hauptsächlich Acetat und Butyrat. In der Übergangsphase C. acetobutylicum schaltet seinen Stoffwechsel (in Abhängigkeit vom externen pH-Wert) auf die Bildung der Lösungsmittel Aceton und Butanol bei einem pH-Wert von 4,5 um. Ethanol wird während der Acidogenese und der Solventogenese in ungefähr gleichen Mengen produziert. In Abbildung 2(d) demonstrieren wir den Vergleich des Modells und der Daten für das „umgekehrte“ dynamische Verschiebungsexperiment.

Steady-State-Analyse des Stoffwechselnetzwerks

Um gentechnische Strategien zur Steigerung der Butanolausbeute zu entwickeln, wollen wir Veränderungen der stationären Zustände des metabolischen Netzwerks als Reaktion auf Variationen der Transkriptionsraten der Lösungsmittel-assoziierten Gene untersuchen. Vernachlässigt haben thlA, bdhA und bdhB aus dem Modell zur Untersuchung der zeitabhängigen Dynamik, um die Anzahl der abzuschätzenden Parameter für das Wildtyp-Modell zu minimieren, führen wir sie in die Steady-State-Studien ein, da es möglich ist, dass eine Über- oder Unterexpression dieser Gene eine Wirkung auf die Fermentationsproduktausbeute. Um die Expression dieser Gene explizit zu variieren, müssen wir daher alternative Darstellungen für die Reaktionen ableiten, an denen ihre Genprodukte beteiligt sind, d. h. wir benötigen Parameter, um die Produktion von jedem dieser Gene darzustellen. Im Steady State werden die Konzentrationen von ThlA und BhdA/B angegeben durch R T /λ und R B/ , wo R T und R B sind die oben genannten Produktionsraten, wobei letztere die kombinierten Niveaus von BdhA und BdhB darstellen (beide spielen gleichwertige Rollen, daher reicht es aus, sie in Kombination zu betrachten). Dann die Preise R4 und R9 werden

Wir stellen jedoch fest, dass Gleichung (7a) nur erforderlich ist, wenn die Produktionsrate von ThlA variiert wird (d. h. in Abbildung 3(f)) in allen anderen Simulationen R4 ist durch den Michaelis-Menten-Ausdruck in Gleichung (4) gegeben.

Steady-State-Kurven von Butanol (Bn) für unterschiedliche Produktion von (a) Adc (Acetoacetat-Decarboxylase), (b) und (c) CtfA/B (CoA-Transferase), (d) AdhE (Alkoholaldehyd-Dehydrogenase), ( e) BdhA und/oder BdhB (Butanol-Dehydrogenasen) und (f) ThlA (Thiolase). In (c) haben wir die Achsen von (b) verändert, um den Effekt der Herunterregulierung von klar erkennen zu können ctfA/B.

Der Einfachheit halber nehmen wir an, dass die Bindungsraten von Butyryl-CoA mit BdhA und BdhB gleich sind (was bedeutet, dass wir den kombinierten Gehalt an Bdh-Proteinen betrachten können) und dass diese Rate dieselbe ist wie die zwischen Butyryl-CoA und AdhE. Wir schließen auch keine Bindungsrate zwischen Acetyl-CoA und ThlA ein. Diese Annahmen reduzieren nicht die Allgemeingültigkeit der stationären Ergebnisse, da nur die Verhältnisse von Bindung und Produktion zu Verdünnung erscheinen und den Werten dieser Verhältnisse keine derartigen Beschränkungen auferlegt werden. Da es uns in diesem Abschnitt nicht um das zeitabhängige Verhalten des Systems geht (eine Butanol-Fermentation im großen Maßstab würde vermutlich in einer kontinuierlichen Kultur mit dem System daher im stationären Zustand durchgeführt werden), assoziieren wir eine einzige Produktionsrate, , bei jedem lösungsmittelassoziierten Enzym ist diese Rate für jedes Enzym unterschiedlich und ist die Summe der basalen Produktionsrate (R E für Enzym E), die unabhängig vom pH-Wert auftritt, und die schnellere durch einen niedrigen pH-Wert induzierte Produktionsrate (), die während der Lösungsmittelogenese auftritt, d.h. In Tabelle 3 zeigen wir die Werte dieser kombinierten Enzymproduktionsraten, die denen entsprechen, die für das Wildtyp-assoziierte dynamische Modell verwendet wurden.


Die Wirkung des pH-Werts auf die Aktivität, Thermokinetik und Hemmung der Polyphenoloxidase aus Pfirsich

Diese Studie konzentrierte sich auf die Wirkung des pH-Werts auf die Aktivität, Thermokinetik und Hemmung von Polyphenoloxidase (PPO) aus Honigtaupfirsichpulpe mit (+)-Catechin als Substrat. Der optimale pH-Wert für die PPO-Aktivität lag bei etwa 6,5–7,0, und die optimale Temperatur war pH-abhängig und betrug 40 °C bei pH 6,8 und 30 °C bei pH 4,0. Das Enzym war während der Lagerung bei 4 °C im pH-Bereich von 6,0–8,0 stabil. Die thermokinetischen Parameter (D, z, k, Eein) von PPO deutete darauf hin, dass das Enzym während der thermischen Behandlungen bei pH 6,8 viel stabiler war als bei pH 6,0 und pH 8,0. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse auch, dass das Enzym bei pH 6,8 empfindlicher auf Temperaturänderungen reagierte als bei den anderen pH-Werten. Die Hemmstudie zeigte, dass L-Cystein und Glutathion für die Hemmung des Enzyms hochwirksam waren, während NaF bei pH 6,8 mäßig hemmte. Die Hemmfähigkeiten dieser Inhibitoren waren jedoch pH-abhängig, und saures Medium konnte die Hemmfähigkeit von NaF für PPO aus Pfirsichpulpe stark erhöhen.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


FAKTOREN, DIE DIE ENZYMAKTIVITÄT BEEINFLUSSEN

Hier ist nur eine kurze Zusammenfassung der Faktoren, die die Enzymaktivität beeinflussen.

WAS SIND FAKTOREN, DIE DIE AKTIVITÄT VON ENZYMEN BEEINFLUSSEN?

WIE BEEINFLUSST DIE SUBSTRATKONZENTRATION DIE AKTIVITÄT DER ENZYME?

Wenn die Substratkonzentration ansteigt, nimmt die Geschwindigkeit zu, mit der der Enzymsubstratkomplex gebildet wird, da mehr Substrate für die aktive Stelle des freien Enzyms zur Verfügung stehen, an die sie sich binden können. Auch mit einer Erhöhung der Substratkonzentration ist die Kollisionshäufigkeit des Substrats mit dem aktiven Zentrum des Enzyms größer. Aber bei Vmax Das gesamte aktive Zentrum des Enzyms ist von Substrat besetzt, daher ist die Reaktionsgeschwindigkeit konstant, sodass eine Erhöhung von [S] die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflusst. Bei der Beobachtung der Auswirkungen der Substratkonzentration auf die Enzymaktivität müssen die folgenden Variablen pH, Temperatur und Enzymkonzentration konstant gehalten werden. Der Effekt der Substratkonzentration kann entweder mit dem Line-Weaver-Burk-Diagramm (Gleichung) oder dem Michaelis-Menten-Diagramm (Gleichung) veranschaulicht werden.

ABBILDUNG 1: ILLUSTRIERT DIE WIRKUNG DER SUBSTRATKONZENTRATION AUF DIE ENZYMAKTIVITÄT.

Wie wirkt sich der pH-Wert auf die Enzymaktivität aus?

Wenn der pH-Wert für ein Enzym zu sauer oder zu basisch ist, beginnen seine Wasserstoffbrücken zu brechen, was dazu führt, dass das aktive Zentrum des Enzyms seine Form verliert. Jedes Enzym arbeitet innerhalb eines pH-Bereichs (optimaler pH). Zum Beispiel: Lipase im Magen arbeitet innerhalb des optimalen pH 4-5.

ABBILDUNG 2: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG DES pH-Wertes AUF DIE ENZYMAKTIVITÄT.

WIE BEEINFLUSST DIE TEMPERATUR DIE ENZYMAKTIVITÄT?

Mit steigender Temperatur nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit zu, jedoch über den Punkt der optimalen Temperatur hinaus nimmt die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion ab, da die Wasserstoffbindung und die hydrophobe Wechselwirkung in der Enzymstruktur aufgebrochen wird. Wenn dies geschieht, verliert es seine Form und das Substrat kann nicht richtig an das aktive Zentrum binden, wodurch die Enzymaktivität verringert wird. Darüber hinaus nimmt mit steigender Temperatur die Menge an kinetischer Energie im System zu, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird, da die Kollisionsfrequenz zwischen dem Substrat und dem aktiven Zentrum des Enzyms zunimmt. Auch wenn die Temperatur ansteigt, gewinnen die Substratmoleküle mehr Energie, um die Aktivierungsbarriere zu überwinden, wodurch mehr ES-Komplex gebildet wird, der abwechselnd die Geschwindigkeit der Enzymreaktion erhöht.

ABBILDUNG 2: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG DER TEMPERATUR AUF DIE ENZYMAKTIVITÄT.

WIE BEEINFLUSSEN INHIBITOREN DIE ENZYMAKTIVITÄT?

Es gibt irreversible Inhibitoren und reversible Inhibitoren, die die Geschwindigkeit der Enzymreaktion beeinflussen. Reversible Inhibitoren binden an das Enzym durch nicht-kovalente Bindung, daher setzt die Verdünnung des Enzym-Inhibitor-Komplexes den Inhibitor frei und das Enzym kann seine Aktivität fortsetzen. Es gibt vier Arten von reversiblen Inhibitoren: kompetitiv, nicht kompetitiv, gemischt und nicht kompetitiv.

1. Kompetitive Inhibitoren konkurrieren mit dem Substrat um das aktive Zentrum, daher ähnelt die Form des Inhibitors der Form des Substrats. Wenn der Inhibitor an das aktive Zentrum bindet, verringert dies die Geschwindigkeit der Enzymreaktion, da die Substrate nicht an das aktive Zentrum binden können, da der Inhibitor derzeit das aktive Zentrum besetzt. Ein kompetitiver Inhibitor erhöht Km, daher wird mehr Substrat benötigt, um ½ Vmax zu erreichen. Vmax wird jedoch durch einen kompetitiven Inhibitor nicht beeinflusst.

ABBILDUNG 3: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG DES WETTBEWERBSHEMMERS AUF Vmax UND Km IM LINEWEAVER-BURK-PLOT.

2. Nicht-kompetitiver Inhibitor bindet an freies Enzym oder ES-Komplex, er bindet nicht an das aktive Zentrum. Daher unterscheidet sich die Form des Inhibitors von der des Substrats. Diese Art von Inhibitor verringert die Fähigkeit des Enzyms, Substrat in Produkt umzuwandeln. Vmax wird reduziert und Km bleibt gleich, da das Substrat noch an das aktive Zentrum binden kann und noch bevor der Inhibitor vorhanden ist.

ABBILDUNG 4: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG EINES NICHT WETTBEWERBSFÄHIGEN INHIBITORS AUF Vmax UND Km IN DER MICHAELLIS-MENTEN-KURVE UND DEM LINEWEAVER-BURK-PLOT.

3. Ein nichtkompetitiver Inhibitor tritt auf, wenn der Inhibitor nur an den ES-Komplex bindet. Sie binden nicht an freie Enzyme. Es reduziert sowohl Vmax als auch Km in gleichem Maße. Die Steigung des Graphen bleibt konstant, da sich sowohl Km als auch Vmax proportional zueinander ändern, und so wird einfach beobachtet, dass sich die Linie nach oben und nach links verschiebt.

ABBILDUNG 5: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG EINES NICHT WETTBEWERBSFÄHIGEN INHIBITORS AUF Km UND Vmax IN EINEM LINEWEAVER BURK PLOT.

4. Gemischter Inhibitor bindet an freies Enzym oder Enzymsubstratkomplex. Sie binden nicht an das aktive Zentrum. Wenn der Inhibitor an die Enzyme bindet, ändert er die Form des Enzyms, wodurch die Affinität des Substrats zum aktiven Zentrum des Enzyms verringert wird. Vmax wird immer reduziert, während Km entweder zu- oder abnimmt.

Gemischte Inhibitoren können dem nicht-kompetitiven Inhibitor ähnlich erscheinen, sind jedoch unterschiedlich. Wenn nicht-kompetitive Inhibitoren an die Enzyme binden, bilden sie den EIS-Komplex, der dazu führte, dass das Produkt nicht gebildet wurde, während bei gemischten Inhibitoren, wenn der Inbitor an das den EIS-Komplex bildende Enzym bindet, immer noch ein Teil des Produkts gebildet wird, obwohl der Inhibitor vorhanden ist.

ABBILDUNG 6: ILLUSTRIERT DIE AUSWIRKUNG EINES GEMISCHTEN INHIBITORS AUF Km UND Vmax UNTER VERWENDUNG EINES LINEWEAVER BURK PLOT.


Kinetik - Warum wirkt sich eine Konzentrationsänderung nicht auf die Geschwindigkeitskonstante aus?

Sowohl eine Temperaturerhöhung als auch der Einsatz von Katalysatoren erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die Geschwindigkeitskonstante, aber obwohl eine Konzentrationserhöhung auch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht, warum nicht es beeinflusst die Rate konstant?

Egal, ich habe die Antwort gefunden:

„Die Geschwindigkeitsgleichung zeigt den Zusammenhang zwischen der Konzentration der Reaktanten und der Reaktionsgeschwindigkeit.

Wenn die Konzentration eines der Reaktanten zunimmt, erhöht sich auch die Reaktionsgeschwindigkeit, die Geschwindigkeitskonstante k ändert sich nicht.

Wenn der Druck ansteigt, erhöht sich die Konzentration aller Reaktanten und damit auch die Reaktionsgeschwindigkeit. Auch hier ändert sich die Geschwindigkeitskonstante nicht.

Die Geschwindigkeitskonstante k ist somit konzentrations- und druckunabhängig.

Steigt jedoch die Temperatur an oder wird ein Katalysator zugegeben, erhöht sich die Reaktionsgeschwindigkeit ohne Konzentrationsänderung, also muss sich die Geschwindigkeitskonstante k ändern.

Die Geschwindigkeitskonstante k variiert somit mit der Temperatur und wird auch durch die Zugabe eines Katalysators beeinflusst."

Für alle anderen, die das gleiche Problem hatten.

Nicht das, was Sie suchen? Versuchen Sie&hellip

Schauen Sie sich die Arrhenius-Gleichung an. Die Geschwindigkeitskonstante hängt von der Anwesenheit/Abwesenheit von Katalysator und der Temperatur ab.

lnk = -Ea/RT + lnA
y = mx + c
(Die Arrhenius-Gleichung).
Wie Sie sehen können, kommt die Konzentration in dieser Gleichung nicht vor.
lnk = natürlicher Logarithmus der Geschwindigkeitskonstante (k)
Ea= Aktivierungsenergie
R= relative Gaskonstante (8,314)
T= Temperatur, Kelvin.
lnA= natürlicher Logarithmus des präexponentiellen Faktors A (keine Sorge, was das ist).

Sie verwenden diese Gleichung in A2, um die Aktivierungsenergie (und manchmal A) aus Diagrammen zu ermitteln.

Eine andere Möglichkeit zu erkennen, dass die Konzentration die Geschwindigkeitskonstante nicht beeinflusst, ist die "einfachere" Geschwindigkeitsgleichung:

Rate =k [M] m [N] n wobei m und n die Ordnungen der Reaktanten sind (im Grunde der Effekt, den eine steigende Konzentration dieser Reaktanten auf die Gesamtreaktion hat). Die eckigen Klammern stellen die Konzentrationen der Reaktanten dar.

Wie du siehst, Bewertung wird durch die Konzentration beeinflusst – wenn [M] ansteigen würde, würde auch die Rate steigen, weil k and [N] are being multiplied by a larger number.
Aber, k in itself isn't affected by concentration. It is the rate constant for a reaction at a given temperature.
Think about the kinetics of a reaction. Increasing concentration means there are more molecules/atoms in a certain volume, increasing the likelihood of molecules colliding, but not affecting the number of molecules above activation energy.
However, increasing temperature means that more molecules are above activation energy (look at Boltzmann distributions).
This links back to the Arrhenius equation, which talks about activation energy but not concentration- hence catalysts and temperature does change the rate constant.

Sorry this is badly explained, it's been a while since I did this rate constant nonsense XD


How pH Affects Enzymes

A pH environment has a significant effect on an enzymes. It can affect the intramolecular forces and change the enzyme's shape -- potentially to the point where it is rendered ineffective. With these effects in mind, typical enzymes have a pH range in which they perform optimally. For example, alpha amylase, which found in the mouth, operates most effectively near a neutral pH. However, lipases operate better at more basic pH levels. Buffer systems built into most organisms prevent pH levels from reaching the point where essential enzymes are rendered ineffective. If an enzyme is rendered ineffective by pH level, adjusting the pH can cause the enzyme to become effective again.


Does pH affect Michaelis constant? - Biologie

THE EFFECT OF CHANGING CONDITIONS IN ENZYME CATALYSIS

This page looks at the effect of changing substrate concentration, temperature and pH on reactions involving enzymes. It follows on from a page describing in simple terms how enzymes function as catalysts. Please remember that this series of pages is written for 16 - 18 year old Chemie students. If you want something more advanced, you are looking in the wrong place.

Notiz: This page assumes that you have already read the page about how proteins function as enzymes. If you have come straight to this page via a search engine, you really ought to go back and read that page first. In fact, unless you already have a good knowledge of protein structure, you may have to go back further still to a page about the structure of proteins.

The effect of substrate concentration on the rate of enzyme-controlled reactions

Remember that in biology or biochemistry, the reactant in an enzyme reaction is known as the "substrate".

What follows is a very brief and simple look at a very complicated topic. Anything beyond this is the stuff of biochemistry degree courses!

A reminder about the effect of concentration on rate in ordinary chemical reactions

If you have done any work on rates of reaction (especially if you have done orders of reaction), you will have come across cases where the rate of reaction is proportional to the concentration of a reactant, or perhaps to the square of its concentration.

You would discover this by changing the concentration of one of the reactants, keeping everything else constant, and measuring the initial rate of the reaction. If you measure the rate after the reaction has been going for a while, the concentration of the reactant(s) will have changed and that just complicates things. That's why initial rates are so useful - you know exactly how much you have of everything.

If you plotted a graph of initial reaction rate against the concentration of a reactant, then there are various possibilities depending on the relationship between the concentration and the rate.

If the rate is independent of the concentration

This is called a zero order reaction.

If the rate is proportional to the concentration

This is called a first order reaction.

If the rate is proportional to some power of the concentration greater than one

In this case, you get a curve. If the rate was proportional to the square of the concentration, that's a second order reaction.

With reactions controlled by enzymes, you get a completely different type of graph.

Plotting initial rates of enzyme-controlled reactions against substrate concentration

The graph for enzyme controlled reactions looks like this:

Two minor things to notice before we discuss it . . .

Biochemists talk about a reaction velocity instead of a reaction rate. If you have done any physics, you will know that this is a complete misuse of the word "velocity"! But that's what you will find in biochemistry sources, so that's what we will have to use.

So why is the graph the shape it is?

For very, very low substrate concentrations, the graph is almost a straight line - like the second chemistry rate graph above. In other words, at very, very low concentrations, the rate is proportional to the substrate concentration.

But as concentration increases, increasing the concentration more has less and less effect - and eventually the rate reaches a maximum. Increasing the concentration any more makes no difference to the rate of the reaction.

If you know about orders of reaction, the reaction has now become zero order with respect to the substrate.

The reason for this is actually fairly obvious if you think about it. After a certain concentration of substrate is reached, every enzyme molecule present in the mixture is working as fast as it can. If you increase the substrate concentration any more, there aren't any enzyme molecules free to help the extra substrate molecules to react.

Is this unique to enzyme-controlled reactions? Nein! It can happen in some ordinary chemistry cases as well, usually involving a solid catalyst working with gases. At very high gas pressures (in other words, very high concentrations of gas molecules), the surface of the catalyst can be completely full of gas molecules. If you increase the amount of gas any more, there isn't any available surface for it to stick to and react.

The maximum rate for a particular enzyme reaction is known as Vmax. (That's V for velocity - a bit confusing for chemists where V is almost always used for volume!)

This is easily measured by drawing a line on the graph:

This is sometimes reported as a "turnover number", measured as the number of molecules of substrate processed by a single enzyme molecule per second, or per minute.

Km is known as the Michaelis constant or the Michaelis-Menten constant (for reasons which needn't concern us), and is a useful measure of the efficiency of an enzyme.

Km is the concentration of the substrate in mol dm -3 which produces a reaction rate of half Vmax. So it is found like this . . .

A low value of Km means that the reaction is going quickly even at low substrate concentrations. A higher value means the enzyme isn't as effective.

Notiz: You might possibly wonder why you have to go to the trouble of halving the maximum rate to get this information. Couldn't you just find the concentration of the substrate which produced the maximum rate?

If you look at the shape of the graph, it would be impossible to get any accurate measure of the concentration which first produced a maximum rate. The curve just gradually gets closer and closer to the horizontal, and there is no clear cut-off point at which it suddenly becomes horizontal.

The effect of temperature on the rate of enzyme-controlled reactions

A reminder about the effect of temperature on rate in ordinary chemical reactions

Remember that for molecules to react, they have to collide with an energy equal to or greater than the activation energy for the reaction.

Heating a reaction makes the molecules move faster and so collide more often. More collisions in a given time means a faster reaction.

But far more importantly, increasing the temperature has a very big effect on the number of collisions with enough energy to react. Quite a small temperature rise can produce a large increase in rate.

As a reasonable approximation for many (although not all) reactions close to room temperature, a 10°C increase in temperature will double the rate of a chemical reaction. This is only an approximation - it may take 9°C or 11°C or whatever, but it gives you an idea of what to expect.

Notiz: If you aren't sure about any of this, have a quick look at the page about the effect of temperature on rates of reaction.

Use the BACK button on your browser to come back here afterwards.

Plotting rates of enzyme-controlled reactions against temperature

For low temperatures up to about 40°C, enzyme-controlled reactions behave much as you would expect any other chemical reaction to behave. But above about 40°C (the exact temperature varies from enzyme to enzyme), there is a dramatic fall in reaction rate.

A typical graph of rate against temperature might look like this:

The temperature at which the rate is fastest is called the optimale Temperatur for that enzyme.

Different enzymes have different optimum temperatures. Some enzymes, for example, in organisms known as thermophiles or extremophiles are capable of working at temperatures like 80°C or even higher.

The optimum temperature for a particular enzyme varies depending on how long it is exposed to the higher temperatures. Enzymes can withstand temperatures higher than their normal optimum if they are only exposed to the higher temperatures for a very short time.

Explaining the rate against temperature graph

At lower temperatures, the shape of the graph is exactly what you would expect for any reaction. All that needs explaining is why the rate falls above the optimum temperature.

Remember that the enzyme works because its substrate fits into the active site on the protein molecule. That active site is produced because of the way the protein is folded into its tertiary structure.

Heating an enzyme gives the protein chains extra energy and makes them move more. If they move enough, then the bonds holding the tertiary structure in place will come under increasing strain.

The weaker bonds will break first - van der Waals attractions between side groups, and then hydrogen bonds. As soon as these bonds holding the tertiary structure together are broken, then the shape of the active site is likely to be lost.

Obviously, the longer the enzyme is held at the higher temperature, the more time there is for the enzyme structure to be broken up. Given enough time and high enough temperatures, the enzyme structure is broken permanently. The enzyme is said to be denaturiert. For example, boiling an egg for 5 minutes denatures the proteins in the egg. Once that has happened, you can't un-boil it by cooling it!

The effect of pH on the rate of enzyme-controlled reactions

In the same way that every enzyme has an optimum temperature, so each enzyme also has an optimum pH at which it works best.

For example, trypsin and pepsin are both enzymes in the digestive system which break protein chains in the food into smaller bits - either into smaller peptide chains or into individual amino acids.

Pepsin works in the highly acidic conditions of the stomach. It has an optimum pH of about 1.5.

On the other hand, trypsin works in the small intestine, parts of which have a pH of around 7.5. Trypsin's optimum pH is about 8.

If you think about the structure of an enzyme molecule, and the sorts of bonds that it may form with its substrate, it isn't surprising that pH should matter.

Suppose an enzyme has an optimum pH around 7. Imagine that at a pH of around 7, a substrate attaches itself to the enzyme via two ionic bonds. In the diagram below, the groups allowing ionic bonding are caused by the transfer of a hydrogen ion from a -COOH group in the side chain of one amino acid residue to an -NH2 group in the side chain of another.

In this simplified example, that is equally true in both the substrate and the enzyme.

Now think about what happens at a lower pH - in other words under acidic conditions.

It won't affect the -NH3 + group, but the -COO - will pick up a hydrogen ion.

What you will have will be this:

You no longer have the ability to form ionic bonds between the substrate and the enzyme. If those bonds were necessary to attach the substrate and activate it in some way, then at this lower pH, the enzyme won't work.

What if you have a pH higher than 7 - in other words under alkaline conditions.

This time, the -COO - group won't be affected, but the -NH3 + group will lose a hydrogen ion.

Again, there is no possibility of forming ionic bonds, and so the enzyme probably won't work this time either.

Notiz: If you think about it, this argument only works using ionic bonding if the enzyme has an optimum pH around 7. Under fairly acidic or alkaline conditions, all the charges present in the enzyme and substrate would be the same - as in the examples above.

Under those circumstances, you would be looking at other sorts of bonding - hydrogen bonding, for example, perhaps involving hydrogen bonds between an ion on one of either the enzyme and substrate, and a suitable hydrogen atom or lone pair on the other.

The example given is easy to follow. Don't worry about complications at this level. As long as you can see why changing the pH might affect a simple case, that's all you need.

At extreme pH's, something more drastic can happen. Remember that the tertiary structure of the protein is in part held together by ionic bonds just like those we've looked at between the enzyme and its substrate.

At very high or very low pH's, these bonds within the enzyme can be disrupted, and it can lose its shape. If it loses its shape, the active site will probably be lost completely. This is essentially the same as denaturing the protein by heating it too much.

This enzyme topic continues onto a final page about enzyme inhibitors.

Fragen zum Testen Ihres Verständnisses

Wenn dies Ihr erster Fragenkatalog ist, lesen Sie bitte die Einführungsseite, bevor Sie beginnen. Sie müssen die ZURÜCK-TASTE Ihres Browsers verwenden, um danach hierher zurückzukehren.


Human pancreatic alpha-amylase. II. Effects of pH, substrate and ions on the activity of the enzyme

Purified human pancreatic alpha-amylase (alpha-1,4-glucan 4-glucano-hydrolase, EC 3.2.1.1) was found to be stable over a wide range of pH values (5.0 to 10.5) with an optimal pH for the enzymatic activity of 7.0. The Michaelis constant of the enzyme at optimal pH and assay conditions was found to be 2.51 mg per ml for soluble starch. Halide ions were required for the activity of the enzyme whereas sulfate and nitrate were not. The order of effectiveness of activation was found to be: Cl- greater than Br- greater than I- greater than F-. Calcium and magnesium were activators at concentrations of 0.001M and 0.005M, respectively, but exhibited inhibitory effects at concentrations higher than 0.005M. At 0.01M ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) concentration the enzymatic activity upon seven min incubation, was inhibited up to 96%. The inhibition of EDTA and calcium could be reversed upon addition of calcium and EDTA, respectively.


Does pH affect Michaelis constant? - Biologie

Many biologically important molecules have multiple binding sites. For example hemoglobin, the oxygen carrying molecule in red blood cells, binds four molecules of molecular oxygen, each binding at its own distinct binding site. Hemoglobin is an example of a cooperative molecule, that is one where the binding of a ligand at one site alter that the affinity of other binding sites for their ligands. In the case of hemoglobin, the binding of a molecule of O2 at one site erhöht sich the affinity of the other sites for O2.

This property is critical for the function of hemoglobin, which picks up four molecules of O2 in the oxygen-rich environment of the lungs, then delivers it to the tissues that have a much lower concentration of oxygen. As each molecule of O2bind to hemoglobin, the affinity of the remaining binding site increases, making it easier for more O2 to bind . Conversely, as each molecule of O2 is released to a tissue, the affinity of the remaining sites for O2 decreases, making it easier for subsequent molecules of O2 to dissociate.

Scanning electron micrograph of blood. The doughnut-shaped cells are red blood cells. Photo credit: Bruce Wetzel. Courtesy of the National Cancer Institute.

The problem of how hemoglobin delivers oxygen throughout the body has been studied for the past 100 years. In 1910, biochemist Archibald Hill modeled this property of hemoglobin using the rational function,

wo &theta is the percentage of binding sites occupied, [L] is the concentration of ligand, n is the Hill coefficient, which represents the degree of cooperativity, and KD is the dissociation constant. Recall that KD is equal to the ligand concentration when half of the binding sites are filled.

A common application of the Hill equation is modeling cooperative enzymes. These enzymes are under allosteric control, that is the binding of a molecule at one site alters the affinity of the enzyme for its substrate and hence regulates the enzyme activity. In this case, the Hill equation is rewritten as the rational function,

wo V is the reaction velocity, Vmax is the maximum reaction velocity, and [S] is the substrate concentration. Die Konstante K is analogous to the Michaelis constant (Km) und n is the Hill coefficient indicating the degree of cooperativity.

Hill coefficient Cooperativity
n = 1 keiner
n >1 positiv
n < 1 Negativ

Positive cooperativity occurs when an enzyme has several sites to which a substrate can bind, and the binding of one substrates molecules increases the rate of binding of other substrates. Cooperativity can be recognized by plotting velocity against substrate concentration. An enzyme that displays positive cooperativity sill be sigmoidal (or S-shaped), while noncooperative enzymes display Michaelis-Menten kinetics and the plots are hyperbolic.

Use the Hill equation to answer the following questions:


Schau das Video: Der PH-Wert und sein Einfluß auf unsere Gesundheit (Kann 2022).